EA002549B1 - Применение блокатора связывания cd40:cd154 для предотвращения противоадаптивных иммунных реакций, в частности отторжения трансплантата - Google Patents

Abstract

С помощью композиций и способов, представленных в описании, обнаруживают, что отторжение тканевого трансплантата можно затормозить при применении прерывателя связывания CD40:CD154 самого по себе или в комбинации с другим иммуномодулятором или иммуносупрессором. При благоприятном исходе обладающая синергическим действием комбинация состоит из прерывателя связывания CD40:CD154 и прерывателя сигналирования через CD28. Типичным прерывателем связывания CD40:CD154 является анти-CD154 моноклональное антитело, такое как антитело, имеющее специфические для антигена характеристики связывания 5с8 моноклонального антитела. Типичным прерывателем сигналирования через CD28 является CTLA4-Ig слитый белок. Описанные композиции и способы можно применять с целью продления выживания трансплантированной ткани у реципиента, реверсии острого отторжения трансплантата и ослабления иммунологических последствий несостоятельности трансплантированной ткани.

Description

Смежные заявки

Данная заявка является отчасти продолжением заявки на предварительный патент, поданной 12 мая 1998 (Эоске! Νο. А053Р; Ехртезз Май ЬаЬе1 Νο. ЕМ046582947И8), а также частично продолжением заявки на предварительный патент США 8.Ν. 60/046791, поданной 17 мая 1997,и заявки на предварительный патент США 8.Ν. 60/049389, поданной 11 июня 1997. В данном описании заявители ссылаются на основные положения всех трех ранее зарегистрированных патентных заявок.

Изобретение относится в целом к супрессии нежелательных иммунных реакций, в частности, противоадаптивных иммунных, опосредованных Т-лимфоцитами. Изобретение относится, в частности, к предотвращению, лечению, супрессии или отмене вызванного иммунной системой отторжения трансплантированной ткани или трансплантированного органа у реципиента-хозяина.

Предпосылки к созданию изобретения

Трансплантация органа между генетически неидентичными особями неизменно приводит к иммунологическому отторжению органа посредством зависимого от Т-клеток механизма, если только этот процесс отторжения не сдерживать введением лекарственных средств, подавляющих функцию Т-клеток. В нескольких патентах США представлено применение подобных иммуносупрессорных лекарственных средств для торможения отторжения трансплантата, включая патенты США № 5104858; 5008246 и 5068323. Другие принятые агенты описаны у 8и111ап11пгап е! а1. (1994), 331 Хеи Епд. Меб. 1., 365-376. В клинике используются как ингибиторы кальцийнейринфосфатазы, так и глюкокортикостероиды, и оба типа соединений предотвращают вызванную Т-клетками выработку активированных цитокинов, особенно ГЬ-2. Однако терапия с помощью этих типов стандартных агентов оказывается недостаточной. Оба типа действуют путем ослабления сигналов, передаваемых через рецептор антигенов Т-клеток (ТСК), единственный медиатор антигенной специфичности Т-клеток, и действуют на все Т-клетки без разбора. Кроме того, действие этих лекарственных средств является непродолжительным, так что прекращение лечения обычно приводит к потере трансплантата. Таким образом, чтобы поддержать жизнеспособную функциональную интеграцию трансплантата, реципиенты должны испытать на себе последствия долгосрочной, неспецифической иммуносупрессии. Эти последствия включают в себя повышенный риск инфекции и злокачественного развития, а также значительную стоимость и токсичность.

Таким образом, существует потребность улучшенного или более эффективного иммуносупрессорного или иммуномодулирующего лечения реципиентов трансплантата. В частности, существует необходимость лечения, не требующего пан-Т-клеточной иммуносупрессии, т. е. лечения, которое ослабляет восприимчивость реципиента к злокачественному развитию или сопутствующей инфекции. По существу, назрела потребность в лечении, оказывающем меньшую токсичность, чем оказывают имеющиеся в настоящее время терапевтические агенты. Также имеется потребность в лечении, которое способствует продолжительной функциональной интеграции трансплантата, т.е. интеграции, которая сохраняется после окончания курса лечения.

Объектом изобретения является обеспечение иммуномодулирующего агента, который ослабляет противоадаптивные реакции Т-клеток без необходимости применения пан-Тклеточной иммуносупрессии. Другим объектом изобретения является обеспечение иммуномодулирующего агента, который способствует функциональной интеграции тканевого трансплантата в реципиента-хозяина. Еще одним объектом изобретения является получение иммуномодулирующего агента, который блокирует передачу костимулирующего сигнала активированным Т-клеткам. Особым предметом является получение блокатора связывания СЭ40:СЭ154 для применения в терапии, особенно для применения в терапии с целью ослабления или торможения иммунологического отторжения ткани трансплантата.

Другим особым объектом изобретения является получение терапевтической композиции и установление курса лечения с целью ослабления противоадаптивных иммунных реакций, опосредованных Т-клетками, основанных на применении блокатора связывания СЭ40:СЭ154 в сочетании с другим иммуносупрессором или иммуномодулятором. Таким образом, особым объектом изобретения является получение терапевтической композиции и установление курса лечения, основанных на применении блокатора связывания СЭ40:СЭ154 в сочетании с агентом, который блокирует костимуляцию через СЭ28. В общем, объектом изобретения является получение терапевтической композиции и установление курса лечения с целью торможения, смягчения, ослабления или отмены недостаточности или острого отторжения ткани трансплантата. Кроме того, главным объектом изобретения является повышение жизнеспособности тканевых трансплантатов путем обеспечения иммуномодулирующих композиций, которые способствуют функциональной интеграции аллогенной или ксеногенной ткани в организм реципиентахозяина. Кроме того, главным аспектом изобретения является предотвращение, смягчение, ослабление или лечение болезненных состояний, являющихся результатом противоадаптивных иммунных реакций, включая аутоиммунные заболевания, вызванные Т-лимфоцитами (например, инсулинзависимый сахарный диабет, рассеянный склероз и тому подобное), а также аллергические заболевания.

Настоящее изобретение основывается на обнаружении того факта, что применение блокатора связывания СО40:СО154 самого по себе или в сочетании с другим иммуномодулирующим агентом ослабляет, подавляет, предотвращает, тормозит или отменяет отторжение пересаженной ткани, вызванное противоадаптивной иммунной системой реципиента, не требуя пансупрессии иммунной системы реципиента. Таким образом, изобретение относится к способам и композициям для иммуномодулирующей терапии реципиентов трансплантируемой ткани. Первый способ заключается в торможении отторжения тканевого трансплантата реципиентом трансплантата с помощью лечения этого реципиента блокатором связывания СЭ40:СЭ154 (СО40Ь). Настоящим блокатором связывания является любой агент, который прекращает связывание костимулирующей молекулы (здесь, лиганд СЭ40. также известный как антиген 5с8; С0400 СО 154 и также известный в этой области как др39) с ее противорецептором или распознающим рецептором (здесь, СО40). Предпочтительно блокатором связывания является соединение анти-СО40Ь, которое связывается с СО40Й (СЭ154) и тем самым блокирует, создает препятствие или разрушает способность СО40Ь связываться с СО40. Примером соединения анти-СО40Ь является моноклональное антитело, в частности антитело, имеющее специфические для антигена характеристики связывания 5с8 антитела, описанного в Патенте США № 5474771, данные о котором упоминаются здесь в виде ссылки.

Второй способ заключается в продлении жизни тканевого трансплантата у реципиента трансплантата посредством лечения этого реципиента блокатором связывания ί.Ό40:ί.Ό154. предпочтительно моноклональным антителом анти-СЭ40Ь. Третий способ заключается в ослаблении иммунологических осложнений, возникших из-за неудачи пересадки ткани, посредством лечения реципиента трансплантата блокатором связывания 0040:00154, предпочтительно моноклональным антителом анти-СО40Ь. То есть способ заключается в торможении, супрессии, ослаблении или в значительном уменьшении подобных иммунологических осложнений. В частности, способ заключается в устранении или ослаблении осложнений, таких как интерстициальный фиброз, хронический атеросклероз трансплантата, васкулит и тому подобное.

Таким образом, приведенные выше способы являются эффективными для лечения острого и/или хронического отторжения тканевого трансплантата и могут быть применены в целях профилактики для послеоперационного лечения или для отмены или супрессии отторжения трансплантата в любое время в течение жизни реципиента. Типичный способ состоит из вве дения блокатора связывания СО40: СО154 на 2ой, 4, 6, 8, 12, 16 и 28 дни после операции. В общем, описанные способы включают в себя введение блокатора связывания при желаемых интервалах времени (ежедневно, два раза в неделю, еженедельно или раз в две недели) в течение, по меньшей мере, двух- или трехнедельного периода. График введения устанавливается по необходимости таким образом, чтобы достичь определенного снижения показателей противоадаптивных иммунных реакции, в частности, показателей отторжения трансплантата. Данный курс лечения может быть повторен при последующем отторжении трансплантата. В тех случаях, когда блокатором связывания является моноклональное антитело анти-СО40Ь, блокатор вводится в дозах приблизительно между 5 мг/кг веса тела и 20 мг/кг веса тела.

