CN103619352A - 抗内皮因子抗体和表达新人/鼠嵌合内皮因子的敲入小鼠 - Google Patents

Abstract

提供了涉及血管生成相关疾病的预防和治疗的组合物和方法，包括表达新的人/鼠嵌合内皮因子的新敲入小鼠，制备该小鼠所使用的载体，以及包括新人/鼠转基因的鼠胚胎干细胞。还提供了抗人内皮因子单克隆抗体(mAb)，该单克隆抗体用作用于预防或治疗人肿瘤血管生成和具有过度血管化的人血管生成相关疾病的抗血管生成剂。单克隆抗体和鼠内皮因子无交叉反应。还提供了使用抗人内皮因子单克隆抗体来预防或治疗人肿瘤血管生成以及具有过度血管化的血管生成相关疾病的方法。

Description

抗内皮因子抗体和表达新人/鼠嵌合内皮因子的敲入小鼠

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年2月23日提交的美国临时申请No.61/445,971，以及2011年2月23日提交的美国临时申请No.61/445,970的优先权，每个申请的内容通过引用并入本文。

关于联邦资助的研究或发展的声明

本发明是在政府支持下在美国国防部乳腺癌研究计划署授予的基金BC020043的资助下进行的。政府对本发明具有一些权利。

技术领域

本发明总体上涉及癌症治疗领域，更具体地，涉及用于抗癌及抗血管生成疗法的组合物和方法。

背景技术

存在对于预防和治疗涉及不良血管生成的疾病的组合物和方法的持续需要。血管生成部分与内皮因子(Endoglin)在内皮细胞上的表达有关。

内皮因子

内皮因子是同源二聚体肿瘤相关的细胞膜抗原，分子大小为160千道尔顿(KD)或170KD，主要表达在白血病细胞和内皮细胞上(Haruta和Seon，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：7898-7902；Gougos和Letarte，1988，J.Immunol.141：1925-1933；Seon等，1997，Clin.Cancer Res.3：1031-1044)。内皮细胞上的内皮因子表达在肿瘤相关的血管内皮和淋巴管内皮的内皮细胞的增殖中上调(Seon等，Supra；Burrows等，1995，Clin.Cancer Res.1：1623-1634；Matsuno等，1999，Clin Cancer Res.5：371-382；Clasper等，2008，68：7293-7303)。内皮因子对于血管生成/血管生长是必不可少的(Li等，1999，Science284：1534-1537；Arthur等，2000，Dev.Biol.217：42-53)，且是TGF-β的共受体(Cheifetz等，1992，J.Biol.Chem.267：19027-19030)。

鼠内皮因子的特征在于，是分子大小约为180千道尔顿(KD)的二聚体。人内皮因子以两种形式存在；即，较小的160KD的形式，较大的170KD的形式，二者的区别被发现存在于蛋白质的细胞质部分。内皮因子具有胞外区，疏水跨膜区以及胞质尾区。人内皮因子的核苷酸序列与鼠内皮因子的核苷酸系列的比较显示出约71％-72％的同一性(St.Jacques等，1994，Endocrinol.134：2645-2657；Ge和Butcher，1994，Gene158：2645-2657)。然而，在编码内皮因子的跨膜区和胞质区的人和鼠序列中，同一性为93％-95％。因此，在编码抗体在细胞表面被定向的胞外区的人和鼠序列中，同一性明显少于70％。尽管在人和鼠内皮因子间的氨基酸序列看起来基本类似，但是观察到的胞外区的氨基酸序列差异应该足以生成人内皮因子或鼠内皮因子独有的截然不同的抗原表位。这是因为，在肽表位中，包括表位的氨基酸序列或侧翼氨基酸序列的甚至一个微小的变化都可以显著影响表位的免疫原性(参见例如，Vijayakrishnan等，1997，J.Immunol.159：1809-1819)。例如，肽中的单个氨基酸取代可以引起肽的免疫原性的显著变化(Vijayakrishnan等，1997，同上)。因为单克隆抗体限定良好的特异性，所以肽表位的这些变化强烈影响了单克隆抗体的特异性。

内皮因子的单克隆抗体(mAb)

SN6是产生自具有人白血病细胞的细胞膜的糖蛋白混合物的肿瘤相关组分的小鼠的免疫的抗体(Haruta和Seon，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.83：7898-7902)。鼠mAb识别人内皮因子。单克隆抗体44G4是产生自具有人前B型白血病细胞的整个细胞悬液的小鼠的免疫的抗体(Gougos和Letarte，1988，J.Immunol.141：1925-1933；1990，J.Biol.Chern.265：8361-8364)。鼠单克隆抗体识别人内皮因子。单克隆抗体MJ7/18是产生自皮肤发炎的大鼠的免疫的抗体(Ge和Butcher，1994，同上)。单克隆抗体识别鼠内皮因子。单克隆抗体Tec-11是产生自具有人脐静脉内皮细胞的小鼠的免疫的抗体(Burrows等，1995，Clin.Cancer Res.1：1623-1634)。鼠单克隆抗体对人内皮因子具有受限反应。

通过使用抗内皮因子抗体和各种染色步骤已经确定，内皮因子在如来自人白血病(包括非T细胞型(非T)急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓单核细胞性白血病)的人肿瘤细胞上在中等水平上被表达。此外，还确定了内皮因子在来自人实体瘤的肿瘤相关的脉管系统以及来自胎盘的人脉管系统中含有的内皮细胞中在中等到高等水平上被表达，人实体瘤包括血管肉瘤、乳腺癌、盲肠癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、腮腺肿瘤、咽癌、直肠乙状结肠癌。在取自脾、胸腺、肾、肺和肝的不同的正常的成人组织切片中观察到对于内皮因子的较低程度(弱)的内皮细胞染色。

在涉及血管生成的病理学条件下也报导了在血管内皮细胞上的提高了的内皮因子表达。这类血管生成相关疾病包括大部分类型的人实体瘤、类风湿性关节炎、胃溃疡以及慢性炎性皮肤损伤(例如牛皮癣、皮炎；Westphal等，1993，J.Invest.Dermatol.100：27-34)

血管生成

血管生成包括引起新生血管形成的新毛细血管的形成。血管生成是个复杂的过程，涉及一系列连续的步骤，包括血管基膜和间质基质的内皮细胞介导的降解、内皮细胞的迁移、内皮细胞的增殖，以及由内皮细胞形成毛细血管袢。实体瘤依赖于血管生成，即，当小实体瘤到达临界直径时，为进一步增长，需要在周围的正常组织中引起血管生成响应。肿瘤因而发生的新生血管形成与更快速的增长以及局部入侵相关联。此外，血管生成的增加也与增加的转移风险相关联。因此，抑制肿瘤血管生成的抗血管生成疗法将会抑制或遏制肿瘤的生长和扩散。

在正常的生理性过程(例如伤口愈合)中，一旦此过程结束，血管生成即完成。相反，肿瘤血管生成并不是自限性的。进一步地，在某些病理性(和非恶性)过程中，血管生成被异常地延长。这些血管生成相关疾病包括糖尿病性视网膜病，慢性炎性疾病(包括类风湿性关节炎、皮炎和牛皮癣)。

人实体瘤的抗血管生成疗法和血管靶向疗法

实体瘤超过临床隐匿大小(例如，几立方毫米)的渐进性增长需要新血管的不断形成，这一过程被称为肿瘤血管生成。肿瘤的生长和转移依赖于血管生成。肿瘤必须不断刺激新毛细血管的生长以将营养和氧输送到肿瘤自身以生长。因此，防止肿瘤血管生成(抗血管生成疗法)或选择性破坏现有肿瘤血管(血管靶向疗法)都提供了预防或治疗实体瘤的策略。

由于新毛细血管的局部网络为原发肿瘤转移到人体其他部位提供了路径，抗血管生成疗法应该对于预防小实体瘤的形成或转移具有重要的意义(参见例如，Folkman，1995，NatureMedicine，1：27-31)。另一方面，攻击已存在的脉管系统的血管靶向疗法可能对于脉管系统已受损的较大的肿瘤最有效(参见例如，Bicknell和Harris，1992，Semin.Cancer Biol.3：399-407)。恰当选择的单克隆抗体可以靶向肿瘤的血管内皮细胞并能通过多个机制抑制肿瘤生长和/或破坏肿瘤，该机制包括依赖抗体的细胞介导的细胞毒性以及诱导细胞凋亡(Seon等，2011，Current Drug Delivery8：135-143)。在另一种情况下，单克隆抗体及其片段可以作为抗血管生成疗法和血管靶向疗法(统称为“抗血管生成疗法”)方法中传递至已存在肿瘤脉管系统或新形成的肿瘤新生血管形成治疗化合物的手段使用。然而，仍然需要可用于识别可能对人临床应用有效的单克隆抗体的工具，因此，也需要这类抗体本身。

