EA010594B1 - Слитые белки taci-иммуноглобулина - Google Patents

Слитые белки taci-иммуноглобулина Download PDF

Info

Publication number
EA010594B1
EA010594B1 EA200600894A EA200600894A EA010594B1 EA 010594 B1 EA010594 B1 EA 010594B1 EA 200600894 A EA200600894 A EA 200600894A EA 200600894 A EA200600894 A EA 200600894A EA 010594 B1 EA010594 B1 EA 010594B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
tac1
amino acid
immunoglobulin
fragment
cells
Prior art date
Application number
EA200600894A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600894A1 (ru
Inventor
Марк У. Риксон
Джейн А. Гросс
Original Assignee
Займодженетикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Займодженетикс, Инк. filed Critical Займодженетикс, Инк.
Publication of EA200600894A1 publication Critical patent/EA200600894A1/ru
Publication of EA010594B1 publication Critical patent/EA010594B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении было доказано, что молекулы, которые мешают связыванию рецептора фактора некроза опухоли с его лигандом, например растворимого рецептора, являются полезными как в фундаментальных исследованиях, так и в терапии. Настоящее изобретение предоставляет улучшенные растворимые рецепторы трансмембранного активатора и кальциевого модулятора, взаимодействующие с циклофилиновым лигандом (TACI).

