CZ458899A3 - Použití činidla rušícího vazbu CD40:CD154 pro přípravu léku ke zmírnění syndromů způsobených inhibicí exogenního proteinu - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká obecně potlačení (suprese) nežádoucí imunitní odpovědi, zvláště protiadaptivní imunitní odpovědi zprostředkované T-lymfocyty. Vynález se konkrétně týká prevence, léčení, suprese nebo reverze imunologické inhibice terapeutické aktivity exogenně podávaných proteinů nebo jiných biologických terapeutických činidel.

Dosavadní stav techniky

Hemofilie A je genetická porucha vázaná na X, která postihuje 1 až 2 muže z každých 10 000 živě narozených.

Jedinci trpící hemofilií A má částečný nebo úplný funkční deficit endogenního koagulačního faktoru VIII (FVIII) a musí být léčeni tím, že dostávají náhradní purifikovaný nebo rekombinantní FVIII (Lusher et al., 1993, 328 N. Eng. J. Med. 453-459) . Přibližně u 15 % jedinců s hemofilií A se jako reakci na nahrazovací terapii rozvine protilátková odpověď s vysokým titrem (tj. > 10 BU/ml). Tito jedinci jsou označováni jako silně odpovídaví (McMillan et al., 1988, 71 • · · · > · · « » · · <

• · · · · <

• « • ·

Blood 344-348). Tyto protilátky, zvané inhibitory FVIII, blokují funkci (biologickou aktivitu) terapeutického činidla nahrazujícího FVIII tím, že se váží na podávaný exogenní FVIII. Tato protiadaptivní humorální imunitní odpověď činí léčení krvácení u silně odpovídavých jedinců velmi problemnatickým. Menší krvácivé události (např. hemartrózy) j sou často uspesne léčeny koncentrátem aktivovaného protrombinového komplexu (např. Autoplex nebo FEIBA, FVIII inhibitor bypass activity), ale silné krvácení je obtížně léčitelné pomocí Hematol. 319-329) nízkou hladinu těchto látek (Brettler, 1996, 9 Clin.

Většina silně odpovídavých jedinců má protilátek inhibujících FVIII, dokud nedostanou následnou infúzi FVIII, která stimuluje (zesiluje) tvorbu blokujících protilátek. Proto je nová indukce inhibičních protilátek u silně odpovídavých jedinců vysoce předvídatelná (Brettler et al., 1996, 9 Clin. Hematol. 319329). Bylo ukázáno, že profylaxe s FVIII snižuje výskyt intraartikulárních hemoragií a chronických artropatií u pacientů trpících hemofilií (Liesner et al., 1996, 92, Br.

J. Haematol. 973-978). Avšak tito silně odpovídaví jedinci nemohou být profylakticky ošetřováni FVIII vzhledem k jejich specifické humorální imunitní odpovědi na FVIII.

Silně odpovídaví jedinci s indukovatelnou, silnou imunitní odpovědí na FVIII jsou často léčeni pravidelnými infúzemi velmi vysokých dávek FVIII v režimu, který byl navržen tak, aby indukoval toleranci k exogennímu terapeutickému FVIII (Brettler et al., 1996, 9 Clin. Hematol.

319-329). V některých případech režimu podávají imunomodulační cyklofosfamidy, intravenózní

Toleranční terapie je účinná odpovídavých jedinců (Mariani se v průběhu tolerančního, činidla (glukokortikoidy, imunoglobulin (IVIg)). u 50 % až 80 % silně et al., 1994, 72 Thromb.

• · · ·· ·· ·» • « · · · · • · · ♦ · • · ··· ·· ·

Haemostasis 155-158). Náklady na takovou terapii se pohybují v rozmezí 200 000 US$ až 1 milión US$ na osobu. Jelikož infúze FVIII indukuje u silně odpovídavých jedinců velmi vysoké hladiny inhibitorů v průběhu toleranční periody, která často trvá 32 až 8 měsíců, tito jedinci nemohou být léčeni FVIII, jestliže u nich dojde ke krvácení (Brettler et al., 1996, 9 Clin. Hematol. 319-329).

Po úspěšné indukci tolerance jsou jedinci udržováni často na profylaktických infuzích podávaných 2 až 3x týdně (Brettler et al., 1996, 9 Clin. Hematol. 319-329). Mechanismy indukce tolerance tímto způsobem nejsou jasné, ale mohou zahrnovat indukci anti-idiotypových protilátek (Gilles et al., 1996, 97 J. Clin. Invest 1382-1388)a nebo přímou supresi klonů B-buněk tvořících protilátky inhibující FVIII. Kromě toho přípravky IVIg obsahují anti-idiotypové protilátky proti FVIII inhibitorům, což může vysvětlit účinnost této terapie u některých silně odpovídavých jedinců (Sultán et al., 1991, 91 Am. J. Med. 5A-24S-5A-39S. Ve velmi těžkých a život ohrožujících případech, kdy je při krvácení nezbytné užít léčení pomocí FVIII, mohou být inhibitory FVIII odstraněny mimotělní imunoabsorpcí na koloně s anti-Ig nebo proteinem A (Knobl et al., 1995, 74 Thromb. Haemostasis 1035-1038, Gjorstrup et al., 1991, 61, Vox Sang. 244-250). Tyto postupy jsou většinou velmi zdlouhavé a vedou k 50% až 70% snížení celkové hladiny sérových imunoglobulinů (Ig) ( Knobl et al., 1995, 74 Thromb. Haemostasis 1035-1038) a tudíž potenciálně k vyššímu riziku infekce.

Podobné komplikace při nahrazovací proteinové terapii se vyskytují u dalších vrozených nebo získaných nemocí charakterizovaných deficitem proteinu, kam patří např. deficit dalších koagulačních faktorů, krevních nebo plazmatických proteinů, růstových faktorů apod. Kromě toho se s podobnými potížemi setkáváme i v jiných klinických situacích, jako např. když se terapeuticky podává rekombinantně připravený protějšek endogenního, ale vzácného nebo izolovaně se vyskytujícího proteinu. Tak např. se s obdobným problémy lze setkat při terapii, jejíž součástí je podávání rekombinantních cytokinů, lymfokinů, růstových faktorů nebo enzymů. Jedním z příkladů je podávání erytropoetinu (EPO) k léčení anemie. Jiným příkladem je podávání interferonu β (IFNP) k léčení roztroušené sklerózy mozkomíšní (MS) . Ještě dalším příkladem je podávání lidského růstového hormonu pro terapeutické urychlení růstu. K podobným problémů dochází také, když se terapeuticky podává mikrobiální protein, jako např. streptokináza, která se podává při léčení infarktu nebo jiných typů cévních okluzí.

