CN117683836A - 用于修饰微囊藻毒素和节球藻毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种产生修饰的非核糖体肽(例如修饰的微囊藻毒素和/或修饰的节球藻毒素,一起为CA)的方法,所述方法包括以下步骤:a)在培养基中生长产生修饰的非核糖体肽的蓝细菌菌株,b)向所述培养物添加一种或多种修饰的底物,优选地修饰的氨基酸,和c)在存在所述修饰的底物的情况下接种所述产生非核糖体肽的菌株。如此修饰的非核糖体肽可用于治疗各种疾病。
Description
发明领域
本发明属于癌症治疗领域。其属于用于癌症治疗的毒素领域。其属于来自蓝细菌的非核糖体肽(以微囊藻毒素、节球藻毒素以及anabeopepteptins、oscillamides为例)及其在治疗疾病(比如癌症、血栓形成、代谢性疾病)以及其他应用中的用途的领域。本发明一般涉及微生物学、分子生物学、药学和生物技术领域,并且更具体地讲涉及修饰的非核糖体肽(包括微囊藻毒素和节球藻毒素)的合成。本发明也属于酶抑制工具(包括磷酸酶、蛋白酶和肽酶抑制生化工具)的领域。
背景
微囊藻毒素为由蓝细菌(也称为蓝绿藻)天然产生的毒素。当过多的蓝细菌在湖泊或池塘中生长时,它们形成藻华,藻华通常表现为一层绿色浮渣。然而,并非湖上所有的绿色浮渣均为藻华,也不是所有的藻华均含有产生微囊藻毒素的蓝细菌种类。微囊藻毒素同类物很多,微囊藻毒素-LR为其中毒性更强且经过充分研究的同类物之一。微囊藻毒素为由许多蓝细菌属产生的一组环状七肽肝毒素。其中最著名和同名的为广泛的微囊藻属。在结构上,大多数微囊藻毒素由一般结构环(-D-Ala1-X2-D-MeAsp3-Y4-Adda5-D-Glu6-Mdha7-)组成。X和Y为可变L-氨基酸,D-MeAsp为D-赤型-β-甲基天冬氨酸和Mdha为N-甲基脱氢丙氨酸。然而,尽管X和Y为最可变的氨基酸,但在微囊藻毒素核心结构的所有位置均可发现变化(见图1)。Adda为蓝细菌独特的C20-β-氨基酸3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-癸-4,6-二烯酸。2和4位可变L-氨基酸的取代以及在其他组成氨基酸中较不经常发现的改变导致迄今为止100多种报道的天然微囊藻毒素。
微囊藻毒素为1型和2A型蛋白磷酸酶的有效抑制剂。例如,微囊藻毒素-LR对于1型和2A型蛋白磷酸酶的IC50分别为0.03nM和0.0nM。
蛋白磷酸酶1和2A为真核细胞中两种主要的磷酸酶,可将丝氨酸和苏氨酸残基去磷酸化。
蛋白磷酸酶2B被有效抑制1000倍,而6种其他测试的磷酸酶和8种测试的蛋白激酶不受影响。
节球藻毒素为与微囊藻毒素结构相关的化合物,因为它们是从微囊藻毒素起源进化而来的,并且还含有在微囊藻毒素中发现的氨基酸Adda。它们尤其是由节球藻属物种产生,并且与微囊藻毒素形成对比,它们为环状五肽,具有最常见的同类物环[-D-赤型-甲基Asp-L-Arg-Adda-D-Glu-Mdhb],其中Mdhb为N-甲基脱氢丁酸(见图1)。
微囊藻毒素和节球藻毒素可用作癌症药物。假设可分离出天然微囊藻毒素变体,它们相对于OATP1B1优先由OATP1B3型主动转运蛋白转运,以发展为具有临床上可耐受的肝毒性的抗癌剂(OATP1B3转运蛋白主要存在于癌组织,例如肝癌中)。已分离出微囊藻毒素变体,并测试了在用OATP1B1和OATP1B3转运蛋白稳定转染的癌细胞中的细胞毒性。发现了细胞毒性OATP1B1/OATP1B3 IC50比率在0.2-32之间范围(代表转运蛋白选择性的150倍范围)的微囊藻毒素变体。由于微囊藻毒素结构对转运蛋白的选择性具有显著影响,因此有可能开发出具有甚至更明显的OATP1B3选择性的类似物,从而使其能够开发成为抗癌药物。然而,更特异性的递送方法将为优选的。一种这样的方法涉及本文公开的新颖概念,即添加靶向部分。对于避免脱靶毒性的靶向和高度特异性癌症疗法而言,理想的是微囊藻毒素和节球藻毒素的结构变体将带有靶向部分(例如癌症特异性单克隆抗体),并且不是由所有OATP转运蛋白亚型转运或转运不良,或者仅由或主要由癌症特异性OATP 1B3亚型转运。
作为微囊藻毒素的不同结构变体之间转运效率差异的一个实例,我们参考下表。
表:所选微囊藻毒素在表达OATP的HeLa和RKO细胞的模型中的效力和选择性。
MC毒性取决于对PP1和2A的活性,而且还取决于由OATP介导的主动和选择性摄取。
微囊藻毒素难以化学合成。一种获得微囊藻毒素的较便利的方法涉及通过蓝细菌体内产生微囊藻毒素。
学院团体的先前实验旨在通过供给在由所供给菌株合成的相应微囊藻毒素的至少一种结构变体中掺入的氨基酸来增加天然产生的非核糖体肽(此处为微囊藻毒素)的产物产量。更具体地讲,将氨基酸亮氨酸(L,Leu)或精氨酸(R,Arg)供给产生微囊藻毒素(MC)变体MC-LR和MC-RR(L代表亮氨酸,R代表精氨酸)的蓝细菌菌株取决于所供给的氨基酸而影响两种变体的产量。此外,供给在由所供给菌株合成的相应微囊藻毒素的至少一种结构变体中掺入的氨基酸也可影响生物量的产生。
另外,还已经表明,供给代表天然掺入由所供给菌株产生的相应非核糖体肽中的氨基酸的略微修饰形式的氨基酸,也可掺入相应非核糖体肽中。该方法通常称为突变合成。然而,对于蓝细菌非核糖体肽,迄今为止,该方法仅限于天然氨基酸的简单类似物,比如高酪氨酸代替酪氨酸(仅相差一个亚甲基)或卤化氨基酸(仅相差一个卤素原子)比如氯酪氨酸代替酪氨酸。迄今为止尚未报道经较广泛修饰的氨基酸或与天然掺入非核糖体肽中的氨基酸不同的氨基酸及其类似物的供给。此外,在文献中已经描述了不可能供给修饰的氨基酸以掺入微囊藻毒素。
需要来自蓝细菌的修饰的非核糖体肽,包括来自蓝细菌的修饰的细胞毒素,例如修饰的微囊藻毒素(例如与基于微囊藻毒素的癌症先导化合物的优化有关)。需要产生非核糖体肽(像微囊藻毒素)以及将微囊藻毒素偶联至靶向单元的方法(例如与用于癌症、感染性疾病、血栓形成的靶向疗法和其他种类的靶向疗法的抗体-药物缀合物的构建有关)。
发明概述
通过将一种或多种修饰的底物掺入这些非核糖体肽中产生修饰的非核糖体肽(例如微囊藻毒素、节球藻毒素、anabaenopeptins、oscillamides等)来解决该问题。
本发明涉及一种从蓝细菌产生修饰的非核糖体肽(例如修饰的微囊藻毒素和/或修饰的节球藻毒素,一起为细胞毒性剂,CA)的方法,所述方法包括以下步骤:
a)在培养基中生长产生非核糖体肽的蓝细菌菌株,
b)向所述培养物添加一种或多种修饰的底物,优选地修饰的氨基酸,和
c)在存在所述修饰的底物的情况下培养菌株。
本发明涉及包含至少一种修饰的氨基酸的修饰的非核糖体肽,其中至少一种修饰的氨基酸包含直接可及或可化学转化以用于缀合化学(包括点击化学)的锚定基团,用于连接靶向部分和/或标记和/或用于另外的结构修饰。
定义
在本文中,非核糖体肽为一类由非核糖体肽合成酶合成的肽次级代谢产物,所述合成酶与核糖体不同,不依赖于信使RNA。每种非核糖体肽合成酶只能合成一种类型的肽。非核糖体肽通常具有环状和/或分支结构,可含有非蛋白氨基酸(包括D-氨基酸)、带有修饰像N-甲基和N-甲酰基,或者被糖基化、酰化、卤化或羟基化。经常针对肽“主链”进行氨基酸的环化,产生噁唑啉和噻唑啉;这些可被进一步氧化或还原。有时,对丝氨酸进行脱水,产生脱氢丙氨酸。这只是非核糖体肽可进行的各种操作和变化的示例。非核糖体肽通常为链接在一起或环化或者甚至分支而成的相同序列的二聚体或三聚体。非核糖体肽为非常多样化的天然产物家族,具有极其广泛的生物学活性和药理学特性。它们通常为毒素、铁载体或颜料。非核糖体肽抗生素、细胞抑制剂和免疫抑制剂已投入商业使用。
与来自其他微生物生产者的非核糖体肽形成对比,蓝细菌非核糖体肽具有在一类非核糖体肽中的数量异常多的结构变体(见表)。此外,许多蓝细菌产生非核糖体肽和聚酮化合物的杂合结构。因此,用于非核糖体肽和聚酮化合物的那些杂合结构的多酶复合物也由非核糖体肽合成酶部分和聚酮化合物合酶部分构建。在本文中,非核糖体肽也可为非核糖体肽和聚酮化合物的杂合体(例如微囊藻毒素的化合物类别)。
表:所选类别的蓝细菌非核糖体肽(同义词是指原始出版物中的名称):变体的数量反映2005年初已知同类物的结构变化性(隐藻素数量来自2017年)。总体而言,当今的天然存在的蓝细菌非核糖体肽的变体数量明显更高。
表:天然存在的隐藻素
在本文中,本发明的微囊藻毒素具有D-Ala1-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-D-Glu6-Mdha7的一般结构,其中结构变化原则上可发生在所有位置,但最常发生在X和Z处(见图1)。这些为可变L-氨基酸。D-MeAsp为D-赤型-b-甲基天冬氨酸,Mdha为N-甲基脱氢丙氨酸和Adda为3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基癸-4,6-二烯酸。如图1所示,3和/或7位的脱甲基化和6位的甲基化以及1、5和7位的进一步修饰也在本发明的范围内。
在本文中,我们证明了2和4位的可变L-氨基酸(X和Z)和其他D-氨基酸的修饰的多种组合。
在本文中,节球藻毒素为由环[-D-赤型-甲基Asp(异键)-L-Arg-Adda-D-Glu(异键)-Mdhb]组成的单环五肽,其中Mdhb代表N-甲基脱氢丁酸和Adda为特定的C20-氨基酸:3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基癸-4,6-二烯酸,而所有位置均可天然略微修饰,如图1所示。节球藻毒素在结构和生物学活性方面非常类似于微囊藻毒素。
微囊藻毒素和节球藻毒素的修饰不应发生于Adda和D-Glu的位置处,因为这两个位置对于针对PP1和PP2A的抑制活性至关重要。
在本文中,微囊藻毒素和节球藻毒素以及来自蓝细菌的其他细胞毒性非核糖体肽(以所有其修饰变化形式)称为细胞毒性剂或CA(参见表格,具有来自蓝细菌的所选细胞毒性非核糖体肽)。
表:来自蓝细菌的通常具有新作用方式的所选细胞毒性非核糖体肽。
在本文中,将产生CA的蓝细菌菌株称为CA-STRAIN。
在本文中,anabaenopeptin和oscillamide为环状肽,其特征为5位赖氨酸和通过Lys与6位氨基酸的羧基之间的N-6肽键形成环。一个氨基酸单元的侧链通过Lys的α-N与侧链氨基酸的α-N之间形成的脲基键连接至环。环中的所有其他位置和侧链均可变。