Description

Область изобретения
Данное изобретение, в целом, относится к усовершенствованным слитым белкам, содержащим фрагмент рецептора фактора некроза опухоли и фрагмент иммуноглобулина. В частности, данное изобретение относится к усовершенствованным ТАС1-иммуноглобулиновым слитым белкам.
Предпосылки изобретения
Цитокины являются растворимыми небольшими белками, которые опосредуют ряд биологических эффектов, включая регуляцию роста и дифференциации многих типов клеток (см., например, Ага1 е! а1., Аппи. Вес. Вюсйет. 59:783 (1990); Моктапп, Сшт. Ορίη. 1ттипо1. 3/311 (1991); Раи1 апб Бебег, Се11 76:241 (1994)). Белки, которые составляют группу цитокинов, включают интерлейкины, интерфероны, колониестимулирующие факторы, факторы некроза опухоли и другие регуляторные молекулы. Например, интерлейкин-17 человека является цитокином, который стимулирует экспрессию интерлейкина-6, внутриклеточной адгезионной молекулы 1, интерлейкина-8, колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов и экспрессию простагландина Е2 и играет роль в избирательном созревании гемопоэтических предшественников СП34+ в нейтрофилы (Уао е! а1., 1ттипо1. 755:5483 (1995); Бокк1ех е! а1., 1. Εχρ. Меб. 183:2593 (1996)).
Рецепторы, которые связывают цитокины, являются типично состоящими из одного или нескольких интегральных мембранных белков, которые связывают цитокины с высокой аффинностью и передают этот результат связывания в клетку через цитоплазматические участки определенных субъединиц рецептора. Рецепторы цитокинов сгруппированы в несколько классов на основе сходств в их внеклеточных лиганд-связывающих доменах. Например, рецепторные цепи, ответственные за связывание и/или трансдукцию действия интерферонов, являются членами рецепторного семейства цитокинов II типа, основанного на характеристике внеклеточного домена из 200 остатков.
Клеточные взаимодействия, которые происходят во время иммунного ответа, регулируются членами нескольких семейств поверхностных клеточных рецепторов, включая рецепторное семейство фактора некроза опухоли (ΤΝΕΚ.). Семейство ΊΝΓΒ состоит из ряда интегральных мембранных гликопротеиновых рецепторов, многие из которых, связываясь с их соответствующими лигандами, регулируют взаимодействия между различными гемопоэтическими клеточными линиями (см., например, Соктап, Б!ет Се11к 12:440 (1994); \Уа)ап1 е! а1., Су!окше Сго\\111 Рас!ог Веу. 70:15 (1999); Уей е! а1., 1ттипо1. Неу. 169:283 (1999); 1бп88 апб ШЕктЦк М1сгокс. Век. Тесй. 50:184 (2000)).
Одним таким рецептором является ТАС1, трансмембранный активатор, и взаимодействующий с САМЬ (уоп Вй1о\\· апб Вгат, Бшепсе 228:138 (1997); Вгат апб уоп Ви1о\у. патент США № 5969102 (1999)). ТАС1 является мембранно-связанным рецептором, который имеет внеклеточный домен, имеющий в своем составе две обогащенные цистеином псевдоповторности, трансмембранный домен и цитоплазматический домен, который взаимодействует с САМБ (кальциевым модулятором и циклофилиновым лигандом), интегральный мембранный белок, локализованный во внутриклеточных везикулах, который является коиндуктором активации ΝΡ-АТ при сверхэкспрессии в клетках Журката. ТАС1 ассоциированы с В-клетками и субпопуляцией Т-клеток. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют ТАС1 и соответствующую ему аминокислотную последовательность, даны здесь как БЕЦ ΙΌ, номера 1 и 2 соответственно.
Рецептор ТАС1 связывает два члена семейства лигандов фактора некроза опухоли (ТЫБ). Один лиганд, по-разному определяемый, как ΖΊΝΕφ ВАББ, нейтрокин-α, В1уБ, ТАББ-1 и ΤΗАNΚ (Уи е! а1., международная публикация № XVΟ 98/18921 (1998), Мооге е! а1., Баепсе 285:269 (1999); Микйорабйуау е! а1., I. Вю1. Сйет. 274:15978 (1999); Бсйпе1бег е! а1., I. Εχρ. Меб. 789:1747 (1999); Бйи е! а1., I. Беикос. Вю1. 65:680 (1999)). Аминокислотную последовательность ΖΊΝ^ представляют как БЕЦ ΙΌ ΝΟ:3. Другой лиганд назвали как ’^Т№2, АРВ1Б и лиганд гибели-1 ΊΝΗΓ (Найпе е! а1., I. Εχρ. Меб. 788:1185 (1998); Ке11у е! а1., Сапсег Век. 60:1021 (2000)). Аминокислотную последовательность ΖΊΝ^ представляют как БЕЦ ΙΌ ΝΟ:4. Оба лиганда также связываются рецептором созревания В-клеток (ВСМА) (Огокк е! а1., №11иге 404:995 (2000)). Нуклеотидную и аминокислотную последовательность ВСМА представляют как БЕЦ ΙΌ ΝΟ:26 и БЕЦ ΙΌ ΝΟ:27 соответственно.
Показанная ш угуо активность рецепторов фактора некроза опухоли иллюстрирует клинические возможности растворимых форм рецептора. Растворимые формы рецептора ТАСЕ были синтезированы в виде иммуноглобулиновых слитых белков. Первоначальные варианты давали в результате слабо экспрессируемый гетерогенный белок. Гетерогенность наблюдали в аминоконце ТАШ, в карбоксильном конце Бс и в стволовой области ТАСБ Следовательно, существует необходимость в фармацевтически пригодных композициях рецептора ТАСк
Сущность изобретения
Данное изобретение предусматривает усовершенствованные слитые ТАСБиммуноглобулиновые белки, пригодные в качестве терапевтических композиций.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 демонстрирует аминокислотную последовательность ТАШ человека. Положения богатых цистеином псевдоповторностей заштрихованы, трансмембранный домен помещен в рамку, и стволовой участок показан мелкими черточками.
- 1 010594
Фиг. 2 представляет собой схематический чертеж иммуноглобулина подкласса 1дС1. СЦ константная область легкой цепи; СН1, СН2, СН3: константные области тяжелой цепи; Уъ: вариабельная область легкой цепи; УН: вариабельная область тяжелой цепи; СНО: углевод; Ν: аминоконец; С: карбоксильный конец.
Фиг. 3А, 3В, 3С и 3Ό показывают сравнение аминокислотной последовательности константной области Рс γ1 дикого типа человека с вариантами Рс-488, Рс4, Рс5, Реб, Рс7 и Рс8. СН1-домен константной области γ1 человека не является частью Рс и поэтому не показан. Показана локализация шарнирного участка СН2- и СН3-доменов. Отмечены остатки Сук, которые обычно вовлечены в дисульфидные связи константной области легкой цепи (ЬС) и константной области тяжелой цепи (НС). Обозначение «.» показывает идентичность с диким типом в этом положении, тогда как «***» обозначает локализацию карбоксильного конца и иллюстрирует различия в карбоксильном конце Рсб относительно других вариантов Рс. Положения аминокислот обозначены по индексной позиции Европейского сообщества.
Фиг. 4 показывает специфическое связывание 1251-2Т№4 с различными конструкциями ТАС1-Рс. Слитые белки ТАС1-Рс содержат фрагменты ТАС1, у которых отсутствуют первые 29 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности 8Еф ГО N0:2. Один из слитых белков содержит фрагмент ТАС1 с интактной стволовой областью (ТАС1(б1-29)-Рс5), тогда как три из слитых белков ТАС1-Рс содержат фрагменты ТАС1 с различными делециями в стволовой области (ТАС1(б1-29, б107-154)-Рс5; (ТАС1(б1-29, б111-154)-Рс5; (ТАС1(б1-29, б120-154)-Рс5. Экспериментальные подробности описывают в примере 4.
Подробное описание изобретения
1. Обзор.
Как описано ниже, данное изобретение предусматривает слитые белки трансмембранного активатора и кальциевого модулятора, взаимодействующие с циклофилиновым лигандом (ТАС1) с иммуноглобулинами, и способы применения ТАС1-иммуноглобулиновых слитых белков. Например, настоящее изобретение предоставляет способы ингибирования пролиферации опухолевых клеток, предусматривающие введение в опухолевые клетки композиции, которая содержит слитый белок ТАС1-иммуноглубулина. Такая композиция может быть введена в клетки, культивируемые ίη νίίτο. Альтернативно, композиция может быть фармацевтической композицией, которая состоит из фармацевтически приемлемого носителя и слитого белка ТАС1-иммуноглобулина, и фармацевтическая композиция может быть введена субъекту, который имеет опухоль. Субъект может быть млекопитающим субъектом. Введение фармацевтической композиции может ингибировать, например, пролиферацию В-лимфоцитов у млекопитающего субъекта.
Данное изобретение также предоставляет способы ингибирования активности 2Т№4 у млекопитающего, предусматривающие введение млекопитающему композиции, которая содержит ТАС1иммуноглобулин. Активность 2Т№4 может быть ассоциирована с различными болезнями и нарушениями. Например, фармацевтическая композиция, которая содержит слитый белок ТАС1-иммуноглобулина может быть использована для лечения аутоиммунных болезней, таких как системная красная волчанка, астенический бульбарный паралич, рассеянный склероз, инсулинзависимый сахарный диабет, болезнь Крона, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный полиартрит и псориатический артрит. Альтернативно, фармацевтическая композиция, которая содержит ТАС1-иммуноглобулин, может быть использована для лечения расстройства, такого как астма, бронхит, эмфизема и последняя стадия почечной недостаточности. Фармацевтическая композиция, предусматривающая ТАС1-иммуноглобулин, может быть также использована для лечения почечного заболевания, такого как гломерулонефрит, васкулит, нефрит, амилоидоз и пиелонефрит, или расстройства, такого как неоплазма, хроническая лимфоцитарная лейкемия, множественная миелома, неходчкинкская лимфома, посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение и легкая цепь гаммопатии. В определенных случаях активность 2Т№4 может быть ассоциирована с Т-клетками. Фармацевтическая композиция, которая содержит ТАС1-иммуноглобулин, может быть также использована для лечения заболевания или нарушения, связанного с иммуносупрессией, отторжением трансплантата, реакцией «трансплантат против хозяина» и воспаления. Например, фармацевтическая композиция, которая содержит ТАС1-иммуноглобулин может быть использована для уменьшения воспаления и для лечения нарушений, таких как суставная боль, опухоль, анемия и септический шок.
Данное изобретение также предоставляет способы снижения циркулирующих уровней 2Т№4 в крови у млекопитающих субъектов, предусматривающие введение млекопитающему субъекту фармацевтической композиции, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель и слитый белок ТАС1-иммуноглобулина, причем введение фармацевтической композиции снижает циркулирующий уровень 2Т№4 в крови млекопитающего субъекта. В качестве иллюстрации введение такой фармацевтической композиции может снизить циркулирующий уровень 2Т№4 в крови по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 10-60%, по меньшей мере на 20-50% или по меньшей мере на 30-40% по сравнению с уровнем 2Т№4 в крови перед введением фармацевтической композиции. Специалисты в данной области могут измерить циркулирующие уровни 2Т№4. Иллюстративные способы
- 2 010594 описывают в примерах 4 и 5.
Как описано ниже, иллюстративные слитые белки ТАС1-иммуноглобулина содержат:
(a) фрагмент рецептора ТАС1, который состоит из фрагмента полипептида, который имеет аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 154 последовательности 8ЕО ГО N0:2, причем фрагмент рецептора ТАС1 содержит по меньшей мере один из (1) аминокислотных остатков с 34 по 66 последовательности 8Е0 ГО N0:2 и (и) аминокислотные остатки с 71 по 104 последовательности 8Е0 ГО N0:2, и причем компонент рецептора ТАС! связывает по меньшей мере один из ΖΊΝΕ2 или ΖΊΝΕ4, и (b) фрагмент иммуноглобулина, содержащий константную область иммуноглобулина. Подходящие фрагменты рецептора ТАС1 включают: полипептиды, которые содержат аминокислотные остатки с 34 по 66 последовательности 8Е0 ГО N0:2 и аминокислотные остатки с 71 до 104 8ЕЦ ГО N0:2; полипептиды, которые содержат аминокислотные остатки с 34 по 104 8Е0 ГО N0:2; полипептиды, которые содержат аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 110 8Е0 ГО N0:2 и полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков с 30 по 110 8ЕО ГО N0:2.
Иммуноглобулиновый фрагмент слитого белка ТАС1-иммуноглобулина может содержать константную область тяжелой цепи, например константную область тяжелой цепи человека. Константная область тяжелой цепи 1дО1 представляет один пример пригодной константной области тяжелой цепи. Иллюстративной константной областью тяжелой цепи 1дО1 является Ее-фрагмент 1дО1, который содержит домены СН2 и Снз. Ес-фрагмент ЦС1 может быть Ес-фрагментом дикого типа 1дО 1 или видоизмененным Ес-фрагментом 1дО1, таким как фрагмент Ес, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:33. Одним типичным слитым белком ТАС1-иммуноглобулина является белок, который содержит аминокислотную последовательность, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:54.
Слитые белки ТАС1-иммуноглобулина, описанные здесь, могут быть мультимерами, например димерами.
Данное изобретение также предоставляет молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют слитый белок ТАС1-иммуноглобулина. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует слитый белок ТАС1-иммуноглобулина представлена последовательностью 8ЕЦ ГО N0:53.
Данное изобретение также включает в себя растворимые рецепторы ТАС1, которые состоят из фрагмента полипептида, который имеет аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 154 8Е0 ГО N0:2, причем растворимый рецептор ТАС1 содержит по меньшей мере один из (1) аминокислотных остатков с 34 по 66 8Е0 ГО N0:2 и (ίί) аминокислотные остатки с 71 по 104 8ЕЦ ГО N0:2, и причем растворимый рецептор ТАС1 связывает по меньшей мере один из ΖТNЕ2 или /ТОТД. Дополнительные растворимые рецепторы ТАС1 описывают здесь в виде подходящих фрагментов рецептора ТАС1 для слитых белков ТАС1-иммуноглобулинов. Кроме того, растворимые рецепторы ТАС1 могут быть использованы в способах, описанных для слитых белков ТАС1-иммуноглобулинов.
Эти и другие аспекты изобретения станут очевидными из ссылки к следующему детальному описанию и фигурам. Кроме того, различные ссылки представляют ниже.
2. Определения.
В последующем описании широко используют ряд терминов. Нижеследующие определения представлены для облегчения понимания изобретения.
Как используется здесь, «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» относится к полинуклеотидам, таким как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), олигонуклеотидам, фрагментам, синтезированным полимеразной цепной реакцией (ПЦР), и фрагментам, произведенным любым из эндонуклеазных действий и экзонуклеазных действий - лигирования, разрезания. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть составлены из мономеров, которые являются природными нуклеотидами (таких как ДНК и РНК), или аналогов природных нуклеотидов (например, α-энантиомерных форм природных нуклеотидов), или сочетания обоих. Модифицированные нуклеотиды могут иметь перестройки в сахарных остатках и/или в остатках пиримидиновых или пуриновых оснований. Модифицирование сахаров включает, например, замещение одной или нескольких гидроксильных групп галогенами, щелочными группами, аминами и азидными группами, или сахара могут быть функционализированы в виде простых или сложных эфиров. Кроме того, целый сахарный остаток может быть замещен пространственно и электронно сходными структурами, такими как азасахара и карбоциклические аналоги сахаров. Примеры модификаций в основе остатка включают алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины, или другие хорошо известные гетероциклические замещения. Мономеры нуклеиновых кислот могут быть связаны фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Аналоги фосфодиэфирных связей включают фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфоранилитад, фосфороамидат и т.п. Термин молекула нуклеиновой кислоты» также включает так называемые «пептидные нуклеиновые кислоты», которые состоят из природных или модифицированных оснований нуклеиновых кислот, присоединенных к полиамидной основе. Нуклеиновые кислоты могут быть или одноцепочечными, или
- 3 010594 двухцепочечными.
Термин «комплементарная молекула нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей комплементарную нуклеотидную последовательность и противоположное направление по сравнению с эталонной нуклеотидной последовательностью. Например, последовательность 5'АтСсАСССС 3' (8ЕО ΙΌ N0:57) является комплиментарной последовательности 5'ССССТССАТ 3' (8ЕО ΙΌ N0:58).
Термин «контиг» означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая имеет прилегающий отрезок идентичной или комплементарной последовательности другой молекуле нуклеиновой кислоты. Прилегающие последовательности, говорят, «перекрывают» данный отрезок молекулы нуклеиновой кислотой или полностью, или на частичном протяжении молекулы нуклеиновой кислоты.
Термин «вырожденная нуклеотидная последовательность» означает последовательность нуклеотидов, которая включает один или несколько вырожденных кодонов по сравнению с эталонной молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид. Вырожденные кодоны содержат различные триплеты нуклеотидов, но кодируют тот же аминокислотный остаток (например, триплеты САИ и САС каждый кодирует Акр).
Термин «структурный ген» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в матричную РНК (мРНК), которая затем транслируется в аминокислотную последовательность, характерную для конкретного полипептида.
«Изолированная молекула нуклеиновой кислоты» представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая не является интегрированной (пер., встроенной) в геномную ДНК организма. Например, молекула ДНК, которая кодирует фактор роста, которая была отделена от геномной ДНК клетки, является изолированной молекулой ДНК. Другим примером изолированной молекулы ДНК является молекула химически синтезированной нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геном организма. Молекула нуклеиновой кислоты, которая выделена из отдельных видов, является меньшей, чем целая молекула ДНК хромосомы тех же видов.
«Молекулярная конструкция нуклеиновой кислоты» означает молекулу нуклеиновой кислоты или одно- или двухцепочечной, которая была модифицирована посредством человеческого вмешательства таким образом, что она содержит в себе участки нуклеиновой кислоты, скомбинированные и соединенные в расположении, не существующем в природе.
«Линейная ДНК» означает некольцевые молекулы ДНК, имеющие свободные 5' и 3' концы. Линейная ДНК может быть получена из замкнутых кольцевых молекул ДНК, таких как плазмидные, путем энзиматического переваривания или физического разрыва.
«Комплементарная ДНК (кДНК)» означает одноцепочечную молекулу ДНК, которая образована из матричной мРНК ферментом обратной транскриптазой. Типично, затравка, комплементарная участку мРНК, используется для инициации обратной транскрипции. Специалисты в данной области также используют термин кДНК, который относится к двухцепочечной молекуле ДНК, состоящей из такой одноцепочечной молекулы ДНК и ей комплементарной нити ДНК. Термин «кДНК» также относится к клону молекулы кДНК, синтезированному из РНК-матрицы.
«Промотор» означает нуклеотидную последовательность, которая направляет транскрипцию структурного гена. Типично, промотор локализован на 5' некодирующем участке гена, ближайшем к сайту начала танскрипции структурного гена. Последовательность элементов внутри промоторов, функция которых в инициации транскрипции, часто отличается консенсусными нуклеотидными последовательностями. Такие промоторные элементы включают РНК-полимеразные связывающие сайты, ТАТАпоследовательности, СААТ-последовательности, специфические для дифференциации элементы (ΌδΕκ; МсСейее е! а1., Μοί. Епбоеппо1. 7:551 (1993)), элементы ответа на циклический АМФ (СЯЕк), сывороточные элементы ответа (8ВЕк; Тге1зтап. 8ет1иагк ίη Сапсег Βίοί. 7:47 (1990)), элементы ответа на глюкокорикоид (СЯЕк) и связывающие сайты других факторов транскрипции, таких как СКЕ/АТЕ (О'ВеШу е! а1., 1. Βίοί. Сйет. 267:19938 (1992)), АР2 (Уе е! а1., 1. Βίοί. Сйет. 269:25728 (1994)), 8Р1, белок, связывающий цАМФ-элемент ответа (СВЕВ; ^οекеη, Сепе Ехрг. 3:253 (1993)) и октамерные факторы (см. вообще, \Ма(κοη е! а1., ебк., ΜοΕαιΕπ· Βίο1ο§\· οί !йе Сепе, 4!й еб. (Тйе Вен)ат1п/Ситттдк РиЬйкйтд ^трапу, 1пс. 1987) и Ьетащге апб Кциккеаи, Вюсйет. 1. 303:1 (1994)). Если промотор является индуцибельным промотором, тогда скорость траскрипции возрастает в ответ на индуцирующий агент. Наоборот, скорость траскрипции не регулируется индуцирующим агентом, если промотор является конститутивным промотором. Репрессируемые промоторы также известны.
«Коровый промотор» содержит нуклеотидные последовательности, существенные для функции промотора, включая ТАТА-бокс и последовательность начала транскрипции. Согласно этому определению коровый промотор может или не может иметь обнаруживаемую активность в отсутствие специфических последовательностей, которые могут усиливать активность, или придавать тканеспецифическую активность.
«Регуляторный элемент» означает нуклеотидную последовательность, которая изменяет активность корового промотора. Например, регуляторный элемент может содержать нуклеотидную последовательность, которая связывается с клеточными факторами, разрешающими исключительно транскрипцию, или
- 4 010594 предпочтительно в отдельных клетках, тканях или органеллах. Такие типы регуляторных элементов обычно ассоциированы с генами, которые экспрессируются в «клеточно-специфичной», «тканеспецифичной» или «органельно-специфичной» манере.
«Энхансер» означает тип регуляторного элемента, который может усиливать эффективность транскрипции, независимо от расстояния или ориентации энхансера относительно сайта начала транскрипции.
«Г етерологичная ДНК» относится к молекуле ДНК или популяции молекул ДНК, которая не существует естественным образом внутри данной хозяйской клетки. Молекулы ДНК, гетерологичные по отношению к конкретной клетке-хозяину, могут содержать ДНК, полученную из разновидностей клеткихозяина (например, эндогенная ДНК), при условии, что хозяйская ДНК скомбинирована с нехозяйской ДНК (например, экзогенной ДНК). Например, молекула ДНК, содержащая отрезок нехозяйской ДНК, кодирующей полипептид, пришита в результате манипуляций к отрезку хозяйской ДНК, содержащему транскрипционный промотор, считается, должна быть гетерологичной молекулой ДНК. Наоборот, гетерологичная молекула ДНК может содержать эндогенный ген, связанный в результате манипуляций с экзогенным промотором. В качестве другой иллюстрации, молекула ДНК, содержащая ген, полученный из клетки дикого типа, считается, должна быть гетерологичной ДНК, если такую молекулу ДНК внедряют в мутантную клетку, в которой отсутствует ген дикого типа.
«Полипептид» означает полимер аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, созданный или природным путем, или икусственно. Полипептиды меньше чем около 10 аминокислотных остатков обычно относят к «пептидам».
«Белок» означает макромолекулу, содержащую один или несколько полипептидных цепей. Белок может также содержать непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть добавлены к белку клеткой, в которой белок ситезируется, и будут изменяться вместе с типом клетки. В этом патенте белки определяют на основе их аминокислотной структуры основной цепи; заместители, такие как углеводные группы, вообще не указывают, но тем не менее, заместители могут присутствовать.
Пептид или полипептид, кодируемый нехозяйской молекулой ДНК, является «гетерологичным» пептидом или полипептидом.
«Интегрированный генетический элемент» означает отрезок ДНК, который внедрили в хромосому хозяйской клетки, после чего этот элемент вводили в клетку посредством манипуляций человека. В рамках настоящего изобретени, интегрированные генетические элементы чаще всего получают из линеаризованных плазмид, которые вводят внутрь клетки электропорацией или другими способами. Интегрированные генетические элементы передаются из исходной клетки-хозяина ее потомству.
«Клонирующий вектор» означает молекулу нуклеиновой кислоты, например плазмидной, космидной или бактериофага, которая обладает способностью реплицироваться автономно в хозяйской клетке. Клонирующие векторы типично содержат в себе один сайт или небольшое число сайтов узнавания рестрикционными эндонуклеазами, которые делают возможной инсерцию молекулы нуклеиновой кислоты в устанавливаемой манере без потери существенной биологической функции вектора, так же, как и нуклеотидной последовательности, кодирующей маркерный ген, который является подходящим для использования в идентификации и селекции клеток, трансформированных клонирующим вектором. Маркерные гены типично включают в себя гены, которые придают устойчивость к тетрациклину и устойчивость к ампициллину.
«Экспрессионный вектор» означает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей ген, который экспрессируется в хозяйской клетке. Типично, экспрессионный вектор содержит транскрипционный промотор, ген и терминатор транскрипции. Экспрессию гена обычно ставят под контроль промотра и такой ген, указывают, должен быть «операбельно связан с» промотором. Аналогично регуляторный элемент и коровый промотор являются операбельно связанными, если регуляторный элемент регулирует активность корового промотора.
«Рекомбинантный хозяин» означает клетку, которая содержит в себе гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, например клонирующий вектор или экспрессионный вектор. В настоящем контексте примером рекомбинантного хозяина является клетка, которая синтезирует слитый белок ТАСТРе из экспрессионного вектора.
«Интегративные трансформанты» означает рекомбинантные хозяйские клетки, в которых гетерологичная ДНК становится интегрированной в геномную ДНК клеток.
«Слитый белок» означает гибридный белок, экспрессированный молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидные последовательности по меньшей мере двух генов. Например, слитый белок ТАС1-иммуноглобулина содержит фрагмент рецептора ТАС1 и фрагмент иммуноглобулина. Как используют здесь, «фрагмент рецептора ТАС1» является участком внеклеточного домена рецептора ТАС1, который связывает по меньшей мере один из ΖΊΝΕΤ или ΖΊΝΕΤ. Фраза «иммуноглобулиновый фрагмент» имеет отношение к полипептиду, который содержит константную область иммуноглобулина. Например, иммуноглоубулиновый фрагмент может содержать константную область тяжелой цепи. Термин слитый белок «ТАС1-Рс» относится к слитому белку ТАС1-иммуноглобулина, в котором иммуноглобулиновый фрагмент содержит константные области иммуноглобулиновой тяжелой цепи, Сн2 и Снз.
- 5 010594
Термин «рецептор» означает ассоциированный с клеткой белок, который связывается с биологически активной молекулой, называемой «лиганд». Это взаимодействие опосредует эффект лиганда на клетку. В контексте связывание рецептора ТАС1, фраза «специфично связывает» или «специфичное связывание» относится к способности лиганда к конкурентному связыванию с рецептором. Например, ΖΤΝΡ4 специфически связывается с рецептором ТАС1, и это может быть показано путем наблюдения за конкуренцией за рецептор ТАС1 между меченым, для обнаружения, ΖΤΝΡ4 и немеченым ΖΤΝΡ4.
Рецепторы могут быть мембранно-связанными, цитоплазматическими или ядерными; мономерными (например, рецептор тиреотропина, бета-адренергический рецептор) или мультимерными (например, ΡΌΟΡ-рецептор, рецептор гормона роста, рецептор 1Ь-3, рецептор ОМ-С8Р, рецептор С-С8Р, рецептор эритропоэтина и рецептор 1Ь-6). Мембранно-связанные рецепторы характеризуются мультидоменной структурой, содержащей внеклеточный лиганд-связывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен, который типично вовлечен в передачу сигнала. У некоторых мембранно-связанных рецепторов внеклеточный лиганд-связывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен расположены в изолированных полипептидах, которые составляют полный функциональный рецептор.
Вообще, связывание лиганда с рецептором приводит в результате к конформационному изменению в рецепторе, которое вызывает взаимодействие между эффекторным доменом и другими молекулами (другой молекулой) в клетке, которое, в свою очередь, ведет к изменению клеточного метаболизма. Метаболические события, которые часто связаны с лиганд-рецепторными взаимодействиями, включают транскрипцию гена, фосфорилирование, дефосфорилирование, увеличение синтеза циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитольных липидов и гидролиз фосфолипидов.
Термин «секреторная сигнальная последовательность» означает последовательность ДНК, которая кодирует пептид («секреторный пептид»), который в качестве компонента большего полипептида направляет больший полипептид по секреторному пути клетки, в которой он синтезируется. Больший полипептид, как правило, расщепляется для удаления секреторного пептида во время прохождения по секреторному пути.
«Изолированный полипептид» означает полипептид, который является существенно свободным от примесных клеточных компонентов, таких как углеводы, липиды или другие белковые примеси, ассоциированные с полипептидом в природе. Типично получение изолированного полипептида включает в себя полипептид в высокоочищенном виде, т.е. по меньшей мере около 80%-ной чистоты, по меньшей мере около 90% чистоты, по меньшей мере около 95% чистоты, больше чем 95% чистоты или больше чем 99% чистоты. Одним из способов показать, что конкретное получение белка содержит изолированный полипептид, является появление одиночной полосы после электрофореза белкового препарата в полиакриламидном геле в додецилсульфате натрия (8Ό8) и окрашивания геля Кумасси бриллиантовым синим (Соошакые ВпШаШ В1ие). Однако термин «изолированный» не исключает присутствия такого же полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры, или альтернативно гликозилированные или производные формы.
Термин «аминоконцевой» «карбоксиконцевой» используют здесь для обозначения положений внутри полипептидов. Где позволяет контекст, эти термины используют со ссылкой на конкретную последовательность, или часть полипептида для обозначения пространственной близости, или относительного положения. Например, определенная последовательность, расположенная на карбоксильном конце, по отношению к исходной последовательности внутри полипептида является близлежащей к карбоксильному концу эталонной последовательности, но не обязательно находится в карбоксильном конце полного полипептида.
Термин «экспрессия» относится к биосинтезу продукта гена. Например, в случае структурного гена экспрессия включает в себя транскрипцию структурного гена в мРНК и трансляцию мРНК в один или несколько полипептидов.
Термин «вариант сплайсинга» используют здесь для обозначения альтернативных форм РНК, транскрибированных с гена. Варьирование сплайсинга происходит естественно вследствие использования альтернативных сайтов сплайсинга в транскрибированной молекуле РНК, или реже, между отдельно транскрибированными РНК молекулами и могут давать в результате несколько матричных РНК, транскрибированных из того же гена. Варианты сплайсинга могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин вариант сплайсинга также используют здесь для обозначения полипептида, кодируемого вариантом сплайсинга мРНК, транскрибированной с гена.
Как используют здесь, термин «иммуномодулятор» включает в себя цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, костимуляторные молекулы, гематопоэтические факторы и синтетические аналоги этих молекул.
Термин «пара комплемент/антикомплемент» означает неидентичные фрагменты, которые образуют нековалентносвязанную, стабильную пару при соответствующих условиях. Например, авидин и биотин (или стрептавидин) являются прототипичными представителями пары комплемент/антикомплемент. Другой пример пары комплемент/антикомплемент включает пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен, или эпитоп), смысловые/антисмысловые полинуклеотидные пары и тому подоб
- 6 010594 ное. В тех случаях, когда желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, пара комплемент/антикомплемент предпочтительно имеет аффинность связывания меньшую, чем 109 М-1.
«Фрагмент антитела» представляет собой фрагмент антитела, например Е(аЬ')2, Е(аЬ)2, ЕаЬ', ЕаЬ и тому подобное. Независимо от структуры фрагмент антитела связывается с тем же самым антигеном, который узнается интактным антителом.
Термин «фрагмент антитела» также включает искусственный или генноинженерный полипептид, который связывается со специфическим антигеном, например полипепептидами, состоящими из легкой цепи вариабельного участка, Εν''-фрагментами, состоящими из вариабельных участков тяжелой и легкой цепей, рекомбинантными одноцепочечными полипептидными молекулами, в которых легкие и тяжелые вариабельные участки связаны пептидным линкером (зсΕν-белками) и минимальными единицами узнавания, состоящими из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельный участок.
«Химерное антитело» означает рекомбинантный белок, который содержит в себе вариабельные домены и участки, определяющие комплементарность, полученные от антитела грызуна, тогда как остаток молекулы антитела получен от антитела человека.
«Гуманизированные антитела» представляют собой рекомбинантные белки, в которых мышиные участки, определяющие комплементарность моноклонального антитела, перенесли из тяжелой и легкой вариабельных цепей мышиного иммуноглобулина в вариабельный домен человека.
Как используют здесь, «терапевтический агент» означает собой молекулу или атом, который конъюгирован с фрагментом антитела для получения конъюгата, который является полезным для терапии. Примеры терапевтических агентов включают лекарственные препараты, токсины, иммуномодуляторы, хелатирующие агенты, соединения бора, фотоактивные агенты или красители и радиоизотопы.
«Детектируемая метка» представляет собой молекулу или атом, которые могут быть конъюгированы с участком антитела для получения молекулы, пригодной для обнаружения. Примеры детектируемых меток включают комплексоны, фотоактивные агенты, радиоизотопы, флуоресцентные агенты, парамагнитные ионы или другие маркерные агенты.
Термин «аффинная метка» используют здесь для обозначения отрезка полипептида, который может быть прикреплен ко второму полипептиду для обеспечения очистки или обнаружения второго полипептида или предоставления сайтов прикрепления второго полипептида к субстрату. В принципе, любой пептид или белок, для которого антитело или другой специфический связывающий агент является доступным, может быть использован в качестве аффинной метки. Аффинные метки включают полигистидиновый участок, протеинА (ЯПззои е! а1., ЕМВО 1. 4:1075 (1985); Шззои е! а1., Ме!йобз Еихуто1. 198:3 (1991)), глутатион-8-трансферазу (8шйй аиб 1ойизои, Сеие 67:31 (1988)), С1и-С1и-аффинную метку (Сгиззешеуег е! а1., Ргос. N11. Асаб. δει. И8А 82:7952 (1985)), Р-вещество, ЕЬАС-пептид (Норр е! а1., Вю!есйио1оду 6:1204 (1998)), стрептавидин-связывающий пептид или другие антигенные эпитопы или связывающие домены. Вообще, см. Еогб е! а1., Рго!еш Ехргеззюи аиб Ршгйсайои 2:95 (1991). Молекулы ДНК, кодирующие аффинные метки, являются доступными от коммерческих поставщиков (например, Рйагшаста Вю!есй, Р1зса!а^ау, N1).
«Оголенное антитело» означает целое антитело в противоположность фрагменту антитела, которое не конъюгировано с терапевтическим агентом. Оголенные антитела включают как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также определенные рекомбинантные антитела, например химерные и гуманизированные антитела.
Как используют здесь, «антительный компонент» включает в себя как целое антитело, так и антительный фрагмент.
«Иммуноконъюгат» означает конъюгат антительного компонента с терапевтическим агентом или детектируемой меткой.
«Полипептид-мишень» или «пептид-мишень» означает аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере один эпитоп и которая экспрессируется в клетке-мишени, такой как опухолевая клетка, или клетка, которая переносит антиген инфекционного агента. Т-клетки узнают пептидные эпитопы, представленные молекулой главного комплекса гистосовместимости на полипептидемишени или пептиде-мишени и типично лизируют клетку-мишень или призывают другие иммунные клетки к местонахождению клетки-мишени, таким образом, убивая клетку-мишень.
«Антигенный пептид» означает пептид, который свяжет молекулу главного комплекса гистосовместимости с образованием МНС-пептидного комплекса, который узнается Т-клеткой, таким образом, индуцируя цитотоксический ответ лимфоцитов при представлении Т-клетке. Таким образом, антигенные пептиды способны связываться с соответствующей молекулой главного комплекса гистосовместимости и индуцировать цитотоксический ответ Т-клеток, например клеточный лизис или выброс специфического цитокина, против клетки-мишени, которая связывает или экспрессирует антиген. Антигенный пептид может быть связан в контексте с молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса или II класса на клетке, представляющей антиген, или на клетке-мишени.
У эукариот, РНК-полимераза II катализирует транскрипцию структурного гена для получения мРНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть сконструирована таким образом, чтобы содержать матрицу РНК-полимеразы II, в которой РНК-транскрипт имеет последовательность, которая комплемен
- 7 010594 тарна последовательности специфической мРНК. РНК-транскрипт называют «антисмысловой РНК» и молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует антисмысловую РНК, называют «антисмысловой ген». Молекулы антисмысловой РНК способны связываться с мРНК, приводя в результате к ингибированию трансляции мРНК.
Вследствие погрешностей стандартных аналитических методов, понятно, что молекулярные массы и длины полимеров являются приблизительными. Если такие значения выражают как «около» X, или «приблизительно» X, то указанная величина X, будет понятным, является с точностью до ±10%.
3. Получение молекул нуклеиновых кислот, кодирующих белки ТАС1-иммуноглобулин.
Фиг. 1 предоставляет прогнозируемую аминокислотную последовательность ТАС1 человека (νοη Βϋ1ο\ν апб Вгат, 8с1епсе 278:138 (1997)). Полипептид ТАС1 содержит в себе следующие прогнозируемые элементы: (а) две богатых цистеином псевдоповторяющихся структуры, характерные для лигандсвязывающих доменов фактора некроза опухоли, (Ь) 62-аминокислотную «стволовую область», которая находится между лиганд-связывающими доменами и трансмембранным доменом, (с) 20тиаминокислотный трансмембранный домен и (б) 127-аминокислотный внутриклеточный домен. Аминокислотная последовательность не содержит прогнозированную гидрофобную аминоконцевую сигнальную последовательность.
Для того чтобы создать растворимую форму ТАС1 человека для использования в качестве ингибитора взаимодействия лиганд: нативный рецептор, создали слитый белок: внеклеточный домен ТАС1-Рс иммуноглобулин человека. Доступную последовательность ТАС1 человека использовали в качестве начальной точки конструирования молекулы слитого белка (νοη Βϋίον апб Вгат, 8с1епсе 278:138 (1997)). Эта исходная конструкция, обозначенная как «ТАС1-Ес4», включающая аминокислотные остатки с 1 по 154 полипептида ТАС1 и модифицированный участок Рс человека, описана ниже. Точку слияния 154-го остатка выбрали для присоединения как можно большего стволового участка ТАС1, при этом не включая любую возможную часть прогнозированного трансмембранного домена.
Поскольку нативный полипептид ТАС1 не содержит аминоконцевую сигнальную последовательность, то аминоконцевую сигнальную последовательность присоединяли к ТАС1 для создания секретируемой формы слитого белка ТАС1-Рс. Сигнальной последовательностью была модифицированная препоследовательность-пропоследовательность активатора плазминогена ткани человека. Модификации были включены для усиления расщепления сигнальной пептидазой и процессинга протеазоспецифичного фурина, и по этой причине эта последовательность была названа как «оптимизированная лидирующая последовательность 1РА (о1РА)». Последовательность о1РА (8Е0 ΙΌ N0:25) представлена ниже; модифицированные аминокислотные остатки заштрихованы.
Последовательность, кодирующая рекомбинантный слитый белок ТАС1-иммуноглобулина, встроили в экспрессионный вектор, который искусственно вводили в клетки яичника китайского хомячка.
-35 -30
Ме1 Азр А1а Ме( Ьуз Агд 61у 1_еи Суз Суз \/а11_еи Ьеи Ьеи Суз сайт разрезания сигнальной пептидазы
-20 | -10
С!у А1а \/а1 РИе \/а1 Зег Ьеи Зег 6Ιη 31и Не Нгз А1а С!и Ьеи фуриновый сайт разрезания
I
Агд Агд РНе Агд Агд
Трансфецированные клетки яичника китайского хомячка производили белок ТАС1-Рс4 на низком уровне от около 0,3 пкг/клетку/день. Вестерн-блот анализ белка ТАС1-Рс с козьей антисывороткой против Рс 1дО человека выявил две полосы, одна полоса была меньше, чем ожидаемый размер, приблизительно 48 кДа. Анализ аминокислотной последовательности очищенных белков выявил, что меньшая полоса отображала расщепление слитых белков по разным сайтам внутри корового участка ТАС1. Обращаясь к последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2, мажорный конец обнаружили на аминокислотных остатках 118 и 123, хотя белки также расщеплялись по аминокислотным остаткам в положениях 110, 139 и 141.
В дополнение к гетерогенности, вызванной расщеплением в стволовой области, наблюдали также гетерогенность в аминоконце (Ν-конце) и карбоксильном конце (С-конце). Со ссылкой на 8Е0 ΙΌ N0:2 мажорный аминоконец обнаружили в положениях аминокислотных остатков 1, 10 и 13. Различия в карбоксильных концах отражают естественную гетерогенность рекомбинантных иммуноглобулинов и слитых иммуноглобулиновых белков, которые включают неполное удаление лизинового остатка, кодированного с карбоксиконца. Другую причину гетерогенности обнаружили в вариабельной природе углеводной структуры, прикрепленной к кодированному иммуноглобулиновому СН2- домену фрагмента Рс.
Новые варианты ТАС1-Рс были синтезированы в ответ на наблюдаемую гетерогенность. Были соз
- 8 010594 даны конструкции, которые включали по меньшей мере одно из следующих изменений во фрагменте ТАС1: (1) части стволовой области ТАС1 удалили, (2) часть стволовой области ТАС1 заменили частью стволовой области ВСМА, (3) остаток аргинина в положении 119 изменили для элиминирования потенциального фуринового сайта расщепления, (4) остаток глутамина в положении 121 изменили для элиминирования (удаления) потенциального фуринового сайта расщепления, (5) остаток аргинина в положении 122 изменили для элиминирования потенциального фуринового сайта расщепления, (6) аминокислотный остаток в положениях 123 и 142 изменили на аминокислотные остатки, обнаруженные в соответствующих положениях ТАС1 мышей, (7) сигнальную последовательность οίΡΑ человека заменили сигнальной последовательностью вариабельного участка тяжелой цепи человека, (8) остаток валина в положении 29 был изменен на метионин, и сигнальная последовательность о!РА была присоединена в аминоконцевом положении к этому остатку, и (9) сигнальная последовательность о!РА была присоединена в аминоконцевом положении к остатку аланина в положении 30.
Модификации были также внесены в иммуноглобулиновую часть. Пять классов иммуноглобулинов идентифицировано у высших позвоночных: 1дС, 1дА, 1дМ, Ι§Ό и 1дЕ. Белки 1дС. Ι§Ό и 1дЕ являются характерно дисульфидно-связанными гетеротетрамерами, состоящими из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей. Типично 1дМ находится в виде пентамера тетрамера, несмотря на то, что 1дА существует в виде димера тетрамера.
1дС составляют большой класс, который существует в норме как второй наиболее обильный белок, обнаруженный в плазме. У человека ЦО состоит из четырех подклассов, обозначенных 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. Как показано на фиг. 2, каждая тяжелая цепь иммуноглобулина имеет константную область, которая состоит из константных участков белковых доменов (Сн1, шарнирного участка, СН2 и Сн3), которые являются неизменными для данного подкласса. Константные области тяжелой цепи класса 1дС отождествляют греческой буквой γ. Например, иммуноглобулины подкласса 1дС1 содержат константный участок тяжелой цепи γ1.
Фрагмент Ес, или Ее-домен, состоит из петлевых участков, Сн2- и Снз-доменов тяжелой цепи, связанных дисульфидными мостиками. В иммуноглобулиновых слитых белках Ес-домены подкласса 1дС1 часто используют в качестве иммуноглобулиновой части, поскольку 1дС1 имеет самый продолжительный период полураспада сыворотки, чем любой из сывороточных белков. Протяженный период полужизни сыворотки может быть желательной характеристикой белка при изучении животных и при потенциальном терапевтическом использовании для человека. Кроме того, подкласс 1дС1 обладает очень сильной способностью выполнять эффекторные функции, опосредованные антителом. Первичная эффекторная функция, которая может быть наиболее полезной у иммуноглобулинового слитого белка, является способность 1дС1-антител опосредовать связанную с антителом клеточную цитотоксичность. С другой стороны, это может быть нежелательной функцией слитого белка, который функционирует первично как антагонист. Идентифицировали несколько из специфичных аминокислотных остатков, которые являются важными для постоянной активности антител подкласса 1дС1. Включение или исключение таких специфических аминокислот, следовательно, предусматривает включение или выключение специфической пространственно-опосредованной иммуноглобулиновой активности.
Было получено шесть вариантов модифицированных Ес 1дС1 человека для создания слитых белков Ес. Ес-488 сконструировали для удобного клонирования слитого белка, содержащего Ес-участок γ1 человека, и он был сконструирован с использованием в качестве затравки константной области иммуноглобулина дикого типа γ1 человека. Беспокойство о потенциально вредных эффектах вследствие непарного цистеинового остатка привело к решению замены цистеина (аминокислотный остаток 24 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:6), который обычно связан дисульфидными связями с константной областью легкой цепи иммуноглобулина, на сериновый остаток. Дополнительное изменение было внедрено в кодирующий кодон, в 218 индексной ЕИ-позиции (аминокислотный остаток 22 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:6) для внедрения сайта узнавания фермента рестрикции ВдШ для облегчения последующих манипуляций с ДНК. Эти изменения были внесены в продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР), кодированный ПЦР-праймерами. Благодаря локализации сайта ВдШ и для того, чтобы достроить шарнирный участок Ес, кодоны 216 и 217 по индексной ЕИ-позиции (аминокислотные остатки 20 и 21 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:6) внедряли в партнерные последовательности слитого белка.
Ес4, Ес5 и Ес6 содержат в себе мутации для снижения эффекторных функций, опосредованных Ес, снижением связывания ЕсγΚ.I и связывания комплемента С1 с|. Ес4 содержит те же самые аминокислотные замещения, что были введены в Ес-488. Дополнительные аминокислотные замещения вводили для снижения потенциальных эффекторных функций, опосредованных Ес. В частности, замещения трех аминокислот вводили для снижения связывания ίογΕΙ. Эти замещения 234, 235 и 237 по индексной ЕИпозиции (аминокислотные остатки 38, 39 и 41 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:6). Показали, что замещения в этих положениях снижает связывание с ЕсγΚ.I (Энпсап а! а1., №11игс 332:563 (1988)). Такие аминокислотные замещения могут снижать связывание ЕсγΚЛа так же, как и связвание ίογΕΙΙΙ (Ъопбсгшапп е! а1., ХаИие 406:267 (2000); Ашек е! а1., 1. ]ттипо1. 764:5313 (2000)).
Несколько групп описали важность положений 330 и 331 по индексной позиции Европейского со
- 9 010594 общества (аминокислотные остатки 134 и 135 в 8ЕО ГО N0:6) в связывании комплемента С1с.| и последующей фиксации комплемента (Сапйс1й апй Моглкоп. ЕЕхр.Мсй. 773:1483 (1991); Тао с! а1.. ЕЕхр.Мсй. 778:661 (1993)). Аминокислотные замещения в этих положениях вводили в Ес4 для снижения связывания комплемента. Снз-домен Ес4 является идентичным таковому. который нашли в соответствующем полипептиде дикого типа. за исключением стоп-кодона. который изменили с ТОЛ на ТАА для элиминирования потенциального сайта метилирования йат. если клонированную ДНК наращивают в йат-плюс штамме Е.сой.
В Ес5 аргининовый остаток 218 по индексной позиции Европейского сообщества изменяли обратно на лизин. поскольку схему клонирования Вд111 не использовали при слиянии белков. содержащих этот конкретный Ес. Остаток последовательности Ес5 соответствует выше описанному для Ес4.
Ес6 является идентичным Ес5 за исключением того. что С-концевой лизиновый кодон элиминировали. С-концевой лизин зрелых иммуноглобулинов часто удаляют из зрелых иммуноглобулинов на посттрансляционной стадии перед секрецией из В-клеток. или удаляют во время циркуляции сыворотки. Следовательно. С-концевой лизиновый остаток типично не обнаруживают в циркулирующих антителах. Как в выше упомянутых Ес4 и Ес5. стоп-кодон в последовательности Ес6 заменили на ТАА.
Ес7 является идентичным Ес γ1 дикого типа за исключением аминокислотнго замещения в положении 297 по индексной позиции Европейского сообщества. локализованного в Сн2-домене. По индексной позиции Европейского сообщества Лкп-297 (аминокислотный остаток 101. 8Е0 ГО N0:6) является сайтом присоединения углевода. связанного с Ν-концом. Связанный с Ν-концом углевод вносит потенциальный источник вариабельности в рекомбинантно экспрессированный белок благодаря потенциальному ваьированию между группами в углеводной структуре. В попытке элиминирования этой потенциальной вириабельности изменяли Лкп-297 на остаток глутамина для предотвращения присоединения Νконцевого углевода по этому положению остатка. Углевод при 297 остатке также вовлечен в связывание Ес с ЕсγΚ.III (8опйсгтапп с! а1.. №1игс 406:267 (2000)). Однако удаление углевода должно вообще снизить связывание рекомбинантного Ес7. содержащего слитые белки. с ЕсγΚ.8. Так же. как и выше. стоп-кодон в последовательности Ес7 изменили на ТАА.
Ес8 является идентичным участку γ1 иммуноглобулина дикого типа. показанного в 8Е0 ГО N0:6. за исключением того. что цистеиновый остаток в положении 220 по индексной позиции Европейского сообщества (аминокислотный остаток 24 последовательности 8Е0 ГО N0:6) заменили сериновым остатком. Это изменение элиминировало цистеиновый остаток. который обычно связан дисульфидными связями с константным участком легкой цепи иммуноглобулина.
Иллюстративные конструкции ТАС1-Ес описывают в табл. 1.
Таблица 1
Иллюстративные конструкции слитого белка ТАС1-Ес
ТАС1(атО7-154)
ТАС1(К119и)
ТАС1(1-104)-ВСМА(42-54)
ТАС1М143-150
Информацию о локализации. мутациях и делециях аминокислотных последовательностей представляют в круглых скобках относительно аминокислотной последовательности 8Еф ГО N0:2.
ь Включает аминокислотные остатки с 1 по 154 8Еф ГО N0:2.
