PL192521B1 - Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 i kompozycja - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie przerywacza wi azania CD40:CD154 do wytwarzania leku do a) hamownia odrzucania przeszczepu tkankowego przez biorc e przeszczepu b ed acego na- czelnym b) odwracania ostrego odrzucania przeszczepionej tkanki przez biorc e b ed acego naczelnym c) przed lu zania prze zycia przeszczepionej tkanki u biorcy b ed acego naczelnym d) os labiania powik la n immunologicznych niepowodzenia przeszczepienia tkanki u biorcy b ed acego naczelnym. 2. Zastosowanie wed lug zastrz. 1, znamienne tym, ze przerywacz wi azania CD40:CD154 jest zwi azkiem o aktywno sci anty-CD40L (anty-CD154). 3. Zastosowanie wed lug zastrz. 2, znamienne tym, ze zwi azkiem o aktywno sci anty-CD40L jest przeciwcia lo monoklonalne. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są zastosowania przerywacza wiązania CD40:CD154 i kompozycja.

Wynalazek dotyczy ogólnie zahamowania niepożądanych reakcji odpornościowych, w szczególności przeciw adapcyjnej reakcji odpornościowej za pośrednictwem limfocytów T. Wynalazek dotyczy w szczególności zapobiegania, leczenia albo odwracania odrzucania przeszczepu tkankowego albo narządowego u biorcy, wywołanego przez układ odpornościowy.

Tło wynalazku

Przeszczepienie narządu pomiędzy różniącymi się genetycznie osobnikami niezmiennie prowadzi do immunologicznego odrzucenia narządu z powodu mechanizmów zależnych od limfocytów T, o ile proces odrzucania nie zostanie zakłócony przez podanie leków hamujących działanie limfocytów T. Kilka patentów USA ujawnia zastosowanie takich leków immunosupresyjnych w celu hamowania odrzucania przeszczepu, w tym patent USA nr 5,104,858; 5,008,246 i 5,068,323. Inne konwencjonalne środki opisano w Suthanthiran i in., (1994), 331 New. Engl. Med. J. 365-376. Klinicznie stosuje się inhibitory fosfatazy kalcyneuryny i glikokortykosteroidy, zaś obie grupy leków zapobiegają uwalnianiu aktywujących cytokin przez limfocyty T, w szczególności IL-2. Jednakże, terapia tym rodzajem środków jest nadal niedoskonała. Oba rodzaje leków działają nie wybiórczo na limfocyty T przez zaburzanie sygnalizacji zachodzącej przez antygenowy receptor limfocytu T (TCR) będącym jedynym pośrednikiem swoistości antygenowej limfocytów T. Oprócz tego, działanie tych leków nie jest trwałe, tak że przerwanie leczenia powoduje zwykle odrzucenie przeszczepu. Tak więc, w celu utrzymania żywego i funkcjonującego przeszczepu, biorcy są narażeni na nastę pstwa długotrwałej, nieswoistej immunosupresji. Następstwa te obejmują zwiększone ryzyko zakażenia i nowotworzenia, jak również istotny koszt i toksyczność.

Tak więc, istnieje potrzeba ulepszonego albo skuteczniejszego leczenia immunosupresyjnego albo immunomodulacyjnego biorców przeszczepów. W szczególności, istnieje zapotrzebowanie na leczenie, które nie wymaga ogólnej immunosupresji limfocytów T, tj. leczenie, które nie powoduje, że biorca jest podatny na nowotwory albo zakażenia oportunistyczne. Wyszczególniając, istnieje zapotrzebowanie na leczenie, które wykazuje mniejszą toksyczność niż obecnie stosowane środki terapeutyczne. Podobnie, istnieje zapotrzebowanie na leczenie, które ułatwia długotrwałą integrację przeszczepu, tj. integrację, która pozostaje mimo zakończenia leczenia.

Streszczenie wynalazku

Opisane poniżej rozwiązania według wynalazku mają na celu dostarczenie środka immunomodulacyjnego, który osłabia przeciwną adaptacji reakcję limfocytów T, bez konieczności ogólnej immunosupresji limfocytów T, hamuje odrzucanie immunologiczne przeszczepionej tkanki, przerywa dostarczanie sygnału ko-stymulującego do aktywowanych limfocytów T. W szczególności rozwiązania według wynalazku umożliwiają dostarczenie przerywacza wiązania CD40:CD154 do zastosowania w terapii, szczególnie do zastosowania w leczeniu w celu złagodzenia albo opóź nienia immunologicznego odrzucenia przeszczepionej tkanki. Rozwiązania według wynalazku dostarczają kompozycji terapeutycznej i schematu leczenia do złagodzenia reakcji immunologicznej za pośrednictwem limfocytów T przeciwnej adaptacji, opartych na zastosowaniu przerywacza wiązania CD40:CD154 w kombinacji z innymi środkami immunosupresyjnymi i immunomodulującymi. Tak więc, rozwiązania według wynalazku są oparte na zastosowaniu przerywacza wiązania CD40:CD154 w kombinacji, na przykład, z czynnikiem, który blokuje ko-stymulację przez CD28 i umoż liwiają hamowanie, łagodzenie, os łabianie, opóźnianie albo odwracanie nieprawidłowego albo ostrego odrzucania przeszczepionej tkanki. Ponadto rozwiązania według wynalazku umożliwiają polepszenie dostępności tkanki przeszczepu, oraz funkcjonalną integrację tkanki allogenicznej albo ksenogenicznej z organizmem biorcy. Rozwiązania według wynalazku mogą również znaleźć zastosowanie w zapobieganiu, łagodzeniu, osłabianiu albo leczeniu stanów chorobowych spowodowanych reakcją odpornościową przeciwną adaptacji, w tym chorobom autoagresyjnym zależ nym od limfocytów T (np. cukrzycy insulinozależnej, stwardnieniu rozsianemu itp.) jak również chorobom alergicznym.

W ogólnoś ci wynalazek opiera się na ujawnieniu, ż e zastosowania przerywacza wią zania CD40:CD154 (CD40L) samego albo w kombinacji z innym środkiem immunomodulującym osłabia, hamuje, zapobiega, opóźnia albo odwraca immunologiczną reakcję odrzucania tkanki przeszczepu przeciwną adaptacji, bez potrzeby uogólnionej supresji układu odpornościowego pacjenta. Przerywacz wiązania jest dowolnym czynnikiem, który przerywa wiązanie cząsteczki ko-stymulującej (tu, liganda CD40 określanego również jako antygen 5c8, CD40L, CD154 jak również określanego jako gp39)

PL 192 521 B1 z jego partnerem wią zania albo receptorem (tu, CD40). Przerywacz wiązania jest substancją skierowaną przeciwko CD40L, co oznacza, że związek, który wiąże CD40L(CD154) i w ten sposób blokuje, zakłóca albo przerywa zdolność CD40L do wiązania z CD40. Przykładem związku przeciwnego CD40L jest przeciwciało monoklonalne, szczególnie przeciwciało o swoistości antygenowej przeciwciała 5c8, ujawnionego w patencie USA 5,474,771, załączonego tu jako odnośnik.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do

a) hamownia odrzucania przeszczepu tkankowego przez biorcę przeszczepu będącego naczelnym

b) odwracania ostrego odrzucania przeszczepionej tkanki przez biorcę będącego naczelnym

c) przedłużania przeżycia przeszczepionej tkanki u biorcy będącego naczelnym

d) osłabiania powikłań immunologicznych niepowodzenia przeszczepienia tkanki u biorcy będącego naczelnym.

Korzystnie przeszczepiona tkanka jest wybrana spośród tkanki nerkowej, wątrobowej, sercowej, trzustkowej, skórnej, naczyniowej, kostnej i chrzestnej. Również korzystnie przeszczepiona tkanka jest allogeniczna względem biorcy przeszczepu będącego naczelnym; lub przeszczepiona tkanka jest ksenogeniczna względem biorcy przeszczepu będącego naczelnym.

Ponadto korzystnie przeszczepiona tkanka składa się z wyizolowanych lub zawieszonych komórek. Korzystniej wyizolowane lub zawieszone komórki są wybrane z grupy składającej się z: (a) obwodowych komórek krwi; i (b) komórek szpiku kostnego lub ich dowolnego składnika hematopoetycznego Korzystnie lek wytwarzany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania ze związkiem immunosupresyjnym albo immunomodulującym. Korzystniej związek immunosupresyjny albo immunomodulujący jest czynnikiem przerywającym ko-stymulującą sygnalizację limfocytów T przez CD28; albo czynnikiem przerywającym sygnalizację kalcyneuryny. Najkorzystniej związek immunosupresyjny albo immunomodulujący jest wybrany spośród kortykosteroidu, środka antyproliferacyjnego, cyklosporyny, takrolimusa, sirolimusa, mykofenolanu mofetylu, mizorubiny, dezoksyspergualiny, soli sodowej brekwinaru, leflunomidu i azaspiranu.

Korzystnie biorcą przeszczepu będącym naczelnym jest człowiek, a lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania biorcy przeszczepu sposobem wybranym z grupy składającej się z (a) drogi pozajelitowej;

(b) biokompatybilnego lub bioerodującego implantu o przedłużonym uwalnianiu;

(c) wszczepienia pompy infuzyjnej;

(d) podawania doustnego lub jelitowego; oraz (e) podawania miejscowego.

Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania dawcy przeszczepu lub do przeszczepianej tkanki przed jej integracją u biorcy przeszczepu będącego naczelnym.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do hamownia lub odrzucania przeszczepu tkankowego przez biorcę przeszczepu będącego naczelnym, przeznaczonego do podawania w skutecznej ilości biorcy przeszczepu będącego naczelnym:

a) w 2, 4, 6, 8, 12, 16 i 28 dniu, licząc od dnia wszczepienia przeszczepu temu naczelnemu; lub b) dzień przed przeszczepem przeszczepu tkankowego, następnie w dniu przeszczepu równocześnie z wszczepianiem przeszczepu tkankowego, oraz w 3, 10, 18 i 28 dniu, licząc od dnia wszczepienia przeszczepu temu naczelnemu.

Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do wielokrotnego podawania w reżimie miesięcznym, począwszy miesiąc po 28 dniu, licząc od dnia wszczepienia.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do odwracania ostrego odrzucania przeszczepionej tkanki u biorcy przeszczepu będącego naczelnym, przy czym lek jest przeznaczony do podawania w dniu, w którym wykazuje on objawy ostrego odrzucania przeszczepu oraz później w 3, 10, 18 i 28 dniu. Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania biorcy w reżimie miesięcznym, począwszy miesiąc po 28 dniu od wystąpienia objawów ostrego odrzucenia przeszczepu.

Korzystnie przerywacz wiązania CD40:CD154 jest związkiem o aktywności anty-CD40L (antyCD154), korzystniej przeciwciałem monoklonalnym. Korzystnie przeciwciało monoklonalne wiąże się

PL 192 521 B1 z antygenem 5c8, a najkorzystniej wykazuje antygenowe swoiste właściwości wiązania przeciwciała 5c8 wytwarzanego przez depozyt o numerze dostępu ATCC HB 10916. Również korzystniej związek o aktywności anty-CD40L jest wybrany z grupy składającej się z: fragmentów Fab, związków F(ab')2, regionów VH oraz przeciwciał jednołańcuchowych.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja obejmująca przeciwciało monoklonalne lub jego fragment wykazujące antygenowo swoiste właściwości wiązania jak przeciwciało 5c8 wytwarzane przez depozyt o numerze dostępu ATCC HB 10916; oraz immunosupresyjny albo immunomodulacyjny związek wybrany z grupy składającej się z (a) czynnika przerywającego ko-stymulującą sygnalizację limfocytów T przez CD28;

(b) czynnika przerywającego sygnalizację kalcyneuryny;

(c) kortykosteroidu lub środka antyproliferacyjnego; lub (d) takrolimusa, sirolimusa, mykofenolanu mofetylu, mizorubiny, dezoksyspergualiny, soli sodowej brekwinaru, leflunomidu i azaspiranu.

W ogólności rozwiązania według wynalazku osłabiają powikłania immunologiczne, niepowodzenia przeszczepienia tkanki. W szczególności, rozwiązania według wynalazku pozwalają unikać albo łagodzą komplikacje takie jak, zwłóknienie śródmiąższowe, przewlekła miażdżyca przeszczepu, zapalenia naczyń itp.

Rozwiązania według wynalazku pozwalają na skuteczne leczenie ostrego i/lub przewlekłego odrzucania przeszczepu, które może być stosowane profilaktycznie albo jako leczenie pooperacyjne, albo w celu odwrócenia, albo stłumienia odrzucania przeszczepu w dowolnym momencie życia biorcy. Leczenie takie można powtarzać w kolejnych epizodach odrzucania przeszczepu. Przykładowe dawkowanie dla przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40L wynosi od około 5 mg/kg ciężaru ciała do około 20 mg/kg ciężaru ciała.

W rozwiązaniach według wynalazku, przerywacz wiązania CD40:CD154 można formułować w kompozycję terapeutyczną , która obejmuje skuteczną terapeutycznie ilość przerywacza wią zania w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku. Kompozycja farmaceutyczna moż e również obejmować skuteczną terapeutycznie ilość innego związku immunosupresyjnego albo immunomodulującego, w tym, nieograniczają co, czynnik, który przerywa ko-stymulują c ą sygnalizację limfocytów T przez CD28 (np. CTLA4Ig); czynnik, który przerywa sygnalizację przez kalcyneurynę (np. cyklosporyna, makrolid taki jak takrolimus, znany również jako FK506); kortykosteroid albo środek antyproliferacyjny (np. azatiopryna). Inne skuteczne terapeutycznie związki, przydatne do zastosowania z przerywaczem wiązania CD40:CD154 obejmują sirolimus (znany jako rapamycyna); mykofenolan mofetilu (MMF), mizorybinę, dezoksyspergualinę, sól sodową brekwinaru, leflunomid, azaspiran itp.

Rozwiązania według wynalazku są przydatne do zastosowania z wszystkimi rodzajami procedur przeszczepiania, na przykład w przypadkach, gdy biorca jest ssakiem, w szczególności naczelnym, zaś najkorzystniej człowiekiem. Dawcą przeszczepu może być syngeniczny członek tego samego gatunku filogenetycznego co biorca (tj. dawca allogeniczny, zakładając przeszczep allogeniczny), albo członek innego filogenetycznie gatunku (tj. dawca ksenogeniczny, zakładając przeszczep ksenogeniczny). Jeżeli dawcą jest dawca ksenogeniczny, korzystnie dawca jest zbliżony do biorcy pod względem MHC o ile to możliwe; przykładowo, orangutan albo szympans będzie korzystnym dawcą tkanki dla człowieka. Rozwiązania według wynalazku można zastosować w celu ułatwienia przyjęcia się przeszczepu dowolnej tkanki albo narządu, niezależnie od tego, czy tkanka dawcy (przeszczep) jest całym narządem, wycinkiem albo częścią narządu albo tkanki albo izolowanych komórek. Nie ograniczające przykłady odpowiednich tkanek obejmują tkanki nerki, wątroby, serca, trzustki (np. wysepki), skóry, naczyń, nerwów, kości, chrząstki itp. tkanek ssaków.

Jak to niniejszym ujawniono, korzyści płynące z rozwiązań według wynalazku potwierdzono badaniami odpowiednich modeli przed-klinicznych. Przykładowy przerywacz wiązania CD40:CD154 (przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40L, 5c8) badano samo i w kombinacji z innymi przykładowymi immunomodulatorami (przerywacz wiązania CD28, CTLA4Ig; mykofenolan mofetilu, kortykosteroidy, takrolimus) na leukocytach krwi obwodowej rezusa in vitro, oraz na małpach rezus z przeszczepionymi unaczynionymi przeszczepami allogenicznymi nerki.

Powyższe, oraz inne cele, cechy i zalety niniejszego wynalazku, jak również sam wynalazek, będą łatwiej zrozumiałe w oparciu o poniższy opis najkorzystniejszych wykonań.

Szczegółowy opis wynalazku

Przez ostatnie 20 lat zebrano dowody, że aktywacja limfocytów T wymaga zarówno sygnału za pośrednictwem TCR, jak i równoczesnych sygnałów ko-stymulujących. Przykładowo, wytwarzanie

PL 192 521 B1 przeciwciał przez limfocyty B w reakcji na antygeny białkowe wymaga swoistego, ko-stymulującego oddziaływania z limfocytami T. To oddziaływanie limfocyta B i limfocyta T zachodzi, oprócz receptora TCR, przez kilka zjawisk wiązania receptor-ligand. Te dodatkowe zjawiska wiązania obejmują wiązanie CD40 na limfocytach B z CD154 (CD40L) na limfocytach T. Ludzka CD40 jest białkiem powierzchniowym 50 kDa, wyrażanym na limfocytach B, jak również makrofagach i aktywowanych komórkach śródbłonka. CD40 należy do klasy receptorów związanych z programowaną śmiercią komórek, w tym Fas/CD95 i receptora czynnika martwicy nowotworu (TNF) alfa. Ludzki CD154 (CD40L) jest glikoproteiną powierzchniową typu II o 32 kDa, z homologią do TNF-alfa, który ulega przemijającej ekspresji na aktywowanych limfocytach T. Wykazano, że wiązanie CD40:CD154 jest niezbędne do reakcji przeciwciał zależnej od limfocytów T. W szczególności, wiązanie CD40:CD154 zapewnia sygnały pobudzające zapobiegające apoptozie i/lub pobudzające limfokiny.

Innym istotnym sygnałem ko-stymulującym jest sygnał wytwarzany przez wiązanie CD28 na limfocytach T z partnerem wiązania, CD80 (B7-1) albo CD86 (B7-2) na komórkach prezentujących antygen (APC) i prawdopodobnie na komórkach śródmiąższowych. Co istotne, ekspresja CD80 i/lub CD86 jest dodatnio regulowana przez sygnał z wiązania CD40 z CD154. Dalsze badania wykazały, że cząsteczka CTLA4 (CD152) ujemnie reguluje ko-stymulację i aktywację za pośrednictwem TCR przynajmniej częściowo przez współzawodnictwo z CD28 o CD80/CD86 oraz przez dostarczanie unikalnego negatywnego sygnału do kompleksu przekaźnika sygnału TCR.

Ważność wiązania CD40:CD154 w promowaniu zależnej od limfocytów T reakcji biologicznej jest podkreślona przez opracowanie powiązanego z chromosomem X zespołu nadmiernego wytwarzania IgM (X-HIGM) u ludzi pozbawionych funkcjonalnego CD154. Osobnicy ci mają normalny albo wysoki poziom IgM, ale nie są w stanie wytwarzać przeciwciał IgG, IgA ani IgG. Chorujący osobnicy cierpią na nawracające, czasami ciężkie, zakażenia bakteryjne (najpowszechniej Streptococcus pneumoniae i Hemophilus influenzae) i pewne niezwykłe zakażenia pasożytnicze, jak również zwiększonej częstości chłoniaki i nowotwory jamy brzusznej. Te objawy kliniczne można kontrolować dożylną zastępczą terapią immunoglobulinami.

Objawy K0HIGM można naśladować u zwierząt ze znokautowanym genem kodującym CD154 (zwierzęta nokautowane). Badania nad nokautowanymi zwierzętami potwierdziły, że mimo iż limfocyty B mogą wytwarzać IgM pod nieobecność wiązania CD40:CD154, są niezdolne do przełączania izotypów albo do przeżywania po dojrzewaniu powinowactwa. Pod nieobecność funkcjonalnego oddziaływania CD40:CD154, centra namnażania węzłów chłonnych nie rozwijają się prawidłowo, zaś dojrzewanie limfocytów B pamięci jest zaburzone. Defekty te przyczyniają się do braku wtórnej (dojrzałej) reakcji przeciwciał.

