CN111868082A - 调节vista和vsig3的相互作用的化合物及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了结合至VSIG3的多克隆抗体和单克隆抗体、调节VISTA和VSIG3的相互作用的化合物以及制备和使用多克隆抗体和单克隆抗体和化合物的方法。本文还描述了包括通过引入调节VISTA和VSIG3的相互作用的化合物来调节VISTA和VSIG3的相互作用的方法。

Description

调节VISTA和VSIG3的相互作用的化合物及其制备和使用方法
继续申请资料
本申请要求2018年2月2日提交的美国临时申请序列第62/625,594号和2018年2月7日提交的美国临时申请序列第62/627,478号的权益，所述申请中的每一个都通过引用并入本文。
序列表
本申请包括作为ASCII文本文件以电子形式提交给美国专利商标局的序列表，所述文件名为“0541-000007WO02-SeqList_ST25.txt”，其大小为45千字节，并且创建于2019年1月17日。由于序列表的电子存档，以电子形式提交的序列表既作为37CFR§1.821(c)要求的纸质副本，也作为§1.821(e)要求的CRF。序列表中所含的信息通过引用并入本文并且不超出如所提交的国际申请中的公开。
背景技术
含V区免疫球蛋白的T细胞活化的抑制因子(在本文中被称为“VISTA”，并且也被称为T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子，PD-1H、Gi24、Dies1、DD1α或B7-H5)已经被报道为是介导T细胞抑制的受体。
发明内容
在一个方面中，本公开描述了一种调节VISTA和“含V-Set和免疫球蛋白结构域蛋白3”(在本文中被称为“VSIG3”或“VSIG-3”，也被称为IGSF11)的相互作用的化合物，以及包括通过引入调节VISTA和VSIG3的相互作用的化合物来调节VISTA和VSIG3的相互作用的方法。VSIG3是一种在上皮细胞和内皮细胞上表达的粘附蛋白，并且在结肠直肠癌、肠癌和肝细胞癌中被上调(Watanabe等人，(2005)Cancer Sci.96:498)。在一些实施例中，VSIG3是VISTA配体。在一些实施例中，VISTA是VSIG3配体。
在一些实施例中，所述方法包含激动或拮抗VISTA和VSIG3的相互作用。在一些实施例中，所述方法包含调节VISTA或VSIG3或两者的多聚化。
在一些实施例中，调节VISTA和VSIG3的相互作用的化合物包含针对VSIG3、VSIG3多肽、VISTA多肽或软骨寡聚基质蛋白(COMP)或其组合的卷曲螺旋结构域的抗体。
在一些实施例中，所述化合物消除VISTA信号传导和VSIG3信号传导中的至少一种。在一些实施例中，所述化合物可以影响T细胞增殖和/或T细胞信号传导，包含例如CD3诱导的作用。
在另一个方面中，本公开描述了用治疗有效量的化合物治疗受试者。
在进一步的方面中，本公开描述了针对VSIG3的抗体，包含单克隆抗体。
在另外的方面中，本公开描述了包括抗VSIG3抗体的组合物。在进一步的方面中，本公开描述了包括多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和多聚化的VSIG8的组合物。
在进一步的方面中，本公开描述了针对表3A中描述的VSIG3免疫原产生的多克隆抗体。
如本文所使用的术语“抗体”是指含有至少一个抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点免疫特异性地结合到感兴趣的特定抗原靶上。因此，术语“抗体”包含但不限于全长抗体和/或其变体、其片段、肽体及其变体、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体和模拟抗体或其特定片段或部分(包含单链抗体及其片段)的结构和/或功能的抗体模拟物。抗体与靶的结合可以引起多种效应，诸如但不限于其中这样的结合在体外、原位和/或在体内调节、减少、增加、拮抗、激动、减轻、减缓、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种靶活性或结合，或者受体活性或结合。因此，本公开的抗体涵盖能够结合至生物分子(诸如抗原或受体)或其部分的抗体片段，包含但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、pFC’、Fd、单结构域抗体(sdAb)、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)或二硫键连接的Fv(sdFv)；双抗体或二价双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，也就是说，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成所述群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点是高度特异性的。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。单克隆抗体可以由未被其他免疫球蛋白产生细胞污染的杂交瘤细胞合成。可替代地，单克隆抗体可以重组产生，包含例如通过用编码单克隆抗体的重链和轻链基因稳定或瞬时转染的细胞来产生。
修饰词“单克隆”表示如上所定义的抗体的特征，其是从基本上均质的抗体群体中获得的，并且不应被解释为需要通过任何特定的方法对抗体进行工程改造。在一些实施例中，术语“单克隆”在本文中被用于指来源于细胞克隆群体的抗体，包含任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是工程改造抗体的方法。
如本文所使用的，“分离的”指的是从其原始环境(例如，自然环境，如果它是天然存在的)中移除的材料，并且因此“由人的手”改变其自然状态。
如本文所使用的，“室温”是16℃至26℃，或者更优选地，18℃至24℃。在一些实施例中，“室温”是20℃至22℃。
如本文所使用的，两种多肽之间的“序列同一性”是通过比较一种多肽的氨基酸序列与第二种多肽的序列来确定的。当在本文中讨论时，可以使用本领域中已知的方法和计算机程序/软件来确定任何特定的多肽是否与另一种多肽至少40百分比(％)、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，诸如但不限于，BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics ComputerGroup,University Research Park,575Science Drive,Madison,Wis.53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman(1981)Advances in Applied Mathematics2:482-489的局部同源性算法，以寻找两个序列之间的最佳同源性片段。当使用BESTFIT或任何其他序列比对程序来确定特定的序列是否与根据本发明的参考序列例如95％相同时，设置参数使得在参考多肽序列的全长上计算同一性的百分比，并且允许参考序列中氨基酸总数的高达5％的同源性差距。
“结合亲和力”或“亲和力结合”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原或抗原表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力由解离常数(KD)表示，解离常数通常可以通过使用本领域中已知的方法来确定，例如，使用BIACORE生物传感器，其可从BIACORE(通用电气医疗保健全球公司，伊利诺伊州芝加哥)购得。在一些实施例中，本公开的抗体可以根据它们对VSIG3的结合亲和力来描述。在一些实施例中，本公开的抗体包括与抗原相互作用的抗体，其中解离常数(KD)小于或等于5×10-6M、小于或等于1×10-6M、小于或等于5×10-7M、小于或等于1×10-7M、小于或等于5×10-8M、小于或等于1×10-8M、小于或等于5×10-9M、小于或等于1×10-9M、小于或等于5×10- 10M、小于或等于1×10-10M、小于或等于5×10-11M、小于或等于1×10-11M、小于或等于5×10- 12M、小于或等于1×10-12M、小于或等于5×10-13M、小于或等于1×10-13M、小于或等于5×10- 14M、小于或等于1×10-14M、小于或等于5×10-15M或者小于或等于1×10-15M。
如本文所使用的，术语“受试者”包含但不限于人类和非人类脊椎动物。在一些实施例中，受试者是哺乳动物，尤其是人。受试者可以是个体。受试者可以是“个体”、“患者”或“宿主”。非人类脊椎动物包括家畜、伴侣动物和实验动物。非人类受试者还包含非人灵长类动物以及啮齿类动物，诸如但不限于大鼠或小鼠。非人类受试者还包含但不限于鸡、马、牛、猪、山羊、狗、猫、豚鼠、仓鼠、貂和兔子。
如本文所使用的，“体外”是在细胞培养物中，而“体内”是在受试者的体内。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的本发明的实施例。然而，在相同或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，一个或多个优选的实施例的叙述并不意味着其他实施例是无用的，并且不旨在将其他实施例排除在本发明的范围之外。
术语“包括”及其变型在这些术语出现在说明书和权利要求中的情况下不具有限制意义。
除非另有说明，否则“一个”、“一种”、“所述”和“至少一个”可互换使用，并且表示一个或多于一个。
同样在本文中，端点对数值范围的叙述包含纳入在所述范围内的所有数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。在值的范围为“高达”或“至少”特定值的情况下，所述值包括在所述范围内。
对于本文公开的包含离散步骤的任何方法，这些步骤可以以任何可行的顺序进行。并且，适当时，两个或更多个步骤的任意组合可以同时进行。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示组分数量、分子量等的所有数字应被理解为在所有情况下都用术语“约”修饰。因此，除非另有相反的指示，否则在说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据本发明寻求获得的期望的性能而变化。至少，并且不是试图将等同原则限制到权利要求的范围，每个数字参数应该至少根据报告的有效数字的数量并且通过应用普通的舍入技术来解释。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中阐述的数值尽可能精确地报告。然而，所有数值都固有地含有一个范围，所述范围必然是由在它们相应的测试测量值中发现的标准偏差产生的。
所有标题都是为了方便读者，并且除非特别说明，否则不应当被用来限制标题后面的文字的含义。
在整个本说明书中提及“一个实施例”、“实施例”、“某些实施例”或“一些实施例”等意味着结合实施例描述的特定特征、配置、组成或特性被包含在本公开的至少一个实施例中。因此，在整个说明书中的不同地方出现这样的短语不一定是指本公开的相同实施例。此外，在一个或多个实施例中，特定的特征、配置、组成或特性可以以任何合适的方式组合。
本发明的上述概述不旨在描述本发明的每个公开的实施例或每个实现方式。下面的描述更具体地举例说明了示例性的实施例。在整个本申请的若干个地方，通过示例的列表提供了指导，这些示例可以用于各种组合。在每种情况下，所列举的列表仅作为代表性的组，而不应被解释为排他性的列表。
附图说明
图1A示出了在示例性的功能性酶联免疫吸附测定(ELISA)结合测定中，重组人VSIG3Fc嵌合体(“rhVSIG3”或“VSIG03IgG1 Fc”)与重组人VISTA Fc嵌合体(“rhVISTA”)特异性结合。图1B示出了抗VSIG3抗体对rhVSIG3和rhVSIG3蛋白的结合的影响的代表性结果。抗体同种型对照(□-空心方块)显示无阻断；抗体克隆993820(○-空心圆圈)显示VSIG3和VISTA之间的结合的8％阻断，其中ED50为0.32μg/mL。ED50反映了取得50％最大阻断所需的抗体的浓度。
图2示出了阻断rhVSIG3与rhVISTA结合的多克隆兔抗人VSIG3肽抗体的代表性结果。使用链霉亲和素-HRP检测了rhVSIG3-rhVISTA相互作用，然后进行了显色反应。抗体I205(○-空心圆圈)显示无阻断；兔抗体G129(·实心圆圈)显示70％阻断VSIG-3和VISTA之间的结合，其中ED50为2.59μg/mL。ED50反映了取得50％最大阻断所需的抗体的浓度。
图3示出了示例性的兔多克隆抗人VSIG3抗体减弱VSIG3蛋白抑制来自活化的T细胞的IL-2分泌的能力。在2-8℃下，将小鼠抗人CD3抗体以1μg/mL包被在96孔板上过夜。将重组人VSIG3(rhVSIG3)蛋白以连续稀释(○-空心圆圈)或以20μg/mL固定在测定板上，并在37℃下孵育3小时。添加连续稀释的多克隆兔抗人VSIG3(N66)或同种型对照(兔IgG)，并在室温下与20μg/mL的rhVSIG3蛋白共孵育1-2小时。使用MagCellect人CD3+分离试剂盒(R&DSystems，明尼苏达州明尼阿波利斯市)从人PBMC中分离人T细胞，并将分离的人T细胞添加到板(2×105/孔)中，并在37℃在5％CO2的存在下培养24小时。使用QUANTIKINE人IL-2ELISA试剂盒(R&D Systems，，明尼苏达州明尼阿波利斯市)在细胞培养上清液中测量分泌的IL-2。抗体同型对照兔IgG(□-空心方块)显示没有阻断VSIG3对IL-2分泌的作用；多克隆抗体克隆N66(Δ-三角)显示阻断了VSIG3对IL-2分泌的作用。
图4示出了rhVSIG3蛋白可以抑制正常人外周血T细胞的抗CD3诱导的细胞增殖。这种抑制可以通过单克隆抗人VSIG3抗体克隆973404和993620来逆转。单克隆抗体克隆774208显示对T细胞的增殖无影响，并且代表阴性对照。
图5示出了示例性的单克隆抗人VSIG3抗体减弱了VSIG3蛋白抑制来自活化的T细胞的干扰素-γ分泌的能力。在2-8℃下，将小鼠抗人CD3抗体以1μg/mL包被在96孔板上过夜。将重组人VSIG3(rhVSIG3)蛋白以连续稀释(□-空心方块)或以20μg/mL固定在测定板上，并在37℃下孵育3小时。添加连续稀释的单克隆抗人VSIG3(973404或973422克隆)，并在室温下与20μg/mL的rhVSIG3蛋白共孵育1-2小时。使用MagCellect人CD3+T细胞分离试剂盒(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯市)从人PBMC中分离出人T细胞。将分离的人T细胞(2×105/孔)添加到板中，并在5％CO2的存在下在37℃培养24小时。使用QUANTIKINE人干扰素γELISA试剂盒(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯市)在细胞培养上清液中测量分泌的干扰素γ。单克隆抗体克隆973404(ο-空心圆圈)显示阻断了VSIG3对干扰素-γ分泌的作用。然而，单克隆抗体克隆#973422(Δ-三角形)显示VSIG3对干扰素-γ分泌的作用的进一步增强了。
图6示出了来自VISTA(左)、VSIG3或VSIG8(右)的胞外结构域的示意图，其与大鼠软骨寡聚基质蛋白(COMP，残基26-72，中间)的五聚体卷曲螺旋结构域融合，随后是6xHis标签。
图7示出了VISTA(左)、VSIG3或VSIG8(右)的示意图，其与大鼠软骨寡聚基质蛋白(COMP，残基26-72，中间)的五聚体卷曲螺旋结构域融合，随后是碱性磷酸酶、Flag和6xHis标记。接头残基以绿色示出。碱性磷酸酶可以用于AVEXIS测定中的酶检测，并且总蛋白可以使用抗多聚His抗体进行标准化。
图8A示出了VISTA-COMP构建体的序列：VISTA(1-195)-COMP-AlkPhos-Flag/His(SEQ ID NO:7)和VISTA(1-195)-COMP-His(SEQ ID NO:8)；图8B示出了VSIG3-COMP构建体的序列：VSIG3(1-245)-COMP-AlkPhos-Flag/His(SEQ ID NO:9)和VSIG3(1-245)-COMP-His(SEQ ID NO:10)；以及图8C示出了VSIG8-COMP构建体的序列：VSIG8(1-263)-COMP-AlkPhos-Flag/His(SEQ ID NO:11)和VSIG8(1-263)-COMP-His(SEQ ID NO:12)。