Existuje tudíž zjevná potřeba zlepšeného a účinnějšího imunosupresivního nebo imunomodulačního léčení k minimalizaci nebo potlačení tvorby inhibičních protilátek, které se váží na exogenně podávané proteiny, čímž blokují jejich terapeutickou účinnost. Zvláště je značná potřeba takového léčení, při kterém nedochází k celkové imunosupresi T-buněk, tzn. takové léčení, které neponechává léčeného pacienta bezbranného vůči malignitám a oportunním infekcím. Ještě důraznější je potřeba zvrácení nebo potlačení inhibičního syndromu, který znemožňuje podávání potřebných terapeutických proteinů, jako je např. FVIII, těm jedincům, kteří je potřebuj i.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je použití imunomodulačního činidla, které zmírňuje protiadaptivní odpověď T-buněk bez potřeby « · A * · · · ··· ··· “ * . * A·· AA AAAAAAA AA celkové imunosuprese T-buněk. Dalším předmětem vynálezu je poskytnout imunomodulační činidlo, které zmírňuje závažnost protiadaptivní humorální imunitní odpověď na potřebný exogenně podávaný proteinový léčivý přípravek. Dalším cílem vynálezu je poskytnout imunomodulační činidlo, které zpomaluje nástup protiadaptivní humorální imunitní odpovědi na potřebný exogenně podávaný proteinový léčivý přípravek. Dále je předmětem vynálezu poskytnout imunomodulační činidlo, které potlačuje nebo obrací protiadaptivní humorální imunitní odpověd na potřebný exogenně podávaný proteinový léčivý přípravek. Dalším předmětem vynálezu je poskytnout imunomodulační činidlo, které zpomaluje nástup protiadaptivní humorální imunitní odpovědi na potřebný exogenně podávaný proteinový léčivý přípravek. Dále vynález poskytuje imunomodulační činidlo, které přerušuje přenos kostimulačního signálu aktivovaným T-buňkám, zvláště kostimulační signál ke tvorbě imunoglobulinů. Zvláštním předmětem vynálezu je poskytnutí činidla rušícího vazbu CD40:CD154, jako je např. činidlo blokující CD154, pro použití k léčení, zvláště ke zmírnění, zpoždění nástupu nebo zvrácení protiadaptivní odpovědi inhibičních protilátek (tj. inhibitorů) na potřebné exogenní terapeutické činidlo, jako je např. FVIII.

Předkládaný vynález je založen na objevu, že použití činidla rušícího vazbu CD40:CD154, jako je např. činidlo blokující CD154, oslabuje, potlačuje, zabraňuje, zpožďuje nebo ruší protiadaptivní odpověď inhibičních protilátek (inhibitorů) na proteinový antigen, aniž by byla potřebná celková suprese příjemcova imunitního systému. Přesněji řečeno, předkládaný vynález je založen na objevu, že použití činidla blokujícího CD154 oslabuje, potlačuje, zabraňuje, zpožďuje nebo ruší nežádoucí inhibičních humorální imunitní odpověď, která blokuje biologickou aktivitu proteinu ··· ··· • · • · ·· terapeuticky podávaného jedinci k nahrazení nebo zvýšení nativní biologické aktivity endogenního, ale defektního proteinu, jako je např. koagulační faktor, např. FVIII.

Předkládaný vynález tudíž poskytuje použití činidla rušícího vazbu CD40:CD154 pro přípravu léku (dále stručně jen použití podle vynálezu) k terapii syndromů inhibice exogenního proteinu. První použití podle vynálezu je k oslabení nebo zmírnění závažnosti syndromu inhibice exogenního proteinu. Druhé použití podle vynálezu potlačuje škodlivé účinky syndromu. Třetí použití podle vynálezu zabraňuje rozvinutí syndromu. Čtvrté použití podle vynálezu zpožďuje nástup syndromu. Páté použití podle vynálezu inhibuje vývoj syndromu. Šesté použití podle vynálezu způsobuje reverzi syndromu. Sedmé použití podle vynálezu slouží k uchován terapeutické účinnosti exogenního proteinu, jako je např. terapeutický protein podávaný proto, aby nahradil nebo doplnil nativní, ale defektní protein. Osmé použití podle vynálezu umožňuje obnovení terapeutické účinnosti takových exogenních proteinů. Všechna uvedená použití se týkají použití činidla přerušujícího vazbu CD40:CD154, čímž je myšleno jakékoliv činidlo rušící vazbu CD40 ligandu (tj . CD40L, známý také jako CD154 nebo antigen 5c8 a někdy též označován jako gp39) k příslušnému receptorů (tj . CD40), pro přípravu léku k léčení subjektu trpícího nebo ohroženého syndromem inhibice exogenního proteinu, čímž je myšlena antiadaptivní humorální imunitní odpověď, která blokuje (ruší) biologickou účinnost exogenního proteinu. Výhodně je činidlem rušícím vazbu CD40:CD154 činidlo, které blokuje CD154 (CD40L), čímž je myšleno jakékoliv činidlo, které se váže na CD154 a tím zabraňuje vazbě s příslušným receptorem (tj. CD40) nebo ji alespoň ruší. Příkladem činidla blokujícího CD154 je monoklonální protilátka (MAb), zvláště • ·

444 444 taková, která má antigenně-specifické vazebné charakteristiky monoklonální protilátky 5c8, popsané v patentu US 5 474 771, jejíž popis je zahrnut v odkazech.

Jak bylo již uvedeno, předkládaný vynález lze aplikovat s cílem oslabit nebo zmírnit inhibiční syndromy namířené proti exogenním (cizorodým) proteinům, které jsou podávány proto, aby nahradily nebo zvýšily biologickou aktivitu nativního (endogenního) proteinu, který je defektní.