Osobnicy z X-HIGM i nokauty CD154 wykazują również defekt odporności komórkowej. Defekty te objawiają się zwiększonym występowaniem zakażeń Pneumocystis carinii, Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans, jak również przewlekłego zakażenia Giardia lambli. Mysie nokauty nie są w stanie rozwinąć odporności na zakażenie Leishmania. Wiele spośród tych defektów komórkowych można odwrócić przez podanie IL-2 albo IFN-γ. Dane te wspierają pogląd, że wiązanie CD40:CD154 ułatwia rozwój reakcji limfocytów pomocniczych T typu I. Dalsze dowody pochodzą z obserwacji, że aktywacja makrofagów nie zachodzi w układzie z upośledzonym CD154, oraz że podawanie przeciwciał przeciwko CD40L zmniejsza ich zdolność do wyleczenia z zakażenia Pneumocystis. Blokada wiązania CD40:CD154 wydaje się zmniejszać zdolność makrofagów do wytwarzania tlenku azotu, który pośredniczy w wielu aktywnościach zapalnych makrofagów. Należy zaznaczyć, że ssaki (w tym ludzie), którzy są pozbawienia funkcjonalnego CD154 nie rozwijają istotnej ilości zakażeń wirusowych albo posocznicy.

Wiele z badań przedklinicznych ustaliło, że czynniki zdolne do przerywania wiązania CD40:CD154 są obiecującymi środkami immunomodulującymi. W układach mysich, przeciwciała blokujące CD154 blokują pierwotną i wtórną reakcję odpornościową na egzogenny antygen, zarówno in vitro jak i in vivo. Przeciwciała przeciwko CD154 powodują zmniejszenie się centrów namnażania u myszy i małp, zgodnie z danymi dotyczącymi niedoboru odporności związanego z CD154. Podanie trzech dawek przeciwciała przeciwko CD154 myszy chorującej na toczeń, w wieku trzech miesięcy istotnie zmniejsza miana przeciwko dwuniciowemu DNA i nukleosomom, opóźnia rozwój ciężkiego zapalenia nerek i zmniejsza śmiertelność. Ponadto, podawanie przeciwciał przeciwko CD154 myszom w wieku 5-7 miesięcy z ciężkim zapaleniem nerek stabilizuje albo nawet odwraca chorobę nerek. Przeciwciała przeciwko CD154 wraz z małą liczbą istniejących spoczynkowych allogenicznych limfocytów umożliwia nieograniczone przeżywanie po przeszczepie autologicznych przeszczepów wysepek

PL 192 521 B1 trzustkowych. W innych modelach zwierzęcych, zakłócanie wiązania pomiędzy CD40:CD154 zmniejsza objawy chorób autoagresyjnych, (np. stwardnienia rozsianego, reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby zapalnej jelita grubego), odrzucanie przeszczepu (allogenicznych przeszczepów serca, choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi), zapalenie kłębuszków nerkowych z powodu zatrucia chlorkiem rtęci, które zachodzi przez mechanizmy zarówno typu komórkowego jak i humoralnego.

Dodatkowe badania na gryzoniach wykazały, że aktywację limfocytów T można zablokować i przedł u ż y ć przeż ycie przeszczepu allogenicznego, przez zakł ócanie wią zania CD80/CD86 z ich partnerem wiązania na limfocytach T, receptorami CD28 i CTLA4. Badania te obejmowały zastosowanie swoistego wobec CD80/CD86 białka fuzyjnego, CTLA4-Ig jako przerywacza sygnalizacji przez CD28. Inni wykazali, że można zapobiec dodatniej regulacji CD80/CD86 przez zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 (np. przeciwciała monoklonalnego MR1). Skuteczność obydwu klas czynników immunomodulacyjnych wydaje się zależeć od TCR. Tak więc, czynniki takie oferują zdolność do modulowania swoistości procesów biologicznych zależnych od limfocytów T, zamiast zależeć od ogólnej immunosupresji limfocytów T. Badania obejmujące zastosowanie takich czynników in vivo na modelach odrzucania przeszczepów przez gryzonie dały dramatyczne rezultaty, w tym przyjęcie w pełni niezgodnych przeszczepów skóry, który to wynik był niemożliwy do osiągnięcia przy użyciu współczesnych środków immunosupresyjnych.

Należy zaznaczyć jednakże, że wszystkie opisywane do tej pory badania długotrwałego przeżycia przeszczepów u gryzoni zakończyły się niepowodzeniem, albo były związane z niedopuszczalną toksycznością, podczas badania nad innymi gatunkami, w szczególności na naczelnych.

Ujawnione badania potwierdzające podstawy rozwiązań według wynalazku wykazały, że zastosowania przerywacza wiązania CD40:CD154 samego albo w kombinacji z innym lekiem immunomodulującym albo immunosupresyjnym (takim jak przerywacz sygnalizacji CD28) ułatwia długotrwałe przeżycie przeszczepu, integrację bez odrzucania heterologicznej (niezgodnej pod względem MHC) tkanki dawcy u biorcy będącego naczelnym. Zachęcające jest to, że terapia ta była bardzo prosta, obejmowała bowiem podawanie czynnika terapeutycznego przez standardowe wstrzyknięcie przez dożylny cewnik, oraz była bardzo dobrze tolerowana przez biorców. Jest to w znacznym kontraście z innymi schematami leczenia stosowanymi do uzyskania trwałego przyjęcia przeszczepu przez biorcę u naczelnych, wymagają cymi promieniowania jonizują cego, podawania szpiku pobranego od dawcy i znacznej immunosupresji pooperacyjnej. Zwierzę ta opisane w badaniu nie wykazywały żadnych objawów aktywacji limfocytów T albo uwalniania cytokin obserwowanych zwykle po leczeniu przeciwciałami skierowanymi przeciwko CD3, zaś przedłużone przeżycie nie niosło ze sobą kosztów w sensie zakażeń oportunistycznych. Ponadto, nie obserwowano zmian w parametrach krwi obwodowej podczas badania. Długotrwałe przeżycie osiągnięto bez zmniejszenia liczby limfocytów, i bez utraty reaktywności limfocytów T in vitro. Nie jest zatem prawdopodobne, żeby obserwowane efekty można było przypisać zniszczeniu limfocytów T po opsonizacji przeciwciałem albo białkiem fuzyjnym. Wyniki te są wstrząsające, a powodzenie leczenia w nie wsobnej populacji rezusów sugeruje, że przy zastosowaniu tego podejścia albo równoważnego integracja przeszczepu allogenicznego (a nawet ksenogenicznego) jest możliwym do osiągnięcia celem w populacji ludzkiej.

Mechanizm i względny wkład każdego z czynników do ewentualnej opisanej niżej terapii złożonej pozostaje niejasny. Powodzenie samego blokowania CD40:CD154 sugeruje, że jakakolwiek podstawowa sygnalizacja ko-stymulacyjna jest mniej istotna w utrzymaniu reakcji odrzucenia niż dodatnia regulacja CD80/CD86. W rzeczywistości, podanie przeciwciała przeciwko CD154 spowodowało imponujące przeżycie bez odrzucenia przeszczepu, podczas gdy efekty przerywacza CD28 (CTLA4-Ig) były bardziej przejściowe. Wiedząc, że CD154 ulega ekspresji na komórkach nie szpikowych, takich jak śródbłonek naczyń i mięśnie gładkie, oraz że CD80 można indukować na fibroblastach i hepatocytach, zjawiska nie związane z limfocytami T mogą być kluczowe dla wykształcenia się reaktywności przeciwko tkance dawcy. Przez uniemożliwienie układowi odpornościowemu dostępu do istotnych sygnałów ko-stymulacyjnych i adhezyjnych śródmiąższu w momencie przeszczepienia, można zapobiec rozpoznaniu przeszczepu i aktywacji. Różnice w aktywacji wywołanej śródmiąższem dawcy i aktywacji wywołanej komórkami limfoidalnymi mogą wyjaśniać zachowanie reaktywności in vitror mimo normalnego funkcjonowania przeszczepu i ogólnie słabą korelację pomiędzy reaktywnością MLR i wynikiem klinicznym przeszczepu. Mimo to, efekty przykładowych czynników blokujących ko-stymulację, CTLA4-Ig i humanizowanego 5c8 (przeciwko CD154) okazały się być synergistyczne in vivo i in vitro. Być może, CTLA4-Ig zapewnia ochronę przed ekspresją CD80/CD86, która umyka efektowi przerywacza wiązania CD40:CD154 przez humanizowane 5c8. W takim przypadku, konieczny

PL 192 521 B1 będzie dłuższy czas w celu zorganizowania skutecznej ostrej reakcji z kilku komórek, które uniknęły początkowej blokady.

Ponieważ niniejsza strategia okazała się być sukcesem w odwracaniu istniejącego odrzucania potwierdzonego biopsją, wydaje się, że proces odrzucania musi być utrzymywany przez ciągłą kostymulację, a nie ciągły proces, który po początkowym uruchomieniu przebiega dopóki nie zostaną wyeliminowane albo niezdolne do sygnalizacji przez TCR. Teleologicznie, organizmowi służy najlepiej stan zapalny, który jest łatwy do kontrolowania. Tak więc pod nieobecność wskazówek do ataku odwrót może być słuszny. Wspiera to pogląd, że wykorzystanie naturalnej skłonności układu odpornościowego do ujemnego regulowania powinno być korzystniejsze niż powszechna immunosupresja.

Poniższa dyskusja ilustruje na przykładach różne konteksty i okoliczności rozwiązań według wynalazku, jak również dostarcza dowodów z użyciem konkretnych postaci wykonania.

Biorcy

Rozwiązania według wynalazku można zastosować do leczenia albo profilaktyki dowolnego biorcy będącego ssakiem, albo ssaka wymagającego takiego przeszczepu. Korzystnie, biorca (określany również jako biorca przyjmujący albo biorca) jest naczelnym, jeszcze korzystniej wyższym naczelnym, najkorzystniej człowiekiem. Biorcą może być, jednakże, inny ssak wymagający przeszczepu tkankowego, szczególnie ssak istotny gospodarczo, albo zwierzę towarzyszące albo inne wartościowe zwierzę, jak np. członek zagrożonego gatunku. Tak więc, biorcy obejmują również, choć nie są ograniczeni do owcy, koni, jagniąt, kóz, świń, psów, kotów, królików, świnek morskich, chomików, dżerbili, szczurów i myszy.