血管生成相关疾病的小鼠模型

血管生成小鼠模型的使用已被接受并对于评估治疗剂有效，因为这些模型显示出反映各疾病的临床参数特征，并预示了治疗剂对患者的有效性。这些小鼠模型包括但不限于：用于视网膜新生血管形成的小鼠模型(Pierce等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：905-909)；用于类风湿性关节炎的小鼠模型(MRL-lpr/lpr小鼠模型，Folliard等，1992，Agents Actions36：127-135；mev小鼠，Kovarik等，1994，J.Autoimmun.7：575-88)；用于血管生成的小鼠模型(Majewski等，1994，Int.J.Cancer57：81-85；Andrade等，1992，Int.J.EXp.Pathol.，73：503-13；Sunderkotter等，1991，Am.J.Pathol.138：931-939)；用于皮炎的小鼠模型(Maguire等，1982，J.Invest.Dermatol.79：147-152)以及用于牛皮癣的小鼠模型(Blandon等，1985，Arch.Der.matol.Res.277：121-125；Nagano等，1990，Arch.Der.matol.Res.282：459-462)。已知几种抗人内皮因子(hENG)单克隆抗体(mAb)可潜在用于抗血管生成疗法。这些单克隆抗体包括K4-2C10(或称为SN6f)、D4-2G10(或称为SN6a)、Y4-2F1(或称为SN6j)以及P3-2G8(或称为SN6k)。然而，所有这些单克隆抗体与鼠内皮因子或鼠内皮细胞交叉反应。然而，这些交叉反应性很弱，而且对于抗血管生成活性在动物(小鼠)中的这些单克隆抗体的评估只有在有限的条件下才能进行(Seon等，2011)。因此，需要表达可被更多抗人内皮因子单克隆抗体靶向的人内皮因子的新的动物模型，同时也需要新的有效的抗人内皮因子单克隆抗体本身。本发明满足了这些及其他需求。

发明内容

本发明提供了涉及血管生成相关疾病的预防和治疗的组合物和方法。本发明包括提供表达新人/鼠嵌合内皮因子的新敲入小鼠(knockin mice)。这种小鼠可用于评估抗人内皮因子单克隆抗体的体内疗效，抗人内皮因子单克隆抗体可用于以至少部分过度血管化为特征的人肿瘤抗血管生成和人抗血管生成相关疾病的抗血管生成疗法。在不同的实施例中，敲入小鼠的内皮因子基因包括人内皮因子(hENG)基因的外显子4、5、6、7和8以及其组合。提供了适合于生产转基因小鼠的同源重组的载体以及包括敲入人内皮因子基因区域的鼠胚胎干细胞。

本发明还提供了抗内皮因子单克隆抗体，其可用作用于预防或治疗人肿瘤血管生成和具有过度血管化的人血管生成相关疾病的抗血管生成剂。在不同的实施例中，单克隆抗体与鼠内皮因子并无交叉反应，并对于被人内皮因子外显子4、5、6、7和8编码的人内皮因子区域有特异性。在一个实施例中，所选单克隆抗体对于被人内皮因子外显子4-8编码的人内皮因子区域有特异性。因此，单克隆抗体可以与包括来自天冬酰胺121到丙氨酸378(包括一切)的hENG氨基酸类的hENG部分特异性结合。

本发明也提供了用于使用抗内皮因子单克隆抗体来预防或治疗人肿瘤血管生成以及具有过度血管化的血管生成相关疾病的方法。总体而言，该方法包括对需要抗血管生成剂的个体给予组合物，该组合物包括一个或多个单克隆抗体，或其hENG结合片段，或从单克隆抗体开发的免疫偶联物(immunoconjugate)。对每种治疗性使用，本发明包括使用单克隆抗体、其hENG结合片段、免疫偶联物以及其他治疗剂的联合疗法。

附图说明

图1为我们实验室所生成的八个抗hENG单克隆抗体所限定的人内皮因子(hENG)的线性序列表位的图形描述。hENG表位的分子图由SN6系列抗hENG单克隆抗体以及相应的外显子所限定。示出了七个多肽片段中的每个片段的氨基末端的氨基酸残基。成熟的被翻译的hENG的氨基末端残基以及片段1为所示的谷氨酸26。分子图基于12个抗hENG单克隆抗体与8个细菌表达的重组hENG多肽片段(包括由hENG的整个胞外域组成的片段)(参见图10)的反应性构建。该图中也示出了相关的SN6系列单克隆抗体。由SN6K所限定的表位是假定的构象表位。我们迄今所开发的所有12个抗hENG单克隆抗体限定细胞外表位。该图中也示出了人ENG基因的相应的外显子。粗体字母所示的外显子4-8用来替换在下述A计划中的生成敲入小鼠中的小鼠ENG基因的相应的外显子。图的阴影与氨基酸编号表示为表位作图研究所合成的肽。

图2描述了hENG外显子4-8敲入载体。hENG外显子4-8来源于人类男性BAC库RPCI-11。5’-臂和3’-臂来源于BALB/cByJ BAC库CHORI-28。

图3描述了小鼠野生型ENG基因和靶向ENG基因(其中小鼠ENG外显子4-8被hENG外显子4-8替换)，并示出了Neo标记的插入。通过基因敲入载体转染进入小鼠胚胎干(ES)细胞而进行基因靶向。如图所示，正确靶向的胚胎干细胞通过PCR以及DNA印迹来筛选。这些试验表明克隆27和226包含了所需靶向基因。稍后，通过将携带靶向基因的雄性小鼠与Cre雌性小鼠相杂交，而将Neo标记从靶向基因中删除。

图4A和4B描述了来自纯合子(#56)小鼠和杂合子(半合子；#64)小鼠的4T1小鼠乳腺肿瘤中的人/鼠嵌合ENG的免疫组织化学(IHC)染色。作为对照，来自野生型小鼠的4T1肿瘤中的小鼠ENG也被染色。图4A和4B中，我们示出了四个抗hENG单克隆抗体SN6h、SN6j、SN6d、SN6f以及两个对照的实验结果，这两个对照是同型匹配对照免疫球蛋白G(MOPC195v；IgG1-κ)和大鼠抗小鼠ENG单克隆抗体MJ7/18(BD Bioscience)。所有SN6h、SN6j、SN6d和SN6f与纯合子小鼠以及杂合子(半合子)小鼠中的嵌合ENG反应良好。同型匹配对照免疫球蛋白G并未显示出与嵌合或野生型ENG的明显反应性。抗小鼠ENG单克隆抗体与纯合子小鼠中的嵌合ENG并无反应，但是与杂合子小鼠以及野生型小鼠中的小鼠ENG反应强烈。在不同的纯合子(#63、#67和#74)小鼠与杂合子(#54和#70)小鼠中观察到了这些单克隆抗体和对照免疫球蛋白G的类似IHC染色图案。在来自纯合子(#57)小鼠和杂合子(#81)小鼠的Col26结肠肿瘤中也检测出了人/鼠嵌合ENG被这些单克隆抗体和对照免疫球蛋白G的类似IHC染色。

图5A和5B描述了4T1肿瘤中的人/鼠嵌合ENG被图4A和4B未示出的5个另外的抗hENG单克隆抗体SN6c、SN6i、SN6、SN6g以及SN6k IHC染色。SN6c、SN6i和SN6i与纯合子小鼠和杂合子小鼠中的人/鼠嵌合ENG反应良好。似乎限定了碳水化合物表位的SN6g与纯合子小鼠的肿瘤中的嵌合ENG反应微弱，但与杂合子小鼠的肿瘤中的嵌合ENG的反应并非如此。图5A和5B中的同型匹配对照免疫球蛋白G MOPC195v和抗小鼠ENG(CD105)单克隆抗体的反应性方式与图4A和4B中的反应性方式一致。MOPC195v并未显示出与嵌合ENG或小鼠ENG的明显反应。抗鼠ENG(CD105)单克隆抗体与杂合子小鼠和野生型小鼠的4T1肿瘤中的小鼠ENG反应良好，却不与纯合子小鼠肿瘤中的嵌合ENG发生反应。

图6A描述了抗hENG SN6j、SN6c或SN6d对表达人/鼠嵌合ENG的敲入小鼠中的4T1乳腺肿瘤生长的抑制。对照为同型匹配对照免疫球蛋白G MOPC195v。治疗之初，具有已建立的相似大小皮下肿瘤的小鼠被平均分成四个不同的组(每个组中n＝7)。每组中具有已建立的肿瘤的各个小鼠通过静脉给药50μg的同型匹配对照免疫球蛋白G、SN6j、SN6c或SN6d而被治疗。如垂直箭头所示，每隔3或4天重复给药(每周两次)。图中的每条线代表每组中七只小鼠肿瘤体积的平均值。

图6B描述了通过静脉给药100μg的抗hENG单克隆抗体SN6j、SN6c或SN6d对敲入小鼠中已建立的4T1肿瘤生长的抑制。图6B中的实验方式与图6A相同，但是100μg的单克隆抗体或对照免疫球蛋白G被给药到各个敲入小鼠，而非图6A中的50μg。

图7描述了抗hENG单克隆抗体对敲入小鼠中已建立的Col26结肠肿瘤的生长的抑制。治疗之初，具有已建立的相似大小皮下肿瘤Col26的小鼠被平均分成四组(每个组中n＝6)。每组中具有已建立的肿瘤的各个小鼠通过静脉给药100μg的抗hENG单克隆抗体SN6j、SN6c或SN6d或同型匹配的对照免疫球蛋白G MOPC195v(IgG1-κ)而被治疗。如垂直箭头所示，每隔3或4天重复给药(每周两次)。图中所示的每条线代表每组小鼠中六只小鼠的肿瘤体积的平均值。除了抗hENG单克隆抗体治疗的组与对照免疫球蛋白G治疗的组之间肿瘤体积的差异外，使用SN6j、SN6c和SN6d中的每一种所治疗的三组小鼠比使用对照免疫球蛋白G治疗的组存活时间更长。

图8提供了对为确定本发明的抗体所识别的内皮因子的立体表位而通过抗体分析所得到的结果的图形描述。

图9提供了通过细胞放射免疫测定测量的从SN6系列抗内皮因子单克隆抗体(mAb)和¹²⁵I标记的SN6d之间的竞争性抗体结合所得结果的图形描述。

图10描述了编码S-ENG的互补DNA(A)和细菌表达重组ENG片段(B)的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物用于PCR以合成编码ENG蛋白质分子的胞外域的不同部分的DNA片段。A组中引物名称后面的括号中的数字为距5’端的位置。在PCR中正向引物FW1分别与反向引物RV1、RV2、RV3、RV4、RV5和RV6相结合，以合成B组中编码ENG片段I、II、III、IV、V和VI的DNA。正向引物FW2分别与反向引物RV5和RV6相结合，以合成编码ENG片段VII和VIII的DNA。片段VI对应于全长胞外域，而其他片段对应于ENG分子的不同部分。

图11描述了使用抗ENG单克隆抗体的重组ENG片段的蛋白质印迹。从IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)所收获的内含体(已经由空白质粒载体pET-21d(+)或包含编码八个ENG片段(即，I至VIII)中的每一个的互补DNA的质粒载体pET-21d(+)转染)在包含8M脲的缓冲液中溶解。溶解的多肽片段在还原条件下在SDS-PAGE中在15％的凝胶上被分馏。使用12种抗ENG单克隆抗体的每一个可在蛋白质印迹中检测到分离的ENG片段。此外，溶解的重组片段在非还原条件下经受SDS-PAGE，且在蛋白质印迹中可检测到分离的片段与SN6a、SN6g和SN6k的反应性。在还原条件下，可检测到与SN6、SN6b、SN6c、SN6d、SN6e、SN6f、SN6h、SN6I以及SN6j的清晰的反应带，但是检测不到与SN6a、SN6g以及SN6k的反应带。然而，在非还原条件下，SN6a和SN6k可以与不同的ENG片段反应。因为SN6a、SN6b以及SN6k与本专利申请不相关，所以此处并未示出它们的结果。在还原条件或非还原条件下，限定了包含唾液酸的表位的SN6g均不与细菌表达的重组ENG片段中的任一种发生反应。重复实验且可观察到相似的结果。

图12为用于合成图10所述的内皮因子(ENG)片段的PCR引物的序列。该图中提供了每个引物的SEQ ID。

图13A为敲入人内皮因子的氨基酸序列(外显子4-8；上方组)。该图中外显子4中的氨基末端的氨基酸残基N1对应于包括前导序列的整个hENG分子的N121。敲入人内皮因子的氨基酸序列(外显子5和6；下方组)。该图中外显子5中的氨基末端的氨基酸残基A1对应于包括前导序列的整个hENG分子的A175。提供了每个外显子组的SEQ ID。

图13B为包括外显子4-8的人内皮因子基因的核苷酸序列；外显子序列有下划线。且提供了SEQ ID。

具体实施方式

本发明涉及用于预防和/或治疗血管生成相关病症的组合物及方法。

一方面，本发明提供了组合物，所述组合物包括对人内皮因子某部分有特异性的抗体，其中所述抗体与鼠上皮细胞所表达的鼠内皮因子并无交叉反应。也提供了同样对人内皮因子某部分有特异性但是并不与鼠上皮细胞所表达的内皮因子有交叉反应的抗体片段。

另一方面，本发明提供了适合于制备转基因小鼠的组合物。所述组合物包括适合于同源重组的载体，以便可制备表达嵌合内皮因子的转基因小鼠。在特定的实施例中，所述载体适用于用人内皮因子基因的同源外显子同源替换鼠内皮因子基因的外显子4、5、6、7和8或其组合。

本发明的另一方面提供了与不良血管生成相关病症的预防和/或治疗方法。该方法包括对需要进行抗血管生成疗法的个体给予单克隆抗体或其人内皮因子(hENG)结合片段。对抗体及其hENG结合片段的各种改变可被进行且在下面进一步讨论。用于治疗血管生成相关紊乱的方法包括联合疗法，该联合疗法包括使用现在提供的单克隆抗体和/或其hENG结合片段。

术语“血管生成相关疾病”或“血管生成相关病症”在这里均指人类血管生成异常延长的某些病理过程。这些血管生成相关疾病包括但不一定限于糖尿病性视网膜病、成人黄斑变性、慢性疾病、类风湿性关节炎、皮炎、牛皮癣、胃溃疡以及大部分类型的人实体瘤。

术语“血管生成抑制剂”在这里指的是物质组合物，包括但并不一定限于肽类、蛋白质类、酶类、多糖类、寡核苷酸类、DNA、RNA、重组载体以及具有抑制血管生成功能的药物。血管生成抑制剂为现有技术中已知的。代表性例子包括天然和合成生物分子，例如舒尼替尼、索拉非尼、贝伐单抗(阿瓦斯丁)、紫杉醇、0-(氯乙酰基-氨基甲酰基)烟霉醇(″TNP-470″或″AGM1470″)、血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2、血管生长抑素(angiostatin)、人类软骨细胞源性血管生成抑制剂(″hCHIAMP″)、软骨源性血管生成抑制剂、血小板因子-4、gro-β、人干扰素诱导蛋白10(″IP10″)、白细胞介素12、Ro318220、三环癸-9-基黄原酸酯(″D609″)、伊索拉丁、8、9-二羟基-7-甲基-苯并[b]喹嗪鎓溴化物(″GPA1734″)、甲羟孕酮、肝素和可的松的组合、糖苷酶抑制剂、染料木素、沙利度胺、二氨基蒽醌、除莠霉素、熊果酸以及齐墩果酸。

术语“抗血管生成疗法”在这里指的是针对包括表达内皮因子的细胞的脉管系统的疗法。与静态脉管系统相比，内皮因子在增殖脉管系统上的表达处于更高水平。本发明提供的治疗方法可以针对血管生成(即，导致新生血管形成的新毛细血管的形成)，和/或针对已存在的脉管系统以及涉及疾病的情况(例如血管靶向疗法)。

术语“抗体片段”或“其片段”在这里指的是完整抗体分子的部分或片段，其中所述片段保留了抗原结合功能；即，F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、单链Fv(″scFv″)、Fd′以及Fd片段。由单克隆抗体制备不同片段的方法对本领域技术人员是公知的(参见例如，Pluckthurn，1992，Immunol.Rev.130：152-188)。

