ES2642787T3 - Anticuerpos con actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mejorada, métodos para su producción y uso - Google Patents

Anticuerpos con actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mejorada, métodos para su producción y uso Download PDF

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Abstract

El uso de células epiteliales mamarias de mamíferos no humanos para mejorar la unión de la región Fc de un anticuerpo IgG o anticuerpos IgG a un receptor FcγRIII en comparación con un anticuerpo o anticuerpos derivados de un cultivo de células, en donde dichas células son de un mamífero no humano tratado mediante ingeniería genética para expresar el anticuerpo en su leche, y en donde el modelo de glicosilación del anticuerpo se modifica produciendo el anticuerpo o los anticuerpos en las células.

Description

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el núcleo.
La Fig. 11 demuestra la unión de anticuerpos a células CHO que expresan CD137. La Fig. 11A proporciona los resultados para células CHO sin CD137 (testigo negativo); la Fig. 11B proporciona los resultados para células CHO que expresan CD137. La curva con trazo oscuro en cada gráfica es para la tinción con un anticuerpo anti-DNP irrelevante.
La Fig. 12 ilustra el exterminio potenciado de células CHO que expresan CD137 por parte de un anticuerpo derivado de la leche en un ensayo de ADCC.
La Fig. 13 proporciona resultados de un análisis de biosensor de la unión IgG1-sFcgRIIIa. La Fig. 13a muestra los resultados con el anticuerpo de leche de cabra; la Fig. 13B muestra los resultados con el anticuerpo de leche de ratón; la Fig. 13C muestra los resultados con el anticuerpo del cultivo de células; la Fig. 13D muestra los resultados con anticuerpo aglicosilado de leche de ratón.
La Fig. 14 ilustra un kit que comprende un anticuerpo con actividad de ADCC mejorada.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se ha descubierto que anticuerpos producidos en la leche de animales transgénicos tienen una actividad de ADCC mejorada en relación con anticuerpos recombinantes producidos a través del cultivo de células in vitro. El modelo de glicosilación de anticuerpos que tienen actividad de ADCC mejorada también ha sido evaluado. Se proporcionan composiciones de anticuerpos producidos en células epiteliales mamarias al igual que los métodos de su producción y uso.
En un aspecto de la invención, los anticuerpos tienen actividad de ADCC mejorada. Tal como se utiliza en esta memoria, “actividad de ADCC mejorada” pretende referirse a un anticuerpo o composición del mismo que exhibe una mayor actividad de ADCC cuando se produce por un método que altera su modelo de glicosilación que cuando se produce por un método que no altera su modelo de glicosilación o el nivel de actividad de ADCC que posee antes de la alteración de su modelo de glicosilación según se proporciona en esta memoria. Anticuerpos con actividad de ADCC mejorada incluyen aquellos que antes de la alteración no exhibían actividad de ADCC alguna. Tal como se utiliza en esta memoria, “modelo de glicosilación” se refiere al conjunto de hidratos de carbono que están presentes en un anticuerpo individual o en un grupo de anticuerpos. Se pueden realizar cambios al modelo de glicosilación alterando la glicosilación de un anticuerpo o de un grupo de anticuerpos. El cambio del modelo de glicosilación de una composición de anticuerpos pretende abarcar casos en los que ha cambiado la glicosilación de un anticuerpo individual, un subconjunto de los anticuerpos en las composiciones o la totalidad de los anticuerpos en la composición. El modelo de glicosilación se puede determinar por muchos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, métodos para analizar hidratos de carbono en proteínas han sido descritos en la solicitudes de patente de EE.UU. publicadas como US 2006-0057638 y US 2006-0127950.
La glicosilación es importante para el plegamiento correcto, la fijación de objetivos, la bioactividad y el aclaramiento de glicoproteínas terapéuticas. Con el desarrollo, por ejemplo, de animales transgénicos como sistemas de expresión, se ha apreciado que diferentes fondos genéticos resultan en diferentes niveles de expresión y glicosilación de las proteínas producidas. La glicosilación de proteínas transgénicamente derivadas aisladas de la leche de cabra es diferente a la de proteínas recogidas de un cultivo de células (Denman et al., 1991). En antitrombina humana producida transgénicamente, el tipo de glicosilación es dependiente del sitio. Oligosacáridos fucosilados y sialilados se encontraron en las posiciones Asn96 y Asn192, mientras que Asn155 tenía un oligosacárido oligomanosa (Edmunds et al., 1998). La glicosilación dependiente del sitio también se encontró en interferón gamma producido en la leche de ratón (James et al., 1995).