Předkládaný vynález lze aplikovat také ke zmírnění nebo potlačení inhibičních syndromů namířených proti dalším exogenním proteinům, jako jsou např. jakékoliv exogenní proteiny podávané· k terapeutickým účelům. Např. lze vynález uskutečnit s cílem potlačit, zvrátit nebo zastavit inhibiční reakci namířenou proti jakémukoliv proteinovému léčivu připravenému rekombinantní technologií, zvláště proti proteinovému léčivu, které má primární strukturu (sekvenci) v podstatě podobnou (např. v podstatě identickou) s nativním, funkčním, ale vzácně se vyskytujícím proteinem, nebo nativním proteinem, který je přirozeným způsobem omezen jen na určitou tělní strukturu nebo kompartment, jako je např. kostní dřeň, lymfatické uzliny nebo centrální nervový systém. Obdobně lze vynález aplikovat k potlačení nebo zvrácení inhibiční odpovědi na rekombinantní verzi nativního proteinu, který je exprimován přechodně nebo je exprimován pouze jako odpověď na specifický vnější podnět nebo jen v určitém okamžiku v průběhu vývoje. Tudíž vynález lze použít k oslabení nebo zlepšení inhibiční reakce proti růstovým hormonům, faktorům hojícím rány (jako je např. tkáňový regenerační faktor nebo diferenciační faktor), cytokinům nebo lymfokinům (např. faktor stimulující kolonie, faktor kmenových buněk, interferon, interleukin), enzymům (např. glukocerebrosidáza), koagulačním faktorům (např. trombin, protrombin, faktory V, • · · · ··· ··« • ·· » · ··

VII, VII, IX, X, XI a XII) nebo jiným složkám plazmy (jako je např. albumin, aktivátor tkáňového plasminogenu). Dále lze vynález použít k oslabení nebo zlepšení inhibiční reakce proti cizorodému proteinu, zvláště bakteriálnímu proteinu (např. streptokináza), který se podává k terapeutickým účelům (např. léčení cévních okluzí). Výhodným subjektem pro aplikace vynálezu je člověk. Konkrétně je možné aplikovat vynález u lidí trpících hemofilií ke zmírnění nebo zlepšení syndromu inhibice koagulačního faktoru.

Výše zmíněné a ještě další předměty předkládaného vynálezu společně s podrobnými vlastnostmi a výhodami budou pro lepší porozumění vysvětleny dále pomocí výhodných provedení vynálezu.

Podrobný popis vynálezu

Aktivace T-buněk, a na ní závislé další imunologické procesy, vyžaduje jak signály zprostředkované receptory T-buněk (TCR), tak simultánně předávané tzv. kostimulační signály. Důležitý kostimulační signál se přenáší navázáním CD4 0 buněk prezentujících antigen, jako např. B-buněk, na CD40L (CD154) T-buněk. Lidský CD40 je buněčný povrchový protein velikosti 50 kD exprimovaný na zralých B buňkách, a také na makrofágách a aktivovaných endotelových buňkách. CD40 patří do třídy receptorů podílejících se na programované buněčné smrti (apoptóze), kam patří také Fas/CD95 a alfa receptor nádorového nekrotického faktoru (TNF). Lidský CD154 (CD40L) je membránový glykoprotien typu II velikosti 32 kD, který vykazuje homologii s TNF alfa, který je přechodně exprimován primárně na aktivovaných T-buňkách. Bylo ukázáno, že vazba CD40:CD154 je nutná pro všechny typy protilátkové odpovědi závislé na T-buňkách. Konkrétně vazba CD40:CD154 poskytuje antiapoptotický a/nebo stimulační signál pro lymfokiny.

Důležitost vazby CD40:CD154 při podpoře biologické odpovědi závislé na T-buňkách je podtržena objevem, že syndrom X-vázané hyper-IgM (X-HIGM) u lidí je fenotyp vyplývající z genetického nedostatku funkčního CD154. Jedincí s X-HIGM mají normální nebo vysoké hladiny IgM, ale selhává u nich tvorba protilátek IhG, IgA nebo IgE a trpí opakovanými, někdy velmi těžkými, bakteriálními a parazitárními infekcemi, a také zvýšeným výskytem lymfomů a abdominálních rakovin. Obdobný fenotyp byl pozorován u zvířat nulizygotních pro gen kódující CD154 (tzv. knockout, tj. s vyřazenou funkcí genu). B-buňky nulizygotních zvířat mohou produkovat IgM i za absence vazby CD40:CD154, nejsou však v takových podmínkách schopny přepnutí isotypu (isotype switching) nebo normálně přežívat po afinitním zrání (maturaci). V nepřítomnosti funkční interakce CD40:CD154 se nevyvíjejí správně germinální centra lymfatických uzlin a paměťové B-buňky buďto mají narušený vývoj nebo úplně chybí. Tyto defekty pak přispívají k silnému snížení nebo úplnému vymizení druhotné (zralé) protilátkové odpovědi. Byly pozorovány také defekty buněční imunity, které se projevují zvýšeným výskytem bakteriálních a parazitárních infekcí. Mnoho z těchto defektů zprostředkovaných buňkami je reverzibilních, tj . může být odstraněno podáváním IL-12 nebo IFN-gamma. Tyto údaje opodstatňují názor, že vazba CD40:CD154 podporuje vývoj imunitní odpovědi T pomocných buněk typu I.

Blokování interakce CD40:CD154 v průběhu imunizace proteinovými antigeny může u myši specificky blokovat protilátkovu odpověď na tento antigen (Foy et al., 1993, 178, J, Exp. med. 1567-1575). Např. protilátky anti-CD154 mohou blokovat indukci protilátek proti kolagenu u kolagenem φφ φφ ► · φ · » φ ♦ · φφφ φφφ • · φφ φφ indukované artritidy (Durie et al., 1993, 261, Scinece 13281330). Protilátky anti-CD154' mohou redukovat snížit hladiny autoprotilátek anti-dsDNA a anti-nukleosom u myši, které mají spontánní lupus (Mohan et al., 1995, 154, Immunol. 14701480) . Kromě toho protilátky anti-CD154 symptomy u myší s experimentální encefalomyelitidou (EAE) , která je modelem mohou oslabit autoimunitní MS. Podobné výsledky byly popsány u modelových hlodavců pro nemoc štěpversus-hostitel (odhojení štěpu), glomerulonefritidu indukovanou chloridem rtuťnatým a zánětlivou střevní nemoc.