с Эта конструкция включает аминокислотные остатки с 1 по 104 8Еф ГО N0:2 (ТАС1) и аминокислотные остатки с 42 по 54 8Е(,) ГО N0:27 (ВСМА).
- 10 010594
Белки ТЛС1-Бе синтезировали рекомбинантными клетками яичника китайского хомячка, изолировали и анализировали с использованием Вестерн-блот анализа и анализа аминокислотной последовательности. Удивительно, что делеция первых 29 аминокислот с Ν-конца полипептида ТАС1 дала в результате десятикратное усиление синтеза слитых белков ТАС1-Бе клетками яичника китайского хомячка. Эта делеция также уменьшает расщепление полноразмерной стволовой области. Кроме того, расщепление внутри стволовой области подавлено или укорачиванием стволовой области ТАС1, или замещением стволовой области ТАС1 частью другой аминокислотной последовательностью (например, аминокислотной последовательностью стволовой области ВСМА).
Как описано в примере 4, функциональный анализ конструкций ТАС1-Бе показывает, что слитые белки ТАО(61-29)-Ес5, ТАС1(к1-29, 6107-154)-Ес5, ТАС1(к1-29, 6111-154)-Ес5 и ТАС1(к1-29, 6120-154)Бс5 имеют сходные аффиности связывания 2Т№4. Однако конструкции ТАС1(61-29)-Бе5, ТАСД61-29, 6111-154)-Ес5 и ТАС1(61-29, 6120-154)-Ес5, по-видимому, связывают больше ΖΊΝΡ4 на моль ТАС1-Рс, чем конструкция ТАС1(61-29, 6107-154)-Ес5. В зависимости от использования по назначению (т.е. терапевтическое, диагностическое или научное), могут быть использованы слитые белки ТАС1-Рс или с высокой, или с низкой емкостью. Кроме того, комбинация слитых белков ТАС1-Рс с высокой емкостью и с низкой емкостью делает возможным титрование ΖТNΕ2 или ΖТNΕ4.
Настоящее изобретение рассматривает слитые белки ТАС1-иммуноглобулина, которые включают в себя фрагмент рецептора ТАО, состоящий из аминокислотных остатков с 30 по 106 8ЕО ΙΌ N0:2, с 30 по 110 8ЕО ΙΌ N0:2, с 30 по 119 8Е0 ΙΌ N0:2 или с 30 по 154 8Е0 ΙΌ N0:2. Настоящее изобретение также включает в себя слитые белки ТАС1-иммуноглобулина, которые включают в себя фрагмент рецептора ТАС1, состоящий из аминокислотных остатков с 31 по 106 8Е0 ΙΌ N0:2, с 31 по 110 8Е0 ΙΌ N0:2, с 31 по 119 8ЕО ΙΌ N0:2 или с 31 по 154 8ЕО ΙΌ N0:2.
В более общем смысле, настоящее изобретение включает слитые белки ТАО-иммуноглобулина, причем фрагмент рецептора ТАО состоит из фрагмента аминокислотных остатков с 30 по 154 8Е0 ΙΌ N0:2, и причем фрагмент рецептора ТАО связывает по меньшей мере один из ΖТNΕ2 или ΖТNΕ4. Такие фрагменты содержат богатую цистеином псевдоповторяющуюся область и произвольно могут включать по меньшей мере один из ^концевых отрезков, которому свойственно положение аминоконца в богатой цистеином псевдоповторяющейся области, и стволовой отрезок, которому свойственно положение Сконца в богатой цистеином псевдоповторяющейся области. Подходящие богатые цистеином псевдоповторяющиеся области включают полипептиды, которые: (а) содержат по меньшей мере один из аминокислотных остатков с 34 по 66 8Е0 ΙΌ N0:2 и аминокислотные остатки с 71 по 104 8Е0 ΙΌ N0:2, (Ь) содержат как аминокислотные остатки с 34 по 66 8Е0 ΙΌ N0:2, так и аминокислотные остатки с 71 по 104 8Е0 ΙΌ N0:2, или (с) содержат аминокислотные остатки с 34 по 104 8Е0 ΙΌ N0:2.
Подходящие ^концевые отрезки включают следующие с обращением к 8Е0 Ш N0:2: аминокислотный остаток 33, аминокислотные остатки с 32 по 33, аминокислотные остатки с 31 по 33 и аминокислотные остатки с 30 по 33. Подходящие стволовые отрезки включают одну или несколько аминокислот аминокислотных остатков со 105 по 154 8Е0 Ш N0:2. Например, стволовой отрезок может состоять из следующих с обращением к 8Е0 ΙΌ N0:2: аминокислотного остатка 105, аминокислотных остатков со 105 по аминокислотных остатков со 106, аминокислотных остатков со 105 по 107, аминокислотных остатков со 105 по 108, аминокислотных остатков со 105 по 109, аминокислотных остатки со 105 по 110, аминокислотные остатки со 105 по 111, аминокислотных остатков со 105 по 112, аминокислотных остатков со 105 по 113, аминокислотных остатков со 105 по 114, аминокислотных остатков со 105 по 115, аминокислотных остатков со 105 по 116, аминокислотных остатков со 105 по 117, аминокислотных остатков со 105 по 118, аминокислотных остатков со 105 по 119, аминокислотных остатков со 105 по 120, аминокислотных остатков со 105 по 121, аминокислотных остатков со 105 по 122, аминокислотных остатков со 105 по 123, 105 по 124, аминокислотных остатков со 105 по 125, аминокислотных остатков со 105 по 126, аминокислотных остатков со 105 по 127, аминокислотных остатков со 105 по 128, аминокислотных остатков со 105 по 129, аминокислотных остатков со 105 по 130, аминокислотных остатков со 105 по 131, аминокислотных остатков со 105 по 132, аминокислотных остатков со 105 по 133, аминокислотных остатков со 105 по 134, аминокислотных остатков со 105 по 135, аминокислотных остатков со 105 по 136, аминокислотных остатков со 105 по 137, аминокислотных остатков со 105 по 138, аминокислотных остатков со 105 по 139, аминокислотных остатков со 105 по 140, аминокислотных остатков со 105 по 141, аминокислотных остатков со 105 по 142, аминокислотных остатков со 105 по 143, аминокислотных остатков со 105 по 144, аминокислотных остатков со 105 по 145, аминокислотных остатков со 105 по 146, аминокислотных остатков со 105 по 147, аминокислотных остатков со 105 по 148, аминокислотных остатков со 105 по 149, аминокислотных остатков со 105 по 150, аминокислотных остатков со 105 по 151, аминокислотных остатков со 105 по 152, аминокислотных остатков со 105 по 153, аминокислотных остатков со 105 по 154.
Дополнительные подходящие стволовые отрезки включают один или несколько аминокислот стволового отрезка ВСМА (т.е. аминокислотные остатки с 42 по 54 8Е0 ΙΌ N0:27). Например, стволовой отрезок может состоять из следующих аминокислотных остатков с обращением к 8Е0 ΙΌ N0:27: аминокислотного остатка 42, аминокислотных остатков с 42 по 43, аминокислотных остатков с 42 по 44, ами- 11 010594 нокислотных остатков с 42 по 45, аминокислотных остатков с 42 по 46, аминокислотных остатков с 42 по
47, аминокислотных остатков с 42 по 48, аминокислотных остатков с 42 по 49, аминокислотных остатков с 42 по 50, аминокислотных остатков с 42 по 51, аминокислотных остатков с 42 по 52, аминокислотных остатков с 42 по 53, аминокислотных остатков с 42 по 54.
В более общем смысле стволовая область может состоять из от 2 до 50 аминокислотных остатков.
Иммуноглобулиновый фрагмент слитого белка, описанного здесь, содержит по меньшей мере одну константную область иммуноглобулина. Предпочтительно иммуноглобулиноввый фрагмент представляет отрезок иммуноглобулина человека. Последовательность иммуноглобулина человека может быть аминокислотной последовательностью дикого типа или модифицированной аминокислотной последовательностью дикого типа, которая имеет по меньшей мере одну из аминокислотных мутаций, обсужденных выше. Аминокислотная последовательность иммуноглобулина человека может также варьировать от дикого типа, имея одну или несколько мутаций, характерных для известной аллотипической детерминанты. Табл. 2 показывает аллотипические детерминанты константной области 1дСу1 человека (Ри1тап, ТНс Р1акша Рго1еш8, Уо1. V, стр. 49-140 (Асабеш1с Ргекк, 1пс. 1987)). Индексная позиция Европейского сообщества (ЕЙ) 214, 356, 358 и 431 определяет известные аллотипы 1дСу1. Положение 214 находится в домене Сн1 константной области 1дСу1 и, следовательно, не находится внутри последовательности Ес. Последовательность Ес дикого типа последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:6 включает в себя аллотипы О1ш(1) и О1ш(2-). Однако часть Ес белка ТАС1-Ес может быть модифицирована для отображения всякой комбинации таких аллотипов.
Таблица 2 Аллотипические детерминанты константной области иммуноглобулина γ1 человека
Аллотип Аминокислотный остаток Положение аминокислоты ΕΙΙ индекс 5ЕО Ю N0:6
<Э1т(1) Азр, Беи 356,358 160,162
О1т(1-) <31и,Ме1 356,358 160,162
61т(2) С1у 431 235
61т(2-) А1а 431 235
61т(3) Агд 214
С!т(3-) Буз 214 ·
Примеры белков ТАС1-Ес, раскрытых здесь, содержат константные участки 1дС1 человека. Тем не менее, подходящие иммуноглобулиновые фрагменты также включают полипептиды, содержащие по меньшей мере одну константную область, такую как константая область тяжелой цепи любого из следующих иммуноглобулинов: 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дОА1, 1дОА2, Ι§Ό, 1дЕ и 1дМ. Преимущественно иммуноглобулиновые фрагменты, полученные из 1дС2 дикого типа или 1дС4 дикого типа, обеспечивают сниженную эффекторную функцию по сравнению с 1дС1 дикого типа или 1дС3 дикого типа. Настоящее изобретение также рассматривает слитые белки, которые содержат фрагмент рецептора ТАС1, как описано выше, и/или альбумин, или в2-макроглобулин.
Другим типом рецепторного слитого белка, который связывает ΖΕΝΕΤ или 2Т№4, является слитый белок ВСМА-иммуноглобулин. Исследования выполнили со слитым белком ВСМА-Ес4, в котором фрагмент ВСМА состоит из аминокислотных остатков с 1 по 48 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:27. Удивительно, что фармакокинетические исследования на мышах показали, что слитый белок ВСМА-Ес4 имел период полужизни около 101 ч, тогда как белок ТАС1-Ес имел период полужизни 25 ч. Таким образом, введение слитого белка ВСМА-иммуноглобулин может быть предпочтительным в некоторых клинических состояниях. Кроме того, комбинирование слитых белков ТАС1-иммуноглобулина и ВСМАиммуноглобулин может быть полезным для лечения некоторых состояний. Такая комбинационная терапия может быть достигнута введением слитых белков ТАС1-иммуноглобулина и ВСМАиммуноглобулин или введением гетеродимеров слитых белков ТАС1-иммуноглобулина и ВСМАиммуноглобулин.
Другим типом рецепторного слитого белка, который связывает ΖТNΕ4, является слитый белок, содержащий внеклеточных домен рецептора, обозначенный как Ζίηίτ12. Аминокислотную и нуклеотидную последовательности Ζίηίτ12 представляют в виде 8ЕЦ ΙΌ N0:59 и 8ЕЦ ΙΌ N0:60 соответственно. Пригодные части рецептора Ζΐηίτ12 включают полипептиды, содержащие аминокислотные остатки с 1 по 69 8Е0 ΙΌ N0:60 или аминокислотные остатки с 19 по 35 8ЕЦ ΙΌ N0:60.
Слитые белки настоящего изобретения могут иметь форму одноцепочечных полипептидов, димеров, тримеров или мультимеров, состоящих из димеров или тримеров. Димеры могут быть гомодимера- 12 010594 ми или гетеродимерами, и тримеры могут быть гомотримерами или гетеротримерами. Примеры гетеродимеров включают полипептид ТАС1-иммуноглобулин с полипептидом ВСМА-иммуноглобулин, полипептид ТАС1-иммуноглобулин с полипептидом Ζ!ηίτ 12-иммуноглобулин и полипептид ВСМАиммуноглобулин с полипептидом Ζ!ηί^12-иммуноглобулин. Примеры гетеротримеров включают полипептид ТАС1-иммуноглобулин с двумя полипептидами ВСМА-иммуноглобулин, полипептид ТАС1иммуноглобулин с двумя полипептидами Ζ!ηί^12-иммуноглобулин, полипептид ВСМА-иммуноглобулин с двумя полипептидами Ζίηί^12-иммуноглобулин, два полипептида ТАС1-иммуноглобулин с полипептидом ВСМА-иммуноглобулин, два полипетида ТАС1-иммуноглобулин с полипептидом Ζ!ηίτ12иммуноглобулин, два полипептида ВСМА-иммуноглобулин с полипептидом Ζΐπίτΐ2-иммуноглобулин и тример полипептида ТАС1-иммуноглобулин, ВСМА-иммуноглобулин и полипетид Ζ!ηίτ12иммуноглобулин.
В таких слитых белках фрагмент рецептора ТАС1 может содержать по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей 8ЕЭ ΙΌ N0:2: аминокислотные остатки с 30 по 154, аминокислотные остатки с 34 по 66, аминокислотные остатки с 71 по 104, аминокислотные остатки с 47 по 62 и аминокислотные остатки с 86 по 100. Фрагмент рецептора ВСМА может содержать по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей 8ЕЭ ΙΌ N0:27: аминокислотные остатки с 1 по 48, аминокислотные остатки с 8 по 41 и аминокислотные остатки с 21 по 37.
Фрагмент рецептора Ζ!ηίτ12 может содержать по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей 8ЕЭ ΙΌ N0:60: аминокислотные остатки с 1 по 69 и аминокислотные остатки с 19 по 35.
Слитые белки могут быть синтезированы с использованием методов ПЦР, использованных для конструирования иллюстративных молекул ТАС1-Ес, которые описаны в примерах. Однако специалисты в данной области могут использовать другие стандартные подходы. Например, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды ТАС1, ВСМА, Ζίπίτ12 или иммуноглобулин, могут быть получены скринингом кДНК или геномной библиотек человека с использованием полинуклеотидных проб, основанных на последовательностях, раскрытых здесь. Эти способы являются стандартными и хорошо известными (см., например, АикиЬе1 е! а1., (ебк.), 81юг1 Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 3гб Εάίΐίοη, стр. 4-1 по 4-6 (1о1т ^11еу & 8οηκ 1995) (АикиЬе1 (1995)); \Уи е! а1., Ме!Побк ίη Оепе Вю1:есйпо1оду, стр. 33-41 (СКС Ргекк, 1пс. 1997) (№и (1997)); АикиЬе1 (1995) стр. 5-1 по 5-6; \\'и (1997) стр. 307-327)).
Альтернативно, молекулы для конструирования иммуноглобулиновых слитых белков могут быть получены путем синтезирования молекул нуклеиновых кислот с использованием взаимных длинных олигонуклеотидов в качестве затравки и нуклеотидных последовательностей, описанных здесь (см., например, АикиЬе1 (1995) стр. 8-8 по 8-9). Принятые способы с использованием полимеразной цепной реакции предоставляют возможность синтеза молекул ДНК длиной по меньшей мере две тысячи нуклеотидов (Абагщ е! а1., Р1аШ Мо1ес. Вю1. 21:1131 (1993), ВатЬо! е! а1., РСК МеШобк амб Аррйсабощ 2:266(1993), ЭШоп е£ а1., Ике о£ !1е Ро1утегаке СПат Кеас!^ £ог !1е Кар1б СопкПисПоп о£ 8уп1Нс11с Оспск, ίη Ме!1обк ίη Мо1еси1аг В1о1оду, Уо1. 15:РСК Рго!осо1к: Сиггсп! Ме!1обк аиб Аррйсабощ, ^Ы!е(еб.), стр. 263-268, (Нитат Ргекк, 1пс. 1993), и Но1отасПик е! а1., РСК МеШобк Арр1. 4:299 (1995)).
Молекулы нуклеиновой кислоты данного изобретения могут также быть синтезированы «генной машиной» с использованием протоколов, таких как фосфоамидит-метод. Если для применения необходима химически синтезированная двухцепочечная ДНК, например, для синтеза гена или фрагмента гена, то каждую комплементарную цепь делают отдельно. Получение коротких генов (от 60 до 80 пар оснований) является технически простым и может быть выполнено синтезом комплементарных цепей и затем их отжига. Однако для получения более длинных генов (>300 пар оснований) могут понадобиться специальные стратегии поскольку эффективность сопряжения каждого цикла во время синтеза ДНК редко сотавляет 100%. Для преодоления этой проблемы искусственные гены (двухцепочечные) собирают в модулярной форме из одноцепочечных фрагментов, которые являются длиной от 20 до 100 нуклеотидов. В качестве обзоров по синтезу полинуклеотидов см., например, Сйск шчб Рак!етак, Мо1еси1аг Вю1ес1то1оду, Ргтар1ек шчб АррИсабощ о£ КесотЬтагИ ΩΝΛ (А8М Ргекк 1994), Иакига е! а1., Аппи. Кеу. ВюсПет. 53:323 (1984), и СПт1е е! а1., Ргос. №!1 Асаб. 8сг И8А 87:633 (1990).
4. Получение ТАС1-иммуноглобулиновых полипептидов.
Полипептиды данного изобретения могут быть получены в рекомбинантных клетках-хозяевах, следуя общепринятым способам. Для экспрессирования последовательности, кодирующей ТАС1иммуноглобулин, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, должна быть исправно связана с регуляторными последовательностями, которые контролируют транскрипционную экпрессию в экспрессионном векторе, и затем введена внутрь клетки-хозяина. В добавление к транскрипционным регуляторным последовательностям, таким как промоторы, энхансеры, экспрессионные векторы могут включать трянсляционные регуляторные последовательности и маркерные гены, которые являются пригодными для селекции клеток, которые несут экспрессионный вектор.
Экспрессионные векторы, которые являются подходящими для получения чужеродного белка в эукариотических клетках, типично содержат: (1) элементы прокариотической ДНК, кодирующей бактериальную точку начала репликации и маркер устойчивости к антибиотику для обеспечения роста и отбора
- 13 010594 экспрессионного вектора в бактерии-хозяине; (2) элементы эукариотической ДНК, которые контролируют инициацию транскрипции, например промотор; и (3) ДНК-элементы, которые контролируют процессинг транскриптов, таких как транскрипционная последовательность терминации/полиаденилирования.
Экспрессионные векторы могут также включать нуклеотидные последовательности, кодирующие секреторную последовательность, которая направляет гетерологичный полипептид по секреторному пути клетки-хозяина. Например, экспрессионный вектор может содержать нуклеотидную последовательность, которая кодирует ТАС1-иммуноглобулин и секреторную последовательность, полученную от любого секреторного гена. Как обсуждают выше, одной подходящей сигнальной последовательностью является сигнальная последовательность !РА. Пример сигнальной последовательности !РА представляют последовательностью 8ЕО ГО N0:25. Другой пригодной сигнальной последовательностью является Ун 26-10 сигнальная последовательность мыши. Мышиные антитела 26-10 описывает, например, №ат е! а1, Мо1. 1ттипо1. 27:901 (1990). Иллюстративные аминокислотные и нуклеотидные последовательности мышиной 26-10 Ун сигнальной последовательности представляют последовательностями 8Е0 ГО N0:61 и 8Е0 ГО N0:65 соответственно. 8Е0 ГО N0:62 раскрывает аминокислотную последовательность слитого белка ТАС1-Ре5, которая содержит мышиную 26-10 Ун сигнальную последовательность.
Белки ТАС1-иммуноглобулин данного изобретения могут быть экспрессированы в клетках млекопитающих. Примеры пригодных клеток-хозяев млекопитающих включают почечные клетки африканской зеленой обезьяны (Уего; АТСС СКБ 1587), почечные клетки человеческого эмбриона (293-НЕК; АТСС СИР 1573), клетки почек детенышей хомячка (ВНК-21, ВНК-570; АТСС СИР 8544, АТСС СИР 10314), почечные клетки собаки (МОСК; АТСС ССЬ 34), клетки яичника китайского хомячка (СНО-К1; АТСС ССЬ61; СНО ΌΟ44 (Сбакш е! а1., 8от. Се11. Мо1ес. СепеР 12:555, 1986)), клетки гипофиза крысы (ОН1; АТСС ССЬ82), 83-клетки НеЬа (АТСС ССЬ2.2), клетки гепатомы крысы (Η-4-ΙΙ-Ε; АТСС СИР1548). почечные клетки обезьяны, трансформированные 8У40 (С08-1; АТСС СИИ 1650) мышиные эмбриональные клетки (МН-3Т3; АТСС СИИ 1658).
Для млекопитающего хозяина регуляторные сигналы транскрипции и трансляции могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирусы, вирусы папилломы быка, вируса обезьяны или подобных, в которых регуляторные сигналы ассоциированы с конкретным геном, который имеет высокий уровень экспрессии. Пригодные транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности также могут быть получены из генов млекопитающих, таких как гены актина, коллагена, миозина и металлотионеина.
Регуляторные последовательности транскрипции включают промоторный участок, достаточный для прямой инициации синтеза РНК. Подходящие эукариотические промоторы включают промотор гена металлотионеина I мыши (Натег е! а1., 1. Мо1ес. Арр1. СепеР 7:273 (1982)), ТК-промотор вируса герпеса (МсКшдб!, Се11 37:355 (1982)), ранний промотор 8У40 (ВеиоШ е! а1, №1Шге 290:304 (1981)), промотор вируса саркомы Иоик (Согтап е! а1., Ргос. №111 Асаб. 8с1. И8А 79:6777 (1982)), промотор цитомегаловируса (Роескшд е! а1., Сепе 45:101 (1980)) и промотор вируса опухоли молочных желез мыши (см. вообще, Е1сбеуепу, Ехртеккюи оГ Еидшеетеб РтоРешк ш Маттабап Се11 сибиге, в Рго!еш Епдтеетшд: Рппс1р1е5 апб Ргасбсе, С1е1апб е! а1., (ебк), стр. 163-181 (1обп \УПеу & 8оп§, 1пс. 1996)). Одну полезную комбинацию промотора и энхансера обеспечили посредством миелопролиферативнго промотора вируса саркомы и энхансера цитомегаловируса человека.
Альтернативно прокариотический промотор, такой как РНК-полимеразный промотор бактриофага Т3, может быть использован для контроля синтеза белков ТАС1-иммуноглобулин в клетках млекопитающих, если прокариотический промотор регулируется эукариотическим промотором (Убой е! а1., Мо11. Се11. Вю1. 10:4529 (1990), и КаиГтап е! а1., №с1. Ас1б§ Иек. 79:4485 (1991)).
Экспрессионный вектор может быть введен внутрь клеток хозяина с использованием множества стандартных способов, включающих трансфекцию с фосфатом кальция, трансфекцию с помощью липосом, доставку с помощью микропроекции, электропорацию и т.п. Трансфецированные клетки могут быть отобраны и размножены для получения рекомбинантных клеток хозяина, которые содержат экспрессирующий вектор, устойчиво интегрированный в геном клеки-хозяина. Способы внедрения векторов в эукариотические клетки и методы отбора таких устойчивых трансформантов с использованием селективных маркеров описаны, например, Лп5пЬе1 (1995) апб Миггау (еб), Сепе ТгапкГег апб Ехртекыоп Рго!осо15 (Нитапа Ргекк, 1991).
Например, одним подходящим селективным маркером является ген, который предоставляет устойчивость к антибиотику неомицину. В этом случае отбор проводят в присутствии лекарственного препарата неомицинового типа, например С-418, или ему подобным. Системы отбора могут также быть использованы для усиления уровня экспрессии интересующего гена, процесс, называемый «амплификацией». Амплификацию осуществляют культивированием трансфектантов в присутствии низкого количества селективного агента, и затем увеличения количества селективного агента для отбора клеток, которые производят высокие уровни продуктов внедренных генов. Подходящим амплифицируемым селективным маркером является дигидрофолатредуктаза, которая придает устойчивость к метотрексату. Также могут быть использованы другие гены устойчивости к лекарственным препаратам (например, устойчивости к гигромицину, устойчивости ко многим лекарственным препаратам, к пуромицин-ацетилтрансферазе).
- 14 010594
Альтернативно маркеры, которые вводят в измененный фенотип, такие как зеленый флуоресцентный белок или поверхностные клеточные белки, такие как ί.Ό4. СЭ8. С1а§8 I МНС, плацентарная щелочная фосфатаза, могут быть использованы для отделения трансфецированных клеток от нетрансфецированных клеток путем так называемой РАС8-сортировки, или технологии разделения на намагниченных шариках.
Полипептиды ТАС1-иммуноглобулин могут также быть произведены культивированными клетками млекопитающих с использованием вирусной системы доставки. Примеры вирусов для этой цели включают аденовирусы, вирусы герпеса, вакцинные вирусы и аденоассоциированные вирусы (ААУ). Аденовирус, вирус с двухцепочечной ДНК, является наиболее изученным вектором переноса генов для доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты (см. обзор Вескег е! а1., Ме111. Се11 Вю1. 43:161 (1994), и Ооид1а5 аиб Сште1, 8с1еисе & Мебюше 4:44 (1997)). Преимущества аденовирусной системы включают размещение относительно крупных вставок ДНК, способность расти до высоких титров, способность инфецирования широкого ряда типов клеток млекопитающих и гибкость, которая позволяет использование с большим числом доступных векторов, содержащих различные промоторы.
Путем делеций частей аденовирусного генома могут быть помещены крупные вставки гетерологичной ДНК (вплоть до 7 т.п.). Такие вставки могут быть внедрены в вирусную ДНК прямым лигироанием, или гомологичной рекомбинацией с котрансфецированными плазмидами. Альтернативой является удаление существенного гена Е1 из вирусного вектора, что в результате дает неспособность к репликации, если ген Е1 не предоставлен клеткой-хозяином. 293 клетки человека, ифицированные аденовирусным вектором (АТСС, NN. СВЕ-1573, 45504, 45505), например, могут быть выращены в виде адгерентных клеток, или в суспензионной культуре при относительно высокой плотности клеток для получения существенного количества белка (см. Саш1ег е! а1., Су1о1ес1то1. 75:145 (1994)).
Специалисты в данной области могут изобрести пригодные экспрессионные векторы для получения слитых белков, описанных здесь, с клетками млекопитающих. Пример 4 описывает особенности одного из экспрессионных векторов. Другой пример экспрессионного вектора может содержать бицистронную экспрессионную кассету, которая включает часть энхансера цитомегаловируса человека, миелопролиферативный промотор вируса саркомы, нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, полиовирусные внутренние рибосомальные сайты входа, нуклеотидную последовательность, кодирующую дигидрофолатредуктазу мыши, за которой следует дополнительная поли-А поледовательность 8У40. Нуклеотидная последовательность 8ЕО ΙΌ N0:69 показывает конструкцию энхансер цитомегаловируса/миелопролиферативный ЬТВ-промотор вируса саркомы, в которой энхансер цитомегаловируса простирается от 1 нуклеотида до 407. Миелопролиферативный ЬТВ-промотор вируса саркомы в отсутствие участка негативного контроля простирается от 408 нуклеотида до 884 нуклеотида 8Е0 ΙΌ N0:69. Нуклеотидную последовательность миелопролиферативного ЬТВ-промотора вируса саркомы без участка негативного контроля представляют в 8Е0 ΙΌ N0:70.
Пример 1 описывает экспрессионный вектор, который содержит промотор цитомегаловируса для прямой экспресси трансгена рекомбинантного белка, иммуноглобулиновый интрон и сигнальную последовательность тканевого активатора плазминогена. Одним подходящим иммуноглобулиновым интроном является интрон Ун 26-10. 8Е0 ΙΌ N0:66 представляет иллюстративную нуклеотидную последовательность интрона Ун 26-10 мыши. Экспрессионный вектор может также включать 5'-нетранслируемую область (ИТВ), локализованную выше нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок ТАС1иммуноглобулин. Подходящая 5'-иТВ может быть произведена из гена Ун 26-10 мыши. 8Е0 ΙΌ N0:63 раскрывает нуклеотидную последовательность полезной нативной 5'-иТК. Ун 26-10 мыши, в то время как 8Е0 ΙΌ N0:64 показывает нуклеотидную последовательность 5'-иТВ Ун 26-10 мыши, которую оптимизировали на 3'-конце.
В качестве иллюстрации последовательность 8Е0 ΙΌ N0:67 предоставляет нуклеотидную последовательность, которая включает следующие элементы: нативную 5'-иТВ Ун 26-10 мыши (нуклеотиды с 1 по 51), сигнальную последовательность Ун 26-10 мыши (нуклеотиды с 52 по 97 и со 182 по 192), интрон Ун 26-10 мыши (нуклеотиды с 98 по 181), нуклеотидную последовательность, которая кодирует часть ТАСЧ (нуклеотиды со 193 по 435) и нуклеотидную последовательность, которая кодирует часть Рс5 (нуклеотиды с 436 по 1131). Нуклеотидная последовательность 8Е0 ΙΌ N0:68 отличается от 8Е0 ΙΌ N0:67 вследствие замещения 5'-иТВ Ун 26-10 (нуклеотиды с 1 по 51) нативной последовательности мыши оптимизированной последовательностью.
Белки ТАСЕиммуноглобулин могут также быть экспрессированы в других эукариотических клетках высших, таких как клетки птиц, грибов, насекомых, грибов или растений. Бакуловирусная система предоставляет эффективные способы внедрения клонированных генов внутрь клеток насекомых. Подходящие экспрессионные векторы основаны на вирусе ядерного полиэдроза Аи1одгарЙ8 саИГогшса (АсМ№У) и содержат хорошо известные промоторы, такие как промотор белка теплового шока 70 (йкр) ОгокорШа, предранний генный промотор (1е-1) вируса ядерного полиэдроза АнЮдгарНа сайГогшса и задержанно ранний промотор 39К, бакуловирусный промотор р10 и металлотионеиновый промотор ЭгоюрЫ1а. Второй способ создания рекомбинантных бакуловирусов использует систему, основанную на транспозонах, описанную Ьискоте (Ьискоте, е! а1., 1. У1го1. 67:4566 (1993)). Эта система, которая исполь- 15 010594 зует вектор для переноса, продается в наборе ВАС-!о-ВАС (ЫГс ТесБио1од1ек, ВоскуШе, МО). Эта система использует вектор для переноса РРА8ТВАС (ЫГе ТесБио1од1ек), содержащий транспозон Тп7 для перемещения ДНК, кодирующей полипептид ТАС1-иммуноглобулин, в бакуловирусный геном, поддерживающийся в Е.соБ в виде большой плазмиды, называемой Ьасииб. См. НШ-Регктк апб Роккее, 1. Сеп. У1го1. 77:971 (1990), Воптпд., е! а1., 1. Сеп. Уио1. 75:1551 (1994), и СБахепЬа1к апб Варорой, 1. Вю1. СБет. 270:1543 (1995). Кроме того, векторы для переноса могут включать слияние внутри рамки с ДНК, кодирующей эпитопную метку на С-конце или на Ν-конце экспрессированного полипептита ТАС1иммуноглобулин, например эпитопная метка С1и-С1и (Сгиккептеуег е! а1., Ргос. Νη1'1 Асаб. 8с1. 82:7952 (1985)). Используя способ, известный в данной области, вектор для переноса, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ТАС1-иммуноглобулин, переносят внутрь Е.соБ и отбирают бактериальные плазмиды, которые содержат прерывающийся 1ас2-ген, указывающий на рекомбинантные бакуловирусы. ДНК бактериальных плазмид, содержащую рекомбинантный бакуловирусный геном, затем выделяют, используя общепринятые способы.
Иллюстративный вектор РРА8ТВАС может быть модифицирован до существенной степени. Например, полиэдриновый промотор может быть удален и замещен бакуловирусным основным белковым промотором (также известным как промотор Рсог, р6.9 или МР-промотор), который является раннеэкспрессируемым при бакуловирусной инфекции, и было показано, что он должен быть полезным для экспрессии секретируемых белков (см., например, НБ1-Регкшк апб Роккее, 1. Сеп. Уио1. 71:971 (1990), Вопшпд., е! а1., 1. Сеп. Уио1. 75:1551 (1994), и СБахепЬа1к апб Варорой, 1. Вю1. СБет. 270:1543 (1995). В таких конструкциях векторов для переноса может быть использован короткий или длинный вариант основного белкового промотора. Кроме того, векторы для переноса могут быть сконструированы с секреторными сигнальными последовательностями, полученными из белков насекомых. Например, в таких конструкциях может быть использована секреторная сигнальная последовательность экдистероидных глюкозилтрансфераз (ЕСТ), или меллитина медоносных пчел Дпуйгодеп СогрогаБоп, Саг1кЬаб, СА) или бакуловирусного др67 (РБагМшдеп: 8ап О1едо, Са).
Рекомбинантные вирусы или бактериальные плазмиды используют для трансфекции клетокхозяина. Подходящие клетки-хозяина насекомых включают клеточные линии, полученные из ГРЬВ-8Г21, клеточной линии яичников куколки 8робор!ега Ггищрегба, таких как 8Г9 (АТСС СВЬ 1711), 8Г21АЕ и 8Г21 (1пуБгодеп СогрогаБоп; 8ап П1едо, Са) так же, как и клеток 8сБпе1бег-2 ИгокорБуБа и клеточной линии Н1СН Р1УЕО (1пуБгодеп), полученной из ТпсБорБыа ш (патент США № 5300435). Коммерчески доступная среда, не содержащая сыворотку, может быть использована для наращивания и для поддержания клеток. Подходящими средами являются 8Г900 II™ (ЫГе ТесБпо1ощек) или Е8Р 921™ (Ехргеккюп 8ук!етк) для клеток 8Г9; и Ех-се11О405™ (1ВН Вюкаепсек, Ьепеха, К8) или Ехргекк Р1уеО™ (ЫГе ТесБпо1ощек) для клеток Т.ш. При использовании рекомбинантного вируса клетки типично выращивают от плотности инокулята приблизительно 2-5х105 клеток до плотности 1-2х106 клеток, во время которой добавляют рекомбинантный вирусный маточный раствор при множественности заражения (МО1) от 0,1 до 10, более типично около 3.
Установленные способы производства рекомбинантных белков в бакуловирусных системах представлены Вабеу е! а1., Машри1а!юп оГ Васи1оу1гик Уес!огк, в Ме!Бобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1ите 7: Сепе ТгапкГег апб Ехргеккюп Рго!осо1к, Миггау (еб), стр. 147-168 (ТБе Нитапа Ргекк, 1пс. 1991), Ра!е1 е! а1., ТБе Ьаси1оу1гик ехргеккюп кук!ет, в ^NА С1ошпд 2:Ехргеккюп 8ук!етк, 2пб Еб1Боп, С1оуег е! а1. (ебк.), стр.205-244 (ОхГогб Ишуегкйу Ргекк 1995), АикиЬе1 (1995) на стр. с 16-37 по 16-57, ВюБагбкоп (еб.), Васи1оу1гик Ехргеккюп Рго!осо1к (ТБе Нитапа Ргекк, 1пс. 1995), и Ьискпоте, 1пкес! Се11 Ехргеккюп ТесБпо1оду, в Рго!ет Епщпееппд: Рппар1ек апб РгасБсе, С1е1апб е! а1. (ебк.), стр. 183-218 (1оБп ^Беу & 8опк, 1пс. 1996).
Клетки грибов, в том числе дрожжевые клетки, также могут быть использованы для экспрессии генов, описанных здесь. Особенно интересные в этом отношении представители дрожжей включают 8ассаготусек сегеуШае, РюЫа рак!опк и Р1сБ1а те1БапоБса. Подходящие промоторы для экспрессии в дрожжах включают промоторы от САШ (галактозы), РСК (фосфоглицеринкиназы), АИН (алкогольдегидрогеназы), АОХ1 (алкогольоксидазы), Н184 (гистидиндигидрогеназы) и прочие. Созданы многие дрожжевые клонирующие векторы и являются легкодоступными. Вектор может быть сконструирован для создания конструкций, использующих необходимые элементы для осуществления гомологичной рекомбинации в дрожжах (см., например, Ваутопб е! а1., ВюТесБпк|иек 26:134 (1999)). Например, такой экспрессионный вектор может включать последовательности ИВА3 и СЕ№АВ8 (автономно реплицирующуюся последовательность), требуемые для отбора и репликации в 8. сегеуШае. Другие пригодные векторы включают векторы на основе У1р, такие как У1р5, векторы УВр, такие как УВр17, векторы УЕр, такие как УЕр13, и векторы УСр, такие как УСр19. Способы трансформирования клеток 8. сегеуШае экзогенной ДНК и получения рекомбинантных полипептидов из этих клеток раскрыты, например, Кагакак1, патент США № 4599311, Ка\уакак| е! а1., патент США № 4931373, Вгаке, патент США № 4870008, \Уе1сБ е! а1., патент США № 5037743 и Миггау е! а1., патент США № 4845075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому селективным маркером, обычно устойчивостью к препарату или
- 16 010594 способностью расти в отсутствие специфического питательного вещества (например, лейцина). Пригодной векторной системой для использования в 8ассаготусск ссгсуШас является векторная система РОТ1, раскрытая Ка\\'акак| с! а1. (патент США № 4931373), которая позволяет трансформированным клеткам быть отобранными путем роста в глюкозосодержащей среде. Дополнительные подходящие промоторы и терминаторы для использования в дрожжах включают таковые из генов гликолитических ферментов (см., например, Катакак1, патент США № 4599311, Ктдктаии с! а1., патент США № 4615974 и В|Цсг патент США № 4977092) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также патенты США №№ 4990446, 5063154, 5139936 и 4661454.
В данной области известны системы трансформации на основе других дрожжей, включая Нап8спи1а ро1утогрйа, ЗсЫхозассНаготуссз ротЬс, К1иуусготусск 1асбк, К1иуусготусск ГгадШк, Ик!11адо тауб1к, ИсЫа рак!опк, Р1сЫа тсШапоНса, РюЫа дш11сгтопби и Сапб1ба та1!ока. См., например, О1сккоп с! а1., 1. Осп. М1сгоЪю1. 732:3459 (1986) и Сгсдд, патент США № 4882279. Клетки АкрсгдШик могут быть использованы в соостветствии со способом МсКшдй! с! а1., патент США № 4935349. Способы трансформирования Асгстошит сйгукодспит раскрыты 8итто с! а1., патент США № 5162228. Способы трансформирования №игокрога раскрыты ЬатЬо^й/, патент США № 4486533.
Например, применение Р1сЫа тсШапоНса в качестве хозяина для получения рекомбинантных белков раскрыто Раутопб в патенте США № 5716808, Ваутопб, патент США № 5736383, Раутопб с! а1., Усак! 74:11-23 (1998) и в международной публикации №№ \¥0 97/17450, \У0 97/17410, \У0 98/02536 и XV0 98/02565. Молекулы ДНК для использования в трансформированных Р. тсШапоНса обычно будут подготовлены в виде двухцепочечных, кольцевых плазмид, которые предпочтительно линеаризирут перед трансформацией. Для наработки полипептидов в Р. тсШапоНса промотором и терминатором в плазмиде может быть промотор гена Р. тсШапоНса, например ген утилизации спирта Р. тсШапоНса (АИ61 или АИ62). Другие пригодные промоторы включают в себя промоторы генов дигидроксиацетонсинтазы (ОНА8), формиатдегидрогеназы (ЕМО) и каталазы (САТ). Для облегчения интегрирования ДНК внутрь хромосомы хозяина предпочтительно иметь цельный экспрессионный отрезок плазмиды, фланкированный с обоих концов последовательностями хозяйской ДНК. Пригодным селективным маркером для использования в РюЫа тсбитокса является ген ΆΌΕ2 Р. тс^амШа, который кодирует фосфорибозил-5аминоимидазолкарбоксилазу (А1К.С; ЕС 4.1.1.21) и который позволяет клеткам хозяина абс2 расти в отсутствие аденина. Для крупномасштабных производственных процессов, где желательно минимизирование использования метанола, могут быть использованы клетки хозяина, в которых удалены оба гена, утилизирующих метанол (АИС1 и АИС2). Для наработки секретируемых белков в клетках хозяина могут отсутствовать гены вакуолярных протеаз (РЕР4 и РКВ1). Используют электропорацию для способствования внедрения плазмиды, содержащей ДНК, кодирующей полипептид интереса, внутрь клеток Р. тсШапокса. Клетки Р. тсШапоНса могут быть трансформированы электропорацией с использованием экспоненциально затухающего, пульсирующего электрического поля, имеющего мощность от 2,5 до 4,5 кВ/см и фиксированное время (!) от 1 до 40 мс, более предпочтительно около 20 мс.
Экспрессионные векторы могут также быть внедрены внутрь протопластов растений, интактных растительных тканей или внутрь изолированных растительных клеток. Способы внедрения экспрессионных векторов внутрь растительной ткани включают прямое инфицирование или совместное культивирование растительной ткани с АдгоЬас!сгшт !итсίас^сик, микропроэкционную доставку, инъекцию ДНК, электропорацию и прочие. См., например, НогксН с! а1., Зсюпсс 227:1229 (1985), К1ст с! а1., Вю1сс11по1оду 70:268 (1992) и М1к1 с! а1., Ргоссбигск Гог ШНобистд ЕогЦдп ^NА т!о Р1ап!к в МсШобк ш Р1ап! Мо1сси1аг Вю1оду апб ВюШсНпоШду, 61юк с! а1., (сбк.), стр. 67-88 (СРС Ргскк, 1993).
Альтернативно, белки ТАС1-иммуноглобулин могут быть произведены в прокариотических клетках хозяина. Подходящими промоторами, которые могут быть использованы для получения полипептидов ТАС1-иммуноглобулин в прокариотическом хозяине, являются промоторы, хорошо известные в данной области, и включают промоторы, допускающие узнавание полимеразами Т4, Т3 8р6 и Т7, промоторы бактериофага ламбда Рк и Ръ, промоторы Е.со11 !гр, гссА, теплового шока, 1асИУ5, !ас, 1рр-1ас8рг, рНоА и ΕκΖ, промоторы В.киЬННк, промоторы бактериофагов ВасШик, промоторы 81гср!отусск, промотор т! бактериофага ламбда, промотор Ь1а рВВ322 и промотор САТ гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы. Прокариотические промоторы рассмотрены СНск, 1. 1пб. МюгоЬюк 1:277 (1987), -№а!коп с! а1., Мо1сси1аг Вю1оду оГ !Нс Оспс, 4!Н Еб. (Всщатю Ситттк 1987) и АикиЬс1 с! а1., (1995).
Пригодные прокариотические организмы-хозяева включают Е.со11 и ВасШик киЬШик. Пригодные штаммы Е.со11 включают ВЬ21(ПЕ3), ВЕ21(ПЕ3)рЬук8, ВЕ21(ПЕ3)рЬукЕ, ЭНЕ 1)1141, ОН5, ПН51, ОН51Е, ОН51МСВ, ОН10В, ПН10В/р3, №118, С600, НВ101, 1М101, 1М105, 1М109, 1М110, К38, ВШ1, Υ1088, Υ1089, С8Н18, ЕВ1451 и ЕВ1647 (см., например, Вго^п (сб.) Мо1сси1аг Вю1оду ЬаЫах (Асабсшю Ргскк 1991)). Пригодные штаммы ВасШик киЬШик включают ВВ151, ΥВ886, М1119, М1120 и В170 (см., например, Нагбу, ВасШик С1ошпд МсШобк, ш ^NА С1ошпд: А Ргас!юа1 АрргоасН, 61оусг (сб.) (1КЬ Ргскк 1985)).
При экспрессии белка ТАС1-иммуноглобулин в бактерии, например в Е.со11, полипептид может быть аккумулирован в цитоплазме, типично в виде нерастворимых гранул, или может быть направлен в периплазматическое пространство бактериальной секретирующей последовательностью. В ранее рас
- 17 010594 смотренном случае клетки лизируют, а гранулы выделяют и денатурируют с помощью, например, гуанидинизотиоцианата или мочевины. Денатурированный полипептид может затем быть повторно свернут и димеризован растворением в денатурирующем агенте, например, диализом против раствора мочевины и сочетанием восстанавленного и окисленного глутатиона, с последущим диализом против буферносолевого раствора. В последнем случае полипептид может быть выделен из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме путем разрушения клеток (например, ультразвуком или осмотическим шоком) для высвобождения содержимого периплазматического пространства и выделения белка, таким образом, избегая необходимость денатурирования и повторного сворачивания.
Способы экспрессии белков в прокариотических «организмах» хозяина являются хорошо известными специалистам в данной области (см., например, ^1111ашз с1 а1., Е.хргсззюп оГ Гогсфп ргокшз ίη Е.со11 изшд р1азт1б уссЮгз апб ригШсайоп оГ зрссШс ро1ус1опа1 апНЬобШз, в ΌΝΛ С1ошпд 2: Е.хргсззюп 8у51ст5. 2пб Ебйюп С1оусг с1 а1., (сбз), стр. 15 (ОхГогб ишусгзйу Ргсзз 1995), \Уагб с1 а1., бспсйс Матри1айоп апб Е.хргсззюп оГ АпйЬобюз в Мопос1опа1 АпйЬобюз: Ргтар1сз апб Аррйсайопз, стр. 137 (^11су-Е1зз, 1пс. 1995), апб Осогдюи, Е.хргсззюп оГ Ргокшз, ш Вас1спа в РгсЛст Епдшссгтд: Ргшс1р1сз апб Ргасйсс, С1с1апб с1 а1., (сбз.), стр. 101 До1т \УПсу & 8опз, 1пс. 1996)).
Стандартные способы внедрения экспрессионных векторов в клетки бактерий, дрожжей, насекомых и растений представлены, например, АизиЬс1 (1995).
Общие способы экспрессии и получения чужеродного белка, произведенного клеточной системой млекопитающих, представлены, например, Е!сйсуспу, Е.хргсззюп оГ Епдтссгсб РгоГстз т МаттаПап Сс11 СиНигс в РгсЛст Епдтссгшд: Рг1пс1р1с> апб Ргасйсс, С1с1апб с1 а1., (сбз.), стр. 163 (ХУПсу-изз, 1пс. 1996). Стандартные способы выделения белка, произведенного бактериальной системой, предоставлены, например, Опззйаттсг с1 а1., Рипйсайоп оГ оусг-ргобиссб ргоГстз Ггот Е.сой сс11з, т ^NΛ С1ошпд2: Ехргсзз1оп 8уз1стз, 2пб Ебйюп, С1оусг с1 а1., (сбз.) стр. 59-92 (ОхГогб и шутку Ргсзз 1995). Принятые способы выделения рекомбинантных белков из бакуловирусной системы описаны КГсйагбзоп (сб.) Васи1оу1ги8 Ехргсзз1оп РгоЮсо1з (Т1с Нитапа Ргсзз, 1пс. 1995).
В качестве альтернативы, полипептиды настоящего изобретения могут быть синтезированы первоклассным твердофазным синтезом, частичными твердофазными методами, конденсацией фрагментов или традиционным жидкофазным синтезом. Эти методы синтеза хорошо известны в данной области (см., например, Мстйс1б, Г Ат. С1ст. 8ос. 85:2149 (1963), 81с\уаг1 с1 а1., 8ойб Р1азс Рср11бс 8уп!ксз1з, (2пб Ебйюп), Р1сгсс Сйстюа1 Со. 1984), Ваусг апб Карр, С1ст. РсрГ. РгоГ. 3:3 (1986), АЛсйоп с1 а1., 8оНб Р1азс РсрОбс 8уп111сз1з: А РгасОса1 Арргоасй (1ЯЬ Ргсзз 1989), Р1с1бз апб Со1отеюк, 8окб-Р11азс РсрОбс 8уп11сδίδ, МсГйобз ш Епхуто1оду Уо1итс 289 (Асабстк Ргсзз 1997), и Ь1оуб-№1Шатз с1 а1., Сйстка1 Арргоасйсз Ю 11с 8уп!ксз1з оГ Рср(1бс8 апб РгоГсшз (СКС Ргсзз, 1пс. 1977)). Изменения в стратегиях общего химического синтеза, например «нативное химическое лигирование» и «лигирование экспрессированных белков», также являются стандартными (см., например, Ра\узоп с1 а1., 8с1спсс 266:776 (1994), Наскспд с1 а1., Ргос. №Г'1 Асаб. 8ск И8А 94:7845 (1997), Ратезоп, Мскобз ЕпхутоГ 287:34 (1997), Мшг сГ а1., Ргос. №Г1 Асаб. 8οΐ. И8А 95:6705 (1998) и Зсусгшоу апб Мшг, I. Вю1. С1ст. 273:16205 (1998)).
5. Анализ слитых белков ТАС1-иммуноглобулинов.
Функция слитых белков ТАС1-иммуноглобулинов может быть оценена с использованием разнообразных подходов для оценки способности слитых белков связывать ΖТNΕ4 или ΖТNΕ2. В качестве иллюстрации пример 4 предоставляет способы измерения аффинности связывания и емкости связывания для ΖТNΕ4.
Альтернативно слитые белки ТАС1-иммуноглобулина могут быть охарактеризованы по способности ингибировать стимуляцию В-клеток человека растворимым ΖТNΕ4, как описано Огозз с1 а1., 1п!сгпайопа1 РиЬНсайоп №. \УО 00/40716. Кратко, В-клетки человека выделяют из периферических мононуклеарных клеток крови с использованием намагниченных шариков СР19 и магнитной системы для разделения УапоМасз (М11!спу1 ВюГсс АиЬигп, СА) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Очищенные В-клетки смешивают с растворимым ΖТNΕ4 (25 нг/мл) и рекомбинантным 1Ь-4 человека (10 нг/мл, РЬагтшдсп) и клетки вносят в лунки 96-луночных круглодонных планшетов при 1х105 клеток на лунку.
Растворимые белки ТАС1-иммуноглобулин могут быть растворены от около 5 мкг/мл до около 6 нг/мл и инкубированы с В-клетками в течение пяти дней, с подачей импульсов 1 мкКи Н3-тимидина на лунку в течение ночи в четвертый день. В качестве контроля белок ТАС1-иммуноглобулин может также быть инкубирован с В-клетками и 1Ь-4 без ΖΊΝΡ4. Для наращивания планшеты помещали в прибор для наращивания Раскагб и просчитывали с использованием счетчика Раскагб.
Для оценки трех слитых белков ТАС1-Рс использовали общий подход. Хотя все слитые белки ингибировали пролиферацию В-клеток, конструкции ТАС1(б1-29, б111-154)-Рс5 и ТАС1(б1-29, б120-154)-Рс5 были более эффективными, чем ТАС1(б1-29, б107-154)-Рс5.
Твердо установившиеся экспериментальные модели на животных возможны для тестирования эффективности белков ТАС1-иммуноглобулин ш у|уо при определенных болезненных состояниях. Например, белки ТАС1-иммуноглобулин могут быть проанализированы в ряде экспериментальных моделей аутоиммунныых заболеваний на животных, такими как родственные линии мышей МКЕ-Грг/Грг или Р1
- 18 010594 близкородственных линий мышей ΝΖΒχΝΖν, которые служат в качестве модели 8ЬЕ (системной красной волчанки). Такие экспериментальные модели на животных известны в данной области (см., например, СоНеп апб МШег (ебк.), ЛиЮпптипс Э^еаке Мобе1к: А СшбеЬоок (Асабетк Ргекк, 1пс. 1994).
Потомство от скрещивания между мышами новозелландской черной №\ν Ζеа1аηб В1аск (ΝΖΒ) и новозелландской белой №\ν Ζеа1аηб νΐιί^ (ΝΖν) обнаруживает спонтанную форму 8ЬЕ, которая имеет близкое сходство с 8ЬЕ человека. Потомство мышей, известное как ΝΖΒν, в возрасте одного месяца начинает нарабатывать антитела 1дМ против Т-клеток и в возрасте от пяти до семи месяцев аутоантитела против ДНК являются доминирующим иммуноглобулином. Вклад этих аутоантител, особенно тех, которые направлены против одноцепочечной ДНК, связан с развитием гломерулонефрита, который клинически проявляется как протеинурия, азотемия и смерть от почечной недостаточности.
Почечная недостаточность является главной причиной смертности у мышей, пораженных спонтанной 8ЬЕ, а у линии ΝΖΒν этот процесс является хроническим и уничтожительным. Заболевание является более быстрым и тяжелым у женских особей, чем у мужских, со средней жизнеспособностью в течение только 245 дней по сравнению с 406 днями для мужских особей. Несмотря на то, что многие из мышей женских особей в 5-7 месячном возрасте будут с клинически выраженной протоуренией, некоторые особи могут быть гораздо моложе или старше при проявлении у них симптомов. Смертельный иммунный нефрит, наблюдаемый у мышей ΝΖΒν, является очень похожим на наблюдаемый гломерулонефрит 8ЬЕ у человека, что делает эту спонтанную экспериментальную модель на мышах очень привлекательной для исследования лечений потенциальной 8ЬЕ (Рийегтап апб №рагйек, Мигше Мобе1к о£ 8роп1апеоик 8ук1ет1с Ьирик Егукетаккик, ίη Аик1ттипе П1кеаке Мобе1к: А СшбеЬоок, стр. 217-234 (Асабетк Ргекк, 1пс., 1994); МоНап еί а1., 1. 1ттипо1. 754:1470 (1995); и Оа1к11 еί а1., 1. 1ттипо1. 759:3104 (1997)).
Как описано Сгокк еί а1., международная публикация № ν0 00/40716, белки ТАС1-иммуноглобулин могут быть введены мышам ΝΖΒν для выявления их подавляющего эффекта на В-клетки в течение пятинедельного периода в среднем, как полагают, что наработка антител к В-клеткам у мышей ΝΖΒν достигает высокого уровня. Кратко, 100 женских особей мышей 8-недельного возраста Р1 (ΝΖΒ х ΝΖν) могут быть разделены на шесть групп по 15 особей в каждой. Перед введением мышей поверяют один раз в месяц на белок в моче и отбирают кровь для СВС и заготовки сыворотки. Сыворотка может быть проанализирована на наличие аутоантител. Поскольку протеинурия является выраженным признаком гломерулонефрита, то уровень белка в моче измеряют показателем уровня с регулярными интервалами в течение периода исследования. Введение можно начинать, когда мыши будут приблизительно в пятимесячном возрасте. Мыши получают внутрибрюшинные инъекции только носителя (фосфатно-солевого буферного раствора), или ТАС1-иммуноглобулина человека (контрольный белок), или ТАС1иммуноглобулина (например, от 20 до 100 мкг испытуемого белка на дозу) три раза в неделю в течение пяти недель.
В течение лечения кровь собирают дважды и соберут по меньшей мере дважды после лечения. Значения показателей уровней в моче для протеинурии и значения масс тела определяют каждые две недели после начала лечения. Значения показаний для крови, мочи и массы тела собирали во время эвтаназии. Селезенку и тимус отделяли для анализа сортировки клеток, обработанных флуоресцентным агентом, и для гистологии. Субмандибулярные слюнные железы, цепь брыжеечных лимфатических узлов, печеночную долю с желчным пузырем, слепую кишку и толстую кишку, желудок, тонкий кишечник, поджелудочную железу, правую почку, надпочечник, язык с трахеей и пищеводом, сердце и легкие также собирали для гистологии.
Модели на мышах использовали для экспериментов по аллергическому энцефаломиелиту в качестве инструмента для исследования как механизмов заболеваний, связанных с иммунитетом, так и способов потенциального терапевтического вмешательства. Модель имеет сходство с рассеянным склерозом человека и приводит к демиелинизации, как результату активации Т-клеток на нейробелки, такие как основной белок миелина, или протеолипидный белок. Инокуляция антигеном приводит к индуцированию СЭ4+, Т-клеток II класса (ТН1), заключенных в МНС. Изменения в процедуре экспериментального аллергического энцефаломиелита могут породить острые, хронически-рецидивные или пассивноперенесенные варианты модели ^ешЬегд еί а1., I. 1ттипо1. 762:1818 (1999); МуаЬа еί а1., Се11. 1ттипо1. 186:94 (1999); и С1аЬшкк1, Мек. Гп/лт. 288:182 (1997)).
Сгокк еί а1., международная публикация № ν0 00/40716, описывает один подход к оценке эффективности белков ТАС1-иммуноглобулин в улучшении симптомов, связанных с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом. Кратко, 25 женских особей мышей Р1 РЬх81Ь (12-недельного возраста) подвергали подкожному инъецированию антигеном 125 мкг/мышь (антигеном является миелиновый протеолипидный белок, РЬР, остатки 139-151), приготовленным в полном адъюванте Фрейнда. Мышей делят на пять групп по пять мышей в каждой. Внутрибрюшинные инъекции токсина коклюша (400 нг) производили в 0 день и во второй. Группам давали 1х, 10х или 100-кратную дозу белка ТАС1-иммуноглобулин, одна группа получает только растворитель, и одна группа не получает лечение. Профилактическая терапия начинается в 0 день, лечебное вмешательство начинается на 7 день или при появлении клинических признаков. Признаки заболевания, потеря веса и паралич, обнаруживаются приблизительно на 10-14 день и сохраняются в течение приблизительно одной недели. Животных оценивают ежедневно
- 19 010594 посредством сбора массы тела и определения клинической оценки соответствия распространения их симптомов. Клинические признаки экспериментального аллергического энцефаломиелита появляются в течение 10-14 дней инокуляции и сохраняются приблизительно в течение одной недели. В конце исследования всех подвергают эвтаназии путем избыточной дозировки газа и вскрывают. Мозг и позвоночник собирают для гистологии или замораживают для анализа мРНК. Результаты массы тела и клинической оценки вносят на каждую особь или на группу.