Dawca albo tkanka przeszczepiana

Rozwiązania według wynalazku można zastosować z dowolnym rodzajem przeszczepu tkankowego albo procedurą przeszczepiania, szczególnie, gdy tkanka dawcy (przeszczepiana) jest uszkodzona albo odrzucona (lub istnieje ryzyko jej uszkodzenia lub odrzucenia) przez układ odpornościowy w organizmie biorcy. W szczególności, wynalazek można zastosować w dowolnym kontekście, gdy biorca nie jest zgodny z tkanką przeszczepu. Tak więc, oprócz autologicznych albo syngenicznych, rozwiązania według wynalazku można zastosować z tkanką przeszczepu allogenicznego albo nawet ksenogenicznego. Tkanka przeszczepiana może pochodzić od ochotnika albo innego żywego organizmu, albo od dawcy zmarłego. Korzystnie, dawca jest zgodny histologicznie z biorcą. Tak więc, gdy biorcą jest człowiek, korzystnym dawcą tkanki jest dawca tkanki autologicznej albo allogenicznej jest korzystny. Jednakże tkankę dawcy można pozyskać od gatunku heterologicznego (w przypadku tym określa się go jako przeszczep heterologiczny), takiego jak naczelny nie będący człowiekiem (np. szympans albo orangutan) albo inny względnie zgodny ssak (np. świnia).

W niektórych wykonaniach, tkanka dawcy obejmuje narzą d albo część ciał a. W innych wykonaniach tkanka dawcy obejmuje część, fragment albo bioptat z narządu albo tkanki dawcy. W jeszcze innych wykonaniach, tkanka dawcy obejmuje komórki, szczególnie izolowane albo zawieszone, w tym komórki pobrane albo wycięte z organizmu dawcy, komórki utrzymywane w hodowli pierwotnej albo unieśmiertelnioną linię komórkową. Ewentualnie, tkanka dawcy może obejmować komórki niosące obcy materiał genetyczny, taki jak komórki transfekowane albo transformowane, które zostały przekonstruowane (albo pochodzą od przodka, którego przekonstruowano) w taki sposób, że zawierają materiał genetyczny konieczny do wytworzenia polipeptydu o wartości terapeutycznej dla biorcy. W jeszcze innym wykonaniu, tkanka dawcy może pochodzić od transgenicznego ssaka, którego skonstruowano w taki sposób, że obejmuje materiał genetyczny konieczny do wytwarzania, we wszystkich albo niektórych komórkach ciała, polipeptyd o wartości terapeutycznej dla biorcy. Przykładowe polipeptydy o wartości terapeutycznej dla biorcy obejmują: hormony takie jak insulina albo hormon wzrostu, cytokiny, czynniki wzrostu i różnicowania, enzymy, białka strukturalne i inne.

Tak więc, w świetle powyższego, jasne jest, że rozwiązania według wynalazku można zastosować wobec takich przeszczepów narządowych jak nerka, wątroba, trzustka, płuco, serce itp. Podobnie, można je zastosować w odniesieniu do wycinków albo części powyższych jak również do innych rodzajów tkanek, zwłaszcza tkanki nerkowej, wątrobowej, trzustkowej (szczególnie wysepki), oddechowej, sercowej, skóry, naczyniowej, nerwowej, kostnej, szpiku, chrząstki, ścięgna, powięzi, mięśniowej, tłuszczowej, sutka, wyściółki przewodu pokarmowego, śródbłonka, nabłonka, tkanki łącznej itp. Ponadto, rozwiązania według wynalazku można zastosować z częściami ciała obejmującymi wiele rodzajów komórek w celu zastąpienia albo innej zmiany chirurgicznej albo rekonstrukcji oka, ucha, nosa, palców (paluch albo pozostałych palców), stawu, naczynia krwionośnego, nerwu, mięśnia, kończyny albo innej części ciała. W innych wykonaniach, wynalazek można zastosować z preparatem

PL 192 521 B1 komórkowym albo zawiesiną, wprowadzanych ogólnoustrojowo i miejscowo biorcy. Przykładowo, izolowane, zawieszone albo rozproszone komórki można podawać dożylnie, albo wszczepić w pożądane miejsce, takie jak jama szpikowa, wątroba, w torebkę nerki albo w torebkę stawową, domięśniowo albo miejscowo do rany. Przykładowe komórki obejmują komórki krwi obwodowej, szpik albo dowolny składnik hematopoetyczny, komórki mezenchymalne, komórki satelitarne wątroby, hepatocyty, komórki wytwarzające pro-hormony albo komórki neuroendokrynowe, fibroblasty, komórki grzebienia nerwowego, śródbłonki itp. W niektórych wykonaniach, komórki są zdolne do mitozy i tworzą nową tkankę pochodzącą od dawcy. W innych wykonaniach komórki nie są zdolne do mitozy, ale wytwarzają albo wyrażają polipeptyd albo inny produkt o wartości terapeutycznej dla biorcy.

Przykładowe przerywacze CD40:CD154

Związki terapeutyczne znajdujące zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku obejmują dowolny związek, który blokuje oddziaływanie powierzchniowego CD40 (np. na limfocytach B) z CD40L (CD154) wyrażanym na powierzchni aktywowanych limfocytów T. Przerywacze wiązania CD40:CD154, takie jak związki skierowane przeciwko CD40L, które są konkretnie uwzględniane obejmują przeciwciała poliklonalne i monoklonalne (mAb), jak również pochodne przeciwciał takie jak przeciwciała chimeryczne, cząsteczki humanizowane, cząsteczki o zmniejszonej funkcji efektorowej, cząsteczki o podwójnej swoistości i koniugaty przeciwciał. W korzystnym wykonaniu, przeciwciałem jest 5c8, jak opisane w patencie USA nr 5,474,771, którego ujawnienie jest włączone tu jako odnośnik. W korzystnym wykonaniu, przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane 5c8. Inne znane przeciwciała przeciwko CD154 obejmują przeciwciała ImxM90, ImxM91 i ImxM92 (Immunex), przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40L dostępne z Ancell (klon 24-33331, nr kat. 353-020, Bayport, MN) i przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40L dostępne z Genzyme (Cambridge, MA, nr kat. 80-3703-01). Również dostępne jest przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40L z PharMingen (San Diego, nr kat. 33580D). Wytworzono i scharakteryzowano liczne przeciwciała przeciwko CD40L (patrz, np. WO 96/23071, Bristol-Myers Squibb, załączone tu jako odnośnik).

W rozwią zaniach według wynalazku można stosować również cząsteczki przeciwko CD40L innego rodzaju, takie jak kompletne fragmenty Fab, związki F(ab')2, regiony VH, regiony FV, przeciwciała jednołańcuchowe, (patrz, np. 96/23071), polipeptydy, fuzyjne konstrukty polipeptydowe, fuzje CD40 (takie jak CD40lg, hollenbaugh i in., J. Immunol. Meth., 188:1-7, 1995, załączone tu jako odnośnik) oraz związki drobnocząsteczkowe, takie jak pół-peptydowe związki drobnocząsteczkowe albo związki nie-peptydowe, zdolne do blokowania albo przerywania wiązania CD40:CD154. Procedury projektowania, badania przesiewowego i optymalizacji związków drobnocząsteczkowych dostarczone są w zgłoszeniu PCT/US96/10664, zgłoszonym 21 czerwca, 1996, załączone tu jako odnośnik.

Różne postaci przeciwciał można również wytworzyć stosując standardowe techniki rekombinacji DNA (Winter i Milstein, Nature 349:293-99, 1991). Przykładowo, można skonstruować przeciwciała „chimeryczne, w których domena wiążąca antygen z przeciwciała zwierzęcego jest połączona z ludzką domeną stałą (przeciwciało pochodzące początkowo od ssaka nie będącego człowiekiem, w którym zastosowano technologię rekombinacji DNA w celu usunięcia całości albo części regionów zawiasowych i stałych łańcucha ciężkiego i/lub region stały łańcucha lekkiego, które odpowiadają regionom łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego ludzkiej immunoglobuliny) (patrz, Cabilly i in., patent USA nr 4,816,567; Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55, 1984). Przeciwciała chimeryczne zmniejszają reakcje odpornościową wywołaną przez przeciwciała zwierzęce zastosowane do leczenia ludzi.

Oprócz tego, można syntetyzować rekombinowane przeciwciała „humanizowane”. Przeciwciała humanizowane są przeciwciałami początkowo pochodzącymi od ssaka nie będącego człowiekiem, w których zastosowano technologię rekombinacji DNA w celu zastąpienia całoś ci albo części aminokwasów niekoniecznych do wiązania antygenu aminokwasami z odpowiednich regionów łańcucha ciężkiego i lekkiego ludzkiej immunoglobuliny. Oznacza to, że są to chimery obejmujące w większości sekwencje immunoglobuliny ludzkiej, do których wprowadzono regiony odpowiedzialne za swoiste wiązanie antygenu (patrz, np. zgłoszenie PCT nr WO 94/04679). Zwierzęta immunizuje się pożądanym antygenem, odpowiednie przeciwciała izoluje się i usuwa część sekwencji regionu zmiennego odpowiedzialną za swoiste wiązanie antygenu. Pochodzące od zwierzęcia regiony wiążące antygen klonuje się w odpowiedniej pozycji genów przeciwciała ludzkiego, w których usunięto regiony wiążące antygen. Humanizowane przeciwciała minimalizują zastosowanie heterologicznych (międzygatunkowych) sekwencji w przeciwciałach do zastosowania w leczeniu ludzi i dają mniejsze prawdopodobieństwo

PL 192 521 B1 wywołania niepożądanej reakcji odpornościowej. Prymatyzowane przeciwciała można wytworzyć w podobny sposób.

W rozwiązaniach według wynalazku możliwe jest również zastosowanie ludzkich przeciwciał, które można wytworzyć w zwierzętach nie będących człowiekiem, takich jak zwierzęta transgeniczne niosące jeden albo wiele transgenów ludzkich immunoglobulin. Zwierzęta takie można zastosować jako źródło splenocytów do wytwarzania hybrydoma, jak to opisano w patencie USA nr 5,569,82.5.