Blokování CD40:CD154 tedy může poskytnout potenciálně účinnou terapii pro zmírnění nebo zlepšení nežádoucí imunitní reakce, zvláště pokud jde o autoimunitní nemoci, nebo kdekoliv tam, kde cílový antigen je protein s terapeutickým významem, jehož účinnost je snižována protiadaptivní imunitní odpovědí. I přes četné popisované slibné výsledky, studie prováděné na modelových hlodavcích s indukovanou protiadaptivní imunologickou nemocí (např. autoimunitní) špatně korelovaly s výstupy testů u skutečných nemocí nebo na preklinických modelových systémech velkých zvířat (např. primátů).

V předkládaném vynálezu se popisují protokoly k hodnocení účinku výhodného činidla blokujícího CD154, humanizované monoklonální protilátky, která má antigenněspecifické vazebné vlastnosti monoklonální protilátky 5c8 (Lederman et al., J. Exp. Med. 175: 1091.1101, 1992) u preklinických modelů, o kterých se věří, že mají prediktivní hodnotu pokud jde o terapeutickou účinnost při léčení syndromů inhibice exogenního proteinu. Konkrétně předkládané modely obsahují terapii blokováním CD154 ke zmírnění nebo zleošení bioinhibiční humorální imunity specifické pro koagulační faktory (např. FVIII) a lymfokiny

• · ♦ • 4

(např. IFNP). Tyto modely lze adaptovat, což nevyžaduje nic jiného než rutinní úpravy, ke stanovení účinnosti terapie blokování CD154 k oslabení nebo zlepšení inhibiční látkové imunity namířené proti jakémukoliv terapeuticky významnému proteinu.

Následující diskuse demonstruje řadu okolností, za jakých lze vynález využít a příklady pak popisují specifická provedení vynálezu.

Subjekty

Vynález je možné využít při léčení nebo profylaxi u jakéhokoliv subjektu - savce, který potřebuje, nebo už dostává, proteinovou nahrazovací terapii nebo jakékoliv proteinové léčivo. Tudíž vhodný subjekt trpí, nebo je v ohrožení, rozvíjejícím se syndromem inhibice exogenního proteinu. Např. pacienti trpící hemofilií léčení exogenním FVIII jsou v podstatném riziku, že se stanou silně odpovídavými, čímž FVIII ztratí účinnost pro svůj původní zamýšlený účel, tj. potlačení krvácení. Tudíž je vynález zvláště výhodný pro hemofílíky. Způsob, jak stanovit, zda se u hemofilika vyvinula inhibiční odpověď proti terapeuticky podávanému FVIII a/nebo se stal vysoce odpovídavým je odborníkovi dobře známa (viz např. Hematology: Clinical and Laboratory Practice, vol 2., Bick (ed.), Mosby-Year Boo, lne., 1993, pp. 1544-1548. Výhodně je subjekt primát, výhodněji vyšší primát a nejvýhodněji člověk. V jiných provedeních vynálezu je subjektem jiný savec, který je ohrožen tím, že se u něj vyvine syndrom inhibice exogenního proteinu, zvláště komerčně významný savec, nebo společenské domácí zvíře nebo jiný hodnotný živočich, jako např. příslušník ohroženého druhu. Takže k vhodným subjektům patří (přičemž výčet není omezující) ovce, koně, krávy, kozy, • · · · · · • 4 4 ··· ···

4 9 9

949 4444 44 99 prasata, psi, kočky, králíci, morčata, křečci, pískomilové, krysy a myši.

Příklady činidel rušících vazbu CD40:CD154

K terapeutickým sloučeninám vhodným pro způsoby podle vynálezu patří jakákoliv sloučenina, která blokuje interakci CD40 na buněčném povrchu (např. na B-buňkách) s CD40L (CD154) exprimovaným např. na povrchu aktivovaných T-buněk. Sloučeniny rušící vazbu CD40:CD154, jako je např. činidlo blokující CD154, které jsou specificky zahrnuty do vynálezu, jsou např. polyklonální protilátky a monoklonální protilátky (MAb), a také deriváty protilátek jako jsou chimérické molekuly, humanizované molekuly, molekuly se sníženou efektorovou funkcí, bispecifické molekuly a konjugáty protilátek. Ve výhodném provedení vynálezu jde o protilátku, která má v podstatě stejné antigenně-specifické vazebné charakteristiky jako protilátka 5c8, která byla popsána v Patentu US 5 474 771, na který se tímto plně odkazujeme.

V současném velmi výhodném provedení vynálezu je protilátka humanizovaná protilátka 5c8 (hu5c8). K dalším známým protilátkám proti CD154 patří protilátky ImxM90, ImxM91 a ImxM92 (od firmy Immunex Corp., Seattle, WA), monoklonální protilátka anti-CD40L komerčně dostupná od firmy Ancell (klon 24-31, katalog. č. 353-020, Bayport, MN) a monoklonální protilátka anti-CD154 komerčně dostupná od firmy Genzyme (Cambridge, MA, katalog, č. 80-3703-01) . Také je komerčně dostupná monoklonální protilátka anti-CD154 firmy PharMingen (San Diego, katalog, č. 33580D). Mnohé další protilátky anti-CD40L byly připraveny a charakterizovány (viz např. přihláška WO 96/23071, Bristol-Myers Squibb, na jejíž popis se tímto odkazujeme).

• « » ·· • ·· ♦· ·♦ • · · ♦ · · « · • * · · · · • · * ♦·· ··· • · · · »·· ·♦·· ·· ♦·

Vynález se týká také použití dalších činidel blokujících CD154, která jsou odvozena nebo připravena z výše uvedených, případně ekvivalentních, monoklonálních protilátek jako jsou např. úplné fragmenty Fab, F(ab')2, úseky V_H, Fv, jednořetězcové protilátky (viz např. WO 96/23071), polypeptidy, fúzní konstrukty polypeptidu, fúze obsahující CD40 (jako např. CD40Ig, viz publikace Hollenbaugh et al., J. Immunol. Meth. 188: 1-7, 1995) a sloučeniny s malými molekulami jako jsou malé semipeptidové sloučeniny nebo nepeptidové sloučeniny, schopné blokovat nebo přerušovat vazbu CD40:CD154. Způsoby, jak navrhovat malé molekuly, provádět jejich screening a optimalizovat je, byly popsány v patentové přihlášce PCT/US96/10664, podané 21. června 1996, na kterou se tímto odkazujeme.