С целью лечения блокатор связывания С040:С0154 может входить в состав терапевтической композиции, которая включает в себя терапевтически эффективное количество блокатора связывания, диспергированного в фармацевтически приемлемом носителе. В некоторых аспектах терапевтическая композиция может также включать в себя терапевтически эффективное количество другого иммуносупрессивного или иммуномодулирующего соединения, включая без ограничений: агент, прерывающий костимулирующее сигналирование Тклеток через СО28 (например, СТЬЛ41д); агент, который прерывает сигналирование с участием кальцинейрина (например, циклоспорин, макролид, такой как такролимус, известный как РК506); кортикостероид или антипролиферативный агент (например, азатиоприн). Другие терапевтически эффективные соединения, подходящие для использования вместе с данным прерывателем связывания С040:С0154, включают сиролимус (известный как рапамицин); микофенолат мофетила (ММГ), мизорибин, дезоксиспергвалин, бреквинар натрия, лефлуномид, азаспиран и тому подобное.

Способы и композиции согласно изобретению являются подходящими для использования со всеми типами процедур по трансплантации. Таким образом, изобретение является подходящим для применения в тех случаях, когда реципиент трансплантата (реципиент-хозяин) является млекопитающим животным, предпочтительно приматом, самое предпочтительное человеком. Донор трансплантата может быть несингенным членом такого же филогенетического вида, как и реципиент трансплантата (т. е., аллогенный донор, дающий аллогенный трансплантат) или членом другого филогенетического вида (т.е., ксеногенный донор, дающий ксеногенный трансплантат). Если в качестве источника трансплантата ткани используют ксеногенный донор, то предпочтительным является донор, который относительно гистосовместим (МНС-совместимый) с реципиентом; например, павиан или шимпанзе будут предпочтительными донорами трансплантируемой в человека ткани. Изобретение можно применять для того, чтобы способствовать приживлению любой ткани тела или органа, является ли ткань донора (трансплантат) целым органом, срезом или частью органа или ткани или изолированными клетками. Неограничивающие примеры подходящих тканей включают в себя ткани почек, печени, сердца, поджелудочной железы (например, островки Лангерганса), кожи, сосудов, нервов, костей, хрящей и подобные ткани тела млекопитающих.

В данном описании основные принципы настоящего изобретения обоснованы путем тестирования в соответствующей предклинической модели. Типичный блокатор связывания СИ40:СИ154 (анти-СИ40Ь моноклональное антитело 5с8) испытывали как сам по себе, так и в комбинации с другими типичными иммуномодуляторами (блокатор) связывания СИ28СТЬА4-1д; микофенолат мофетила кортикостероиды; такролимус) на лейкоцитах периферической крови макак резус ίη νίίτο и на макаках резус, которым первоначально трансплантировали васкуляризированные почечные аллотрансплантаты.

Перечисленные выше и другие аспекты, характеристики и преимущества настоящего изобретения, а также само по себе изобретение будут более понятными благодаря последующему описанию предпочтительных аспектов.

В течение последних двадцати лет накоплены данные, показывающие, что для Тклеточной активации требуются ТСК-опосредованные сигналы, а также одновременно передача костимулирующих сигналов. Например, для продукции антитела В-лимфоцитами в ответ на белковые антигены требуется специфическое костимулирующее взаимодействие с Т-лимфоцитами. Кроме прикрепления к рецептору ТСК, взаимодействие В-клеток с Тклетками опосредуется несколькими этапами связывания лиганда с рецептором. Эти дополнительные этапы связывания включают в себя связывание СИ40 на В-клетках с СИ154 (СИ40Б) на Т-клетках. СИ40 человека является белком клеточной поверхности в 50 кД, экспрессируемым на зрелых В-клетках, а также на макрофагах и активированных эндотелиальных клетках. СИ40 принадлежит классу рецепторов, вовлеченных в запрограммированную гибель клеток, включающему в себя Рак/СИ95 и рецептор фактора некроза опухоли альфа (ΤΝΤ). СИ154 человека (СИ40Б) является мембранным гликопротеином типа II в 32 кД, гомологичным рецептору ΤΝΡ альфа, который кратковременно экспрессируется первоначально на активированных Т-клетках. Было показано, что связывание СИ40:СИ154 необходимо для всех реакций антителообразования, зависимых от Т-клеток. В частности, связывание СИ40:СИ154 обеспечивает антиапоптотические сигналы и/или сигналы, стимулирующие лимфокины.

Другой важный костимулирующий сигнал вырабатывается посредством связывания СИ28 на Т-клетках с его противорецептором СИ80 (В7-1) или СИ86 (В7-2) на антиген представляющих клетках (АРСк) и, возможно, также на паренхимных клетках. Существенно, что экспрессия СИ80 и/или СИ86 в значительной степени усиливается под действием сигналов, инициируемых связыванием СИ40 с СИ154. Дальнейшие исследования показывают, что молекула СТЬА4 (СИ 152) на Т-клетках, по-видимому, способствует снижению костимуляции и опосредованной ТСК. активации, по крайней мере, отчасти в результате конкуренции СИ28 с СИ80/СИ86 и в результате доставки единственного отрицательного сигнала к комплексу передачи сигнала ТСК.

Важность связывания СИ40:СИ154 в обеспечении зависимых от Т-клеток биологических ответов подчеркивается при развитии Х-связанного гипер-1дМ-синдрома (Х-НЮМ) у людей, у которых отсутствует функциональный СИ154. Эти индивидуумы имеют нормальные или высокие уровни 1дМ, но не продуцируют антитела 1дС. 1дА или 1дЕ. Пораженные индивидуумы страдают от повторяющейся, иногда тяжелой, бактериальной инфекции (обычно 81гер1ососсн5 рпеитошае апб НешорШик 1пПиепхае) и определенных редких паразитарных инфекций, а также от частых лимфом и рака брюшной полости. С этими клиническими проявлениями заболевания можно справиться путем внутривенной заместительной терапии иммуноглобулинами.

Эффекты Х-НЮМ моделируются на животных, представляющих собой нуллизиготы по гену, кодирующему СИ154 («нокаутированные» животные). Исследования на нуллизиготах подтверждают тот факт, что хотя В-клетки и могут продуцировать 1дМ в отсутствие связывания СИ40:СИ154, но они не способны на переключение изотипа или на нормальную выживаемость после созревания аффинности. В отсутствие функционального взаимодействия СИ40:СИ154 зародышевые центры лимфатического узла правильно не развиваются, и развитие памяти В-клеток ухудшается. Эти дефекты вносят вклад в значительное снижение или отсутствие вторичного (зрелого) антительного ответа.

Индивидуумы с Х-НЮМ и нуллизиготы СИ 154 также имеют дефекты клеточного иммунитета. Эти дефекты проявляются в повышенной частоте инфекций РпеишосукЮ саппл, Нщ1ор1а8ша сар8и1а1иш, Сгур1ососсн5 пеоГогтапк, а также хронической инфекции 61атб1а 1атЫ1. Мышиные нуллизиготы лишены способности бороться с инфекцией Ьещйташа. Многие из этих опосредованных клетками дефектов обратимы при введении 1Б-12 или ΙΡΝ-гамма. Эти данные подтверждают точку зрения, что связывание СБ40:СБ154 способствует развитию ответа Т-клеток-хелперов типа I. Дальнейшее подтверждение этому следует из наблюдений того, что активация макрофагов нарушается при возникновении дефицита СБ 154, и что введение анти-СБ40Ь-антител мышам снижает их способность устранять инфекцию РпсишосубЕ. Блокировка связывания СБ40:СБ154, повидимому, снижает способность макрофагов производить окись азота, которая опосредует многие из провоспалительных активностей макрофагов. Следует отметить, однако, что у млекопитающих (включая человека), у которых отсутствует функциональный СБ154, не наблюдаются частые случаи вирусных инфекций или сепсиса.

Ряд предклинических исследований показал, что агенты, способные прерывать связывание СБ40:СБ154, являются перспективными как иммуномодуляторы. В мышиных системах антитела к СБ 154 блокируют первичные и вторичные иммунные реакции на экзогенные антигены, как ίη νίίτο, так и ίη νίνο. Антитела к СБ154 вызывают снижение числа зародышевых центров у мышей и обезьян, что соответствует данным по иммунодефициту СБ 154. Введение трех доз анти-СБ154-антитела трехмесячным мышам, пораженным волчанкой, существенно снижает титры против двухцепочечной ДНК и нуклеосом, тормозит развитие тяжелого нефрита и снижает смертность. Кроме того показано, что введение анти-СБ 154-антител мышам в возрасте от 5 до 7 месяцев с тяжелым нефритом стабилизирует или даже устраняет заболевание почек. Анти-СБ 154-антитела, вводимые совместно с малыми покоящимися аллогенными лимфоцитами, приводят к неограниченному времени выживания мышиных аутотрансплантатов панкреатических островков. На других животных моделях показано, что помеха связыванию СБ40:СБ154 снижает симптомы аутоиммунных заболеваний (например, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, воспаления кишечника), отторжение трансплантата (аллотрансплантата сердца, реакцию «трансплантат против хозяина») и вызванного хлористой ртутью (2) гломерулонефрита, опосредованного как гуморальными так и клеточными механизмами.