术语“免疫偶联物”在这里指的是包括根据本发明的抗内皮因子单克隆抗体或其片段(或可选地，识别人血管内皮细胞但与鼠内皮因子缺乏交叉反应性的抗内皮因子单克隆抗体或其片段)以及至少一种抗肿瘤剂或至少一种血管生成抑制剂的偶联物。这类抗肿瘤剂在本领域是公知的，包括但不限于毒素、药物、酶类、细胞因子类、放射性核素、光动力剂、和血管生成抑制剂。毒素包括蓖麻毒蛋白A链、突变假单胞菌外毒素类、白喉类毒素、链黑菌素、博安霉素(boamycin)、皂草素、白树毒素以及商陆抗病毒蛋白。药物包括柔红霉素、甲氨喋呤、卡培他滨、紫杉醇和刺孢霉素。放射性核素包括放射性金属。细胞因子类包括转化生长因子(TGF)-β、白细胞介素类、干扰素类和肿瘤坏死因子。光动力剂包括卟啉类及其衍生物。将抗内皮因子的单克隆抗体或其片段与至少一种抗肿瘤剂复合的方法对本领域技术人员是公知的(即，由Ghetie等，1994，Pharmacal.Ther.63：209-34综述的抗体偶联物)。通常，这类方法利用几种用于耦合或连接分子的可用的异双功能试剂中的一种。

为了本说明书和权利要求书的目的，术语“同型对照免疫球蛋白”在这里指一种特异性的(例如，与其相比的抗体的相同种类中升高)的同型匹配(例如与其相比的抗体具有相同的免疫球蛋白(Ig)类和亚类的)的免疫球蛋白(Ig)，这类免疫球蛋白并不与抗原(对比抗体与其特异性结合)特异性结合，这在以下实施例中将会更加明显。

术语“肿瘤”在这里指的是在中等至高等的水平(与同型正常组织的表达相比)上表达内皮因子的肿瘤，例如人白血病，包括非T细胞型(非T)的急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓单核细胞性白血病；和人实体瘤，其周围脉管系统在中等至高等的水平(与同型的正常组织的表达相比)上表达内皮因子，包括血管肉瘤、乳腺癌、盲肠癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、腮腺肿瘤、咽癌、前列腺癌、和直肠乙状结肠癌。

常规的化疗和放疗的缺点是缺乏选择性将治疗剂传递到指定目标、病变组组而非正常组织的。单克隆抗体已被用于以更大的靶特异性传递治疗剂，从而降低了毒性。在大部分单克隆抗体或片段通过人源化或嵌合化被相应的人类部件替换后，鼠单克隆抗体或其片段已被用于治疗人类疾病。

抗血管生成疗法可以克服与人实体瘤的常规化学疗法或免疫疗法相关联的某些主要问题。首先，抗血管生成疗法可以规避获得性耐药问题。由于肿瘤细胞的遗传不稳定性，很容易产生抗药性肿瘤突变体。然而，遗传稳定的正常细胞，例如血管内皮细胞，远不能产生抗药性。此外，由于如上所论的原因，抗血管生成疗法可以克服肿瘤异质性问题。进一步地，靶向肿瘤的脉管系统而非肿瘤细胞可以规避使高分子量药物(如单克隆抗体和免疫偶联物)渗透到实体瘤的生理障碍。这是因为抗血管生疗法中所传递的治疗剂选择性地作用于作为肿瘤血管衬里的血管内皮细胞而非肿瘤细胞本身(尽管传递的治疗剂会继发性地作用于其接触到的肿瘤细胞)。血管内皮细胞可以直接接近循环的高分子量药物/抗肿瘤剂。此外，有效的抗血管生成疗法并不是必然要破坏所有与肿瘤相关的血管。这是因为大量的肿瘤细胞严重依赖于少量的毛细血管内皮细胞。如果由于抗血管生成疗法损坏了毛细血管床，大量的肿瘤细胞会因为营养和氧的缺乏而死亡。另外一个优点是，用于抗血管生成疗法而开发的一种单一类型的治疗剂可以应用到很多种实体瘤和血管生成相关疾病。本发明包括提供用于血管生成相关疾病的预防与治疗的新的改进的组合物和方法的以下方法。

用于制备转基因小鼠的组合物

用于小鼠基因同源替换(即，基因敲入)的组合物和方法是本领域所公知的。本发明提供了适合于生产包括hENG编码序列的鼠胚胎干细胞(ES)的载体。转基因胚胎干细胞可用于制备敲入小鼠，这种小鼠可以表达嵌合鼠/人内皮因子，相应地，对研究抗血管生成剂的效应很有价值，抗血管生成剂包括但不限于本发明所提供的单克隆抗体及其hENG结合片段。

在一个实施例中，本发明提供了用部分hENG基因来替换部分鼠内皮因子基因所使用的载体。因此，该载体适于促进与鼠内皮因子基因的同源重组。一般而言，适于与受体染色体中的靶位点同源组合所使用的载体具有本领域技术人员所公知的特征。这些特征包括但不一定限于可选择标记，例如特征明确的Neo标记；多克隆位点，除了用于插入染色体靶向部分的基因片段相同的基因片段之外，替换基因片段也被克隆到多克隆位点中，从而实现正确靶向替换；用于载体线性化的位点；某些重组事件所涉及的酶类所识别的位点，例如LoxP位点；以及启动子序列。图2描述了适合于将hENG外显子4、5、6、7、8插入到鼠染色体中的代表性敲入载体。图13A给出了hENG基因的外显子4-8所编码的氨基酸序列，而图13B描述了外显子本身的序列及插入人内含子的外显子序列，其中外显子序列有下划线。图13A中氨基末端的氨基酸残基N1(上组序列)为在全长hENG氨基酸序列的121位处的天冬酰胺，包括前导序列，而图13A中的羧基末端的氨基酸(上组)为全长hENG氨基酸序列的378位处的丙氨酸，包括其前导序列。

因此，在各种实施例中，本发明提供了适合于用人内皮因子基因的同源部分替换鼠内皮因子基因的部分的重组载体。在特定的实施例中，该载体配置为使得外显子4、5、6、7、8中的每个均被人内皮因子基因外显子4、5、6、7、8分别替换。在其他的实施例中，该载体被调整为使得鼠外显子中的任一个、两个、三个、四个或五个均被同源人外显子替换。在一个实施例中，该载体被配置为仅用人外显子5-6替换鼠内皮因子的外显子5-6。

本领域技术人员将认识到，根据本发明用于生产转基因胚胎干细胞和/或转基因小鼠的载体中的人内皮因子外显子序列与内生的人内皮因子外显子序列相同。然而，由于冗余的遗传密码，人内皮因子外显子可以与内生的人内皮因子序列不同，人内皮因子外显子可以包括对部分人内皮因子蛋白(由人内皮因子外显子4-8及其所有组合所编码的)编码的任何核苷酸序列。可以预期到的是，与鼠内含子序列相关的敲入载体中的内含子序列中的明显变异性是容许的，因为内含子序列不是蛋白质编码的。在某些情况下，理想的是在敲入载体中的内含子序列基本上与鼠内皮因子基因中的内含子序列具有相同的长度。

为了使用本发明的载体，一般而言，使用常规技术可以获得胚胎干细胞，选择胚胎干细胞是基于其所具有的结合到并成为发育的胚胎的种系中的一部分从而创造转基因种系传递的能力。因此，任何可以这样做的胚胎干细胞或细胞系均适用于本发明。使用本领域所公知的各种方法，包括，例如，电穿孔、显微注射和磷酸钙处理，可以实现将本发明中所述的敲入载体引入到胚胎干细胞。为引入所选DNA序列，在所选插入方法的适当条件下，敲入载体被添加到胚胎干细胞中。例如，如果细胞将被电穿孔，使用电穿孔机(电穿孔器)并遵循制造商的使用指南将胚胎干细胞和构建DNA暴露于电脉冲下。电穿孔后，在适当的培养条件下允许细胞恢复。由于敲入构建体的存在，细胞被筛选。使用不同方法可以进行对含有转基因(例如，同源重组体)的细胞的筛选，该方法为例如通过使用特定探针进行筛选或通过聚合酶链反应(PCR)或通过DNA印迹法。一旦被选择，胚胎干细胞被注入到动物的胚泡(例如，小鼠)，以形成聚集嵌合体(参见例如，Bradley，在Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells：A Practical Approach，E.J.Robertson，ed.(IRL，Oxford，1987)，第113-152页)。然后，嵌合胚胎可以被植入适当的假孕雌性寄养动物中，该胚胎将用于生产“敲入”动物。在其生殖细胞中含有同源重组DNA的后代可通过标准技术来识别并用于繁殖所有动物细胞均含有同源重组DNA的动物。