La glicosilación es una modificación post-traducción que puede producir una diversidad de formas de proteínas finales en el estado natural. Moléculas de IgG se glicosilan en el residuo Asn297 del dominio CH2, dentro de la región Fc. Determinadas alteraciones en la estructura de los hidratos de carbono también pueden afectar a la función del anticuerpo o a la eficacia terapéutica. Por ejemplo, en enfermedades tales como artritis reumatoide se ha documentado una incidencia mayor que la normal de estructuras agalactosilo (que parecen ser específicas para un hidrato de carbono asociado a Fc de IgG) (Parekh et al., 1985; Rademacher et al. 1988a). Se ha propuesto que esta estructura aglicosilada es más móvil que la estructura observada normalmente en esta región y, así, puede inducir cambios en la estructura cuaternaria de la glicoproteína, contribuir a la inmunogenicidad del anticuerpo o puede por sí misma contribuir a una función aberrante del anticuerpo (Rademacher et al. 1988b; Axford et al. 1992). Sin embargo, en este estado patológico, esta estructura sólo es una de numerosa glicoformas observadas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en esta memoria tienen una actividad de ADCC al
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menos dos veces superior a la actividad de ADCC de anticuerpos derivados del cultivo de células epiteliales no mamarias. En otras realizaciones, la glicosilación de los anticuerpos es modificada por los métodos proporcionados, y la actividad de ADCC de los anticuerpos modificados es al menos dos veces superior a la actividad de ADCC de la versión no modificada del mismo anticuerpo. En algunas realizaciones, los anticuerpos tienen al menos una actividad de ADCC 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ó 30 veces superior. Los anticuerpos proporcionados se obtienen a partir de la expresión en células epiteliales mamarias de mamíferos. A anticuerpos de este tipo también se les alude en esta memoria como anticuerpos derivados de células epiteliales mamarias. En algunas realizaciones, los anticuerpos se obtienen de la expresión en la leche de un animal transgénico no humano. A anticuerpos de este tipo se les alude también en esta memoria como “anticuerpos derivados de la leche”. Tal como se utiliza en esta memoria, “transgénica” se refiere a una célula que incluye una molécula de ácido nucleico que ha sido insertada artificialmente en una célula o en un antecesor de la misma, y se convierte en parte del genoma del animal que se desarrolla a partir de esa célula. El término se utiliza también con referencia a un animal que ha tenido una molécula de ácido nucleico que ha sido insertada artificialmente en sus células o genoma.
Generalmente, en algunas realizaciones, la glicosilación exhibe un modelo de glicosilación con elevado contenido en manosa. Tal como se utiliza en esta memoria, un “modelo de glicosilación con alto contenido en manosa” pretende aludir a un anticuerpo que contiene al menos una oligomanosa o una composición de anticuerpos en donde al menos el 30% de los anticuerpos contiene al menos una oligomanosa. En algunas realizaciones, al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de los hidratos de carbono de los anticuerpos son oligomanosa. En algunas realizaciones, al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de los hidratos de carbono de los anticuerpos son oligomanosa no fucosilada. En otras realizaciones, menos del 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% o menos de los hidratos de carbono de los anticuerpos contienen fucosa. Todavía en otras realizaciones, los anticuerpos son de bajo contenido en fucosa y de alto contenido en oligomanosa. Por lo tanto, en realizaciones adicionales, al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% o más de los hidratos de carbono de los anticuerpos son oligomanosa y menos del 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o 5% de los hidratos de carbono de los anticuerpos contienen fucosa. Por lo tanto, todavía en una realización adicional, al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% o más de los hidratos de carbono de los anticuerpos son oligomanosa no fucosilada y menos del 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o 5% de los hidratos de carbono de los anticuerpos contienen fucosa. Una realización de la invención pertenece a anticuerpos con actividad de ADCC incrementada que no tienen un azúcar 1,6-fucosa en la cadena pesada. En una realización, la unión de la región Fc de los anticuerpos al receptor FcγRIII encontrado en monocitos, macrófagos y células asesinas naturales es potenciada si el anticuerpo carece de la fucosa en el núcleo que se encuentra fijada al sitio de glicosilación Asn297 en la región Fc (p. ej. una fucosa enlazada a la base de la estructura biantenaria).