Дополнительные исследования на грызунах показали, что Т-клеточная активация может быть блокирована и время выживания аллотрансплантата грызуна, пролонгированного путем нарушения связывания СБ80/СБ86 с их Т-клеточными противорецепторами, СБ28 и СТЬА4. Эти исследования включают в себя не применение специфического для СБ80/СБ86 слитого белка, СТЬА4-1д, как блокатора сигналирования через СБ28. Другие исследования показали, что увеличение связывания СБ80/СБ86 может быть предотвращено путем применения блокатора связывания СБ40:СБ154 (например, моноклонального антитела МК1). Для достижения эффекта оба класса иммуномодулирующих агентов, по-видимому, зависят от связывания ТСР. Таким образом, подобные агенты проявляют способность модулировать специфичность зависимых от Т-клеток биологических процессов, а не зависящую от пан-Тклеток иммуносупрессию. Исследования, включающие в себя применение таких агентов ίη νίνο при отторжении трансплантата на моделях грызунов, имели драматические результаты, включая приживление полностью несовместимых кожных трансплантантов - результат, не достигаемый при постоянно проводимой иммуносупрессии.

Заслуживает внимания, однако, тот факт, что опубликованные результаты всех ранее проводимых исследований о долгосрочной выживаемости трансплантата у грызунов не имели успеха или были связаны с неприемлемой токсичностью при проверке на других млекопитающих, особенно на приматах.

В основополагающих исследованиях настоящего изобретения, наоборот, установили, что применение блокатора связывания СБ40:СБ154 самого по себе или в сочетании с другим иммуномодулирующим или иммуносупрессованным агентом (таким как блокатор сигналирования СБ28) способствует долговременной неотторгаемой интеграции ткани (МНСнесовместимой) гетерологичного донора в реципиента-примата. Обнадеживающим является то, что терапия, предложенная в данном изобретении, является в значительной степени простой, включающей в себя введение терапевтических агентов посредством стандартного периферического внутривенного катетера, и хорошо переносимой реципиентами. Это выгодно отличается от других применяемых режимов для достижения долговременного существования трансплантата у реципиентов, требующего для этого ионизирующего излучения, введения донорского костного мозга и значительной периоперативной иммуносупрессии. У обработанных в описанных исследованиях животных не обнаружено заметной активации Т-клеток или выработки цитокинов, обычно наблюдаемых после обработки антителами против СБ3, и продление жизни (трансплантата) не влекло за собой традиционную расплату в виде сопутствующих инфекций. Кроме того, никаких изменений гематологических параметров периферической крови не наблюдали в течение этих исследований. Долговременное выживание достигается без явного выведения или значительного снижения в любой субпопуляции лимфоцитов и без потери Т-клеточной реактивности ίη νίίτο. Поэтому маловероятно, что наблюдаемый эффект происходит за счет Т-клеточной деструкции после опосредованной антителом или слитым белком опсонизации. Эти результаты производят впечатление. Подобный успех, полученный на аутбредных макаках резус, предполагает, что вживление аллотрансплантата (или даже ксенотрансплантата) у человека является достижимой задачей при использовании этого или равноценного ему, терапевтического подхода.

Механизм действия каждого агента и его относительный вклад в необязательную комбинированную терапию, описанную ниже, остаются невыясненными. Успех блокировки связывания СЭ40:СЭ154 самого по себе предполагает, что любое базальное костимулирующее сигналирование является менее важным в поддержании реакции отторжения, чем увеличение связывания СЭ80/СЭ86. Действительно, введение анти-СО 154-антитела самого по себе приводит к долговременной выживаемости, в то время как действие блокатора СО28 (СТЬЛ4-1д) было более скоротечным. Показано, что СО 154 экспрессируется на немиелоидных клетках, включая сосудистый эндотелий и гладкие мышцы, и что СО80 может индуцироваться на фибробластах и гепатоцитах, причем не-Т-клеточные реакции могут быть критическими в установлении реактивности против ткани донора. Узнавание трансплантата и его деструкцию можно предотвратить путем создания условий, препятствующих адгезии (клеток) иммунной системы на паренхиме и костимулирующим сигналам во время трансплантации. Различия в активации, вызванной паренхимой донора, и активации, вызванной лимфоидными клетками, могут объяснить наблюдаемое сохранение реактивности ίη νίΐΓΟ по отношению к лимфоцитам донора, несмотря на нормальную функцию трансплантата и общую плохую корреляцию между МЬКреактивностью и клиническим результатом трансплантации. Тем не менее было показано, что действие типичных агентов, блокирующих костимуляцию, СТЬЛ4-1д и гуманизированное антитело 5с8 (анти-СО 154 человека), является синергическим как ίη νίΐΓΟ, так и ίη νίνο. Возможно, СТЬЛ4-1д обеспечивает страхование против экспрессии СО80/СО86, что позволяет избежать действия блокатора связывания СО40:СО154 посредством гуманизированного 5с8. В этом случае, по-видимому, требуется значительное время, чтобы поддержать эффективное острое отторжение немногими клетками, которые не подверглись первоначальной блокировке.

Поскольку эта стратегия оказалась эффективной, вызывая реверсию в случае установленного, подтвержденного биопсией отторжения, вероятнее всего, процесс отторжения скорее поддерживается длительной костимуляцией, чем является процессом, который будучи однажды запущен, протекает независимо от того, элиминированы ли эффекторные клетки или же они утратили способность ТСЯ-сигналирования. Телеологически, тело самым наилучшим образом «обслуживается» воспалением, которое легко контролировать. Таким образом, в отсутствие направления к атаке, отступление может быть разумным предписанием. Это подтверждает такую точку зрения, что снижение эксплуатации природных свойств иммунной системы будет более успешным, чем паниммуносупрессия.

Последующее обсуждение иллюстрирует и служит примером ряда ситуаций и случаев, при которых изобретение может быть применено, а также охватывает основополагающие исследования, включая специфические аспекты изобретения.

Реципиенты-хозяева

Изобретение может быть применено для лечения или профилактики любого млекопитающего реципиента трансплантата ткани или любого млекопитающего животного, в случае необходимости трансплантата. Предпочтительно, реципиент (также названный здесь реципиентом-хозяином, или просто хозяином) является приматом, более предпочтительно высшим приматом, самое предпочтительное - человеком. В других аспектах реципиентом может быть другое млекопитающее животное, в случае необходимости трансплантата, особенно млекопитающее животное, представляющее коммерческий интерес, или животное близкого вида или животное другого, но не антагонистического, вида. Таким образом, реципиенты-хозяева также включают в себя, но не ограничиваются ими, овец, лошадей, крупный рогатый скот, коз, свиней, собак, кошек, кроликов, морских свинок, хомяков, песчанок, крыс и мышей.

Донор трансплантируемой ткани

Изобретение можно применять к любому типу тканевого трансплантата или к процессу пересадки, особенно к тем процессам, где донорская (трансплантированная) ткань подвержена или может быть подвержена ослаблению или отторжению иммунной системой реципиента-хозяина. В частности, изобретение можно применять в любой ситуации, где донорская ткань не является гистосовместимой с реципиентом. Таким образом, кроме ткани аутогенного или сингенного донора, изобретение можно применять в случае ткани аллогенного или даже ксеногенного донора. Ткань донора может быть получена с помощью подходящих средств от добровольца или другого живого донора, или трупного донора. Предпочтительно, чтобы донор являлся как гистосовместимым, так практически приемлемым для реципиента-хозяина. Таким образом, в тех случаях, где реципиентом является человек, предпочтительной донорской тканью является ткань аутогенного или аллогенного донора. Однако донорская ткань может быть получена от ксеногенных видов (в этом случае говорят о ксенотрансплантате), таких как нечеловеческий примат (например, шимпанзе или павиан), или от другого относительно сходного млекопитающего животного (например, свиньи).

В некоторых аспектах изобретения ткань донора представляет собой орган или часть тела. В других аспектах ткань донора представляет собой часть, долю или биопсию органа или ткани донора. Еще в иных аспектах ткань донора представлена клетками, в частности, изолированными или суспендированными, клетки, включая клетки, взятые или иссеченные из донора, клетки, поддерживаемые в культуре, или линия бессмертных клеток. Необязательно, ткань донора включает в себя клетки, имеющие связанный экзогенный генетический материал, такие как трансфицированные или трансформированные клетки хозяина, которые были (или получены из предшественных клеток, которые были) получены генноинженерным способом с целью включения генетического материала, необходимого для продуцирования полипептида, имеющего терапевтическое значение для реципиента. В других аспектах ткань донора может быть получена от трансгенного млекопитающего животного, которое было выведено генноинженерным способом с целью включения генетического материала, необходимого для продуцирования полипептида, имеющего терапевтическое значение для реципиента, в некоторых или во всех его тканях тела. Типичные полипептиды терапевтического для реципиента значения включают в себя гормоны, такие как инсулин, или гормон роста; цитокины; факторы роста и дифференцировки; ферменты; структурные белки и тому подобное.