В экспериментальной модели на животных по изучению индуцированного коллагеном артрита у мышей развивался хронический воспалительный артрит, который имеет близкое сходство с ревматоидным артритом человека. Поскольку индуцированный коллагеном артрит обнаруживает сходные с ревматоидным артритом иммунологические и патологические признаки, то это делает его идеальной моделью для скрининга потенциальных противовоспалительных компонентов у человека. Другим преимуществом использования модели по изучению индуцированного коллагеном артрита является то, что механизмы его патогенеза известны. Идентифицированы Т- и В-клеточные эпитопы на коллаген II типа и определены различные иммунологические (замедленная гиперчувствительность и антитела против коллагена) и противовоспалительные (цитокины, хемокины, ферменты, разрушающие матрикс) параметры, относящиеся к иммуно-опосредованным артритам, и могут быть использованы для оценки эффективности тестируемых компонентов в моделях (\Уоо1еу. Сигг. Ορίη. Кйеит. 3:407 (1999); ^1Шатк е1 а1., 1ттипо1. 89:9784 (1992); Муегк е! а1., Ь1ке 8οΐ. 67:1861 (1997); и \\ апд е! а1., 1ттипо1. 92:8955 (1995)).
Сгокк е1 а1., международная публикация № \¥0 00/40716, описывает способ оценки эффективности белков ТАС1-иммуноглобулин в улучшении симптомов, ассоциированных с артритом, индуцированным коллагеном. Кратко, восьминедельных мужских особей мышей ΌΒΆ/1 I (Ласккоп ЬаЬк) делят на группы по пять мышей в группе и производят две подкожные инъекции коллагена от 50 до 100 мкл в концентрации 1 мг/мл (коллаген цыпленка или бычий) с интервалами в три недели. Одна контрольная (группа) не получает инъекции коллагена. Первый инъекционный раствор приготовлен в полном адъюванте Фрейнда, а второй инъекционный раствор приготовлен в неполном адъюванте Фрейнда. Белок ТАС1иммуноглобулин вводят с профилактической целью во время или перед вторым инъецированием, или после того, как животное обнаружит два или больше клинических показателей, которые сохраняются по меньшей мере 24 ч. Животные начинают демонстрировать симптомы артрита после второй инъекции коллагена, обычно в течение от двух до трех недель. Например, ТАС1-Рс, контрольный белок, 1дРс или фосфатно-буферный раствор (растворитель) могут быть введены с профилактической целью, начиная с семи дней до начала второго инъецирования (день -7). Белки могут быть введены в (количестве) 100 мкг, даваемые три раза в неделю в виде 200 микролитровой внутрибрюшинной инъекции и продолжающейся в течение четырех недель.
В экспериментальной модели на животных по изучению индуцированного коллагеном артрита степень заболевания оценивают в каждой лапке с использованием циркуля для определения толщины лапки и задания клинической оценки каждой лапке. Например, клиническая отметка «0» означает нормальная мышь, отметка «1» означает, что один или больше пальцев являются воспаленными, отметка «2» означает слабое воспаление лапок, оценка «3» означает среднее воспаление лапок и оценка «4» означает тяжелое воспаление лапок. Животных подвергают эвтаназии после того, как устанавливают заболевание в течение установленного периода времени, обычно семи дней. Лапки собирают для гистологического анализа, или для анализа мРНК, а сыворотку собирают для анализа иммуноглобулинов и цитокинов.
Миастения гравис является другим аутоиммунным заболеванием, для которого экспериментальные модели на мышах являются пригодными. Миастения гравис является нарушением нервно-мышечной проводимости, затрагивающим выработку аутоантител, направленных против никотинового ацетилхолинового рецептора. Это заболевание является приобретенным или наследственным с клиническими признаками, включающими огромную слабость и утомляемость при напряжении.
Установлена экспериментальная модель на мышах миастении гравис (С1пк1абокк е1 а1., Ек1аЬНк11теп1 ок а Мойке Мобе1 ок МуакШеша дга\ак \У1пс11 Мтпск Нитап МуакШеша дга\аб Ра!йодепек1к ког 1ттипе [Щег^'е^/оп, т 1ттипоЬю1оду ок РгсИетк апб Рерббек VIII, А1акк1 апб В1х1ег (Ебк.), стр. 195-199 (1995)). Экспериментальная аутоиммунная миастениа гравис является заболеванием, опосредованным антителами, охарактеризованным наличием антител к ацетилхолиновому рецептору. Эти антитела разрушают рецептор, приводя к повреждению нейромускульных электрических импульсов, выражающихся в мышечной слабости. В экспериметальной модели для миастении гравис мышей иммунизировали никотиновым ацетилхолиновым рецептором. Клинические признаки миастении гравис становятся очевидными через неделю после второй иммунизации. Экспериментальную миастениа гравис оценивают нескольким способами, включая измерение уровней сыворотки антител к рецептору ацетилхолина, радиоиммунологический анализ (Сйпк!абокк апб ИаирЫпее, I Iттиηο1. 136:2437 (1986); Ыпбк!гот е1 а1., МеШобк Епхуток 74:432 (1981)), измерение мышечного рецептора ацетилхолина, или электромиографию (Со11дап е! а1., (Ебк.), РгоЮсо1к ш ^типо^ду. ^1. 3, стр. 15.8.1 (Лойп ^11еу & 8опк, 1997)).
Эффект ТАСЛ-иммуноглобулин на экспериментальную миастениа гравис может быть установлен введением слитых белков во время проводящейся клинической миастениа гравис на мышах В6. Например, 100 особей мышей В6 иммунизируют 20 микрограммами (20 мкг) ацетилхолинового рецептора в
- 20 010594 полном адъюванте Фрейнда в дни 0 и 30. Приблизительно от 40 до 60% мышей проявят от умеренной (степень 2) до тяжелой (степень 3) клинической миастении гравис после повышения уровня рецептора ацетилхолина. Мышей с клиническим заболеванием 2-й и 3-й степени делят на 3 группы (с одинаковыми степенями заболевания) и взвешивают (мыши вместе со слабостью также теряют в весе, так они испытывают затруднение в потреблении пищи и воды) и отбирают кровь для сыворотки (для предварительной очистки антител против рецептора ацетилхолина и уроня изотипов). Группу А инъецируют ГР в фосфатно-солевом буферном растворе, группу В инъецируют внутрибрюшинно ^С-Ес человека в качестве контрольного белка (100 мкг) и группу С инъецируют 100 мкг ТАСЧ-Ес три раза в неделю в течение четырех недель. Мышей просматривают на клиническую мышечную слабость дважды в неделю и взвешивают и отбирают кровь для сыворотки через 15 и 30 дней после начала введения. Цельную кровь собирают на 15-й день для определения соотношения клеток Т/В с помощью анализа сортировки флуоресцентноактивированных клеток, с использованием маркеров В220 и ΕΌ5. Выживших мышей убивают после 3045 дней после начала лечения и их тела замораживают для последующего выделения рецептора ацетилхолина для определения потери мышечного рецептора ацетилхолина, первичной патологии в миастениа гравис (см., например, Сойдаи е! а1., (Ебз.), Рго!осо1з ίη йптииокду. Уо1. 3, стр. 15.8.1 (Чойи XV Неу & 8оиз, 1997)).
Сывороточные антитела к мышиному мышечному рецептору ацетилхолина могут быть определены установленным радиоиммунологическим анализом, а изотипы антител против рецептора ацетилхолина ЦдМ, ТдС1, !дС2Ь и !дС2с) определяют методом ЕЫ8А. Такие методы известны. Определяют эффекты ТАСЕиммуноглобулина на текущую клиническую миастениа гравис, антитела против рецептора ацетилхолина и уровень изотипов, и на потерю мышечного ацетилхолинового рецептора.
Приблизительно 100 мышей может быть иммунизировано 20 мкг рецептора ацетилхолина в полном адъюванте Фрейнда на 0 и 30 день. Мышей с клинической миастениа гравис делят на четыре группы. Группу А инъецируют внутрибрюшинно 100 мкг конрольного Ес, группу В инъецируют 20 мкг конрольного Ес, группу С инъецируют 100 мкг ТАСЧ-Ес и группу Ό инъецируют 20 мкг ТАСЧ-Ес три раза в неделю в течение четырех недель. Мышей взвешивают, а кровь отбирают для сыворотки перед и после 15 и 30 дней после начала лечения. Сыворотку исследуют на антитела против рецептора ацетилхолина и изотипы, как описано выше. Потеря мышечного рецептора ацетилхолина может также быть измерена.
Другие анализы слитых белков ТАСЕиммуноглобулинов могут быть определены специалистами в данной области.
6. Получение конъюгатов ТАСЕиммуноглобулин.
Настоящее изобретение включает в себя химически модифицированные ТАСЕиммуноглобулиновые композиции, в которых полипептид ТАСЕиммуноглобулин связан с полимером. Типично, полимер является водорастворимым, так что иммуноглобулиновый конъюгат не преципитируется в водной среде, такой как физиологическая среда. Примером пригодного полимера является полимер, который модифицировали, чтобы в его состав входила одна реакционноспособная группа, например активный сложный эфир для ацилирования или альдегид для алкилирования. Таким образом, может быть проконтролирована степень полимеризации. Примером реакционноспособного альдегида является пропионовый альдегид полиэтиленгликоля, или моно-(С1-С10)алкокси, или арилоксипроизводные от них (см., например, Натз, е! а1., патент США № 5252714). Полимер может быть разветвленным или неразветвленным. Кроме того, для получения ТАСЕиммуноглобулиновых конъюгатов могут быть использованы смеси полимеров.
ТАСЕиммуноглобулиновых конъюгаты, используемые для терапии, могут содержать фармацевтически приемлемые водорастворимые полимерные компоненты. Подходящие водорастворимые полимеры включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-ПЭГ, моно-(С1-С10)алкокси-ПЭГ, арилокси-ПЭГ, поли-(№винилпирролидон)ПЭГ, трезилмонометокси-ПЭГ, ПЭГ-пропиональдегид, Ь1з-сукцинимидкарбонат-ПЭГ, гомополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт, декстран, целлюлозу или другие полимеры на основе углеводов. Подходящий ПЭГ может иметь молекулярную массу от около 600 до около 60000, включая, например, 5000, 12000, 20000 и 25000. Конъюгат ТАСЕиммуноглобулина может также содержать смесь таких водорастворимых полимеров.
Один пример конъюгата ТАСЕиммуноглобулин содержит часть ТАСЕиммуноглобулина и часть полиалкилоксида, присоединенную к Ν-концу ТАСЕиммуноглобулина. ПЭГ является одним подходящим полиалкилоксидом. В качестве иллюстрации, ТАСЕиммуноглобулин может быть модифицирован ПЭГом, процесс известен как «ПЭГилирование». ПЭГилирование ТАСЕиммуноглобулина может быть достигнуто любой их реакций ПЭГилирования, известных в данной области (см., например, ЕР 0154316, Эе1дабо е! а1., Спйса1 Ее\зе\\'з ш Тйегареийс Эгид Сатег 8уз!етз 9:249 (1992), Описав аиб 8ргеайсо, С1т. Рйагтасокте!. 27:290 (1994), и Егаиаз е! а1., Л! ί Нета!о1 68:1 (1998)). Например, ПЭГилирование может быть произведено реакцией ацилирования или реакцией алкилирования с реакционноспособной молекулой полиэтиленгликоля. В альтернативном подходе, конъюгаты ТАСЕиммуноглобулина образуют конденсированием активированного ПЭГа, при котором концевую гидроксильную или аминогруппу ПЭГа замещают активированным линкером (см., например, 1<агаз1е\\'1сх е! а1., патент США № 5382657).
- 21 010594
ПЭГилирование ацилированием типично требует взаимодействия активного производного сложного эфира ПЭГа с полипептидом ТАС1-иммуноглобулин. Примером активированного сложного эфира ПЭГа является ПЭГ, этерифицированный до Ν-гидроксисукцинимида. Как используют здесь, термин «ацилирование» включает в себя следующие типы связей между ТАС1-иммуноглобулином и водорастворимым полимером: амидом, карбаматом, уретаном и т. п. Способы получения ПЭГилированного ТАС1-иммуноглобулина ацилированием будут типично содержать этапы: (а) взаимодействия полипептида ТАС1-иммуноглобулин с ПЭГом (таким как реакционноспособный сложный эфир альдегидного производного ПЭГа) в условиях, при которых одна или несколько групп ПЭГа прикрепляются к ТАС1иммуноглобулину, и (Ь) получения продукта (продуктов) реакции. Вообще, оптимальные условия взаимодействия реакций ацилирования будут определены на основе известных параметров и желаемых результатов. Например, чем больше соотношение ПЭГ :ТАС1-иммуноглобулин, тем выше процентное содержание поли-ПЭГилированного ТАС1-иммуноглобулинового продукта.
Продукт ПЭГилирования ацилированием является типично поли-ПЭГилированным продуктом ТАС1-иммуноглобулина, причем лизиновые ε-аминогруппы являются ПЭГилированными через ацильную связывающую группу. Примером соединительного звена является амид. Типично образующийся в результате ТАС1-иммуноглобулин будет по меньшей мере на 95% моно-, ди- или трипэгилированным, хотя могут быть образованы некоторые разновидности с более высокой степенью ПЭГилирования в зависимости от условий взаимодействия. ПЭГилированные разновидности могут быть отделены от неконъюгированных полипептидов ТАС1-иммуноглобулина с использованием стандартных способов очистки, например диализа, ультрафильтрации, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии и т. п.
ПЭГиляция алкилированием вообще включает в себя взаимодействие конечного производного альдегида ПЭГа с ТАС1-иммуноглобулином в присутствии редуцирующего агента. Группы ПЭГа могут быть присоединены к полипептиду через -СΗ2-NΗ-группу.
Получение производных посредством редуктивного алкилирования для получения моноПЭГилированного продукта использует дифференциальную реакционную способность различных типов первичных аминогрупп, пригодных для получения производных. Типично, взаимодействие проводят при рН, которое позволяет взаимодействию использовать различия рКа между ε-аминогруппами остатков лизина и α-аминогруппой Ν-концевого остатка белка. Путем такого селективного получения производных контролируют присоединение водорастворимого полимера, который имеет в своем составе реакционную группу, например альдегид, к белку. Конъюгирование с полимером происходит преимущественно на Ν-конце белка без существенной модификации реакционных групп, таких как аминогруппы лизинов боковой цепи. Настоящее изобретение предоставляет существенно гомогенное получение конъюгатов монополимера ТАС1-иммуноглобулина.
Восстановительное алкилирование для производства существенно гомогенной популяции молекул конъюгата ТАС1-иммуноглобулина с монополимером может предусматривать этапы: (а) взаимодействия полипептида ТАС1-иммуноглобулин с реакционноспособным ПЭГом в условиях восстановительного алкилирования при рН, подходящем для позволения избирательной модификации α-аминогруппы на аминоконце ТАС1-иммуноглобулина, и (Ь) получения продукта (продуктов) взаимодействия. Редуцирующий агент, используемый для восстановительного алкилирования, должен быть стабильным в водном растворе и способным к восстановлению шиффового основания, образованного на начальных этапах восстановительного алкилирования. Иллюстративные восстановители включают боргидрид натрия, цианборгидрид натрия, диметиламинборан и пиридинборан.
Для существенно гомогенной популяции конъюгатов ТАС1-иммуноглобулина с монополимерами условия взаимодействия восстановительного алкилирования являются такими, что позволяют избирательное присоединение водорастворимой части полимера к Ν-концу ТАС1-иммуноглобулина. Такие условия взаимодействия вообще предусматривают различия рКа между аминогруппами лизина и αаминогруппой на Ν-конце. рН также влияет на соотношение полимера к белку, что должно быть использовано. Вообще, если рН ниже, то будет желательно избыточное количество полимера по отношению к белку, поскольку меньшее количество реакционных Ν-концевых α-групп, больше полимера необходимо для достижения оптимальных условий. Если рН выше, то полимер :ТАС1-иммуноглобулин не должен быть большим, поскольку большее количество реакционных групп имеется в распоряжении. Типично рН будет находиться в диапазоне от 3 до 9 или от 3 до 6.
Другим фактором для рассмотрения является молекулярная масса водорастворимого полимера. Вообще, чем выше молекулярная масса полимера, тем меньше число полимерных молекул, которые могут быть присоединены к белку. Для взаимодействия с ПЭГом типичная молекулярная масса составляет от около 2 до около 100 кДа, от около 5 до около 50 кДа или от около 12 до около 25 кДа. Молярное соотношение водорастворимого полимера к ТАС1-иммуноглобулину будет вообще в области от 1:1 до 100:1. Типично молярное соотношение водорастворимого полимера к ТАС1-иммуноглобулину будет от 1:1 до 20:1 для поли-ПЭГилирования и от 1:1 до 5:1 для моно-ПЭГилирования.
Общие способы получения конъюгатов, содержащих части полипептида и водорастворимых поли
- 22 010594 меров. известны в данной области. См.. например. 1<агак1с\\тсх с! а1.. патент США № 5382657. Сгссп\уа1й с! а1.. патент США № 5738846. №сГог111 с! а1.. С1ш. Рйагтасо1. ТНсг.59:636 (1996). Мопкагкй с! а1.. Апа1. ВюсНст. 247:434 (1997)).
Настоящее изобретение рассматривает композиции. содержащие пептид. или полипептид. описанные здесь. Такие композиции могут. кроме того. содержать носитель. Носителем может быть общепринятый органический или неорганический носитель. Примеры носителей включают воду. буферный раствор. спирт. пропиленгликоль. макрогол. кунжутное масло. кукурузное масло и т.п.
7. Выделение полипептидов ТАС1-иммуноглобулин.
Полипетиды настоящего изобретения могут быть очищены по меньшей мере до 80%-ной чистоты. по меньшей мере до около 90%-ной чистоты. по меньшей мере до около 95%-ной чистоты или выше чем 95% чистоты относительно примесных макромолекул. особенно относительно других белков и нуклеиновых кислот и не содержать инфекционные и пирогенные агенты. Полипептиды настоящего изобретения могут также быть очищены до фармацевтически чистого состояния. которое является выше чем 99.9% чистоты. В определенных препаратах очищенный полипептид является существенно освобожденным от других полипептидов. особенно от других полипептидов животного происхождения.
Способы фракционирования и/или общепринятой очистки могут быть использованы для получения препаратов полипептидов. искусственных полипептидов ТАС1-иммуноглобулин и рекомбинантных полипептидов ТАС1-иммуноглобулин. очищенных от рекомбинантных клеток хозяина. Вообще осаждение сульфатом аммония и кислотная экстракция или хаотропная экстракция могут быть использованы для фракционирования образцов. Примеры этапов очистки могут включать жидкостную хроматографию на гидроксиапатите. эксклюзивную хроматографию. ЕРЬС (скоростная жидкостная хроматография белков) и обратнофазовую жидкостную хроматографию с высоким разрешением. Пригодные хроматографические среды включают замещенные декстраны. агарозу. целлюлозу. полиакриламид. специальные селикагели и т.п. Производные РЕ1. ОЕЛЕ. ОЛЕ и О являются пригодными. Примеры хроматографических носителей включают такие носители. модифицированные фенильными. бутильными или октильными группами. например Рйспу1-8срйагокс ЕЕ (Рйагташа). Тоуорсаг1 Ьи!у1 650 (Токо Наак. Моп!дотсгуу111с. РА) 0с1у1-8ср11агокс (Рйагтааа) и т.п.; или полиакриловые смолы. такие как АтЬсгсйгот СО 71 (Токо Наак) и т.п. Пригодные твердые носители включают стеклянные шарики. смолы на основе силикагеля. целлюлозные смолы. агарозные шарики. сшитые шарики агарозы. полисиреновые шарики. сшитые полиакриламидные смолы и т.п.. которые являются нерастворимыми в условиях. при которых они должны использоваться. Эти носители могут быть модифицированы реакционными группами. что делает возможным присоединение белков аминогруппами. карбоксильными группами. сульфгидрильными группами. гидроксильными группами и/или углеводными остатками.
Примеры процессов химического связывания включают активирование циан-бромидом. активирование №гидроксисукцинимидом. эпоксидное активирование. сульфгидрильное активирование. активирование гидразидом и карбокси- и аминопроизводными для процессов химической сшивки карбодиимидов. Эти и другие твердые носители являются хорошо известными и широко используются в данной области и являются доступными от коммерческих поставщиков. Выбор специфического способа выделения и очистки полипептида является рутинным делом и определяется. отчасти. свойствами выбранного носителя. См.. например. АШпйу Сйгота!одгарйу: Ргтс1р1ск & Мсйюйк (Рйагтас1а ЬКВ Вю!ссйпо1оду 1988) и Эоопап. Рго!ст РшШса!юп Рго!осо1к (ТНс Нитапа Ргскк 1996).
Дополнительные варианты выделения и очистки ТАС1-иммуноглобулинов могут быть придуманы специалистами в данной области. Например. могут быть использованы антитела анти-ТАС1 или анти-Ес для выделения больших количеств белка методом иммуноаффинной очистки.
Полипептиды настоящего изобретения также могут быть выделены с использованием индивидуальных свойств. Например. адсорбционная хроматография с иммобилизованными ионами металла (1МАС) может быть использована для очистки белков. богатых гистидином. включая те белки. содержащие полигистидиновые метки. Кратко. сначала гель наполняют ионами металла для образования хелатов (8и1ко^кк1. Тгспйк ίπ ВюсНст. 3:1 (1985)). Богатые гистидином белки будут адсорбироваться на этом матриксе с различной аффинностью. зависящей от использованного иона металла. будут сэлюированы конкурентной элюцией. понижением рн или использованием сильных хелатирующих агентов. Другие способы очистки включают очистку гликозилированных белков аффинной хроматографией с иммобилизованным лектином. Рго!ст А-хроматография. и ионообменную хроматографию (МГОсШксНсг. (сй.). МсШ ЕпгутоБ 182:529 (1990)).
Полипептиды ТАС1-иммуноглобулин или их фрагменты могут также быть получены путем химического синтеза. как описано выше. Полипептиды ТАС1-иммуноглобулин могут быть мономерами или мультимерами; гликозилированными или негликозилированными; ПЭГилированными или неПЭГилированными и могут включать. или могут не включать. начальный аминокислотный остаток метионина. Слитый белок ТАС1-иммуноглобулина может быть негликозилированным. гликозилированным или гликозилированным только в части ТАС1 или в части иммуноглобулина. Иммуноглобулиновая часть может быть получена из антител человека. химерных антител или антител человекообразных.
8. Терапевтическое применение полипептидов ТАС1-иммуноглобулин.
- 23 010594
Белки ТАСЧ-иммуноглобулин могут быть использованы для модуляции иммунной системы путем связывания 2'ТЫЕ4 или 2Т№2, и таким образом, препятствуя связыванию этих лигандов с эндогенными рецепторами ТАСЧ или ВСМА. Следовательно, настоящее изобретение включает использование белков ТАСЧ-иммуноглобулин субъекту, который испытывает недостаток в достаточном количестве рецепторов ТАСЧ или ВСМА, или который производит избыток 2Т№4 и 2'ТЫЕ2. Эти молекулы могут быть введены любому субъекту, который нуждается в лечении, и настоящее изобретение рассматривает как применение в ветеринарии, так и в терапии человека. Иллюстративные субъекты включают субъекты млекопитающих, таких как сельскохозяйственные животные, домашние животные и больные люди.
Полипептиды ТАСЧ-иммуноглобулин могут быть использованы для лечения аутоиммунных заболеваний, карциномы В-клеток, иммуномодуляции, ΙΒΌ и любых патологий, опосредованных антителами (например, ПСР, миастениа гравис и т.п.), почечная недостаточность, косвенный Т-клеточный иммунный ответ и отторжение трансплантата и заболевания трансплантат против хозяина. Полипептиды настоящего изобретения могут быть мишенями к специфичным ответам, регулируемым В-клетками во время иммунного ответа. Кроме того, полипептиды настоящего изобретения могут быть использованы для модулирования развития В-клеток, развития других клеток, наработки антител и наработки цитокинов. Полипептиды настоящего изобретения также могут модулировать взаимодействие Т-клеток и Вклеток путем нейтрализации пролиферативных эффектов 2'ТЫЕ4.
Полипептиды ТАСЧ-иммуноглобулин настоящего изобретения могут быть полезными для нейтрализации эффектов 2Т№4 для лечения пре-В- или В-клеточных лейкозов, таких как плазмоклеточный лейкоз, хронический или острый лимфоцитарный лейкоз, миеломы, такие как множественная миелома, плазмоклеточная миелома, омобластома и гигантоклеточная миелогенная опухоль и лимфомы, такие как неходжкинская лифома, которая ассоциирована с ростом полипептидов 2ЮТ4.
2ЮТ4 экспрессируется в СО8+-клетках, моноцитах, дендровидных клетках, активированных моноцитах, которые указывают, что в определенных аутоиммунных заболеваниях, цитотоксические Т-клетки могут стимулировать наработку В-клеток посредством избыточной наработки 2Т№4. Иммунодепрессантные белки, которые избирательно блокируют действие В-лимфоцитов, могли бы использоваться при лечении заболевания. Наработка аутоантител является одинаковой для нескольких аутоиммунных заболеваний и вносит вклад в разрушение ткани и обострение заболевания. Аутоантитела могут также привести к появлению осложнений осаждения иммунного комплекса и привести ко многим симптомам системной красной волчанки, включая почечную недостаточность, невралгические симптомы и смерть. Модулирование наработки антител, не зависящее от клеточного ответа, также было бы выгодным во многих болезненных состояниях. Было показано также, что В-клетки играют роль в секреции артрогенных иммуноглобулинов при ревматоидных артритах. Как таковое, ингибирование наработки антител 2ЮТ4 было бы выгодным в лечении аутоиммунных заболеваний, таких как миастениа гравис, ревматоидный артирит, детский полиартрит и псориатический артрит. Иммунодепрессантная терапия, например, белками ТАСИиммуноглобулин, которые избирательно блокируют или нейтрализуют действие Влимфоцитов, была бы полезной для таких целей.
Изобретение предусматривает способы применения белков ТАСЧ-иммуноглобулин для селективного блокирования или нейтрализации действия В-клеток в связи с конечной стадией почечной недостаточности, которая может или не может быть ассоциирована с аутоиммунным заболеванием. Такие способы также были бы полезны для лечения иммунологических почечных заболеваний. Такие способы были бы полезными для лечения гломерулонефрита, связанного с заболеваниями, такими как мембранная нефропатия, ЦА нефропатия или болезнь Бергера, ΙβΜ нефропатия, болезнь Гудпасчура, постинфекционный гломерулонефрит, мезангиопролиферативное заболевание, хронический лимфоидный лейкоз, минимально-измененный нефротический синдром. Такие способы также могли бы служить в качестве терапевтических применений для лечения вторичного гломерулонефрита или ангины, связанными с такими заболеваниями, как волчанка, полиартрит, болезнь Шенлейна-Геноха, склеродерма, заболеваниями, связанными с ВИЧ, амилоидоз или гемолитико-уремический синдром. Способы настоящего изобретения также были бы полезными в качестве части (доли) терапевтического применения для лечения интерстициального нефрита или пиелонефрита, ассоциированного с хроническим пиелонефритом, злоупотребления болеутоляющими средствами, нефрокальциноза, нефропатии, вызванной другими агентами, почечнокаменной болезни или хронического или острого интерстициального нефрита.
Способы настоящего изобретения также включают применение белков ТАСЧ-иммуноглобулин для лечения гипертонических заболеваний или заболеваний крупных сосудов, включая стеноз почечной артерии, или окклюзию, или холестериновую эмболию, или почечную эмболию.
Настоящее изобретение также предоставляет способы лечения почечных или урологических истинных опухолей, множественных миелом, лимфом, легкой цепи невропатии или амилоидоза.
Изобретение также предоставляет способы блокирования или ингибирования активированных Вклеток с использованием белков ТАСЧ-иммуноглобулин для лечения астмы и других хронических заболеваний дыхательных путей, таких как бронхиты и эмфизема. Описанные здесь белки ТАСЧиммуноглобулин также могут быть использованы для лечения синдрома Шегрена.
Также предоставляют способы ингибирования или нейтрализации эффекторного ответа Т-клеток с
- 24 010594 использованием белков ТАСБиммуноглобулин для использования при иммунодепрессии, в частности для такого терапевтического использования как при реакции «трансплантат против хозяина», так и при отторжении трансплантата. Кроме того, белки ТАСБиммуноглобулин будут полезными в терапевтических протоколах для лечения таких аутоиммунных заболеваний, как инсулинзависимый сахарный диабет (ГОЭМ) и болезнь Крона. Способы настоящего изобретения могут иметь дополнительную терапевтическую ценность для лечения хронических воспалительных заболеваний, в частности, для уменьшения суставных болей, опухолей, анемии и других ассоциированных симптомов, так же как и лечения септического шока.
Хорошо установленные модели на животных являются пригодными для анализа ш νί\Ό эффективности белков ТАСБиммуноглобулин настоящего изобретения в точных болезненных состояниях. В частности, белки ТАСБиммуноглобулин могут быть проанализированы ш νί\Ό в ряде экспериментальных моделей на животных на аутоиммунное заболевание, таких как МВБ-Ιρτ/Ιρτ или Б1 NΖВxNΖV родственных линий мышей, которые служат в качестве модели ББЕ (системной красной волчанки). Такие модели животных являются известными в данной области.
Потомство от скрещивания между мышами №\ν Ζеа1аηб В1аск (N76) и №\ν Ζеа1аηб \νΐιί^ (ΝΖν) проявляет спонтанные формы ББЕ, которые имеют близкое сходство с ББЕ человека. Потомство мышей, известное как NΖВV, начинает обнаруживать ЦМ-аутоантитела против Т-клеток в возрасте 1 месяца и в 5-7-месячном возрасте, Ιβ-аутоантитела против ДНК являются доминантным иммуноглобулином. Поликлональная гиперактивность В-клеток приводит к чрезмерной наработке аутоантител. Накопление этих аутоантител, особенно аутоантител направленных против однонитевой ДНК, связано с развитием гломерулонефрита, который проявляется клинически как протеинурия, азотемия и смертью от почечной недостаточности. Почечная недостаточность является главной причиной смерти мышей, пораженных спонтанной ББЕ, а у линии NΖВV этот процесс является хроническим и уничтожающим. Заболевание является более быстрым и тяжелым у женских особей, чем у мужских, со средним выживанием только 245 дней по сравнению с 406 днями для мужских особей. В то время как многие из женских особей мышей будут симптоматичными (протенуриа) в возрасте 7-9 месяцев, некоторые из них могут быть намного моложе или старше при проявлении симптомов. Смертельный иммунный нефрит, обнаруженный у мышей NΖВV, является очень похожим на гломерулонефрит, обнаруженный у человека с ББЕ, делая эту спонтанную модель на мышах полезной для тестирования потенциальной терапии ББЕ.
Модели на мышах для экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ) использовали в качестве инструмента для исследования как механизмов иммунно-опосредованного заболевания, так и способов потенциального терапевтического вмешательства. Модель имеет сходство с рассеянным склерозом человека и дает демиелинизацию в качестве результата активации Т-клеток к нейробелкам, таким как основной белок миелина (МВР) или протеолипидный белок (РБР). Инокуляция антигеном приводит к индуцированию СИ4+, Т-клеток ΙΙ класса (Тй1), рестриктированных по главному комплексу гистосовместимости (МНС). Изменения в протоколе по ЕАЕ могут породить острые, хронически-рецидивные или пассивно-перенесенные варианты модели.
В экспериментальной модели на животных по изучению индуцированного коллагеном артрита (С'ЧА) у мышей развивался хронический воспалительный артрит, который имеет близкое сходство с ревматоидным артритом (ВА) человека. Поскольку С'ЧА обнаруживает сходные с ВА иммунологические и патологические признаки, то это делает его идеальной моделью для скрининга потенциальных противовоспалительных компонентов у человека. Другим преимуществом использования модели по изучению С'ЧА является то, что механизмы его патогенеза известны. Идентифицированы Т- и В-клеточные эпитопы на коллаген ΙΙ типа и определены различные иммунологические параметры (замедленная гиперчувствительность и антитела против коллагена) и противовоспалительные (цитокины, хемокины, ферменты, разрушающие матрикс) параметры, относящиеся к иммунно-опосредованным артритам, и могут быть использованы для оценки эффективности тестируемых компонентов в моделях.
Миастения гравис (МО) является другим аутоиммунным заболеванием, для которого экспериментальные модели на мышах являются пригодными. МО является нарушением нервно-мышечной проводимости, затрагивающим выработку аутоантител, направленных против никотинового ацетилхолинового рецептора (АСйВ). МО является приобретенным или наследственным с клиническими признаками, включающими огромную слабость и утомляемость при напряжении. Установлена экспериментальная модель на мышах МО. Экспериментальная аутоиммунная миастениа гравис (ЕАМО) является заболеванием, опосредованным антителами, характеризующимся наличием антител к АСйВ. Эти антитела разрушают рецептор, приводя к повреждению нейромускульных электрических импульсов, выражающемуся в мышечной слабости. В экспериметальной модели ЕАМО мышей иммунизировали никотиновым ацетилхолиновым рецептором. Клинические признаки МО становятся очевидными через неделю после второй иммунизации. ЕАМО оценивают несколькими способами, включая измерение уровней сыворотки антител к АСйВ радиоиммунологическим анализом, измерение мышечного АсйВ, или электромиографией.
Вообще, доза введенного белка ТАСБиммуноглобулин будет варьировать в зависимости от таких факторов, как возраст субъекта, вес, пол, общее медицинское состояние и предыдущая история болезни.
- 25 010594
Типично, является желательным обеспечение реципиента дозой белка ТАСЕиммуноглобулин, которая находится в диапазоне от около 1 пг/кг до 10 мг/кг (количество агента/массу тела субъекта), хотя более низкие или более высокие дозы также могут быть введены, как диктуют обстоятельства.
Введение белка ТАСЕиммуноглобулин субъекту может быть внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, внутримышечным, подкожным, внутриплевральным, интратекальным, перфузиионным через региональный катетер или прямой внутриповреждающей инъекций. При введении терапевтических белков инъекцией введение может быть в виде непрерывной инфузии или простыми или сложными болюсами.
Дополнительные пути введения включают оральный, мембранно-слизистый, пульмональный и чрескожный. Оральный прием является пригодным для полиэфирных микросфер, зеиновых микросфер, белковых микросфер, полицианакрилатных микросфер и систем на основе липидов (см., например, ΌΕ Ваке апк Могге1, 0га1 Иектегу оГ М1сгоепсарки1а1ек Рго1етк, ίη Рго1ет Иектегу: РВукюа1 8ук!етк, 8апкегк апк Непкгеп (екк.), стр. 255-288 (Р1епит Ргекк 1997)). Удобоисполнимость интраназального введения иллюстрируют таким способом введения инсулина (см., например, Н1псВс11ГГе апк Шит, Акт. Эгид Эект. Вет. 35:199 (1999)). Сухие или жидкие частицы, содержащие ТАСЕиммуноглобулин, могут быть приготовлены и поглощены путем вдыхания с помощью диспергаторов для сухого порошка, аэрозольных генераторов для жидкостей или распылителей (например, РеШ1 апк СотЬо1х. ТШТЕСН 76:343 (1998); Ра1!оп е! а1., Акт. Эгид Ое1й. Вет. 35:235 (1999)). Этот подход иллюстрируют системой управления диабетом АЕВХ, которая представляет собой портативный электронный ингалятор, который доставляет аэрозольный инсулин в легкие. Исследования показывают, что белки до 48000 кДа были доставлены через кожу в терапевтических концентрациях с помощью низкочастотного ультразвука, который иллюстрирует выполнимость чрескожного введения (М1кадокт е! а1., 8с1епсе 269:850 (1995)). Чрескожная доставка с использованием электропорации предоставляет другие способы введения белков ТАСЕиммуноглобулин (Рокк е! а1., Ркагт. Вю1есйпо1. 70:213 (1997)).
Фармацевтическая композиция, содержащая белок ТАСЕиммуноглобулин, может быть технологически произведена в соответствии с известными способами приготовления фармацевтически полезных композиций, в соответствии с чем терапевтические белки комбинируют в композицию с фармацевтически приемлемым носителем. Указывают, что композиция должна быть «фармацевтически пригодным носителем», если ее введение может быть толерантным для реципиентного пациента. Стерильный фосфатно-солевой буферный раствор является одним примером фармацевтически удовлетворяющего носителя. Другие подходящие носители являются хорошо известными в данной области. См., например, Оеппаго (ек.), ВетшдФп'к РВагтасегикса1 8с1епсек, 191В Екйюп (Маск РиЬккЫпд Сотрапу 1995).
В терапевтических целях белки ТАСЕиммуноглобулин вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве. Указывают, что белки ТАСЕиммуноглобулин и фармацевтически приемлемый носитель должны быть введены в «терапевтически эффективном количестве», если вводимое количество является физиологически существенным. Агент является физиологически существенным, если его наличие дает в результате обнаруживаемое изменение в физиологии реципиентного пациента. Например, агент, используемый для лечения воспаления, является физиологически существенным, если его присутствие облегчает воспалительную реакцию. В качестве другого примера агент, используемый для ингибирования роста опухолевых клеток, является существенным, если введение агента приводит в результате к уменьшению количества опухолевых клеток, уменьшенным метастазам, уменьшенной в размере твердой опухоли или увеличенному некрозу опухоли. Кроме того, агент, используемый для лечения системной красной волчанки, является физиологически значимым, если введение агента дает в результате снижение циркулирующих антител против двухцепочечной ДНК или уменьшение по меньшей мере одного из следующих симптомов: лихорадки, боли суставов, эритемного поражения кожи или других признаков системной красной волчанки. Одним примером общего признака, что белок ТАСЕиммуноглобулин вводят в терапевтически эффективном количестве, является то, что при последующем введении субъекту наблюдается снижение в циркулирующих уровнях ΖТNΕ4 (ВЬу8).
Фармацевтическая композиция, содержащая белок ТАСЕиммуноглобулин, может быть предоставлена в жидкой форме, в аэрозольной форме или в твердой форме. Жидкие формы иллюстрируют инъекционными растворами и оральными суспензиями. Экземпляры твердых форм включают капсулы, таблетки и формы с контролируемым высвобождением. Последнюю форму иллюстрируют миниосмотическими насосами и имплантатами (Вгетег е! а1., Ркагт. Вю1ескпо1. 70:239 (1997); Вапаке, 'ЧтркнИк т Игид Пектегу, в Эгид Оектегу 8ук!етк, Вапаке апк Но1кпдег(екк.), стр.95-123(СВС Ргекк 1995); Вгетег е! а1., Рго1ет Иектегу \νί!1ι кГикюп Ритрк, т Рго1ет Иектегу: Ркук1са1 8ук!етк, 8апкегк апк Непкгеп (екк.), стр. 239-254 (Р1епит Ргекк 1997); Уе\теу е! а1., Иектегу оГ Рго1ешк Ггот а Соп!го11ек Ве1еаке [п|ес1аЬ1е Ттр1ап1, в Рго1ет Иектегу: Ркукюа1 8ук!етк, 8апкегк апк Непкгеп (екк.), стр. 93-117 (Р1епит Ргекк 1997)).
Липосомы предоставляют один способ доставки терапевтических полипептидов субъекту внутривенно, внутрибрюшинно, интратекально, внутримышечно, поверхностно или через оральное введение, ингаляцию или интраназальное введение. Липосомы являются микроскопическими везикулами, которые состоят из одного или нескольких липидных бислоев, окружающих водные компартменты (см., в целом,
Ваккег-ХУоикепЬегд! е! а1., Еиг. I. Скп. МюгоЬюк !пГес1. Όίκ. 12 (8ирр1. 7):861 (1993), К1т, Игидк 46:618
- 26 010594 (1993), апб Капабе, 8йе-8ресШс Эгид ОеБуегу Икшд Ырокотек ак Сатегк, в Эгид ОеНуегу 8ук!етк, Капабе апб НоШпдег (ебк.), стр. 3-24 (СКС Ргекк 1995)).
Липосомы по составу сходны с клеточными мембранами, и, в результате, липосомы могут быть введены безопасно и являются биодеградируемыми. В зависимости от способа получения липосомы могут быть однослойными, или многослойными, и липосомы могут варьировать в размере с диапазоном диаметра от 0,02 мкм до больше чем 10 мкм. Множество агентов может быть инкапсулировано в липосомы: гидрофобные агенты, разделенные в бислоях, и гидрофильные агенты, распределенные во внутреннем (внутренних) водном пространстве (пространствах) (см., например, МасНу е! а1., Ырокотек Ιπ Се11 Вю1оду Апб РНагтасо1оду (1оНп ЫЬЬеу 1987), и 0к!го е! а1., Атепсап 1. Нокр. РНагт. 46:1576 (1989)). Кроме того, существует возможность контроля терапевтической эффективности инкапсулированного агента посредством изменения размера липосомы, числа бислоев, липидного состава так же, как и заряда и поверхностных свойств липосом.
Липосомы могут адсорбировать, практически, любые типы клеток и затем медленно высвобождать инкапсулированный агент. Альтернативно, абсорбированная липосома может быть подвергнута эндоцитозу клетками, которые являются фагоцитами. Эндоцитоз происходит с последующей деградацией липосомальных липидов внутри лизосом и высвобождением инкапсулированных агентов (8сНегрНоГ е! а1., Апп. КУ. Асаб. 8а 446:368 (1985)). После внутривенного введения небольшие липосомы (от 0,1 до 1,0 мкм) поглощаются клетками ретикулоэндотелиального аппарата, локализованного, главным образом, в печени и селезенке, в то время как липосомы больше чем 3,0 мкм депонируются в легких. Это преимущественное поглощение более мелких липосом клетками ретикулоэндотелиального аппарата было использовано для доставки хемотерапевтических агентов к макрофагам и к опухолям печени.
Ретикулоэндотелиальный аппарат может быть обманут несколькими способами, включая насыщение большими дозами липосомных частиц, или избирательной инактивацией макрофагов фармакологическими средствами (С1ааккеп е! а1., ВюсЫт. ВюрНук. Ас!а 802:428 (1984)). Кроме того, показано, что внедрение производных гликолипидпроизводных или полиэтиленгликольпроизводных фосфолипидов внутрь липосомных мембран дает в результате существенно сниженное поглощение ретикулоэндотелиальным аппаратом (А11еп е! а1. ВюсЫт. ВюрНук. Ас1а 7068:133 (1991); А11еп е! а1. ВюсЫт. ВюрНук. Ас!а 1150:9 (1993)).
Липосомы также могут быть подготовлены для специфических клеток-мишеней или органов варьированием фосфолипидной композиции или внедрением рецепторов, или лигандов внутрь липосом. Например, липосомы, очищенные с высоким содержанием неионного поверхностно-активного вещества, использовали для попадания в печень (Науака^а е! а1., патент Японии № 04-244018; Ка!о е! а1., Вю1. РНагт. Ви11. 76:960 (1993)). Эти композиции были получены смешиванием соевого фосфатидилхолина, α-токоферола и этоксилированного гидрогенизированного касторового масла (НСО-60) в метаноле, концентрированием смеси в вакууме и затем разбавления смеси водой. Также было показано, что липосомная композиция дипальмитоилфосфатидилхолина (ЭРРС) со смесью полученного из сои стерилгликозида (86) и холестерина (СН) попадает в печень (8Ы1Ыхи е! а1., Вю1. РНагт. Ви11. 20:881 (1997)).
Альтернативно, различные лиганды-мишени могут быть пришиты к поверхности липосомы, такие как антитела, фрагменты антител, углеводы, витамины и транспортные белки. Например, липосомы могут быть модифицированы разветвленными галактозиллипидными производными для обнаружения рецепторами асиалогликопротеина (галактозы), которые являются исключительно экспрессированными на поверхности клеток печени (Ка!о апб 8ид1уата, СгН. Кеу. ТНег. Эгид Сатег 8ук!. 14:287 (1997); МигаНакН1 е! а1., Вю1. РНагт. Ви11. 20:259 (1997)). Подобным образом, ХУи е! а1., Нера!о1оду 27:772 (1998), показали, что мечение липосом асиалофетуином приводило к сокращению полужизни липосомной плазмы и вообще усиливало поглощение гепатоцитами липосом, меченных асиалофетуином. С другой стороны, печеночная аккумуляция липосом, содержащих разветвленные производные галактозиллипида, может быть ингибирована предварительной инъекцией асиалофетуина (МигаНакЫ е! а1., Вю1. РНагт. Ви11. 20:259 (1997)). Полиаконитилированные липосомы сывороточного альбумина человека предоставляют другой подход для попадания липосом в клетки печени (Катрк е! а1., Ргос. N<11’1 Асаб. δα. И8А 94:11681 (1997)). Кроме того, 6еНо, е! а1., патент США № 4603044, описывают систему доставки в гепатоциты на основе липосомных пузырьков, которая является специфичной для гепатобилиарных рецепторов, ассоциированных со специализированными метаболическими клетками печени.
В более общем подходе по попаданию в ткани клетки-мишени предварительно метят биотинилированными антителами, специфичными для лиганда, экспрессированного клеткой-мишенью (Нагакут е! а1., Абу. Эгид ЭеНу. Кеу. 32:99 (1998)). После удаления плазмой свободного антитела вводят стрептавидинконъюгированные липосомы. В другом подходе, анитела, которые служат меткой, прикрепляют прямо к липосомам (Нагакут е! а1., Абу. Эгид ЭеНу. Кеу. 32:99 (1998)).
Белки ТАСБиммуноглобулин могут быть инкапсулированы внутрь липосом с использованием стандартных приемов микроинкапсулирования белков (см., например, Апбегкоп е! а1., Шес!. Iттиη. 37:1099 (1981), Апбегкоп е! а1., Сапсег Кек. 50:1853 (1990), и СоНеп е! а1., ВюсЫт. ВюрНук. Ас!а 1063:95 (1991),
АМпд е! а1, Ргерага!юп апб Ике оГ Ырокотек ш Iттиηо1од^са1 8!иб1ек, в Ырокоте ТесНпо1оду, 2пб Еб1боп, νθ1. ΙΙΙ, ОгедопабБ (еб.), стр. 317 (СКС Ргекк 1993), ХУаккеГе! а1., Ме!Н. Епхуто1. 149:124 (1987)). Как
- 27 010594 подчеркивают выше, терапевтически пригодные липосомы могут иметь в своем составе различные компоненты. Например, липосомы могут содержать липидные производные полиэтиленгликоля (А11сп е! а1., ВюсЫт. ВюрЬук. Ас!а 1150:9 (1993)).
Для поддержания высоких системных уровней терапевтических белков были созданы распадающиеся полимерные микросферы. Микросферы получают из биодеградируемых полимеров, таких как поли(лактид-когликолид) (РЬС), полиангидриды, полиортоэфиры, биологически неразложимые этилвинилацетатные полимеры, в которых белки инкапсулированы в полимер (СошЬо1х а1'1б Ре!й!, В1осон)ида!е С1ет. 6:332 (1995); Катбе, Ко1е о£ Ро1утегк ίη Эгид ПеНуегу, в Эгид ОеКуегу Зук!етк, Катбе аг1б Но11шдег (ебк.), стр. 51-93 (СКС Ргекк 1995); Коккок аг1б Макк1еМс7,ПедгабаЬ1е СогИгоПеб Ке1еаке Зук!етк ике£и1 £ог Рго!ет ПеНуегу, в Рго!еш Пе11уегу:РЬук1са1 8ук!етк, 8аг1бегк аг1б Нсп6гсп (ебк.), стр. 45-92 (Р1епшп Ргекк 1997); Вайик е! а1., Заеме 287:1161 (1998); РиШеу шчб Вигке, №Пиге В^ο!есЬηο1οду 76:153 (1998); РиШеу, Сигг. Орт Скет. Вю1. 2:548 (1998)). Наносферы, покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ), могут также предоставлять носители для внутривенного введения терапевтических белков (см., например, 6ге£ е! а1., Ркагт. Вю!ссЬпо1. 70:167 (1997)).
Настоящее изобретение также рассматривает химически модифицированные белки ТАС1иммуноглобулин, в которых полипептид связан с полимером, как обсуждают выше.
Другие лекарственные формы могут быть разработаны специалистами в данной области, как показано, например, Апкс1 амб Ророукк, Ркагтасеийса1 Эокаде Гогтк амб Эгид Оекуегу Зук!етк, 5'1' Е6йюп (Ъеа & ГеЫдег 1990), Сспплго (еб.), Кеттдойк Ркагтасеийса1 Зс1спсск, 19'1' Е6йюп (Маск РиЬккктд Сотрат- 1995), Камбе аг1б Но11шдег, Эгид ОеНуегу Зук!етк (СКС Ргекк 1996)).
В качестве иллюстрации фармацевтические композиции могут быть поставлены в виде набора, содержащего контейнер, который содержит белок ТАС1-иммуноглобулин. Терапевтические полипептиды могут быть предоставлены в виде инъекционного раствора для одной или нескольких доз или в виде стерильного порошка, который будет растворен перед инъецированием. Альтернативно, такой набор может включать в себя диспергатор для сухих порошков, жидкостно-аэрозольный генератор или распылитель для введения терапевтического полипептида. Такой набор, кроме того, может содержать написанную информацию по указанию и применению фармацевтической композиции. Кроме того, такая информация может включать утверждение, что белковая композиция ТАС1-иммуноглобулин противопоказана пациентам с известной гиперчувствительностью к любому из компонентов рецептора ТАС или иммуноглобулиновому компоненту.
9. Терапевтическое использование нуклеотидных последовательностей ТАС1-иммуноглобулина.
Настоящее изобретение включает в себя применение молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют слитые белки ТАС1-иммуноглобулина для предоставления этих слитых белков субъекту, который нуждается в таком лечении. Для ветеринарного терапевтического применения или терапевтического применения для человека такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены субъекту, имеющему нарушение или заболевание, как обсуждено выше. В качестве одного примера, обсужденного ранее, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитый белок ТАС1-иммуноглобулина, могут быть использованы для продолжительного лечения системной красной волчанки.
Существует ряд подходов по внедрению гена ТАС1-иммуноглобулин субъекту, включающих использование рекомбинантных клеток хозяина, которые экспрессируют ТАС1-иммуноглобулин, доставку очищенной нуклеиновой кислоты, кодирующей ТАС1-иммуноглобулин, использование катионного липидного переносчика с молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует ТАС1-иммуноглобулин и использование вирусов, которые экспрессируют ТАС1-иммуноглобулин, таких как рекомбинантные ретровирусы, рекомбинантные адено-ассоциированные вирусы, рекомбинантные аденовирусы и рекомбинантные симплексные вирусы герпеса (см., например, МиШдащ Зс1спсс 260:926 (1993), КокснЬс^ е! а1., Заеме 242:1575 (1988), ЬаЗа11е е! а1., Заетое 259:988 (1993), \\оИТ е! а1., Заетое 247:1465 (1990), Вгеакйе1б аг1б Пе1иса, Тке Νον Вю1од1к! 3:203 (1991)). В подходе ех у1уо, например, изолированные клетки субъекта, заражают вектором, который экспрессирует ген ТАС1-иммуноглобулин, и затем пересаживают внутрь субъекта.
Для того чтобы произвести экспрессию гена ТАС1-иммуноглобулин, конструируют вектор, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая ген ТАС1-иммуноглобулин, пришита в результате манипуляций к коровому промотору и произвольно к регуляторному элементу для контроля транскрипции гена. Общие требования к экспрессионному вектору описывают выше.
Альтернативно, ген ТАС1-иммуноглобулин может быть доставлен с использованием рекомбинантных вирусных векторов, включающих, например, аденовирусные векторы (е.д., Какк-Е1к1ег е! а1., Ргос.№П'1 Асаб. Зск ИЗА 90:11498 (1993), Ко11к е! а1., Ргос. №!'1Асаб. За. ИЗА 97:215 (1994), Ы е! а1. Нит^е^ Ткег. 4:403 (1993), Утсей е! а1., №!. 6е11е1. 5:130 (1993), а^ Ζ№ι^γ е! а1., Се11 75:207 (1993)), аденовирус-ассоциированные вирусные векторы (Г1о!!е е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. Зсъ ИЗА 90:1061.3 (1993)), альфавирусы, такие как лесной вирус и ЗшбЫк вирус (Ней/ аг1б Ниа^, I У1г. 66:857 (1992), Ка_)и аг1б Ниа^, I. У1г. 65:2501 (1991), аг1б Хюп§ е! а1., Зс1спсс 243:1188 (1989)), вирусные векторы герпеса (е.д., патенты США №№ 4769331, 4859587, 5288641 и 5328688), векторы парвовирусов (Коеппд е! а1., Нит. Сспс Ткегар. 5:457 (1994)), векторы вирусов оспы (Охак1 е! а1., Вюскет. Вюркук. Кек. Сотт. 793:653
- 28 010594 (1993), Рашса11 апб Рао1ей1, Ргос. №111 Асаб. 8с1. И8А 79:4927 (1982)), вирусы оспы, например канареечный вирус оспы или вирус коровьей оспы (Р1кйег-Носй еί а1., Ргос. Νί1 Асаб. δα. И8А 86:317 (1989), и Р1ехпег еί а1., Апп. ХУ.Асаб. δα. 569:86 (1989)), и ретровирусы (е.д., ΒаЬа еί а1., I. №игокигд 79:729 (1993), Кат еί а1., Сапсег Кек. 53:83 (1993), Такат1уа еί а1., I. №игока. Кек 33:493 (1992), У11е апб Най, Сапсег Кек. 53:962 (1993), У11е апб Най, Сапсег Кек. 53:3860 (1993), и Апбегкоп еί а1., патент США № 5399346). В рамках различных вариантов или сами вирусные векторы, или вирусные частицы, которые содержат вирусный вектор, могут быть использованы в способах и композициях, описанных ниже.