Ve vynálezu lze užít činidla blokující CD154, odvozená od protilátek, připravená standardními technikami rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře 349: 293-99, 1991). Např. k jedné třídě činidel blokujících CD154 patří chimérické protilátky nebo fúzní proteiny, které jsou konstruovány tak, že nukleová kyselina kódující antigen vázající doménu protilátky savce jiného než člověka (např. protilátky myši nebo potkana) požadované specifičnosti spojena s nukleovou kyselinou kódující lidskou konstantní doménu imunoglobulinu (Ig) (viz např. Cabilly et al., patent US 4 816 567, Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-55, 1984) . Chimérické protilátkové polypeptidy exprimované z takových konstruktů jsou obecně méně imunogenní, když se použijí v klinickém ošetření nebo profylaxí u člověka, než původní jiné než lidské protilátky, ze kterých je chiméra odvozena.

Druhou třídu činidel blokujících CD154 patří rekombinantní humanizované nebo primatizované protilátky.

• · · · • · · · * ··· ··· protilátky jiného než • · · ♦ • · · ·· · ··

Humanizované nebo primatizované protilátky jsou s požadovanou specifičností získané ze savce člověka, ve kterých byla technologie rekombinantní DNA užita k nahrazení některých nebo všech kodonů pro aminokyseliny, které nejsou potřeba pro navázání antigenu, jinými kodony pro aminokyseliny z odpovídajících úseků lehkého a těžkého řetězce imunoglobulinu člověka nebo primátů. Neboli jsou to chiméry obsahující z větší části lidské imunoglobulinové sekvence, do kterých byly vloženy metodami genového inženýrství úseky odpovídající za specifickou vazbu antigenu (viz např. patentová přihláška PCT WO94/04679). Humanizované protilátky jsou dokonce ještě méně imunogenní in vivo než chimérické protilátky. Pro realizaci vynálezu je výhodná humanizovaná monoklonální protilátka, která má v podstatě stejnou antigenní specifitu jako monoklonální protilátka 5c8 (hu5c8).

Další třída činidel blokujících CD154 odvozených z protilátek zahrnuje lidské protilátky, které lze připravovat ve zvířatech, např. v transgenních zvířatech, která nesou integrovaný jeden nebo několik lidských imunoglobulinových transgenů. Taková zvířata se mohou užít např. jako zdroj splenocytů pro přípravu hybridomů, jak bylo popsáno v patentu US 5 569 825.

Samozřejmě je také možné užít jakékoliv antigenně specifické vazebné fragmenty kterékoliv výše zmíněné protilátky nebo z ní odvozeného terapeutického činidla, a to za předpokladu, že fragment je dostatečně velký na to, aby sféricky zabránil navázání CD154 na příslušný receptor. takže je možné užít fragmenty monoklonálních protilátek nebo univalentní monoklonální protilátky. Univalentní protilátky obsahují dimer těžký/lehký řetězec vázaný k Fc úseku (stonku) druhého těžkého řetězce. Úsek Fab označuje takový

Μ ·· *· ·· · ’ ' ·· · · · « ♦ · ···· * · · · · * • · · · · · * ··· ··· • · · · · · · ·*· ·· ··· ·*·· ·· ♦ · úsek řetězců, který je zhruba ekvivalentní nebo analogický sekvenci, která obsahuje úsek těžkého řetězce z oblasti rozvětvení ve tvaru Y a celý lehký řetězec, a který v agregátech projevuje protilátkovou aktivitu. Protein Fab obsahuje agregáty těžkého a lehkého řetězce (obecně známé jako Fab') a také tetramery, které odpovídají rozvětveným segmentům protilátky tvaru Y (známým jako F(ab)₂), ať už jsou agregovány kovalentně nebo nekovalentně, pokud jsou agregáty schopny selektivně reagovat s určitým antigenem nebo antigenní rodinou.

Kromě toho lze užít standardní techniky rekombinantní DNA ke změně vazebné afinity rekombinantních protilátek s jejich antigeny tím, že se změní aminokyselinové zbytky v blízkosti míst vázajících antigen. Vazebná afinita pro antigen humanizované protilátky se dá zvýšit mutagenezí založenou na molekulárním modelování (Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-33, 1989, PCT patentová přihláška WO 94/04679. Může totiž být žádoucí zvýšit nebo snížit vazebnou afinitu protilátek k CD154, v závislosti na typu cílové tkáně nebo předpokládaném konkrétním léčebném schématu. To lze udělat pomocí metody fágové expozice (phage display tehnique), viz např. Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 433-445, 1994 a Schier et al., J. Mol. Biol.

255: 28-43, 1996, které tímto zahrnujeme do odkazů). Např.

může být výhodné podávat pacientovi konstantní hladinu protilátek se sníženou afinitou k CD154 s částečně profylaktickým cílem. Nebo zase naopak protilátky se zvýšenou afinitou k CD154 mohou být výhodné pro krátkodobá léčení.

Způsoby podávání

Činidla rušící vazbu CD40:CD154, včetně činidel blokujících CD154, použitá podle vynálezu, se mohou podávat « · · ► ftft · ·· * ft ft ft

4 4 4

4 4

4 44 * jakýmkoliv lékařsky přijatelným způsobem. V závislosti na specifických okolnostech může být žádoucí lokální nebo systémové podávání. Výhodně se sloučenina podle vynálezu podává parenterálně, např. intravenózní, intraarteriální, subkutánní, intramuskulární, intraorbitální, intraventrikulární, intraperitoneální, subkapsulární, intrakraniální, intraspinální nebo intranasální injekcí, nebo infúzí či inhalací. Sloučenina může být také podávána subjektu implantací infúzní pumpy nebo formou biokompatibilního nebo bioerodovatelného implantátu s dlouhodobým uvolňováním léčiva. Alternativně, některé sloučeniny podle vynálezu nebo přípravky, které je obsahují, jsou vhodné pro perorální podávání nebo enterální podávání. Další přípravky podle vynálezu jsou vhodné pro topické podávání.

V jiném provedení vynálezu se činidlo rušící vazbu CD40:CD154 poskytuje subjektu nepřímo, a to tak, že se podává vektor nebo jiný exprimovatelný genetický materiál kódující’ uvedené činidlo. Genetický materiál je internalizován a exprimován v buňkách nebo tkání subjektu, čímž je in šitu tvořeno činidlo rušící vazbu. Např. vhodný konstrukt nukleové kyseliny obsahuje sekvence kódující jeden nebo několik imunoglobulinových (Ig) řetězců monoklonální protilátky MAb 5c8, jak je popsáno v patentu US 5 474 771. Další vhodné konstrukty obsahují sekvence kódující chimérické nebo humanizované verze imunoglobulinových řetězců monoklonální protilátky 5c8 nebo její antigen vážící fragmenty. Ještě další vhodné konstrukty obsahují sekvence kódující část nebo celou jinou monoklonální protilátku specifickou pro CD154. Konstrukty jsou podávány systémově nebo lokálně, např. do místa v blízkosti místa implantace nebo inzulín-exprimující tkáně.