Otros anticuerpos con modelos de glicosilación específicos se describen en esta memoria en los Ejemplos. Tal como se utiliza en esta memoria, cuando se comentan composiciones de anticuerpos, las composiciones pueden ser homogéneas o heterogéneas en la glicosilación.
Los anticuerpos se pueden seleccionar en cuanto a su capacidad de unirse a receptores u otras proteínas tales como las implicadas en un proceso patológico y/o de ADCC. Los anticuerpos se pueden dirigir a cualquier marcador celular en el que la provisión de un anticuerpo dirigido al mismo y que tenga actividad de ADCC proporcionaría un beneficio terapéutico. Los anticuerpos incluyen los que pueden unir antígenos diana tales como marcadores de células tumorales. Ejemplos de marcadores de células y enfermedades a título de ejemplo contemplados en esta memoria incluyen CD3, CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD32B, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD59, CD74, CD80, CD126, CD138, CD137 o GPIIbIIIa. En algunas realizaciones, los anticuerpos se pueden dirigir contra HM1.24, HLA-DR, MUC1, tenascina, PIGF, VEGF, un oncogen, un producto de oncogen, un antígeno de necrosis, antígeno 17-A1, IL-2, T101, TAC, IL-6, TRAIL-R1, gangliósido GD3 o TRAIL-R2. Otras dianas incluyen: anticuerpos anti-CD3 (p. ej. linfoma no Hodgkin; enfermedad autoinmune -SLE), anticuerpos anti-CD16 (p. ej. FcRIII), anticuerpos anti-CD19
(p. ej. linfoma no Hodgkin), anti-CD20, anti-CD32B (p. ej. FcRIIB y alergia), anticuerpos anti-CD30 (p. ej. enfermedad de Hodgkin), anti-GPIIbIIIa (p ej. trombosis), anti-TNF-α (p. ej artritis reumatoide y enfermedad de Crohn), anticuerpos anti-TEM para marcadores endoteliales de tumores (p. ej. para el control de la angiogénesis – anticáncer). Una vez unidos a marcadores de células tumorales, los anticuerpos de la invención pueden recluir monocitos, macrófagos y células asesinas naturales para atacar a las células tumorales. Por lo tanto, los anticuerpos con ADCC mejorada pueden considerarse inmunomoduladores que pueden ser eficaces en la contracción de tumores sólidos y en la prevención de su recurrencia.
Amplios estudios demostraron que la estimulación de CD137 por parte de su ligando natural o por parte de anticuerpos agonistas potenciaba una respuesta anti-tumor que resultaba en la regresión de tumores en ratón establecidos en diversos modelos. CD137 (también denominada 4-1BB) es una glicoproteína de la membrana que se expresa en varios tipos de células linfoides. Se ha informado que un anticuerpo monoclonal agonista contra
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En algunas realizaciones, la construcción que codifica el anticuerpo (o polipéptido de fusión a anticuerpo) deseado es impulsada por al menos un promotor de beta-caseína. En otras realizaciones, el mamífero transgénico no humano es un ungulado. Todavía en otras realizaciones, el mamífero transgénico no humano es una cabra.
En algunas realizaciones, los anticuerpos producidos por el mamífero transgénico se producen a un nivel de al menos 1 gramo por litro de leche producida.
Animales transgénicos, capaces de una expresión de anticuerpos recombinantes, también se pueden generar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (véase, p. ej. la patente de EE.UU. nº 5.945.577). Animales adecuados para la expresión transgénica incluyen, pero no se limitan a cabras, ovejas, bisontes, camellos, vacas, cerdos, conejos, búfalos, caballos, ratas, ratones o llamas. Animales adecuados incluyen también ganado bovino, caprino, ovino y porcino, los cuales se refieren a diversas especies de vacas, cabras, ovejas y cerdos (o cerdas), respectivamente. Animales adecuados incluyen también ungulados. Tal como se utiliza en esta memoria, “ungulado” es o se refiere a un mamífero cuadrúpedo, típicamente herbívoro, con pezuñas que incluye, sin limitación ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno y caballos. En una realización, los animales se generan cotransfectando células primarias con construcciones separadas que contienen las cadenas pesada y ligera. Estas células se utilizan luego para la transferencia nuclear. Alternativamente, si se utilizó micro-inyección para generar los animales transgénicos, las construcciones se co-inyectan. Si se necesitaran realizar alteraciones a los niveles de glicosilación, se puede utilizar en una realización, la mutagénesis dirigida al sitio.