В качестве иллюстрации одной из систем аденовирус, вирус с двухцепочечной ДНК, является хорошо охарактеризованным ветором для генного переноса доставки гетерологичных молекул нуклеиновой кислоты (см. обзор, Βеске^ еί а1., Ме111. Се11 ΒώΕ 43:161 (1994); Эоид1ак апб Сипе1, 8аепсе & Мебюше 4:44 (1997)). Аденовирусная система дает несколько преимуществ, включающих: (1) способность к размещению относительно крупных вставок ДНК, (и) способность быть нарощенными до высокого титра, (ш) способность к инфицированию широкого ряда типов клеток млекопитающих и (ίν) способность быть использованными со многими различными промоторами, включая убиквитиновые, тканеспецифичные и регулируемые промоторы. Кроме того, аденовирусы могут быть введены путем внутривенной инъекции, поскольку вирусы являются устойчивыми в кровотоке.
Используя аденовирусные векторы, где части аденовирусного генома удалены, вставки внедряют в вирусную ДНК прямым лигированием или гомологичной рекомбинацией с плазмидой для котрансфекции. В иллюстративной системе важнейший ген Е1 удаляют из вирусного вектора, и вирус не будет реплицироваться, пока ген Е1 не будет предоставлен клеткой-хозяином. При внутривенном введении интактным животным аденеовирус сначала поражает печень. Хотя аденовирусная система доставки с делецией в гене Е1 не может реплицироваться в клетке-хозяине, ткани хозяина будут экспрессировать и подвергать процессингу кодируемый гетерологичный белок. Клетки хозяина будут также секретировать гетерологичный белок, если соответствующий ген включает в себя секреторную сигнальную последовательность. Секретированные белки будут поступать в кругооборот из ткани, которая экспрессирует гетерологичный ген (например, высоковаскулизированная печень).
Кроме того, аденовирусные векторы, содержащие различные делеции вирусных генов, могут быть использованы для снижения или элиминирования иммунного ответа на вектор. Такие аденовирусы содержат делецию в Е1 и, кроме того, содержат делеции Е2А или Е4 (Ьикку еί а1., I. У1го1. 72:2022 (1998); Карег еί а1., Нитап Сепе ТНегару 9:671 (1998)). Сообщалось также, что делеция Е2Ь понижает иммунный ответ (Ата1Йапо еί а1., I. Уйо1. 72:926 (1998)). Делецией всего аденовирусного генома могут быть размещены очень крупные вставки гетерологичной ДНК. Получение так назывемых «бесхарактерных» аденовирусов, где все вирусные гены удалены, является особенно выгодным для инсерции крупных вставок гетерологичной ДНК (см., обзор УеН. апб РегпсаибеР РА8ЕΒ I. 11:615 (1997)).
Матричные растворы с высокими титрами рекомбинантных вирусов, обеспечивающих экспрессию терапевтического гена, могут быть получены из инфицированных клеток млекопитающих с использованием стандартных методов. Например, рекомбинантный вирус герпеса к1тр1ех может быть приготовлен в клетках Уега, как описано ΒηηΗΙ еί а1., I. Сеп. Уйо1. 72:2043 (1991), Него1б еί а1., I. Сеп. У1го1. 75:1211 (1994), У1каШ апб Βιο^ί, Уно1о§у 785:419 (1991), Сгаи ег а1., 1птек1. 0р11111а1то1. У1к. δα. 30:2474 (1989), Βιο^ΐ е! а1., I. Уйо1. Ме111. 36:209 (1992), и ΒΐΌ\νπ апб МасЬеап (ебк.), Н8У Уник Рго1осо1к (Нитапа Ргекк 1997).
Альтернативно, экспрессионный вектор, содержащий ген ТАС1-иммуноглобулин, может быть внедрен в клетки субъекта липофекцией ш νί\Ό с использованием липосом. Искусственные катионные липиды могут быть использованы для получения липосом для трансфекции ш νί\Ό геном, кодирующим маркер (Ре1дпег е! а1., Ргос. ΝπΐΊ Асаб. δα. И8А 84:7413 (1987); Маскеу е! а1., Ргос. Νη1'1 Асаб. δα. И8А 85:8027 (1988)). Использование липофекции для внедрения экзогенных генов в специфические органы ш νί\Ό имеет определенные практические преимущества. Липосомы могут быть использованы для прямой трансфекции отдельных типов клеток, которые являются особенно полезными в ткани с клеточной гетерогенностью, таких как ткани поджелудочной железы, печени, почек и мозга. Липиды могут быть химически связаны с другими молекулами с целью мечения. Пептиды-мишени (например, гормоны или нейротрансмиттеры), белки, такие как антитела, или непептидные молекулы могут быть присоединены к липосомам химическим путем.
Электропорация является другим альтернативным способом введения. Например, А1йага апб М1уахакР №11иге Β^οΐесЬηο1ο§у 76:867 (1998) демонстрировали использование электропорации ш νί\Ό для переноса генов в мышцу.
Вообще, доза композиции, содержащей терапевтический вектор, имеющий нуклеотидную последовательность ТАС1-иммуноглобулина, например рекомбинантный вирус, будет варьировать в зависимости от таких факторов, как возраст субъекта, вес, рост, пол, общее медицинское состояние и предыдущая история болезни. Пригодные пути введения терапевтических векторов включают внутривенную инъекцию, внутриартериальную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутриопухолевую инъекцию и инъекцию внутрь каверны, которая содержит опухоль. В качестве иллюстрации Нойоп е! а1., Ргос. Νη1'1 Асаб. δα. ИЗА 96:1553 (1999), показал, что внутримышечная инъекция плазмидной ДНК, кодирующей
- 29 010594 интерферон-α, вызывает сильные противоопухолевые эффекты на первичные и метастазирующие опухоли в модельных экспериментах на мышах.
Композиция, содержащая вирусные векторы, не вирусные векторы или сочетание вирусных и не вирусных векторов настоящего изобретения, могут быть приготовлены в соответствии с известными способами получения фармацевтически пригодных композиций, тем самым векторы или вирусы комбинируют в композицию с фармацевтически приемлемым носителем. Как отмечалось выше, композиция, такая как фосфатно-солевой буферный раствор, указывается, должна быть «фармацевтически приемлемым носителем», если ее введение может быть выдержано субъектом-реципиентом. Другие пригодные носители хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Ветшд!ои'к Р11агтасеШюа1 8сЕ еисек, 1911 Еб. (Маск РиЬНкЫид Со. 1995), и СПтаи'к Не Р1агтасо1од1са1 ВакЕ оГ Тйегареийск, 7111 Еб. (МасМШаи РиЬйкЫид Со. 1985)).
В терапевтических целях, экспрессионный вектор терапевтического гена или рекомбинантный вирус, содержащий такой вектор, и фармацевтически приемлемый носитель вводят субъекту в терапевтически эффективном количестве. Указывают, что комбинация экспрессионного вектора (или вируса) и фармацевтически приемлемого носителя должна быть введена в «терапевтически эффективном количестве», если вводимое количество является физиологически существенным. Агент является физиологически существенным, если его наличие дает в результате обнаруживаемое изменение в физиологии реципиентного субъекта. Например, агент, используемый для лечения воспаления, является физиологически существенным, если его наличие смягчает воспалительный ответ. В другом примере, агент, используемый для ингибирования роста клеток опухоли, является физиологически значимым, если введение агента приводит к уменьшению числа опухолевых клеток, уменьшению метастаз, уменьшению в размере твердой опухоли или усилению некроза опухоли.
Если субъектом, которого лечат экспрессионным вектором терапевтического гена или рекомбинантным вирусом, является человек, тогда терапией является предпочтительно генная терапия соматической клетки. Это означает, что предпочтительное лечение человека экспрессионным вектором терапевтического гена или рекомбинантным вирусом не влечет за собой внедрение внутрь клеток молекулы нуклеиновой кислоты, которая может образовывать часть зародышевой линии человека и быть передана следующим поколениям (т.е. исправление генетических дефектов методами генетической инженерии в зародышевой линии человека).
10. Получение трансгенных мышей.
Трансгенные мыши могут быть созданы со сверхэкспрессируемыми последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими слитые белки ТАСЕиммуноглобулина во всех тканях, или под контролем тканеспецифичного или тканепредпочтительного регуляторного элемента. Это сверхпроизводство слитых белков ТАСЕиммуноглобулинов может быть использовано для отличия фенотипа, который получается в результате сверхэкспрессии, и трансгенные животные могут служить моделью для заболеваний человека, вызванных избытком рецепторного белка ТАС'Ч. Трансгенные мыши, которые сверхэкспрессируют слитые белки ТАСЕиммуноглобулина, также предоставляют модель биореакторов по производству слитых белков ТАСЕиммуноглобулинов в молоке или в крови высших животных. Способы получения трансгенных мышей являются хорошо известными специалистам в данной области (см., например, 1асоЬ, Ехртеккюи аиб Киоскои! оГ ШетГетоик ίη Ттаикдешс Мюе, в 0уетехртеккюи аиб Киоскои! оГ Су!окшек ίη Ттаикдешс Мюе, 1асоЬ (еб.), стр. 111-124 (Асабетю Ргекк, Ь!б. 1994), Моиак!егкку аиб ВоЬ1 (ебк.), 8!га!ещек 1и Тгаикдешс Ашта1 8аеисе (А8М Ргекк 1995), и АЬЬиб аиб №1кои, ВесотЬшаи! Рго!еш Ехртеккюи 1и Ттаикдешс Мюе, в Сеие Ехртеккюи 8ук!етк: Иктд №1Шге Гог !1е Аг! оГ Ехртеккюи, Еетаибех аиб ноеГГ1ег (ебк.), стр. 367-397 (Асабетю Ргекк, Шс. 1999)).
Например, способ получения трансгенной мыши, которая экспрессирует нуклеотидную последовательность, которая кодирует слитый белок ТАСЕиммуноглобулина, может начинаться с взрослых, фертильных мужских особей (производителей) (В6С3Г1, в возрасте от 2 до 8 месяцев (Тасошс Рагтк Сегтаи!отеи, NΥ)), самцов после вазектомии (поддельных) (В6О2Г1, в возрасте от 2 до 8 месяцев (Тасошс Рагтк)), препубертатных фертильных самок (доноры) (В6С3Г1, от 4 до 5 недель (Тасошс Рагтк)) и взрослых фертильных самок (реципиентов) (В6О2н, от 2 до 4 месяцев, (Тасошс Рагтк)). Доноров акклиматизируют в течение одной недели и затем инъецируют гонадотропином сыворотки жеребых кобыл в дозе приблизительно 8 МЕ/мышь (81дта СНетюа1 Сотраиу; 8!. Ьошк, МО) внутрибрюшинно и через 46-47 ч хорионическим гонадотропным гормоном человека в дозе 8 МЕ/мышь (1СС (кщта)) внутрибрюшинно, для индуцирования суперовуляции. Доноров спаривали с производителями вслед за гормональными инъекциями. Овуляция вообще происходит в течение 13 ч инъекции 1СС. Копуляцию подтверждают наличием вагинальной пробки утром после спаривания.
Оплодотворенные яйцеклетки собирают под хирургическим микроскопом. Яйцеводы собирают и яйцеклетки выпускают на пластинки для анализа мочи, содержащие гиалуронидазу (кщта). Яйцеклетки промывают один раз в гиалуронидазе и дважды в среде Виттена (^Ыйеи'к \У640 шебшш, описанной, например, Мешио аиб 0'С1агау, Вю1. Вергоб. 77:159 (1986), и О1ег111аг1 аиб Оотеик, Ζудо!е 4:129 (1996)), яйцеклетки инкубировали с 5% С02, 5% 02 и 90% N при 37°С. Яйцеклетки затем хранят в инкубаторе
- 30 010594 при 37°С/5% С02 вплоть до микроинъекции.
От 10 до 20 мкг плазмидной ДНК, содержащей кодирующую последовательность слитого белка ТАС1-иммуноглобулина, линеаризируют, очищают в геле и ресуспендируют в 10 мМ ТП5-НС1 (рН 7,4), 0,25 мМ ЕЭТА (рН 8,0) до конечной концентрации 5-10 нанограмм на микролитр для микроинъекции. Например, кодирующие последовательности слитого белка ТАС1-иммуноглобулина могут кодировать ТАС1-полипептид с делецией аминокислотных остатков с 1 до 29 и с 111 до 154 8ЕЦ ΙΌ N0:2 и фрагмент Рс5 иммуноглобулина.
Плазмидную ДНК микроинъецируют в собранные яйцеклетки, заключенные в каплю среды ^640, покрывают теплым, уравновешенным С02, минеральным маслом. ДНК втягивают внутрь инъекционной иглы (вытянутой из боросиликатного стеклянного капилляра с внутренним диаметром 0,75 мм, наружным диаметром 1 мм) и инъецируют внутрь отдельных яйцеклеток. Каждую яйцеклетку пронизывают инъекционной иглой внутрь одного или обоих гаплоидных пронуклеусов.
Пиколитры ДНК инъецируют внутрь пронуклеуса и инъекционную иглу удаляют без вступления в контакт с ядрышком. Процедуру повторяют до тех пор, пока все яйцеклетки будут инъецированы. Успешно микроинъецированные яйцеклетки переносят внутрь органной кюветы для клеточной культуры с предварительно газированной средой \У640 для хранения в течение ночи в инкубаторе при 37°С/5% С02.
На следующий день двухклеточные эмбрионы переносят внутрь псевдобеременных реципиентов. Реципиентов идентифицируют по наличию копуляционных пробок после копуляции с вазектомированными подделками. Реципиентов подвергают анестезированию и выбривают левую сторону спины, переносят под хирургический микроскоп. Делают небольшой надрез в коже и через мышечную стенку в середине брюшной области очерчивают реберную клетку, таз и заднюю ногу, шириной между коленом и селезенкой. Репродуктивные органы временно выводят на поверхность тела внутрь небольшой хирургической складки. Жировое тело протягивают над хирургической складкой и маломощным сосудистым зажимом (ИоЬох, ИоскуШе, МО) прикрепляют к жировому телу и оставляют, подвешивая над спинкой мыши, предохраняя органы от соскальзывания обратно внутрь.
Высококачественной пипеткой для переноса, содержащей минеральное масло, за которым следует чередование \У640 с воздушными пузырьками, 12-17 здоровых двухклеточных эмбрионов от инъецирования в предыдущий день переносят внутрь реципиента. Разбухший пузырек помещают и прикрепляют яйцевод между пузырьком и сумкой, разрез в яйцеводе делают 28-граммовой иглой рядом с сумкой, будучи уверенными, что пузырек или сумка не повреждены.
Пипетку переносят в разрез в яйцеводе и выдувают эмбрионы внутрь, допуская первый воздушный пузырек до вытекания из пипетки. Жировое тело осторожно вдавливают внутрь брюшины и репродуктивным органам позволяют соскользнуть внутрь. Стенку брюшины закрывают одним швом и шкурку закрывают раневым зажимом. Мышей восстанавливают на плавном нагревателе при 37°С в течение минимум 4 ч.
Реципиентов возвращают в клетки парами и допускают 19-21-дневный период беременности. После рождения допускают 19-21-дневный послеродовой период перед отнятием от груди. У отнятых от груди детенышей определяют пол и помещают в отдельные клетки по половому признаку и производят биопсию, отрезают чистыми ножницами 0,5 см хвоста (для определения генотипа).
Геномную ДНК получают из хвостовых отрезков, с использованием, например, набора О^СЕН ВХЕА8У, следуя инструкциям фирмы-производителя. Геномную ДНК анализируют методом ПЦР с использованием праймеров, сконструированных для амплификации последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих слитый белок ТАС1-иммуноглобулина или селективный маркерный ген, который был внедрен в ту же самую плазмиду. После подтверждения того, что животные должны быть трансгенными, их подвергают возвратному скрещиванию внутри инбредной линии путем помещения трансгенных самок вместе с самцами дикого типа или трансгенных самцов с одной или двумя (самкой) самками дикого типа. По мере того как детеныши рождаются и их отнимают от груди, их разделяют по полу и отрезают их хвостики для генотипического различия.
Для проверки экспрессии трансгена в живом животном производят частичную гепатэктомию. Хирургическое начало готовят в верхней части живота непосредственно под мечевидным отростком грудины. Используя стерильные приемы, делают небольшой 1,5-2 см надрез ниже грудины и временно выводят на поверхность левую латеральную долю печени. С использованием шелковой нити 4-0 обвязывают вокруг нижней доли, закрепляя ее с внешней стороны разреза тела. Атравматический зажим используют для фиксации банта, в то время как вторую петлю рассасывающегося дексона (Вехой, Атепсап Суапат1б; ^аупе, N.1.) помещают на ближайшем расстоянии к первому узлу. Дистальный надрез делают от дексонового узла и приблизительно 100 мг отсеченной ткани печени помещают в стерильную чашку Петри. Отсеченный сегмент печени переносят в 14-миллилитровую пропиленовую круглодонную пробирку и кусочек замораживают в жидком азоте и затем хранят в сухом льду. Хирургический участок закрывают наложением швов и раневых скрепок и клетки животных после операции помещают на подушку с подогревом на 37°С в течение 24 ч. В послеоперационный период животных проверяют ежедневно и раневые скрепки удаляют через 7-10 дней после операции. Уровень экспрессии мРНК слитого белка ТАС1-иммуноглобулина проверяют для каждой трансгенной мыши с использованием метода РНК
- 31 010594 гибридизации в растворе или полимеразной цепной реакции.
Используя общие подходы, описанные выше, получили трансгенных мышей, которые экспрессируют существенные уровни слитого белка ТАС1-иммуноглобулина в молоке. В этом конкретном случае, кодирующая последовательность слитого белка ТАС1-иммуноглобулина, кодировала полипептид ТАС1 с делецией аминокислотных остатков с 1 по 29 и с 111 по 154 8ЕЦ ΙΌ Ν0:2 и иммуноглобулиновый Ес5фрагмент.
Таким образом, настоящее изобретение вообще описывает, как будет понятно более легко из ссылок на следующие примеры, которые предоставляют в качестве иллюстрации и которые не предназначены ограничивать настоящее изобретение.
Пример 1. Конструирование молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют белки ТАС1-Ес.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие ТАС1 человека, получали во время экспрессионного клонирования рецепторов 2Т№4, как описано Сгакк е! а1., №Ш1ге 404:995 (2000). Кодирующие последовательности, содержащие в себе экспрессионные конструкции ТАС1-Ес, создавали методом ПЦР с перекрытием, с использованием стандартных методов (см., например, Ηοί^ е! а1., Сепе 77:61 (1989)). кДНК ТАС1 человека и кДНК Ес использовали в качестве стартовых матриц для ПЦР-амплификации. ПЦРпраймеры сконструировали для получения желаемой кодирующей последовательности на 5'- и 3'- концах и для внедрения сайтов узнавания ферментами рестрикции для облегчения встраивания этих кодирующих последовательностей в экспрессионные векторы. Кодирующие последовательности ТАС1-Ес встраивали внутрь экспрессионных векторов, которые содержали в себе функциональный ген дигидрофолатредуктазы мыши. Один экспрессионный вектор также содержал цитомегаловирусный промотор для направления экспрессии трансгенного рекомбинантного белка, иммуноглобулиновый интрон, сигнальную последовательность тканевого плазминогенного активатора, последовательность, определяющую место входа внутрь рибосом, удаленный цистрон СЭ8 для отбора зараженных клеток на поверхности и дрожжевые экспрессионные элементы для роста плазмид в дрожжевых клетках.
Один подход, который использовали для получения слитых белков ТАС1-Ес иммуноглобулин, иллюстрируют способом, используемым для конструирования ТАС1-Ес4. Другие слитые белки ТАС1-Ес получали инсерцией нуклеотидных последовательностей, которые кодируют слитый белок ТАС1-Ес иммуноглобулин, в экспрессионный вектор млекопитающих и внедреним этого экспрессионного вектора в клетки млекопитающих.
А. Конструирование фрагмента Ес4 Ι§γ1.
Для приготовления слитого белка ТАС1-Ес4 модифицировали Ес-фрагмент 1дС1 человека (шарнирный участок доменов СН2 и СН3) для удаления связывающих функций Есγ1 с рецептором (Ес/И1) и с комплементом (С1ц). Этот модифицированный вариант Ес 1дС1 человека обозначили «Ес4».
Ес-фрагмент изолировали из ПЦР-библиотеки печени человеческих эмбрионов (Скэп!есй) с использованием олигопраймеров 5' АТСАССССАА ТТСАСАТСТТ САСАСААААС ТСАСАСАТСС ССАС 3' (8ЕС) ΙΌ Ν0:7) и 5' СССАСТСТСТ АСАТСАТТТА СССССАСАСА СССАС 3' (8ЕО ΙΌ Ν0:8). Мутации внутрь Ес-фрагмента вводили методом ПЦР для уменьшения связывания ΕογΚ.1. Связывающий сайт Ес';'Е1 (Ееи-Ьеи-С1у-С1у; аминокислотные остатки с 38 по 41 8ЕЦ ΙΌ Ν0:6, что соответствует положениям с 234 по 237 по индексации Европейского сообщества) видоизменили на А1а-С1и-С1у-А1а для уменьшения связывания ЕсγΚ1 (см., например, Эппсам е! а1., №Ш1ге 332:563 (1988); Ваит е! а1., ЕМВ0 1. 73:3992 (1994)). Олигонуклеотидные праймеры 5' СССТССССАС САССТСААСС ССАССССССА СССТСАСТСТ ТССТСТТССС С 3' (/ЕЕ) ΙΌ Ν0:9) и 5' ССАТТСТАСА ТТАТТТАССС ССАСАСАССС А 3' (8ЕЦ ΙΌ Ν0:10) использовали для внедрения изменений. К 50 мкл конечного объема добавляли 570 нг матрицы [дЕс, 5 мкл 10-кратного буфера для реакции РГи (8!га!адепе), 8 мкл 1,25 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бКГРк) 31 мкл дистиллированной воды, 2 мкл 20 мМ олигонуклеотидных праймеров. Добавляли равный объем минерального масла и реакционную смесь нагревали до 94°С в течение 1 мин. Добавляли РГи-полимеразу (2,5 единиц, 8!га!адепе), после чего следуют 25 циклов при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 1 мин, с последующим удлинением в течение 7 мин при 72°С. Продукты реакции фракционировали методом электрофореза и обнаруживали полосу, соответствующую прогнозированному размеру около 676 пар нуклеотидов. Эту полосу вырезали из геля и ДНК выделяли с использованием набора ^IАСΕN ΟΙАцшскТМ Се1 Ех1гас!юп Кй (О|адеп) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.
ПЦР также использовали для введения замены А1а на 8ег (аминокислотный остаток 134 8ЕЦ ΙΌ Ν0:6, который соответствует положению 330 по индексации Европейского сообщества) и Рго на 8ег (аминокислотный остаток 135 8ЕЦ ΙΌ Ν0:6, который соответствует положению 331 по индексации Европейского сообщества) для уменьшения связывания комплемента С1с| или фиксирования комплемента (Эипсап апб ^ш!ег, №Ш1ге 332:788 (1988)). Два первых цикла реакции выполняли с использованием в качестве матрицы, измененной в результате побочной мутации последовательности ЦЕс, связывающую Ес/И1. К 50 мкл конечного объема добавляли 1 мкл измененной матрицы ЦЕс, связвающего сайта Ес'/ИЕ 5 мкл 10-кратного буфера для реакции РГи (81га1адепе), 8 мкл 1,25 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бЭТРк), 31 мкл дистиллированной воды, 2 мкл 20 мМ 5' ССТССССССТ СССАСАТССС
- 32 010594
ТССТСТСССА ССССАСАТСТ ТСАСАСАААА СТСАС 3' (8 ЕС) ГО N3:11), 5'-начало праймера с нуклеотида 36 8ЕС) ГО ^:5, и 2 мкл 20 мМ 5' ТСССАССССТ ТТСТТССА 3' (8ЕО ГО ^:12), 3'-начало праймера с комплементарного нуклеотида 405 8ЕО ГО NО:5. Вторая реакционная смесь содержала по 2 мкл каждого из 20 мМ матричных олигонуклеотидных примеров 5' ТССААСАААС СССТСССАТС СТССАТССАС ААААССАТСТ СС 3' (8Е<3 ГО N3:13), 5'-начало праймера с нуклеотида 388 8ЕО ГО ^:5 и 5' ССАТССАТСС АТСААССАСС ТСТССТТСТТ ССТССТССТС СТССССССТС ССАСАТС 3' (8ЕО ГО NО:14), 3'-праймер для внедрения мутации А1а на 8ег, ХЬа1 сайт рестрикции и стоп-кодон. Добавляли равный объем минерального масла и реакционную смесь нагревали до 94°С в течение 1 мин. Добавляли РГи-полимеразу (2,5 единиц, 8!га!адепе), после чего следуют 25 циклов при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 2 мин, с последующим удлинением в течение 7 мин при 72°С. Продукты реакции фракционировали методом электрофореза и обнаруживали полосы, соответствующие прогнозированным размерам около 370 и около 395 пар нуклеотидов соответственно. Полосы вырезали из геля и экстрагировали с использованием набора ^IАСЕN р1АдшскТМ Се1 Ех!гасйоп К1! (01ареп) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.
Второй цикл реакции проводили для соединения вышеуказанных фрагментов и добавления сайта рестрикции 5' ВатН1 и сигнальной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи 2'Сь иммуноглобулина человека ГВЬ (Содпе е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 78:1485 (1988)). К 50 мкл конечного объема добавляли 30 мкл дистиллированной воды, 8 мкл 1,25 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бКГРк), 5 мкл 10-кратного полимеразного реакционного буфера РГи (8!га!адепе) и по 1 мкл каждого из двух первых двух продуктов ПЦР. Добавляли равный объем минерального масла и реакционную смесь нагревали до 94°С в течение 1 мин. Добавляли РГи-полимеразу (2,5 единиц, 8!га!адепе), после чего следуют 5 циклов при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин. Температуру опять поднимали до 94°С и добавляли по 2 мкл каждого из 20 мМ матричных растворов 5' ССАТССАТСС АТСААССАСС ТСТССТТСТТ ССТССТССТС СТССССССТС ССАСАТС 3' (8ЕС) ГО МО:14), 5'-начало праймера с нуклеотида 1 8ЕС) ГО МО: 5, и 5' ССАТТСТАСА ТТАТТТАССС ССАСАСАССС А 3' (8ЕО ГО ^:10) с последующими 25 циклами при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 2 мин и в конце с удлинением в течение 7 мин при 72°С. Продукты реакции обнаруживали с использованием гельэлектрофореза. Обнаружили полосу, соответствующую прогнозированному размеру в 789 пар нуклеотидов.
В. Конструирование экспрессионного вектора ТАС1-Рс4.
Экспрессионные плазмиды, содержащие кодирующую область слитого белка ТАС1-Рс4, конструировали с помощью гомологичной рекомбинации в дрожжах. Фрагмент кДНК ТАС1, который включал полинуклеотидную последовательность с 14 нуклеотида по 475 нуклеотид 8ЕО ГО NО:1, изолировали с использованием ПЦР. Обоими праймерами, используемыми в наработке фрагмента ТАС1, были: (1) праймер, содержащий в себе 40 пар оснований 5'-векторной фланкирующей последовательности и 17 пар оснований, соответствующих аминоконцу фрагмента ТАС1 (5' СТСАСССАСС АААТССАТСС ССАСТТСАСА СССТТСССТА СААТСАСТСС ССТСССССС 3'; 8ЕС) ГО ^:15; (2) 40 пар оснований 3'-конца, соответствующих фланкирующей последовательности Рс4 и 17 пар оснований, соответствующих карбоксильному концу фрагмента ТАС1 (5' ССАТСТСТСА СТТТТСТСТС ААСАТСТССС СТССТТСАСС ССССССАС 3'; 8ЕО ГО NО:16). К 100 мкл конечного объема добавляли 10 нг матрицы ТАС1, 10 мкл 10-кратного буфера для Тад-полимеразы (10х Тад ро1утегаке Веасйоп ВиГГег, Регкт Е1тег), 8 мкл 2,5 нМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бКТРк), 78 мкл дистиллированной воды, по 2 мкл каждого из 20 мМ матричных растворов олигонуклеотидных праймеров и Тад-полимеразу (2,5 единиц, ЫГе Тесйио1о§у). Добавляли равный объем минерального масла и реакционную смесь нагревали до 94°С в течение 2 мин с последующими 25 циклами при 94°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 72°С в течение 1 мин с последующим удлинением в течение 5 мин при 72°С.
Фрагмент, содержащий кДНК, кодирующую фрагмент Рс4, конструировали сходным образом. Обоими праймерами, использованными для получения фрагмента Рс4 (против хода и по ходу транскрипции), были олигонуклеотидные праймеры, содержащие в себе 40 пар оснований 5' ТАС1-фланкирующей последовательности и 17 пар оснований, соответствующих аминоконцу фрагмента Рс4 (5' ССАСАСАССС ТСАСААССАА СТССАССТСТ ССССССССТС ААССАССССА САТСТТСАСА 3'; 8 ЕС) ГО NО:17; и олигонуклеотидный праймер, содержащий в себе 40 пар оснований на 3'-конце, соответствующие фланкирующей векторной последовательности, и 17 пар оснований, соответствующих карбоксильному концу фрагмента Рс4 (5' ССССТСССТА СААССССАСА ССТСТТТТАА ТСТАСАТТАТ ТТАСССССАС АСАССС 3'; 8ЕО ГО NО:18). К 100 мкл конечного объема добавляли 10 нг матрицы Рс4, описанной выше, 10 мкл 10-кратного буфера для Тад-полимеразы (10х Тад ро1утегаке Веасйоп ВиГГег, Регкт Е1тег), 8 мкл 2,5 нМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бКТРк), 78 мкл дистиллированной воды, по 2 мкл каждого из 20 мМ матричных растворов олигонуклеотидов и Тад-полимеразу (2,5 единиц, ЫГе Тес11по1ору). Добавляли равный объем минерального масла и реакционную смесь нагревали до 94°С в течение 2 мин, с последующими 25 циклами при 94°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 72°С в течение 1 мин с последующим удлинением в течение 5 мин при 72°С.
- 33 010594
По 10 мкл из каждой из 100 мкл реакционных смесей ПЦР, описанных выше, прогоняли в 0,8% БМР-агарозном геле (8еар1адие) с 1-кратным буфером ТВЕ для анализа. Оставшиеся 90 мкл реакционной смеси ПЦР осаждали добавлением 5 мкл 1М хлорида натрия и 250 мкл абсолютного этанола. Плазмиду ρΖΜΡ6 расщепляли 8та1 для линеаризации ее в полилинкере. Плазмиду ρΖΜΡ6 получали из ρΟΖΚ199 (Атепсап Туре Си1!иге Со11ес!юп, Мапаккак, УА, АТСС#98668), и она представляет собой экспрессионный вектор, содержащий экспрессионную кассету, имеющую предранний промотор цитомегаловируса, общий типичный интрон локуса вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, множественные сайты рестрикции для внедрения кодирующих последовательностей, стоп-кодон и терминатор гормона роста человека. Плазмида также имеет точку начала репликации Е.сой, экспрессионную единицу селективного маркера млекопитающих, имеющую промотор 8У40, энхансер и точку начала репликации, ген дигидрофолатредуктазы и терминатор 8У40. Вектор ρΖΜΡ6 конструировали из ρΟΖΚ199 замещением металлотионеинового промотора на цитомегаловирусный предранний промотор и последовательность Кохас на 5'-конце открытой рамки считывания.
100 мкл компетентных дрожжевых клеток (8.сегеу1к1ае) смешивали с 10 мкл, содержащими приблизительно 1 мкг внеклеточного домена ТАСЧ и ПЦР-фрагменты Ес4, и с 100 нг вектора ρΖΜΡ6, переваренного 8та1, и переносили в 0,2-сантиметровую кювету для электропорации. Смеси дрожжи/ДНК подвергали электропульсации при 0,75 кВ (5 кВ/см), ж Ом, 25 мкФ. В каждую кювету добавляли 600 мкл 1,2М сорбита и две аликвоты дрожжей по 300 мкл распределяли в двух чашках с ИКА-Э и инкубировали при 30°С.
После приблизительно 48 ч дрожжевые трансформанты Ига+ из одной чашки ресуспендировали в 1 мл воды и короткое время центрифугировали для получения осадка дрожжевых клеток. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл лизисного буфера (2% Тгйоп Х-100, 1% додецилсульфат натрия (8Ό8), 100 мМ №С1, 10 мМ Тпк, рн 8,0, 1 мМ ЭДТА). 500 мкл смеси для лизиса добавляли в пробирки Эппендорф, содержащие 300 мкл отмытых кислотой стеклянных шариков, и 200 мкл смеси фенол-хлороформ, дрожжевые клетки разрушали в вортексе в течение 1 мин с интервалами, два или три раза с последующим центрифугировнием в течение 5 мин в центрифуге Эппендорф на максимальных оборотах. 300 мкл водной фазы переносили в чистую пробирку и ДНК осаждали 600 мкл этанола с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 4°С. Осадок ДНК ресуспендировали в 100 мкл воды.
Трансформацию электрокомпетентных клеток Е.сой (Он10В, С1ЬсоВКЕ) осуществляли с использованием 0,5-2 мл начальной ДНК дрожжей и 40 мкл клеток ОИ10В. Клетки подвергали электропульсации при 2,0 кВ 25 мФ и 400 ом. Вслед за электропорацией, 1 мл 80С (2% Вас!о-Тгур!опе (П1Бсо, Ое1гой, МЦ 0,5% дрожжевой экстракт (Оксо), 10 мМ №С1, 2,5 мМ КС1, 10 мМ МдС12, 10 мМ Мд804, 20 мМ глюкоза) вносили в аликвотных объемах по 250 мкл в четыре чашки, содержащие ЬВ АМР (ЬВ Ьго!й (Ьепиох), 1,8% Вас!о-Адаг (П1Бсо), 100 мг/л ампициллина).
Индивидуальные клоны, скрывающие правильную экспрессионную конструкцию ТАС[-Ес4, идентифицировали рестрикционным перевариванием для подтверждения наличия инсерции и для подтверждения, что различные последовательности ДНК правильно соединились одни с другими. Вставки позитивных клонов подвергали анализу последовательностей. Крупные плазмидные ДНК выделяли с использованием набора О|адеп Мах1 к1! (О|адеп) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.
С. Конструирование Ес5, Ес6 и Ес7.
В Ес5 остаток Агд 218 по индексной позиции Европейского сообщества заменили обратно на остаток Бук. Ιβγ1 дикого типа человека содержит лизин в этом положении. Кратко, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие Ес5, получали с использованием олигонуклеотидных праймеров 5' 6А6СССАААТСТТСА6АСААААСТСАСАСАТ6СССА 3' (8 ЕС) ΙΌ N0:19) и 5' ТААТТ66С6С6ССТСТА6АТТАТТТАССС66А6АСА 3' (8 ЕС) ΙΌ N0:20). Условия ПЦРамплификации были следующими. К 50 мкл конечного объема добавляли 236 нг матрицы Ес4, 5 мкл 10кратного буфера для реакции РБц (8!га!адепе), 4 мкл 2,5 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (йЭТРк), по 1 мкл 20 мкМ каждого олигонуклеотида и 1 мкл Рки-полимеразы (2,5 единиц, 8Сга1адепе). Температурный профиль амплификации состоял из 94°С в течение 2 мин, 5 циклов при 94°С в течение 15 с, 42°С в течение 20 с, 72°С в течение 45 с, 20 циклов при 94°С в течение 15 с, 72°С в течение 1 мин 20 с с последующим удлинением в течение 7 мин при 72°С. Продукты реакции фракционировали методом электрофореза в агарозном геле и обнаружили полосу, соответствующую прогнозированнному размеру около 718 пар нуклеотидов. Полосу вырезали из геля и восстанавливали с использованием набора О^СЕХ Ц^дшскТМ Се1 Ех1гас!юи Кй (Цхадеи) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.
Ес6 является идентичным Ес5 за исключением того, что карбоксиконцевой лизиновый кодон удалили. Как у Ес4 и Ес5, как указано выше, стоп-кодон в последовательности Ес6 изменили на ТАА. Ес6 получали из ДНК-матрицы, которая кодирует Ес5 с использованием праймеров 5' САССССАААТ СТТСАСАСАА ААСТСАСАСА ТССССА 3' (8ЕС) ΙΌ N0:19) и 5' 66С6С6ССТС ТАСАТТААСС С66А6АСА66 6А6А66С 3' (8ЕС) ΙΌ N0:21).
Ес7 является идентичным Ес γ1 дикого типа за исключением замещения аминокислоты Акп в 297 положении по индексации Европейского сообщества, локализованной в СН2-домене. Акп 297 заменили
- 34 010594 на остаток С1и для предотвращения присоединения Ν-концевого углевода в этом положении остатка. Как сказано выше, стоп-кодон в последовательности Ес7 заменили на ТАА. Ес7 получили перекрыванием ПЦР, с использованием кДНК Ес дикого типа человека в качестве матрицы и олигонуклеотидных праймеров 5' САССССАААТСТТСССАСААААСТСАСА 3' (δ ЕС) II) N0:22) и 5'
СТАССТССТТТССТАСТССТССТССССССССТТ 3' (δΗ(') II) N0:23) для 5'-участка Ес7 и олигонуклеотидных праймеров 5' САСТАССАААССАССТАСССТСТССТСА 3' (δ ЕС) II) N0:24) и 5' ТААТТССССССССТСТАСАТТАТТТАСССССАСАСА 3' (8Ер II) N0:20) для создания 3'-участка Ес7. Два ПЦР-продукта объединяли и амплифицировали с использованием олигонуклеоидных праймеров 5' САССССАААТСТТСССАСААААСТСАСА 3' (δЕС) II) N0:22) и 5' ТААТТССССССССТСТАСАТТАТТТАСССССАСАСА 3' (δΙΤ) II) N0:20).
Все получающиеся в результате ПЦР продукты очищали в геле, клонировали и подтверждали анализом последовательности ДНК.
Ό. Конструирование аминоукороченных слитых белков ТАСЧ-Ес.
Создали четыре аминоконцевых укороченных варианта ТАСЧ-Ес. Все четыре имели модифицированную сигнальную последовательность (ЪЕЦ ГО N0:25) активатора плазминогена тканей человека, слитую с аминокислотным остатком номер 30 δΞρ ГО N0:2. Однако четыре белка, отличающиеся по положению точки, в которой Ес5 был слит с аминокислотной последовательностью ТАСЧ δΞρ ГО N0:2. Табл. 3 обрисовывает структуры четырех слитых белков.
Таблица 3
Слитые белки ТАСЧ
Наименование ТАСЬРс Аминокислотные остатки ТАС1
ТАС1(с11-29)-Рс5 с 30 по 154 8Е0 Ю N0:2
ТАС1(61-29,с1107-154)-Рс5 с 30 по 106 8ЕО Ю N0:2
ТАС1(С| 1 -29,ά 111-154)-Рс5 с 30 поПОЗЕО Ю N0:2
ТАС1(с11-29,с1120-154)-Рс5 с30по119 8Е0 Ю N0:2
Экспрессионные кассеты, кодирующие белки, создали методом перекрывания ПЦР с использованием стандартных методов (см., например, Нойои е! а1., Сеие 77:61 (1989)). Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ТАС! и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую Ес5, использовали в качестве матриц ПЦР. Олигонуклеотидные праймеры идентифицированы в табл. 4 и 5.
Таблица 4 Олигонуклеотидные праймеры, использованные для получения слитых белков ТАС!
Наименование ТАС!-Рс Наименование олигонуклеотидов
5’ТАС1 3-ТАС1 5’Рс5 З’Рсб
ТАС1(с11-29)-Рс5 Ζ024.903 Ζ024.955 ΖΟ24,952 Ζ024,946
ТАС1(01-29,Й107-154)-Рс5 Ζ024.903 ΖΟ24.951 Ζ024,949 ΖΟ24.946
ТАС1(с11-29,с!111-154)-Рс5 ΖΟ24.9Ο3 ΖΟ28,978 ΖΟ28,979 ΖΟ24.946
ТАС1(с11-29,с1120-154)-Рс5 2024,903 Ζ028,981 ΣΟ28,980 Ζ024,946
- 35 010594
Таблица 5
Олигонуклеотидные последовательности
Праймер Нуклеотидная последовательность 5Е0 Ю ΝΟ
ΖΟ24.903 5 ТАТТАбСССеСССАССАТСОАТССААТСА 3’ 40
ΖΟ24.955 5 тзААСАттгсеестссттоАбАССтбсеА з 41
ΖΟ24,952 5 ТСССАСЗСТСТСААССАССССАААТСТТСА 3 42
ΖΟ24.946 5ТААТТС6ССССССТСТАСАТТАТТТАССС<3<ЗАЙАСА 3 20
Ζ024,951 5 ТбААОАТТТООССТСОТТСТСАСАЙААбТА 3 43
гС24,949 5 АТАСТТСТбТОАОААСОАбСССАААТСТТСА 3 44
Ζ028,978 5 ТТТбОеСТСССТССТСАОСТТСТТСТСАСА 3 45
Ζ028,979 5 СТСАССАСССАОСССАААТСТТСАбАСА 3 46
Ζ028,981 5 ТТТ6СССТСССТ6АОСТСТ6СТ6ОАА 3 47
2С28,980 5 бАССТСАСССАССССАААТСТТСАСАСА 3 48
Первый цикл амплификаций с использованием ПЦР состоит из двух реакций для каждого из четырех аминоконцевых укороченных вариантов. Две реакции выполняли отдельно с использованием в одной реакции 5' и 3' олигонуклеотидов ТАО и 5' и 3' олигонуклеотидов Рс5 в другой реакции для каждого варианта. Условия первого цикла ПЦР-амплификации были следующими. К 25 мкл конечного объема добавляли приблизительно 200 нг ДНК-матрицы, 2,5 мкл 10-кратного буфера для реакции Рки (8!га!адепе), 2 мкл 2,5 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бКГРк), по 0,5 мкл 20 мкМ каждого 5' олигонуклеотида и 3' олигонуклеотида и 0,5 мкл Рки-полимеразы (2,5 единиц, 8!га!адепе). Температурный профиль амплификации состоял из 94°С в течение 3 мин, 35 циклов при 94°С в течение 15 с, 50°С в течение 15 с, 72°С в течение 2 мин с последующим удлинением в течение 2 мин при 72°С. Продукты реакции фракционировали методом электрофореза в агарозном геле и полосы, соответствующие прогнозированным размерам, вырезали из геля и восстанавливали с использованием набора Ο^ΟΕΝ ОМОиК’К Се1 Ех!гасНоп Κίΐ (О/адеп) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.
Второй цикл ПЦР-амплификации, или ПЦР-амплификация реакций с перекрытием, выполняли с использованием фрагментов, очищенных в геле, после первого цикла ПЦР в качестве ДНК-матрицы. Условия второго цикла ПЦР-амплификации были следующими. К 25 мкл конечного объема добавляли приблизительно 10 нг ДНК-матрицы каждого из фрагментов ТАО и фрагментов Рс5, 2,5 мкл 10-кратного буфера для реакции Рки (8йта!адепе), 2 мкл 2,5 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бЭТРк), 0,5 мкл 20 мкМ каждого 2С24,903 (8ЕО ГО N0:40) и 2С24,946 (8Е0 ГО N0:20) и 0,5 мкл Рки-полимеразы (2,5 единиц, 81га1адепе). Температурный профиль амплификации состоял из: 94°С в течение 1 мин, 35 циклов при 94°С в течение 15 с, 55°С в течение 15 с, 72°С в течение 2 мин с последующим удлинением в течение 2 мин при 72°С. Продукты реакции фракционировали методом электрофореза в агарозном геле, и полосы, соответствующие прогнозированным размерам, вырезали из геля и восстанавливали с использованием набора ^IА6ЕN О^ОиК’К Се1 Ех1гасбоп Κίΐ (О/адеп) в соответствии с рекомендациями фирмыпроизводителя.
Каждый из четырех вариантов ПЦР-продуктов ТАСЕРс с укороченным аминоконцом отдельно клонировали с использованием набора ^йгодеп'к 2ЕК0ВЬиЭТ Т0Р0 РСК С1ошпд Κίΐ, следуя рекомендательному протоколу фирмы-изготовителя. Табл. 6 идентифицирует нуклеотидные и аминокислотные последовательности конструкций ТАСЕРс.
Таблица 6
Последовательности вариантов ТАСЕРс
Наименование ТАСРЕс Номера 8ЕО Ю
Нуклеотиды Аминокислоты
ТАС1(61-29)-Рс5 49 50
ТАС1(сП-29,6107-154)-Рс5 51 52
ТАС1(61-29,6111-154)-Рс5 53 54
ТАС1(61-29,6120-154)-Рс5 55 56
- 36 010594
После проверки нуклеотидных последовательностей плазмиды, содержащие каждый из четырех вариантов слитые ТАС1-Ес с укороченными аминоконцами, переваривали Екс1 и Акс1 для высвобождения амнокислотных кодирующих участков. Фрагменты Екс1-Акс1 лигировали внутрь экспрессионного вектора млекопитающих, содержащего промотор СМУ и поли-А участок 8У40. Экспрессионные векторы встраивали в клетки яичника китайского хомячка, как описано ниже.
Пример 2. Производство белков ТАС1-Ес клетками яичника китайского хомячка.
Экспрессионные конструкции ТАС1-Ес использовали для трансфекции посредством электропорации суспензионно-адаптированных клеток яичников китайского хомячка (СНО) ΌΘ44, выращенных в среде для клеток животных, не содержащих белки (Иг1аиЬ с! а1., 8от. Сс11. Мо1сс. Оспс!. 72:555 (1986)). В клетках СН0 ЭС44 отсутствует функциональный ген дигидрофолатредуктазы вследствие делеций в обоих местах дигидрофолатредуктазы в хромосомах. Рост клеток в присутствии возрастающих концентраций метотрексата дает в результате амплификацию гена дигидрофолатредуктазы и связанный ген, кодирующий рекомбинантный белок, работающий в экспрессионной конструкции.
Клетки СН0 Ό644 переносили на среду РЕСН0 (ЖН В^кс^сск, Ьспсха, К8) с добавлением 4 мМ Ь-глутамина (ЖН Вюксюпсск) и 1х гипотанаксинтимидин (Ь1Гс ТссΗио1од^ск) и клетки инкубировали при 37°С и 5% С02 в качалочных колбах Согшпд при 120 об./мин на ротационно-встряхивающей платформе. Клетки раздельно подвергали трансфекции линеаризированными экспрессионными плазмидами. Для обеспечения стерильности однократное осаждение этанолом проводили на льду в течение 25 мин соединением 200 мкг плазмидной ДНК в пробирке Эппендорф с 20 мкл изолированной спермы лосося, несущей ДНК (5' 3' 1пс. Вои1бсг, СО, 10 мг/мл), 22 мкл 3М №-10Ас (рН 5,2) и 484 мкл 100% этанола (6о1б
8Ыс1б С11ст1са1 Со., Нау^агб, СА). После инкубации пробирку центрифугировали при 14000 об./мин в микроцентрифуге, помещенной в холодную комнату при 4°С, супернатант удаляли, а осадок промывали дважды 0,5 мл 70% этанола и высушивали на воздухе.
В то время как осадок ДНК подсыхал, готовили клетки СН0 ЭС44 центрифугированием 106 суммарных клеток (16,5 мл) в 25 мл конических центрифужных пробирках при 900 об./мин в течение 5 мин. Клетки СН0 ЭС44 ресуспендировали в суммарном объеме 300 мкл ростовой среды РЕСН0 и помещали в кювету Сиус!!с с 0,4 см электродной щелью (ВюЖаб). После приблизительно 50 мин времени подсыхания, ДНК ресуспендировали в 500 мкл ростовой среды РЕСН0 и добавляли к клеткам в кювету так, что суммарный объем не превышал 800 мкл, и позволяли находиться при комнатной температуре в течение 5 мин для уменьшения образования пузырьков. Кювету помещали в аппарат ВюЯаб Оспс Ри1ксг II при 0,296 кВ и 0,950 высокой емкости и немедленно подвергали электропорации.
Клетки инкубировали 5 мин при комнатной температуре перед помещением в суммарный объем 20 мл среды РЕСН0 в колбе Со8!аг Т-75. Колбу помещали при 37°С и 5% С02 в течение 48 ч, затем клетки подсчитывали с использованием гемоцитометра, использующего высвобождение трипанового синего, и помещали в селекционную среду РЕСН0 без добавки гипотанаксинтимидина и содержащую 200 мМ метотрексата (Са1ВюсИст).
После восстановления процесса селекции с метотрексатом приспособленную среду, содержащую секретированные белки ТАС1-Ес, проверяли анализом Vск!с^и В1о!.
Пример 3. Структурный анализ белков ТАС1-Ес.
В определенных случаях слитые белки ТАС1-Ес частично очищали перед анализом. Кондиционированную среду из под культуры клеток яичника китайского хомячка стерилизовали фильтрацией через 0,22 мкм фильтр и белок ТАС1-Ес наносили на колонку с протеином А. Материал, связавшийся с протеином А, элюировали и пропускали через гель-фильтрационную колонку 8-200 для конечной очистки.
Vск!с^и В1о!-анализ проводили как с кондиционированной клеточной средой, так и с очищенным белком для оценки структурной стабильности белков ТАС1-Ес. Кратко, образцы белка или супернатанта переносили на нитроцеллюлозные мембраны и детектировали белки ТАС1-Ес с использованием козьих антимышиных 1дО2а, конъюгированных с пероксидазой (ВосЬгшдсг МаппКшт), или с использованием козьих антител, связанных с пероксидазой, против специфической 1дО Ес антисыворотки человека (Р1сгсс).
Анализы аминоконцевых аминокислотных последовательностей проводили с использванием системы для сиквенса белков Мобс1к 476А и 494 Рго!ст 8сс.|испссг 8ук!стк, Рсгкт Е1тсг АррНсб Вюкук!стк Охущюп (Еок!сг Сйу, СА). Результаты анализа обрабатывали с помощью АррНсб Вюкук!стк Мобс1 610А Эа1а Апа1ук1к 8ук!ст Гог Рго!ст 8с^исис^ид, усгкюп 2.1а (АррНсб Вюкук!стк, 1пс). Большая часть использованных приспособлений и реактивов была от АррНсб Вюкук!стк, 1пс.
Пример 4. Функциональный анализ белков ТАС1-Ес.
Для оценки характеристик связывания четырех белков ТАС1-Ес с ΖТNЕ4 использовали два подхода. Первым подходом измеряли способность конструкций ТАС1-Ес к конкуренции на чашках, покрытых ТАС1 за связывание ΖТNЕ4, меченного 125Ι. Во втором подходе инкубировали возрастающие концентрации ΖТNЕ4, меченого 125Ι, с каждой из конструкций ТАС1-Ес и определяли радиоактивность, связанную с осажденными комплексами ΖТNЕ4-ТАСI-Ес. Слитые белки ТАС1-Ес имели фрагменты ТАС1, которые не содержали 29 первых аминокислотных остатков аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2. Один из слитых белков имел фрагмент ТАС'Ч с интактной стволовой областью тогда
- 37 010594 как три из слитых белков ТАСЧ-Бс имели фрагменты с различными делециями в стволовой области (ТАО(б1-29, б107-154)-Бс5; ТАО(б1-29, б111-154)-Бс5; ТАО(б1-29, б120-154)-Бс5).
A. Конкурентный анализ связывания.
ΖΙΝΡ^ йодировали радиоактивным йодом с использованием 1обоЬеабк (Р1егсе), следуя стандартным способам. Кратко, 50 мкг ΖΊΝΈΓ йодировали 4 мКи 125Ι с использованием одноразовых шариков 1обоЬеаб. Реакционную смесь гасили 0,25% раствором бычьего сывороточного альбумина, а свободный 125Ι удаляли гель-фильтрацией с использованием колонки РИ-10 (Р1егсе). Специфическую активность препаратов '^Ι-ΖΙΝΈΤ· определяли осаждением трихлоруксусной кислотой до и после стадии обессоливания.
Ν-концевой фрагмент рецептора ТАСБ обозначенный как «ТАО-Ν», вносили в 96-луночные планшеты (по 100 мкл при 0,1 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывали, блокировали буфером Б^е^оск (Р1егсе) и снова промывали. Конструкции ТАС'Ч-Бс в различных концентрациях в диапазоне от 0 до 11,5 нг/мл смешивали с фиксированной концентрацией ^Ι-ΖΊΝΕ^· (20 нг/мл) и инкубировали в течение 2 ч при 37°С на планшете, покрытом ТАСРЫ. Контроли содержали или ТАСЬИ в растворе, или не содержали ТАСЧ-Бс. После инкубации планшеты отмывали и просчитывали. Каждое определение готовили в трехкратной повторности.
Результаты показали, что все конструкции ТАСЧ-Бс полностью ингибировали связывание 125ΙΖΤNР4 в концентрациях около 100 нг/мл или выше. Белки ТАСЧ-Бс, ТАСЦбТ^^-БсЗ, ТАСЧ(б1-29, б111154)-Бс5 и ТАСЧ(б1-29, б120-154)-Бс5 были более эффективными ингибиторами, чем конструкция ТАСЧБс ТАСЧ(б1-29, б107-154)-Бс5. Сам фрагмент Бс не ингибировал связывание. Значения Ю, подсчитывали для каждой конструкции в трех экспериментах. Средние значения для конструкций составляли ТАСЦб129)-Бс5: 2,07 нМ; ТАО(б1-29, б107-154)-Бс5: 4,95 нМ; ТАСЦб1-29, б111-154)-Бс5: 2,31 нМ; и ТАО(б129, б120-154)-Бс5: 2,21 нМ.
B. Анализ связывания в растворе.
Каждую конструкцию ТАСЧ-Бс концентрации 0,05 нМ инкубировали с от 0,4 пкМ до 1,5 нМ 125ΙΖΤNР4 в течение 30 мин при комнатной температуре в суммарном объеме 0,25 мл/пробирку. В каждую пробирку добавляли суспензию РапкогЬт (Б1а]э11 А) и после 15 мин образцы центрифугировали, дважды промывали и осадки просчитывали. Неспецифическое связывание определяли добавлением 130 нМ немеченого ΖΤNР4 к смеси 125I-ΖΤNР4/ΤАСI-Рс. Специфическое связывание определяли вычитанием связанных импульсов/мин (с]эт) в присутствие немеченного ΖΤNΡ4 из общего значения связанных имп./мин (с]эт) при каждой концентрации 125I-ΖΤNΡ4. Каждое определение проводили в трехкратной повторности. Константы связывания рассчитывали с использованием программного обеспечения О^аρйРаб Рпкт коГ!\гаге (Маст!окй ν.3.0).
Фиг. 4 иллюстрирует специфическое связывание 125I-ΖΤNΡ4 с различными конструкциями ТАСРРс. Связывание обнаруживали при приближении насыщения каждой конструкцией и было существенно выше для конструкций ΤАСI(б1-29)-Рс5, ТАО(б1-29, б111-154)-Бс5, ТАО(б1-29, б120-154)-Бс5 по сравнению со связыванием ТАСЧ(б1-29, б107-154)-Бс5. Рассчитывали значения максимального связывание (Втах) и константу диссоциации (Кб), и результаты суммировали в табл. 7.
Таблица 7 Связывание 125I-ΖΤNР4 с конструкциями ТАСЧ-Бс
Конструкция ТАС1-Ес Кч (нМ) Вт„(нМ)
ТАС1(И1-29)-Ес5 0,134 0,023
ТАС1(с11-29,4107-154)-Ес5 0,121 0,010
ТАС1(41-29,<Л11-154)-Бс5 0,115 0,018
ТАС1(<11-29,с1120-154)-Ес5 0,092 0,021
Пример 5. Определение циркулирующего ΖΤNР4.
Уровни ΖΤNР4 у индивидуумов с болезненными состояниями (такими как, например, системная красная волчанка, ревматоидный артрит) по отношению к нормальным индивидуумам определяли с использованием метода электрохемолюминесценции. Стандартную кривую, приготовленную из растворимого ΖΤNР4 человека в концентрациях 10, 1, 0,1, 0,01 и 0 нг/мл, готовили в буфере ΟΡΙ6ΙΝ Оцеп, ОаййегкЬигд, МИ). Образцы сыворотки разводили в буфере ΟΡΙ6ΙΝ. Стандарты и образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч с биотинилированными кроличьими антителами против ΖΤNР4-NР ВУ человека, разведенными до 1 мкг/мл в буфере Ο^^д^η Аккау ВиГГег (ЮЕЫ) и рутенилированными поликлональными кроличьми антителами против ΖΤNР4-NР ВУ человека, разведенными до 1 мкг/мл в буфере Οπβίπ Аккау ВиГГег (ЮЕЫ). После инкубации образцы встряхивали и к каждому образцу и каждому стандарту добавляли 0,4 мг/мл покрытых стрептавидином шариков(к!^еρίаν^б^η ИупаЬеабк,
- 38 010594
Оупа1. 0к1о. №г\уау) при 50 мкл/пробирку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы встряхивали и образцы просчитывали на анализаторе 0пдш Апа1у/сг (1дсп) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. 0пдт-анализ основан на электрохемолюминесценции и производит вывод результатов в ЕСЬ. В исследовании измеряли уровень возбуждения 2Т№4 в образцах сыворотки мышей как ^ВХУП/Е так и МВЕ/Мр_)-Еак1рг. который прогрессировал в развитых стадиях гломерулонефрита и аутиммунном заболевании.
0КЮЕЫ А88АУ использовали также для определения уровней 2Т№4 в крови пациентов с системной красной волчанкой относительно циркулирующих уровней у здоровых индивидуумов. Калибровочную кривую готовили из растворимого человека при 10. 1. 0.1. 0.01 и 0 нг/мл в буфере 0В1С1Н (1дсп). Все образцы пациентов вели в трехкратной повторности с конечным объемом 25 мкл. Стандарты и образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч с захватывающими антителами. биотинилированными кроличьими поликлональными антителами против 2Т№4-№ ВУ человека. разведенными до 1 мкг/мл в буфере 0пдт Аккау ВиГГсг (ЮЕЦ) и антителами для детекции. рутенилированными кроличьими поликлональными антителами против 2'ТЫЕ4-№ ВУ человека. разведенными до 1 мкг/мл в буфере 0пдт Аккау ВиГГсг (ЮЕЦ). Вслед за инкубацией образцы встряхивали и добавляли 0.4 мг/мл шариков. покрытых стрептавидином (к!гср!ау1йт ОупаЬсайк. Эупа1). в каждый стандарт и в каждый образец при 50 мкл/пробирку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы встряхивали и образцы анализировали с использованием анализатора 0пдт 1.5 Апа1у/сг (1дсп) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Анализ включал 28 нормальных контрольных образцов и образцы от 20 пациентов с диагнозом системная красная волчанка (8ЬЕ). Повышенные уровни 2Т№4 наблюдали в сыворотке пациентов с диагнозом 8ЬЕ по сравнению с сывороткой здоровых контрольных доноров. Уровни 2Т№4 рассчитывали в виде кратного увеличения уровней 2'ТЫЕ4 в образцах пациента или в контрольных образцах по сравнению с произвольным контрольным образцом сыворотки человека. Среднее значение 28 контрольных образцов в 1.36 раза превышало контрольный образец человека и среднее значение 20 образцов пациентов с 8ЬЕ составляло 4.92. Семеро из 20 пациентов с 8ЬЕ имели уровни 2Т№4. которые были в два раза выше среднего значения контрольных образцов. несмотря на то. что существовал только один контрольный индивидуум. который имел более чем двукратное превышение над средним значением в контроле.