Таким образом, в свете вышесказанного становится очевидным, что изобретение может быть применено к таким трансплантатам солидных органов как трансплантируемые почка, печень, поджелудочная железа, легкое, сердце и тому подобное. Аналогичным образом, изобретение может быть применено к секциям или частям вышеперечисленных типов тканей, а также к дополнительным типам тканей, особенно к ткани почек, печени, поджелудочной железы (особенно островкам Лангерганса), дыхательных путей, сердца, кожи, сосудов, нервов, костей, костного мозга, хрящей, сухожилий, связок, мышц, жира, молочной железы, желудочно-кишечного тракта, эпителия, эндотелия, соединительной ткани и тому подобное. Кроме того, изобретение может быть применено к частям тела, представляющим множественные типы тканей, предназначенные для замещения или других хирургических изменений или реконструкций глаза, уха, носа, пальца (пальца руки или стопы), сустава, кровеносного сосуда, нерва, мышцы, конечности или других частей тела. В других аспектах изобретение может быть применимо к клеточному препарату или суспензии клеток, вводимых системно или местно реципиенту. Например, изолированные, суспендированные или диспергированные клетки могут быть доставлены внутрь сосудов или имплантированы в желаемый участок, такой как полость костного мозга, печень, почечную оболочку или суставную капсулу, внутримышечным или местным путем к раневому участку. Типичные клетки включают в себя клетки периферической крови, костного мозга или его любого гематопоэтического компонента, мезенхимные стволовые клетки, клетки-сателлиты мышц, гепатоциты, клетки, продуцирующие гормоны, или нейроэндокринные клетки, фибробласты, клетки отростка нерва, эндотелия и тому подобное. В некоторых аспектах клетки являются митотически компетентными и производят новую ткань донорского происхождения. В других вариантах изобретения клетки не являются митотически компетентными, но производят или экспрессируют полипептид или другой продукт терапевтического для реципиента назначения.

Типичные блокаторы связывания ί'Ό40:ί.Ό154

Терапевтические соединения, применяемые к способам изобретения, включают в себя любое соединение, которое блокирует взаимодействие ί.Ό40 на поверхности клеток (например, на В-клетках) с СО40Ь (СО154), экспрессируемым на поверхности активированных Тклеток. Соединения, блокирующие связывание ί'Ό40:ί.Ό154. такие как анти-СО40Е которые рассматриваются особо, включают в себя поликлональные антитела и моноклональные антитела (шАЬз), а также производные антител, такие как химерные молекулы, гуманизированные молекулы, молекулы с пониженной эффекторной функцией, биоспецифические молекулы и конъюгаты антител. В предпочтительных аспектах антителом является 5с8, описанное в патенте США 5474771 и упоминаемое в данном описании. В самом предпочтительном аспекте в настоящее время антителом является гуманизированное антитело 5с8. Другие известные антитела против СО 154 включают в себя антитела 1тхМ90, 1тхМ91 и 1тхМ92 (полученные от 1ттипех), анти-СО40Ь тАЬ, коммерчески доступные от Апсе11 (клон 24-31, каталог # 353-020, Ваурог!, ΜΝ) , и анти-СО40Ь тАЬ, коммерчески доступные от Сепхуте (СатЬпйде. МА, каталог # 80-3703-01). Также коммерчески доступным является анти-СО40Ь тАЬ от РйатМтдеп (8ап О1едо, каталог # 33580Ώ). Многочисленные дополнительные анти-СО40Е-антитела получены и охарактеризованы (см., например, международную публикацию \νϋ 96/23071 Вт151о1-Муег5 8ди1ЬЬ, на которую ссылаются в данном описании).

Изобретение также включает в себя молекулы анти-СО40Е других типов, такие как полные фрагменты ЕаЬ, Е(аЬ')₂ соединения Унобласти, Еу-области, одноцепочечные антитела (см., например, международную публикацию νθ 96/32071), полипептиды, слитые конструкции полипептидов, слитые СО40 (такие как СО401д, как описано у НоПепЬаидй е! а1., 1. 1ттипо1. Ме111. 188:1-7, 1995, которые упоминают13 ся в данном описании) и соединения, представленные малыми молекулами, такими как малые полупептидные соединения или непептидные соединения, все способные блокировать или прерывать связывание ί.Ό40:ί.Ό154. Способы конструирования, скрининга и оптимизации малых молекул описаны в патентной заявке США РСТ 96/10664, зарегистрированной 21 июня 1996, и упоминаются в данном описании.

При использовании стандартной техники рекомбинации ДНК (^1и1ег аиб МПйеш, №11игс 349: 293-299, 1991) можно получать различные формы антител. Например, могут быть сконструированы «химерные» антитела, в которых антигенсвязывающий домен из антитела животного связывается с константным доменом человека (антитело первоначально произведено от нечеловеческого млекопитающего животного, для которого применяется технология рекомбинации ДНК с целью замещения в целом или частей шарнирного участка и константной области тяжелой цепи и/или константной области легкой цепи на соответствующие области легкой или тяжелой цепей иммуноглобулина человека) (см., например, СаЫ11у е! а1., патент США Νο. 4816567; Моткоп е! а1., Ргос. ЫаИ. Асаб. 8с1. 81:6851-6855, 1984). Химерные антитела снижают иммуногенность реакций, вызванных антителами животных, при применении их в клинике для лечения человека.

Кроме того, могут быть синтезированы «гуманизированные» антитела. Гуманизированные антитела являются антителами, первоначально полученными от нечеловеческого млекопитающего животного с использованием технологии рекомбинации ДНК с целью замещения некоторых или всех аминокислот, не участвующих в связывании с антигеном, на аминокислоты из соответствующих областей легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина человека. То есть они являются химерами, представляющими, главным образом, последовательности иммуноглобулина человека, в которые включены области, ответственные за специфическое связывание антигена (см., например, патентную заявку РСТ \νϋ 94/04679). Животных иммунизируют желаемым антигеном, соответствующие антитела выделяют, и часть последовательностей вариабельной области, ответственных за специфическое связывание антигена, удаляют. Полученные от животных области, связывающие антиген, затем клонируют в соответствующее положение генов антитела человека, у которого исключены области, связывающие антиген. Гуманизированные антитела минимизируют применение гетерологичных (вневидовых) последовательностей в антителах для использования в терапии человека и, маловероятно, выявляют нежелательные иммунные реакции. Антитела приматов могут быть получены аналогичным образом.

Другие аспекты изобретения включают в себя применение антител человека, которые можно продуцировать у нечеловеческих животных, таких как трансгенные животные, имеющие один или более трансген иммуноглобулина человека. Подобных животных можно использовать в качестве источника для спленоцитов для производства гибридом, как это описано в патенте США 5569825.

Фрагменты антител и моновалентные антитела можно применять в способах и композициях этого изобретения. Моновалентные антитела представляют собой димер из легкой и тяжелой цепей, связанный с Рс-(или стволовой) областью второй тяжелой цепи. «Раб-область» относится к тем частям цепей, которые приблизительно эквиалентны или аналогичны последовательностям, которые содержат Υразветвленные части тяжелой цепи и легкой цепи в целом и которые, как было показано, совокупно (в агрегатах) проявляют активность антитела. Раб-белок включает в себя агрегаты, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепи (известный как Раб'), а также тетрамеры, которые соответствуют двум разветвленным сегментам антитела Υ (известным как Р(аб)₂), независимо от того, ковалентно или нековалентно цепи связаны в агрегатах, поскольку агрегация способствует избирательному взаимодействию с отдельным антигеном или семейством антигена.

Кроме того, стандартная техника рекомбинации ДНК может быть применена с целью изменения сродства к связыванию рекомбинантных антител с их антигенами путем изменения аминокислотных остатков вблизи сайтов связывания антигена. Сродство антигена к связыванию антитела человека может быть увеличено путем мутагенеза, основанного на молекулярном моделировании (Онееп е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8сг 86:10029-10033, 1989; международная публикация патентной заявки νθ 94/04679). Желательно увеличить или уменьшить сродство антител к СЭ406 в зависимости от типа тканимишени или от особого режима лечения. Это может быть достигнуто при применении технологии обнаружения фага (см., например. νίηΝΓ е! а1., Апп. Кеу. 1ттипо1. 12:433-455, 1994; апб 8сЫег е! а1., 1. Мо1. Бю1. 255:28-43, 1996, которые упоминаются в данном описании). Например, это может оказаться благоприятным для лечения больного с постоянным уровнем антител со сниженным сродством к СЭ406 для полупрофилактического лечения. Также антитела с повышенным сродством к СЭ406 могут быть применимы для кратковременного лечения.

Способы введения

Соединения согласно изобретению можно вводить любым способом, который приемлем с медицинской точки зрения. В зависимости от отдельных обстоятельств, желательным может быть местное или системное введение. Пред15 почтительно соединения вводить парентеральным способом, таким как внутривенная, внутриартериальная, подкожная, внутримышечная, внутриглазничная, внутрижелудочковая, внутрибрюшинная, субкапсулярная, внутричерепная, интраспинальная или интраназальная инъекция, вливание или ингаляция. Соединение также может быть введено путем вживления инфузионного насоса, или биосовместимого имплантата или имплантата, высвобождаемого в результате равномерной биодеградации, в реципиента-хозяина, либо до, либо после имплантации ткани донора. В отличие от этого, определенные соединения согласно изобретению или композиции из них могут быть подходящими для перорального введения или введения в тонкий кишечник. Другие соединения согласно изобретению будут подходящими для местного введения.