Alternativně je vektor nebo jiný genetický materiál kódující činidlo rušící vazbu internalizován vhodnou populací izolovaných buněk, čímž vzniknou hostitelské buňky produkující uvedené činidlo. Tyto hostitelské buňky se pak implantují příjemci nebo podávají infúzí, buďto lokálně nebo systémově, což poskytuje in sítu tvorbu činidla rušícího vazbu CD40:CD154. K vhodným hostitelským buňkám patří kultivované buňky jako jsou např. imortalizované buňky, a také buňky získané z příjemce (např. buňky periferní krve nebo buňky lymfatických uzlin, např. tzv. cytotoxické NK buňky).

Formulace přípravků

Obecně jsou sloučeniny podle vynálezu suspendovány, rozpuštěny nebo dispergovány ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo excipientu. Výsledný terapeutický přípravek neovlivňuje nepříznivě příjemcovu homeostázu, zvláště pak elekrolytovou rovnováhu. Tak např. vhodný nosič obsahuje normální fyziologický roztok (0,15M NaCl, pH 7,0 až 7,4). Jiným přijatelný nosič obsahuje 50mM fosforečnan sodný a lOOmM chlorid sodný. Mnohé další přijatelné nosiče jsou odborníkovi dobře známy a jsou popsány v odborné literatuře, např. v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro (ed), Mack Publishing Co., 1990. K přijatelným nosičům také patří nosiče obsahující biokompatibilní, inertní nebo biologicky absorbovatelné soli, pufrující činidla, oligo- nebo polysacharidy, polymery, činidla upravující viskozitu, konzervační látky apod.

Jakékoliv činidlo rušící vazbu CD40:CD154, jako je např. činidlo blokující CD154, které se užívá podle vynálezu, je formulováno tak, že se podává ve farmaceuticky účinném nebo terapeuticky účinném množství nebo dávce, což je množství,

• · 0 0 0 0 0 000 000 0 0 0 0 0 0 00 00 00 které je schopné vyvolat detekovatelný, výhodně lékařsky prospěšný, účinek u příjemce. Lékařsky prospěšný účinek znamená prevenci, zpoždění nebo zmírnění zhoršování zdravotního stavu nebo znatelné zlepšení zdravotního stavu příjemce. Tak např. titr inhibující protilátky proti potřebnému léčivu, kterým je exogenní protein, může být potlačen nebo snížen. Příkladem účinného množství terapeutické sloučeniny podle vynálezu, jako je např. činidlo blokující CD154, je jakékoliv množství, které v detekovatelné míře obnoví terapeutickou účinnost proteinového léčiva. Optimální účinné množství je takové množství, které v podstatě odstraní protiadaptivní protilátky, které způsobují inhibiční syndrom subjektu.

Dávkování a frekvence léčení

Velikost a frekvence dávek jakékoliv konkrétního přípravku podle vynálezu, který se má podávat pacientovi, spadá do kompetence a klinického úsudku příslušného odborníka v oboru lékařství, např. ošetřujícího lékaře. Všeobecné dávkování a režim podávání se stanoví na základě preklinických a klinických studií, které zahrnují extenzivní, ale rutinní studie k určení optimálních parametrů pro podávání dané sloučeniny. Dokonce i poté, co jsou poskytnuty tyto všeobecné pokyny pro podávání, ošetřující lékař často mění dávkování pro různé příjemce na základě řady úvah, týkajících se např. věku, zdravotního stavu, hmotnosti, pohlaví a případně léčení dalšími přípravky u konkrétního j edince.

Stanovení účinných dávek a léčebného režimu pro každé z činidel přerušujících vazbu CD40:CD154 podle vynálezu, je rutinní záležitostí pro odborníky v oboru farmacie a lékařství. Dávky a léčebný režim by měly být dostatečné • »· · ·· · ·· • ··· · • · · * · ··· ·· ··· ·· ·· ·· • · · · · · • * · · · e · ··· ··· • · · ···· ·· ·* k tomu, aby způsobily klinicky prospěšnou změnu alespoň v jednom nebo několika klinických příznacích pacientova zdravotního stavu. Příklady časového průběhu léčení a dávkovacího režimu jsou uvedeny v základní princip dokazující studii zahrnuté v příkladech.

Abychom uvedli nějaký příklad dávkování anti-CD154 sloučeniny, uvádíme dávkovači strategii monoklonální protilátky anti-CD154. Dávky lze podle toho snadno stanovit i pro jiné typy sloučenin blokujících CD154. Obecně připadá v úvahu jednotlivá dávka 0,05 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta, přičemž nejčastější jsou dávky 1 až 20 mg/kg. Pro profylaktíckouu iniciaci terapie blokování CD154, když je subjekt v remisi, nebo pro pohotovostní léčení akutní nemoci, je účinná dávka protilátky 1 mg/kg až 20 mg/kg tělesné hmotnosti podávaná denně nebo v intervalech 2 až 5 dnů po dobu 3 týdnů. Léčení lze udržovat poté intermitentním podáváním monoklonální protilátky, a sice v dávce 0,01 mg/kg až 20 mg/kg tělesné hmotnosti. Ve fázi udržovací léčby je interval mezi dávkami 1 týden až tři měsíce. V současnosti je výhodný interval mezi dávkami jeden měsíc (4 týdny).