Fragmenty przeciwciał i przeciwciała jednowartościowe można również zastosować w rozwiązaniach według wynalazku. Przeciwciało jednowartościowe obejmuje dimer łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego, połączonych regionem Fc (albo zrębem) drugiego łańcucha ciężkiego. „Region Fab oznacza tę część łańcuchów, które są z grubsza równoważne albo analogiczne z sekwencjami, które obejmują rozgałęzienie Y łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego w całości, i które razem (jako agregat) wykazują aktywność przeciwciała. Białko Fab obejmuje agregaty jednego łańcucha ciężkiego i jednego lekkiego (zwykle określane jako Fab'), jak również tetramery, które odpowiadają dwóm segmentom rozgałęzień przeciwciała Y (zwykle określanego jako F(ab')2, niezależnie czy połączony kowalencyjnie czy nie kowalencyjnie, jak długo agregat jest zdolny do wybiórczego reagowania z konkretnym antygenem albo rodziną antygenów.

Oprócz tego, standardowe techniki rekombinacji DNA można zastosować do zmiany powinowactwa wiązania rekombinowanych przeciwciał z ich antygenami, przez zmianę reszt aminokwasowych w sąsiedztwie miejsc wiązania antygenu. Powinowactwo wiązania antygenu humanizowanego przeciwciała można zwiększyć przez mutagenezę opartą na modelowaniu molekularnym (Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33, 1989; zgłoszenie PCT nr WO 94/04679). Może być pożądane zwiększenie albo zmniejszenie powinowactwa przeciwciał do CD40L, zależnie od docelowej tkanki albo przewidywanego schematu leczenia. Można to zrobić przez wykorzystanie technologii prezentacji fagowej (patrz, Winter i in., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455; Schier i in., J. Mol. Biol., 255:28-43, 1996, załączone tu jako odnośnik). Przykładowo, korzystne może być leczenie pacjenta stałym poziomem przeciwciał o zmniejszonym powinowactwie do CD40L w pół-profilaktycznym celu. Podobnie, przeciwciała o zwiększonym powinowactwie do CD40L mogą być korzystniejsze podczas krótkotrwałego leczenia.

Droga podawania

Opisane niniejszym związki mogą być podawane każdym sposobem, który jest medycznie dopuszczalny. Zależnie od swoistych okoliczności pożądane może być podawanie miejscowe albo układowe. Korzystnie, związek jest podawany drogą dootrzewnową, taką jak wstrzyknięcia dożylne, dotętnicze, podskórne, domięśniowe, dogałkowe, dokomorowe, dootrzewnowe, dootrebkowe, doczaszkowe, dokanałowe, albo donosowe, wlewy albo inhalacje. Związek może być również podawany gospodarzowi biorcy przez wszczepienie pompy infuzyjnej, albo implant o przedłużonym uwalnianiu biokompatybilny i biodegradowalny, zarówno przed, jak i po wszczepieniu tkanki dawcy. Alternatywnie, konkretne związki, albo ich formulacje mogą być odpowiednie do podawania doustnego albo dojelitowego. Ponadto inne związki mogą być przydatne do podawania miejscowego.

Ogólnie, związki są podawane organizmowi biorcy. Jednakże, związki mogą być również podawane dawcy, albo do tkanki dawcy. Na przykład, związek może być zawarty w płynach perfuzyjnych, albo konserwujących, w których tkanki dawcy są przechowywane, albo transportowane przed ich integracją z gospodarzem biorcą.

Dawki i częstość leczenia

Ilość i częstość dawkowania każdego związku, który ma być podany pacjentowi z chorobą kompleksów immunologicznych pozostaje w zakresie wiedzy i osądu praktykujących lekarzy transplantologów, takich jak chirurdzy transplantolodzy. Ogólne dawki i schemat podawania został ustalony przez badania przedkliniczne i kliniczne, obejmujące intensywne, lecz rutynowe badania określające optymalne parametry dawkowania związku. Nawet po ustaleniu takich rekomendacji, lekarze mogą często zmieniać te dawki dla różnych gospodarzy biorców, w oparciu o różne założenia, takie jak wiek osobnika, stan medyczny, ciężar, płeć i jednoczesne leczenie innymi związkami farmakologicznymi. Określenie optymalnego dawkowania i schematu podawania każdego związku przeciw-CD40L stosowanego do zahamowania odrzucenia przeszczepu jest rutynowym postępowaniem dla specjalistów farmaceutów i lekarzy.

Generalnie, częstość dawkowania może zostać określona przez lekarza prowadzącego albo podobnie wprawnego lekarza i może obejmować okresy o większej częstości dawkowania, takie jak

PL 192 521 B1 odstępy dzienne albo tygodniowe, zmieniając te okresy na okresy o mniejszej częstości dawkowania, takie jak odstępy miesięczne albo dłuższe.

W celu zilustrowania rozważań o dawkowaniu związku przeciwko CD40L, poniżej podano przykłady schematów dawkowania mAb przeciwko CD40L. Wielkości dawek można łatwo dopasować dla różnych typów związków przeciwko CD40L. Generalnie, rozważane są pojedyncze dawki pomiędzy około 0,05 i około 50 mg/kg ciężaru ciała pacjenta, najczęściej dawki w zakresie 1-20 mg/kg. W ostrym trybie leczenia, takim jak przed, albo w czasie transplantacji, albo w odpowiedzi na rozpoczynające się objawy odrzucania przeszczepu, skuteczna dawka przeciwciał waha się od około 1 mg/kg ciężaru ciała do około 20 mg/kg ciężaru ciała podawana codziennie przez okres około 1 do 5 dni, korzystnie w bolusie do podawania dożylnego. Takie samo dawkowanie i schemat dawkowania może być stosowany w fazie nasycania i w schemacie utrzymywania fazy nasycenia, z fazą utrzymywania nasycenia obejmującą podawanie dożylne i domięśniowe przeciwciał w zakresie od około 0,1 mg/kg ciężaru ciała do około 20 mg/kg ciężaru ciała, w którymkolwiek okresie leczenia w odstępach od tygodnia do 3 miesięcy. Przewlekłe leczenie można również prowadzić schematem utrzymywania fazy nasycenia, w którym przeciwciała są podawane drogą dożylną albo domięśniową w zakresie od około 0,1 mg/kg ciężaru ciała do około 20 mg/kg ciężaru ciała z odstępami między dawkowaniu wahającymi się od około tygodnia do około 3 miesięcy. Dodatkowo, na przewlekłe leczenie można wpływać schematem przerywanych dożylnych bolusów, w którym przeciwciała są podawane między około 1,0 mg/kg ciężaru ciała, a około 100 mg/kg ciężaru ciała, z odstępami między skutecznymi terapiami od 1 do 6 miesięcy. Dla wszystkich schematów, za wyjątkiem schematu przerywanych bolusów, podawanie może być również drogą doustną, dopłucną, donosową albo podskórną.

Skuteczność przeciwciał może być zwiększona przez podawanie okresowe, albo w kombinacji z tradycyjnymi czynnikami terapeutycznymi przeciwko odrzuceniu, albo lekami takimi jak, na przykład kortykosteroidy albo leki immunosupresyjne. Alternatywnie, przeciwciała mogą być sprzęgane z tradycyjnym czynnikiem. Korzystnie pozwalają one na podawania tradycyjnego czynnika w ilości mniejszej niż dawkowanie tradycyjne, na przykład, mniej niż około 50% tradycyjnego dawkowania, gdy czynnik jest podawany w monoterapii. Zgodnie z tym można uniknąć występowania wielu efektów ubocznych związanych z takim czynnikiem.

Terapie złożone do leczenia odrzucenia przeszczepu obejmują zastosowanie przeciwciał przeciw CD40L łącznie z czynnikami ukierunkowanymi na limfocyty B, takie jak przeciwciała przeciwko CD19, CD28, albo CD20 (nie sprzęgnięte albo znakowane pierwiastkami promieniotwórczymi), antagoniści LL-14, LJP394 (blokery receptorów LaJolla Pharmaceuticals), 1R-1116 (małe cząstki Takeda) i idiotypowe przeciwciał a monoklonalne przeciwko Ig. Alternatywnie, kombinacje mog ą obejmować czynniki ukierunkowane na limfocyty T/B, takie jak CTLA4Ig, antagoniści IL-2, antagoniści IL-4, antagoniści IL-6, antagoniści receptorów, przeciwciała monoklonalne przeciwko CD80/CD86, TNF, antagoniści LFA 1/ICAM, antagoniści VLA4/VCAM, brekwinar i konjugaty toksyny IL-2 (np. DAB), prednizon, Mab przeciwko CD3 (OKT3), mykofenolanu mofetilu (MMF), cyklofosfamid i inne leki immunosupresyjne, takie jak blokery sygnałowe kalcyneuryny, obejmujące lecz nie ograniczone do takrolimus (FK506). Kombinacje mogą również obejmować czynniki ukierunkowane na limfocyty T, takie jak antagoniści CD4, antagoniści CD2 i IL-12.

Dla utrzymywania integracji przeszczepu, albo w okresie następującym po zahamowaniu ostrego epizodu odrzucania przeszczepu, jeśli jest to potrzebne podawana jest podtrzymująca dawka przeciwciał przeciwko CD40L, sama albo w połączeniu z tradycyjnym czynnikiem przeciwko odrzuceniu przeszczepu. Następnie, można zmniejszyć dawkowanie, albo częstość podawania, albo obie. Gdy nie ma objawów odrzucenia przeszczepu leczenie można przerwać z nieprzerwanym monitorowaniem objawów odrzucenia przeszczepu. W innych przypadkach, określanych przez lekarza, można podawać leczenie okresowe, na przykład w odstępach czterotygodniowych albo dłuższych. Biorcy mogą jednakże wymagać przerywanego leczenia w długim okresie czasu w razie nawrotu objawów choroby. Formulacja

Generalnie, związki są zawieszane, rozpuszczane albo poddawane dyspersji w farmaceutyczne dopuszczalnych nośnikach albo zaróbkach. Powstała kompozycja terapeutyczna nie wpływa ujemnie na homeostazę biorcy, szczególnie na równowagę elektrolitową. Tak, więc przykładowy nośnik obejmuje normalną sól fizjologiczną (0,15 M NaCl, pH 7,0 do 7,4). Inne dopuszczalne nośniki są dobrze znane w stanie techniki i opisane, na przykład w Remington Pharmaceutical Science, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., 1990. Dopuszczalne nośniki mogą obejmować biokompatybilne, obojętne albo

PL 192 521 B1 bioadsorbowane sole, czynniki buforujące, oligo- albo polisacharydy, polimery, czynniki poprawiające lepkość, konserwanty i podobne.