在本文中,靶向部分为蛋白质(主要是抗体及其片段)、肽、核酸(适体)、小分子或其他(维生素或碳水化合物)以及纳米颗粒。优选的是单克隆抗体(mAb)作为护航分子,用于靶向递送经改变和修饰的非核糖体肽,包括经改变和修饰的微囊藻毒素或节球藻毒素。然而,小分子也可充当靶向部分,因为它们可能影响所述肽的物理化学性质。对此的一个实例为与亲水性部分比如糖类偶联,以例如增加所述肽的水中溶解度。此外,连接的小分子可具有改变肽的体内药代动力学特性的目的,例如连接易于体内代谢的官能团可增加肝清除率和降低肝毒性,或者可影响转运蛋白的选择性,从而影响细胞对修饰的非核糖体肽的(主动)摄取。
在本文中,ADC(ADC代表抗体-药物缀合物)为直接或经接头(L)连接至靶向部分(TM)的CA,而根据ADC的定义,靶向部分为抗体。
本文中的术语抗体(AB)以最广义使用,并且具体地讲涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段,只要它们呈现出期望的生物学活性即可。抗体可为鼠、人、人源化、嵌合的或衍生自其他物种。抗体为由免疫系统产生的能够识别并与特定抗原结合的蛋白。靶抗原通常具有被多种抗体上的互补决定区(CDR)识别的众多结合位点,也称为表位。与不同表位特异性结合的每种抗体具有不同的结构。因此,一种抗原可具有一种以上相应的抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分,即含有免疫特异性地结合目标靶标的抗原或其部分的抗原结合位点的分子,这种靶标包括(但不限于)癌细胞、微生物细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫抗体的细胞。免疫球蛋白可属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。免疫球蛋白可源自任何物种,包括人、鼠或兔来源。
抗体片段(AB片段)包含全长抗体的一部分,通常为其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段;双功能抗体;线性抗体;由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(anti-Id)抗体、CDR(互补决定区)和以上任一项的表位结合片段(其与癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原免疫特异性结合)、单链抗体分子;由抗体片段形成的多特异性抗体。
接头通过共价键将抗体或AB片段或靶向部分或标记连接于CA。接头为双功能或多功能部分,其可用于连接一个或多个药物部分(D,而D=CA)和抗体单元(Ab)以形成抗体-药物缀合物(ADC)。接头(L)在细胞外侧(即胞外)可为稳定的,或者其可通过酶活性、水解或其他代谢条件进行切割。抗体-药物缀合物(ADC)可使用具有用于与药物部分(在此为CA)和抗体结合的反应性官能团的接头便利地制备。在本文中,ADC为连接于靶向部分的CA。接头还可包括间隔子,其可具有在接头、药物和靶向部分之间获得有利空间距离的优势。
如下所述的抗体(AB)的半胱氨酸硫醇、胺例如N-末端或氨基酸侧链(比如赖氨酸)或任何其他修饰可与接头试剂、药物部分(D)或药物-接头试剂(DL)的官能团形成键。接头优选地在细胞外为稳定的。在转运或递送至细胞中之前,抗体-药物缀合物(ADC)优选地为稳定的并保持完整,即抗体保持与药物部分连接。接头在靶细胞外为稳定的,并且可在细胞内以一定速率切割。有效的接头将:(i)维持抗体的特异性结合特性;(ii)使得缀合物或药物部分能够细胞内递送;(iii)保持稳定和完整,即不被切割,直至缀合物已被递送或转运至其靶部位;和(iv)维持CA的细胞毒性、细胞杀伤作用或细胞抑制作用。ADC的稳定性可通过标准分析技术(比如质谱、HPLC和分离/分析技术LC/MS)进行测量。抗体和CA的共价连接需要接头具有两个反应性官能团,即反应性意义上的二价。已知可用于连接两个或更多个功能或生物活性部分(比如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原和报告基团)的二价接头试剂。
在另一个实施方案中,接头可被磺酸酯取代基或其他可增加试剂水溶性和促进接头试剂与抗体或CA的偶联反应、或者促进AB-L与D或D-L与AB的偶联反应的取代基取代,这取决于用于制备ADC的合成路线。抗体上的亲核基团包括(但不限于):(i)N-末端胺基,(ii)侧链胺基,例如赖氨酸,(iii)侧链硫醇基,例如半胱氨酸,和(iv)在抗体被糖基化时的糖羟基或氨基。胺、硫醇和羟基为亲核性的,并且能够与接头部分、接头试剂和CA(=D)上的亲电子基团反应形成共价键,所述亲电子基团包括:(i)活性酯,比如NHS酯、HOBt酯、卤甲酸酯和酰卤;(ii)烷基和苄基卤化物,比如卤乙酰胺;(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键,即半胱氨酸桥。通过用还原剂比如DTT(二硫苏糖醇)处理,可使抗体具有与接头试剂缀合的反应性。因此,每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。通过赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut试剂)的反应导致胺转化为硫醇,可将另外的亲核基团引入到抗体中。可通过引入1、2、3、4或更多个半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体),将反应性硫醇基团引入到抗体(或其片段)中。US2007/0092940通过引入反应性半胱氨酸氨基酸来工程化抗体。
修饰的底物意指任何氨基酸和任何带有至少一个氨基和一个羧基的相关化合物,其使得在相应的非核糖体肽中肽结合形成修饰的底物,并且其天然不掺入由特定蓝细菌菌株合成的非核糖体肽中。
修饰的氨基酸或修饰的底物可包含氨基酸接头组分(包括天然存在的那些)以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物(比如瓜氨酸)。可设计氨基酸接头组分并对其通过特定酶例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶的酶促切割的选择性进行优化。氨基酸侧链包括天然存在的那些以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物(比如瓜氨酸)。
发明详述
本发明涉及一种产生修饰的非核糖体肽,尤其是细胞毒性的非核糖体肽,比如修饰的微囊藻毒素和/或修饰的节球藻毒素(两者均为CA)的方法,所述方法包括以下步骤:
a)在培养基中生长产生微囊藻毒素和/或节球藻毒素的蓝细菌菌株(CA-STRAIN),
b)向所述培养物中添加一种或多种修饰的底物,优选地修饰的氨基酸,和
c)在存在所述修饰的底物的情况下培养菌株。
本发明涉及一种从蓝细菌产生修饰的非核糖体肽的方法,所述方法包括以下步骤:
a)在培养基中生长产生非核糖体肽的蓝细菌菌株,
b)向所述培养物添加一种或多种修饰的底物,和
c)在存在所述修饰的底物的情况下生长菌株,
d)其中修饰的底物为
i)修饰的氨基酸,其包含直接可及或可转化以用于缀合化学(包括点击化学)的锚定基团,用于连接靶向部分或标记或接头或用于任何其他的结构修饰,
ii)或者,非核糖体肽中的修饰的底物为不直接衍生自天然掺入的底物的修饰的底物,比如优选地氨基酸或修饰的氨基酸,其在自然中未掺入所述非核糖体肽的特定位置,并且也不是用官能团取代天然掺入的底物,所述官能团不直接可及或可转化以用于缀合化学,包括点击化学,用于连接靶向部分或标记。
在第一种选择中,修饰的底物带有直接可及或可转化以用于缀合化学(包括点击化学)的锚定基团,用于连接靶向部分或标记或接头或用于非核糖体肽的任何其他结构修饰。例如,这将使得能够将抗体连接于CA。
在第二种选择中,修饰的底物使得能够产生新的CA,其中CA在CA中于其中在自然中不存在氨基酸并且也不是天然掺入的底物被不直接可及或可转化以用于缀合化学的官能团取代的位置带有这种氨基酸。氨基酸可被修饰。这使得能够创建具有新颖结构的CA的大型化合物文库。
以下图A以通过供给带有可点击叠氮基作为锚定基团的修饰的底物4-叠氮基-L-苯丙氨酸(图左侧)或通过供给带有可点击炔丙基(也称为炔基)作为锚定基团的修饰的底物O-炔丙基-L-酪氨酸(图左侧)产生修饰的微囊藻毒素YR(MC-YR)为例,说明本发明的一般原理。具有其相应的可点击锚定基团的两种底物均导致2位酪氨酸的替换(参见上部化学结构中的箭头)。在供给4-叠氮基-L-苯丙氨酸的情况下,所得修饰的微囊藻毒素为MC-4-叠氮基-FR(F代表L-苯丙氨酸;R代表精氨酸)。在供给O-炔丙基-L-酪氨酸的情况下,所得修饰的微囊藻毒素为MC-O-炔丙基-YR(Y代表酪氨酸;R代表精氨酸)。两种修饰的微囊藻毒素的产生均可通过使用质谱(MS)基于其分子量进行检测。
图A:供给修饰的底物的一般原理,所述修饰的底物包含直接可及或可转化以用于缀合化学(包括点击化学)的锚定基团,用于连接靶向部分或标记或小有机分子或接头或任何其他结构修饰。
上述两种修饰的微囊藻毒素的两种锚定基团(叠氮基和炔丙基,也称为炔基)可直接用于缀合化学,更特别用于点击化学。特此,相应的点击反应基于这两种基团彼此之间的反应。这意味着叠氮基与炔丙基(炔基)反应形成三唑缀合物,如以下图B所示。因此,叠氮基和炔丙基(炔)这两种基团均可用作修饰的底物的锚定基团。
图B:炔修饰的接头与叠氮化物修饰的毒素之间形成三唑缀合物的点击化学反应的图示。这两种基团代表直接可及或可转化以用于点击化学的潜在锚定基团,用于连接靶向部分或标记或接头或用于任何其他结构修饰。
用于供给修饰的底物的合适菌株的选择需要通过筛选来确定(用大量的多种修饰的底物的供给实验,包括针对大量菌株的菌株特异性培养条件的使用和变化)。为了确保生产量和效率,优选地以小规模培养物(例如以1.6ml-10ml规模)进行这种筛选。另外,修饰的非核糖体肽的检测优选地通过质谱(MS)进行,而MS法优选地适合于小规模培养物的分析而无需广泛提取和样品制备,例如MALDI-ToF-MS(见图2)。