Terapii blokování CD154 lze provádět, pokud je to třeba, sériově nebo v kombinaci s konvenční imunosupresivní terapií. Konvenční imunosupresiva (např. kortikosteroidy nebo inhibitor kalcineurinu) se mohou podávat současně v libovolném okamžiku terapie blokující CD154 podle úvahy lékaře. Alternativně mohou být monoklonální protilátky blokující CD154 konjugovány s konvenčními činidly. To výhodně dovoluje podávání konvenčních činidel v množství, které je menší než obvykle užívané dávky, např. méně než 50 % konvenční dávky, pokud by se činidlo podávalo v monoterapii. Tímto způsobem lze odstranit mnohé vedlejší účinky konvenčních činidel. Tudíž podle vynálezu monoklonální • ·· ··· · · ·· · • ft ftftftft •ftftft · ········ • ftft ftft ftft • ftft ftft ftftft ftftftft ftft ·· protilátky blokující CD154 se mohou užít společně s činidly cílenými na B-buňky jako jsou např. protilátky anti-CD19, anti-CD28 nebo anti-CD20 (nekonjugované nebo radioaktivně značené), antagonisté IL-14, LJP394 (blokátor receptorů, LaJolla Pharmaceuticals) , IR-1116 (malá molekula, Takeda) a anti-Ig idiotypové monoklonální protilátky. Alternativně mohou kombinace obsahovat činidla zaměřená na T-buňky/B-buňky, jako jsou např. CTLA4Ig, antagonisté IL-2, antagonisté IL-4, antagonisté IL-6, antagonisté receptorů, monoklonální protilátky anti-CD80/CD86, TNF, antagonisté LFA1/ICAM, antagonisté VLA4/VCAM, konjugáty brequinaru a IL-2 toxinu (např. DAB), prednison, monoklonální protilátka anti-CD3 (OKT3), mykofenolátmofetil (MMF), cyklofosfamid a další imunosupresiva jako jsou např. blokátory signalizace kalcineurinu, kam patří (aniž by výčet byl limitující) např. tacrolimus (FK506). Kombinace může také obsahovat činidla zamířená na T-buňky, jako jsou antagonisté CD4, antagonisté CD2 a IL-12.

Příklady provedení vynálezu

Preklinické modelové systémy pro hodnocení léčebných režimů činidel rušících vazbu CD40:CD154

V následujících příkladech jsou uvedeny současné výhodné příklady modelového systému pro testování účinnosti činidla rušícího vazbu CD40:CD154 (např. anti-CD40L sloučeniny nebo činidla blokujícího CD154, jako je např. monoklonální protilátka s vlastnostmi protilátky 5c8) . V každém z uvedených systémů lze provést rutinní změny tak, aby se publikovaný postup upravil podle potřeby k hodnocení účinků

• · • · · jakéhokoliv činidla rušícího vazbu CD40:CD154 na stav titru inhibujícího proteinu u modelového zvířete. Některé modifikace jsou zmíněny v následujících stručných přehledech, ale odborníkovi jsou zřejmé i mnohé další vhodně modifikace, které připadají v úvahu.

Příklad 1

Model knockout myši s hemofilií A

Nedávno popsali výzkumní pracovníci Amerického červeného kříže fertilní kmen nulizygotních myší s vyřazeným genem (tzv. knockout) pro nativní myší FVIII (Bi et al., 1995, 10 Nátuře Genetics, 119) . Tyto myši vykazují všechny relevantní patologické příznaky humánní hemofilie A. Navíc tento myší model věrně napodobuje etiologii nemoci: hereditární nebo kongenitální absenci biologicky aktivního nativního FVIII. Bylo popsáno, že podání bolusu lidského FVIII, způsobem odpovídajícím konvenční terapii nahrazování FVIII, spustilo u těchto myší tvorbu protilátek inhibujících FVIII (Quian et al., 1996, 88 Blood 656a, Suppl.) . Jiné způsoby podávání, zejména konstitutivní nahrazování prostřednictvím integrace adenovirového vektoru kódujícího funkční FVIII, představují proteinová léčiva, která jsou méně imunogenní (Connely et al., 1998, 91 Blood, 3273-3281).

Účinek činidla blokujícího CD154, např. anti-myší CD154 na vývoj vysoce odpovídavých jedinců v populaci výše uvedených hemofilických myší se hodnotí, obecně řečeno, následujícím způsobem:

Antigen (tj . FVIII) se injikuje jako bolusová dávka (např. 0, 2 gg) 0. a pak 14. den studie. 54. den studie se odebere vzorek krve a testuje se (rutinním ELISA testem) na • · • · · » * · · ··· 999 přítomnost protilátek inhibujících FVIII. Pak se zvířatům v testované skupině (např. 5 zvířat, obdobný počet zvířat se vezme do jedné nebo několika kontrolních skupin) podá odpovídající dávka anti-myší CD154 (např. 250 μg i.p. nebo

i. v.

např. 55. a/nebo 57. den studie. Zesilovací dávka

FVIII se pak podá 56. den. Poté se odeberou vzorky krve a testují se v příslušné dny, aby se sledoval rozvoj, a u testované skupiny potlačení nebo zvrácení, sekundární odpovědi inhibičních protilátek na FVIII. Tak např. krev se odebere 74., 81. a 96. den studie.

I přes jistou individuální variabilitu mezi zvířaty v testované skupině terapie blokováním CD154 významně zeslabila nebo potlačila sekundární humorální imunitu k FVIII.

Příklad 2

Model chimérické myši SCID-hu

Tento modelový systém chimérické myši SCID-hu, původně publikovaný v Mosier et al. (1998, 335 Nátuře 256-259), je založen na imunologické záchraně (funkční rekonstituci) myši se silnou kombinovanou imunodeficiencí (SCID) implantací normálních lidských leukocytů z periferní krve (PBL), která vedla k vytvoření stabilní chiméry myš-člověk. Tento systém byl použit pro četné výzkumy chování a dynamických interakcí lidských lymfocytů in vivo. Tento modelový systém byl také užit ke zkoumání toho, jak činidla rušící vazbu CD40:CD154 ovlivňují reakci normálních lidských leukocytů na myší erytrocyty (použité zde jako modelový antigen) (Chen et al., 1995, 155 J. Imunol. 2833-2840). V této studii bylo ukázáno, • ·

	• · · · to • to toto to • · · · · • · · · *·· ·· · · <	• to to · to · • · · · · • · ··· ··· • ·· ···· ·· ··
23
že monoklonální protilátky anti-CD40 a snížení celkové tvorby Ig u člověka.	antiCD154	vedou ke
Tento modelový systém dovoluje	hodnotit	účinek
anti-CD154, např. hu5c8, na lidské	T-buňky	in vivo,

s použitím libovolného proteinu jako testovaného antigenu. Podle jedné vhodné modifikace je možné připravit chiméry SCID-hu tak, že se implantují lidské PBL z člověka trpícího hemofilií. Samozřejmě je možné užít stejný postup s PBL kteréhokoliv člověka trpícího syndromem inhibice exogenního proteinu. V případě myši SCID-hu připravené z vysoce odpovídavého jedince s hemofilií se vhodný počet myší (2 až 5 nebo více) rozdělí do následujících pokusných skupin: skupina A (hu5c8 a FVIII), skupina B (samotná hu5c8), skupina C (samotný FVIII), skupina D (pouze vehikulum), skupina E (kontrolní Ig a FVIII) a skupina F (samotný kontrolní Ig) . Testovaná sloučenina a/nebo kontrolní látka se smíchají s PBL v okamžiku implantace a aplikují se i.p. 2. a 4. den studie. Kinetika průběhu reakce inhibující FVIII se pak monitoruje standardním způsobem (testem ELISA) pomocí vzorků krve odebíraných ve vhodných intervalech po dobu několika týdnů.

Terapie s hu5c8 významně zeslabila nebo potlačila sekundární humorální imunitu k FVIII.

Příklad 3

Model primátů: AVONEX (IFN-β)

Primáti, makak rhesus nebo makak jávský, se rozdělí např. po 2 až 4 zvířatech, do vhodných pokusných skupin: skupina 1 (kontrolní antigen HAS, 50 μg/kg a hu5c8, 5 mg/kg), skupina 2 (vehikulum a hu5c8, 5 mg/kg), skupina 3 (AVONEX, • · ·

Skupiny 1, jednou za 2 nebo počínaje 17 gg/kg a hu5c8, 5 mg/kg), skupina 4 (AVONEX, 50 μg/kg a hu5c8, 5 mg/kg) a skupina 5 (vehikulum a hu5c8, 5 mg/kg).

a 3 dostávaly hu5c8 počínaje 1. dnem studie 3 dny. Skupiny 4 a 5 dostávaly hu5c8 dnem studie jednou za 2 nebo 3 dny. Všechny skupiny, které dostávaly AVONEX, ho dostávaly denně počínaje

3. dnem studie. Vývoj a kinetika protilátek inhibujících AVONEX byla sledována pomocí ELISA testu. Byly očekávány jasné rozdíly mezi AVONEX skupinami, které dostávaly nebo nedostávaly hu5c8.

Předběžné ošetření hu5c8 významně zeslabilo nebo potlačilo tvorbu protilátek inhibujících AVONEX. V případě opožděného ošetření hu5c8 se podstatně potlačil nebo zvrátil rozvoj sekundární humorální imunity na AVONEX.

Výše popsané modely lze rutinním způsobem adaptovat k hodnocení účinků hu5c8 nebo jiného činidla blokujícího CD154 na primární a sekundární inhibiční reakci na jiné modelové antigeny, včetně terapeutických exogenních proteinů, např. vhodnou rutinní modifikací protokolu a dávek je možné hodnotit chování FVIII nebo jiného koagulačního faktoru u primátů, když je terapie blokování CD154 nasazena jako profylaktický nebo jako léčebný režim.

Ekvivalence

Předkládaný vynález může mít i jiné výhodné formy provedení, které jsou taktéž výsledkem stejné vynálezecké činnosti. Uvedené příklady jsou proto pouze ilustrativní a vynález nijak neomezují. Předmět vynálezu je definován následujícími patentovými nároky a spadají do něho také všechny změny a modifikace ve smyslu ekvivalence.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití činidla rušícího vazbu CD40:CD154 pro výrobu lék-u k oslabení závažnosti syndromu inhibice exogenního proteinu u subjektu trpícího nebo ohroženého tímto syndromem.
2. 2. Použití činidla rušícího vazbu CD40:CD154 pro výrobu léku potlačení škodlivých účinků syndromu inhibice exogenního proteinu u subjektu trpícího nebo ohroženého tímto syndromem.
3. 3. Použití činidla rušícího vazbu CD40:CD154 pro výrobu léku k zabránění vývoje syndromu inhibice exogenního proteinu u subjektu trpícího nebo ohroženého tímto syndromem.
4. 4. Použití činidla rušícího vazbu CD40:CD154 pro výrobu léku ke zpoždění nástupu syndromu inhibice exogenního proteinu u subjektu trpícího nebo ohroženého tímto syndromem.
5. 5. Použití činidla rušícího vazbu CD40:CD154 pro výrobu léku k inhibici rozvoje syndromu inhibice exogenního proteinu u subjektu trpícího nebo ohroženého tímto syndromem.
6. 6. Použití činidla rušícího vazbu CD40:CD154 pro výrobu léku ke zvrácení syndromu inhibice exogenního proteinu u subjektu trpícího nebo ohroženého tímto syndromem.
7. 7. Použití činidla rušícího vazbu CD40:CD154 pro výrobu léku uchování terapeutické aktivity exogenního proteinu u subjektu, který je tímto exogenním proteinem léčen.

   • · « · > · · ·· · «
8. 8. Použití činidla rušícího vazbu CD40:CD154 pro výrobu léku k obnovení terapeutické aktivity exogenního proteinu u subjektu léčeného tímto exogenním proteinem, když exogenní protein vyvolal u subjektu imunitní reakci.
9. 9. Použití podle nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 nebo 8, kde činidlo rušící vazbu CD40:CD154 je:

   a) činidlo blokující CD154 (CD40L), nebo

   b) monoklonální protilátka

   c) monoklonální protilátka, která má vazebné charakteristiky k antigenu jako protilátka 5c8 získaná z ATCC č. HB 10916.
10. 10. Použití podle nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 nebo 8, kde exogenní protein je:

    a) náhrada endogenního, ale defektního proteinu, nebo

    b) protein, který má v podstatě stejnou primární strukturu jako odpovídající endogenní protein, nebo

    c) je tvořen izolovanými hostitelskými buňkami nesoucími exprimovatelnou rekombinantní nukleovou kyselinu kódující exogenní protein, nebo

    d) protein bakteriálního původu, nebo

    e) koagulační faktor, včetně faktoru VIII nebo IX, nebo

    f) růstový hormon, faktor hojící ránu, růstový faktor, cytokin, lymfokin, enzym, koagulační faktor, složka plazmy, nebo

    g) streptokináza.
11. 11. Použití podle nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 nebo 8, kdy subjektem je člověk.

    * · • i* • · • · • · ·
12. 12.Použití podle nároku 11, kdy je to člověk hernofilií.