Związek przeciwko CD40L stosowany w rozwiązaniach według wynalazku jest podawany w farmaceutycznie skutecznej albo terapeutycznie skutecznej ilości, która jest ilością wystarczają c ą do wytworzenia wykrywalnego, korzystnie klinicznie dobroczynnego efektu u biorcy z ryzykiem, albo dotkniętego odrzuceniem przeszczepu. Medycznie dobroczynne wpływy mogą obejmować zapobieganie, opóźnienie albo złagodzenie pogarszania, albo wykrywalną poprawę, stanu klinicznego biorcy. Przykładowo, wskazania stanu przeszczepu allogenicznego nerki albo przeszczepu ksenogenicznego, funkcja nerek i stan zdrowia monitorowano jednym albo więcej rutynowymi testami laboratoryjnymi, mierzącymi stężenia istotnych substancji we krwi i moczu, inne badania moczu, albo współczynniki oczyszczania różnych substancji z krwi do moczu. Parametry mierzone w tych testach, zarówno pojedyncze, jak i w kombinacji, mogą być stosowane przez lekarza do oceny funkcji nerek albo uszkodzenia nerek. Przykłady takich parametrów obejmują stężenie mocznika, kreatyniny albo białka we krwi; stężenie białka we krwi albo różnych komórek krwi, takich jak erytrocyty, albo leukocyty, ciężar właściwy moczu; ilość moczu; klirens inuliny, kreatyniny, mocznika albo kwasu para-aminohipurowego; i obecności nadciś nienia albo obrzęków.

Swoistym przykładem klinicznego zastosowania rozwiązań według wynalazku jest podawanie okołooperacyjne Mab przeciwko CD40L (np. hu5c8) u biorców nerek albo u biorców wykazujących objawy odrzucania przeszczepu. Ostre odrzucanie przeszczepu allogenicznego nerki może być manifestowanie przez wiele wskaźników, w tym wzrost kreatyniny w surowicy, albo azotu mocznika we krwi, zmniejszenie wydalania moczu, rozwój białkomoczu i/lub krwiomoczu, albo innych wskaźników odrzucania przeszczepu. Wielkość i czas leczenia immunomodulującego powinien być wystarczający do wytworzenia klinicznie korzystnych zmian jednego lub więcej z tych składników. Przykładowy czas i schemat dawkowania został przedstawiony w dobrze udowodnionych badaniach zawartych tutaj. Pomimo, tego że terapia w pierwszym rzędzie obejmuje podawanie przerywacza wiązania CD40:CD154 (przykładem jest hu5c8) dożylnie jako terapię bolusem w ilości powyżej 50 mg/kg, po czym następuje odpowiedni schemat kolejnego podawania (tj. codzienne dożylne albo podskórne wstrzyknięcia), przez co najmniej 2 tygodnie następujące po rozpoczęciu terapii, albo aż do wystąpienia objawów pożądanych, korzystnych zmian wskaźników odrzucenia przeszczepu albo niewydolności.

W innym przykładzie, dla biorców z objawami odrzucenia innego narządu, można podawać związek przeciwko CD40L w sposób podobny do opisanego powyżej. Na przykład, ostre odrzucenie przeszczepionej wątroby prowadzi do żółtaczki (hiperbilirubinemii), zapalenia wątroby (podwyższone poziomy aminotransferaz), koagulopatii i encefalopatii.

Przedkliniczne układy modelowe do oceny schematów leczenia przerywaczy CD40:CD154

Korzystnym, przykładowym układem modelowym do badania skuteczności związku przerywającego CD40:CD154 (np. związek przeciwko CD40L, takie jak mAb 5c8) jest model przeszczepu allograficznego nerki naczelnych ujawniony w wcześniejszym, pokrewnym zgłoszeniu amerykańskim S.N. 60/049,389 (06/11/97) i u Kirk'a i in., (1997), 94 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8789-8794, oba włączone tu przez odnośniki. Wykazano wielokrotnie, że niniejszy model małpy rezus jest dokładnym testem manipulacji immunologicznej, który jest wyjątkowo wrażliwy na nawet niewielkie zmiany funkcji przeszczepu allogenicznego albo na objawy uboczne wpływające na gojenie ran u biorcy i funkcjonowanie układu odpornościowego. Dodatkowo, są oczywiste podobieństwa do przeszczepu nerki u ludzi. Szczególnie, geny kodujące białka MHC są dobrze zakonserwowane pomiędzy małpami rezus, a ludźmi i ich odrzucenie unaczynionych narządów jest analogicznie, co widać klinicznie.

Będzie można łatwo ocenić, że ten układ modelowy jest przydatny do oceny przeszczepów obejmujących tkanki nerki. Inne znane w stanie techniki przedkliniczne układy modelowe, korzystnie u naczelnych, są przydatne do oceny skutecznoś ci przeszczepów innych rodzajów tkanek, takich jak wątroba, serce, płuco, trzustka, wysepka trzustkowa, skóra, obwodowy albo ośrodkowy nerw, albo inne tkanki, albo rodzaje organów.

Materiały i metody Reagenty

Ludzkie CTLA4-lg i kontrolne białko fuzyjne IgGl wytworzono, jak to opisano uprzednio i otrzymano w roztworze z Genetics Institute, Cambridge, MA. Przeciwciało przeciwko ligandowi CD40, humanizowane 5c8, wytworzono jak to opisano uprzednio i otrzymano w roztworze z Biogen Corporation, Cambridge, MN. Chomicze przeciwciało monoklonalne przeciwko mysim CD28, PV-1 (IgG1, klon G62) oczyszczono z nadsączy hodowli hybrydoma i zastosowano jako kontrola izotypu.

PL 192 521 B1

Typowanie MHC i selekcja dawca/biorca

Kombinacje dawca-biorca i zwierzęta wybrane do badania z użyciem komórek wyselekcjonowano na podstawie różności genetycznej w obrębie MHC klasy I i II. Odmienność klasy I określono na podstawie jednowymiarowego ogniskowania izoelektrycznego jak to opisano uprzednio. Odmienność klasy II określono w oparciu o wyniki jednokierunkowej reakcji mieszanych limfocytów (MLR). Oprócz tego, loci DRB zwierząt sprawdzono przez elektorforezę na denaturujących żelach z gradientem i bezpośrednie sekwencjonowanie drugiego egzonu DRB, jak to opisano uprzednio. Gwałtowną reakcją limfocytów T biorcy przeciwko dawcy potwierdzono in vitro dla wszystkich par biorca-dawca. Doświadczenie opisane tu przeprowadzono w oparciu o zasady zawarte w „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, DHHS, nr. publ. NLH) 86-23(1985).

Analiza komórkowa in vitro

Jednokierunkową MLR przeprowadzono u wszystkich zwierząt przed przeszczepieniem oraz u zwierzą t, które przeż ył y z przeszczepem ponad 100 dni. Każde ze zwierzą t badano wzglę dem każ dego z potencjalnych dawców w celu ustalenia najsilniejszej reakcji do przeszczepienia. Komórki reagujące (3x10⁵) inkubowano z napromieniowanymi komórkami pobudzającymi (1x10⁵) w 37°C przez dni. Komórki znakowano pulsem ³H-tymidyny, poczym ś ledzono wbudowywanie ³H-tymidyny. Pobudzanie poliklonalne wywołane konkanawaliną (25 μg/ml) służyło jako kontrola pozytywna. Wskaźnik pobudzenia obliczono przez normalizację na samoreaktywność, która we wszystkich przypadkach była niemal równa z tłem. Do badania reakcji na dawkę, CTLA4-Ig albo humanizowane 5c8 dodawano do MLR w dniu 1 w stężeniach w zakresie od 100 μg/ml do 0,01 μg/ml. Skojarzone leczenie przeprowadzano przez zmienianie stężenia CTLA4-Ig i utrzymywanie stężenia humanizowanego 5c8 na poziomie 50 μg/ml.

Analizę fenotypową limfocytów krwi obwodowej przeprowadzono przed przeszczepieniem, oraz okresowo podczas i po terapii. Testy badały 0,2 ml heparynizowanej krwi pełnej rozcieńczonej PBS i 1% surowicą płodową cielęcą. Przeciwciała monoklonalne T11, B1 (Coulter) i FN18 (dar dr Davida M. Neville, Jr) znakowane FITC zastosowano w celu określenia odsetków komórek, odpowiednio, CD2 (limfocyty T/limfocyty NK), CD20 (limfocyty B) i CD3 (limfocyty T). Krwinki czerwone usunięto przez zastosowanie buforu ACK (0,15 M NH4C1, 1,0 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,3) po barwieniu. Komórki poddano cytometrii przepływowej od razu albo po utrwaleniu 1% paraformaldehydem. Cytometrię przepływową przeprowadzono przy użyciu FACScan Becton Dickinson.

Przeszczepy allogeniczne nerki

Przeszczepienie allogenicznej nerki przeprowadzono jak to opisano uprzednio. Pokrótce, niewsobne, młode (1 do 3 lat) małpy rezus, seronegatywne pod względem małpiego wirusa niedoboru odporności, małpiego retrowirusa i wirusa herpes B, otrzymano z Primate Center (Univbersity of Wisconsin) albo LABS (Yemassee, SC). Procedurę przeprowadzono w znieczuleniu ogólnym przy użyciu ketaminy (1 mg/kg, i.m.), ksylazyny (1 mg/kg, i.m.) i halotanu (1%, wziewnie). Przeszczepienie przeprowadzono pomiędzy parami genetycznie różnych biorców-dawców, których określono typowaniem MHC opisanym wyżej. Zwierzęta heparynizowano podczas pobierania narządów i wszczepiania (100 jedn./kg). Przeszczepy allogeniczne wszczepiano stosując standardowe techniki mikronaczyniowe, tworząc połączenie naczyniowe „koniec do boku pomiędzy tętnicą nerkową dawcy i dystalnym odcinkiem aorty biorcy, oraz żyłą nerkową dawcy i żyłą czczą biorcy. Wytworzono pierwotną ureteroneocystotomię. Przed zaszyciem wykonano obustronną natywną neplirektomię.