Обычно соединения данного изобретения вводят реципиенту-хозяину. Однако соединения могут быть также введены донору или в ткань донора. Например, соединения согласно изобретению могут быть включены в жидкость для перфузии и консервации, в которой ткань донора хранится или транспортируется до ее вживления в реципиента.

Дозировки и курс лечения

Количество и частота дозировок для любого отдельного соединения, которое вводится больному с данным сложным иммунным заболеванием, находится в компетенции специалистов и клинической оценки обычных врачейпрактиков в области трансплантации тканей, таких как хирурги-трансплантологи. Обычная доза и режим введения устанавливаются с помощью предклинических и клинических испытаний, которые включают в себя обширные, но обычные исследования, для определения оптимальных параметров введения соединения. Даже после сделанных рекомендаций практикующий врач будет часто изменять эти дозировки для различных реципиентов, принимая во внимание различные соображения, такие как возраст больного, его медицинский статус, вес, пол и конкурентное лечение другими фармацевтическими препаратами. Определение оптимальных дозировок и режима введения для каждого соединения анти-СЭ40Ь, используемого для торможения отторжения трансплантата, является обычным занятием для специалистов в фармацевтической области и области медицины.

Обычно режим дозировок, определяемый обслуживающим врачом или практикующим специалистом, возможно, имеет периоды более частых дозировок, таких как ежедневные или еженедельные интервалы, чередующиеся периодами менее частых дозировок, таких как ежемесячные или более длительные интервалы.

В результате проверки дозировок для соединения анти-СЭ40Ь следующие примеры стратегии введения приводятся для анти-СЭ40Ь тАЬ. Количество дозы можно легко регулировать для других типов соединений анти-СЭ40Ь. Обычно, принимают во внимание единичные дозы приблизительно между 0,05 и 50 мг/кг веса тела больного, чаще в области 1-20 мг/кг. Для экстренного лечения, такого как до или во время трансплантации, или в ответ на любой признак, указывающий на начало отторжения трансплантата, эффективная доза антител колеблется в области приблизительно от 1 мг/кг веса тела до 20 мг/кг веса тела, вводимая ежедневно в течение периода от 1 до 5 дней, предпочтительно путем внутривенного введения с помощью болюса. Такую же дозу и режим дозирования можно применять в фазе нагрузки поддерживаемого режима нагрузки, включая внутривенное или внутримышечное введение антител в области приблизительно от 0,1 мг/кг веса тела до 20 мг/кг веса тела в течение периода лечения, включающего в себя от недельного до 3месячного интервалов. Лечение хронических состояний также можно проводить с помощью поддерживающего режима, при котором антитела вводят внутривенным или внутримышечным путем в области приблизительно от 0,1 мг/кг веса тела до 20 мг/кг веса тела с дозовыми интервалами, колеблющимися приблизительно от 1 недели до 3 месяцев. Кроме того, лечение хронических состояний может быть эффективным при использовании прерывистого режима внутривенного введения, при котором антитела вводят приблизительно между 1,0 мг/кг веса тела и 100 мг/кг веса тела с интервалом между последующими курсами лечения от 1 до 6 месяцев. Для всех случаев, кроме прерывистого режима, введение также может осуществляться пероральным, легочным путем, через нос или подкожным путем.

Согласно еще одному аспекту изобретения в отношении торможения отторжения трансплантата, эффективность антител можно увеличить путем серийного введения или в комбинации с обычными терапевтическими агентами, например, против отторжения, или лекарственными средствами, такими, например, как кортикостероиды или иммунодепрессанты. По сравнению с этим, антитела можно конъюгировать с обычным агентом. Этот подход с успехом позволяет применять введение обычного агента при монотерапии в количестве, составляющем менее обычной дозировки, например, приблизительно менее 50% стандартной дозировки. Соответственно, можно избегать многих побочных эффектов, связанных с этим агентом.

Согласно этому изобретению, комбинированная терапия для лечения отторжения трансплантата включает в себя применение антиСО40Ь-антител вместе с агентами, направленными на В-клетки, такими как анти-СО 19, антиСО28 или анти-СО20-антитела (неконъюгированные или радиомеченные), антагонисты 1Ь-14 ШР394 (Ьа1о11а РйаттасеиИсаН гесерЮг

Ыоскег), ΙΚ-1116 (малая молекула Такейа) и анти-1д-идиотипические моноклональные антитела. По сравнению с этим, комбинации могут включать в себя таргетирующие Т-клетки/В-клетки агенты, такие как СТЛЬЛ41д, антагонисты Ш-2, антагонисты Ш-4, антагонисты Ш-6, антагонисты рецепторов, анти-СП80/СИ86-моноклональньге антитела, ΤΝΡ, ЬРЛИСЛМ-антагонисты, ¥ЬЛ4/УСЛМ- антагонисты, конъюгаты бреквинара и Ш-2-токсина (например, ΌΑΒ), преднизон, анти-СП3-МаЬ (ОКТ3), микофенолат мофетила (ММР), циклофосфамид и другие иммунодепрессанты, такие как блокаторы сигнала кальцийнейрина, включая в себя, без ограничений, такролимус (РК506). Комбинации также могут включать в себя таргетирующие Т-клетки агенты, такие как антагонисты СП4. антагонисты СП2 и Ш12.

Для поддержания интеграции трансплантата или в период после супрессии острого отторжения трансплантата вводится, если необходимо, поддерживающая доза анти-СП40Ьантитела самого по себе или в сочетании с обычным агентом, направленным против отторжения. В тех случаях, когда признака отторжения трансплантата не выявлено, лечение можно приостановить, однако следует регистрировать возможные сигналы отторжения трансплантата. По показаниям обычного практикующего врача-специалиста в некоторых случаях может быть назначено лечение с интервалами, например, от 4 недель или более. Однако реципиент может потребовать режим прерывистого лечения на долговременной основе в ответ на любой рецидив симптомов заболевания.

Композиция

Обычно соединения согласно изобретению суспендируют, растворяют или диспергируют в фармацевтически приемлемом носителе или наполнителе. Полученная терапевтическая композиция не оказывает вредного воздействия на гомеостаз реципиента, особенно на баланс электролитов. Таким образом, примером носителя может быть нормальный физиологический солевой раствор (0,15М №С1, рН 7,0 или 7,4). Другие приемлемые носители, хорошо известные в данной области, описаны, например, в Кешшдоп'к Рйагтасеи11са1 Зсгепсек, Сеппаго. ей., Мас) РиЫщЫпд Со., 1990. Приемлемые носители могут включать в себя биосовместимые, инертные или биоабсорбируемые соли, буферные агенты, олиго- или полисахариды, полимеры, улучшающие вязкость агенты, консерванты и тому подобное.

Соединение анти-СП40Ь, применяемое в способах согласно изобретению, вводится в фармацевтически эффективном или терапевтически эффективном количестве, которое является достаточным для того, чтобы производить на реципиента благотворное с медицинской точки зрения воздействие в случае риска или беспокойства по поводу отторжения трансплантата. С медицинской точки зрения, благотворное воз действие заключается в предотвращении, задержке или ослаблении повреждения или в регистрируемом улучшении медицинского состояния реципиента. В качестве примера, показания статуса аллотрансплантата или ксенотрансплантата почки, функцию почек и состояние больного регистрируют с помощью одного или более обычных лабораторных тестов, которые включают в себя измерение концентрации соответствующих веществ в крови или моче, других характеристик мочи или скорость выведения различных веществ из крови в мочу. Измеренные с помощью этих тестов параметры, либо отдельно, либо в комбинации, могут быть использованы врачом для оценки функции печени или ее поражения. Примерами подобных параметров является концентрация в крови мочевины, креатинина или белка; концентрация белка в моче или различных клеток крови, таких как эритроциты или лейкоциты; удельная вязкость мочи, количество мочи; скорость выведения инсулина, креатинина, мочевины или паминогиппуровой кислоты; или наличие гипертонии или отека.

В качестве отдельного примера клинического применения способов изобретения, реципиентам ткани донорской почки вводят периоперативно анти-СП40Ь-МАЬ (например, гуманизированное антитело 5с8), также как и реципиентам с признаками отторжения трансплантата. Острое отторжение аллотрансплантата почки может быть обнаружено с помощью многочисленных показателей, включая увеличение креатинина в сыворотке или азота мочевины в крови, снижение объема мочи, развитие протеинурии и/или гематурии или другие показатели отторжения трансплантата. Количества иммуномодуляторов и продолжительности действия иммуномодулирующей терапии должно быть достаточно для благотворного изменения в одном или более из этих показателей. Обычная продолжительность лечения и режим дозировок указаны выше в разделе основополагающих исследований, включенных в описание. Существенно, однако, что терапия включает в себя введение блокатора связывания СИ40:СИ154 (примером служит гуманизированное антитело 5с8) внутривенно с помощью болюса в количестве вплоть до 50 мг/кг с последующим соответствующим режимом последовательных введений (например, ежедневных внутривенных или подкожных инъекций) в течение вплоть до 2 недель после начала терапии или до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое благоприятное изменение в показателях отторжения трансплантата или его достаточности.