La clonación resultará en una multiplicidad de animales transgénicos – cada uno de ellos capaz de producir un anticuerpo u otra construcción de gen de interés. Los métodos de producción incluyen el uso de los animales clonados y las crías de esos animales. En algunas realizaciones, los animales clonados son ganado caprino, bovino o ratones. La clonación abarca también la transferencia nuclear de fetos, transferencia nuclear, trasplante de tejidos y órganos y la creación de crías quiméricas.
Una etapa del proceso de clonación comprende transferir el genoma de una célula que contiene el transgen de interés a un oocito enucleado. Tal como se utiliza en esta memoria, “transgen” se refiere a cualquier trozo de una molécula de ácido nucleico que está insertado artificialmente en una célula o un antecesor de la misma y que se convierte en parte del genoma de un animal que se desarrolla a partir de esa célula. Un transgen de este tipo puede incluir un gen que es parcial o enteramente exógeno (es decir, extraño) al animal transgénico, o puede representar un gen que tenga identidad con un gen endógeno del animal.
Fuentes de mamíferos adecuadas para oocitos incluyen cabras, ovejas, vacas, cerdos, conejos, cobayas, ratones, hámsteres, ratas, primates no humanos, etc. Preferiblemente, los oocitos se obtienen de ungulados, y lo más preferiblemente de cabras o ganado vacuno. Métodos para el aislamiento de oocitos son bien conocidos en la técnica. Esencialmente, el proceso comprende aislar oocitos de los ovarios o del tracto reproductor de un mamífero, p. ej. una cabra. Una fuente fácilmente disponible de oocitos de ungulados es de animales hembras inducidos hormonalmente. Para el uso con éxito de técnicas tales como ingeniería genética, transferencia nuclear y clonación, los oocitos pueden ser preferiblemente madurados in vivo antes de que estas células se puedan utilizar como células receptoras para la transferencia nuclear y antes de que sean fertilizadas por la célula espermática para desarrollarse en un embrión. Oocitos de metafase II, que han sido madurados in vivo se han utilizado con éxito en técnicas de transferencia nuclear. Esencialmente, oocitos de metafase II maduros se recogen quirúrgicamente de animales no super-ovulados o super-ovulados varias horas después del comienzo del celo o después de la inyección de gonadotropina coriónica humana (hCG – siglas en inglés) o una hormona similar.
Una de las herramientas utilizadas para predecir la cantidad y calidad de la proteína recombinante expresada en la glándula mamaria es través de la inducción de la lactancia (Ebert KM, 1994). La lactancia inducida permite la expresión y el análisis de proteínas procedentes de la fase temprana de la producción transgénica más que de la primera lactancia natural que resulta de la preñez, que es al menos de un año más tarde. La inducción de la lactancia se puede realizar ya sea hormonal o manualmente. Es posible que diversos procesos de lactancia, especialmente la lactancia inducida hormonalmente, puedan afectar a la regulación transcripcional de glicosiltransferasas en glándulas mamarias. Oligosacáridos N-enlazados procedentes de varias muestras de lactancia de animales clonados eran similares excepto por el contenido de NeuGc. Los hidratos de carbono en la producción de anticuerpos transgénicos a partir de la lactancia natural contenían mayores cantidades de NeuGc que de otros procesos de lactancia, incluso a pesar de que era equiparable el contenido en ácido siálico global en muestras de diferentes lactancias. Igualmente, parece ser que las proteínas transgénicas producidas en la leche de cabras están también constituidas por una mezcla compleja de especies de proteína individuales (Zhou, 2005).
Fracciones de IgG purificadas con proteína A, aisladas de muestras de leche agrupadas de cada una de las líneas se analizaron in vitro para caracterizar la especificidad de unión a anticuerpos y la afinidad y la mejora dependiente de la dosis de la proliferación de células T. En una realización, preparados quiméricos glicosilados y aglicosilados
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derivados de la leche con respecto al mAb GW original.
Se estableció la producción de ratones transgénicos sanos con características de crecimiento y reproductoras normales y niveles razonables (> 1 mg/ml) de anticuerpo bioactivo. La producción en ratones con una construcción dada puede ser un precursor para trabajar en una producción a gran escala en especies tales como ganado caprino o bovino. La producción y caracterización de anti-CD137 quimérico condujo al ensayo de uno o más de estos preparados en un modelo de ratón para demostrar la actividad anti-tumoral in vivo. Las construcciones de anticuerpo quiméricas tanto glicosiladas como aglicosiladas se utilizaron después para generar cabras transgénicas para que expresaran anti-CD137 en su leche.