Zwierzęta traktowano płynami dożylnymi przez około 36 godzin do uzyskania przyjmowania płynów doustnie. Trimethaprim-sulfa podawano przez 3 dni w celu profilaktyki antybiotykowej. Wszystkie zwierzęta otrzymały 81 mg aspiryny w dniu przeszczepu. Konieczność analgezji oceniano indywidualnie i podawano domięśniowo butophanol. Zwierzęta ważono co tydzień. Szwy skórne zdjęto między 7 i 10 dniem. CTLA4-Ig albo humanizowane 5c8 podawano dożylnie w dawkach i schematach różniących się w zależności od zgromadzonego doświadczenia dotyczącego danego czynnika. Nie podawano innych immunofarmaceutyków. Codziennie badano poziom kreatyniny w surowicy i elektrolity w krwi pełnej Na⁺, K⁺, Ca²⁺ oraz poziom hemoglobiny do momentu ustabilizowania się wyników, a następnie co tydzień.

Analiza patologiczna

Biopsje przeprowadzono na zwierzętach podejrzewanych o odrzucanie przeszczepu stosując igłę wielkości 20 Gauge (Biopty-Cut, Bard). Przeprowadzano standardowe barwienie HE na zamrożonych albo utrwalonych formaliną tkankach, w celu potwierdzenia rozpoznania odrzucenia. Zwierzęta

PL 192 521 B1 zabijano w momencie anurii albo jeżeli utrata ciężaru ciała przekroczyła 15% ciężaru ciała przed przeszczepieniem, zgodnie ze standardami AAALAC. Wszystkie zwierzęta poddano badaniu sekcyjnemu i histopatologicznemu w momencie śmierci.

Wyniki

Zarówno CTLA4-Ig jak i humanizowane 5c8 hamowały MLR rezusów w sposób zależny od dawki. Jednakże, CTLA4-Ig było bardziej skuteczne niż humanizowane 5c8 jako pojedynczy czynnik w zapobieganiu proliferacji limfocytów T. Zasadnicze zmniejszenie wbudowywania tymidyny obserwowano dla stężenia CTLA4-Ig równego 0,1 μg/ml i dalsze zahamowanie uzyskano wraz ze wzrostem stężenia. Umiarkowane zahamowanie uzyskano przy użyciu humanizowanego 5c8 w stężeniu 0,01 μg/ml, ale zahamowanie to nie polepszało się zasadniczo ze wzrostem stężenia. Przy badaniu w kombinacji, oba czynniki hamowały proliferację około 100-krotnie skuteczniej niż każdy z czynników pojedynczo. Badania zależności od dawki powtórzono w 3 osobnych badaniach z identycznymi wynikami. CTLA4-Ig i humanizowane 5c8 zapobiegały synergistycznie odrzuceniu przeszczepu allogenicznego in vivo.

Przeprowadzono 12 przeszczepów. 4 zwierzęta otrzymały przeszczepy bez interwencji immunologicznej. Zwierzęta te odrzuciły przeszczepy w dniach 5, 7, 7 i 8. Badanie histologiczne wykazało ostre komórkowe odrzucenie charakteryzujące się rozproszonym limfocytarnym naciekiem śródmiąższowym i kanalikowym z obrzękiem i martwicą komórkową. Jedno ze zwierząt otrzymało 5-dniowe leczenie CTLA4-Ig (10 mg/kg/dzień) rozpoczęte w dniu przeszczepienia i utrzymało przeszczep przez 20 dni. Odrzucenie przeszczepu nastąpiło na skutek nacieku komórkowego identycznego jak u zwierząt kontrolnych. Jedno ze zwierząt leczono CTLA4-Ig 20 mg/kg w dniu przeszczepienia, a następnie przez 12 dni po 10 mg/kg codziennie i odrzuciło przeszczep po 30 dniach. Ponownie odrzucenie przeszczepu nastąpiło na skutek nacieku komórkowego identycznego jak u zwierząt kontrolnych. Ekstrapolując z uprzednio publikowanych prac na heterotopowych przeszczepach allogenicznych serca u szczurów, podawano dwukrotne przetoczenie limfocytów pochodzących z węzłów chłonnych dawców (10⁸) w czasie przeszczepienia 2 spośród zwierząt.

zwierzęta leczono samym humanizowanym 5c8. Oba zwierzęta otrzymywały 20 mg/kg codziennie począwszy od dnia przeszczepu i przez 14 dni po operacji (w sumie 8 dawek). Oba zwierzęta odrzuciły przeszczep po dłuższym czasie, jakkolwiek przemijające podwyższenie poziomu kreatyniny zarejestrowano podczas drugiego i czwartego tygodnia po operacji. Oba zwierzęta odrzuciły przeszczep w 95 i 100 dniu po przeszczepieniu. Przeprowadzono biopsję u obu zwierząt w celu potwierdzenia diagnozy. Oba zwierzęta ponownie leczono 7 dawkami humanizowanego 5c8 (20 mg/kg; jedno ze zwierząt codziennie, drugie co dwa dni) i oba powróciły do normalnych funkcji nerek bez objawów niepożądanych. Pozostały żywe i w dobrej kondycji ponad 150 dni po przeszczepieniu.

zwierzęta otrzymały po 20 mg/kg CTLA4-Ig i humanizowanego 5c8 po przeszczepieniu. Ponownie, leki podawano codziennie począwszy od dnia przeszczepienia i przez 14 dni po operacji. Jedne ze zwierząt odrzuciło przeszczep w 32 dni po zabiegu, drugie ze zwierząt utrzymało przeszczep przez 100 dni, ale podobnie jako zwierzęta leczone humanizowanym 5c8 odrzuciło przeszczep po tym czasie. Podobnie, biopsja wykazała ostre odrzucenie komórkowe. Początkowy schemat CTLA4-Ig i humanizowanego 5c8 powtórzono i poziom kreatyniny u zwierząt powrócił do poziomu wyjściowego (1,0). Analiza MLR po tym leczeniu wykazała swoistą wobec dawcy utratę reaktywności. Reaktywność na pozostałe antygeny pozostała utrzymana. W 165 dni po przeszczepie, zwierzęta zabito czego wymagał protokół utraty ciężaru ciała. Funkcja przeszczepu w tym momencie pozostała normalna. Podczas sekcji, stwierdzono, że zwierzęta mają zapalenie jelit spowodowane Shigella i Campylobacter, powszechne zakażenie u małp rezus. Choroba ta rozszerzyła się na wiele zwierząt w oryginalnej hodowli, w tym na zwierzęta nieleczone. Nie stwierdzono innych nieprawidłowości, zwłaszcza nie występowały objawy choroby limfoproliferacyjnej albo zakażeń oportunistycznych. Histologicznie, przeszczep zawierał ogniska limfocytów w śródmiąższu, ale nie występowały objawy nacieku kanalikowego, uszkodzenia kłębuszków i martwicy śródmiąższu.

Podobnie jak zwierzęta leczone samym humanizowanym 5c8, oba zwierzęta wykazywały przemijający wzrost poziomu kreatyniny w połączeniu ze wzrostem wielkości przeszczepu podczas 4 tygodni po operacji. Podejrzewa się, że obrzęk przeszczepu odzwierciedlał drugą falę nacieku limfocytarnego, co spowodowało zmianę schematu dawkowania w taki sposób, że oba składniki podawano w dniu przeszczepu i w dniach 2, 4, 6, 8, 12, 16 i 28 po zabiegu.

Dwoje zwierząt leczono zmodyfikowanym schematem. Oba zwierzęta nie odrzuciły przeszczepu, jak również nie doświadczyły zaburzeń albo zmian w funkcjonowaniu nerek przez ponad 150 dni.

PL 192 521 B1

Po 100 dniach przeżycia bez odrzucenia, MLR powtórzono ponownie z użyciem komórek dawcy i komórek postronnych. Nie obserwowano zmian w reaktywnoś ci in vitro. Badania te powtórzono po 150 dniach przeżycia z podobnymi wynikami. Oba zwierzęta utrzymywały gwałtowną reakcję przeciw gospodarzowi i komórkom postronnym in vitro, ale nie odrzucały przeszczepu allogenicznego. Żadne ze zwierząt nie wykazywało toksyczności spowodowanej leczeniem. Konkretnie, nie występowała gorączka, anoreksja, albo zaburzenia hemodynamiczne, jak również nie występowały zakażenia oportunistyczne. Zwierzęta trzymano w standardowych warunkach i miały kontakt z innymi zwierzętami w kolonii. Utrzymywa ł y normalny ciężar ciał a. Parametry laboratoryjne i hematologiczne, takie jak hemoglobina i liczba krwinek białych, pozostawały w normie. Odsetki komórek wyrażających CD2, CD3 i CD20 pozostawały niezmienne niezależnie od schematu leczenia. Konkretnie, nie obserwowano zmniejszenia liczby limfocytów T podczas i po leczeniu u jakiegokolwiek ze zwierząt.

Dalsze badania przedkliniczne z użyciem układu modelowego przeszczepu allogenicznego nerki u naczelnych

Wyżej opisany układ przeszczepu allogenicznej nerki u naczelnych zastosowano do dalszego badania różnych dodatkowych i/lub dalszych schematów leczenia opartych na zastosowaniu humanizowanych mAb 5c8 jako monoterapia, albo w kombinacji z innym czynnikiem terapeutycznym, np. CTLA4-lg, MMF, takrolimus, kortykosteroidami albo ich kombinacją. Monoterapia przeszczepu allogenicznego nerki u naczelnych

Dwa zwierzęta otrzymywały morioterapię 5c8 przy użyciu schematu indukcji i podtrzymywania w nastę pują cy sposób. Schemat indukcji obejmował podawanie 20 mg/kg 5c8 w dniu -1, 0, 3, 10 i 18, przy czym dzień 0 był dniem przeszczepienia nerki allogenicznej. Utrzymywanie obejmowało comiesięczne podawanie 20 mg/kg 5c8, począwszy od dnia 28 badania. Leczone zwierzęta utrzymywały przeszczep, co oceniono przez monitorowanie liczby podtypów limfocytów i/lub poziomu kreatyniny w dniach 170 i 163.