В качестве другого примера, реципиентам с признаками отторжения другого органа вводят соединение анти-СП40Ь подобным же образом, как это описано выше. Например, острое отторжение трансплантатов печени приводит к желтухе (гипербилирубинемии), гепатиту (повы19 шенным уровням аминотрансферазы), коагулопатии и энцефалопатии.

Предклинические модельные системы для оценки режимов лечения блокатором связывания СЛ40:СЛ154

Предпочтительной, типичной модельной системой для проверки эффективности соединения, блокирующего связывание СЛ40:СЛ154 (например, анти-СЛ40Ь соединение, такое как тАЬ 5с8) является модель аллотрансплантата почки примата, описанная ранее в смежном предварительном патенте США 8.Ν. 60/049389 (06/11/97) и у К1гк е! а1., (1997), 94

Ртос.№11.Асаб.8с1.и8А 8789-8794, упоминаемые в данном описании. Данная модель макаки резус неоднократно являлась мощным тестом в иммунологической манипуляции: она является одной из тех, которые исключительно чувствительны даже к минорным изменениям в функции аллотрансплантата или к сильным воздействиям на реципиента на уровне ранозаживления и функции иммунной системы. Кроме того, она имеет очевидное биологическое сходство с трансплантацией почки человека. В особенности, гены, которые кодируют белки МНС, достаточно консервативны у макаки резус и человека, и отторжение их васкуляризированных органов очень сходно с отторжением, наблюдаемым в клинике.

Легко оценить, что эта модельная система является подходящей для оценки трансплантатов, представляющих собой почечную ткань (почку). Другие предклинические модельные системы в данной области, предпочтительно у приматов, являются подходящими для оценки эффективности трансплантатов других типов ткани, таких как ткани печени, сердца, легкого, поджелудочной железы, островков Лангерганса, кожи, периферических или центральных нервов или других типов тканей и органов.

Материалы и методы Реагенты

СТЬА4-1д и контрольный слитый белок1дС1 человека получают так, как описано ранее, и транспортируют в растворе из Института генетики, СатЬпбде, МА. Анти-СЛ40-антителолиганд, гуманизированное антитело 5с8, получают так, как описано ранее, и транспортируют в растворе из Вюдеи Со грога! ίο η, СатЬпбде, МА. Антитело хомячка РУ-1 (1д1, клон 662), полученное против мышиного моноклонального антитела СЛ28. очищают из культуральных супернатантов гибридом и используют в качестве изотипических контрольных моноклональных антител.

Типирование МНС (главного комплекса гистосовместимости) и отбор донора/реципиента

Комбинации донор-реципиент и животные, выбранные для получения контрольных клеток, отбирают на основе генетической неидентичности по обоим классам I и II МНС. Несоответствие классу I устанавливали с помощью одномерного изоэлектрического фокусирования, так, как это описано ранее. Несоответствие классу II устанавливали на основании результатов однонаправленных реакций смешанных лимфоцитов (МЬК.к). Кроме того, ЛКВ-локусы животного являются несоответствующими, как показано с помощью градиентного гель-электрофореза в денатурирующих условиях и прямого секвенирования второго экзона ЛЕВ, как описано ранее. Сильную Т-клеточную реактивность реципиента по отношению к донору подтверждают ίη νίΐτο для всех пар донор-реципиент. Эксперименты, описанные в этом исследовании, проводили согласно изложенным в «6шбе £от !Не Саге апб Ике о£ ЬаЬота!огу Аштак» [п8111и!е о£ ЬаЬога!огу Ашта1к Кекоигеек, №!юпа1 КекеагеН Соипс11, ЛНН8, РиЬ. №. МН) 86-23 (1985).

Клеточный анализ ίη νίΙΐΌ

Однонаправленные реакции смешанных лимфоцитов (МККк) были выполнены на всех животных до трансплантации и на оставшихся в живых без отторжения животных после 100 дней. Каждое животное проверяют против всех потенциальных доноров для того, чтобы выявить самые подходящие пары реагирующих организмов для трансплантации. Клеткиреспондеры (3х10⁵) инкубируют с облученными стимулирующими клетками (1х10⁵) при 37°С в течение 5 дней. Клетки метили ЗН-тимидином, и пролиферацию клеток контролировали путем включения ЗН-тимидина. Поликлональная стимуляция конканавалином А (25 мкг/мл) служила положительным контролем. Индекс стимуляции рассчитывали с помощью нормализации до аутореактивности, которая во всех случаях является почти фоновым значением. Для изучения эффекта дозы ίη νίΙΐΌ к МЬК добавляли СТЛА4или гуманизированное антитело 5с8 в первый день при концентрации, колеблющейся от 100 мкг/мл до 0,01 мкг/мл. Комбинированное лечение выполняли посредством изменения концентрации 0^^4-^ и применения постоянной концентрации гуманизированного 5с8 - 50 мкг/мл.

Фенотипический анализ лимфоцитов периферической крови выполняли до трансплантации и периодически в течение и после лечения лекарственными средствами. Пробы по 0,2 мл гепаринизированной цельной крови разбавляли фосфатным буфером и 1% сывороткой теленка. Меченые флуоресцинизотиоцианатом (МТС) моноклинальные антитела Т11, В1 (Сои1!ег) и ΡΝ18 (любезно предоставленные Лт. Лау|б М. Nеν^ 11е, 1т.) использовали, чтобы оценить процент СЛ2(Т-клетки/ЫК-клетки), СЛ20 (В-клетки) и СЛЗ (Т-клетки) положительных клеток. Эритроциты удаляли из препарата с помощью обработки АСК буфером для лизиса (0,15 М ΝΗιΟ, 1,0 тМ КНСО₃, 0,1 тМ №1₂ЕЛТА. рН 7,3) после окрашивания. Клетки подвергали проточной цитометрии немедленно или после фиксации в 1% параформальдегиде.

Проточную цитометрию выполняли на приборе Вее1ои ΌίοΚίηδοη ΡΛΟδΟΛΝ.

Аллотрансплантаты почки

Аллотрансплантацию почки выполняли так, как описано ранее. Кратко, неродственных ювенильных макак резус (от 1 до 3 лет) серонегативных в отношении вируса иммунодефицита обезъян, ретровируса обезъян и вируса герпеса В получает из Рпта1е СеШег ШшуегЩу οί ХУйеои8ш) или ЬАВ8 (Уетаккее, 8С). Процедуры выполнили под общим наркозом с кетамином (1 мг/кг, внутримышечно), ксилазином (1 мг/кг, внутримышечно) и галотаном (1%, при вдыхании). Трансплантацию выполняли между генетически различными парами донор-реципиент, как это определено с помощью анализа МНС, описанного выше. Животных гепаринизировали в процессе получения органа и имплантации (100 ед/кг). Аллотрансплантат пересаживали, используя стандартную для микрососудов технику для создания анастомоза «конец в бок» между почечной артерией донора и периферической аортой реципиента, а также почечной веной донора и полой веной реципиента. Затем проводили первоначальную уретроцистонеостомию. Билатеральную нативную неплиректомию заканчивали до смыкания.

Животных обрабатывали внутривенной жидкостью приблизительно в течение 36 ч, до тех пор, пока пероральное введение не будет адекватным. Триметаприм-сульфа в качестве антибиотика вводили в течение 3 дней для хирургической профилактики. Каждое животное получало по 81 мг аспирина в день операции. Необходимость в анальгезии часто подтверждалась, и анальгезию поддерживали с помощью внутримышечного введения буторфанола. Животных взвешивали еженедельно. Кожные швы удаляли после 7-10 дней. СТЬА4-1д и/или гуманизированное антитело 5с8 вводили внутривенно при дозах и схеме применения, изменяющихся на основании накопления опыта с агентами. Никаких других иммунофармацевтических препаратов не вводят. Креатинин сыворотки и электролиты цельной крови (Ν+, К+, Са₂+) и гемоглобин определяли каждый день до тех пор, пока они не становились стабильными, а затем определяли еженедельно.

Патологоанатомический анализ

Биопсии выполняли на животных, у которых предположительно отторгается трансплантат, используя 20-калибровую биопсийную иглу (Вюр1у-Си1, Ватф. Стандартное окрашивание гематоксилином и эозином осуществляли на замороженной или фиксированной формалином ткани для подтверждения диагноза отторжения. Животных умерщвляли при анурии или при потере веса, составляющей 15% от веса тела перед трансплантацией, в соответствии со стандартами АААЬАС. Все животные были подвергнуты проверке в полном объеме и гистопатологической оценке в период гибели.

Результаты

Как СТЬА4-1д, так и гуманизированное антитело 5с8 тормозят МЬК.8 у макак резус дозозависимым образом. Однако СТЬА4-1д является более эффективным, чем гуманизированное антитело 5с8, в качестве единственного агента в предотвращении Т-клеточной пролиферации. Заявители наблюдали существенное снижение включения тимидина при концентрации СТЬА41д 0,1 мкг/мл, а также дальнейшее торможение при более высоких концентрациях. Умеренное снижение пролиферации наблюдали при применении гуманизированного антитела 5с8 с концентрацией 0,01 мкг/мл, однако торможение существенно не повышалось при увеличении концентрации. В тех случаях, когда агенты тестировали в комбинации друг с другом, обнаруживали, что оба агента вместе тормозят пролиферацию приблизительно в 100 раз более эффективно, чем это делает любой агент в отдельности. Изучение реагирования в зависимости от дозы повторяли отдельных контрольных животных с идентичными результатами. Таким образом, СТЬА4-1д и гуманизированное антитело 5с8 воздействуют синергически и тем самым предотвращают отторжение аллотрансплантата ίη νίνο.