La capacidad de modificar los genomas de los animales a través de una tecnología transgénica ofrece nuevas alternativas al fabricante de proteínas recombinantes con modelos de glicosilación modificados. La producción de productos farmacéuticos recombinantes humanos en la leche de animales de granja transgénicos resuelve muchos de los problemas asociados con biorreactores microbianos (p. ej. carencia de modificaciones post-traducción, plegamiento inadecuado de proteínas, elevados costes de purificación) o biorreactores de células animales (p. ej. elevados costes de capital, medios de cultivo costosos, bajo rendimiento). La presente invención incluye, en algunas realizaciones, el uso de la producción transgénica de anticuerpos en la leche de animales transgénicos homozigóticos para un gen deseado que optimiza el modelo de glicosilación de esas moléculas.
De acuerdo con otra realización, el modelo de glicosilación de una molécula diana puede modificarse, por ejemplo, a través de la alteración en la alimentación a un mamífero no humano (Kerr et al., 2003).
Se describen además métodos para producir un anticuerpo, que comprenden recoger el anticuerpo de la leche de un mamífero transgénico no humano, tratado mediante ingeniería genética para expresar el anticuerpo en su leche, y determinar la actividad de ADCC del anticuerpo. En algunas realizaciones, la actividad de ADCC se compara con la actividad de ADCC de anticuerpos expresados en el cultivo de células. En otras realizaciones el anticuerpo se recoge de células epiteliales mamarias en cultivo tratadas mediante ingeniería genética para expresar el anticuerpo, y se determina la actividad de ADCC del anticuerpo. En algunas realizaciones, la actividad de ADCC se compara con la actividad de ADCC de anticuerpos expresados en cultivo de células. En algunas realizaciones, las células del cultivo de células son células epiteliales no mamarias. Se proporcionan a continuación ensayos para evaluar la actividad de ADCC en los Ejemplos y también se conocen en la técnica.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión “sustancialmente puras” significa que las proteínas están esencialmente exentas de otras sustancias en una medida práctica y apropiada para su uso pretendido. En particular, las proteínas son lo suficientemente puras y están lo suficientemente exentas de otros constituyentes biológicos de sus células hospedantes con el fin de ser útiles, por ejemplo, en la secuenciación de las proteínas, o para producir preparados farmacéuticos. En algunas realizaciones, por lo tanto, los anticuerpos son sustancialmente puros.
Tal como se utiliza en esta memoria con respecto a polipéptidos, “aislado” significa separado de su entorno natural y presentes en una cantidad suficiente para permitir su identificación o uso. Aislado, cuando se refiere a una proteína o polipéptido, significa, por ejemplo: (i) producido de forma selectiva mediante clonación de expresión o
(ii) purificado tal como mediante cromatografía o electroforesis. Proteínas o polipéptidos aislados pueden, pero no necesitan ser sustancialmente puros. Debido a que un polipéptido aislado se puede mezclar con un vehículo farmacéuticamente aceptable en un preparado farmacéutico, el polipéptido puede comprender sólo un pequeño porcentaje en peso del preparado. El polipéptido está, no obstante, aislado en el sentido de que ha sido separado de las sustancias con las que puede estar asociado en sistemas vivos, es decir, aislado de otras proteínas. En algunas realizaciones, por lo tanto, los anticuerpos están aislados.
Los anticuerpos exhiben una actividad de ADCC mejorada, lo cual es un factor importante en el uso con éxito de anticuerpos monoclonales en la terapia. La unión simultánea de la región constante o Fc de los anticuerpos de la invención puede inducir una respuesta biológica. Una de estas respuestas es la inducción de la apoptosis celular en la célula diana o ADCC. La ADCC funciona a través de la unión de la región Fc a los receptores gamma de Fc que están situados sobre la superficie de monocitos, macrófagos y células asesinas naturales. Tras la unión al receptor, estas células son activadas y liberan citoquinas y radicales libres oxidantes que pueden matar a la célula diana (la célula que contenía la diana antígeno).