Claims (16)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение слитого белка трансмембранного активатора и кальциевого модулятора. взаимодействующего с циклофилиновым лигандом (ТАС1) с иммуноглобулином для производства лекарственного средства ингибирования пролиферации опухолевых клеток. причем слитый белок ТАС1иммуноглобулина содержит:
    (a) фрагмент рецептора ТАС1. который состоит из фрагмента полипептида. который имеет аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 154 последовательности 8ЕО ΙΌ N0:2. причем фрагмент рецептора ТАС1 содержит по меньшей мере один из (1) аминокислотных остатков с 34 по 66 8ЕО ΙΌ N0:2 и (ίί) аминокислотных остатков с 71 по 104 8ЕО ΙΌ N0:2. причем фрагмент рецептора ТАС1 связывает по меньшей мере один из 2Т№2 или 2Т№4. и (b) фрагмент иммуноглобулина. содержащий константную область иммуноглобулина.
  2. 2. Применение по п.1. где фрагмент рецептора ТАС1 включает в себя аминокислотные остатки с 34 по 66 8Е0 ΙΌ N0:2 и аминокислотные остатки с 71 по 104 8Е0 ΙΌ N0:2.
  3. 3. Применение по п.1. где фрагмент рецептора ТАО содержит аминокислотные остатки с 34 по 104 8ЕО ΙΌ N0:2.
  4. 4. Применение по п.1. где фрагмент рецептора ТАО имеет аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 110 8Е0 ΙΌ N0:2.
  5. 5. Применение по п.1. где иммуноглобулиновый фрагмент содержит константную область тяжелой цепи.
  6. 6. Применение по п.5. где иммуноглобулиновый фрагмент содержит константную область тяжелой цепи человека.
  7. 7. Применение по п.6. где константная область тяжелой цепи является константной областью тяжелой цепи ΙβΟ1.
  8. 8. Применение по п.7. где иммуноглобулиновый фрагмент является Ес-фрагментом Ι§01. который содержит Сн2- и Сн3-домены.
  9. 9. Применение по п.8. где иммуноглобулиновый фрагмент является Ес-фрагментом Ι§01. содержащим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:33.
  10. 10. Применение по п.9. где слитый белок ТАСЕиммуноглобулина имеет аминокислотную последовательность. содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:54.
  11. 11. Применение по п.1. где слитый белок ТАСЕиммуноглобулина является димером.
  12. 12. Применение по п.1. где композицию вводят в клетки. культивированные ш νίΙΐΌ.
  13. 13. Применение по п.1. где композиция является фармацевтической композицией. которая содержит
    - 39 010594 слитый белок ТАС1-иммуноглобулина и фармацевтически приемлемый носитель, причем фармацевтическую композицию вводят млекопитающему субъекту, который имеет опухоль.
  14. 14. Применение по п.13, где введение фармацевтической композиции ингибирует пролиферацию Влимфоцитов у млекопитающего субъекта.
  15. 15. Применение слитого белка трансмембранного активатора и кальциевого модулятора, взаимодействующего с циклофилиновым лигандом (ТАС1) с иммуноглобулином для производства лекарственного средства ингибирования пролиферации опухолевых клеток у млекопитающего субъекта, причем слитый белок ТАС1-иммуноглобулина имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность 8Ε^ II) N0:54.
  16. 16. Применение по п.15, где слитый белок ТАС1-иммуноглобулина является димером.
EA200600894A 2001-05-24 2002-05-20 Слитые белки taci-иммуноглобулина EA010594B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29334301P 2001-05-24 2001-05-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600894A1 EA200600894A1 (ru) 2007-08-31
EA010594B1 true EA010594B1 (ru) 2008-10-30