小鼠和胚胎干细胞

通过使用上述组合物和方法或任何其他合适的技术，本发明提供了转基因鼠胚胎干细胞敲入小鼠，其稳定地表达了新的人/鼠嵌合内皮因子。我们开发了两种嵌合ENG基因，其在“A计划”和“B计划”中进行了描述。

A计划中，包括hENG外显子4-8的嵌合ENG基因被设计并构建为使得翻译后的嵌合蛋白可以被我们开发的12种抗hENG单克隆抗体中的几种(7或8)所靶向。B计划中，我们生成了一个较小的嵌合基因，该嵌合基因包括编码蛋白的hENG外显子5-6，我们预期该蛋白可以被我们结合本发明所生成的12种单克隆抗体中的几个(2或3)所靶向。B计划的实行是因为考虑到A计划中含有大hENG蛋白(含258个氨基酸多肽和碳水化合物的二聚体)的嵌合ENG在小鼠中不能很好地发挥作用，并可能诱发小鼠中的缺陷性血管生长。应该指出的是，缺乏ENG的小鼠死于缺陷性血管生长(Li等，1999，Science284：1534-1537)，人类hENG突变与遗传性出血性毛细血管扩张症类型1(HHT1；McAllister等，1994，NatureGenetics8：345-351)相关联。然而，我们发现使用A计划和B计划所生产的敲入小鼠发育正常且没有显示出任何类似出血性毛细血管扩张症的症状。这些结果表明嵌合ENG在小鼠中会产生生理作用的。

下一个重要问题是，翻译后的人/鼠嵌合ENG蛋白是否可以在生成血管的血管中有效表达。我们通过对敲入小鼠的肿瘤组织进行免疫组织化学(IHC)染色来解决这个问题。A计划中，小鼠的肿瘤微细管(结肠26和4T1)在IHC染色中与7种抗hENG单克隆抗体(SN6、SN6c、SN6d、SN6f、SN6h、SN6i以及SN6j)反应强烈，而与1种抗hENG单克隆抗体(SN6g)反应微弱。结果表明，7或8种抗hENG单克隆抗体中的每个可以对A计划中敲入小鼠的肿瘤进行靶向。A计划和B计划小鼠均可用于筛选多种多样的抗hENG剂。例如，就其体内抗肿瘤疗效而言，A计划敲入小鼠可用于筛选8种活性的抗hENG单克隆抗体中的最好的一种或两种。重要的是要注意到A计划嵌合ENG的hENG部分包括许多抗hENG单克隆抗体所针对的免疫显性表位。因此，A计划敲入小鼠对于评估许多抗hENG单克隆抗体或其他抗hENG剂的体内抗肿瘤疗效很有价值。此外，敲入小鼠对于寻找抗hENG单克隆抗体与其他治疗剂的合适组合很有价值，以增强单克隆抗体及其hENG结合片段的抗肿瘤疗效。可以相信，本发明首次公开了稳定表达人/鼠嵌合ENG的敲入小鼠和只识别嵌合ENG的hENG部分并在抗血管生成疗法中显示出抗血管生成活性的抗ENG单克隆抗体/免疫偶联物。

抗体

本发明的另一实施例提供了抗hENG单克隆抗体。抗体的特征是对在敲入小鼠中的人/鼠嵌合ENG的hENG部分上表达的表位的结合特异性，此特异性受制于某些肿瘤脉管系统和增殖的血管内皮细胞(血管生成的特征)。在小鼠模型中评估单克隆抗体的体内疗效，以进行对于评估临床疗效、药代动力学及在人抗血管生成疗法的潜在的不利副作用必要的研究。本发明测试了8种此类抗内皮因子单克隆抗体：来自杂交瘤克隆N13A1的单克隆抗体SN6、来自克隆L41C8的SN6c、来自克隆D31A2的SN6d、来自K42C10的SN6f、来自克隆I12G6的SN6g、来自克隆G42C2的SN6h、来自克隆K21C7的SN6i以及来自克隆Y42F1的SN6j。图1、图8、图9以及表1中描述了这些单克隆抗体的特性。

从前面的描述以及此处给出的示例及附图可以明显看到，在不同的实施例中，本发明提供了抗hENG单克隆抗体，抗hENG单克隆抗体可用作用于预防或治疗人肿瘤血管生成以及人血管生成相关疾病(至少部分特征是过度血管化)的抗血管生成剂。此类血管生成相关疾病的例子包括但不一定限于所有人实体瘤，以及糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性、慢性炎性疾病(包括类风湿性关节炎，皮炎以及牛皮癣)。

在不同的实施例中，单克隆抗体及其hENG结合片段与鼠内皮因子并无交叉反应。单克隆抗体可以对由人内皮因子外显子4、5、6、7、8中的任一种编码的人内皮因子区域有特异性。图13A和13B描述了由其编码的代表性的外显子序列和氨基酸序列。在不同的实施例中，单克隆抗体对于由人内皮因子外显子4-8所编码的人内皮因子区域有特异性，并相应地与hENG部分(包括N121-A378(包括一切)的hENG氨基酸或由N121-A378(包括一切)的hENG氨基酸组成)特异性结合。图1还图解示出了具有这些特征的示例性抗体。本发明并不包括与鼠内皮因子有交叉反应的单克隆抗体指定的SN6f和SN6j。分别产生SN6f和SN6j的杂交瘤K42C10和Y42F1，分别存放到美国典型培养物保藏所保藏，保藏编号分别为HB-12172和HB-12171。在一个实施例中，用于抗血管生成和抗肿瘤治疗而提供的抗体包括SN6c、SN6d、SN6i及其组合。本发明包括生成每种所述单克隆抗体的杂交瘤。

图8和9示出了本发明的抗体的具体示例的表征。特别在图8中，A组提供了由12个SN6系列抗ENG单克隆抗体所限定的ENG的立体表位图。该图通过进行3种不同试验构建，这3种不同试验包括：1)使用几个¹²⁵I-标记SN6d系列单克隆抗体所进行的序列竞争性抑制试验，2)同时的竞争性结合测定，以及3)各个表位的敏感性程度与各种酶消化的对比。B组提供了ENG线性序列表位图，示出了由11种SN6系列单克隆抗体(不包括SN6g)所限定的表位的位置。该图中示出了用于表位作图的每个肽片段的氨基末端和/或羧基末端的氨基酸残基。该图中，氨基酸残基(不包括25个氨基酸的前导序列)被编号。因此，氨基末端的氨基酸被指定为E1(谷氨酸1)而非E26。

图9提供了使用细胞放射免疫法测量的SN6系列抗内皮因子单克隆抗体和¹²⁵I-标记的SN6之间的竞争性抗体结合实验的结果。将由各个SN6系列抗内皮因子单克隆抗体所限定的各个表位的空间位置进行对比的试验之一是竞争性结合试验，其结果在图9中示出，其中左组的横坐标为纯化的单克隆抗体(SN6、SN6a、SN6b、SN6j、SN6k)、对照单克隆抗体(SN4d；IgG2a-κ)以及对照小鼠免疫球蛋白G(MOPC195变异体；IgG1-κ)的纳克数。右组的横坐标为从SN6系列杂交瘤(SN6、SN6c、SN6d、SN6e、SN6f、SN6g、SN6h和SN6i)和MOPC195变异体浆细胞瘤的腹水液进行10倍连续稀释后的倒数获得的相对浓度。靶抗原为KM-3白血病细胞上的内皮因子(CD105)。在本次测试中，表达内皮因子的KM-3(未成熟的B谱系白血病细胞系)细胞首先使用不同浓度的各个SN6系列单克隆抗体和对照小鼠免疫球蛋白G/或对照单克隆抗体来培养，随后，¹²⁵I-标记SN6单克隆抗体被允许与预培养的KM-3细胞进行反应。用SN6(自体单克隆细胞；阳性对照)对KM-3细胞的预培养最大时几乎完全阻断了¹²⁵-SN6的随后结合，而用SN6c或SN6d对KM-3细胞的预培养最大时大约90％地阻断了¹²⁵I-SN6的随后结合。另一方面，用SN6i或SN6f对KM-3细胞的预培养最大时分别47％和40％地阻断了¹²⁵I-SN6的随后结合。因此，由SN6c和SN6d限定的表位处于离开SN6f(称为SN6f表位)所限定的表位的不同空间位置。SN6i表位接近于SN6f表位，但是不同于SN6f表位。重要的是，用更高浓度SN6f和SN6k进行的预培养并没有阻断反而提高了¹²⁵I-SN6的随后结合。这可能是由于SN6g和SN6k与KM-3细胞上的内皮因子(诱发内皮因子分子以这样的方式发生构象变化：SN6表位暴露得更多一些)进行结合的原因。将从图9中变得明显的是，在某些实施例中，本发明所提供的抗体可以竞争性地抑制SN6与人内皮因子的结合。

在一个实施例中，本发明提供了由杂交瘤克隆L41C8所产生的被称为SN6c的抗hENG单克隆抗体。这种单克隆抗体限定了异亮氨酸271和丙氨酸378之间由hENG基因外显子7-8所编码的hENG的区域的表位。这种单克隆抗体并不与鼠内皮细胞发生交叉反应。

在另一个实施例中，本发明提供了由杂交瘤克隆D31A2所产生的被称为SN6d的抗hENG单克隆抗体。这种单克隆抗体限定了异亮氨酸271和丙氨酸378之间由hENG基因外显子7-8所编码的hENG的区域的表位。这种单克隆抗体并不与鼠内皮细胞发生交叉反应。

在另一个实施例中，本发明提供了由杂交瘤克隆K21C7所产生的被称为SN6i的抗hENG单克隆抗体。这种单克隆抗体限定了异亮氨酸271和丙氨酸378之间由hENG基因外显子7-8所编码的hENG的区域的表位。这种单克隆抗体并不与鼠内皮细胞发生交叉反应。

此外，本发明还提供了与上述hENG特异性结合，同时不与鼠内皮因子发生交叉反应的抗体片段。该抗体片段包括但不一定限于Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链(ScFv)、双抗体、多价抗体、包括一个或多个抗体部分的融合蛋白，以及包括所需hENG特异性的抗原识别位点但不与鼠内皮因子发生交叉反应的任何其他改性的免疫球蛋白分子。

本发明还提供了此处所公开的嵌合和部分或全部人源化的抗体版本。制备人和嵌合抗体的方法是本领域所公知的。在一个实施例中，人源化抗体包括：鼠超变区，该鼠超变区对人内皮因子氨基酸N121和氨基酸A378之间的人内皮因子区域具有内皮因子结合特异性；以及人免疫球蛋白的恒定区和可变区序列。在某些实施例中，所述抗体为人源化抗体，该人源化抗体包括：鼠超变区，该鼠超变区对人内皮因子天冬酰胺121和丙氨酸378之间的人内皮因子区域具有内皮因子结合特异性；以及人免疫球蛋白的恒定区和可变区(不包括超变区)序列。在其他实施例中，所述抗体为嵌合抗体，该嵌合抗体包括：鼠可变区，该鼠可变区对人内皮因子氨基酸异亮氨酸217和氨基酸丙氨酸378之间的人内皮因子区域具有内皮因子结合特异性；以及人免疫球蛋白的恒定区序列。

本发明还提供了组合物，该组合物包括本发明所描述的单克隆抗体及其hENG结合片段，并具有药学上可接受的载体。用于治疗目的的此类组合物可通过将单克隆抗体或其片段与任何合适的药学上可接受的载体混合来制备。适合于与所述试剂混合的组合物的例子可以在以下文献中找到：Remington：The Science and Practice of Pharmacy(2005)第21版，费城，宾夕法尼亚，Lippincott Williams & Wilkins。

这些试剂可以单独使用，或者在组合物(也包括其他治疗剂)中使用，和/或以组合治疗方式使用。其他治疗剂可以包括但不限于阿霉素、环磷酰胺、紫杉醇、卡培他滨、舒尼替尼，索拉非尼和贝伐单抗(阿瓦斯丁)。

在一个实施例中，本发明提供了免疫偶联物。免疫偶联物是通过将抗内皮因子单克隆抗体或其片段与至少一种抗肿瘤剂偶合而形成的，其中得到的免疫偶联物保留了其限于某些肿瘤脉管系统以及具有血管生成特征的增殖血管内皮细胞的选择性的免疫反应性。裸露的抗hENG单克隆抗体或免疫偶联物可以被给药到需要抗血管生成疗法的个体。

方法

在各种实施例中，任何抗体(改性的或未改性的)或其hENG结合片段可以使用本发明中所述的小鼠模型来测试。这一实施例适合于测试试验抗体以确定其是否是用于治疗人血管生成相关疾病的候选物。在评估了本发明所提供的小鼠模型中的参数(例如临床疗效和药代动力学)后，抗血管生成疗法可以“放大”用于人类治疗。包括单克隆抗体的治疗剂从小鼠模型放大到人类的生理基础是本领域技术人员所公知的(例如参见，Baxter等，1995，Cancer Res.55：4611-4622)。

根据本发明的另一实施例包括使用根据本发明的抗hENG单克隆抗体或其hENG结合片段用于预防和/或治疗血管生成相关疾病的方法。在这一方面，该方法可以用于预防和/或治疗需要治疗的个体。需要治疗的个体可能被诊断、怀疑或有风险罹患血管生成相关疾病。因此，该个体可能被诊断、怀疑或有风险罹患任何人实体瘤以及选自由糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性以及慢性炎性疾病(包括类风湿性关节炎、皮炎和牛皮癣)构成的组的任何其他疾病。

本领域技术人员公认的是，考虑到所治疗个体的体形、性别、健康和年龄等因素，以及个体可能患有或具有风险患有的血管生成相关疾病的类型和阶段，可以通过给药途径和其他已知变量来规定任何单克隆抗体或其hENG结合片段的特定给药方案的形式和特点，无论其是单独使用，或是在药物制剂中使用，又或是结合一种或多种其他治疗剂来使用。基于这种标准，本领域技术人员可以确定给药到个体的组合物的有效量。

除了其他治疗剂之外(如果需要的话)，包括抗体或其hENG结合片段的组合物可以使用任何可用的方法和途径给药到个体，该方法和途径包括口服、肠胃外注射、皮下注射、腹膜内注射、肺内注射、鼻内注射和颅内注射。肠胃外输注包括肌内给药、静脉内给药、动脉内给药、腹膜内给药和皮下给药。本发明中的方法可以在常规抗癌疗法之前、之后或与之同时进行，常规抗癌疗法包括但不限于化疗、手术介入和放射疗法。

从前面的描述以及这里示出的示例和附图可以清楚看出，本发明所提供的抗hENG单克隆抗体对人/鼠嵌合ENG的hENG部分上的表位具有结合特异性，且可以用于抑制肿瘤相关的血管生成以及原有小血管的血管舒张(血管靶向)。因为相信当前的结果证明了抗内皮因子单克隆抗体或含有抗内皮因子单克隆抗体的免疫偶联物可以有效地体内靶向肿瘤相关脉管系统，本发明的另一实施例提供了抗血管生成疗法的方法，该方法利用可识别在人脉管系统内皮细胞上表达的内皮因子的任何抗内皮因子单克隆抗体。更具体地，因为本发明中的抗ENG单克隆抗体显示出了对ENG的免疫反应性以及体内靶向肿瘤相关脉管系统中的疗效，这类单克隆抗体对于人类自身和仅识别人血管内皮细胞表面上的ENG的单克隆抗体，建立了可预测的合理效用。

给出以下示例以说明本发明。这些示例不以任何方式对本发明进行限制。

示例1

本示例描述了对稳定表达新的人/鼠嵌合内皮因子的敲入小鼠的开发。

我们开发的12种抗hENG单克隆抗体限定了由免疫和生化试验(例如，竞争性结合试验)所确定的至少8种不同立体表位。在hENG的氨基酸序列中的特定区域中所限定的单克隆抗体的序列表位使用对应于ENG分子不同部分的重组多肽片段来确定。图1示出了该序列表位。

我们人源化了外显子4-8所覆盖的鼠ENG(mENG)区域，因为该区域包含了到目前为止我们所生产的大部分抗hENG单克隆抗体所限定的表位。此外，外显子7所编码的hENG蛋白区域包含了免疫显性表位。我们构建了基因靶向载体，该基因靶向载体用于将mENG的外显子4-8靶向地替换为hENG的相应外显子(图2)。通过聚合酶链反应和DNA印迹来检测靶向敲入基因。这两项结果证实mENG中的外显子4-8被hENG外显子4-8成功替换(图3)。通过使携带Neo的雄性小鼠与删除了Cre的雌性小鼠进行交配，移除了敲入小鼠靶向基因中的Neo标记。在重复的交配/繁殖之后，我们得到了所需的敲入小鼠，该小鼠携带人/鼠嵌合ENG基因但是没有Neo和Cre基因；这一点通过聚合酶链反应和DNA印迹实验得到证实。使用类似策略，(B计划)，我们将mENG基因的外显子5-6替换为hENG基因的相应外显子5-6。

然后，我们测试了翻译后的人/鼠嵌合ENG蛋白是否在生成血管的血管中得到了有效表达。通过对敲入小鼠的肿瘤组织的免疫组织化学(IHC)染色(图4A、4B和图5A、5B)，我们解决了这一问题。为此，我们将结肠26鼠结肠腺癌细胞或4T1鼠乳腺癌细胞皮下接种到敲入小鼠和野生型小鼠(对照)的左侧腹。移除生成的肿瘤，并通过使用抗hENG单克隆抗体、同型匹配对照免疫球蛋白G和对照单克隆抗体进行免疫组织化学染色来检测被移除的肿瘤中的血管。结肠26肿瘤和4T1肿瘤均表现出了使用多种抗hENG单克隆抗体的一致的免疫组织化学染色图案。除SN6j之外，所有其他6种抗hENG单克隆抗体(SN6h、SN6、SN6c、SN6d、SN6f和SN6i)(其序列表位位于外显子4-8编码的蛋白序列区域中)(参见图1)也表现出了对敲入小鼠中肿瘤相关血管的有效的免疫染色。另外，限定了碳水化合物表位的SN6g染色微弱。图4A、4B、5A、5B示出了免疫组织化学染色的例子。

免疫组织化学研究结果验证了我们的实验设计。敲入小鼠正常发育且健康。结果表明生成的嵌合ENG在小鼠中可以产生生理作用。

示例2

这个示例描述了抗抗hENG单克隆抗体的制备。使用来自表达ENG的人白血病细胞的细胞膜糖蛋白的肿瘤相关抗原富集部分使小鼠免疫而产生抗hENG单克隆抗体SN6(Haruta和Seon，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：7898-7902)。本发明其余的7种抗hENG单克隆抗体是通过使用纯化的人内皮因子(hENG)制剂使小鼠免疫所产生的。hENG是从人急性淋巴细胞性白血病(ALL)细胞中纯化出的。细胞膜糖蛋白使用前文所述的洗涤剂提取法和凝集素亲和层析法来分离(Haruta和Sean，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7898-7902，通过引用并入本文)。分离出的糖蛋白被加到包含抗内皮因子单克隆抗体SN6的免疫亲和性柱(Seon等，1997，Clin.Cancer Res.3：1031-1044.)，该抗内皮因子单克隆抗体SN6已使用25mM的Tris-HCl平衡，Tris-HCl的pH值为8.0，含0.5％牛磺胆酸盐、0.15M的NaCl、2mM的EDTA、0.03％NaN3和0.5mM苯甲基磺酰氟。用pH值为11.3且含0.5％牛磺胆酸盐、2mM的EDTA、0.03％NaN3的50mM二乙胺-HCl(“碱性缓冲液”)对束缚材料进行洗脱。立即通过加入0.5M的Tris-HCl缓冲液(pH值为7.1)的1/10体积来中和洗出液。洗脱的材料被再次加到免疫亲和性柱，束缚材料被另外含有0.01％细胞色素c(12.4kD载体蛋白)的碱性缓冲液洗脱及中和。将洗脱的材料透析和使用超滤(例如，用YM-10膜)浓缩。在4-6℃的温度下进行该纯化工艺。用固相放射免疫测定使用单克隆抗体SN6监测并用凝胶电泳银染色证实hENG的纯化。得到的hENG制剂包含170kD(非还原条件下)和92kD(还原条件下)的单一主要成分。

第一免疫治疗方案中，在上述免疫治疗方案(Seon等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：845-849)及其修改之后，2只雌性BALB/c小鼠使用分离的hENG进行免疫。简言之，包括100μl10mM的Tris-HCl缓冲液(pH值为7.5，含0.5％牛磺胆酸盐、0.15M NaCl以及14μg细胞色素c)中的10μg hENG制剂的抗原溶液与等体积的佐剂(例如，Fruend的完整的)混合，然后皮下注射到每个小鼠的多个部位。此外，在不同的部位，注射100μl盐水中的1×10⁹百日咳博德特菌细菌。皮下给药两个佐剂中的抗原溶液的加强免疫接种。最后一次免疫接种为腹膜内给药，包括40μl抗原溶液(含有与200μl盐水混合的8μghENG制剂)。最后一次免疫后第4天，脾被移除并融合P3/NS1/1-Ag4-1(NS-1)小鼠骨髓瘤细胞系。如前面所述，进行细胞融合、杂交瘤筛选以及免疫球蛋白类别确定(Haruta和Seon，1986，同上)。在第二免疫治疗方案中，如第一次实验所述，用分离的hENG对雌性BALB/c小鼠进行免疫，但未给药百日咳博德特菌。这些免疫接种产生的11种杂交瘤各自产生了不同的进一步表征的坑hENG单克隆抗体。

如图4A、4B、5A、5B所示，使用这些免疫治疗方案生成的11种单克隆抗体中的7种证明了对于稳定表达在敲入小鼠中的人/鼠嵌合ENG的hENG部分的结合特异性。

示例3

此示例描述了抗hENG单克隆抗体。使用在示例2中描述的第一免疫治疗方案生成单克隆抗体SN6f、SN6g、SN6h、SN6i和SN6j，使用第二免疫治疗方案生成单克隆抗体SN6c和SN6d。使用来自如上示例2所述的人白血病细胞的细胞膜糖蛋白的肿瘤相关抗原富集部分生成单克隆抗体SN6。8种单克隆抗体中的每个的免疫反应性特异性的特征在于在细胞放射免疫测定(RIA)中对不同造血细胞系进行测试这些抗体以及使用上述方法对hENG进行免疫沉淀反应(Haruta和Sean，1986，同上)。简言之，通过RIA在每次试验中使用20μl按1∶9比例稀释的各个杂交瘤培养液以及2x105造血细胞。小鼠浆细胞瘤免疫球蛋白G1和免疫球蛋白G2a包括在测定中，作为对照。表1示出了表明免疫反应性(+)或表明未检测到免疫反应性(-)的结果。

表1

如表1对于本发明的抗内皮因子单克隆抗体所示，以及如前面对于抗hENG单克隆抗体SN6所确定的，所测试的未成熟B谱系白血病细胞系(KM-3，REH，NALM-1，NALM-6和NALM-16)以及所测试的骨髓单核细胞性白血病细胞系(ML-2，HL-60和U937)均显示出免疫反应性。但是它们并不与任何成熟B谱系白血病淋巴瘤细胞系(BALL-1、BALM-2、BALM-3、Daudi、Ramos、U698M和SU-DHL-4)、任何T白血病细胞系(MOLT-4、JM、CCRF-CEM、CCRF-HSB2、Ichikawa、HPB-MLT和HUT-78)或EBV转化的B细胞系(CCRF-SB、RPMI1788和RPMI8057)发生反应。免疫沉淀测定表明，本发明中的所有8种抗hENG单克隆抗体在非还原条件下沉淀了170kD组分，而在还原条件下沉淀了92kD组分。

进一步地，8种单克隆抗体SN6、SN6c、SN6d、SN6f、SN6g、SN6h、SN6i和SN6j中的每种的免疫反应性特异性的特征在于在几种人恶性组织的组织化学染色中使用这些单克隆抗体。这些组织包括乳腺、结肠、肾、肺和淋巴结的恶性组织。根据本领域中的标准方法，组织被冷冻，然后空气干燥，用丙酮固定，及染色。带有8种单克隆抗体中的每种的恶性组织的免疫组织化学(IHC)染色表明这些单克隆抗体与同所有测试的恶性组织相关的血管内皮反应强烈，而同型对照免疫球蛋白G在每种组织中没有表现出任何明显染色。

综上所述，如对表达ENG的人白血病淋巴瘤细胞和人血管内皮细胞的选择性反应性所显示的那样(如它们与恶性肿瘤脉管系统的反应性所表明的)，根据本发明的抗hENG单克隆抗体显示出了对于ENG的强免疫反应性。因为ENG主要是与增殖相关的对于经历活跃血管生成的内皮细胞的标记，所以根据本发明的抗hENG单克隆抗体可以用于选择性地将抗血管生成疗法靶向到肿瘤脉管系统或在人类其他血管生成相关疾病中存在的过度血管化。

任何潜在用于抗血管生成疗法的新试剂在应用到涉及人类患者的临床试验之前，都优选先评估其在动物模型中的安全性与疗效。在这方面，开发的敲入小鼠稳定地表达了人/鼠嵌合ENG，且根据本发明的对于敲入小鼠中的嵌合ENG的hENG部分特异性反应的单克隆抗体对于评估这些单克隆抗体以及使用这些单克隆抗体所形式的免疫偶联物的安全性和疗效是很有价值的。