Dwa dodatkowe zwierzęta otrzymywały monoterapię 5c8 stosując standardowy schemat indukcji i podtrzymywania niską dawką w następujący sposób: schemat indukcji obejmował podawanie 20 mg/kg 5c8 w dniach -1, 0, 3, 10 i 18, przy czym dzień 0 był dniem przeszczepienia nerki allogenicznej. Utrzymywanie obejmowało comiesięczne podawanie 10 mg/kg 5c8, począwszy od dnia 28 badania. Leczone zwierzęta utrzymywały przeszczep do dnia, odpowiednio, 149 i 148.

Dwa dalsze zwierzęta otrzymywały monoterapię 5c8 stosując schemat indukcji niską dawką i podtrzymywania niską dawką w następujący sposób: schemat indukcji obejmował podawanie 10 mg/kg 5c8 w dniach -1, 0, 3, 10 i 18, przy czym dzień 0 był dniem przeszczepienia nerki allogenicznej. Utrzymywanie obejmowało comiesięczne podawanie 10 mg/kg 5c8, począwszy od dnia 28 badania. Leczone zwierzęta utrzymywały przeszczep do dnia, odpowiednio, 38 i 9.

Jeszcze inne dwa zwierzęta otrzymywały monoterapię 5c8 stosując schemat indukcji niską dawką i podtrzymywania niską dawką w następujący sposób: schemat indukcji obejmował podawanie 5 mg/kg 5c8 w dniach -1, 0, 3, 10 i 18, przy czym dzień 0 był dniem przeszczepienia nerki allogenicznej. Utrzymywanie obejmowało comiesięczne podawanie 5 mg/kg 5c8, począwszy od dnia 28 badania. Leczone zwierzęta utrzymywały przeszczep do dnia 7-10.

Skojarzona terapia przeszczepów allogenicznych u naczelnych

Wszystkie zwierzęta otrzymywały leczenie 5c8 stosując standardową indukcję 20 mg/kg i schemat podtrzymują cy 20 mg/kg w kombinacji z innym schematem immunosupresji w nastę pują cy sposób: 3 zwierzęta otrzymywały skojarzone leczenie obejmujące kortykosteroidy (np. metyloprednizon, przez 5 dni leczenia) i mykofenolan mofetilu (MMF; 20 mg/kg p.o. BID) w dawkach skutecznych terapeutycznie. Zwierzęta leczone utrzymywały przeszczep w dniu 143, 81 i 80. W przeciwieństwie, jedno ze zwierząt kontrolnych leczone podobnymi dawkami MMF i krtykosteroidami bez leczenia 5c8 odrzuciło przeszczep w dniu 7.

Dwa dodatkowe zwierzęta otrzymały leczenie skojarzone obejmujące takrolimus (dawniej FK506) w dawce skutecznej terapeutycznie (1,5-2 mg/kg p.o. BID w roztworze 10 ng/ml). Te zwierzęta utrzymywały przeszczep w dniu, odpowiednio, 31 i 36.

Dwa dalsze zwierzęta otrzymywały terapię skojarzoną obejmującą CTLA4-Ig w dawce skutecznej terapeutycznie. Te zwierzęta utrzymywały przeszczep w dniach 122 i 3.

Wnioski oparte na badaniach modeli przedklinicznych.

Wyżej opisane wyniki podsumowując wskazują, że indukcja integracji przeszczepu samym humanizowanym 5c8 jako przerywaczem wiązania CD40:CD154 może prowadzić do długotrwałego przeżycia przeszczepionej tkanki. Efekty humanizowanego 5c8 działają synergistycznie w kombinacji

PL 192 521 B1 przerywaczem sygnalizacji CD28, CTLA4-Ig, i są zgodne z dobrze znanymi środkami immunosupresyjnymi i/lub immunomodulacyjnymi.

Ekwiwalenty

Wynalazek można przeprowadzić w innej postaci bez oddalania się od ducha albo jego zasadniczej charakterystyki. Powyższe wykonania są uwzględniane jako ilustratywne, nie zaś ograniczające do ujawnionego wynalazku. Zakres wynalazku jest więc określony dołączonymi zastrzeżeniami, a nie opisem wynalazku, zaś wszystkie zmiany objęte pojęciem ekwiwalentów są objęte zakresem zastrzeżeń.

Claims (31)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do

   a) hamownia odrzucania przeszczepu tkankowego przez biorcę przeszczepu będącego naczelnym

   b) odwracania ostrego odrzucania przeszczepionej tkanki przez biorcę będącego naczelnym

   c) przedłużania przeżycia przeszczepionej tkanki u biorcy będącego naczelnym

   d) osłabiania powikłań immunologicznych niepowodzenia przeszczepienia tkanki u biorcy będącego naczelnym.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przerywacz wiązania CD40:CD154 jest związkiem o aktywności anty-CD40L (anty-CD154).
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że związkiem o aktywności anty-CD40L jest przeciwciało monoklonalne.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne wiąże się z antygenem 5c8.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne wykazuje antygenowe swoiste właściwości wiązania przeciwciała 5c8 wytwarzanego przez depozyt o nr dostępu

   ATCC HB 10916.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że związek anty-CD40L jest wybrany z grupy składającej się z: fragmentów Fab, związków F(ab')2, regionów VH oraz przeciwciał jednołańcuchowych.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeszczepiona tkanka jest wybrana spośród tkanki nerkowej, wątrobowej, sercowej, trzustkowej, skórnej, naczyniowej, kostnej i chrzestnej.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeszczepiona tkanka jest allogeniczna względem biorcy przeszczepu będącego naczelnym; lub przeszczepiona tkanka jest ksenogeniczna względem biorcy przeszczepu będącego naczelnym.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeszczepiona tkanka składa się z wyizolowanych lub zawieszonych komórek.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że wyizolowane lub zawieszone komórki są wybrane z grupy składającej się z: (a) obwodowych komórek krwi; i (b) komórek szpiku kostnego lub ich dowolnego składnika hematopoetycznego.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania ze związkiem immunosupresyjnym albo immunomodulującym.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że związkiem immunosupresyjnym albo immunomodulującym jest czynnik przerywający ko-stymulującą sygnalizację limfocytów T przez CD28; albo czynnik przerywający sygnalizację kalcyneuryny.
13. 13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że związek immunosupresyjny albo immunomodulujący jest wybrany spośród kortykosteroidu, środka antyproliferacyjnego, cyklosporyny, takrolimusa, sirolimusa, mykofenolanu mofetylu, mizorubiny, dezoksyspergualiny, soli sodowej brekwinaru, leflunomidu i azaspiranu.
14. 14. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że naczelny jest człowiekiem.
15. 15. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania biorcy przeszczepu sposobem wybranym z grupy składającej się z (a) drogi pozajelitowej;

    (b) biokompatybilnego lub bioerodującego implantu o przedłużonym uwalnianiu;

    (c) wszczepienia pompy infuzyjnej;

    PL 192 521 B1 (d) podawania doustnego lub jelitowego; oraz (e) podawania miejscowego.
16. 16. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania dawcy przeszczepu lub do przeszczepianej tkanki przed jej integracją u biorcy przeszczepu będącego naczelnym
17. 17. Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do hamownia odrzucania przeszczepu tkankowego przez biorcę przeszczepu będącego naczelnym, przeznaczonego do podawania w skutecznej ilości biorcy przeszczepu będącego naczelnym:

    a) w 2, 4, 6, 8, 12, 16 i 28 dniu, licząc od dnia wszczepienia przeszczepu temu naczelnemu; lub b) dzień przed przeszczepieniem przeszczepu tkankowego, następnie w dniu przeszczepu równocześnie z wszczepianiem przeszczepu tkankowego, oraz w 3, 10, 18 i 28 dniu, licząc od dnia wszczepienia przeszczepu temu naczelnemu.
18. 18. Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do odwracania ostrego odrzucania przeszczepionej tkanki u biorcy przeszczepu będącego naczelnym, przy czym lek jest przeznaczony do podawania w dniu, w którym wykazuje on objawy ostrego odrzucania przeszczepu oraz później w 3, 10, 18 i 28 dniu.
19. 19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do wielokrotnego podawania w reżimie miesięcznym, począwszy miesiąc po 28 dniu, licząc od dnia wszczepienia.
20. 20. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania biorcy w reżimie miesięcznym, począwszy miesiąc po 28 dniu od wystąpienia objawów ostrego odrzucenia przeszczepu.
21. 21. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że przerywacz wiązania CD40:CD154 jest związkiem o aktywności anty-CD40L (anty-CD154).
22. 22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że związkiem o aktywności anty-CD40L jest przeciwciało monoklonalne.
23. 23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne wiąże się z antygenem 5c8.
24. 24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne wykazuje antygenowe swoiste właściwości wiązania przeciwciała 5c8 wytwarzanego przez depozyt o nr dostępu ATCC HB 10916.
25. 25. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że naczelny jest człowiekiem.
26. 26. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że przerywacz wiązania CD40:CD154 jest związkiem o aktywności anty-CD40L (anty-CD154).
27. 27. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że związkiem o aktywności anty-CD40L jest przeciwciało monoklonalne.
28. 28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne wiąże się z antygenem 5c8.
29. 29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne wykazuje antygenowe swoiste właściwości wiązania przeciwciała 5c8 wytwarzanego przez depozyt o nr dostępu ATCC HB 10916.
30. 30. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że naczelny jest człowiekiem.
31. 31. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje przeciwciało monoklonalne lub jego fragment wykazujące antygenowe swoiste właściwości wiązania jak przeciwciało 5c8 wytwarzane przez depozyt o nr dostę pu ATCC HB 10916; oraz immunosupresyjny albo immunomodulacyjny zwi ą zek wybrany z grupy skł adają cej się z (a) czynnika przerywającego ko-stymulującą sygnalizację limfocytów T przez CD28;

    (b) czynnika przerywającego sygnalizację kalcyneuryny;

    (c) kortykosteroidu lub środka antyproliferacyjnego; lub (d) takrolimusa, sirolimusa, mykofenolanu mofetylu, mizorubiny, dezoksyspergualiny, soli sodowej brekwinaru, leflunomidu i azaspiranu.