Por lo tanto, en un aspecto se describen preparados de anticuerpos con actividad de ADCC incrementada y, por lo tanto, propiedades terapéuticas mejoradas. Las composiciones proporcionadas se pueden utilizar para tratar a un sujeto en el que la actividad de ADCC conferiría al menos algún beneficio médico. Por lo tanto, la composición proporcionada puede utilizarse para tratar a un sujeto con una enfermedad. En algunas realizaciones, los anticuerpos se pueden utilizar para tratar a un sujeto mejorando la actividad de ADCC en un sujeto a través de la
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tipo permiten que los compuestos de la invención sean formulados en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, soluciones acuosas, suspensiones y similares, para la ingesta por vía oral por parte de un sujeto a tratar. Preparados farmacéuticos para uso oral se pueden obtener en forma de un excipiente sólido, moliendo opcionalmente una mezcla resultante y tratando la mezcla de gránulos, después de añadir compuestos auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluidas lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparados de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, fécula de patata, gelatina, goma tragacanto, metil-celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal de los mismos tal como alginato de sodio. Opcionalmente, las formulaciones orales se pueden también formular en disolución salina o tampones, es decir EDTA para neutralizar las condiciones ácidas internas o se pueden administrar sin soporte alguno.
También se contemplan específicamente formas de dosificación orales de los anticuerpos. El componente o los componentes pueden modificarse químicamente de modo que sea eficaz el suministro por vía oral de los anticuerpos. Generalmente, la modificación química contemplada es la fijación de al menos un resto a los anticuerpos, en que dicho resto permite (a) la inhibición de la proteólisis; y (b) la absorción en el torrente sanguíneo procedente del estómago o del intestino. También se desea el incremento en la estabilidad global de los anticuerpos y el incremento en el tiempo de circulación en el cuerpo. Ejemplos de restos de este tipo incluyen: polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetil-celulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico) polinvinil-pirrolidona y poliprolina. Abuchowski y Davis, 1981, “Soluble Polymer-Enzyme Adducts” en: Enzymes as Drugs, Hocenberg y Roberts, comps., Wiley-Interscience, Nueva York, NY, págs. 367-383; Newmark et al., 1982,
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Para las composiciones, la localización de liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el duodeno, el yeyuno o el íleon) o el intestino grueso. Un experto en la técnica tiene formulaciones disponibles que no se disolverán en el estómago pero que liberarán el material en el duodeno o en otra parte del intestino. Preferiblemente, la liberación evitará los efectos perjudiciales del entorno del estómago, ya sea mediante protección del anticuerpo o mediante liberación del material biológicamente activo más allá del entorno del estómago tal como en el intestino.
Para asegurar una resistencia gástrica completa, es esencial un revestimiento impermeable a al menos pH 5,0. Ejemplos de los ingredientes inertes más comunes que se utilizan como revestimientos entéricos son acetatotrimelitato de celulosa (CAT – siglas en inglés), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP – siglas en inglés), HPMCP 50, HPMCP 55, poli(acetato-ftalato de vinilo) (PVAP – siglas en inglés), Eudragit L30D, Aquateric, acetatoftalato de celulosa (CAP – siglas en inglés), Eudragit L, Eudragit S y goma laca. Estos revestimientos se pueden utilizar en forma de películas mixtas.
Un revestimiento o mezcla de revestimientos también se puede utilizar en comprimidos que no estén destinados para la protección frente al estómago. Éstos pueden incluir revestimientos de azúcares o revestimientos que hacen al comprimido más fácil de tragar. Las cápsulas pueden consistir en una envuelta dura (tal como gelatina) para el suministro del producto terapéutico seco, es decir, polvo; para formas líquidas se puede utilizar una envuelta de gelatina blanda. El material de la envuelta de sellos podría ser almidón espeso o incluso papel comestible. Para píldoras, pastillas, comprimidos moldeados o triturados de comprimidos, se pueden utilizar técnicas de formación de masa en húmedo.
El agente terapéutico puede estar incluido en la formulación en forma de materiales en múltiples partículas finas en forma de gránulos o nódulos de un tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm. La formulación del material para la administración de la cápsula también podría ser en forma de un polvo, tacos ligeramente comprimidos o incluso en forma de comprimidos. El agente terapéutico podría prepararse por compresión.
Colorantes y agentes saboreantes pueden estar todos ellos incluidos. Por ejemplo, las composiciones se pueden formular (tal como mediante encapsulación en liposomas o microesferas) y luego pueden estar adicionalmente contenidas dentro de un producto comestible tal como una bebida refrigerada que contiene colorantes y agentes saboreantes.
Se puede diluir o incrementar el volumen del agente terapéutico con un material inerte. Los diluyentes podrían incluir hidratos de carbono, especialmente manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. También se pueden utilizar determinadas sales inorgánicas en calidad de cargas, incluidos trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes comercialmente disponibles son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.
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