在建立可供给修饰的底物以产生新颖非核糖体肽的菌株筛选的背景下,发明人发现,将O-甲基-酪氨酸和高精氨酸同时供给产生MC-YR和MC-LR(Y-代表酪氨酸;R-代表精氨酸;L代表亮氨酸)的菌株,导致掺入O-甲基酪氨酸代替酪氨酸和掺入高精氨酸代替精氨酸。因此,通过供给这两种修饰的氨基酸,所供给的菌株另外产生了MC-Y-homo-R、MC-O-甲基-YR、MC-O-甲基-Y-homo-R和MC-L-homo-R(见图2)。
此外,理想地基于由特定菌株天然产生的非核糖体肽(例如天然产生的微囊藻毒素和节球藻毒素)来选择合适的用于供给的底物。特此,不仅可选择直接衍生自天然底物的底物。
菌株可能产生几种在非核糖体肽的特定位置处具有不同氨基酸的结构变体的事实显著增加合适底物的数量。如果菌株天然产生在特定位置具有结构疏远的氨基酸的变体,则这一点更为重要,例如微囊藻属菌株CBT 480(可获自Simris Biologics GmbH,Berlin,Germany)主要以类似量产生MC-LR和MC-YR作为主要微囊藻毒素(除了以少量产生其他结构变体之外),尽管疏水性脂肪族氨基酸亮氨酸(L)在结构上与芳香族氨基酸酪氨酸(Y)相当疏远。
有趣的是,通过所述菌株微囊藻属CBT 480的基因组测序,发明人发现尽管该菌株合成了两种主要微囊藻毒素变体MC-LR和MC-YR,但在所述微囊藻属菌株CBT480的基因组中仅编码了一个微囊藻毒素合成酶基因簇。随后与来自主要产生MC-LR的微囊藻属菌株CBT265(也称为PCC7806,可获自The Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria“PCC”,Institut Pasteur,Paris,France)的另一个微囊藻毒素合成酶基因簇的DNA序列比较未发现明显的序列差异,这可解释由两种菌株产生的微囊藻毒素变体丰度的差异(见图3)。这导致发明人得出这样的结论,即通过供给修饰的底物而成为用于产生修饰的非核糖体肽的合适菌株的特征不仅仅与由相应的基因簇编码的非核糖体肽合成酶的多酶复合物相关。更合适的说,此为一种菌株特异性的特征,需要在使用菌株特异性条件培养大量菌株,向菌株供给大量修饰的底物和通过质谱(MS)分析被供给菌株的所得次级代谢产物谱(见图2)的方法中进行筛选。
因此,发明人得出结论,优选地,通过培养/供给/化学分析筛选来选择菌株,并且所产生的非核糖体肽的化学结构为已知,使得可选择合适的修饰的底物,并且在确定的位置发生将修饰的底物在培养期间掺入非核糖体肽中。
优选的蓝细菌菌株可属于多种合适的属,包括(但不限于)以下属,包括微囊藻属(Microcystis)、浮丝藻属(Planktothrix)、颤藻属(Oscillatoria)、念珠藻属(Nostoc)、鱼腥藻属(Anabaena)、束丝藻属(Aphanizomenon)、软管藻属(Hapalosiphon)、节球藻属(Nodularia)、鞘丝藻属(Lyngbya)、席藻属(Phormidium)、螺旋藻属(Spirulina)、盐螺旋藻属(Halospirulina)、节旋藻属(Arthrospira)、束毛藻属(Trichodesmium)、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)、织线藻属(Plectonema)、粘囊藻属(Myxosarcina)、宽球藻属(Pleurocapsa)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、盖丝藻属(Geitlerinema)、Euhalothece、眉藻属(Calothrix)、单歧藻属(Tolypothrix)、伪枝藻属(Scytonema)、费氏藻属(Fischerella)、鞭枝藻属(Mastigocladus)、拟惠氏藻属(Westiellopsis)、真枝藻属(Stigonema)、拟绿胶蓝细菌属(Chlorogloeopsis)、蓝螺藻属(Cyanospira)、筒胞藻属(Cylindrospermopsis)、柱孢藻属(Cylindrospermum)、微毛藻属(Microchaete)、胶须藻属(Rivularia)、Autosira、毛线属(Trichonema)、束毛藻属(Trichodesmium)、束藻属(Symploca)、斯塔尔氏蓝细菌属(Starria)、原绿丝蓝细菌属(Prochlorothrix)、微鞘藻属(Microcoleus)、湖丝藻属(Limnothrix)、发毛针藻属(Crinalium)、博氏藻属(Borzia)、拟甲色球藻属(Chroococcidiopsis)、蓝囊胞菌属(Cyanocystis)、小皮果蓝细菌属(Dermocarpella)、Staniera、异球蓝细菌属(Xenococcus)、管孢藻属(Chamaesiphon)、色球藻属(Chroococcus)、蓝细菌属(Cyanobacterium)、蓝菌属(Cyanobium)、蓝丝菌属(Cyanothece)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、粘杆菌属(Gloeobacter)、黏球藻属(Gloeocapsa)、粘杆藻属(Gloeothece)。此处所述方法所用菌株的唯一前提条件为通过相应的菌株合成至少一种非核糖体肽。
优选地,由蓝细菌菌株产生的非核糖体肽可为多种CA,包括(但不限于)细胞毒性的非核糖体肽,其包括微囊藻毒素、节球藻毒素、隐藻素(cryptophycins)、largarzoles、阿普拉毒素(Apratoxin)、hectochlorines、aurilides、bisebromoamides、grassypeptolides、carmaphycins、symplocamides、lagunamides、coibamides、脱甲氧基巨鞘丝藻酰胺(Desmethoxy majusculamides)、curacins,或者其可为具有另一种生物活性的非核糖体肽,包括(但不限于)生物活性的非核糖体肽,其包括铜绿菌素(aeruginosins)(别名:小菌素(microcin)、spumiginin)、microginins(别名:cyanostatin、oscillaginin、nostoginin)、anabaenopeptins(oscillamide、ferintoic acid、nodulapeptin、plectamide、schizopeptin)、cyanopaptolins(别名:aeruginopeptin、anabaenopeptilide、海兔毒素(dolastatin)、hofmannoline、microcystillide、micropeptin、nostocyclin、nostopeptin、oscillapeptilide、oscillapeptin、planctopeptin、scyptolin、somamide、symplostatin、tasipeptin)、环酰胺类(cyclamides)(别名:aanyascyclamide、dendroamide、microcyclamide、nostocyclamide,raocyclamide、tenuecycyclamide、ulongamide、westiellamide)。该列表中的术语是指原始出版物中的名称。
优选地,修饰的底物为修饰的氨基酸。优选地,修饰的底物使得能够进行缀合化学(包括点击化学)。
修饰的底物使得能够将各种各样的官能团置于非核糖体肽,例如CA中,用于与标记或靶向部分等偶联。
优选地,其使得能够进行缀合化学(包括点击化学),而缀合化学的特征在于能够将两个具有可彼此反应的官能团的分子结合在一起的所有化学反应,而点击化学的特征在于具有高热力学驱动力的化学反应,这快速且不可逆地将它驱动到高产率的单一反应产物,并具有高反应特异性(在一些情况下具有区域和立体特异性两者),产生最少且无害的副产物。点击反应不受水干扰。这些品质使点击反应(特别例如诊断应用)特别适合于在药物的不同位置有效和位点特异性偶联药物样分子的问题,并经合适的接头肽或不使用接头对单克隆抗体的不同位置用不同的点击化学,以创建用于疾病比如癌症、感染性疾病、血栓形成以及其他疾病和障碍的靶向治疗的ADC。
与常规方法相比较,在此所述的将缀合化学(包括点击化学)引入到药物样分子的方法的主要区别为基于引入的方式(通过用于预选的底物供给预选的蓝细菌菌株,及其位点特异性引入到非核糖体肽中),分别具有结构特征和不同类型的缀合和点击化学的各种各样的合适修饰底物的获得,以及由此产生的可点击药物样分子的结构多样性(见图4-30)。就此而言,在此所述的将缀合化学(包括点击化学)引入到药物样分子的方法与常规方法的不同之处还在于通过平行使用不带缀合化学(包括点击化学)的修饰的底物进一步增强药物样分子的结构优化的可能性(见图2A-D、23)。最后,在此所述的将缀合化学(包括点击化学)引入到药物样分子的方法使得能够以较大规模微生物产生结构优化的可点击非核糖体肽以进行工业生产(见图24和25)。