Было выполнено 12 аллотрансплантаций почек. Четверо животных получили аллотрансплантат без какого-либо иммунологического воздействия. Эти животные отторгали трансплантат на 5, 7, 7 и 8 дни. Гистологическая проверка их почек показала острое клеточное отторжение, характеризующееся распространением интерстициального и трубчатого инфильтрата лимфоцитов, сопровождающимся отеком и клеточным некрозом. Одно животное получало 5-дневный курс СТЬА4-1д (10 мг/кг в день), начиная с момента трансплантации, и продолжительность выживания трансплантата составляла до 20 дней.

Потерю трансплантата наблюдали вследствие клеточного отторжения, неотличимого от отторжения, наблюдаемого у контрольных животных. Одно животное обрабатывали СТЬА41д в концентрации 20 мг/кг в день трансплантации с последующим 12-дневным курсом, состоящим из дозы 10 мг/кг через день, и продолжительность выживания у этого животного до 30 дней. И вновь потеря трансплантата была обусловлена острым клеточным отторжением. На основании экстраполяции данных ранее опубликованной работы на модели гетеротопного аллотрансплантата сердца крысы к полученным данным согласно изобретению, этим двум животным была произведена донороспецифическая трансфузия лимфоцитов (10⁸) лимфатических узлов, во время трансплантации.

Двух животных обрабатывали только гуманизированным 5с8-антителом. Оба животных получали дозу 20 мг/кг через день, начиная со дня операции и продолжали получать в течение послеоперационных дней (всего 8 доз). У обоих животных не наблюдали отторжения трансплантата длительное время, хотя кратковременные повышения уровня креатинина регистрировали в течение второй и четвертой недель после операции. У обоих животных трансплантат отторгался между 95 и 100 днями после операции.

Биопсию выполняли у каждого животного для подтверждения диагноза. Обоих животных затем обрабатывали вновь семью дозами гуманизированного антитела 5с8 (20 мг/кг; одно животное через день и одно животное ежедневно), и у обоих функция трансплантата возвращалась к норме без видимых вредных воздействий. Они оставались живыми и здоровыми более 150 дней после трансплантации.

Двум животным давали по 20 мг/кг каждого из СТЬА4-1д и гуманизированного антитела 5с8 после трансплантации. И вновь, каждое лекарственное средство давали через день, начиная со дня операции и продолжая в течение 14 дней после операции. У одного животного отторжения не происходило в течение 100 дней, но, подобно животным, обработанным гуманизированным антителом 5с8 самим по себе, отторжение имело место в то же время. Аналогичным образом, биопсия показала острое клеточное отторжение. Первоначальную схему введения СТЬА4-1д и гуманизированного 5с8антитела повторяли, и отмечали при этом, что уровень креатинина у животных доходил до базовой линии (1,0). Проведенный после этой обработки анализ МЬК выявил потерю специфической для донора реактивности. Контрольные клетки сохраняли реактивность. На 165-ый день после трансплантации животных забивали, как того требуется по протоколу, вследствие потери веса. Функция трансплантата в это время оставалась в пределах нормы. При аутопсии у животного обнаружен 8Ыде11а и Сатрйу1оЬас1ет энтероколит, общая инфекция у макак резус. Это заболевание поражает множество животных в первоначальной колонии приматов, включая несколько необработанных животных. Никаких других патологических нарушений не обнаружено, в частности, не обнаружено доказательств лимфопролиферативного заболевания или сопутствующей инфекции. Гистологические исследования показали, что трансплантат имеет изолированные группы лимфоцитов в интерстиции, а трубчатая инфильтрация, гломерулярные повреждения или некроз паренхимы не наблюдаются.

Подобно животным, обработанным гуманизированным антителом 5с8 самим по себе, оба этих животных обнаруживали временные увеличения креатинина в сочетании с увеличением размера трансплантата в течение четвертой недели после операции. Заявители предположили, что это набухание трансплантата отражает вторую волну инфильтрующих лимфоцитов и поэтому приводит к изменению схемы применения, так, что оба реагента даются в день операции и после операции на 2, 4, 6, 8, 12, 16 и дни.

Двух животных обрабатывали по этой модифицированной схеме. Оба животных демонстрировали продолжительное выживание трансплантата без отторжения и заболевания или изменений в функциях почек в течение более 150 дней. После 100 дней выживания без отторжения повторяли МЬКз против клеток донора и контрольных клеток. Никаких изменений реактивности ίη νίίτο не наблюдали. Эти исследования повторяли после 150 дней выживания без отторжения трансплантата с идентичными результатами. У обоих животных сохранялись сильные реакции ίη νίίτο по отношению к донору и контрольным клеткам, а отторжение аллотрансплантата не наблюдали. Любая из применяемых терапий не оказывала токсического действия на любое из животных. В частности, не наблюдали лихорадку, анорексию или гемодинамические нарушения, а также не обнаруживали сопутствующих инфекций. Животных содержали в обычных условиях и позволяли им контактировать с другими животными в колонии. Они сохраняли нормальный прирост веса. Лабораторные химические и гематологические параметры, такие как гемоглобин и число форменных элементов цельной крови, оставались в норме. Процент клеток, экспрессирующих СЭ2. СЭ3 и СЭ20. не подвергался изменению при любой схеме обработки. В частности, не наблюдали снижение числа Т-клеток у любого из животных в течение или после обработки.

Дальнейшие предклинические исследования с применением модельной системы аллотрансплантата почки примата

Описанную выше систему аллотрансплантата почки примата использовали впоследствии для проверки различных дополнительных и/или в дальнейшем усовершенствованных терапевтических схем, основанных на применении для монотерапии гуманизированного тАЬ 5с8антитела, или комбинаций с другим терапевтическим агентом, например, СТЬА4-1д, ММР, такролимусом, кортикостероидами или их комбинаций.

Монотерапия при аллотрансплантантах почки у приматов

Двух животных подвергали монотерапии посредством 5с8 с режимом индукции и поддержания по следующей схеме: режим индукции включал в себя введение дозы 20 мг/кг 5с8 в исследуемые дни - 1, 0, 3, 10 и 18, причем день 0 является днем оперативной трансплантации почки. Режим поддержания включал в себя ежемесячное введение дозы 20 мг/кг 5с8, начиная с 28 дня исследования. У обработанных животных не наблюдали отторжения трансплантата, определяем измерением количества субпопуляции лимфоцитов или уровня креатинина сыворотки, как на 170, так 163 день, соответственно.

Двух других животных подвергали монотерапии посредством 5с8 с применением стандартной схемы индукции и поддержания на низких дозах: режим индукции включал в себя введение дозы 20 мг/кг 5с8 в дни исследований 1, 0, 3, 10 и 18, причем день 0 является днем оперативной аллотрансплантации почки. Режим поддержания включал в себя ежемесячное введение дозы 10 мг/кг 5с8, начиная с 28 дня исследования. У обработанных животных не наблюдали отторжения трансплантата на 149 и 148 дни, соответственно.

Еще двух животных подвергали монотерапии посредством 5с8, применяя схему, состоящую из индукции низкими дозами и поддержания при низких дозах: режим индукции включал в себя введение дозы 10 мг/кг 5с8 в дни - 1, 0, 3, 10 и 18, причем день 0 является днем оперативной аллотрансплантации почки. Режим поддержания включал в себя введение ежемесячно дозы 10 мг/кг 5с8, начиная с 28 дня исследований. У обработанных животных не наблюдали отторжение трансплантата на 38 и 39 дни, соответственно.

Дополнительную группу из двух животных подвергали монотерапии посредством 5с8, применяя стандартную схему, состоящую из индукции еще более низкими дозами и поддержания при еще более низких дозах: режим индукции состоял из введения дозы 5 мг/кг 5с8 в 1, 0, 3, 10 и 18 дни, причем день 0 является днем оперативной аллотрансплантации почки. Режим поддержания включал в себя введение ежемесячно дозы 5 мг/кг 5с8, начиная с 28 дня исследований. У обработанных животных наблюдали отторжение имплантатов почки на 7-10 день.

Комбинированная терапия у приматов с аллотрансплантатом почки

Всех животных подвергали терапии посредством 5с8 с применением стандартной схемы, состоящей из индукции (20 мг/кг) и поддержания (20 мг/кг), описанной выше, в комбинации с другими режимами иммунодепрессивной терапии: трех животных подвергали комбинированной терапии, состоящей из приема кортикостероидов (например, метилпреднизолона с 5-дневным курсом индукции) и микофенолата мофетила (ММЕ; 20 мг/кг роВГО) при терапевтически эффективных дозах. У обработанных животных не наблюдали отторжения трансплантата на 143, 81 и 80 дни, соответственно. И наоборот, у одного животного, обработанного такими же дозами ММЕ и кортикостероидов, но в отсутствие терапии посредством 5с8, наблюдали отторжение трансплантата почки на 7-ой день.