图9A至图9D示出了使用单体VISTA和多聚体VISTA-COMP通过表面等离子体共振(Biacore)进行的VISTA-VSIG3相互作用的动力学和亲和力的示意图和量化。图9A和图9C示出了Biacore实验的示意图，其中使用抗多聚His抗体在CM5芯片(通用电气医疗保健(GEHealthcare))的表面上捕获VISTA(图9A)或VISTA-COMP(图9C)。分析物VSIG3-Fc以0.2nM至20μM的浓度流过捕获的VISTA。图9B和图9D示出了对于单体VISTA-VSIG3-Fc相互作用(图9B)和多聚体VISTA-COMP-VSIG3-Fc相互作用(图9D)使用1:1模型得到的传感图和动力学拟合。对于捕获的单体VISTA，VSIG3-Fc分析物在0.247μM至20μM的范围内测试。对于捕获的多聚体VISTA-COMP，VSIG3-Fc分析物在0.2nM至500nM的范围内测试。多聚体VISTA-COMP具有高约150倍的对VSIG3-Fc的亲和力，这主要是由于解离速率的增加。
图10示出了示例性的基于亲和力的细胞外相互作用筛选(AVEXIS)的示意图，其被修饰以测试针对VSIG3的阻断抗体。将VSIG3-Fc包被在蛋白A板上，封闭，并与来自针对VSIG3的单克隆抗体组的单个mAb一起孵育。添加与五聚大鼠软骨寡聚基质蛋白(COMP)螺旋和碱性磷酸酶偶联的VISTA胞外域(ECD)，并且基于碱性磷酸酶活性测量VSIG3与VISTA之间的相互作用。
图11示出了来自AVEXIS测定筛选的针对VSIG3的抗体的示例性结果，所述抗体阻断使用BluePhos试剂测量的VSIG3与VISTA之间的相互作用。使用减去背景的650nm吸光度对结果进行量化。测试的抗体是针对rhVSIG3(1-245)培养的小鼠单克隆抗体。显示的是至少三个重复样品在650nm±标准偏差下的平均吸光度。阻断至接近背景水平的抗体克隆774206和774208在图12至图14中用作阳性对照。
图12示出了来自AVEXIS测定法筛选的针对VSIG3的抗体的示例性结果，所述抗体阻断使用BluePhos试剂测量的VSIG3与VISTA之间的相互作用。使用减去背景的650nm吸光度对结果进行定量。测试的抗体是针对rhVSIG3(1-245)的小鼠单克隆抗体。显示的是至少三个重复样品在650nm±标准偏差下的平均吸光度。将抗体克隆774206和774208用作阳性对照，并且背景由红色虚线示出。
图13示出了来自AVEXIS测定筛选的针对VSIG3的抗体的示例性结果，所述抗体阻断使用BluePhos试剂测量的VSIG3和VISTA之间的相互作用。使用减去背景的650nm吸光度对结果进行定量。测试的抗体是针对rhVSIG3(1-245)的小鼠单克隆抗体。显示的是至少三个重复样品在650nm±标准偏差下的平均吸光度。将抗体克隆774206和774208用作阳性对照，并且背景由红色虚线示出。
图14示出了来自AVEXIS测定筛选的针对VSIG3的抗体的示例性结果，所述抗体阻断了使用BluePhos试剂测量的VSIG3和VISTA之间的相互作用。使用减去背景的650nm吸光度对结果进行定量。测试的抗体是针对rhVSIG3(1-245)的小鼠单克隆抗体。显示的是至少三个重复样品在650nm±标准偏差下的平均吸光度。将抗体克隆774206和774208用作阳性对照，并且背景由红色虚线示出。针对PD-1和PD-L2的抗体被用作阴性对照，并且显示未中断相互作用。
图15示出了VSIG3COMP阻断T细胞增殖和活化。rhVSIG3可以部分地抑制抗CD3诱导的正常人外周血T细胞的CD25上调和增殖，而VSIG3-COMP可以完全抑制抗CD3诱导的CD25的表达和增殖。
图16A示出了rhVISTA可以抑制抗CD3诱导的正常人外周血T细胞的增殖，并且这种抑制可以被抗人VSIG3抗体(993620)逆转。重组人VSIG8(rhVSIG8)蛋白也可以抑制抗CD3诱导的增殖，但是VSIG3特异性抗体不会影响这种抑制。图16B示出了rhVISTA可以抑制正常人外周血T细胞上的抗CD3诱导的CD25表达，并且这种抑制可以被抗人VSIG3抗体(993620)逆转。rhVSIG8蛋白也可以抑制抗CD3诱导的CD25表达，但是VSIG3特异性抗体不会影响这种抑制。图16C示出了rhVISTA可以抑制抗CD3诱导的正常人外周血T细胞的CD25上调和增殖。尽管这种抑制不受同种型对照抗体的影响(左上)，但通过添加VSIG3单克隆抗体973404可以部分恢复增殖(左栏)。CD25表达(右栏)(T细胞活化的另一个指标)在存在rhVISTA的情况下也被类似地抑制，并且通过添加VSIG3抗体可以部分地逆转这种抑制。
图17A至图17D示出了VSIG3-VISTA相互作用和相关化合物的复合物的示例性示意模型。图17A示出了具有4:2分子化学计量的VISTA-VSIG3复合物。图17B示出了包括VSIG3-VSIG8异二聚体的VISTA-VSIG3复合物。图17C示出了PVR-TIGIT复合物的化学计量。图17D示出了PDL1-PD1或PDL2-PD1复合物的化学计量。
具体实施方式
本公开描述了包含抗体和能够特异性结合“含V-Set和免疫球蛋白结构域蛋白3”(在本文中被称为“VSIG3”或“VSIG-3”，也被称为IGSF11)的多聚化蛋白的化合物；能够阻断VSIG3与其结合配偶体之间的相互作用的化合物，包括，例如，VSIG3与含V区免疫球蛋白的T细胞活化的抑制因子(在本文中被称为“VISTA”，并且也被称为T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子，PD-1H、Gi24、Dies1、DD1α或B7-H5)之间的相互作用；包含本文所述的化合物的组合物；以及制备和使用这些化合物和组合物的方法。
VISTA是一种介导T细胞抑制的受体。VSIG3(作为VISTA的结合配偶体)可能在维持T细胞耐受中起作用。此外，VSIG3与VISTA的相互作用对T细胞活化、T细胞增殖和/或T细胞细胞因子或趋化因子的产生具有抑制作用。因此，消除VSIG3-VISTA相互作用的化合物可能允许改变免疫调节，包含例如增加免疫反应。
如之前在2016年8月3日提交的美国临时申请序列第62/370,395号和PCT申请第PCT/US2017/045314号(其每一个都通过引用并入本文)中所描述的，并且如本文进一步描述的，VSIG3已经被识别并表征为VISTA的结合配偶。在一些实施例中，VSIG3是VISTA配体。在一些实施例中，VISTA是VSIG3配体。
如在本文中和在2016年8月3日提交的美国临时申请序列第62/370,395号以及PCT申请第PCT/US2017/045314号中进一步描述的，阻断VSIG3/VISTA与中和抗体或其它化合物的相互作用可以有效地治疗肿瘤学和感染性疾病，并且促进或增强VSIG3/VISTA相互作用的VSIG3/VISTA激动剂可用于治疗自身免疫性、过敏性和炎性适应症、GVHD、移植或其它适应症，其中需要抑制T细胞活化、T细胞增殖或细胞因子产生。
调节VSIG3-VISTA相互作用的化合物及其使用方法
在一些方面中，本公开描述了一种调节VISTA和VSIG3的相互作用的化合物。在一些实施例中，所述化合物可以用于调节VSIG3和VISTA的相互作用。在一些实施例中，调节VSIG3和VISTA的相互作用可以包含激动或拮抗VSIG3和VISTA的相互作用。在一些实施例中，调节VSIG3和VISTA的相互作用可以包含调节VSIG3的多聚化。在一些实施例中，调节VSIG3和VISTA的相互作用的可以包含调节VISTA的多聚化。在一些实施例中，调节VSIG3和VISTA的相互作用可以包含消除VISTA信号传导或VSIG3信号传导或两者。例如，调节相互作用可以包含增强或破坏VSIG3或VISTA对细胞增殖、细胞因子产生和趋化因子产生中的至少一种的下游效应。
在一些实施例中，化合物可以包含抗VSIG3抗体，包含例如单克隆抗VSIG3抗体，如本文进一步描述的。
在一些实施例中，化合物可以包含抗VISTA抗体。
在一些实施例中，所述化合物可以包含VSIG3多肽、VISTA多肽、融合蛋白或卷曲螺旋结构域或其组合。在一些实施例中，化合物可以包含Fc结构域。
在一些实施例中，化合物可以包含VSIG3的可溶性片段和/或VSIG3的胞外区。在一些实施例中，所述化合物可以包含VISTA的可溶性片段和/或VISTA的胞外区。在一些实施例中，所述化合物可以包含由表1的至少一个序列编码的蛋白质。在一些实施例中，所述化合物可以包含编码的蛋白质，其与表1的至少一个序列具有至少80％的序列同一性、至少85％的序列同一性、至少90％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少98％的序列同一性或至少99％的序列同一性。
在一些实施例中，所述化合物可以包含多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA或多聚化的VSIG8或其组合。
在一些实施例中，所述化合物可以影响T细胞信号传导，包含例如，CD3诱导的IL-2产生、CD3诱导的干扰素-γ产生、CD3诱导的RANTES产生、CD3诱导的MIP-1α产生、CD3诱导的IL-17产生和/或CD3诱导的CXCL11产生。在一些实施例中，所述化合物可以影响T细胞增殖。不希望被理论所束缚，据信VISTA和/或VSIG3可以消除这些CD3诱导的效应。因此，在一些实施例中，所述化合物可以逆转这种消除。
本公开进一步描述了通过引入调节VISTA和VSIG3的相互作用的化合物来调节VISTA和VSIG3的相互作用。例如，可以用治疗有效量的化合物治疗受试者。在一些实施例中，VSIG3可以在从受试者获得的生物样品中过表达。
抗体
在一些实施例中，本公开描述了一种结合至VSIG3的抗体(即，抗VSIG3抗体)。在一些实施例中，抗体结合至人VSIG3(hVSIG3)。
在一些实施例中，结合至VSIG3的抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，结合至VSIG3的抗体包括由表2A中列出的杂交瘤细胞系(本文也被称为克隆)和/或通过重组方法产生的单克隆抗体。
在一些实施例中，结合至VSIG3的抗体是多克隆抗体。在一些实施例中，结合至VSIG3的抗体包含表3A中列出的多克隆抗体。在一些实施例中，结合至VSIG3的抗体包含使用表3A中列出的肽免疫原产生的多克隆抗体。在一些实施例中，肽免疫原包含表3A中列举的序列，带有半胱氨酸修饰。在一些实施例中，肽免疫原包含表3A中列举的序列，没有半胱氨酸修饰。
在一些实施例中，抗体是分离的抗体。在一些实施例中，抗体可以通过常规的免疫球蛋白纯化程序(诸如蛋白A-或G-琼脂糖凝胶、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)来分离或纯化。
在一些实施例中，结合至VSIG3的抗体识别VSIG3多肽。在一些实施例中，VSIG3多肽是人VSIG3(SEQ ID NO:1；Uniprot编号：Q5DX21。Gene ID:152404)或其片段。在一些实施例中，VSIG3多肽是小鼠VSIG3(Uniprot编号：P0C673；Gene ID：207683)或其片段。在一些实施例中，结合至VSIG3的抗体识别未还原的VSIG3多肽。
表1
Figure BDA0002612977710000121
Figure BDA0002612977710000131
Figure BDA0002612977710000141
在一些实施例中，结合至VSIG3的抗体可以包含通过将任何类型的分子共价连接至抗体而被修饰或缀合的抗体的衍生物。这样的抗体衍生物包含例如，已经通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、毒素或与细胞配体或其他蛋白质的连接而被修饰的抗体。许多化学修饰中的任何一种都可以通过已知的技术(包含但不限于衣霉素的特定化学裂解、乙酰化、甲酰化和代谢合成)进行。此外，衍生物可以含有一种或多种非经典氨基酸。
结合至VSIG3的抗体可以通过本领域中公知的技术直接或间接地偶联至可检测的标记。可检测的标记是可检测的试剂，例如通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段。可用的可检测的标记包含但不限于荧光染料、化学发光化合物、放射性同位素、电子致密试剂、酶、辅酶、有色颗粒、生物素或地高辛。可检测的标记通常产生可测量的信号，诸如放射性、荧光、颜色或酶活性。与可检测的试剂缀合的抗体可以用于诊断或治疗目的。可检测的试剂的示例包含各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层摄影的正电子发射金属和非放射性顺磁性金属离子。使用本领域已知的技术，可检测的物质可以直接地或通过中间体，诸如例如，本领域中已知的接头间接地偶联或缀合至抗体。参见，例如美国专利第4,741,900号，描述了用于诊断用途的金属离子与抗体的缀合。合适的酶的示例包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的示例包含链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的示例包含伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；发光材料的示例包含鲁米诺；生物发光材料的示例包含荧光素和水母发光蛋白；合适的放射性材料的示例包含碘(121I、123I、125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(111In、112In、113mIn、115mIn)、锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh和97Ru。用于将这样的治疗部分与抗体结合的技术是众所周知的。
本公开还包括由这些杂交瘤细胞系的后代或衍生物产生的单克隆抗体，由等同或相似的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体，和/或由其制成的重组衍生物。在一些实施例中，结合至VSIG3的抗体包含重组衍生的单克隆抗体，包含例如兔B细胞衍生的单克隆抗体。
完整的抗体分子具有两个重(H)链可变区(在本文中被缩写为VH)和两个轻(L)链可变区(在本文中被缩写为VL)。VH和VL区可以进一步被细分为高变区(被称为“互补决定区”(CDR))，其穿插有更保守的区(被称为“框架区”(FR))。FR和CDR的范围已被精确定义(参见Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242，和Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。VH和VL各自由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
在一些实施例中，单克隆抗体包含与由表2A的克隆中的至少一个产生的单克隆抗体具有相同重链的单克隆抗体。在一些实施例中，单克隆抗体包含与由表2A的克隆中的至少一个产生的单克隆抗体具有相同轻链的单克隆抗体。在一些实施例中，单克隆抗体包含与由表2A的克隆中的至少一个产生的单克隆抗体具有相同重链和相同轻链的单克隆抗体。在一些实施例中，单克隆抗体可以在上面鉴定的重链和/或轻链中含有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸取代，其中氨基酸取代基本上不影响抗体与VSIG3的结合。
在一些实施例中，单克隆抗体包含与由表2A的克隆中的至少一个产生的单克隆抗体具有相同VH结构域的单克隆抗体。在一些实施例中，单克隆抗体包含与由表2A的克隆中的至少一个产生的单克隆抗体具有相同VL结构域的单克隆抗体。在一些实施例中，单克隆抗体包含与由表2A的克隆中的至少一个产生的单克隆抗体具有相同的VH结构域和相同的VL结构域的单克隆抗体。在一些实施例中，单克隆抗体可以在上面鉴定的VH结构域和/或VL结构域中含有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸取代，这些取代基本上不影响抗体与VSIG3的结合。
在一些实施例中，单克隆抗体包含具有由表2A的克隆中的至少一个产生的单克隆抗体的VH结构域的至少一个CDR的单克隆抗体。在一些实施例中，单克隆抗体包括具有由表2A的克隆中的至少一个产生的单克隆抗体的VH结构域的至少两个CDR的单克隆抗体。在一些实施例中，单克隆抗体包含具有由表2A的克隆中的至少一个产生的单克隆抗体的VH结构域的至少三个CDR的单克隆抗体。
另外地或可替代地，在一些实施例中，单克隆抗体包含具有由表2A的克隆中的至少一个产生的单克隆抗体的VL结构域的至少一个CDR的单克隆抗体。在一些实施例中，单克隆抗体包含具有由表2A的克隆中的至少一个产生的单克隆抗体的VL结构域的至少两个CDR的单克隆抗体。在一些实施例中，单克隆抗体包含具有由表2A的克隆中的至少一个产生的单克隆抗体的VL结构域的至少三个CDR的单克隆抗体。
在一些实施例中，单克隆抗体可以在上面鉴定的一个或多个CDR中含有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸取代，其基本上不影响抗体与VSIG3的结合。