蓝细菌菌株可选自微囊藻属(Microcystis)、浮丝藻属(Planktothrix)、颤藻属(Oscillatoria)、念珠藻属(Nostoc)、鱼腥藻属(Anabaena)、束丝藻属(Aphanizomenon)、软管藻属(Hapalosiphon)、节球藻属(Nodularia)、鞘丝藻属(Lyngbya)、席藻属(Phormidium)、螺旋藻属(Spirulina)、盐螺旋藻属(Halospirulina)、节旋藻属(Arthrospira)、束毛藻属(Trichodesmium)、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)、织线藻属(Plectonema)、粘囊藻属(Myxosarcina)、宽球藻属(Pleurocapsa)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、盖丝藻属(Geitlerinema)、Euhalothece、眉藻属(Calothrix)、单歧藻属(Tolypothrix)、伪枝藻属(Scytonema)、费氏藻属(Fischerella)、鞭枝藻属(Mastigocladus)、拟惠氏藻属(Westiellopsis)、真枝藻属(Stigonema)、拟绿胶蓝细菌属(Chlorogloeopsis)、蓝螺藻属(Cyanospira)、筒胞藻属(Cylindrospermopsis)、柱孢藻属(Cylindrospermum)、微毛藻属(Microchaete)、胶须藻属(Rivularia)、Autosira、毛线属(Trichonema)、束毛藻属(Trichodesmium)、束藻属(Symploca)、斯塔尔氏蓝细菌属(Starria)、原绿丝蓝细菌属(Prochlorothrix)、微鞘藻属(Microcoleus)、湖丝藻属(Limnothrix)、发毛针藻属(Crinalium)、博氏藻属(Borzia)、拟甲色球藻(Chroococcidiopsis)、蓝囊胞菌属(Cyanocystis)、小皮果蓝细菌属(Dermocarpella)、Staniera、异球蓝细菌属(Xenococcus)、管孢藻属(Chamaesiphon)、色球藻属(Chroococcus)、蓝细菌属(Cyanobacterium)、蓝菌属(Cyanobium)、蓝丝菌属(Cyanothece)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、粘杆菌属(Gloeobacter)、黏球藻属(Gloeocapsa)、粘杆藻属(Gloeothece)。
发明人首次将修饰的氨基酸掺入来自蓝细菌的非核糖体肽中,所述非核糖体肽带有所谓的可点击锚定基团,使得能够快速且易于将整个分子与例如接头或其他功能单元(例如抗体)结合(见图4-10、15/16),或者所供给的底物带有对可点击锚定基团可易于进行另外修饰的官能团(见图11-18)。
显示供给可点击底物与例如在相应的非核糖体肽中天然存在的氨基酸、这些氨基酸的修饰形式或任何其他修饰的底物的任何组合可能潜在地导致将所供给的底物组合掺入非核糖体肽中(见图15-18)。
发明人首次显示成功供给的底物(例如修饰的氨基酸)在结构上不一定与天然掺入相应的非核糖体肽中的底物(例如相应的未修饰的氨基酸)直接相关(见图7/8、13/14、19-22、26)。这意味着在过去成功的供给仅被视为直接衍生自天然(自然)掺入的氨基酸的结构变体(例如o-甲基-酪氨酸或氯-酪氨酸代替酪氨酸或者高精氨酸代替精氨酸)。考虑到发明人的新结果,显而易见的是,如果还可使用结构上不是直接衍生自天然掺入相应的非核糖体肽中的底物的底物,则通过供给产生的非核糖体肽的结构和功能多样性显著增加。
本发明涉及产生修饰的非核糖体肽(优选地为修饰的CA)的方法,其中选择菌株和修饰的底物,并且所产生的非核糖体肽的化学结构为已知的,使得在确定的位置发生将修饰的底物在培养期间掺入非核糖体肽中。
优选地,如果非核糖体肽是作为微囊藻毒素的CA,在除了Adda5和DGlu6以外的任何位置掺入一种或多种修饰的底物,其具有以下一般结构:
D-Ala1-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-DGlu6-Mdha7,
并且其中X2和Z4为所述修饰的氨基酸优选掺入的位置。如果CA为节球藻毒素,在除了Adda3和DGlu4以外的任何位置掺入一种或多种修饰的底物,其具有以下一般结构:D-MeAsp1-Arg2-Adda3-DGlu4-Mdhb5。
优选地,如果非核糖体肽是作为微囊藻毒素的CA,修饰的位置为X2或Z4,并且修饰的底物为修饰的氨基酸(见图4-14)。
而且,优选地如果非核糖体肽是作为微囊藻毒素的CA,修饰的位置为X2和Z4,并且修饰的底物为修饰的氨基酸(见图15-18)。
修饰的底物(优选地为修饰的氨基酸)优选地含有直接可及或可转化以用于缀合化学(包括点击化学)的锚定基团,用于连接靶向部分或标记或用于另外的结构修饰(见图4-30)。
在本发明的方法中,可点击底物的缀合化学反应(包括点击化学反应)选自包括以下的反应:铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成、应变促进的叠氮化物-炔烃环加成、炔烃-叠氮化物环加成或炔烃-四嗪逆需求Diels-Alder反应。另外的缀合化学可选自利用伯胺、硫醇、醛、羧基和肟的特定反应性的反应。因此,至少一种修饰的底物的锚定基团,其直接可及而用于缀合化学(包括点击化学),用于连接靶向部分,可选自:
·可随后例如通过与炔烃、活化的烯烃或膦反应进行修饰的叠氮基,而细胞毒素的叠氮基与接头、抗体或其他功能性分子(比如荧光染料或聚合物基质)的相应官能团反应。
·可随后例如通过与叠氮化物反应进行修饰的炔基(例如炔丙基或二芳基应变的环辛炔),而细胞毒素的炔基与接头、抗体或其他功能性分子(比如荧光染料或聚合物基质)的相应官能团反应。
·可随后例如通过与炔烃或烯烃反应进行修饰的四嗪,而细胞毒素的四嗪基与接头、抗体或其他功能性分子(比如荧光染料或聚合物基质)的相应官能团反应。
·可随后例如通过与异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、亚氨酸酯、碳二亚胺、酸酐、膦或氟苯基酯反应进行修饰的伯胺,而细胞毒素的氨基与接头、抗体或其他功能性分子(比如荧光染料或聚合物基质)的相应官能团反应。
·可随后例如通过与马来酰亚胺、卤乙酰基、吡啶基二硫化物、硫代磺酸酯、氰基苯并噻唑或乙烯基砜反应进行修饰的硫醇,而细胞毒素的硫醇基与接头、抗体或其他功能性分子(比如荧光染料或聚合物基质)的相应官能团反应。
·可随后例如通过与胺、氨基硫醇、埃尔曼试剂、烷氧基胺、酰肼或硫醇反应进行修饰的醛,而细胞毒素的醛基与接头、抗体或其他功能性分子(比如荧光染料或聚合物基质)的相应官能团反应。
·可随后例如通过与碳二亚胺反应进行修饰的羧基,而细胞毒素的羧基与接头、抗体或其他功能性分子(比如荧光染料或聚合物基质)的相应官能团反应。
·可随后例如通过与苯乙酮(比如对乙酰基苯丙氨酸)反应进行修饰的肟,而细胞毒素的肟基与接头、抗体或其他功能性分子(比如荧光染料或聚合物基质)的相应官能团反应。
还要求保护的是引入至少一种具有直接可转化的官能团以用于缀合化学(包括点击化学),以连接靶向部分的修饰的底物。为此的一个实例为引入含有硝基的底物,其可被还原以产生伯氨基,后者如上所述可用于缀合化学(包括点击化学)。另一个实例为引入含有呋喃基的底物,其可随后例如通过与亲核试剂(比如肼)发生光化反应进行修饰,而呋喃基在活化为不饱和二羰基残基之后与靶向部分,像接头、抗体或其他功能性分子(比如荧光染料或聚合物基质)的相应亲核官能团反应(见图11-18)。
含有酪氨酸的微囊藻毒素还可使用4-苯基-3H-1,2,4-三唑啉-3,5(4H)-二酮(PTAD)进行官能化,以引入如上所述的另外缀合化学(包括点击化学)适宜的官能团。
理想地,直接可及或可转化以用于缀合化学(包括点击化学)的修饰的氨基酸选自下表(有关相应的执行实例,见图4-30和表1-4):
本发明涉及一种方法,其中产生以下微囊藻毒素之一:
D-Ala1-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-DGlu6-Mdha7,
其中
Ala1 | X2 | D-MeAsp3 | Z4 | Mdha7 |
包含至少一种修饰的底物的掺入位置,其中优选地直接可及或可转化以用于缀合(点击)化学的修饰的底物为选自以下的氨基酸:
本发明还涉及一种方法,其中产生以下节球藻毒素之一:
其中
MeAsp1 | Arg2 | Mdhb5 |
包含至少一种修饰的底物的位置,其中优选地修饰的底物为选自以下的氨基酸:
理想地,节球藻毒素在Arg2位置处被修饰。
本发明还涉及一种方法,其中产生以下anabaenopeptins之一:
位置 | 1 | 3 | 4 | 5 | 6 |
可能的氨基酸 | Tyr | Val | HTyr | MeAla | Phe |
Arg | Ile | MeHTyr | MeLeu | Tyr | |
Lys | HPhe | MeHTyr | Ile | ||
Phe | MeTyr | Leu | |||
Ile | |||||
HArg |
其中
Tyr | Phe |
包含至少一种修饰的底物的位置,其中优选地修饰的底物为选自以下的氨基酸:
本发明还涉及一种方法,其中产生以下oscillamides之一:
位置 | 1 | 3 | 4 | 5 | 6 |
可能的氨基酸 | Tyr | Met | HTyr | MeAla | Phe |
Arg | Ile | MeHTyr |
其中
Tyr | HTyr |
包含至少一种修饰的底物的位置,其中优选地修饰的底物为选自以下的氨基酸:
本发明还涉及一种方法,其中产生修饰的隐藻素,其中隐藻素1中的O-甲基-氯-酪氨酸包含至少一种修饰的底物的位置,其中优选地修饰的底物为选自以下的氨基酸:
在本发明的方法中,至少一种修饰的氨基酸包含直接可及或可转化以用于缀合化学(包括点击化学)的锚定基团,用于在修饰的氨基酸与靶向部分和/或标记之间经接头或者不含接头来连接靶向部分和/或标记。这种锚定基团以上针对修饰的底物进行了描述。
在本发明的方法中,可点击底物的缀合化学反应(包括点击化学反应)选自铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成、应变促进的叠氮化物-炔烃环加成、炔烃-叠氮化物环加成或炔烃-四嗪逆需求Diels-Alder反应。另外的缀合化学可选自利用伯胺、硫醇、醛、羧基和肟的特定反应性的反应。
然而,关于通过引入修饰的底物来修饰微囊藻毒素和节球藻毒素的CA,最优选的为微囊藻属(Microcystis)、浮丝藻属(Planktothrix)、颤藻属(Oscillatoria)、念珠藻属(Nostoc)、鱼腥藻属(Anabaena)、束丝藻属(Aphanizomenon)、软管藻属(Hapalosiphon)、节球藻属(Nodularia)。
本发明涉及修饰的非核糖体肽,包括包含至少一种修饰的氨基酸的修饰的CA化合物,其中至少一种修饰的氨基酸包含直接可及或可转化以用于缀合化学(包括点击化学)的锚定基团,用于在修饰的氨基酸与靶向部分和/或标记之间经接头或者不含接头来连接靶向部分和/或标记。
理想地,至少一种修饰的CA化合物为微囊藻毒素、节球藻毒素或隐藻素或者上表中对于蓝细菌CA列出的CA中的一种。
优选地,CA中修饰的氨基酸连接于靶向部分或标记。
关于靶向部分(TM),在一个实施方案中,ADC与由ErbB基因编码的受体特异性结合。TM可与选自EGFR、HER2、HER3和HER4的ErbB受体特异性结合。ADC可与HER2受体的细胞外结构域(ECD)特异性结合,并抑制过表达HER2受体的肿瘤细胞的生长(见图34)。ADC的抗体可为单克隆抗体,例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。人源化抗体可为huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7或huMAb4D5-8(曲妥珠单抗)。抗体可为抗体片段,例如Fab片段。
本发明的ADC可用于治疗癌症,包括(但不限于)针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。这种肿瘤相关抗原为本领域已知的,并且可使用本领域熟知的方法和信息制备用于产生抗体。为了发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶标,研究人员试图鉴定与一种或多种正常非癌细胞相比较在一种或多种特定类型的癌细胞的表面上特异性表达的跨膜或者以其它方式的肿瘤相关多肽。通常,与非癌细胞表面相比较,这种肿瘤相关多肽在癌细胞表面上更丰富地表达。这种肿瘤相关的细胞表面抗原多肽的鉴定产生了经基于抗体的靶向疗法特异性地靶向癌细胞进行破坏的能力。
TAA的实例包括(但不限于)以下列出的肿瘤相关抗原。由抗体靶向的肿瘤相关抗原包括相对于引用的参考文献中鉴定的序列具有至少约70%、80%、85%、90%或95%序列同一性,或者与具有在引用的参考文献中发现的序列的TAA呈现基本相同的生物学特性或特征的所有氨基酸序列变体和同工型。例如,具有变体序列的TAA通常能够与同具有列出的相应序列的TAA特异性结合的抗体特异性结合。本文具体列举的参考文献中的序列和公开内容明确地通过参考结合。
BMPR1B(骨形态发生蛋白受体IB型,Genbank登记号NM-001203);
E16(LAT1、SLC7A5,Genbank登记号NM-003486);
STEAP1(前列腺的六跨膜表皮抗原,Genbank登记号NM-012449);
0772P(CA125、MUC16,Genbank登记号AF361486);
MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞增强因子、间皮素,Genbank登记号NM-005823);Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质载体家族34(磷酸钠)成员2、II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b,Genbank登记号NM-006424);
Sema 5b(F1110372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、信号素5b Hlog、sema结构域、7个血小板反应蛋白重复序列(1型和1型样)、跨膜结构域(TM)和短胞质结构域、(信号素)5B,Genbank登记号AB040878);
PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA2700050C12基因,Genbank登记号AY358628);
ETBR(内皮素B型受体,Genbank登记号AY275463);
MSG783(RNF124、假定蛋白F1120315,Genbank登记号NM-017763);
STEAP2(HGNC-8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、前列腺的六跨膜表皮抗原2、六跨膜前列腺蛋白,Genbank登记号AF455138);
TrpM4(BR22450、F1120041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4,Genbank登记号NM-017636);
CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生生长因子,Genbank登记号NP-003203或NM-003212);
CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/爱泼斯坦巴尔病毒受体)或Hs.73792Genbank登记号M26004);
CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相关β)、B29,Genbank登记号NM-000626或11038674);
FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C,Genbank登记号NM-030764、AY358130);
HER2(ErbB2,Genbank登记号M11730);Coussens L.,et al Science(1985)230(4730):1132-1139);
NCA(CEACAM6,Genbank登记号M18728);Barnett T.,et al Genomics 3,59-66,1988;
MDP(DPEP1,Genbank登记号BC017023);
IL20Rα(IL20Ra、ZCYTOR7,Genbank登记号AF184971);
短小蛋白聚糖(BCAN、BEHAB,Genbank登记号AF229053);
EphB2R(DRT、ERK、HekS、EPHT3、Tyro5,Genbank登记号NM-004442);
ASLG659(B7h,Genbank登记号AX092328);US20040101899(权利要求2);
PSCA(前列腺干细胞抗原前体,Genbank登记号AJ297436);
GEDA(Genbank登记号AY260763);AAP14954脂肪瘤HMGIC融合伴侣样蛋白/pid=AAP14954.1智人(人类);
(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体、BLyS受体3、BR3,Genbank登记号AF116456);BAFF受体/pid=NP-443177.1-智人;Thompson,J.S.,et al Science 293(5537),2108-2111(2001);WO2004058309;WO2004011611;WO2003045422(实施例,第32-33页);WO2003014294(权利要求35,图6B);WO2003035846(权利要求70,第615-616页);WO200294852(Col 136-137);WO200238766(权利要求3,第133页);WO200224909(实施例3,图3);交叉参考:MIM:606269;NP-443177.1;NM-052945-1;AF132600;
CD22(B细胞受体CD22-B同工型、BL-CAM、Lyb-8、Lyb8、SIGLEC-2、FLJ22814,Genbank登记号AK026467);
CD79a(CD79A、CD79α、免疫球蛋白相关α、B细胞特异性蛋白(其与Igβ(CD79B)共价相互作用并与Ig M分子在表面上形成复合物,转导参与B细胞分化的信号));
CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1,一种G蛋白偶联受体,其由CXCL13趋化因子激活,在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥功能,在HIV-2感染中起作用以及在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的发展中可能起作用);
HLA-DOB(MHC II类分子(Ia抗原)的β亚基,其结合肽并将其呈递给CD4+T淋巴细胞);P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控的离子通道5,一种由细胞外ATP门控的离子通道,可能参与突触传递和神经发生,缺乏可能有助于特发性逼肌功能失调的病理生理学));
CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2);359aa),pI:8.66,MW:40225TM:1[P]GeneChromosome:9p13.3,Genbank登记号NP-001773.1);
LY64(淋巴细胞抗原64(RP105),富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白,调控B细胞活化和凋亡,功能丧失与系统性红斑狼疮患者的疾病活动增加有关);
FcRH1(Fc受体样蛋白1,一种含有C2型Ig样和ITAM结构域的免疫球蛋白Fc结构域的推定受体,可能在B淋巴细胞分化中起作用);
IRTA2(FcRH5,免疫球蛋白超家族受体易位相关2,一种可能在B细胞发育和淋巴瘤发生中起作用的推定免疫受体;
TENB2(TMEFF2、tomoregulin、TPEF、HPP1、TR、推定的跨膜蛋白聚糖,与生长因子EGF/heregulin家族和卵泡抑素有关);
MUC1(肿瘤相关MUC1糖肽表位);人腺癌过表达含有粘蛋白样糖蛋白MUC1的异常单糖和二糖抗原(比如Tn、唾液酸Tn和TF)的低糖基化肿瘤相关形式,以及在可变数量的串联重复序列(VNTR)区域中未糖基化蛋白骨架段。
可基于本发明产生的ADC可用于治疗患者的各种疾病或障碍,比如癌症和自身免疫性病症,包括特征为疾病相关抗原(包括(但不限于)肿瘤相关抗原)的过表达的那些。示例性的病症或障碍包括感染性疾病、血栓形成等,并且特别是良性或恶性肿瘤;白血病和淋巴系统恶性肿瘤;其他障碍,比如神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、表皮、基质、囊胚腔、炎性、血管生成和免疫性障碍。易受ADC治疗影响的癌症类型包括特征为某些肿瘤相关抗原或细胞表面受体(例如HER2)过表达的那些癌症。
一种方法用于治疗哺乳动物的癌症,其中癌症的特征为ErbB受体的过表达。哺乳动物任选地对用未缀合的抗ErbB抗体的治疗不反应或反应不良。方法包括给予哺乳动物治疗有效量的抗体-药物缀合物化合物。通过给予患者与所述生长因子受体和化学治疗剂特异性结合的本发明的ADC,可抑制过表达生长因子受体(比如HER2受体或EGF受体)的肿瘤细胞的生长,其中所述抗体-药物缀合物和所述化学治疗剂各自以在患者中有效抑制肿瘤细胞生长的量给予(见图34)。
本文中待治疗的癌症的实例包括(但不限于)癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴系统恶性肿瘤。这种癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastriccancer)或胃癌(stomach cancer)(包括胃肠道癌、胃肠道基质肿瘤(GIST))、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)或肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
实施例
在不同的培养系统和规模下进行修饰的底物的成功供给,使得能够筛选(小至10ml规模;见图2A-D)和生产(2-20L规模;见图24、25)修饰的非核糖体肽。不同的筛选规模包括:
在约2.2ml深孔微量滴定板(dw-MTP)中培养1.6ml培养物,同时通过600rpm的剧烈振荡和在dw-MTP上方顶部空间中的5%恒定CO2浓度确保CO2供给。一天24小时经LED面板或经荧光灯泡进行照明。根据菌株及其生长阶段将光强度调整在35-250μmol/s*m2之间。温度在20℃-30℃之间菌株特异性变化。
因此,该方法的培养为优选的,其中振荡在400-800rpm之间和恒定CO2浓度为在顶部空间中1-10%,优选地在顶部空间中3-8%。
在40ml聚苯乙烯管中培养10ml培养物,同时通过250-350rpm的剧烈振荡和培养容器下面的5%恒定CO2浓度来确保CO2供给。特此,经培养容器底部的可渗透CO2的聚丙烯膜将CO2引入到培养物中。一天24小时经荧光灯泡进行照明,并根据菌株及其生长阶段将光强度再次调整在35-250μmol/s*m2之间。温度再次在20℃-30℃之间菌株特异性变化。
因此,该方法的培养为优选的,其中一天24小时经荧光灯泡进行照明,并且在20-450μmol/s*m2之间。
在玻璃烧瓶中培养50ml培养物,同时以5%恒定CO2浓度通过鼓泡确保CO2供给。经用磁力搅拌棒以100rpm搅拌来混合培养物。一天24小时经荧光灯泡进行照明,并根据菌株和生长阶段将强度调整在35-250μmol/s*m2之间。
另外,还以2L-20L之间的生产规模进行了供给实验,同时通过以0.5-5.0%的恒定CO2浓度鼓泡来确保CO2供给和混合。经荧光灯泡进行照明,并根据菌株和生长阶段将强度调整在35-250μmol/s*m2之间。
任选地,在如上所述的天期间,于相同的光强度下,以16小时光照/8小时的昼夜循环进行培养。
任选地,用不同的光源(例如LED灯或硫等离子灯)和使用菌株特异性的光强度、CO2浓度、振荡/搅拌强度和培养基组成的变化进行培养。
10ml规模的示例性供给方案:
根据之前确定的菌株特异性培养条件,所有菌株均在BG11培养基(见下文)中进行培养。
将细胞在弱光条件(30μmol/s*m2)下的锥形烧瓶中,于25℃下和70rpm的振荡器上预培养4天。
对于10ml规模的供给实验,将细胞以750nm处的光密度(OD750 nm)为0.5接种于约40ml聚苯乙烯管中。培养基通过添加TES至培养基中的浓度为10mM进行缓冲。任选地,添加DMSO至培养基中的浓度为1%。
接种时通过在培养基中添加相应的修饰的底物至浓度为10μM开始供给培养物。通过每天供给另外的10μM(第1-4天),每天添加的修饰的底物在4天之内保持恒定。或者,在接种之后的第1和第3天通过每一天在培养基中供给修饰的底物至浓度为30μM来添加修饰的底物。每天通过测量750nm处的光密度(OD 750nm)来监测培养物的生长。通过向培养物中添加甲醇至最终浓度为20%来完成培养。随后使用C18改性的硅胶柱经标准固相提取程序进行提取。
对于上述其他规模,方案相似并且只是略微不同。例如,在2和20L规模下,培养基并不总是被缓冲,并且由于生长速度较慢,培养时间再延长一周。此外,在一些情况下,为了提高修饰的非核糖体肽的产率,使用了增加量的所添加修饰的底物,直至300μM培养基浓度(如果菌株耐受这种浓度的话)。
表:已用于供给实验的BG11培养基的配方。
对于以下菌株,证明了至少一种修饰的和可点击的底物的供给。
1可获自Simris Biologics GmbH,Berlin,Germany2对应于PCC 7820,可获自ThePasteur Culture Collection,Institut Pasteur,Paris,France3对应于HUB 5.2.4(M.Hisbergues et al.,Arch Microbiol.2003,180:402-410)
MC为微囊藻毒素,MC后面的两个字母定义可变位置2和4处的氨基酸,其中R为精氨酸,Y为酪氨酸,L为亮氨酸,W为色氨酸和F为苯丙氨酸。D-MAsp3为3位的D-赤型-β-甲基天冬氨酸,和Dhb7为7位的脱氢丁酸。NOD为节球藻毒素。
图4-30说明修饰的氨基酸在非核糖体肽中的掺入,更具体地讲在不同位置和分别由不同属和菌株产生的微囊藻毒素、节球藻毒素、anabaenopeptins和oscillamides中的掺入,它们带有可点击锚定基团或对可缀合的锚定基团可易于进行另外修饰的锚定基团。
下表概述不同的蓝细菌属和菌株分别用一种或两种修饰的底物的供给实验的结果,每种底物均包含直接可及或可转化以用于缀合化学(包括点击化学)的锚定基团,用于在修饰的氨基酸与靶向部分和/或标记之间经接头或者不含接头来连接靶向部分和/或标记。
表1:将一种修饰的底物供给微囊藻属和浮丝藻属的不同蓝细菌菌株的结果概述的部分1。MC-微囊藻毒素,其中MC后面的字母以单字母代码指示可变位置2和4的氨基酸。
表2:将一种修饰的底物供给微囊藻属和浮丝藻属的不同蓝细菌菌株的结果概述的部分2。MC-微囊藻毒素,其中MC后面的字母以单字母代码指示可变位置2和4的氨基酸。
表3:将一种修饰的底物供给微囊藻属和浮丝藻属的不同蓝细菌菌株的结果概述的部分3。MC-微囊藻毒素,其中MC后面的字母以单字母代码指示可变位置2和4的氨基酸。
表4:将两种修饰的底物供给微囊藻属的不同蓝细菌培养物的结果概述。MC-微囊藻毒素,其中MC后面的字母以单字母代码指示可变位置2和4的氨基酸。
附图说明
图1:
左上:微囊藻毒素的一般结构。X2和Z4表示可变的L-氨基酸。D-Ala=D-丙氨酸,D-Me-Asp=D-甲基天冬氨酸,Arg=精氨酸,Adda=3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基癸-4,6-二烯酸,D-Glu=D-谷氨酸,Mdha=N-甲基脱氢丙氨酸。
右上:节球藻毒素的一般结构。Arg2表示微囊藻毒素分子中对应于Z4的可变L-氨基酸。D-Me-Asp=D-甲基天冬氨酸,Arg=精氨酸,Adda=3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基癸-4,6-二烯酸,D-Glu=D-谷氨酸,Mdhb=N-甲基脱氢丁酸。
右下:Anabaenopeptin A的一般结构和anabaenopeptin型肽(包括oscillamides)的示意性一般结构:Anabaenopeptins(和oscillamides)为环状肽,其特征为5位赖氨酸和通过Lys与6位氨基酸的羧基之间的N-6肽键形成环。一个氨基酸单元的侧链通过Lys的α-N与侧链氨基酸的α-N之间形成的脲基键连接至环。环中的所有其他位置和侧链均可变。
右下:隐藻素-1的化学结构。隐藻素为一类大环缩肽类,由念珠藻属的蓝细菌作为次级代谢产物产生。Merck的研究人员于1990年公布了从培养的念珠藻属物种ATCC 53789分离出第一种代表性隐藻素1。
图2:
在针对适合于供给用于修饰非核糖体肽(包括CA)的修饰的底物的菌株的合适筛选方法的背景下,不同培养系统和规模以及不同质谱检测之间的比较(图2A-2D)。
图2A:
在将修饰的底物以50ml规模供给铜绿微囊藻菌株CBT 480之后,通过两种不同的质谱方法检测修饰的微囊藻毒素(4个图A、B、C、D中每一个的上方,用ESI-IT-ToF-MS检测;4个图A、B、C、D中每一个的下方,用MALDI-ToF-MS检测)。
A:对照(未供给O-甲基酪氨酸)B:对照(未供给高精氨酸)
C:供给O-甲基酪氨酸D:供给高精氨酸
天然产生的微囊藻毒素的分子量:
995Da=MC-LR,1045Da=MC-YR
通过供给O-甲基酪氨酸(OMetY)和高精氨酸(hR)产生的修饰的微囊藻毒素的分子量
1059Da=MC-OMetYR或MC-YhR;1009Da=MC-LhR
图2B:
在将修饰的底物以6ml规模供给铜绿微囊藻菌株CBT 480之后,通过两种不同的质谱方法检测修饰的微囊藻毒素(两个图A/A’和B/B’中每一个的上方,用ESI-IT-ToF-MS检测;两个图A/A’和B/B’中每一个的下方,用MALDI-ToF-MS检测)。
A,A’:用O-甲基酪氨酸供给的CBT 480培养物;B,B’:用高精氨酸供给的CBT 480培养物
天然产生的微囊藻毒素的分子量:995Da=MC-LR,1045Da=MC-YR
通过供给O-甲基酪氨酸(OMetY)和高精氨酸(hR)产生的修饰的微囊藻毒素的分子量1059Da=MC-OMetYR或MC-YhR;1009Da=MC-LhR
图2C:
在将修饰的底物以1.6ml(dw-MTP)规模用O-甲基酪氨酸供给铜绿微囊藻菌株CBT480之后,通过两种不同的质谱方法检测修饰的微囊藻毒素(左侧为ESI-IT-ToF-MS;右侧为MALDI-ToF-MS)
A,A’:供给300μM O-甲基酪氨酸(OMetY),不含DMSO
B,B’:供给30μM O-甲基酪氨酸(O-MetY),不含DMSO
C,C’:供给300μM O-甲基酪氨酸(OMetY),含1%DMSO
D,D’:供给30μM O-甲基酪氨酸(OMetY),含1%DMSO
E,E’:对照(无供给)
天然产生的微囊藻毒素的分子量:995Da=MC-LR,1045Da=MC-YR
通过供给O-甲基酪氨酸产生的修饰的微囊藻毒素的分子量
1059Da=MC-OMetYR
图2D:
在将修饰的底物以1.6ml(dw-MTP)规模用高精氨酸供给铜绿微囊藻菌株CBT 480之后,通过两种不同的质谱方法检测修饰的微囊藻毒素(左侧为ESI-IT-ToF-MS检测;右侧为MALDI-ToF-MS检测)
A,A’:供给300μM高精氨酸(hR),不含DMSO
B,B’:供给30μM高精氨酸(hR),不含DMSO
C,C’:供给300μM高精氨酸(hR),含1%DMSO
D,D’:供给30μM高精氨酸(hR),含1%DMSO
E,E’:对照(无供给)
天然产生的微囊藻毒素的分子量:995Da=MC-LR,1045Da=MC-YR
通过供给高精氨酸产生的修饰的微囊藻毒素的分子量
1059Da=MC-YhR;1009Da=MC-LhR
所有修饰的微囊藻毒素均可用两种MS方法检测到。然而,由培养基中未添加1%DMSO的供给所产生的大多数样品用MALDI-ToF-MS不能检测到,但用ESI-IT-ToF-MS可以。因此,建议使用DMSO进行小规模培养物(1-10ml之间的培养物体积)筛选中的供给实验,尤其是如果修饰的非核糖体肽的MS检测为基于MALDI-ToF-MS的话。
另一方面,在将修饰的底物供给深孔微量滴定板(dw-MTP)中培养的1.6ml小规模培养物之后,对修饰的非核糖体肽进行MALDI-ToF-MS检测使得能够进行高通量筛选(HTS)。用于MALDI-ToF-MS的培养(供给和未供给修饰的底物)和样品制备两者均可使用移液机器人进行,使得能够并行测试多种菌株和底物,如Tillich et al.BMC Microbiology 2014,14:239所述。
图3:
McyBI代表McyB的两个酶模块中的第一个,并负责在微囊藻毒素分子的2位掺入氨基酸。在铜绿微囊藻菌株PCC7806的情况下这是氨基酸亮氨酸,而在铜绿微囊藻菌株CBT480中这是亮氨酸或酪氨酸。McyBI的腺苷酰化(A)结构域的所谓核心基序A2-A6以黑色(A2-A6)突出显示,和在相应的微囊藻毒素生物合成期间负责底物(氨基酸)识别和激活的氨基酸通过大而粗的白色字母表示。这些氨基酸形成A结构域的活性口袋,和以其单字母氨基酸代码表示的序列代表使得能够预测A结构域的底物特异性的A结构域的所谓赋予特异性的代码。方框和箭头表示两种菌株的McyBI的氨基酸序列的唯一差异。两种菌株的A结构域的9个形成口袋的氨基酸中仅有1个在菌株之间是不同的,而且A结构域的其余部分以及整个生物合成基因簇的其余部分在菌株之间几乎相同,从而得出以下结论:菌株CBT 480中在微囊藻毒素的2位掺入亮氨酸和酪氨酸为一种菌株特异性特征,但不能分别通过生物合成基因簇的DNA序列和微囊藻毒素合成酶的氨基酸序列的差异来解释。
图4:
示例性实施方案1号:将修饰的底物叠氮基-L-Phe(Phe=苯丙氨酸)掺入由菌株CBT 959产生的微囊藻毒素-YR的2位。在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖微囊藻毒素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,(e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
不能通过测量750nm处的光密度(OD750nm)来跟踪菌株CBT 959的生长,因为细胞形成聚集体,使得无法测量可靠的OD750nm值。
图5:
示例性实施方案2号:将修饰的底物Prg-Tyr(Tyr=酪氨酸)掺入由菌株CBT 480产生的微囊藻毒素YR的2位。
在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖微囊藻毒素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图6:
示例性实施方案2号:添加和未添加Prg-Tyr(Tyr=酪氨酸)的CBT 480培养物的生长曲线。
图7:
示例性实施方案3号:将修饰的底物叠氮基-Lys(Lys=赖氨酸)掺入由菌株CBT275产生的微囊藻毒素LR的4位。
在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖微囊藻毒素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图8:
示例性实施方案3号:添加和未添加叠氮基-Lys(Lys=赖氨酸)的CBT 275培养物的生长曲线。
图9:
示例性实施方案4号:将修饰的底物Prg-Tyr(Tyr=酪氨酸)掺入由菌株CBT 275产生的微囊藻毒素LW的4位。
在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖微囊藻毒素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图10:
示例性实施方案4号:添加和未添加Prg-Tyr(Tyr=酪氨酸)的CBT 275培养物的生长曲线。
图11:
示例性实施方案5号:将修饰的底物硝基-Arg(Arg=精氨酸)掺入由菌株CBT 1产生的微囊藻毒素YR的4位。
在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖微囊藻毒素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图12:
添加和未添加硝基-Arg(Arg=精氨酸)的CBT 1培养物的生长曲线。
图13:
示例性实施方案6号:将修饰的底物呋喃基-L-Ala(Ala=丙氨酸)掺入由菌株CBT275产生的微囊藻毒素LR的4位。
在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖微囊藻毒素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。微囊藻毒素LR的新颖呋喃基-Ala变体的PDA信号由于浓度低而不可见。
图14:
示例性实施方案6号:添加和未添加呋喃基-Ala(Ala=丙氨酸)的CBT 275培养物的生长曲线。
图15:
示例性实施方案7号:将修饰的底物硝基-Arg(Arg=精氨酸)和Prg-Tyr(Tyr=酪氨酸)分别掺入由菌株CBT 480产生的微囊藻毒素YR的2和4位。
在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖微囊藻毒素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图16:
示例性实施方案7号:添加和未添加硝基-Arg(Arg=精氨酸)和Prg-Tyr(Tyr=酪氨酸)的CBT 480培养物的生长曲线。
图17:
示例性实施方案8号:将修饰的底物硝基-Arg(Arg=精氨酸)掺入由菌株CBT 239产生的微囊藻毒素(D-Asp3,E-Dhb7)-RR的2/4位。
在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖微囊藻毒素变体在正电离模式下的双质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图18:
示例性实施方案8号:添加和未添加硝基-Arg(Arg=精氨酸)的CBT 329培养物的生长曲线。
图19:
示例性实施方案9号:将修饰的底物叠氮基-Lys(Lys=赖氨酸)掺入由菌株CBT 1产生的微囊藻毒素YR的4位。
在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖微囊藻毒素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。微囊藻毒素YR的新颖叠氮基-Lys(Lys=赖氨酸)变体的PDA信号由于样品中的峰重叠而不可见。
图20:
示例性实施方案9号:添加和未添加叠氮基-Lys(Lys=赖氨酸)的CBT 1培养物的生长曲线。
图21:
示例性实施方案10号:将修饰的底物叠氮基-Norval(Norval=正缬氨酸)掺入由菌株CBT 633产生的微囊藻毒素RR的2位。
在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖微囊藻毒素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图22:
添加和未添加叠氮基-Norval(Norval=正缬氨酸)的CBT 633培养物的生长曲线。
图23:
示例性实施方案11号:将修饰的底物H-homoarg-OH(homoarg=高精氨酸)掺入由菌株CBT 786产生的节球藻毒素的2位。
在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖节球藻毒素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图24:
示例性实施方案12号:将修饰的底物叠氮基-L-Phe(Phe=苯丙氨酸)掺入在大规模(2l)培养系统中由菌株CBT 480产生的微囊藻毒素YR的2位。
在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖微囊藻毒素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图25:
示例性实施方案13号:用不同量的修饰的底物4-叠氮基-L-苯丙氨酸(0μM,10μM,30μM)供给铜绿微囊藻菌株CBT 480导致所产生的修饰的微囊藻毒素的量随着供给的修饰的底物4-叠氮基-L-苯丙氨酸的量的增加而增加。该结果使得能够针对修饰的非核糖体肽(此处为修饰的微囊藻毒素)的相应产生优化供给方案。
图的上部显示对照培养样品、在培养基中添加了10μM底物4-叠氮基-L-苯丙氨酸的培养样品和在培养基中添加了30μM底物4-叠氮基-L-苯丙氨酸的培养样品在238nm处的覆盖的HPLC-PDA色谱图。下图显示在HPLC色谱图中约10分钟处可见的新形成的峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图26:
示例性实施方案14号:将修饰的底物Prg-Tyr(Tyr=酪氨酸)掺入由菌株CBT 280产生的(D-Asp3,E-Dhb7)微囊藻毒素-RR的2位。
在238nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖微囊藻毒素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图27:
示例性实施方案15号:将修饰的底物Prg-Tyr(Tyr=酪氨酸)掺入由菌株CBT 280产生的AnabaenopeptinA的2位。
在210nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖Anabaenopeptin变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图28:
示例性实施方案16号:将修饰的底物叠氮基-Phe(Phe=苯丙氨酸)掺入由菌株CBT332产生的Anabaenopeptin NZ857中。
在210nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖Anabaenopeptin变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图29:
示例性实施方案17号:将修饰的底物叠氮基-Phe(Phe=苯丙氨酸)掺入由菌株CBT1161产生的Oscillamide Y中。
在210nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖Oscillamide变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图30:
示例性实施方案18号:将修饰的底物Prg-Tyr(Tyr=酪氨酸)掺入由菌株CBT 1161产生的OscillamideY中。
在210nm处的HPLC-PDA色谱图:(a)对照培养样品,(b)添加修饰的底物的培养样品。从新颖Oscillamide变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(c)对照培养样品和(d)添加修饰的底物的培养样品。最后,e)显示色谱图d)中可见峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)对PDA和质谱数据分别以毫吸收单位(mAU)和计数(无量纲量)进行测量。
图31:
示例性实施方案19号:将修饰的底物Prg-Tyr(Tyr=酪氨酸)掺入由菌株CBT 567产生的隐藻素1中。
从新颖隐藻素变体在正电离模式下的质子化分子离子的HPLC-MS质量值数据提取的离子色谱图:(a)对照培养样品和(b)添加修饰的底物的培养样品。最后,c)显示色谱图b)中另外峰的平均质谱。检测器信号强度(y轴)以计数(无量纲量)进行测量。
图32:
示例性实施方案20号:产生的ADC和分析型SEC-HPLC结果。在分析型SEC-HPLC中,缀合物微囊藻毒素-ADC1和微囊藻毒素-ADC2显示高纯度,具有98.9%和99.0%单体。在两种情况下,检出的聚集体和小碎片比率为0.8%和0.2%。
图33:
示例性实施方案21号:考马斯染色的凝胶电泳凝胶证明微囊藻毒素变体1和2作为单克隆抗体上的有效载荷结合。在还原条件下的考马斯染色中,所有样品在约50kDa处显示出重链信号和在约25kDa处显示出轻链信号。与裸MAB相比较,所有缀合物均显示出重链和轻链的蛋白信号上移,表明毒素缀合至两条抗体链。对于所有ADC,均检测到轻链的双信号,表明缀合和非缀合两种。在非还原条件下的考马斯染色中,裸抗体在约150kDa处显示出完整抗体的双信号。ADC在25kDa-150kDa之间显示出多种信号,因为在两种情况下,毒素与还原的链间二硫键缀合,导致在37℃温育期间抗体不稳定。
图34:
示例性实施方案22号:基于微囊藻毒素的ADC的概念的成功的体外证明。用癌细胞系针对不同浓度的微囊藻毒素ADC(两种微囊藻毒素变体作为有效载荷),在体外测定中监测细胞活力。ADC带有不可切割的接头。对于微囊藻毒素ADC-2,测定EC50值为220pM。结构有效载荷变体之间的差异强调了进一步结构优化的巨大潜力。
Claims (15)
1.从蓝细菌产生修饰的非核糖体肽的方法,所述方法包括以下步骤:
a) 在培养基中生长产生非核糖体肽的蓝细菌菌株,
b) 向所述培养物添加一种或多种修饰的底物,和
c) 在存在所述修饰的底物的情况下生长所述菌株,
其中所述修饰的底物为修饰的氨基酸,其包含直接可及或可转化以用于缀合化学,包括点击化学的锚定基团,用于连接靶向部分或标记。
2.权利要求1的方法,其中选择产生非核糖体肽的菌株,使得将修饰的底物掺入所述非核糖体肽中在确定的位置发生。
3.权利要求1或2的方法,其中所述非核糖体肽为微囊藻毒素,并且在除了Adda5和DGlu6以外的任何位置掺入一种或多种修饰的底物,其具有以下一般结构:
D-Ala1-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-DGlu6-Mdha7。
4.权利要求3的方法,其中在位置X2和/或Z4掺入所述修饰的氨基酸。
5.权利要求1或2的方法,其中所述非核糖体肽为节球藻毒素,并且在除了Adda3和DGlu4以外的任何位置掺入一种或多种修饰的底物,其具有以下一般结构:
D-MeAsp1-Arg2-Adda3-DGlu4-Mdhb5。
6.权利要求5的方法,其中在位置Arg2掺入所述修饰的氨基酸。
7.前述权利要求中一项的方法,其中产生以下微囊藻毒素之一:
D-Ala1-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-DGlu6-Mdha7,
其中“X2”和/或“Z4”包含至少一种修饰的底物。
8.前述权利要求中一项的方法,其中产生以下节球藻毒素之一:
其中对于
的位置包含至少一种修饰的底物。
9.权利要求8的方法,其中所述节球藻毒素在Arg2位置包含修饰的底物。
10.前述权利要求中一项的方法,其中培养基中所述修饰的底物或氨基酸的浓度在5-500 µM之间和/或添加另外的成分:DMSO。
11.前述权利要求中一项的方法,其中修饰的氨基酸的缀合化学反应(包括点击化学反应)选自:铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成、应变促进的叠氮化物-炔烃环加成、炔烃-叠氮化物环加成或烯烃-四嗪逆需求Diels-Alder反应以及利用伯胺、硫醇、醛、羧基和肟的特定反应性的反应。
12.前述权利要求中一项的方法,其中所述蓝细菌菌株选自微囊藻属(Microcystis)、浮丝藻属(Planktothrix)、颤藻属(Oscillatoria)、念珠藻属(Nostoc)、鱼腥藻属(Anabaena)、束丝藻属(Aphanizomenon)、软管藻属(Hapalosiphon)、节球藻属(Nodularia)、鞘丝藻属(Lyngbya)、席藻属(Phormidium)、螺旋藻属(Spirulina)、盐螺旋藻属(Halospirulina)、节旋藻属(Arthrospira)、束毛藻属(Trichodesmium)、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)、织线藻属(Plectonema)、粘囊藻属(Myxosarcina)、宽球藻属(Pleurocapsa)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、盖丝藻属(Geitlerinema)、Euhalothece、眉藻属(Calothrix)、单歧藻属(Tolypothrix)、伪枝藻属(Scytonema)、费氏藻属(Fischerella)、鞭枝藻属(Mastigocladus)、拟惠氏藻属(Westiellopsis)、真枝藻属(Stigonema)、拟绿胶蓝细菌属(Chlorogloeopsis)、蓝螺藻属(Cyanospira)、筒胞藻属(Cylindrospermopsis)、柱孢藻属(Cylindrospermum)、微毛藻属(Microchaete)、胶须藻属(Rivularia)、Autosira、毛线属(Trichonema)、束毛藻属(Trichodesmium)、束藻属(Symploca)、斯塔尔氏蓝细菌属(Starria)、原绿丝蓝细菌属(Prochlorothrix)、微鞘藻属(Microcoleus)、湖丝藻属(Limnothrix)、发毛针藻属(Crinalium)、博氏藻属(Borzia)、拟甲色球藻属(Chroococcidiopsis)、蓝囊胞菌属(Cyanocystis)、小皮果蓝细菌属(Dermocarpella)、Staniera、异球蓝细菌属(Xenococcus)、管孢藻属(Chamaesiphon)、色球藻属(Chroococcus)、蓝细菌属(Cyanobacterium)、蓝菌属(Cyanobium)、蓝丝菌属(Cyanothece)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、粘杆菌属(Gloeobacter)、黏球藻属(Gloeocapsa)、粘杆藻属(Gloeothece)。
13.一种产生用于靶向疗法的化合物的方法,所述化合物包含与靶向部分连接的非核糖体肽,所述方法具有以下步骤:
A)通过进行前述权利要求中任一项的方法,提供靶向部分和非核糖体肽,所述非核糖体肽包含至少一种修饰的氨基酸,其中所述至少一种修饰的氨基酸包含直接可及或可转化以用于缀合化学,包括点击化学的锚定基团,
B)通过化学缀合至所述锚定基团,将所述靶向部分连接至所述非核糖体肽。
14.权利要求13的方法,其中所述靶向部分通过在修饰的氨基酸和靶向部分之间排列的接头连接。
15.权利要求13或14的方法,其中所述靶向部分是抗体。
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