如图4A、4B、5A和5B所示，通过IHC染色试验示出了本发明的8种抗hENG单克隆抗体与敲入小鼠中的人/鼠嵌合ENG的人ENG部分的特异性反应性。单克隆抗体SN6h、SN6j、SN6d和SN6f显示了强烈的免疫组织化学染色，这证明了与来自纯合子和杂合子(半合子)敲入小鼠的4T1肿瘤中的人/鼠嵌合ENG的强反应性，但是与来自野生型小鼠的4T1肿瘤中的小鼠ENG并未显示出明显的免疫组织化学染色(图4A和4B)。抗小鼠ENG(CD105)单克隆抗体显示出了与杂合子和野生型小鼠中的小鼠ENG的强免疫组织化学染色(图4A)。同型匹配的对照免疫球蛋白G并没有显示出与嵌合ENG或小鼠ENG的任何明显的免疫组织化学染色(图4A)。如图5A所示，单克隆抗体SN6c、SN6i和SN6显示出了与SN6h、SN6j、SN6d以及SN6f相似的免疫组织化学染色图案。单克隆抗体SN6g显示出与纯合子小鼠中的嵌合ENG的微弱的免疫组织化学染色(图5B)。单克隆抗体SN6k并未显示出与嵌合或小鼠ENG的明显的免疫组织化学染色(图5B)。在这组实验中，抗小鼠ENG单克隆抗体和对照免疫球蛋白G的免疫组织化学染色与图4A所示的上组实验中的免疫组织化学染色在本质上是相同的(图5A和5B)。表现出与4T1乳腺肿瘤中的嵌合ENG的强免疫组织化学染色的单克隆抗体，也表现出了与Col26结肠肿瘤中的嵌合ENG的强免疫组织化学染色。这一发现与前面的发现(ENG表达形式在许多不同的实体瘤的血管生成血管中是常见的)是一致的(Seon等，2011，Curr.Drug Deliv.8：135-143)。

综上所述，本发明中的所有8种抗hENG单克隆抗体与本发明中的敲入小鼠中的嵌合人/鼠嵌合ENG的人ENG部分发生反应。

示例4

此示例描述了将抗hENG抗体用于抗血管生成疗法。虽然抗hENG单克隆抗体可采用非静脉(i.v.)途径给药，说明的优选实施例为单克隆抗体的静脉给药。这是因为包括血管生成的增殖脉管系统是治疗的目标；因此，静脉给药单克隆抗体可以较使用的另一种给药途径更快地浸透靶向脉管系统。此外，静脉途径允许进一步靶向特定组织的可能性。因此，在本实施例的变型中，可用导管将单克隆抗体注入到靶血管生成的位置。例如，如果肿瘤血管生成是抗血管生成疗法的目标，且如果肿瘤位于肝内，那么就可以使用导管将单克隆抗体传递到肝门静脉中。在这个变型中，甚至减少了单克隆抗体的全身分布，从而进一步最小化了抗血管生成疗法的任何潜在副作用。

抗hENG单克隆抗体SN6c、SN6d、SN6j被用于说明根据本发明的方法的抗血管生成疗法。三组治疗方案被用于治疗研究。在第一组治疗方案中，4T1鼠乳腺癌细胞被皮下(s.c.)接种到稳定表达人/鼠嵌合ENG的敲入小鼠的侧腹。在治疗之初，带有明显已建立的相似大小肿瘤的小鼠被平均分成4组(n＝7)。每组的具有已建立的肿瘤的各个小鼠均通过静脉(i.v.)给药(通过尾静脉)50μg的SN6c、SN6d、SN6j或同型匹配对照免疫球蛋白G(MOPC195v)而治疗。每隔3或4天(每周两次)重复给药。每天观察小鼠，每隔2或3天测量肿瘤大小和体重(图6A所示)。

在第二组治疗方案中，产生带有已建立的4T1肿瘤的四组敲入小鼠，并对其以类似于第一组治疗方案的方式进行治疗，但是静脉给药100μg的SN6c、SN6d、SN6j或对照免疫球蛋白G(图6B)。

第三组治疗方案中，Col26鼠结肠癌细胞被皮下接种到敲入小鼠的侧腹。治疗之初，带有明显已建立的类似大小肿瘤的小鼠被平均分成4组(n＝6)。每组中的具有已建立的肿瘤的各个小鼠通过静脉给药100μgSN6c、SN6d、SN6j或同型匹配对照免疫球蛋白G而治疗。每隔3或4天(每周两次)重复给药。每天观察小鼠，每隔2或3天测量肿瘤大小和体重。结果如图7所示。当观察小鼠的存活率时，发现用抗hENG单克隆抗体(SN6c、SN6d和SN6j)治疗的小鼠要比用对照免疫球蛋白G治疗的小鼠活得久一些。

示例5

本示例描述了使用嵌合和人源化抗hENG单克隆抗体进行抗血管生成疗法。上述针对hENG建立的单克隆抗体也可以作为嵌合抗体制备，或者它们可以部分地或全部地被人源化。制备嵌合和人源化抗体的合适技术是本领域所公知的。美国专利No.6,200,566描述了制备和使用嵌合和人源化抗体，其全部公开内容通过引用并入本文。使用嵌合和人源化抗hENG单克隆抗体进行抗血管生成疗法的方法类似于使用鼠抗体进行治疗的方法。一般而言，嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体最小化了人抗小鼠抗体响应的发展。此外，嵌合或人源化抗体总体上通过提供较长半衰期的抗体(较人类中的父鼠抗体的半衰期而言)改变了药代动力学。

示例6

本示例描述了本文所描述的抗体的表位作图。为了确定内皮因子的立体表位，我们进行了三次不同的试验：1)使用几个¹²⁵I-标记的SN6系列单克隆抗体进行的序列竞争性抑制试验，2)同时的竞争性结合测定，和3)将各个表位的敏感性程度与不同酶消化进行对比。这些试验的结果以图形的方式概括在图8中。

虽然参考特定实施例(有些是优选实施例)对本发明进行了具体说明和描述，但是本领域技术人员应该理解的是，在不脱离本文所公开的本发明的精神与范围的条件下，可以对形式和细节进行各种修改。

Claims (13)

1.一种分离的抗体或所述抗体的片段，其中所述抗体或所述抗体的片段与人内皮因子氨基酸天冬酰胺121和氨基酸丙氨酸378之间的人内皮因子的区域特异性结合，其中所述抗体和鼠内皮因子不可交叉反应。

2.根据权利要求1所述的抗体的片段，其中所述片段选自由Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链(ScFv)和其组合构成的组。

3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。

4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体为人源化抗体，所述人源化抗体包括鼠超变区，该鼠超变区对于人内皮因子氨基酸天冬酰胺121和氨基酸丙氨酸378之间的人内皮因子的所述区域具有内皮因子结合特异性，以及人免疫球蛋白的恒定区序列和可变区序列。

5.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体，所述嵌合抗体包括鼠可变区，所述鼠可变区对于人内皮因子氨基酸天冬酰胺121和氨基酸丙氨酸378之间的人内皮因子的所述区域具有内皮因子结合特异性，以及人免疫球蛋白的恒定区序列。

6.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或所述片段共轭到细胞毒性剂。

7.一种包含根据权利要求1所述的抗体或所述片段的组合物，其中所述组合物包括药学上可接受的载体。

8.一种重组载体，包括选自人内皮因子(hENG)外显子4、5、6、7、8和其结合的hENG外显子，其中所述载体适用于鼠内皮因子基因的同源区域的同源替换。

9.根据权利要求8所述的重组载体，其中所述重组载体包括hENG基因的外显子4、5、6、7、8。

10.根据权利要求8所述的重组载体，其中所述重组载体包括与鼠内皮因子基因序列相同的一个或多个序列区。

11.一种鼠胚胎干细胞，包括选自由鼠内皮因子基因外显子4、5、6、7、8及其组合构成的组的鼠内皮因子基因外显子的替换，其中所述鼠内皮因子外显子被替换为同源人内皮因子外显子。

12.根据权利要求11所述的鼠胚胎干细胞，其中所述鼠内皮因子外显子5、6被分别替换为人内皮因子外显子5、6。

13.根据权利要求11所述的鼠胚胎干细胞，其中所述鼠内皮因子外显子4、5、6、7、8被分别替换为人内皮因子外显子4、5、6、7、8。

Images