在一些实施例中，单克隆抗体可以在一个或多个构架区(FR)中含有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸取代。在一些实施例中，构架区(FR)中的取代或取代基本上不影响抗体与VSIG3的结合。
在一些实施例中，单克隆抗体包含具有与由表2A的克隆之一产生的抗体的VH结构域的至少一个CDR的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的单克隆抗体。
在一些实施例中，单克隆抗体包含具有与由表2A的克隆之一产生的抗体的VH结构域的至少两个CDR的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的单克隆抗体。
在一些实施例中，单克隆抗体包含具有与由表2A的克隆之一产生的抗体的VH结构域的至少三个CDR的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的单克隆抗体。
在一些实施例中，单克隆抗体包含具有与由表2A的克隆之一产生的抗体的VL结构域的至少一个CDR的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的单克隆抗体。
在一些实施例中，单克隆抗体包含具有与由表2A的克隆之一产生的抗体的VL结构域的至少两个CDR的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的单克隆抗体。
在一些实施例中，单克隆抗体包含具有与由表2A的克隆之一产生的抗体的Vl结构域的至少三个CDR的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的单克隆抗体。
在一些实施例中，抗VSIG3抗体包含与由表2A的克隆之一产生的抗体结合相同的VSIG3表位的抗体。
在一些实施例中，相对于由表2A的克隆之一产生的抗体，抗体可以含有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸取代，其中所述取代基本上不影响抗体与VSIG3的结合和/或抗体的功能。
在一些实施例中，抗VSIG3抗体包含与VSIG3的ABEIg面相互作用的抗体(图17至18)。在一些实施例中，抗VSIG3抗体包含与VSIG3的GFC Ig面相互作用的抗体(图17至18)。
抗体可以是来自任何合适的物种的抗体。在一些实施例中，抗体可以是小鼠抗体。在一些实施例中，抗体可以是大鼠抗体。在一些实施例中，抗体可以是兔抗体。
在一些实施例中，抗体是IgG抗体。在一些实施例中，抗体可以是抗体或IgG亚类(包含例如G1、G2、G3或G4)。在一些实施例中，抗体可以是以下亚类之一的小鼠IgG：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C和IgG3。在一些实施例中，抗体可以是以下亚类之一的大鼠IgG：IgG1、IgG2A、IgG2B或IgG2C。
在一些实施例中，抗体可以包含κ轻链。在一些实施例中，抗体可以包含λ轻链。
在一些实施例中，单克隆抗体包含抗原结合片段，包含Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段和/或Fv片段。
单克隆抗体可以通过任何合适的技术获得。在一些实施例中，结合至VSIG3的抗体可以通过重组DNA方法制备，通过噬菌体展示产生，和/或通过组合方法产生。编码与VSIG3结合的抗体的DNA可以使用常规程序容易地分离和测序。在一些实施例中，本文所述的杂交瘤细胞可以作为这样的DNA的来源。一旦分离，可以将DNA转染到宿主细胞(包含例如，猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾细胞(HEK)或不以其他方式产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，或通过基因组编辑(例如，使用CRISPR-Cas系统)导入宿主细胞中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。编码结合至VSIG3的抗体的DNA可以被修饰，例如，以使抗体人源化。
在一些实施例中，抗体可以是人源化抗体。结合至VSIG3的抗体可以通过任何合适的方法被人源化。用于生产人源化单克隆抗体的技术可以在例如Jones等人，(1986)Nature321:522和Singer等人，(1993)J.Immunol.150:2844中找到。例如，抗体的人源化可以包含对抗体进行改变，以降低抗体在用于人体时的免疫原性。在一些实施例中，结合至VSIG3的人源化抗体可以包含人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。在一些实施例中，结合至VSIG3的人源化抗体可以包含人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体抗体的一个或多个互补决定区(CDR)的残基被来自结合至VSIG3的非人物种抗体(供体抗体)的一个或多个CDR的残基替代，所述非人物种抗体诸如小鼠、大鼠或兔抗体。在一些实施例中，人免疫球蛋白的Fv框架残基可以被来自结合至VSIG3的抗体的相应非人残基替代。
在一些实施例中，单克隆抗体包含嵌合抗体，即其中不同部分来自不同动物物种的抗体。嵌合抗体可以通过例如将来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物特异性的人抗体分子的基因剪接在一起而获得。参见，例如，Takeda等人，(1985)Nature 314:544。
在一些实施例中，抗体包含双特异性或双功能抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可以通过多种方法(包含杂交瘤细胞的融合或F(ab’)片段的连接)产生。参见，例如，Songsivilai和Lachmann(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315；Kostelny等人，(1992)J.Immunol.148:1547。此外，双特异性抗体可能被形成为“双抗体”(Holliger等人，(1993)PNAS USA 90:6444)或“Janusins”(Traunecker等人，(1991)EMBO J.10:3655；Traunecker等人，(1992)Int.J.Cancer Suppl.7:51)。
在一些实施例中，抗体由动物(包含但不限于人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、山羊、马、鸡或火鸡)产生，由来自动物的细胞产生，化学合成或重组表达。抗体可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和和分级柱色谱法)、离心、差速溶解或通过任何其他用于纯化蛋白质的标准技术来纯化。此外，抗体可以与异源多肽序列融合，如本文所述或以其他方式在本领域中已知的，包含例如，促进纯化。
可以通过本文所述的方法和通过本领域已知的任何合适的方法来测定单克隆抗体的免疫特异性结合。可以使用的免疫测定包含但不限于竞争性和/或非竞争性测定系统，其使用诸如BIACORE分析、荧光活化细胞分选仪(FACS)分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白质印迹、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光测定和蛋白A免疫测定的技术。这样的测定是常规的并且在本领域中是众所周知的(参见，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley&Sons,Inc.,N.Y.(1994))。
在一些实施例中，结合至VSIG3的抗体包含消除VSIG3与VSIG3配体或VSIG3受体结合的抗体。在一些实施例中，抗体包含消除VSIG3与VISTA结合的抗体。在一些实施例中，VISTA是人类VISTA(SEQ ID NO:4；Uniprot编号：Q9H7M9；Gene ID：64115)。在一些实施例中，抗体可以将VSIG3与VSIG3配体(包含例如VISTA)的结合减少至少10百分比(％)、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。
在一些实施例中，结合至VSIG3的抗体包括由表2的杂交瘤细胞系(也被称为克隆或抗体克隆)中的至少一种产生的单克隆抗体。
在一些实施例中，可以通过用VSIG3的胞外结构域免疫动物来制备结合至VSIG3的抗体。在一些实施例中，可以通过用人VSIG3的氨基酸1-245(Uniprot编号：Q5DX21；GeneID：152404)免疫动物来制备与VSIG3结合的抗体。在一些实施例中，动物可以是哺乳动物。例如，动物可以是兔子、小鼠、山羊、绵羊、骆驼或大鼠。在一些实施例中，动物可以是鸡。
在另一个方面中，本公开描述了一种分离的多核苷酸分子。在一些实施例中，分离的多核苷酸分子包含编码抗体的核苷酸序列。在一些实施例中，分离的多核苷酸分子包含与编码本文所述的抗体的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，分离的多核苷酸分子包含在高严格性下与编码抗体或其补体的核苷酸序列杂交的多核苷酸。如本文所用的，“严格条件”是指第一多核苷酸分子在65℃下在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)和1mM EDTA中与第二过滤结合的多核苷酸分子杂交并保持结合的能力，随后在42℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(参见Ausubel等人，(eds.),CurrentProtocols in Molecular Biology,Vol.1,Green Publishing Associates,Inc.,和JohnWiley&Sons,Inc.,N.Y.(1989),atp.2.10.3)。在一些实施例中，分离的多核苷酸分子包含编码本发明的单克隆抗体的CDR中的一个或多个或重链和/或轻链的多核苷酸。用于克隆和测序免疫球蛋白可变结构域和恒定区的一般技术是众所周知的。参见，例如，Orlandi等人，(1989)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:3833。
在另一个方面中，本公开描述了包含本发明的分离的多核苷酸的重组载体。载体可以是例如质粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种程序将合适的DNA序列插入到载体中。通常，通过本领域中已知的程序将DNA序列插入到载体中的合适的限制性内切酶位点中。这样的程序被认为是在本领域技术人员的范围内。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是可商购的。以下载体是通过示例提供的。细菌载体包含例如，pQE70、pQE60、pQE-9、pBS、pD10、噬菌体、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pK233-3、pDR540和pRIT5。真核载体包含例如，pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。然而，可以使用任何其他质粒或载体。
在另一个方面中，本公开还包含含有上述载体中的至少一种的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞，诸如哺乳动物或昆虫细胞，或低等真核细胞，诸如酵母细胞。或者，宿主细胞可以是原核细胞，诸如细菌细胞或植物细胞。可以通过任何合适的技术来实现将载体构建体引入到宿主细胞中，诸如例如，通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔。(Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology(1986))。
本发明的抗体可以在合适的启动子控制下在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其他细胞中表达。也可以使用无细胞翻译系统，以使用由本发明的DNA构建体衍生的RNA来生产这样的蛋白质。用于原核和真核宿主的合适的克隆和表达载体由Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)描述。
在本发明中还包含表达来自本发明的抗体的一个或多个高变区的噬菌体展示文库，和从这样的噬菌体展示文库获得的克隆。噬菌体展示文库用于产生抗体衍生分子。编码抗体的抗原结合可变结构域的基因片段与编码细菌噬菌体的外壳蛋白的基因融合。含有这样的基因融合体的细菌噬菌体用于感染细菌，并且所得的噬菌体颗粒具有表达抗体融合蛋白的外壳，其中抗原结合结构域展示在细菌噬菌体的外部。噬菌体展示文库可以使用例如可从马萨诸塞州伊普斯威奇市新英格兰生物技术公司(New England Biolabs Inc.)获得的PH.D.-7噬菌体展示肽文库试剂盒(目录#E8100S)或PH.D.-12噬菌体展示肽文库试剂盒(目录#E8110S)来制备。参见，例如，Smith和Petrenko(1997)Chem Rev.97:391-410。
杂交瘤细胞系
本公开进一步描述了表达单克隆抗体的杂交瘤细胞系(本文也被称为“克隆”或“抗体克隆”)，包含例如表2A的杂交瘤细胞系。在一些实施例中，由杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体与VSIG3结合。在一些实施例中，由杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体消除了VSIG3与VISTA的结合。
杂交瘤细胞系可以通过本领域技术人员熟知的各种技术来获得。例如，来自用所需的抗原免疫的动物的细胞被永生化，通常通过与骨髓瘤细胞融合被永生化(参见，例如，Kohler和Milstein(1976)Eur.J.Immunol.6:511；J.Goding in“Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,”Academic Press,pp 59-103(1986)；和Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,page726(Cold Spring Harbor Pub.1988)。在一些实施例中，免疫的动物优选地为哺乳动物。在一些实施例中，免疫的动物是大鼠，包含例如Wistar大鼠，或小鼠，包含例如BALB/C小鼠。在一些实施例中，来自动物的细胞是脾细胞。在一些实施例中，来自动物的细胞优选地为淋巴细胞。在一些实施例中，骨髓瘤细胞包括P3X63Ag8.653细胞。
也可以使用产生转化的B细胞系(其产生单克隆抗体)的其他已知方法。
重组抗体
本公开进一步描述了重组衍生的单克隆抗体。重组衍生的单克隆抗体可以包含例如兔B细胞衍生的单克隆抗体。本公开的单克隆抗体可以通过任何合适的重组技术产生，包括例如通过噬菌体展示或通过组合方法。参见，例如美国专利第5,223,409号；WO92/18619；WO91/17271；WO92/20791；WO92/15679；WO93/01288；WO92/01047；WO92/09690；或WO90/02809。这样的方法可以用于产生人单克隆抗体。
抗VSIG3抗体的用途
如本文所述，结合至VSIG3的抗体可以用于任何合适的应用。例如，单克隆抗体可以用于体外和体内诊断和治疗方法。
在一些实施例中，抗体可以用于确定VSIG3蛋白在体外或体内的表达水平。在一些实施例中，抗体可以用于体内或体外标记细胞。在一些实施例中，抗体可以用于确定患者样品中VSIG3蛋白的表达水平。在一些实施例中，患者样品可以包含哺乳动物癌细胞。
在一些实施例中，抗体可以被标记。例如，抗体可以用于标记细胞，并且标记的细胞可以通过第二种方法直接或间接成像。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。
在一些实施例中，抗体可以用于识别来自受试者的样品中VSIG3蛋白的存在或不存在。在一些实施例中，识别VSIG3的存在可以包含识别来自受试者的样品中的VSIG3的量。
在一些实施例中，抗体可以用于调节VSIG3和VISTA的相互作用。在一些实施例中，调节VSIG3和VISTA的相互作用可以包含激动或拮抗VSIG3和VISTA的相互作用。在一些实施例中，调节VSIG3和VISTA的相互作用可以包含调节VSIG3的多聚化。在一些实施例中，调节VSIG3和VISTA的相互作用可以包含调节VISTA的多聚化。在一些实施例中，抗体可以激动和/或拮抗VSIG3与VISTA的相互作用。这样的激动和/或拮抗可以产生免疫治疗效果。
在一些实施例中，VSIG3或VISTA或两者可以在细胞的表面上表达。
本公开进一步描述了一种包含抗体的试剂盒。例如，试剂盒可以包含有包含抗VSIG3单克隆抗体的组合物。试剂盒中的抗体可以用一种或多种可检测的标记物标记，如本文所描述的。
试剂盒可以包含一个或多个填充有本发明的单克隆抗体中的一种或多种的容器。此外，试剂盒可以包含其他试剂，诸如缓冲液，并且也包含实施本发明所需的溶液。可选地，与这样的容器相关联的可以是通知或印刷说明。如本文所使用的，短语“包装材料”是指一个或多个用于容纳试剂盒的内容物的物理结构。包装材料由众所周知的方法构造，优选地以提供无菌、无污染的环境。如本文所使用的，术语“包装”是指能够将多肽保持在固定限度内的固体基质或材料，诸如玻璃、塑料、纸、箔等。
包含抗体和/或调节VSIG3-VISTA相互作用的化合物的组合物
在一些实施例中，本公开描述了一种组合物，其包含至少一种本文所述的抗体和/或至少一种调节本文所述的VSIG3-VISTA相互作用的化合物。
在一些实施例中，所述组合物还可以包含例如，有助于将pH保持在可接受的范围内的缓冲剂或延缓微生物生长的防腐剂。组合物还可以包含例如载体、赋形剂、稳定剂、螯合剂、盐或抗微生物剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂、螯合剂、盐、防腐剂、缓冲剂或抗微生物剂，包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂，诸如叠氮化钠、十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲基铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚；多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或非特异性免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐的抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如，锌(Zn)-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如吐温、普鲁尼克或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施例中，组合物是药物组合物，并且包含单克隆抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备包括本文教导中描述的抗体的药物组合物时，可以使用各种媒介物(vehicle)和赋形剂，这对于本领域技术人员来说是显然的。
所述药物组合物通常将包括药学上可接受的载体和药理学上有效量的抗体或抗体的混合物。
所述药物组合物可以被配制成粉末、颗粒、溶液、悬浮液、气雾剂、固体、丸剂、片剂、胶囊、凝胶、局部霜剂、栓剂、透皮贴剂和/或本领域已知的其他制剂。
为了本文所述的目的，抗体的药学上可接受的盐旨在包含任何本领域公认的药学上可接受的盐，包括有机酸和无机酸和/或碱。盐的示例包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙，以及伯胺、仲胺和叔胺，低级烃的酯，诸如甲酯、乙酯和丙酯。其他盐包含但不限于有机酸，诸如乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水杨酸等。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包括本领域普通技术人员在配制药物组合物时已知的任何标准的药学上可接受的载体。例如，抗体可以在药学上可接受的稀释剂中制备成制剂，所述稀释剂包含例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、含水乙醇，或葡萄糖、甘露醇、葡聚糖、丙二醇、油(例如，植物油、动物油、合成油等)的溶液、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸钙、明胶、聚山梨醇酯80，或者在合适赋形剂中制备成固体制剂。
药物组合物通常将进一步包括一种或多种缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸诸如甘氨酸、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基茴香醚等)、抑菌剂、螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(例如，氢氧化铝)、使制剂与受体的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。可替代地，本发明的组合物可以配制成冻干物。
本领域普通技术人员已知的任何合适的载体可以用于包含至少一种本文所述的抗体的组合物中。抗体组合物可以被配制成用于任何合适的给药方式，包含例如口服、鼻内、粘膜、静脉内、腹膜内、皮内、皮下和肌内给药。
给药和治疗
本公开的组合物可以以适合所选的给药途径的多种形式被配制成药物制剂。本领域技术人员将理解，组合物将根据给药的方式和剂量单位而变化。例如，对于肠胃外给药，可以使用等渗盐水。对于局部给药，可以使用霜剂，包含载体诸如二甲基亚砜(DMSO)，或通常在局部霜剂中发现的不阻断或抑制肽的活性的其它试剂。其他合适的载体包含但不限于乙醇、磷酸盐缓冲盐水和其他平衡盐溶液。本发明的化合物可以多种方式给药，包含但不限于静脉内、局部、口服、皮下、腹膜内和肌内递送。在一些方面中，本发明的化合物可以被配制成用于受控或持续释放。在一些方面中，用于受控或持续释放的制剂适合于皮下植入。在一些方面中，用于受控或持续释放的制剂包含贴剂。化合物可以被配制成用于肠内给药，例如，被配制成胶囊或片剂。
给药可以是以单剂量或以多剂量。在一些实施例中，剂量是如由标准方法(包含但不限于本文所述的方法)确定的有效量。临床试验领域的技术人员将能够通过标准研究来优化特定化合物的剂量。此外，可以使用标准剂量-反应方案在没有不当实验的情况下确定组合物的合适剂量。给药包含但不限于在本文包含的实施例中描述的任何剂量和给药方案、给药间隔和/或给药模式。
包含根据本公开的抗体的组合物可以通过任何合适的手段给药，包含但不限于，例如，口服、直肠、鼻、局部(包含透皮、气雾剂、口腔和/或舌下)、阴道、肠胃外(包含皮下、肌内和/或静脉内)、皮内、膀胱内、关节内、小动脉内、脑室内、颅内、腹膜内、鼻内、通过吸入或病灶内(例如，通过注射到肿瘤内或肿瘤周围)。
例如，对于在水溶液中的肠胃外给药，如果需要，溶液应该被适当地缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖进行等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。在这一点上，可以使用的无菌水性介质对于本领域技术人员来说将是已知的。根据被治疗的受试者的状况，将必然会发生剂量上的一些变化。在任何情况下，负责给药的人员将确定用于个体受试者的适当剂量。此外，对于人类给药，制剂应当符合如FDA所要求的无菌性、产热原性和一般安全性和纯度标准。这样的制剂可以是无热原的。
许多合适的制剂是已知的，包含包封待被释放的药物的聚合物或蛋白质微粒、软膏、凝胶或溶液，其可以局部地或部分地使用以施用药物，并且甚至贴剂，其在长的时间段内提供受控释放。这些也可以采取植入物的形式。这样的植入物可以被植入到肿瘤内。
本发明的化合物也可以以冻干的形式提供。这样的组合物可以包含缓冲液，例如碳酸氢盐，用于在给药前的重构，或者缓冲液可以包含在冻干的组合物中，用于用例如水重构。冻干的组合物可以进一步包含合适的血管收缩剂，例如肾上腺素。冻干的组合物可以在注射器中提供，任选地与用于重构的缓冲液组合包装，使得重构的组合物可以立即施用给患者。
如本文所使用的，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”可以包含治疗性治疗和/或预防性治疗。如本文所使用的“治疗紊乱”并旨在是绝对的术语。治疗可以改善预后或降低症状的频率或严重程度。如本文所用的“治疗有效的”浓度或量是给受试者提供一些改善或益处的量。治疗的期望的效果包含预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。同样，如本文使用的术语“防止”不意味是绝对的术语。相反，预防指的是延迟发病、降低症状的频率或降低与紊乱相关的症状的严重性。因此，预防是指本领域技术人员将能够理解的广泛的预防措施。在一些情况下，症状的频率和严重性被降低到非病理水平。在一些情况下，接受本发明的组合物的个体的症状仅90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％与未经治疗的患有所述紊乱的个体所经历的症状一样频繁或严重。
通过在已知的体外和体内系统(如本文所述的系统)中测试化合物，可以根据经验确定对于本文中每种应用的治疗有效浓度和量，然后可以从其中推断出用于人类或其他动物的剂量。
应当理解，治疗的精确剂量和持续时间是被治疗的疾病的函数，并且可以使用已知的测试方案或通过从体内或体外测试数据外推来凭经验确定。需要注意的是，浓度和剂量值也可以随着待被缓解的病症的严重程度而变化。进一步应理解，对于任何特定的受试者，应根据个体需要和施用或监督组合物的施用的人的专业判断，随时间调整具体的剂量方案，并且本文所述的浓度范围仅是示例性的，并且不旨在限制所要求保护的组合物和方法的范围或实践。
组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如，用于确定LD50(对50％的人群致死的剂量)和ED50(在50％的人群中治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，并且它可以被表示为LD50与ED50之间的比率。呈现出高治疗指数的组合物可能是优选的。从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用于制定用于在人类中使用的剂量的范围。这样的组合物的剂量可以优选在循环浓度的范围内，所述循环浓度包含毒性很小或没有毒性的ED50。剂量可以在这个范围内变化，这取决于所用的剂型和所用的给药途径。确切的制剂、给药途径和剂量可以由个体医生根据患者的病症来选择。
如本文所描述的组合物可以一次给药，或者可以被分成多个较小的剂量以时间间隔给药。例如，组合物可以重复给药，例如至少2、3、4、5、6、7、8次或更多次，或者可以通过连续输注给药。应当理解，治疗的精确剂量和持续时间是被治疗的疾病的函数，并且可以使用已知的测试方案或通过从体内或体外测试数据外推来凭经验确定。需要注意的是，浓度和剂量值也可以随着待被缓解的病症的严重程度而变化。进一步应理解，对于任何特定的受试者，应根据个体需要和施用或监督组合物的施用的人的专业判断，随时间调整具体的剂量方案，并且本文所述的浓度范围仅是示例性的，并且不旨在限制所要求保护的组合物和方法的范围或实践。
在一些治疗性实施例中，药剂的“有效量”是导致至少一个病理参数的降低的量。因此，例如，在本公开的一些方面中，有效量是有效地实现与未用所述药剂治疗的个体中参数的预期降低相比至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的降低的量。
在本公开的方法的一些方面中，一种方法进一步包含施用一种或多种另外的治疗剂。一种或多种另外的治疗剂可以在施用如本文所描述的单克隆抗体之前、之后和/或同时施用。另外的治疗剂可以包含，例如，化疗、放疗等。另外的治疗剂可以单独给药或作为混合物或掺混物的一部分给药。在本公开的一些方面中，当与单独施用其它治疗方式相比时，施用抗体可以允许较低剂量的其它治疗方式的有效性，从而减轻了在施用较高剂量的其它治疗方式的情况下所观察到的毒性。
在本发明方法的一些方面中，施用如本文所描述的组合物和至少一种另外的治疗剂显示了治疗协同作用。在本公开的方法的一些方面中，与在单独施用抗体或另外的治疗剂后观察到的对治疗的反应的相同测量相比，在施用如本文所描述的抗体和另外的治疗剂后观察到的对治疗的反应的测量得到改善。
使用VSIG3/VISTA激动剂和/或VSIG3/VISTA拮抗剂的鉴定和方法
VSIG3与VISTA之间的相互作用可以用于鉴定激动剂或拮抗剂，其激动或拮抗VISTA和VISIG的结合和/或激动或拮抗VSIG3/VISTA相互作用的效应。在一些实施例中，VSIG3/VISTA相互作用是VSIG3/VISTA对T细胞免疫的相互作用。在一些实施例中，VSIG3/VISTA相互作用包含VISTA信号传导。在某些情况下，VSIG3/VISTA拮抗剂将显著地抑制或防止VISTA对细胞增殖的抑制作用。在某些情况下，VSIG3和/或VISTA拮抗剂将显著地抑制或防止VSIG3和VISTA的相互作用。在某些情况下，VSIG3和/或VISTA拮抗剂将导致抑制CD3诱导的MIP-1α、CD3诱导的Rantes(CCL5)、CD3诱导的CXCL11、CD3诱导的干扰素(IFN)-γ、IL-2和/或IL-17(也被称为IL-17A)的产生。这样的产生在外周血单核细胞(PBMC)和/或T细胞中可能减少。这种抑制作用可以使用体外基于细胞的测定通过表达VISTA和/或VSIG3的细胞来检测。相反，在某些情况下，VSIG3/VISTA激动剂将显著地加强或增强VISTA对免疫的抑制作用。这种加强作用也可以在体外使用基于细胞的测定通过表达VISTA和/或VSIG3的细胞来检测。
在一些实施例中，VSIG3/VISTA激动剂或VSIG3/VISTA拮抗剂激动或拮抗VSIG3和VISTA的相互作用。在一些实施例中，当VSIG3和VISTA中的至少一个在细胞的表面上表达时，VSIG3/VISTA激动剂或VSIG3/VISTA拮抗剂激动或拮抗VSIG3和VISTA的相互作用。在一些实施例中，VSIG3/VISTA激动剂或VSIG3/VISTA拮抗剂可以激动或拮抗VSIG3的多聚化。VSIG3的多聚化可以包含VSIG3的同二聚化和/或VSIG3的异二聚化，包含例如与VSIG8的异二聚化。
在一些实施例中，VSIG3/VISTA激动剂或VSIG3/VISTA拮抗剂可以包含抗体。在一些实施例中，VSIG3/VISTA激动剂或VSIG3/VISTA拮抗剂包含抗VISTA抗体。在一些实施例中，VSIG3/VISTA激动剂或VSIG3/VISTA拮抗剂包含抗VSIG3抗体。
VSIG3/VISTA激动剂和VSIG3/VISTA拮抗剂可以被配制成用于人类疗法。例如，在一些情况下，可以提供一种组合物，所述组合物包含VSIG3/VISTA激动剂或VSIG3/VISTA拮抗剂与一种或多种合适的载体、赋形剂、稳定剂、螯合剂、盐或抗微生物剂的组合。此外，组合物中的VSIG3/VISTA激动剂或VSIG3/VISTA拮抗剂可以被修饰以增强体内稳定性。例如，在一些情况下，VSIG3/VISTA激动剂或VSIG3/VISTA拮抗剂可以连接至一个或多个所需的部分，诸如一种或多种水溶性聚合物，诸如聚乙二醇聚合物。此外，在一些情况下，所述组合物可以包含多于一种的VSIG3/VISTA激动剂或VSIG3/VISTA拮抗剂。
在一些情况下，提供了含有VSIG3/VISTA激动剂以在需要治疗的病症(诸如自身免疫、过敏或炎性病症)中抑制T细胞免疫的组合物。这样的组合物可以包括有效地抑制在需要其的受试者中的T细胞活化或增殖的量的VSIG3/VISTA激动剂。示例性的自身免疫性、炎性和过敏性病症包含但不限于关节炎病症，诸如RA、银屑病关节炎、硬皮病、多发性硬化、狼疮、IBD、ITP、糖尿病、结节病、过敏性哮喘等。
在其他情况下，提供了含有VSIG3/VISTA拮抗剂以促进T细胞免疫并治疗需要治疗的病症的组合物，诸如癌症和感染性疾病病症。这样的组合物可以包括一定量的拮抗剂，所述拮抗剂有效地促进需要其的受试者(例如，患有癌症的受试者)中的T细胞活化或增殖。
VSIG3/VISTA拮抗剂可以在用于治疗癌症的组合物中提供。癌症可以包含但不限于黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、睾丸癌、消化道癌、食道癌、肝癌、胰腺癌、肾癌和皮肤癌。申请人还发现，与健康组织相比，VSIG3在结肠癌组织和肝癌组织中高度表达。因此，在一些情况下，可以在用于治疗结肠癌的组合物中提供VSIG3/VISTA拮抗剂。此外，在一些情况下，可以在用于治疗肝癌的组合物中提供VSIG3/VISTA拮抗剂。在某些情况下，可以在用于治疗癌症的组合物中提供VSIG3/VISTA拮抗剂，其通过阻断VSIG3和VISTA的相互作用以防止抑制PBMC中的MIP-1α、Rantes(CCL5)、CXCL11和IL-17分泌，这反过来允许T细胞、单核细胞、树突细胞和巨噬细胞渗入到癌组织中。
癌症包含表达或不表达VSIG3和/或VISTA的癌症，并且进一步包含非转移性或非侵袭性以及侵袭性或转移性癌症，其中通过免疫细胞、基质细胞或患病细胞的VSIG3和/或VISTA表达抑制了抗肿瘤反应和抗侵袭性免疫反应，以及以血管化肿瘤为特征的反应。
还可以在用于治疗感染性疾病的组合物中提供VSIG3/VISTA拮抗剂，所述感染性疾病包含但不限于病毒性疾病，诸如HIV、HPV、EBV、脑炎、疱疹、其他痘病毒和其他已知的人类病毒、寄生虫病、细菌性疾病、真菌或酵母相关疾病。
应该理解的是，本文鉴定的疾病病症旨在是示例性的，而不是穷尽性的。此外，VSIG3/VISTA激动剂或VSIG3/VISTA拮抗剂可以与其它治疗剂组合，这些治疗剂可以在相同或不同的时间以相同或不同的组合物施用。例如，VSIG3/VISTA激动剂或VSIG3/VISTA拮抗剂可以在治疗方案中给药，所述治疗方案包含给药PD-1或PD-L1激动剂或拮抗剂、CTLA4-Ig、细胞因子、细胞因子激动剂或拮抗剂或另一种受体激动剂或拮抗剂。
多聚化
不希望受理论的束缚，据信在一些实施例中，本文所描述的VSIG3/VISTA相互作用可以包含多聚体的复合物。例如，图17示出了预测的最小VISTA-VSIG3结合组装，其与图9中所示的如通过Biacore测量的高亲和力相互作用(约17nM)一致，并且类似于图7和图10中所示的基于亲和力的细胞外相互作用筛选(AVEXIS)相互作用测定，结果如图11至图14所示。这种多聚体相互作用进一步说明了这样的复合物的组装如何可以被抗VSIG3抗体的结合破坏。AVEXIS筛选显示，多聚化的VISTA胞外域(ECD)可以结合VSIG3ECD的二聚体，但在相反的情况下，使五聚体VSIG3对抗VISTA二聚体，没有检测到结合事件。
不希望受理论的束缚，这些结果暗示了VISTA与VSIG3分子之间的4:2化学计量，其中四个VISTA ECD与两个VSIG3 ECD结合。这种相互作用让人想起由PVR-TIGIT结构的X射线结晶学所捕获的结合复合物(Stengel等人，(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA109:5399-5404)，其示出了稳定结合的PVR和TIGIT ECD的2:2化学计量，如图17C所示。PVR-TIGIT复合物说明TIGIT的免疫球蛋白(Ig)结构域首先需要以背对背的方式结合为同源二聚体，采用Ig结构域β-夹心的“ABE”或背面(其通常由七至九个β-链组成，标记为A-G)(Bork等人，(1994)J.Molec.Biol.242:309-320)。TIGIT ECD同二聚体然后可以通过各自的前对前或“GFC”面相互作用结合一对PVR ECD。这些GFC面介导的IG结构域相互作用是用于IG结构域结合的最常见方式，并且已经被X射线结晶学捕获，在细胞表面免疫调节受体之间的几乎每个最小结合复合物中(Stengel等人，(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA109:5399-5404)，并且甚至抗体和T细胞受体(TCR)复合物(Lin等人，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:3011-3016)中。
类似地，图17D示出了在PD-1与其两个配体PD-L1和PD-L2之间的1:1结合复合物，它们分别利用相互作用的IgECD的相同的前对前(或GFC)面(Lin等人，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:3011-3016；Lazar-Molnar等人，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA105:10483-10488)。
通过类比，VSIG3可以首先形成背对背(ABE面)同二聚体，如图17A所示，或者可能形成VSIG3-VSIG8异二聚体，如图17B所示(当两者都存在于同一细胞表面时)。VSIG3和VSIG8是具有非常相似的架构的Ig超家族蛋白(它们各自的ECD都揭示了一对Ig结构域，其中只有它们的N端结构域被预测参与了与VISTA ECD的细胞间结合)，并且两个簇紧密靠近在同一Ig亚家族中，来自Ig免疫调节蛋白的基于序列的敏感分类(Rubinstein等人，(2013)Structure21(5):766-776)。VSIG3与VSIG8之间的这种紧密的序列和结构关系可以允许它们的异二聚体形成和联合VISTA结合。如图17A和图17B所示，如PVR-TIGIT所见，中心VSIG3同二聚体通过前对前(或GFC面)相互作用与VISTAECD接合。然而，与PVR-TIGIT不同的是，VISTA似乎没有将VSIG3作为单体接合，但可能是因为它在其Ig结构域的中间的接近20个氨基酸的异常插入(这可能使VISTA Igβ-夹心的折叠不稳定)(Nowak等人，(2017)Immunol.Rev.276:66-79)，本身需要通过背对背VISTA同源二聚体稳定化，并且因此四个VISTA ECD(在两对背对背同源二聚体中)最少用于在各自的前对前相互作用中抓住VSIG3同源二聚体(或VSIG3-VSIG8异二聚体)，如图17A和图17B所示。相比之下，如图17C所示，PVR作为具有常规Ig结构的单体ECD是稳定的，并且因此仅需要两个PVR来接合TIGIT同二聚体。
因此，如本文进一步描述的，在一些实施例中，针对VSIG3的阻断抗体可能破坏4:2VISTA-VSIG3复合物(或VISTA4-VSIG32，如图17A所示)的组装。
多聚化的VSIG3或多聚化的VISTA及其制备和使用方法
在一些实施例中，本公开描述了多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和多聚化的VSIG8；制造多聚化VSIG3、多聚化的VISTA和多聚化VSIG8的方法；以及使用多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和多聚化的VSIG8的方法。
在一些实施例中，多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8可以包含卷曲螺旋结构域。在一些实施例中，卷曲螺旋结构域可以是五聚体卷曲螺旋结构域。在一些实施例中，卷曲螺旋结构域可以共价地连接至VSIG3、VISTA或VSIG8。在一些实施例中，卷曲螺旋结构域可以是软骨寡聚基质蛋白(COMP)的卷曲螺旋结构域。在一些实施例中，COMP蛋白可以是人蛋白。在一些实施例中，COMP蛋白可以是大鼠蛋白。
在一些实施例中，多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8可以包含接头结构域。在一些实施例中，接头结构域可以是至少10个氨基酸、至少11个氨基酸、至少12个氨基酸或至少13个氨基酸。在一些实施例中，接头结构域可以是高达12个氨基酸、高达13个氨基酸、高达14个氨基酸、高达15个氨基酸或高达20个氨基酸。在一些实施例中，接头结构域可以包含NSGGGSGGGTG(SEQ ID NO:13)或LDRNLPPLAPLGP(SEQ ID NO:14)或两者。
在一些实施例中，多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8可以包含碱性磷酸酶。碱性磷酸酶可以用于基于亲和力的细胞外相互作用筛选(AVEXIS)测定中的酶检测。
在一些实施例中，多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8可以包含蛋白质标签，包含例如His标签。
在一些实施例中，多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8可以包含TEV切割位点。在一些实施例中，TEV切割位点可以包含GSENLYFQG。
在一些实施例中，多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8可以包含图8中公开的序列中的每一个的全部或一部分。
不希望受理论的束缚，认为VSIG3与VISTA之间的相互作用以及VSIG8与VISTA之间的相互作用表现出比在受体-配体相互作用中通常观察到的1:1相互作用(例如，PD-1与PD-L1之间的相互作用)更大的复杂化学计量。例如，VSIG3与VISTA之间的相互作用可以具有4:2的化学计量。因此，VISTA、VSIG3和VSIG8的多聚化可用于复制、破坏或改善VSIG3与VISTA之间或VSIG8与VISTA之间的相互作用的检测。
在一些实施例中，多聚化的蛋白质(例如，多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8)可以用于调节VSIG3和VISTA或VSIG8和VISTA的相互作用。在一些实施例中，调节VSIG3和VISTA的相互作用可以包含激动或拮抗VSIG3和VISTA的相互作用。在一些实施例中，调节VSIG8和VISTA的相互作用可以包含激动或拮抗VSIG8和VISTA的相互作用。在一些实施例中，调节VSIG3和VISTA的相互作用可以包含调节VSIG3的多聚化。在一些实施例中，调节VSIG3和VISTA的相互作用可以包含调节VISTA的多聚化。在一些实施例中，调节VSIG8和VISTA的相互作用可以包含调节VISTA的多聚化。在一些实施例中，调节VSIG8和VISTA的相互作用可以包含调节VSIG8的多聚化。
在一些实施例中，多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8可以用于体外或体内的筛选测定。例如，多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8可以用于筛选VSIG3、VISTA和/或VSIG8的结合配偶体。另外地或可替代地，可以使用多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8来筛选调节VSIG3和VISTA的相互作用的化合物；筛选调节VSIG8和VISTA的相互作用的化合物；筛选调节VSIG3与VSIG3的配体的相互作用的化合物；或者筛选调节VISTA与VISTA的配体的相互作用的化合物。在一些实施例中，多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8可以用于测量VISTA/VSIG相互作用的结合亲和力和动力学。在一些实施例中，多聚体可以用于VSIG3激动剂和/或VSIG3拮抗剂的开发和/或表征。在一些实施例中，相对于使用非多聚体化的蛋白质的筛选测定，使用多聚体化的VSIG3、多聚体化的VISTA和/或多聚体化的VSIG8可以增加筛选测定中的检测灵敏度。
在一些实施例中，多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8可以用于调节VSIG3、VSIG8和/或VISTA信号传导。例如，VSIG3多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8可以用于抑制或防止VSIG3、VSIG8或VISTA对T细胞的抑制作用，包含例如对T细胞信号传导或对T细胞增殖的抑制作用。另外地或可替代地，多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA和/或多聚化的VSIG8可以用于抑制或防止VSIG3和VISTA的相互作用。
在某些情况下，VSIG3-COMP和/或VISTA-COMP拮抗剂将导致抑制CD3诱导的信号传导，包含例如CD3诱导的MIP-1α、CD3诱导的Rantes(CCL5)、CD3诱导的CXCL11、CD3诱导的干扰素(IFN)-γ、IL-2和/或IL-17(也被称为IL-17A)的产生。这样的CD3诱导的信号传导在外周血单核细胞(PBMC)和/或T细胞中可能减少。这种抑制作用可以使用体外基于细胞的测定通过表达VISTA、VSIG3和/或VSIG8的细胞来检测。例如，如图15所示，VSIG3-COMP阻断T细胞增殖和活化。
方法实施例
1.一种方法，其包括调节VISTA和VSIG3的相互作用，所述方法包括引入调节VISTA和VSIG3的相互作用的化合物。
2.根据实施例1所述的方法，其中调节VISTA和VSIG3的相互作用包括激动或拮抗VISTA和VSIG3的相互作用。
3.根据实施例1或2中任一个所述的方法，其中调节VISTA和VSIG3的相互作用包括调节VISTA或VSIG3或两者的多聚化。
4.根据实施例1至3中任一个所述的方法，其中
VISTA在细胞的表面上表达，
VSIG3在细胞的表面上表达，或者
VISTA和VISG3都在细胞的表面上表达。
5.根据实施例1至4中任一个所述的方法，其中所述化合物包括抗VSIG3抗体。
6.根据实施例5所述的方法，抗VSIG3抗体包括：
与由表2A的克隆之一产生的抗体结合至相同的VSIG3表位的抗体；或者
由表2A的克隆之一产生的抗体。
7.根据实施例5或6中任一个所述的方法，其中抗VSIG3抗体包括
以下中的至少一个：
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的重链可变区；或者
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的轻链可变区。
8.根据实施例5至7中任一个所述的方法，其中抗VSIG3抗体包括
以下中的至少一个：
重链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的重链可变区的一个或多个互补决定区(CDR)；或者
轻链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的轻链可变区的一个或多个CDR。
9.根据实施例5至8中任一个所述的方法，其中所述抗VSIG3抗体包括由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体。
10.根据实施例5至9中任一个所述的方法，所述化合物进一步包括抗VISTA抗体。
11.根据实施例5至10中任一个所述的方法，其中所述化合物包括抗原结合片段。
12.根据实施例1至11中任一个所述的方法，其中所述化合物包括VSIG3多肽。
13.根据实施例1至12中任一个所述的方法，其中所述化合物包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的蛋白质。
14.根据实施例12或13中任一个所述的方法，其中所述化合物包括VSIG3的可溶性片段。
15.根据实施例12至14中任一个所述的方法，其中所述化合物包括VSIG3的胞外区。
16.根据实施例15所述的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:2。
17.根据实施例15或16中任一个所述的方法，其中所述化合物包括融合蛋白。
18.根据实施例15至17中任一个所述的方法，其中所述化合物包括Fc结构域。
19.根据实施例18所述的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:3。
20.根据实施例1至19中任一个所述的方法，其中所述化合物包括VISTA多肽。
21.根据实施例20所述的方法，其中所述化合物包括与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的蛋白质。
22.根据实施例20或21中任一个所述的方法，其中所述化合物包括VISTA的可溶性片段。
23.根据实施例20至23中任一个所述的方法，其中所述化合物包括VISTA的胞外区。
24.根据实施例23所述的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:5。
25.根据实施例20至24中任一个所述的方法，其中所述化合物包括融合蛋白。
26.根据实施例20至25中任一个所述的方法，其中所述化合物包括Fc结构域。
27.根据实施例26所述的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:6。
28.根据实施例1至27中任一个所述的方法，其中所述化合物包括软骨寡聚基质蛋白(COMP)的卷曲螺旋结构域。
29.根据实施例28所述的方法，其中所述COMP包括大鼠COMP或人COMP。
30.根据实施例28或29中任一个所述的方法，其中所述卷曲螺旋结构域包括五聚体卷曲螺旋结构域。
31.根据实施例28至30中任一个所述的方法，其中所述卷曲螺旋结构域被共价地连接至VSIG3多肽或VISTA多肽或两者。
32.根据实施例31所述的方法，其中化合物包括接头结构域。
33.根据实施例32所述的方法，其中所述接头结构域包括NSGGGSGGGTG(SEQ IDNO:13)或LDRNLPPLAPLGP(SEQ ID NO:14)或两者。
34.根据实施例28至33中任一个所述的方法，其中所述化合物包括碱性磷酸酶。
35.根据实施例28至34中任一个所述的方法，其中所述化合物包括TEV切割位点。
36.根据实施例1至35中任一个所述的方法，其中所述化合物消除VISTA和VSIG3的结合。
37.根据实施例1至36中任一个所述的方法，其中所述化合物消除VISTA信号传导。
38.根据实施例1至37中任一个所述的方法，其中所述化合物消除VSIG3信号传导。
39.根据实施例1至38中任一个所述的方法，其中所述化合物影响CD3诱导的IL-2产生、CD3诱导的干扰素-γ产生、CD3诱导的RANTES产生、CD3诱导的MIP-1α产生、CD3诱导的IL-17产生或CD3诱导的CXCL11产生或其组合。
40.根据实施例1至39中任一个所述的方法，其中所述化合物影响T细胞增殖。
41.根据实施例1至40中任一个所述的方法，所述方法进一步包括用治疗有效量的化合物治疗受试者。
42.根据实施例41所述的方法，其中VSIG3在从受试者获得的生物样品中过表达。
抗体实施例
1.一种结合至VSIG3的单克隆抗体。
2.根据实施例1的抗VSIG3抗体，其中所述抗体阻断VSIG3-VISTA的相互作用、VSIG3-VSIG8的相互作用、VSIG3的多聚化或VISTA的多聚化或其组合。
3.根据实施例1或2中任一个所述的抗VSIG3抗体，所述抗体包括：
与由表2A的克隆之一产生的抗体结合至相同的VSIG3表位的抗体；或者
由表2A的克隆之一产生的抗体。
4.根据实施例1至3中任一个所述的抗VSIG3抗体，其中抗VSIG3抗体包括
以下中的至少一个：
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的重链可变区；或者
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的轻链可变区。
5.根据实施例1至4中任一个所述的抗VSIG3抗体，其中抗VSIG3抗体包括
以下中的至少一个：
重链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的重链可变区的一个或多个互补决定区(CDR)；或者
轻链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的轻链可变区的一个或多个CDR。
6.根据实施例1至5中任一个所述的抗VSIG3抗体，其中抗VSIG3抗体包括由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体。
7.一种由表2A的克隆中的一个或多个产生的单克隆抗体。
8.一种单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括
以下中的至少一个：
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的重链可变区；或者
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的轻链可变区。
9.一种单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括
以下中的至少一个：
重链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的重链可变区的一个或多个互补决定区(CDR)；或者
轻链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的轻链可变区的一个或多个CDR。
10.一种单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括：
由表2A的克隆之一产生的单克隆抗体的重链可变区的每个互补决定区(CDR)，或者
由表2A的克隆之一产生的单克隆抗体的轻链可变区的每个CDR，或者
由表2A的克隆之一产生的单克隆抗体的重链可变区的每个CDR和由表2A的克隆之一产生的单克隆抗体的轻链可变区的每个CDR。
13.一种单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括氨基酸序列，所述氨基酸序列：
与由表2A的克隆产生的单克隆抗体的重链可变区的一个或多个互补决定区(CDR)至少80％相同；或者
与由表2A的克隆产生的单克隆抗体的轻链可变区的一个或多个CDR至少80％相同，或者
与由表2A的克隆产生的单克隆抗体的重链可变区的一个或多个CDR至少80％相同，并且与由表2A的克隆产生的单克隆抗体的轻链可变区的一个或多个CDR至少80％相同。
14.根据实施例7至13中任一个所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体与VSIG3结合。
15.根据实施例7至14中任一个所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括IgG抗体。
16.根据实施例7至15中任一个所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体消除VSIG3与VSIG3配体的结合。
17.根据实施例7至16中任一个所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体消除VSIG3与VISTA的结合。
18.根据实施例7至17中任一个所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括抗原结合片段，所述抗原结合片段包括Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段或Fv片段或其组合。
19.一种组合物，其包括根据实施例1至18中任一个所述的单克隆抗体或抗VSIG3抗体。
20.一种试剂盒，其包括根据实施例1至18中任一个所述的单克隆抗体或抗VSIG3抗体。
化合物实施例
1.一种调节VISTA和VSIG3的相互作用的化合物。
2.根据实施例1所述的化合物，其包括抗VSIG3抗体。
3.根据实施例2所述的化合物，其中抗VSIG3抗体包括：
与由表2A的克隆之一产生的抗体结合至相同的VSIG3表位的抗体；或者
由表2A的克隆之一产生的抗体。
4.根据实施例1至3中任一个所述的化合物，其中抗VSIG3抗体包括
以下中的至少一个：
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的重链可变区；或者
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的轻链可变区。
5.根据实施例1至4中任一个所述的化合物，其中抗VSIG3抗体包括
以下中的至少一个：
重链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的重链可变区的一个或多个互补决定区(CDR)；或者
轻链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的轻链可变区的一个或多个CDR。
6.根据实施例1至5中任一个所述的化合物，其中抗VSIG3抗体包括由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体。
7.根据实施例2至6中任一个所述的化合物，其中所述化合物包括抗原结合片段。
8.根据实施例1至7中任一个所述的化合物，其中所述化合物消除VISTA和VSIG3的结合。
9.根据实施例1至8中任一个所述的化合物，其中所述化合物调节VSIG3的多聚化。
10.根据实施例1至9中任一个所述的化合物，其中所述化合物消除VISTA信号传导。
11.根据实施例1至10中任一个所述的化合物，其中所述化合物消除VSIG3信号传导。
12.根据实施例1至11中任一个所述的化合物，其中所述化合物影响CD3诱导的IL-2产生、CD3诱导的干扰素-γ产生、CD3诱导的RANTES产生、CD3诱导的MIP-1α产生、CD3诱导的IL-17产生或CD3诱导的CXCL11产生或其组合。
13.根据实施例1至12中任一个所述的化合物，其中所述化合物影响T细胞增殖。
14.根据实施例1至13中任一个所述的化合物，其中所述化合物包括VSIG3多肽。
15.根据实施例14所述的化合物，其中所述化合物包括与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的蛋白质。
16.根据实施例14或15所述的化合物，其中所述化合物包括VSIG3的可溶性片段。
17.根据实施例14至16中任一个所述的化合物，其中所述化合物包括VSIG3的胞外区。
18.根据实施例17所述的化合物，其中所述化合物包括SEQ ID NO:2。
19.根据实施例17至18中任一个所述的化合物，其中所述化合物包括融合蛋白。
20.根据实施例14至19中任一个所述的化合物，其中所述化合物包括Fc结构域。
21.根据实施例20所述的化合物，其中所述化合物包括SEQ ID NO:3。
22.根据实施例1至21中任一个所述的化合物，其中所述化合物包括VISTA多肽。
23.根据实施例22所述的化合物，其中所述化合物包括与SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的蛋白质。
24.根据实施例22或23所述的化合物，其中所述化合物包括VISTA的可溶性片段。
25.根据实施例22至24中任一个所述的化合物，其中所述化合物包括VISTA的胞外区。
26.根据实施例25所述的化合物，其中所述化合物包括SEQ ID NO:5。
27.根据实施例1至26中任一个所述的化合物，其中所述化合物包括融合蛋白。
28.根据实施例1至27中任一个所述的化合物，其中所述化合物包括Fc结构域。
29.根据实施例28所述的化合物，其中所述化合物包括SEQ ID NO:6。
30.根据实施例1至29中任一个所述的化合物，其中所述化合物包括软骨寡聚基质蛋白(COMP)的卷曲螺旋结构域。
31.根据实施例30所述的化合物，其中所述COMP包括大鼠COMP或人COMP。
32.根据实施例30或31中任一个所述的化合物，其中卷曲螺旋结构域包括五聚体卷曲螺旋结构域。
33.根据实施例30至32中任一个所述的化合物，其中卷曲螺旋结构域共价地连接至VSIG3多肽或VISTA多肽或两者。
34.根据实施例33所述的化合物，其中所述化合物包括接头结构域。
35.根据实施例34所述的化合物，其中所述接头结构域包括NSGGGSGGGTG(SEQ IDNO:13)或LDRNLPPLAPLGP(SEQ ID NO:14)或两者。
36.根据实施例30至35中任一个所述的化合物，其中所述化合物包括碱性磷酸酶。
37.根据实施例30至36中任一个所述的化合物，其中所述化合物包括TEV切割位点。
38.根据实施例1至37中任一个所述的化合物，其中所述化合物消除VISTA和VSIG3的结合。
39.一种组合物，其包括根据实施例1至38中任一个所述的化合物。
40.一种试剂盒，其包括根据实施例1至38中任一个所述的化合物。
41.一种方法，其包括用治疗有效量的根据实施例1至38中任一个所述的化合物治疗受试者。
42.根据实施例41所述的方法，其中VSIG3在从受试者获得的生物样品中过表达。
组合物实施例
1.一种包括两种或更多种抗VSIG3抗体的组合物，其中至少一种抗VSIG3抗体包括由表2A的克隆产生的抗体。
2.根据实施例1所述的组合物，其中每种抗VSIG3抗体阻断VSIG3-VISTA的相互作用、VSIG3-VISTA8的相互作用、VSIG3的多聚化和VISTA的多聚化中的一种或多种。
3.根据实施例1或2中任一个所述的组合物，其中两种或更多种抗VSIG3抗体结合至不同的表位。
4.根据实施例1至3中任一个所述的组合物，其中抗VSIG3抗体中的至少一种与VSIG的ABEIg面相互作用。
5.根据实施例1至4中任一个所述的组合物，其中VSIG3抗体中的至少一种抗与VSIG的GFCIg面相互作用。
6.一种包括抗VSIG3抗体和抗VISTA抗体的组合物，其中所述组合物阻断VSIG3-VISTA的相互作用、VSIG3-VISTA8的相互作用、VSIG3的多聚化或VISTA的多聚化或其组合；并且其中抗VSIG3抗体包括由表2A的一个或多个克隆产生的抗体。
7.一种组合物，其包括多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA或多聚化的VSIG8或其组合。
多克隆抗体实施例
1.一种通过用免疫原免疫产生的多克隆抗体，其中所述免疫原包括多肽，所述多肽包括表3A中描述的多肽中的一种或多种。
2.一种通过用免疫原免疫产生的多克隆抗体，其中所述免疫原包括多肽，所述多肽由表3A中描述的一种或多种多肽组成。
3.一种通过用免疫原免疫产生的多克隆抗体，其中所述免疫原包括多肽，所述多肽由表3A中描述的多肽组成。
4.一种通过用多肽免疫产生的多克隆抗体，所述多肽由表3A中描述的肽组成。
5.根据实施例1至4中任一个所述的多克隆抗体，其中多克隆抗体结合VSIG3。
通过以下实例来说明本发明。应当理解的是，具体的实例、材料、量和程序将根据如本文阐述的本发明的范围和精神进行广义解释。
实例
除非另有说明，否则以下实例中的所有孵育都是在室温下进行的，并且所用的所有试剂、起始材料和溶剂都是从商业供应商(例如，西格玛-奥尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯市)购买的，并且无需进行进一步的纯化即可使用。
实例1–单克隆抗体
重组人VSIG3 Fc嵌合体(“rhVSIG3”)–由SEQ ID NO:3编码；参见表1)特异性结合至功能性ELISA结合测定上的重组人VISTA Fc嵌合体(“rhVISTA”–由SEQ ID NO:6编码；参见表1)。将rhVISTA以2μg/mL(100μL体积)包被在ELISA微量滴定板的孔上。在用1％的BSA封闭孔后，添加不同量的用生物素标记的rhVSIG3。用链霉亲和素-HRP检测到由于rhVSIG3–rhVISTA的相互作用而与板相关的生物素标记。如图1A所示，当将rhVISTA以每孔100μL的体积以2μg/mL固定在微量滴定板的孔上时，产生50％最佳结合反应的rhVSIG3的浓度为约0.25μg/mL。减去非特异性结合，并且在所有情况下均小于总信号的5％。
开发了单克隆抗VSIG3抗体，并使用带有His标签的rhVSIG3蛋白(250ng/mL)的涂层，通过直接ELISA试验测试了特异性。由表2的克隆产生的抗体的结果显示在表2A的最右列。
为了测试单克隆抗VSIG3抗体(包含由表2A的克隆之一产生的抗体)对rhVSIG3-rhVISTA的相互作用的影响，在2至8℃下，将ELISA板以2μg/ml的rhVSIG3(100μL体积)包被过夜。在用1％的BSA封闭后，添加不同量的msx人VSIG3，并在室温下预处理2小时。将生物素化的rhVISTA蛋白以7.5μg/ml(100μL体积)添加到每个孔中。使用链霉亲和素-HRP检测到rhVSIG3–rhVISTA的相互作用，并且随后进行显色反应。图1B示出了代表性的结果。
在表2B中总结了另外的结果，其表明如在存在VISTA特异性抗体的情况下使用ELISA测定所测试的rhVSIG3与rhVISTA之间的相互作用的特异性。使用功能性ELISA结合测定来测试三十种单克隆抗人VSIG3抗体。如表2B所示，测试的30种针对VSIG3的单克隆抗体中有26种阻断了rhVSIG3与rhVISTA之间的相互作用。
表2A
Figure BDA0002612977710000401
Figure BDA0002612977710000411
Figure BDA0002612977710000421
表2B
Figure BDA0002612977710000422
Figure BDA0002612977710000431
Figure BDA0002612977710000441
实例2–多克隆抗体
使用表3A中列出的多肽产生兔多克隆抗人VSIG-3抗体，并如实施例1所述进行测试。简言之，在2至8℃下，将rhVSIG-3以2μg/ml(100μL体积)包被在ELISA微量滴定板的孔上过夜。在用1％的BSA封闭孔后，添加不同量的多克隆兔抗hVSIG-3肽抗体，并在室温下预处理2小时。然后将7.5μg/mL的生物素化的rhVISTA以100μL的体积添加到每个孔中。
示例性的结果在图2和表3中示出。如表3B所示，所测试的16种兔多克隆抗体中的六种阻断了rhVSIG3与rhVISTA之间的相互作用。ED50反映了恢复50％最大阻断所需的抗体的浓度
表3A
抗体 肽免疫原 抗体类型
Q111 Q111至C120 兔多克隆
H89 H89至M98+C 兔多克隆
L138 L138至C149 兔多克隆
I205 I205至C215 兔多克隆
V216 V216至C226 兔多克隆
Y176 C+Y176至K186 兔多克隆
G129 G129至L138+C 兔多克隆
C44 C44至L55 兔多克隆
S154 S154至C165 兔多克隆
D194 D194至N204+C 兔多克隆
G78 G78至F88+C 兔多克隆
C120 C120至N132 兔多克隆
Q33 Q33至C44 兔多克隆
N66 N66至Q77+C 兔多克隆
C165 C165至T175 兔多克隆
K186 C+K186至Q195 兔多克隆
表3B
Figure BDA0002612977710000442
Figure BDA0002612977710000451
实例3–单克隆抗体和多克隆抗体对T细胞功能的影响
IL-2分泌
如图3所示，rhVSIG3以剂量依赖性方式显著地抑制由T细胞造成的抗CD3诱导的IL-2产生。兔多克隆抗人VSIG3抗体(N66)阻断了VSIG3抑制从活化的T细胞分泌IL-2的能力。
在2至8℃下，将小鼠抗人CD3抗体以1μg/mL包被在96孔板上过夜。然后将rhVSIG-3蛋白以连续稀释度(空心圆圈)或以20μg/mL固定在测定板上，并在37℃下孵育3小时。添加连续稀释的多克隆兔抗人VSIG-3(N66)或同种型对照(兔IgG)，并与20μg/mL的rhVSIG-3蛋白在室温下共同孵育1至2小时。使用MagCellect人CD3+分离试剂盒(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯市)从人PBMC中分离人T细胞，并将分离的人T细胞添加到板(2×105/孔)中，并在37℃下在存在5％的CO2的情况下培养24小时。使用QUANTIKINE人IL-2 ELISA试剂盒(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯市)在细胞培养上清液中测量分泌的IL-2。结果示于图3中。
对于N66观察到的ND50为约2.67μg/mL，并且预计将取决于固定化的rhVSIG-3的浓度。
T细胞的增殖与活化
如图4和表4所示，rhVSIG3蛋白抑制抗CD3诱导的细胞增殖和正常人外周血T细胞的活化，并且抗VSIG3抗体可以阻断这种抑制。
抗人CD3(1-5μg/mL；R&D Systems，克隆UCHT1，MAB100)和人IgG(对照蛋白；1-5μg/mL；R&D Systems 100-HG)或rhVSIG3蛋白(10至50μg/ml)通过在4℃下孵育过夜，与所示的抗人VSIG3抗体(1至10μg/ml)一起包被在96孔板上。用PBS洗涤板，并用在PBS中的2.5％人AB血清(Innovative Research，密歇根州诺维市)封闭30分钟。使用标记有细胞示踪紫(Cell Trace Violet)增殖染料(Life Technologies，根据制造商规格)的CD3+T细胞分离试剂盒(R&D Systems，MAGH101)从人PBMC中阴性选择CD3+ T细胞，并且添加至200μL的RPMI+10％人AB血清的孔中(每孔5×104至2×105个细胞)。将板在37℃下孵育72至96小时，然后收获细胞，并通过流式细胞术分析增殖/细胞活化。
如图4和表4所示，通过rhVSIG3蛋白(阴影线)来抑制抗CD3诱导的人T细胞的增殖(图4，第一个灰色条)。与单克隆抗人VSIG3 Ab 774208的共培养不影响这种抑制。然而，用单克隆抗人VSIG3抗体克隆973404和993620的培养能够逆转rhVSIG3介导的抑制，表明这些抗体阻断了VSIG3诱导的T细胞增殖的抑制。另外，多克隆抗体G129和C120也能够逆转rhVSIG3介导的抑制，表明这些抗体阻断了VSIG3诱导的T细胞增殖的抑制。
表4.
抗体 免疫原 阻断T细胞增殖的抑制
774208 rhVSIG3(1-245) 否
973404 rhVSIG3(1-245) 是
993620 rhVSIG3(1-245) 是
干扰素-γ分泌
如图5所示，rhVSIG3以剂量依赖性方式显著地抑制由T细胞产生的抗CD3诱导的干扰素-γ。示例性的单克隆抗人VSIG-3抗体(973404)阻断了VSIG3抑制来自活化的T细胞的干扰素-γ分泌的能力。
在2至8℃下，将小鼠抗人CD3抗体以1μg/mL包被在96孔板上过夜。然后将rhVSIG-3蛋白以系列稀释(□-空心方块)或以20μg/mL固定在测定板上，并在37℃下孵育3小时。添加系列稀释的单克隆抗人VSIG-3(973404或973422)，并与20μg/mL的rhVSIG-3蛋白在室温下共同孵育1至2小时。在固定期间，按照来自试剂盒中的插入说明书，使用MagCellect人CD3+T细胞分离试剂盒(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯市)分离人T细胞。将分离的人T细胞(2×105/孔)添加到板中，并且在37℃下在5％的CO2存在下培养24小时。使用QUANTIKINE人干扰素γELISA试剂盒(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯市)测量细胞培养上清液中分泌的干扰素γ。结果示于图5中。
对于973404观察到的ND50(ο-空心圆)为约6.7μg/ml，并且预计取决于固定化的rhVSIG3的浓度。
实施例4–融合蛋白
如图6中示意性所示，将VISTA、VSIG3或VSIG8融合至大鼠软骨寡聚基质蛋白(COMP，残基26-72)的五聚体卷曲螺旋结构域。序列示于表5和图8A至8C中。
如图7中示意性所示，将VISTA、VSIG3或VSIG8融合至大鼠软骨寡聚基质蛋白(COMP，残基26-72)的五聚体卷曲螺旋结构域，随后融合至碱性磷酸酶，Flag和6xHis标签。接头残基以绿色示出。碱性磷酸酶可以用于基于亲和力的细胞外相互作用筛选(AVEXIS)测定中的酶促检测，并且总蛋白可以使用抗多聚His抗体进行归一化。序列示于表5和图8A至8C中。
这些融合蛋白具有高度的多聚化作用，并且由于相对高数量的亚基(相似的构建体几乎都含有2至3个亚基而不是5个)和通过二硫键进行束缚(tethering)而高度稳定。
表5
Figure BDA0002612977710000471
Figure BDA0002612977710000481
Figure BDA0002612977710000491
实例5–通过表面等离子体共振对VISTA-VSIG3的相互作用的动力学和亲和力进行量化
使用抗多聚His抗体将VISTA或VISTA-COMP(各自如实例4中所述制备)共价地固定至CM5芯片(GE Healthcare，美国)的表面上。然后使VSIG3 Fc融合物的稀释液以在0.2nM与20μM之间的浓度流过表面，并使用Biacore T200评估软件3.1版将双倍参考减去的数据拟合为1:1Langmuir结合模型。
如图9所示，多聚VISTA-COMP对VSIG3-Fc(约17nM)的亲和力比对单体VISTA(约2.5μM)高约150倍。这一增加主要是解离速率造成的增加。
实例6–基于亲和力的细胞外相互作用筛选
修改了基于亲和力的细胞外相互作用筛选(AVEXIS)，以筛选针对VSIG3的抗体，所述抗体阻断了重组人VSIG3(rhVSIG3)与VISTA之间的相互作用。测定的示意图显示在图10中。简言之，将纯化的重组Fc融合蛋白(即包含例如VSIG3-Fc的诱饵蛋白)分别捕获在蛋白A包被的板(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆市)上，并且随后用1％的BSA封闭缓冲液封闭。在蛋白A包被的板上捕获VSIG3-Fc诱饵后，将孔分别与抗VSIG3的单克隆抗体孵育。然后添加含有与COMP螺旋寡聚物融合的寡聚猎物蛋白和碱性磷酸酶的条件培养基，孵育并洗涤，并使用BLUEPHOS试剂(KPL/Sera Care，马萨诸塞州米尔福德市)通过检测碱性磷酸酶活性来定量地测定相互作用。
产生了识别人VSIG3的大鼠和小鼠单克隆抗体，并测试了它们阻断VSIG3-VISTA相互作用的能力。如上所述，进行了针对VSIG3-VISTA相互作用的抗体阻断的AVEXIS测定筛选。简言之，诱饵蛋白VSIG3-Fc被捕获在蛋白A包被的板上，并且在没有或有抗体的情况下以10μg/mL被封闭。发现，来自克隆774206和74208的抗体将VISTA-VSIG3的相互作用阻断到接近背景水平，如图11所示，并且在图12、图13和图14中用作阳性对照。在抗VSIG3抗体的存在下孵育猎物蛋白(具有碱性磷酸酶的多聚VISTA)。在洗涤后，使用碱性磷酸酶底物测量VSIG3与VISTA之间的相互作用，并通过测量650nm的吸光度进行定量。结果示于图12、图13和图14中，并总结在表6中。
实例7–VSIG3-COMP阻断T细胞增殖和活化
将抗人CD3(1至5μg/ml)和rhVSIG3(10至25μg/mL)或VSIG3-COMP(10至25μg/ml)的组合物在4℃包被在96孔板上过夜。用PBS洗涤板。使用CD3+ T细胞分离试剂盒(R&DSystems，MAGH101)从人PBMC中阴性选择CD3+ T细胞，用细胞示踪紫(Cell Trace Violet)增殖染料(Life Technologies，根据制造商规格)标记，并且添加到200μl的RPMI+10％人AB血清中的孔中(每孔5×104至2×105个细胞)。将板在37℃下孵育4至6天，然后收获细胞，并通过流式细胞术分析CD25表达和细胞增殖。结果示于图15中。
如图15所示，当在rhVSIG3的存在下培养细胞时，抗CD3诱导的CD4+人T细胞的增殖(左上)被部分抑制，而在VSIG3-COMP的存在下被完全抑制(左列点图)。在rhVSIG3或VSIG3-COMP的存在下，CD25表达作为T细胞活化的另一种指示同样受到抑制(右列点图)。这些结果表明，与rhVSIG3相比，多聚化的VSIG3能够更强烈地影响T细胞的活化和增殖。
实例8-VSIG3阻断抗体恢复VISTA诱导的T细胞增殖和活化的抑制
通过在4℃下孵育过夜，将抗人CD3(1至5μg/ml)和rhVSIG8(10至25μg/ml)或rhVISTA(10至25μg/ml)的组合包被在96孔板上。用PBS洗涤板并且用在PBS中的2.5％人AB血清(Innovative Research)封闭30分钟。然后将可溶性抗人VSIG3抗体993620或973404(1至10μg/ml)添加到适当的孔中。使用标记有细胞示踪紫(Cell Trace Violet)增殖染料(Life Technologies，根据制造商规格)的CD3+ T细胞分离试剂盒(R&D Systems，MAGH101)从人PBMC中阴性选择CD3+ T细胞，并且添加至在200μL的RPMI+10％人AB血清中的孔中(每孔5×104至2×105个细胞)。将板在37℃下孵育3至6天，然后收获细胞，并通过流式细胞术分析增殖/细胞活化。抗体993620的结果显示于图16A和图16B中。抗体973404的结果显示于图16C中。
如图16A所示，抗CD3诱导CD4+人T细胞的增殖(左上图)，如通过每个细胞分裂的细胞示踪剂紫(Cell Tracer Violet)染料的稀释、荧光强度的降低以及细胞群体从右上象限向左上象限的移动所证明的。用rhVSIG8或rhVISTA的培养抑制了CD3诱导的增殖，如由右上象限(顶行、中间和右侧图)的细胞的维持所示出的。尽管添加抗人VSIG3抗体克隆993620对rhVSIG8抑制增殖没有影响，但rhVISTA蛋白对增殖的抑制被部分地逆转(右下图)。这些结果表明抗VSIG3单克隆抗体993620可以阻断rhVISTA诱导的对T细胞增殖的抑制。此外，抗人VSIG3抗体克隆993620的添加部分地恢复了CD3诱导的T细胞活化，如通过在用rhVISTA而非rhVSIG8培养的T细胞上的CD25表达所测量的(图16B，底行)。
如图16C中所示，当在rhVISTA的存在下培养细胞时，抗CD3诱导的CD4+人T细胞的增殖被抑制。尽管这种抑制不受同种型对照抗体的影响(左上方)，但通过添加VSIG3单克隆抗体973404可以部分恢复增殖(左点图)。在存在rhVISTA的情况下，CD25的表达(T细胞活化的另一种指示)受到类似的抑制，并且通过添加VSIG3抗体可以部分地逆转这一现象(右点图)。这些数据表明抗VSIG3阻断抗体可以阻断rhVISTA诱导的对T细胞增殖的抑制。
表6–使用AVEXIS测定筛选抗VSIG3抗体
Figure BDA0002612977710000511
Figure BDA0002612977710000521
本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及电子可获得的材料(包含例如，在例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，以及在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及来自在GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译)的全部公开通过引用并入本文。在本申请的公开和通过引用并入本文的任何文件的公开之间存在任何不一致的情况下，应以本申请的公开为准。前面的详细描述和示例仅仅是为了清楚理解而给出的。不应由此理解不必要的限制。本发明不限于所示出和描述的确切细节，因为对于本领域技术人员来说显而易见的变化将被包含在由实施例限定的本发明内。
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Figure IDA0002612977760000021
Figure IDA0002612977760000031
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Claims (114)

1.一种方法，其包括调节VISTA和VSIG3的相互作用，所述方法包括引入调节VISTA和VSIG3的相互作用的化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节VISTA和VSIG3的相互作用包括激动或拮抗VISTA和VSIG3的相互作用。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中调节VISTA和VSIG3的相互作用包括调节VISTA或VSIG3或两者的多聚化。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中：
VISTA在细胞的表面上表达，
VSIG3在细胞的表面上表达，或者
VISTA和VISG3都在细胞的表面上表达。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述化合物包括抗VSIG3抗体。
6.根据权利要求5所述的方法，所述抗VSIG3抗体包括：
与由表2A的克隆之一产生的抗体结合至相同的VSIG3表位的抗体；或者
由表2A的克隆之一产生的抗体。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中所述抗VSIG3抗体包括
以下中的至少一个：
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的重链可变区；或者
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的轻链可变区。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述抗VSIG3抗体包括
以下中的至少一个：
重链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的重链可变区的一个或多个互补决定区(CDR)；或者
轻链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的轻链可变区的一个或多个CDR。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中所述抗VSIG3抗体包括由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的方法，所述化合物进一步包括抗VISTA抗体。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中所述化合物包括抗原结合片段。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述化合物包括VSIG3多肽。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述化合物包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80％的序列同一性的蛋白质。
14.根据权利要求12或13中任一项所述的方法，其中所述化合物包括VSIG3的可溶性片段。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述化合物包括VSIG3的胞外区。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:2。
17.根据权利要求15或16中任一项所述的方法，其中所述化合物包括融合蛋白。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述化合物包括Fc结构域。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:3。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述化合物包括VISTA多肽。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述化合物包括与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少80％的序列同一性的蛋白质。
22.根据权利要求20或21中任一项所述的方法，其中所述化合物包括VISTA的可溶性片段。
23.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述化合物包括VISTA的胞外区。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:5。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所述化合物包括融合蛋白。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述化合物包括Fc结构域。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:6。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述化合物包括软骨寡聚基质蛋白(COMP)的卷曲螺旋结构域。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述COMP包括大鼠COMP或人COMP。
30.根据权利要求28或29中任一项所述的方法，其中所述卷曲螺旋结构域包括五聚体卷曲螺旋结构域。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述卷曲螺旋结构域被共价地连接至VSIG3多肽或VISTA多肽或两者。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述化合物包括接头结构域。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述接头结构域包括NSGGGSGGGTG(SEQ ID NO:13)或LDRNLPPLAPLGP(SEQ ID NO:14)或两者。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述化合物包括碱性磷酸酶。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述化合物包括TEV切割位点。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述化合物消除VISTA和VSIG3的结合。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述化合物消除VISTA信号传导。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述化合物消除VSIG3信号传导。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述化合物影响CD3诱导的IL-2产生、CD3诱导的干扰素-γ产生、CD3诱导的RANTES产生、CD3诱导的MIP-1α产生、CD3诱导的IL-17产生或CD3诱导的CXCL11产生或其组合。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述化合物影响T细胞增殖。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，所述方法进一步包括用治疗有效量的所述化合物治疗受试者。
42.根据权利要求41所述的方法，其中VSIG3在从所述受试者获得的生物样品中过表达。
43.一种结合至VSIG3的单克隆抗体。
44.根据权利要求43所述的抗VSIG3抗体，其中所述抗体阻断VSIG3-VISTA相互作用、VSIG3-VSIG8相互作用、VSIG3的多聚化或VISTA的多聚化或其组合。
45.根据权利要求43或44中任一项所述的抗VSIG3抗体，所述抗体包括：
与由表2A的克隆之一产生的抗体结合至相同的VSIG3表位的抗体；或者
由表2A的克隆之一产生的抗体。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的抗VSIG3抗体，其中抗VSIG3抗体包括
以下中的至少一个：
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的重链可变区；或者
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的轻链可变区。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的抗VSIG3抗体，其中抗VSIG3抗体包括
以下中的至少一个：
重链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的重链可变区的一个或多个互补决定区(CDR)；或者
轻链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的轻链可变区的一个或多个CDR。
48.根据权利要求43至47中任一项所述的抗VSIG3抗体，其中抗VSIG3抗体包括由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体。
49.一种由表2A的克隆中的一个或多个产生的单克隆抗体。
50.一种单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括
以下中的至少一个：
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的重链可变区；或者
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的轻链可变区。
51.一种单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括
以下中的至少一个：
重链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的重链可变区的一个或多个互补决定区(CDR)；或者
轻链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的轻链可变区的一个或多个CDR。
52.一种单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括：
由表2A的克隆之一产生的单克隆抗体的重链可变区的每个互补决定区(CDR)，或者
由表2A的克隆之一产生的单克隆抗体的轻链可变区的每个CDR，或者
由表2A的克隆之一产生的单克隆抗体的重链可变区的每个CDR和由表2A的克隆之一产生的单克隆抗体的轻链可变区的每个CDR。
53.一种单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括氨基酸序列，所述氨基酸序列：
与由表2A的克隆产生的单克隆抗体的重链可变区的一个或多个互补决定区(CDR)至少80％相同；或者
与由表2A的克隆产生的单克隆抗体的轻链可变区的一个或多个CDR至少80％相同，或者
与由表2A的克隆产生的单克隆抗体的重链可变区的一个或多个CDR至少80％相同，并且与由表2A的克隆产生的单克隆抗体的轻链可变区的一个或多个CDR至少80％相同。
54.根据权利要求49至53中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体与VSIG3结合。
55.根据权利要求49至54中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括IgG抗体。
56.根据权利要求49至55中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体消除VSIG3与VSIG3配体的结合。
57.根据权利要求49至56中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体消除VSIG3与VISTA的结合。
58.根据权利要求49至57中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括抗原结合片段，所述抗原结合片段包括Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段或Fv片段或其组合。
59.一种组合物，其包括根据权利要求43至58中任一项所述的单克隆抗体或抗VSIG3抗体。
60.一种试剂盒，其包括根据权利要求43至58中任一项所述的单克隆抗体或抗VSIG3抗体。
61.一种调节VISTA和VSIG3的相互作用的化合物。
62.根据权利要求61所述的化合物，其包括抗VSIG3抗体。
63.根据权利要求62所述的化合物，其中所述抗VSIG3抗体包括：
与由表2A的克隆之一产生的抗体结合至相同的VSIG3表位的抗体；或者
由表2A的克隆之一产生的抗体。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的化合物，其中抗VSIG3抗体包括
以下中的至少一个：
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的重链可变区；或者
由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体的轻链可变区。
65.根据权利要求61至64中任一项所述的化合物，其中抗VSIG3抗体包括
以下中的至少一个：
重链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的重链可变区的一个或多个互补决定区(CDR)；或者
轻链可变区，其包括由表2A的克隆之一产生的抗体的轻链可变区的一个或多个CDR。
66.根据权利要求61至65中任一项所述的化合物，其中抗VSIG3抗体包括由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体。
67.根据权利要求62至66中任一项所述的化合物，其中所述化合物包括抗原结合片段。
68.根据权利要求61至67中任一项所述的化合物，其中所述化合物消除VISTA和VSIG3的结合。
69.根据权利要求61至68中任一项所述的化合物，其中所述化合物调节VSIG3的多聚化。
70.根据权利要求61至69中任一项所述的化合物，其中所述化合物消除VISTA信号传导。
71.根据权利要求61至70中任一项所述的化合物，其中所述化合物消除VSIG3信号传导。
72.根据权利要求61至71中任一项所述的化合物，其中所述化合物影响CD3诱导的IL-2产生、CD3诱导的干扰素-γ产生、CD3诱导的RANTES产生、CD3诱导的MIP-1α产生、CD3诱导的IL-17产生或CD3诱导的CXCL11产生或其组合。
73.根据权利要求61至72中任一项所述的化合物，其中所述化合物影响T细胞增殖。
74.根据权利要求61至73中任一项所述的化合物，其中所述化合物包括VSIG3多肽。
75.根据权利要求74所述的化合物，其中所述化合物包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80％的序列同一性的蛋白质。
76.根据权利要求74或75所述的化合物，其中所述化合物包括VSIG3的可溶性片段。
77.根据权利要求74至76中任一项所述的化合物，其中所述化合物包括VSIG3的胞外区。
78.根据权利要求77所述的化合物，其中所述化合物包括SEQ ID NO:2。
79.根据权利要求77至78中任一项所述的化合物，其中所述化合物包括融合蛋白。
80.根据权利要求74至79中任一项所述的化合物，其中所述化合物包括Fc结构域。
81.根据权利要求80所述的化合物，其中所述化合物包括SEQ ID NO:3。
82.根据权利要求61至81中任一项所述的化合物，其中所述化合物包括VISTA多肽。
83.根据权利要求82所述的化合物，其中所述化合物包括与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的蛋白质。
84.根据权利要求82或83所述的化合物，其中所述化合物包括VISTA的可溶性片段。
85.根据权利要求82至84中任一项所述的化合物，其中所述化合物包括VISTA的胞外区。
86.根据权利要求85所述的化合物，其中所述化合物包括SEQ ID NO:5。
87.根据权利要求61至86中任一项所述的化合物，其中所述化合物包括融合蛋白。
88.根据权利要求61至87中任一项所述的化合物，其中所述化合物包括Fc结构域。
89.根据权利要求88所述的化合物，其中所述化合物包括SEQ ID NO:6。
90.根据权利要求61至89中任一项所述的化合物，所述化合物包括软骨寡聚基质蛋白(COMP)的卷曲螺旋结构域。
91.根据权利要求90所述的化合物，其中所述COMP是大鼠COMP或人COMP。
92.根据权利要求90或91所述的化合物，其中所述卷曲螺旋结构域是五聚体卷曲螺旋结构域。
93.根据权利要求90至92中任一项所述的化合物，其中所述卷曲螺旋结构域共价地连接至VSIG3多肽或VISTA多肽或两者。
94.根据权利要求93所述的化合物，其中所述化合物包括接头结构域。
95.根据权利要求94所述的化合物，其中所述接头结构域包括NSGGGSGGGTG(SEQ IDNO:13)或LDRNLPPLAPLGP(SEQ ID NO:14)或两者。
96.根据权利要求90至95中任一项所述的化合物，其中所述化合物包括碱性磷酸酶。
97.根据权利要求90至96中任一项所述的化合物，其中所述化合物包括TEV切割位点。
98.根据权利要求61至97中任一项所述的化合物，其中所述化合物消除VISTA和VSIG3的结合。
99.一种组合物，其包括根据权利要求61至98中任一项所述的化合物。
100.一种试剂盒，其包括根据权利要求61至98中任一项所述的化合物。
101.一种方法，其包括用治疗有效量的根据权利要求61至98中任一项所述的化合物治疗受试者。
102.根据权利要求101所述的方法，其中VSIG3在从所述受试者获得的生物样品中过表达。
103.一种包括两种或更多种抗VSIG3抗体的组合物，其中至少一种抗VSIG3抗体包括由表2A的克隆产生的抗体。
104.根据权利要求103所述的组合物，其中每个抗VSIG3抗体阻断VSIG3-VISTA相互作用、VSIG3-VISTA8相互作用、VSIG3的多聚化和VISTA的多聚化中的一种或多种。
105.根据权利要求103或104中任一项所述的组合物，其中所述两种或更多种抗VSIG3抗体结合至不同的表位。
106.根据权利要求103至105中任一项所述的组合物，其中所述抗VSIG3抗体中的至少一种与VSIG3的ABEIg面相互作用。
107.根据权利要求103至106中任一项所述的组合物，其中所述抗VSIG3抗体中的至少一种与VSIG3的GFCIg面相互作用。
108.一种包括抗VSIG3抗体和抗VISTA抗体的组合物，其中所述组合物阻断VSIG3-VISTA相互作用、VSIG3-VISTA8相互作用、VSIG3的多聚化或VISTA的多聚化或其组合；并且其中所述抗VSIG3抗体包括由表2A的克隆中的一个或多个产生的抗体。
109.一种组合物，其包括多聚化的VSIG3、多聚化的VISTA或多聚化的VSIG8或其组合。
110.一种通过用免疫原免疫产生的多克隆抗体，其中所述免疫原包括多肽，所述多肽包括表3A中描述的多肽中的一种或多种。
111.一种通过用免疫原免疫产生的多克隆抗体，其中所述免疫原包括多肽，所述多肽由表3A中描述的多肽中的一种或多种组成。
112.一种通过用免疫原免疫产生的多克隆抗体，其中所述免疫原包括多肽，所述多肽由表3A中描述的多肽组成。
113.一种通过用多肽免疫产生的多克隆抗体，所述多肽由表3A中描述的肽组成。
114.根据权利要求110至113中任一项所述的多克隆抗体，其中所述多克隆抗体结合VSIG3。
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