Family

ID=23128690

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600894A EA010594B1 (ru) 2001-05-24 2002-05-20 Слитые белки taci-иммуноглобулина
EA200301146A EA007275B1 (ru) 2001-05-24 2002-05-20 Слитые белки taci-иммуноглобулина

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200301146A EA007275B1 (ru) 2001-05-24 2002-05-20 Слитые белки taci-иммуноглобулина

Country Status (28)

Country Link
US (9) US20030103986A1 (ru)
EP (2) EP1436003B3 (ru)
JP (2) JP2004535182A (ru)
KR (3) KR20040030628A (ru)
CN (2) CN101628111B (ru)
AT (2) ATE542545T1 (ru)
AU (1) AU2002305646C1 (ru)
BR (1) BRPI0209933B8 (ru)
CA (1) CA2448123C (ru)
CY (2) CY1109751T1 (ru)
DE (1) DE60234202D1 (ru)
DK (2) DK1436003T3 (ru)
EA (2) EA010594B1 (ru)
ES (2) ES2334772T7 (ru)
HK (2) HK1076603A1 (ru)
HR (2) HRP20030948B1 (ru)
IL (2) IL158920A0 (ru)
ME (1) MEP21708A (ru)
MX (1) MXPA03010687A (ru)
NO (1) NO337295B1 (ru)
NZ (1) NZ529638A (ru)
PL (2) PL219013B1 (ru)
PT (2) PT2116259E (ru)
RS (2) RS52228B (ru)
SI (2) SI1436003T1 (ru)
UA (1) UA82830C2 (ru)
WO (1) WO2002094852A2 (ru)
ZA (1) ZA200308984B (ru)