Еще двоих животных подвергали комбинированной терапии, включающей в себя прием иммунодепрессанта такролимуса (известного как ЕК506) при терапевтически эффективных дозах (1,5-2 мг/кг роВГО, местно 10 нг/мл). У этих обработанных животных отторжения трансплантата не наблюдали на 31 и 36 дни, соответственно.

Дополнительную группу из двух животных подвергали комбинированной терапии, включающей в себя введение СТЬЛ4-1д при терапевтически эффективных дозах. У этих обработанных животных отторжения трансплантата не наблюдали на 122 и 123 дни, соответственно.

Заключение, основанное на предклинических модельных исследованиях

Полученные результаты указывают на то, что индукция вживления трансплантата посредством гуманизированного антитела 5с8 самого по себе в качестве блокатора связывания СБ40:СБ154 приводит к долгосрочному выживанию ткани аллотрансплантата. Действие гуманизированного антитела 5с8 комбинируется синергическим образом с действием блокатора сигналирования через СБ28. СТЬЛ4-Ю, и является сравнимым с действием нескольких известных иммуносупрессорных и/или иммуномодулирующих агентов.

Равноценные исследования

Изобретение может быть воплощено в других специфических формах, не отступая при этом от общей тенденции и существенных характеристик изобретения. Поэтому приведенные выше примеры рассматриваются в любом случае как иллюстрирующие, но не ограничивающие объем описанного изобретения. Прилагаемая формула изобретения в наибольшей степени раскрывает сущность изобретения по сравнению вышеприведенным описанием, включающим в себя возможные вариации.

Claims (33)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ ингибирования отторжения тканевого трансплантата реципиентом-приматом, включающий в себя стадию введения эффективного количества блокатора связывания СБ40:СБ154 указанному примату, где указанный блокатор связывания СБ40:СБ154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с СБ 154, его антиген-связывающий фрагмент или производное.
2. 2. Способ по п.1, при котором антитело является моноклональным антителом.
3. 3. Способ по п.2, при котором моноклональное антитело связывается с антигеном 5с8.
4. 4. Способ по п.3, при котором моноклональное антитело обладает антиген-специфическими характеристиками связывания антитела 5с8, продуцируемого под регистрационным номером АТСС Νο. НВ 10916.
5. 5. Способ отмены острого отторжения пересаженной ткани у реципиента-примата, включающий в себя стадию введения эффективного количества блокатора связывания СБ40:СБ154 указанному примату, где указанный блокатор связывания 0040:00154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с 00154, его антиген-связывающий фрагмент или производное.
6. 6. Способ по п.5, при котором пересаживаемая ткань выбирается из ткани почки, печени, сердца, поджелудочной железы, кожи, сосуда, нерва, кости и хряща.
7. 7. Способ удлинения срока выживания пересаженной ткани у реципиента-примата, включающий в себя стадию введения эффективного количества блокатора связывания 0040:00154 указанному примату, где указанный блокатор связывания 0040:00154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с 00154, его антиген-связывающий фрагмент или производное.
8. 8. Способ ослабления иммунологических осложнений, вызванных неблагоприятным исходом при пересадке ткани реципиентупримату, включающий в себя стадию введения эффективного количества блокатора связывания 0040:00154 указанному примату, где указанный блокатор связывания СО40:СО154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с 00154, его антиген-связывающий фрагмент или производное.
9. 9. Способ по пп.1, 6, 7 или 8, при котором пересаживаемая ткань является аллогенной по отношению к указанному примату.
10. 10. Способ по пп.1, 6, 7 или 8, при котором пересаживаемая ткань является ксеногенной по отношению к указанному примату.
11. 11. Способ по пп.1, 6, 7 или 8, при котором пересаживаемая ткань состоит из изолированных или суспендированных клеток.
12. 12. Способ по п. 11, при котором указанные изолированные или суспендированные клетки выбирают из группы, состоящей из (а) клеток периферической крови; и (Ь) клеток костного мозга или любого его гематопоэтического компонента.
13. 13. Композиция, включающая в себя антитело, которое специфически связывается с 00154, его антиген-связывающий фрагмент или производная; и иммуносупрессивное или иммуномодуляторное соединение.
14. 14. Композиция по п.13, в которой указанное иммуносупрессивное или иммуномодуляторное соединение выбрано из группы, состоящей из (а) агента, который блокирует Тклеточное костимулирующее сигналирование через 0028; (Ь) агента, который блокирует сигналирование кальцинейрина; (с) кортикостероида или антипролиферативного агента; или (б) такролимуса, сиролимуса, микофенолата мофетила, мизорубина, дезоксиспергуалина, бреквинара натрия, лефлуномида и азаспирана.
15. 15. Композиция по п.14, в которой указанное антитело является моноклональным антителом.
16. 16. Композиция по п.15, в которой моноклональное антитело связывается с антигеном 5с8.
17. 17. Способ ингибирования отторжения тканевого трансплантата реципиентомприматом, включающий в себя стадии введения эффективного количества какой-нибудь одной из композиций по пп. 13-16.
18. 18. Способ отмены острого отторжения пересаженной ткани у реципиента-примата, включающий в себя стадию введения эффективного количества какой-нибудь одной из композиций по пп. 13-16.
19. 19. Способ удлинения срока выживания пересаженной ткани у реципиента-примата, включающий в себя стадию введения эффективного количества какой-нибудь одной из композиций по пп. 13-16.
20. 20. Способ ослабления иммунологических осложнений, вызванных неблагоприятным исходом при пересадке ткани реципиентупримату, включающий в себя стадию введения эффективного количества какой-нибудь одной из композиций по пп. 13-16.
21. 21. Способ по любому из пп. 17-20, при котором иммуносупрессивное или иммуномодуляторное соединение является агентом, который блокирует Т-клеточное костимулирующее сигналирование через 0028.
22. 22. Способ по любому из пп. 17-20, при котором иммуносупрессивное или иммуномодуляторное соединение является агентом, который блокирует сигналирование кальцинейрина.
23. 23. Способ по п.22, при котором агент выбран из циклоспорина и такролимуса.
24. 24. Способ по любому из пп. 17-20, при котором иммуносупрессивное или иммуномодуляторное соединение является кортикостероидом или антипролиферативным агентом.
25. 25. Способ по любому из пп. 17-20, при котором иммуносупрессивное или иммуномодуляторное соединение выбрано из сиролимуса, микофенолата мофетила, мизорубина, дезоксиспергуалина, бреквинара натрия, лефлуномида и азаспирана.
26. 26. Способ ингибирования отторжения тканевого трансплантата реципиентомприматом, включающий в себя стадии имплантации тканевого трансплантата указанному примату; и введение эффективного количества композиции, содержащей блокатор связывания 0040:00154 указанному примату на 2, 4, 6, 8, 12, 16 и 28 дни, считая со дня имплантации, где указанный блокатор связывания 0040:00154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с 00154, его антигенсвязывающий фрагмент или производное.
27. 27. Способ ингибирования отторжения тканевого трансплантата реципиентомприматом, включающий в себя стадии введения эффективного количества блокатора связывания

    0040:00154 предполагаемому реципиенту29 примату; имплантации через день после этого указанному примату тканевого трансплантата и сопутствующего введения эффективного количества композиции, содержащей блокатор связывания СЭ40:СЭ154 указанному примату на 3, 10, 18 и 28 дни, считая со дня имплантации, где указанный блокатор связывания СЭ40:СЭ154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с СО 154, его антигенсвязывающий фрагмент или производное.
28. 28. Способ по п.27, включающий в себя дополнительную стадию повторного введения эффективного количества блокатора связывания СО40:СО154 указанному примату ежемесячно, начиная через один месяц после 28-го дня, считая со дня имплантации.
29. 29. Способ реверсии острого отторжения тканевого трансплантата у реципиента-примата, включающий в себя стадию введения эффективного количества композиции, содержащей блокатор связывания СО40:СО154, указанному примату в тот день, когда у указанного примата проявляются признаки острого отторжения трансплантата, и на 3, 10, 18 и 28 дни после этого, где указанный блокатор связывания СО40:СО154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с СО 154, его антиген-связывающий фрагмент или производное.
30. 30. Способ по п.29, включающий в себя дополнительную стадию повторного введения эффективного количества блокатора связывания СО40:СО154 указанному примату ежемесячно, начиная через один месяц после 28-го дня, считая со дня проявления признаков острого отторжения трансплантата.
31. 31. Способ по любому из пп. 1, 5, 7, 8, 26, 27 или 29, при котором указанным приматом является человек.
32. 32. Способ по любому из пп.1, 5, 7, 8, 26, 27 или 29, при котором блокатор связывания СО40:СО154 вводится указанному реципиентупримату способом, выбранным из группы, состоящей из (а) парентерального способа введения; (Ь) введения биосовместимого или биодеградируемого имплантата с постепенным высвобождением; (с) вживления инфузионного насоса; (ά) перорального или энтерального введения; и (е) местного введения.
33. 33. Способ по пп.1, 5, 7, 8, 26, 27 или 29, при котором блокатор связывания С040:С0154 вводится донору пересаживаемой ткани до интеграции указанной ткани упомянутому реципиенту-примату.