Families Citing this family (200)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
US6969519B2 (en) 2000-03-10 2005-11-29 Human Genome Sciences, Inc. Methods of using an agonistic antibody human tumor necrosis factor receptor (TR17)
KR101155294B1 (ko) 2000-06-16 2013-03-07 캠브리지 안티바디 테크놀로지 리미티드 면역특이적으로 ＢＬｙＳ에 결합하는 항체
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
AU2001288301A1 (en) 2000-08-18 2002-03-04 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
EP2184291A1 (en) 2000-08-18 2010-05-12 Dyax Corp. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS)
DE60234202D1 (de) * 2001-05-24 2009-12-10 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin-fusionsproteine
WO2002094192A2 (en) 2001-05-24 2002-11-28 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against tumor necrosis factor delta (april)
JP2005510208A (ja) * 2001-08-03 2005-04-21 ジェネンテック・インコーポレーテッド ＴＡＣＩｓ及びＢＲ３ポリペプチドとその用途
US7112410B1 (en) 2001-08-29 2006-09-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor TR21 and methods based thereon
US7256015B2 (en) * 2001-09-21 2007-08-14 Amgen Inc. TALL-1 receptor molecules and uses thereof
AU2003222664A1 (en) * 2002-04-18 2003-11-03 Genencor International, Inc. Production of functional antibodies in filamentous fungi
JP2005535310A (ja) * 2002-06-18 2005-11-24 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド サイトメガロウィルスエンハンサー及び骨髄増殖性肉腫ウィルスプロモーターを有するハイブリッドベクター
CA2501459A1 (en) * 2002-10-11 2004-04-22 Zymogenetics, Inc. Production of homotrimeric fusion proteins
PT1725249E (pt) 2003-11-06 2014-04-10 Seattle Genetics Inc Compostos de monometilvalina capazes de conjugação a ligandos
CA2558811A1 (en) 2004-03-08 2005-09-22 Zymogenetics, Inc. Dimeric fusion proteins and materials and methods for producing them
CN114053429A (zh) 2004-06-01 2022-02-18 健泰科生物技术公司 抗体-药物偶联物和方法
AU2005266875B2 (en) 2004-07-23 2012-07-26 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides, methods and compositions
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
CA2614039C (en) 2005-07-22 2015-10-13 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating disease with fgfr fusion proteins
KR20080056714A (ko) 2005-08-09 2008-06-23 지모제넥틱스, 인코포레이티드 ＴＡＣＩ―Ｉｇ 융합 분자를 사용하여 Ｂ―세포 악성종양을치료하는 방법
EP1922079A2 (en) 2005-08-09 2008-05-21 ZymoGenetics, Inc. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using taci-fusion molecules
WO2007019618A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-22 Garvan Institute Of Medical Research Phrophylactic and/or therapeutic method for treatment of autoimmune disease
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
JP5905184B2 (ja) 2005-10-13 2016-04-20 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッドＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． 自己抗体陽性疾患を有する患者の処置に使用するための方法および組成物
JP6088723B2 (ja) 2005-11-23 2017-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｂ細胞アッセイに関する組成物及び方法。
KR20190097310A (ko) 2005-11-23 2019-08-20 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒⅱａ 길항제 및 골 성장을 촉진하기 위한 이들의 용도
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
EP1996616A1 (en) * 2006-02-10 2008-12-03 Zymogenetics, Inc. Truncated il-17ra soluble receptor and methods of using in inflammation
US8211649B2 (en) 2006-03-31 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Methods of diagnosing and prognosing hodgkin's lymphoma
BRPI0711823A2 (pt) * 2006-05-15 2012-01-17 Ares Trading Sa métodos para tratamento de doenças auto-imunes com uma molécula de fusão taci-ig
US20100093076A1 (en) * 2006-08-25 2010-04-15 Moore Margaret D Soluble il-27 receptor
JP2010501622A (ja) * 2006-08-28 2010-01-21 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｆｃ−融合タンパク質の精製法
NZ574626A (en) * 2006-08-28 2011-12-22 Ares Trading Sa Process for removing free Fc-moieties from fluids comprising Fc-containing proteins using ion exchange chromatography
EP2061802A1 (en) * 2006-08-28 2009-05-27 Ares Trading S.A. Process for the purification of fc-fusion proteins
LT2061803T (lt) 2006-08-28 2019-11-25 Ares Trading Sa Fc turinčių baltymų gryninimo būdas
US7884180B2 (en) 2006-09-18 2011-02-08 Compugen Ltd Peptides which bind to G protein-coupled receptors
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
WO2008090217A1 (en) 2007-01-26 2008-07-31 Merck Serono S.A. Purification of fc-tact fusion proteins using the oilbody technology
CN103920139B (zh) 2007-02-01 2018-02-02 阿塞勒隆制药公司 活化素‑actriia拮抗剂及在治疗或预防乳腺癌中的用途
TW201803890A (zh) 2007-02-02 2018-02-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
TWI459963B (zh) 2007-02-09 2014-11-11 Acceleron Pharma Inc 包含ActRIIa-Fc融合蛋白的醫藥組合物；ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防與癌症相關的骨質流失之用途；ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防多發性骨髓瘤之用途
SI2139517T1 (sl) 2007-03-27 2013-09-30 Zymogenetics, Inc. Kombinacija inhibicije BLyS in mikofenolat mofetila za zdravljenje avtoimunske bolezni
EP2137213A4 (en) * 2007-03-27 2010-06-09 Christopher M Hovens METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PROSTATE CANCER
CN101323643B (zh) * 2007-06-15 2010-12-01 烟台荣昌生物工程有限公司 优化的TACI-Fc融合蛋白
SI2769729T1 (sl) 2007-09-04 2019-06-28 Compugen Ltd. Polipeptidin in polinukleotidi in njihove uporabe kot tarča zdravila za izdelavo zdravil in bioloških zdravil
CN107412734A (zh) 2007-09-18 2017-12-01 阿塞勒隆制药公司 活化素‑actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途
ES2565202T3 (es) * 2007-10-16 2016-04-01 Zymogenetics, Inc. Combinación de activador transmembrana y modulador de calcio e interactor de ligando de ciclofilina (TACI) y agentes anti-CD20 para tratamiento de enfermedades autoinmunitarias
CA2705435A1 (en) * 2007-11-12 2009-05-22 Ares Trading S.A. Taci-immunoglobulin fusion proteins for treatment of relapsing multiple sclerosis
JP2011503035A (ja) * 2007-11-12 2011-01-27 アレス トレーディング ソシエテ アノニム 視神経炎治療のためのｔａｃｉ−免疫グロブリン融合タンパク質
AU2008322930B2 (en) 2007-11-12 2014-05-15 Ares Trading S.A. Formulations for TACI-immunoglobulin fusion proteins
KR101591316B1 (ko) 2007-12-07 2016-02-05 지모제넥틱스, 인코포레이티드 항-사람 ｉｌ-21 단클론성 항체
EP2240196A2 (en) * 2008-01-22 2010-10-20 Compugen Ltd. Clusterin derived peptide
AU2009239437B2 (en) * 2008-04-25 2014-11-13 University Of Washington Levels of BCMA protein expression on B cells and use in diagnostic methods
US8003335B2 (en) 2008-04-30 2011-08-23 Universite Paris-SUD11 Levels of APRIL in serum and use in diagnostic methods
WO2009134633A1 (en) 2008-05-01 2009-11-05 Zymogenetics, Inc. Levels of blys/april heterotrimers in serum and use in diagnostic methods
EP2623112B1 (en) 2008-06-27 2015-03-04 Zymogenetics, Inc. Soluble hybrid Fc gamma receptors and related methods
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
DK2340031T3 (da) 2008-08-14 2019-07-15 Acceleron Pharma Inc Gdf-fanger til anvendelse ved behandling af anæmi
JP5727226B2 (ja) * 2008-09-30 2015-06-03 協和発酵キリン株式会社 Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２又はＦｒｉｚｚｌｅｄ７細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物
CN102300874B (zh) 2008-12-08 2015-08-05 卡姆普根有限公司 Tmem154多肽和多核苷酸及其作为产生药物和生物制品的药物靶标的用途
US9238878B2 (en) * 2009-02-17 2016-01-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
EP3058986B1 (en) 2009-03-30 2018-05-09 Acceleron Pharma Inc. Bmp-alk3 antagonists and uses for promoting bone growth
EP2440576A4 (en) 2009-06-08 2013-11-20 Acceleron Pharma Inc PROCESS FOR INCREASING THE NUMBER OF THERMOUS ADIPOCYTES
CN102656187A (zh) 2009-06-12 2012-09-05 阿塞勒隆制药公司 截短的actriib-fc融合蛋白
US8470980B2 (en) 2009-09-09 2013-06-25 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
PT2498799T (pt) 2009-11-13 2016-11-04 Five Prime Therapeutics Inc Utilização de proteínas do domínio extracelular rfcf1 para tratar cancros caracterizados por mutações ativadoras dependentes de ligando em rfcf2
ES2658292T3 (es) 2009-11-17 2018-03-09 Acceleron Pharma, Inc. Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular
US9428586B2 (en) 2009-12-01 2016-08-30 Compugen Ltd Heparanase splice variant
WO2011102845A1 (en) * 2010-02-18 2011-08-25 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion protein compositions and methods of use
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
CA3079122A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Trustees Of Dartmouth College Vista regulatory t cell mediator protein, vista binding agents and use thereof
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
SI2528625T1 (sl) 2010-04-15 2013-11-29 Spirogen Sarl Pirolobenzodiazepini in njihovi konjugati
CN101851278B (zh) * 2010-05-26 2013-03-13 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
EP2579897A1 (en) 2010-06-08 2013-04-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
WO2011156356A1 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Zymogenetics, Inc. Dimeric vstm3 fusion proteins and related compositions and methods
US20130189268A1 (en) 2010-06-22 2013-07-25 Precision Biologics, Inc. Colon and pancreas cancer specific antigens and antibodies
CN107441480A (zh) 2010-06-30 2017-12-08 卡姆普根有限公司 多肽及其作为用于治疗多发性硬化、类风湿性关节炎以及其他自身免疫病症的药物的用途
WO2016030888A1 (en) 2014-08-26 2016-03-03 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof as a drug for treatment of autoimmune disorders
EP2622091B1 (en) 2010-09-23 2019-03-13 Precision Biologics, Inc. Colon and pancreas cancer peptidomimetics
US20120258496A1 (en) * 2010-09-27 2012-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Production of low fucose antibodies in h4-ii-e rat cells
KR20130132824A (ko) 2010-11-08 2013-12-05 악셀레론 파마 인코포레이티드 Actriia 결합제 및 이의 용도
US8481038B2 (en) 2010-11-15 2013-07-09 Five Prime Therapeutics, Inc. Treatment of cancer with elevated dosages of soluble FGFR1 fusion proteins
WO2012074757A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
US9304134B2 (en) 2010-11-23 2016-04-05 Alderbio Holdings Llc Anti-IL-6 antibodies for the treatment of anemia
US8951972B2 (en) 2010-12-09 2015-02-10 Five Prime Therapeutics, Inc. FGFR1 extracellular domain combination therapies for lung cancer
WO2012090150A2 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Compugen Ltd New cell-penetrating peptides and uses thereof
RU2606016C2 (ru) 2011-01-14 2017-01-10 Редвуд Байосайнс, Инк. Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
CN102085367B (zh) * 2011-01-19 2012-08-22 烟台荣昌生物工程有限公司 优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用
CN105601741A (zh) 2011-04-15 2016-05-25 卡姆普根有限公司 多肽和多核苷酸及其用于治疗免疫相关失调和癌症的用途
WO2012155019A1 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature pepides
JP6342325B2 (ja) 2011-05-25 2018-06-13 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ． 炎症性障害の治療のための抗ｋｉｒ抗体
WO2013001517A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof for treatment of autoimmune disorders and infection
AU2012322607B2 (en) 2011-10-14 2017-02-16 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN107823630A (zh) 2011-11-14 2018-03-23 戊瑞治疗有限公司 治疗癌症的方法
WO2013114367A2 (en) 2012-02-01 2013-08-08 Compugen Ltd. C10rf32 antibodies, and uses thereof for treatment of cancer
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
US9890215B2 (en) 2012-06-22 2018-02-13 King's College London Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
FI3421486T3 (fi) 2012-06-22 2023-12-15 Dartmouth College Uusia vista-ig-rakenteita ja vista-ig:n käyttö autoimmuuni-, allergia- ja tulehdushäiriöiden hoitamiseksi
EP2892558B1 (en) 2012-09-07 2019-04-10 The Trustees Of Dartmouth College Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
HUE039329T2 (hu) 2012-10-12 2018-12-28 Adc Therapeutics Sa Pirrolobenzodiazepin-antitest konjugátumok
WO2014057113A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine - anti-psma antibody conjugates
EP2906250B1 (en) 2012-10-12 2018-05-30 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
HUE045435T2 (hu) 2012-10-12 2019-12-30 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinek és konjugátumaik
PT2906298T (pt) 2012-10-12 2018-12-28 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpos
ES2649990T3 (es) 2012-10-12 2018-01-16 Medimmune Limited Conjugados de anticuerpos anti-CD22-pirrolobenzodiazepinas
ES2660029T3 (es) 2012-10-12 2018-03-20 Medimmune Limited Conjugados de anticuerpo-pirrolobenzodiazepinas
EP3964224A1 (en) 2012-11-02 2022-03-09 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for use in treating renal disease
CN103833856B (zh) * 2012-11-22 2017-05-03 上海康岱生物医药技术股份有限公司 抑制taci‑baff复合物形成的融合蛋白及其制法和用途
CA2894959C (en) 2012-12-21 2022-01-11 Spirogen Sarl Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
EA031585B1 (ru) 2012-12-21 2019-01-31 Медимьюн Лимитед Пирролобензодиазепины и их конъюгаты
US20160031887A1 (en) 2013-03-13 2016-02-04 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA2904044C (en) 2013-03-13 2020-03-31 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
MX363787B (es) 2013-03-13 2019-04-03 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de los mismos.
CN105636612B (zh) 2013-08-12 2020-01-14 基因泰克公司 抗体-药物缀合物及使用和治疗方法
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054983B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015095223A2 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
MX2016007578A (es) 2013-12-16 2016-10-03 Genentech Inc Compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco dimerico de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1h-benzo [e] indol, y metodos de uso y tratamiento.
CR20160271A (es) 2013-12-16 2016-12-02 Genentech Inc Compuestos peptidométicos y sus conjugados de anticuerpo-fármaco
EA201691323A1 (ru) 2013-12-24 2016-11-30 Янссен Фармасьютика Нв Анти-vista антитела и фрагменты
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
JP6997619B2 (ja) 2014-06-11 2022-01-17 キャシー・エイ・グリーン 液性免疫の抑制または増進のための、ｖｉｓｔａアゴニスト及びｖｉｓｔａアンタゴニストの使用
CN114699529A (zh) 2014-06-13 2022-07-05 阿塞勒隆制药公司 用于治疗溃疡的方法和组合物
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP6622293B2 (ja) 2014-09-12 2019-12-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド アントラサイクリンジスルフィド中間体、抗体−薬物複合体、及び方法
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
RU2017107502A (ru) 2014-09-12 2018-10-12 Дженентек, Инк. Антитела и конъюгаты, сконструированные введением цистеина
JP2017533887A (ja) 2014-09-17 2017-11-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピン類及びその抗体ジスルフィドコンジュゲート
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
CN107108750A (zh) 2014-10-28 2017-08-29 默克专利股份公司 细胞表面上非共价含Fc结构域的蛋白质展示的方法
CN107074961A (zh) 2014-11-03 2017-08-18 默克专利股份公司 用于生成双特异性鲨鱼可变抗体结构域的方法及其用途
BR112017011111A2 (pt) 2014-11-25 2017-12-26 Adc Therapeutics Sa conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
MX2017007169A (es) 2014-12-03 2018-05-02 Genentech Inc Compuestos de amina cuaternaria y conjugados de anticuerpofármaco de los mismos.
SI3227675T1 (sl) 2014-12-03 2023-07-31 Celgene Corporation Antagonisti aktivin-actrii in uporaba za zdravljenje mielodisplastičnega sindroma
CA2969730A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Immunext, Inc. Identification of vsig8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/vsig8 modulators
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
MX2017016647A (es) 2015-06-24 2019-04-25 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpos y fragmentos anti-vista.
US11130818B2 (en) 2015-08-07 2021-09-28 Merck Patent Gmbh Transglutamine tag for efficient site-specific bioconjugation
JP6953020B2 (ja) 2015-09-08 2021-10-27 セリピオン， インコーポレイテッド ＡｐｏＡ−１融合ポリペプチドならびに関連する組成物および方法
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
BR112018016461A2 (pt) 2016-02-12 2019-10-01 Janssen Pharmaceutica Nv anticorpos e fragmentos anti-vista, usos dos mesmos e métodos de identificação dos mesmos
WO2017165734A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
MX2018012470A (es) 2016-04-15 2019-07-01 Alder Biopharmaceuticals Inc Anticuerpos anti pacap humanizados y usos de ellos.
EP3448412A4 (en) 2016-04-15 2020-03-25 Immunext Inc. ANTI-HUMAN-VISTA ANTIBODIES AND USE THEREOF
WO2017189432A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
ES2858151T3 (es) 2016-05-20 2021-09-29 Hoffmann La Roche Conjugados de PROTAC-anticuerpo y procedimientos de uso
US20170370906A1 (en) 2016-05-27 2017-12-28 Genentech, Inc. Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates
WO2017214024A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
EP3494141A4 (en) 2016-08-03 2020-04-08 Bio-Techne Corporation IDENTIFICATION OF VSIG3 / VISTA AS A NEW IMMUNE CONTROL POINT AND ITS USE IN IMMUNOTHERAPY
EP3496763A1 (en) 2016-08-11 2019-06-19 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
WO2018065501A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for preparing antibody drug conjugates
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
WO2018136163A2 (en) 2016-12-09 2018-07-26 Theripion, Inc. Tandem apoa-1 fusion polypeptides
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
KR102181375B1 (ko) 2017-02-08 2020-11-25 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 피롤로벤조디아제핀-항체 컨주게이트
BR112019021942A2 (pt) 2017-04-18 2020-05-05 Medimmune Ltd conjugados de pirrolobenzodiazepina
US20200129637A1 (en) 2017-04-20 2020-04-30 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
US11512114B2 (en) 2017-05-09 2022-11-29 Cyano Biotech Gmbh Modified microcystins and nodularins
AU2018278678B2 (en) 2017-05-09 2022-02-03 Cyano Biotech Gmbh Method for modifying microcystins and nodularins
JP7145891B2 (ja) 2017-06-14 2022-10-03 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム 抗ｃｄ１９ ａｄｃを投与するための投与レジメ
CA3070765A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine conjugates for the treatment of a proliferative disease
IL273387B2 (en) 2017-09-20 2023-10-01 Ph Pharma Co Ltd Thylanstatin analogs
EP3746477A1 (en) 2018-02-02 2020-12-09 Bio-Techne Corporation Compounds that modulate the interaction of vista and vsig3 and methods of making and using
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
WO2020086858A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Genentech, Inc. Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
JP2022513198A (ja) 2018-12-10 2022-02-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｆｃ含有タンパク質への部位特異的コンジュゲーションのための光架橋性ペプチド
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
US20220306734A1 (en) 2019-07-24 2022-09-29 H. Lundbeck A/S Anti-mglur5 antibodies and uses thereof
WO2021128027A1 (zh) * 2019-12-24 2021-07-01 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 TACI-Fc融合蛋白及其用途
WO2021226553A2 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Alpine Immune Sciences, Inc. April and baff inhibitory immunomodulatory proteins with and without a t cell inhibitory protein and methods of use thereof
AU2021285813A1 (en) * 2020-06-02 2023-02-02 Ares Trading S.A. Methods related to the treatment of IGA nephropathy
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022178090A2 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Theripion, Inc. Dnase fusion polypeptides and related compositions and methods
US20240270842A1 (en) 2021-05-07 2024-08-15 Viela Bio, Inc Use of an anti-cd19 antibody to treat myasthenia gravis
CA3216795A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods of dosing and treatment with a taci-fc fusion immunomodulatory protein
KR20240067099A (ko) * 2021-09-30 2024-05-16 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 항-il23 항체 융합 단백질 및 용도
EP4296287A1 (en) * 2021-09-30 2023-12-27 RemeGen Co., Ltd. Method for treating sjogren's syndrome using taci-fc fusion protein
AU2023283931A1 (en) * 2022-06-08 2024-05-16 Remegen Co., Ltd. Method for treating myasthenia gravis with taci-fc fusion protein
WO2024067756A1 (zh) * 2022-09-30 2024-04-04 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 用TACI-Fc融合蛋白治疗膜性肾病的方法
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein
WO2024114777A1 (zh) * 2022-12-02 2024-06-06 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 用TACI-Fc融合蛋白治疗微小病变型肾病的方法
WO2024123675A2 (en) * 2022-12-05 2024-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Taci-fc fusion proteins for multifunctional inhibition of baff, april, and neonatal fc receptor
WO2024138128A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU94045908A (ru) * 1992-04-10 1997-11-27 Рисерч Дивелопмент Фаундейшн Композиция, способ обработки неопластической клетки, способ уничтожения неопластической клетки
CA2286933A1 (en) * 1997-04-18 1998-10-29 Biogen, Inc. Type ii tgf-beta receptor/immunoglobulin constant region fusion proteins
RU2127122C1 (ru) * 1992-04-10 1999-03-10 Рисерч Дивелопмент Фаундейшн Композиция, обладающая цитотоксическим действием, способ обработки лейкозной клетки in vitro
GR3033474T3 (en) * 1991-12-20 2000-09-29 Bristol Myers Squibb Co Icams immunoglobulin constant region soluble fusion proteins.
CA2378866A1 (en) * 1999-07-21 2001-02-01 Stephen D. Gillies Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2001021631A2 (en) * 1999-09-20 2001-03-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Secreted proteins and uses thereof

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5738A (en) 1848-08-29 Francis kelsey
US846A (en) 1838-07-17 Improvement in revolving fire-arms
AU560472B2 (en) 1981-08-25 1987-04-09 Celltech Limited Yeast expression vectors
US4769331A (en) 1981-09-16 1988-09-06 University Patents, Inc. Recombinant methods and materials
US4486533A (en) 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US4977092A (en) 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
US5139936A (en) 1983-02-28 1992-08-18 Collaborative Research, Inc. Use of the GAL1 yeast promoter
US4661454A (en) 1983-02-28 1987-04-28 Collaborative Research, Inc. GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US4859587A (en) 1984-06-04 1989-08-22 Institut Merieux Recombinant herpes simplex viruses, vaccines and methods
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
EP0184576B1 (en) 1984-12-06 1990-06-27 Fina Research S.A. Promoters for the expression of foreign genes in yeast, plasmids comprising them, and uses thereof for the production of polypeptides
US4751181A (en) 1984-12-31 1988-06-14 Duke University Methods and compositions useful in the diagnosis and treatment of autoimmune diseases
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
US5162228A (en) 1988-12-28 1992-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5328688A (en) 1990-09-10 1994-07-12 Arch Development Corporation Recombinant herpes simplex viruses vaccines and methods
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
JP3202999B2 (ja) 1991-01-31 2001-08-27 協和醗酵工業株式会社 肝移行性リポソーム製剤
US5298418A (en) 1991-09-16 1994-03-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Cell line isolated from larval midgut tissue of Trichoplusia ni
ZA932522B (en) * 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
WO1994009137A1 (en) 1992-10-15 1994-04-28 Genentech, Inc. Antibodies against type 2 tumor necrosis factor receptor
US5650550A (en) 1993-10-01 1997-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Mutant mice having a deficit of functional estrogen receptors
US5523227A (en) 1994-06-17 1996-06-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Univ. DNA encoding calcium-signal modulating cyclophilin ligand
ATE377073T1 (de) 1994-12-15 2007-11-15 Yeda Res & Dev Modulatoren der funktion des fas/ap01 rezeptors
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE19533447C1 (de) 1995-09-09 1996-12-05 Bbs Kraftfahrzeugtechnik Verfahren und Vorrichtung zum Befüllen eines Gießwerkzeugs mit einer Metallschmelze
US5716808A (en) 1995-11-09 1998-02-10 Zymogenetics, Inc. Genetic engineering of pichia methanolica
US5965389A (en) 1995-11-09 1999-10-12 Zymogenetics, Inc. Production of GAD65 in methylotrophic yeast
ES2210354T3 (es) 1996-03-14 2004-07-01 Human Genome Sciences, Inc. Factor de necrosis tumoral humano delta y epsilon.
IL128073A0 (en) 1996-07-17 1999-11-30 Zymogenetics Inc Transformation of pichia methanolica
US5736383A (en) 1996-08-26 1998-04-07 Zymogenetics, Inc. Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants
WO1998002536A2 (en) 1996-07-17 1998-01-22 Zymogenetics, Inc. Preparation of pichia methanolica auxotrophic mutants
KR20000052796A (ko) 1996-10-25 2000-08-25 벤슨 로버트 에이치. 뉴트로킨 알파
WO1998027114A2 (en) 1996-12-17 1998-06-25 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
CA2292835A1 (en) 1997-06-06 1998-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
WO1998055620A1 (en) 1997-06-06 1998-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
AU9013998A (en) * 1997-07-21 1999-02-10 Zymogenetics Inc. Tumor necrosis factor receptor ztnfr-5
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
CN1195849C (zh) 1997-09-12 2005-04-06 阿普泰克R&D公司 April－具有生长效应的新的蛋白质
WO2001060397A1 (en) 2000-02-16 2001-08-23 Genentech, Inc. Uses of agonists and antagonists to modulate activity of tnf-related molecules
EA007471B1 (ru) * 1999-01-07 2006-10-27 Займодженетикс, Инк. Растворимый рецептор br43x2 и способы его применения
US20060067933A1 (en) * 1999-01-07 2006-03-30 Gross Jane A Soluble receptor BR43x2 and methods of using
TR200102147T2 (tr) 1999-01-25 2002-04-22 Biogen, Inc. BAFF, ilişkili bloke edici maddeler ve bunların bağışıklık karşılığında B-hücreleri ve imünoglobülinlerin uyarımı ve engellenmesinde kullanımları
WO2000062790A2 (en) 1999-04-19 2000-10-26 Immunex Corporation Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders
US20030022233A1 (en) 1999-04-30 2003-01-30 Raymond G. Goodwin Methods of use of the taci/taci-l interaction
PL207501B1 (pl) 1999-08-17 2010-12-31 Apotech R & D Sa Zastosowanie polipeptydu BCMA oraz przeciwciała skierowanego przeciwko BCMA
UA74798C2 (ru) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Способ лечения рака у млекопитающих с помощью полипептида, который препятствует взаимодействию между april и его рецепторами
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
NZ521629A (en) * 2000-04-27 2004-05-28 Biogen Inc TACI as an anti-tumor agent
EP1280826B1 (en) * 2000-05-12 2007-05-02 Amgen Inc. Polypeptides for inhibiting april-mediated b- and t-cell proliferation.
CN100387713C (zh) 2000-08-11 2008-05-14 麒麟医药株式会社 调节磷酸代谢,钙代谢,钙化和维生素d代谢的多肽及其编码dna
ATE432986T1 (de) * 2000-11-07 2009-06-15 Zymogenetics Inc Menschlicher rezeptor für tumor necrosis factor
EP2301971A1 (en) 2001-02-20 2011-03-30 ZymoGenetics, L.L.C. Antibodies that bind both BCMA and TACI
DE60234202D1 (de) 2001-05-24 2009-12-10 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin-fusionsproteine
AU2008322930B2 (en) 2007-11-12 2014-05-15 Ares Trading S.A. Formulations for TACI-immunoglobulin fusion proteins

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR3033474T3 (en) * 1991-12-20 2000-09-29 Bristol Myers Squibb Co Icams immunoglobulin constant region soluble fusion proteins.
RU94045908A (ru) * 1992-04-10 1997-11-27 Рисерч Дивелопмент Фаундейшн Композиция, способ обработки неопластической клетки, способ уничтожения неопластической клетки
RU2127122C1 (ru) * 1992-04-10 1999-03-10 Рисерч Дивелопмент Фаундейшн Композиция, обладающая цитотоксическим действием, способ обработки лейкозной клетки in vitro
CA2286933A1 (en) * 1997-04-18 1998-10-29 Biogen, Inc. Type ii tgf-beta receptor/immunoglobulin constant region fusion proteins
CA2378866A1 (en) * 1999-07-21 2001-02-01 Stephen D. Gillies Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2001021631A2 (en) * 1999-09-20 2001-03-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Secreted proteins and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR20100061860A (ko) 2010-06-09
PL366760A1 (en) 2005-02-07
KR100976743B1 (ko) 2010-08-19
US20090209006A1 (en) 2009-08-20
US7635767B2 (en) 2009-12-22
EP1436003B1 (en) 2009-10-28
NO20035173D0 (no) 2003-11-21
IL217265A (en) 2013-05-30
US20140328844A1 (en) 2014-11-06
KR101021124B1 (ko) 2011-03-14
CN101628111B (zh) 2013-11-06
US8524232B2 (en) 2013-09-03
CN1612750B (zh) 2012-10-31
DK2116259T3 (da) 2012-05-21
PT1436003E (pt) 2010-03-12
EA200301146A2 (ru) 2004-06-24
CA2448123C (en) 2012-09-11
WO2002094852A2 (en) 2002-11-28
ZA200308984B (en) 2004-07-20
HRP20030948A2 (en) 2004-06-30
MEP21708A (en) 2010-06-10
CN101628111A (zh) 2010-01-20
JP2004535182A (ja) 2004-11-25
US20030103986A1 (en) 2003-06-05
EP1436003A2 (en) 2004-07-14
PL403488A1 (pl) 2013-07-08
EP1436003A4 (en) 2005-04-27
US20110229473A1 (en) 2011-09-22
SI2116259T1 (sl) 2012-11-30
DE60234202D1 (de) 2009-12-10
JP5149245B2 (ja) 2013-02-20
EA200301146A3 (ru) 2005-02-24
US7862814B2 (en) 2011-01-04
CA2448123A1 (en) 2002-11-28
KR20040030628A (ko) 2004-04-09
IL158920A0 (en) 2004-05-12
ES2334772T7 (es) 2012-11-19
US7951919B2 (en) 2011-05-31
US9346878B2 (en) 2016-05-24
BRPI0209933B1 (pt) 2018-10-16
HRP20130413A2 (hr) 2013-07-31
CN1612750A (zh) 2005-05-04
PT2116259E (pt) 2012-04-09
US20130309231A1 (en) 2013-11-21
RS20120253A1 (en) 2013-02-28
HK1137659A1 (en) 2010-08-06
EA007275B1 (ru) 2006-08-25
PL219013B1 (pl) 2015-02-27
RS52228B (en) 2012-10-31
US7501497B2 (en) 2009-03-10
UA82830C2 (en) 2008-05-26
US7964711B2 (en) 2011-06-21
MXPA03010687A (es) 2004-07-01
ATE446771T1 (de) 2009-11-15
HK1076603A1 (en) 2006-01-20
CY1112840T1 (el) 2016-02-10
BRPI0209933B8 (pt) 2021-05-25
HRP20030948B1 (hr) 2013-06-30
AU2002305646B2 (en) 2008-09-04
AU2002305646C1 (en) 2009-08-06
BR0209933A (pt) 2004-03-30
US20100130728A1 (en) 2010-05-27
JP2009232856A (ja) 2009-10-15
US20100129384A1 (en) 2010-05-27
SI1436003T1 (sl) 2010-02-26
WO2002094852A8 (en) 2004-04-22
NZ529638A (en) 2007-08-31
US8815238B2 (en) 2014-08-26
YU92503A (sh) 2006-05-25
KR20090080570A (ko) 2009-07-24
CY1109751T1 (el) 2014-09-10
US20060034852A1 (en) 2006-02-16
IL217265A0 (en) 2012-02-29
EP1436003B3 (en) 2012-03-14
DK1436003T3 (da) 2010-03-15
NO337295B1 (no) 2016-03-07
ES2334772T3 (es) 2010-03-16
EP2116259A1 (en) 2009-11-11
US20100183609A1 (en) 2010-07-22
ATE542545T1 (de) 2012-02-15
EA200600894A1 (ru) 2007-08-31
EP2116259B1 (en) 2012-01-25
NO20035173L (no) 2004-01-23
ES2379977T3 (es) 2012-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA010594B1 (ru) Слитые белки taci-иммуноглобулина
JP6949711B2 (ja) ペプチドバリアントを含む医薬組成物及びその使用方法
ES2642787T3 (es) Anticuerpos con actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mejorada, métodos para su producción y uso
JP2017222651A (ja) 代謝障害及び疾患の治療のための組成物、使用及び方法
EA009026B1 (ru) Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях
ES2915851T3 (es) Péptidos quiméricos de FGF19 para usar en el tratamiento de trastornos de ácidos biliares
EA015706B1 (ru) Моноклональное антитело или его фрагмент, связывающиеся с полипептидом il-22ra, гуманизированное антитело, полученное из указанного антитела, гибридомы, продуцирующие антитело, и применение указанного антитела
EA005005B1 (ru) ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД β1α-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, ЕГО МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
JPH09500381A (ja) トランスフェリン受容体特異的リガンド−神経作用剤融合タンパク質
EA030313B1 (ru) СПОСОБ СНИЖЕНИЯ УРОВНЕЙ IgM, IgG И IgA У МЛЕКОПИТАЮЩИХ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ЭТОГО СПОСОБА
JPH05507197A (ja) 結合部位を含む可溶性ペプチド類縁体
EA004635B1 (ru) Рецептор baff (bcma), иммунорегуляторный агент
EA009938B1 (ru) ЛЕЧЕНИЕ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИНТЕРФЕРОНА-β
WO2001081417A2 (en) Use of taci as an anti-tumor agent
AU2001253920A1 (en) Use of taci as an anti-tumor agent
JP2021505593A (ja) Ｈｍ−３融合タンパク質及びその適用
ES2264929T3 (es) Acidos nucleicos y polipeptidos del factor 19 de crecimiento fibroblastico (fgf-19) y procedimientos de utilizacion para el tratamiento de la obesidad.
KR20010089364A (ko) 강화 백신
JP2000502569A (ja) Ｏｂタンパク質レセプター及び関連組成物と関連方法
EA012567B1 (ru) Нуклеиновая кислота, кодирующая il-32, белок il-32, антитело к il-32 и способы применения белка и антитела
ES2277335T3 (es) Citoquina designada lerk-6.
CN1835769B (zh) Kim-1拮抗剂及其在免疫系统调节中的应用
JP2001504695A (ja) ウシ泌乳関連向免疫性タンパク質（ｃｄ１４）、コード遺伝子、およびｂ細胞活性化における適用
WO2022202785A1 (ja) ポリペプチド並びにそれを含む細胞融合剤及びがん治療用医薬組成物
CN103619352A (zh) 抗内皮因子抗体和表达新人/鼠嵌合内皮因子的敲入小鼠

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM