CN105592695B - 具有人源化信号调节蛋白基因的非人动物 - Google Patents

Abstract

提供基因改造的非人动物以及制备和使用它们的方法和组合物，其中基因改造包含内源信号调节蛋白基因的人源化，特别是SIRPα基因的人源化。描述了基因改造的小鼠，包括从内源SIRPα基因座表达人SIRPα蛋白或人源化SIRPα蛋白的小鼠。

Description

具有人源化信号调节蛋白基因的非人动物

对相关申请的交叉引用

本申请要求2013年9月23日提交的美国临时申请No.61/881261的利益，在此通过引用将它们的全部公开内容合并入本文。

背景

免疫系统由几种不同的细胞类型组成，它们涉及多个高度调节的过程，并且它们一起产生免疫反应，所述免疫反应有效消除外来蛋白。进一步，发现这些相同的免疫细胞具有自我意识的属性，其，特别是通过调节膜蛋白，调节细胞间相互作用。这种通讯对于这种生物体的存活是非常重要的，因为这些相同的蛋白被认为是移入物移植的重要决定因素。但是，还没有体内系统来研究清楚人免疫细胞间相互作用及其调节的分子方面。这种系统为人造血和免疫系统相关功能的体内测定、新的疗法和疫苗的鉴别提供了来源。

发明简述

本发明包括认识到构建非人动物以允许改进人造血干细胞的移入是合乎需要的。本发明还包括认识到具有人源化SIRPα基因和/或另外表达、含有、或产生人或人源化SIRPα的非人动物是合乎需要的，例如用于人造血干细胞的移入。

在一些实施方案中，本发明的非人动物表达SIRPα多肽，所述SIRPα多肽包含人SIRPα蛋白的胞外部分和小鼠SIRPα蛋白的胞内部分。

在一些实施方案中，人SIRPα蛋白的胞外部分包含相应于SEQ ID NO:4所示的人SIRPα蛋白的残基28-362的氨基酸。

在一些实施方案中，人SIRPα蛋白的胞外部分与表3中所示的人SIRPα蛋白的相应胞外部分具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性百分比。在一些实施方案中，人SIRPα蛋白的胞外部分与表3中所示的人SIRPα蛋白的相应胞外部分具有100％的同一性(或相同)。

在一些实施方案中，本发明的非人动物也不表达内源非人SIRPα蛋白。在一些实施方案中，非人动物是啮齿动物并且也不表达内源啮齿动物SIRPα蛋白。在一些实施方案中，非人动物是小鼠并且也不表达具有表3所示序列的内源小鼠SIRPα蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供包含SIRPα基因的非人动物，所述SIRPα基因包含与非人SIRPα启动子可操作连接的人SIRPα基因的外显子2、3和4。

在一些实施方案中，本发明的非人动物的SIRPα基因包含非人SIRPα基因的外显子1、5、6、7和8。

在不同的实施方案中，本发明的非人动物是啮齿动物。在一些特定的实施方案中，本发明的啮齿动物选自小鼠或大鼠。

在一些实施方案中，本发明提供由本文所述的非人动物的基因编码的SIRPα多肽。

在一些实施方案中，本发明提供从本文所述的非人动物分离的细胞或组织。在一些实施方案中，细胞选自淋巴细胞(例如B细胞或T细胞)、骨髓细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、骨髓树突细胞和肥大细胞)和神经元。在一些实施方案中，组织选自脂肪、膀胱、脑、乳房、骨髓、眼、心、肠、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、胰腺、血浆、血清、皮肤、脾、胃、胸腺、睾丸、卵和/或它们的组合。

在一些实施方案中，本发明提供分离的小鼠细胞或组织，其基因组包括SIRPα基因，所述SIRPα基因编码与小鼠SIRPα蛋白的胞内部分连接的人SIRPα蛋白的的胞外部分。在一些实施方案中，本发明的SIRPα基因与小鼠SIRPα启动子可操作地连接。在一些实施方案中，本发明的SIRPα基因包含人SIRPα基因的外显子2、3和4。

在一些实施方案中，本发明提供非人胚胎干(ES)细胞，其基因组包含本文所述的SIRPα基因。在一些实施方案中，ES细胞包含与非人SIRPα启动子可操作连接的人SIRPα基因的外显子2、3和4。在一些特定的实施方案中，ES细胞是啮齿动物ES细胞。在一些实施方案中，本发明的非人胚胎干细胞是小鼠或大鼠胚胎干细胞。

在一些实施方案中，本发明提供非人胚胎，所述非人胚胎含有包含本文所述的SIRPα基因的非人胚胎干细胞，由包含本文所述的SIRPα基因的非人胚胎干细胞制备，由其获得或由其产生。在一些实施方案中，本发明的非人胚胎是啮齿动物胚胎。在一些实施方案中，本文所述的啮齿动物胚胎是小鼠或大鼠胚胎。

在一些实施方案中，本发明提供制备表达来自内源SIRPα基因座的SIRPα蛋白的非人动物的方法，其中SIRPα蛋白包含人序列，所述方法包括用包含编码全部或部分人SIRPα蛋白的核苷酸序列的基因组片段靶向非人ES细胞中的内源SIRPα基因座；获得包含内源SIRPα基因座的改造的非人ES细胞，所述内源SIRPα基因座包含所述人序列；以及，使用所述改造的ES细胞产生非人动物。

在一些实施方案中，所述核苷酸序列包含人SIRPα基因的外显子2、3和4。在一些实施方案中，所述核苷酸序列包含人SIRPα基因的外显子2、3和4，所述人SIRPα基因具有与表3中所示的人SIRPα基因至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列。

在一些实施方案中，所述核苷酸序列编码人SIRPα蛋白的氨基酸残基28-362。在一些实施方案中，所述核苷酸序列编码人SIRPα蛋白的氨基酸残基28-362，所述人SIRPα蛋白具有与表3中所示的人SIRPα蛋白至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列。

在一些实施方案中，本发明提供了提供小鼠的方法，该小鼠的基因组包括编码与小鼠SIRPα蛋白的胞内部分连接的人SIRPα蛋白的胞外部分的SIRPα基因，所述方法包括改造小鼠的基因组，使其包含编码与小鼠SIRPα蛋白的胞内部分连接的人SIRPα蛋白的胞外部分的SIRPα基因，由此提供所述小鼠。在一些实施方案中，SIRPα基因是本文所述的SIRPα基因。在一些实施方案中，SIRPα基因包含人SIRPα基因的外显子2、3和4。

在一些实施方案中，本发明提供将人细胞移入到小鼠中的方法，所述方法包括以下步骤：提供小鼠，该小鼠的基因组包含编码与小鼠SIRPα蛋白的胞内部分连接的人SIRPα蛋白的胞外部分的SIRPα基因；并将一个或多个人细胞移入到小鼠中。在一些特定的实施方案中，所述方法进一步包括测定一个或多个人细胞在小鼠中的移入的步骤。在一些特定的实施方案中，测定步骤包括将一个或多个人细胞的移入与在一个或多个野生型小鼠中的移入相比较。在一些特定的实施方案中，测定的步骤包括将一个或多个人细胞的移入与在一个或多个其基因组不包含SIRPα基因的小鼠中的移入相比较，所述SIRPα基因编码与小鼠SIRPα蛋白的胞内部分连接的人SIRPα蛋白的胞外部分。

在一些实施方案中，人细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，人细胞被静脉内移植。在一些实施方案中，人细胞被腹膜内移植。在一些实施方案中，人细胞被皮下移植。

在一些实施方案中，本发明提供一种方法，其包括以下步骤：提供一个或多个细胞，所述细胞的基因组包括编码与小鼠SIRPα蛋白的胞内部分连接的人SIRPα蛋白的胞外部分的SIRPα基因；将所述一个或多个细胞与标记的底物温育；并测量所述一个或多个细胞对标记的底物的吞噬作用。在一些实施方案中，细胞是小鼠细胞。

在一些实施方案中，底物是荧光标记的。在一些实施方案中，底物用抗体标记。在一些实施方案中，底物是一个或多个红细胞。在一些实施方案中，底物是一个或多个细菌细胞。

在一些实施方案中，本发明提供一种方法，其包括以下步骤：提供小鼠，该小鼠的基因组包括编码与小鼠SIRPα蛋白的胞内部分连接的人SIRPα蛋白的胞外部分的SIRPα基因；将该小鼠暴露于抗原；并测量小鼠的一个或多个细胞对抗原的吞噬作用。在一些实施方案中，暴露的步骤包括将小鼠暴露于荧光标记的抗原。在一些实施方案中，暴露的步骤包括将小鼠暴露于一个或多个包含抗原的细胞。在一些实施方案中，暴露的步骤包括将小鼠暴露于一个或多个包含抗原的人细胞。在一些实施方案中，暴露的步骤包括将小鼠暴露于一个或多个包含抗原的细菌细胞。

在不同的实施方案中，本发明的SIRPα基因包含人SIRPα基因的外显子2、3和4。在不同的实施方案中，本发明的人SIRPα蛋白的胞外部分包含相应于表3所示的人SIRPα蛋白的残基28-362的氨基酸。在不同的实施方案中，本发明的SIRPα基因与小鼠SIRPα启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，本发明提供由本发明所述的方法可获得的非人动物。在一些特定的实施方案中，本发明的非人动物不以可检测到的水平表达内源SIRPα蛋白的胞外部分。

在一些实施方案中，本发明提供鉴别或验证药物或疫苗的方法，所述方法包括将药物或疫苗递送到本文所述的非人动物中，并监测对该药物或疫苗的一种或多种免疫反应、该药物或疫苗的安全性状况或它们对疾病或病况的效果的步骤。在一些实施方案中，监测安全性状况包括确定非人动物是否由于递送该药物或疫苗而表现出副作用或不良反应。在一些实施方案中，副作用或不良反应选自发病、死亡、体重改变，一种或多种酶的水平(例如肝)的改变、一个或多个器官的重量的改变、功能丧失(例如感觉、运动、器官等)、对一种或多种疾病的易感性增加、对非人动物基因组的改变、食物消耗的增加或减少以及一种或多种疾病的并发症。

在一些实施方案中，本发明提供本发明的非人动物在开发用于医药(例如用作药剂)的药物或疫苗中的用途，

在一些实施方案中，本发明提供本文所述的非人动物用于评价靶向人细胞的治疗药物的效力的用途。在不同的实施方案中，给本发明的非人动物移植人细胞，并给动物施用靶向这种人细胞的候选药物。通过在施用药物之后监测非人动物中的人细胞，确定药物的效力。

在不同的实施方案中，本发明的非人动物是啮齿动物，优选是小鼠或大鼠。

如本申请中所使用的，术语“约(about)”和“大致(approximately)”等同使用。本申请中使用的用或不用约/大致修饰的任何数值都覆盖了本领域普通技术人员所理解的任何正常波动。

在下述的详细描述中，本发明的其它特征、目的和优点是显而易见的。但是，应当理解，虽然详细描述表明了本发明的实施方案，但它仅仅是以举例说明的方式给出的，并非是限制。根据详细描述，本发明范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

附图简述

本文包括的附图仅仅是为了举例说明的目的，而非限制。

图1显示内源鼠SIRPα基因(上部)的简图，但并非成比例的，其中每一个外显子被编号。人源化内源SIRPα基因(下部)显示含有人SIRPα基因的外显子2-4和新霉素选择盒(Ub-Neo)，其侧翼具有位点特异性重组酶识别位点(例如loxP)。人SIRPα基因的外显子2-4的靶向插入获得表达人源化SIRPα基因的内源基因，所述人源化SIRPα基因具有相应于人SIRPα蛋白的胞外域。

图2显示野生型和人源化SIRPα基因杂合小鼠的SIRPα表达的覆盖(overlay)。

图3显示移入CD34+细胞的不同小鼠株中CD45⁺细胞的百分比。

图4显示移入CD34⁺细胞的不同小鼠株中CD45⁺CD3⁺细胞的百分比。

图5显示移入CD34⁺细胞的不同小鼠株中CD45⁺CD19⁺细胞的百分比。

图6显示在移入hCD34+的SIRPαBRG小鼠中，Ab 1以剂量依赖的方式抑制Raji肿瘤的生长。在肿瘤植入后第3、6、9、13、16、20、23、27、30和34天测量Raji肿瘤体积。给出了个体动物的数据(A-D图)。在第0天给移入hCD34+的SIRPαBRG小鼠皮下施用2x10⁶个Raji肿瘤细胞。对照组所接受的没有抗体(载体对照)(A图)。对于实验组，在第0天对小鼠通过腹膜内给药进行治疗，给予0.4mg/kg的非结合性对照Ab(对照Ab5)(B图)，或0.4mg/kg(C图)或0.04mg/kg(D图)的Ab 1，然后在研究期限内每周两次给药。所有个体测试组的综合数据显示在图7中。

图7显示在移入hCD34+的SIRPαBRG小鼠中，与对照相比，Ab 1显著抑制Raji肿瘤的生长。数据表示来自每组n＝4-5只小鼠的综合数据，如图6所示。数据用平均值(SEM)表示，并使用方差分析(ANOVA)和事后检验进行分析，以检查显著效果(用于两因素方差分析的Tukey's检验)。载体对照组、对照Ab 5组和Ab 1 0.4mg/kg组中的一只小鼠由于早期死亡而被排除在该综合图之外，以通过双因素ANOVA分析数据。

图8显示在移入hCD34+的SIRPαBRG小鼠中，Ab 1不影响体重。在肿瘤植入后第3、6、9、13、16、20、23、27、30和34天测量体重。测量个体动物的数据(A-D图)。在第0天给移入hCD34+的SIRPαBRG小鼠皮下施用2x10⁶个Raji肿瘤细胞。对照组所接受的没有抗体(载体对照)(A图)。对于实验组，在第0天对小鼠通过腹膜内给药(IP dose)进行处理，给予0.4mg/kg的IgG1非结合性对照Ab 5(B图)，或0.4mg/kg(C图)的Ab 1或0.04mg/kg(D图)的Ab 1，然后在研究期限内每周两次给药。

定义

本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅仅是为了描述具体实施方案，不是限制性的，因为本发明的范围由权利要求定义。

除非另有定义，本文使用的所有术语和短语包括该术语和短语在本领域中所具有的含义，除非明确给出相反说明或者从使用该术语和短语的上下文中明确表现出是相反含义。虽然在实施或测试本发明时可以使用与本文所述类似或等同的任何方法和材料，现在描述具体的方法和材料。提及的所有出版物在此通过引用的方式合并入本文。

在本文中应用在感兴趣的一个或多个值上的术语“大致”，指与所述参考值类似的值。在特定的实施方案中，术语“大致”或“约”指落入所述参考值任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的值的范围(除了这些数字会超过可能值的100％的情况)。

本文中所使用的术语“生物活性”指在体外或体内(例如在生物体中)，在生物系统中具有活性的任何试剂的特性。例如，当在生物体中时，在该生物体中具有生物学作用的试剂被视为是有生物活性的。在特定的实施方案中，如果蛋白质或多肽具有生物学活性，该蛋白或多肽的具有至少一种该蛋白或多肽的生物活性的部分通常被称为“生物活性”部分。

术语“可比的”，如本文中所使用的，指两种或更多种试剂、实体、情况、条件设置等，它们可以彼此不相同，但是足够相似，以允许在它们之间进行比较，以使得可以根据所观察到的差异或相似性合理地得到结论。本领域技术人员应当理解，结合上下文，对于两种或更多种试剂、实体、情况、条件设置等来说，在任何给定的环境中需要何种相同程度才能被视为是可比的。

本文中所使用的描述保守氨基酸取代的术语“保守”指氨基酸残基被另一个具有有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基团的氨基酸残基取代。通常，保守氨基酸取代不会在实质上改变蛋白质的感兴趣的功能性质，例如受体与配体结合的能力。具有有类似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括脂肪族侧链例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族羟基侧链例如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链例如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族侧链例如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链例如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫侧链例如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代组包括，例如，缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸，苯丙氨酸/酪氨酸，赖氨酸/精氨酸，丙氨酸/缬氨酸，谷氨酸盐/天冬氨酸盐，和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方案中，保守氨基酸取代可以是用丙氨酸取代蛋白质中的任何天然氨基酸，如，例如丙氨酸扫描突变中所用的。在一些实施方案中，进行保守取代使其在Gonnet et al.(1992)Exhaustive Matching of the EntireProtein Sequence Database,Science 256:1443-45中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值，通过引用将该文献合并入本文。在一些实施方案中，取代是中度保守取代，其中该取代在PAM250对数似然矩阵中具有非负值。

本文中所使用的术语“破裂”(disruption)指与DNA分子(例如与内源同源序列例如基因或基因座)同源重组的结果。在一些实施方案中，破裂可以实现或代表插入、缺失、取代、替换、错义突变或DNA序列移框，或者它们的组合。插入可以包括插入整个基因或基因的片段，例如外显子，其可以来源于除内源序列之外的其它来源。在一些实施方案中，破裂可以提高基因或基因产物的(例如由基因编码的蛋白质的)表达和/或活性。在一些实施方案中，破裂可以降低基因或基因产物的表达和/或活性。在一些实施方案中，破裂可以改变基因的或编码的基因产物的序列(例如编码的蛋白质)。在一些实施方案中，破裂可以截短基因或编码的基因产物(例如编码的蛋白质)或使其片段化。在一些实施方案中，破裂可以使基因或编码的基因产物延长；在一些这样的实施方案中，破裂可以实现融合蛋白的组装。在一些实施方案中，破裂可以影响基因或基因产物的水平但不影响其活性。在一些实施方案中，破裂可以影响基因或基因产物的活性但不影响其水平。在一些实施方案中，破裂可以对于基因或基因产物的水平没有显著影响。在一些实施方案中，破裂可以对于基因或基因产物的活性没有显著影响。在一些实施方案中，破裂可以对于基因或基因产物的水平或活性都没有显著影响。

本文中所使用的术语“内源基因座”或“内源基因”指在引入本文所述的破裂、缺失、替换、改变或修饰之前，在亲本或参考生物体中发现的基因座。在一些实施方案中，内源基因座具有天然发现的序列。在一些实施方案中，内源基因座是野生型的。在一些实施方案中，参考生物体是野生型生物体。在一些实施方案中，参考生物体是工程化生物体。在一些实施方案中，参考生物体是实验室培育的生物体(无论是野生型的还是工程化的)。

短语“内源启动子”指与内源基因自然结合的启动子，例如在野生型生物体中。

本文中所使用的术语“异源”指来自于不同来源的剂或实体。例如，当用于特定细胞或生物体中存在的多肽、基因或基因产物时，该术语表示相关的多肽、基因或基因产物1)通过人为行为被工程化；2)通过人为行为(例如通过基因工程)被引入到该细胞或生物体(或它们的前身)中；和/或3)不是由相关的细胞或生物体(例如相关的细胞类型或生物体类型)天然产生的或天然存在于其中的。

术语“宿主细胞”，如本文中所使用的，指异源(例如外源)核酸或蛋白质被引入到其中的细胞。技术人员在阅读了本公开的内容之后将会理解，该术语不仅仅指特定的主体细胞，还用于指这种细胞的后代。因为在后代中由于突变或环境影响可能发生特定的改变，这种后代可以，事实上，与亲本细胞不完全相同，但是它们仍然被包括在本文中所使用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞包含原核或真核细胞。通常，宿主细胞是适合于接受和/或产生异源核酸或蛋白质的任何细胞，不管该细胞属于哪种生物。示例性的细胞包括原核生物和真核生物的细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母、裂殖酵母、巴斯德酵母、甲醇酵母等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾等)、非人动物细胞、人细胞、或细胞融合体例如杂交瘤或四源杂交瘤(quadromas)。在一些实施方案中，细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是真核的并选自下述细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI 38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和衍生自上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞包含分离的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是组织的一部分。在一些实施方案中，宿主细胞是生物体的一部分。

术语“人源化”在本文中根据它在本领域中理解的含义使用，指核酸或蛋白质，其结构(即核苷酸或氨基酸序列)包括与非人动物中天然发现的特定基因或蛋白质的结构基本相同或完全相同的部分，还包括与相关的特定非人基因或蛋白质中所发现的不同的部分，但与相应的人基因或蛋白质中发现的相应结构更为接近。在一些实施方案中，“人源化”基因编码具有基本上人多肽(例如人蛋白或其部分-例如其特征部分)那样的氨基酸序列的多肽。举一个例子，在膜受体的情况下，“人源化”基因可以编码具有胞外部分的多肽，所述胞外部分具有人胞外部分那样的氨基酸序列，而其余的序列是非人(例如小鼠)多肽的序列。在一些实施方案中，人源化基因包含人基因的DNA序列的至少一部分。在一些实施方案中，人源化基因包含完整的人基因DNA序列。在一些实施方案中，人源化蛋白包含具有人蛋白中出现的部分的序列。在一些实施方案中，人源化蛋白包含完整的人蛋白的序列，并且由相应于人基因的同源物或直系同源物的非人动物的内源基因座表达。

本文中所使用的术语“同一性”用于序列比较时指由本领域已知的多种不同算法确定的，可用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的同一性。在一些实施方案中，使用ClustalW v.1.83(slow)比对，使用10.0的开放缺口罚分和0.1的延伸缺口罚分，并使用Gonnet相似矩阵确定本文所述的同一性(MACVECTOR 10.0.2,Mac Vector Inc.,2008)。

术语“分离的”，如本文中所使用的，指已经(1)从在它最初产生时与它相结合的至少一些组分中被分离(无论是在自然环境中和/或在实验设置中)，和/或(2)人为设计、产生、制备和/或制造的这样的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以从约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的最初与它们相结合的其它组分中被分离。在一些实施方案中，分离的试剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文所使用的，如果物质基本不含其它组分，则该物质是“纯的”。在一些实施方案中，如本领域技术人员所理解的，物质在与特定的其它组分例如一种或多种载体或赋形剂(例如缓冲液、溶剂、水等)混合后，仍然可以被认为是“分离的”或者甚至是“纯的”；在这种实施方案中，计算物质的分离百分比或纯度时不包括这些载体或赋形剂。举一个例子，在一些实施方案中，当天然存在的生物聚合物例如多肽或多核苷酸，a)由于其起源或来源而不与在自然界中在其天然状态下与其一起存在的组分的一些或全部相结合；b)基本不含与自然界中产生它的物种相同的物种的其它多肽或核酸；c)从不属于自然界中产生它的物种的细胞或其它表达系统表达，或者另外与来自这些细胞或表达系统的组分相结合时，它被认为是“分离的”。因此，例如，在一些实施方案中，化学合成的或者在与天然产生它的系统不同的细胞系统中合成的多肽被认为是“分离的”多肽。替代性地或另外地，在一些实施方案中，已经过一个或多个纯化技术纯化的多肽可以被认为是“分离的”多肽，其分离的程度是它已从a)天然与之结合的；和/或b)最初产生时与之结合的其它组分中被分离。

本文所使用的短语“非人动物”指非人的任何有脊椎生物体。在一些实施方案中，非人动物是钩虫(acyclostome)、硬骨鱼、软骨鱼(例如鲨鱼或鳐鱼(ray))、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和禽类。在一些实施方案中，非人哺乳动物是灵长动物、山羊、绵羊、猪、狗、牛或啮齿动物。在一些实施方案中，非人动物是啮齿动物例如大鼠或小鼠。

本文所使用的短语“核酸”，在其最广泛的意义上，指可以被掺入到寡核苷酸链上的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是通过磷酸二酯键被掺入到或可以被掺入到寡核苷酸链上的化合物和/或物质。正如从上下文可以明确看出的，在一些实施方案中，“核酸”指单个核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包含RNA；在一些实施方案中，“核酸”是或包含DNA。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个天然核酸残基，或者由其组成。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个核酸残基类似物，或者由其组成。在一些实施方案中，核酸类似物与核酸的区别在于它不使用磷酸二酯骨架。例如，在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个“肽核酸”，或由其组成，所述“肽核酸”是本领域已知的，在骨架上具有肽键而不是磷酸二酯键，其被认为在本发明的范围之内。替代性地或者另外地，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺连接而不是磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)，或由其组成。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮尿苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、O(6)-甲基尿苷、2-硫代胞苷、甲基化碱基、嵌入性碱基和它们的组合)，或由其组成。在一些实施方案中，核酸与天然核酸中的那些相比包含一个或多个修饰的糖(例如2'-氟代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能性基因产物例如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，通过从自然来源分离，基于互补模板通过聚合来酶促合成(在体内或在体外)，在重组细胞或系统中再生产以及化学合成来制备核酸。在一些实施方案中，核酸是至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个碱基。在一些实施方案中，核酸是单链的；在一些实施方案中，核酸是双链的。在一些实施方案中，核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或与编码多肽的序列互补。在一些实施方案中，核酸具有酶促活性。

短语“可操作连接”，如本文所使用的，指并列，其中所描述的组分处于允许它们以预期的方式行使功能的关系。与编码序列“可操作连接”的控制序列以这样的方式连接，以使在与控制序列相容的条件下获得编码序列的表达。“可操作连接”序列包括与感兴趣基因相邻的表达控制序列和以反式方式作用或远距离作用以控制感兴趣基因的表达控制序列。本文所使用的术语“表达控制序列”指使与之相连的编码序列表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多聚腺苷酸化信号；使细胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增加蛋白稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白分泌的序列。这种控制序列的性质随宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，这种控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，典型地，这种表达控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”包括其存在对于表达和加工来说是必需的组分，并且还可以包括额外的组分，其存在是有利的，例如，前导序列和融合伴侣序列。

术语“多肽”，如本文所使用的，指任何氨基酸的聚合链。在一些实施方案中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有通过人为行为进行设计和/或产生的被工程化的氨基酸序列。

术语“重组”，如本文所使用的，意指通过重组手段设计、工程化、制备、表达、产生或分离的多肽(例如本文所述的信号调节蛋白)，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽，从重组的组合人多肽文库分离的多肽(Hoogenboom H.R.,(1997)TIBTech.15:62-70；Azzazy H.,and Highsmith W.E.,(2002)Clin.Biochem.35:425-445；Gavilondo J.V.,and Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29:128-145；Hoogenboom H.,and Chames P.(2000)Immunology Today 21:371-378)，从用人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如，Taylor,L.D.,et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295；Kellermann S-A.,and Green L.L.(2002)Current Opinion inBiotechnology 13:593-597；Little M.et al(2000)Immunology Today 21:364-370)或通过任何其它手段制备、表达、产生或分离的多肽，所述的其它手段包括将选定的序列元件剪接为另一种。在一些实施方案中，一个或多个这种选定的序列元件是天然存在的。在一些实施方案中，一个或多个这种选定的序列元件是计算机设计的。在一些实施方案中，一个或多个这种选定的序列元件由已知序列元件的诱变(例如在体内或在体外)产生，所述已知序列元件例如来自于天然来源或合成来源。例如，在一些实施方案中，重组多肽由存在于感兴趣的来源生物体(例如人、小鼠等)的基因组中的序列组成。在一些实施方案中，重组多肽具有由诱变(例如在体外或在体内，例如在非人动物中)产生的氨基酸序列，以使得重组多肽的氨基酸序列是可能不天然存在于非人动物体内的基因组中的序列，虽然该序列来自于非人动物体内的基因组中的多肽序列并与其有关。

本文使用的术语“替换”指这样的过程，通过该过程，存在于宿主位点(例如在基因组中)中的“被替换的”核酸序列(例如基因)从该位点上被移除，而不同的“替换”核酸位于该位置上。在一些实施方案中，被替换的核酸序列和替换核酸序列彼此是可比的，例如，它们彼此是同源的和/或含有相应的元件(例如蛋白质编码元件、调节元件等)。在一些实施方案中，被替换的核酸序列包括启动子、增强子、剪接供体位点、剪接受体位点、内含子、外显子、非翻译区(UTR)中的一个或多个；在一些实施方案中，被替换的核酸序列包括一个或多个编码序列。在一些实施方案中，替换核酸序列是被替换核酸序列的同源物。在一些实施方案中，替换核酸序列是被替换核酸序列的直系同源物。在一些实施方案中，替换核酸序列是或包含人核酸序列。在一些实施方案中，当替换核酸序列是或包含人核酸序列时，被替换的核酸序列是或包含啮齿动物序列(例如小鼠序列)。这样放置的核酸序列可以包括一个或多个调节序列，所述调节序列是用于获得这样放置的序列(例如启动子、增强子、5'-或3'-未翻译区域等)的来源核酸序列的一部分。例如，在不同的实施方案中，替换是用异源序列取代内源序列，其导致产生这样放置的核酸序列(包含该异源序列)的基因产物，但不表达该内源序列；替换是用编码与该内源序列编码的蛋白质具有类似功能的蛋白质的核酸序列替换内源基因组序列(例如内源基因组序列编码SIRPα蛋白，而DNA片段编码一种或多种人SIRPα蛋白)。在不同的实施方案中，用相应的人基因或其片段替换内源基因或其片段。相应的人基因或其片段是与被替换的内源基因或其片段是直系同源物的，或者与它基本上类似或者与它在结构和/或功能上相同的人基因或其片段。

本文所使用的短语“信号调节蛋白”或“SIRP”指信号调节蛋白受体，例如SIRPα受体。SIRP基因包括质膜受体，它在细胞表面上表达，并且作为调节蛋白参与真核细胞上的膜表面蛋白质之间的相互作用。已在人受试者中描述了SIRP基因中的多态性变体。以举例说明的方式，人和小鼠SIRP基因的核苷酸和氨基酸序列在表1中提供。技术人员在阅读了本公开的内容之后将会认识到基因组中的一个或多个内源SIRP受体基因(或者全部的)可以被一个或多个异源SIRP基因(例如多态性变体，亚型或突变体，来自另一个物种的基因，人源化形式等)替换。

本文所使用的“SIRP表达细胞”指表达信号调节蛋白受体的细胞。在一些实施方案中，SIRP表达细胞在其表面上表达信号调节蛋白受体。在一些实施方案中，在细胞表面表达的SIRP蛋白的量足以通过在细胞表面上表达的SIRP蛋白介导细胞间相互作用。示例性的SIRP表达细胞包括神经元、淋巴细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和自然杀伤(NK)细胞。SIRP表达细胞调节免疫细胞的相互作用，以调节对不同外部抗原或病原体的免疫反应。在一些实施方案中，本发明的非人动物证明通过在非人动物的一个或多个细胞表面上表达的人源化SIRP受体进行的免疫细胞调节。

本文所使用的术语“基本上”指量的条件，其表示感兴趣的特性或性质的完全的或几乎完全的限度或程度。生物领域的普通技术人员将会理解生物和化学现象很少，如果有的话，达到完全和/或进行完全或者实现或避免绝对的结果。因此术语“基本上”在文本中用于捕捉潜在的在许多生物和化学现象中固有的完全性的缺乏。

本文所使用的短语“基本上同源”指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员所理解的，如果两个序列在相应位置含有同源的残基，则它们通常被认为是“基本上同源”。同源残基可以是相同的残基。或者，同源残基可以是具有适当地类似的结构和/或功能特性的不相同的残基。例如，如本领域技术人员公知的，特定氨基酸通常被分类为“疏水的”或“亲水的”氨基酸，和/或被分为类具有“极性”或“非极性”侧链。将一个氨基酸取代为另一个相同类型的氨基酸通常被认为是“同源”取代。典型的氨基酸分类总结在表1和表2中。

表1

表2

如本领域公知的，可以使用各种算法的任何一种比较氨基酸或核酸序列，包括那些在商业计算机程序中可以获得的，例如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP，缺口BLAST和PSI-BLAST。示例性的这些程序在Altschul,et al,Basic localalignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul,et al,Methodsin Enzymology；Altschul,et al.,"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation ofprotein database search programs",Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Baxevanis,et al.,Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genesand Proteins,Wiley,1998和Misener,et al.,(eds.),Bioinformatics Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology,Vol.132),Humana Press,1999.中描述。除了鉴别同源序列之外，上述的程序通常提供关于同源程度的指示。在一些实施方案中，如果在相关的残基延伸上两个序列的相应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多是同源的，则它们被认为是基本上同源的。在一些实施方案中，相关延伸是完整序列。在一些实施方案中，相关延伸是至少9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多个残基。在一些实施方案中，相关延伸包括沿着完整序列的连续残基。在一些实施方案中，相关延伸包括沿着完整序列的不连续残基。在一些实施方案中，相关延伸是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个残基。

本文所使用的短语“基本上相同”指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员所理解的，如果两个序列在相应位置含有相同的残基，则它们通常被认为是“基本上相同”。如本领域公知的，可以使用各种算法的任何一种比较氨基酸或核酸序列，包括那些在商业计算机程序中可以获得的，例如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP，缺口BLAST和PSI-BLAST。示例性的这些程序在Altschul,et al,Basic localalignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul,et al,Methodsin Enzymology；Altschul,et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Baxevanis,et al.,Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes andProteins,Wiley,1998和Misener,et al.,(eds.),Bioinformatics Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology,Vol.132),Humana Press,1999中描述。除了鉴别相同序列之外，上述的程序通常提供关于相同程度的指示。在一些实施方案中，如果在相关的残基延伸上两个序列的相应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多是相同的，则它们被认为是基本上相同的。在一些实施方案中，相关延伸是完整序列。在一些实施方案中，相关延伸是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个残基。

本文所使用的短语“靶向载体”或“靶向构建体”指包含靶向区域的多核苷酸分子。靶向区域包含与靶细胞、靶组织或靶动物中的序列相同或基本上相同的序列，并且提供靶向构建体通过同源重组向该细胞、组织或动物基因组中的位置上的整合。还包括使用位点特异性重组酶识别位点(例如loxP或Frt位点)靶向区域进行靶向的靶向区域。在一些实施方案中，本发明的靶向构建体进一步包含特别感兴趣的核酸序列或基因、可选择标记、控制和/或调解序列以及其它核酸序列，所述其它核酸序列允许通过外源加入蛋白质介导重组，所述外源加入的蛋白质帮助或有助于涉及这些序列的重组。在一些实施方案中，本发明的靶向构建体进一步包含完整的或部分感兴趣基因，其中感兴趣基因是异源基因，其编码与内源序列编码的蛋白质具有类似功能的完整的或部分蛋白。

术语“变体”，如本文所使用的，指这样的实体，它与参考实体显示出显著的结构同一性，但与参考实体在结构上的不同之处在于与参照实体相比存在一个或多个化学部分或者一个或多个化学部分的水平不同。在许多实施例中，变体与它的参照实体在功能上也不同。通常，特定的实体是否被恰当地认为是参照实体的“变体”，是基于它与参照实体的结构同一性程度。如本领域技术人员所理解的，任何生物或化学参照实体都具有特定的特征结构要素。变体，根据定义，是共有一个或多个这种特征结构要素的不同的化学实体。举几个例子，小分子可以具有特征核结构要素(例如大环核)和/或一个或多个特征侧链部分，以使得该小分子的变体共有核结构要素和特征侧链部分，但是在其它侧链部分和/或在核中存在的键的类型(例如单键相对于双键，E相对于Z等)上不同，多肽可以具有由多个氨基酸组成的特征序列要素，所述多个氨基酸在线性或三维空间中相对于彼此具有指定的位置和/或对于特定的生物学功能有贡献，核酸可以具有由多个核苷酸残基组成的特征序列要素，所述多个核苷酸残基在线性或三维空间中相对于彼此具有指定的位置。例如，变体多肽可以因氨基酸序列上的一个或多个不同和/或与多肽骨架共价连接的化学部分(例如碳水化合物、脂类等)上的一个或多个不同而与参考多肽不同。在一些实施方案中，变体多肽与参考多肽在整个序列上的同一性为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％。替代性地或另外地，在一些实施方案中，变体多肽与参考多肽不共有至少一个特征序列要素。在一些实施方案中，参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽与参考多肽共有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽缺乏参考多肽的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽与参考多肽相比，一种或多种生物活性的水平降低。在许多实施方案中，如果感兴趣多肽与具有与亲本相同的氨基酸序列，除了在特定位置上有少量的序列改变，则该感兴趣多肽被认为是亲本或参考多肽的“变体”。典型地，与亲本向比，在变体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的残基被取代。在一些实施方案中，与亲本相比，变体具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代的残基。通常，变体具有非常少量(例如少于5、4、3、2或1个)取代的功能性残基(即参与特定生物学功能的残基)。而且，与亲本相比，变体通常具有不超过5、4、3、2或1个添加或缺失，并且通常没有添加或缺失。而且，任何添加或缺失通常少于大约25、大约20、大约19、大约18、大约17、大约16、大约15、大约14、大约13、大约10、大约9、大约8、大约7、大约6个，以及通常是少于大约5、大约4、大约3或大约2个残基。在一些实施方案中，亲本或参考多肽是天然存在的。如本领域普通技术人员所理解的，特定的感兴趣多肽的多种变体通常可以是天然存在的，特别是当感兴趣多肽是感染剂多肽时。

术语“载体”，如本文所使用的，指能够转运与之连接的另一个核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体能够在宿主细胞例如真核细胞和/或原核细胞中在染色体外复制和/或表达与它们连接的核酸。能够指导可操作连接的基因的表达的载体在本文中被称为“表达载体”。

术语“野生型”，如本文所使用的，具有本领域所理解的含义，指具有在“正常”(与突变、疾病、改变等相对)状态或环境中天然存在的结构和/或活性的实体。本领域普通技术人员应当理解野生型基因和多肽通常以多种不同形式(例如等位基因)存在。

详细描述

本发明提供，尤其是，改进的和/或工程化的非人动物，其具有编码信号调节蛋白(例如SIRPs)的人源化的遗传材料，用于在移入物的移植、吞噬作用和信号转导的激活中进行测定。预期这种非人动物提供在人细胞的移入物移植上的改进。因此，本发明特别用于在非人动物中保持造血细胞。特别地，本发明包括啮齿动物SIRPα基因的人源化，其导致在非人动物的细胞的质膜表面上表达人源化蛋白。这种人源化蛋白具有通过募集移入人细胞表面上存在的人源化SIRPα蛋白和配体来识别移入的人细胞的能力。在一些实施方案中，本发明的非人动物能够接受移植的人造血细胞；在一些实施方案中，这种非人动物发展出和/或具有包含人细胞的免疫系统。在一些实施方案中，人源化SIRPα蛋白具有相应于人SIRPα蛋白的氨基酸残基28-362的序列。在一些实施方案中，本发明的非人动物包含内源SIRPα基因，该内源SIRPα基因含有来自非人动物和异源物种(例如人)的遗传材料。在一些实施方案中，本发明的非人动物包含人源化SIRPα基因，其中该人源化SIRPα基因包含人SIRPα基因的外显子2、3和4。

本发明的各个方面在下述节中详细描述，这些节的使用不是要限制本发明。每一节都可以应用于本发明的任何方面。在本申请中，“或”的使用表示“和/或”，除非另外说明。

信号调节蛋白(SIRPs)基因家族

信号调节蛋白(SIRPs)构成细胞表面糖蛋白家族，它们在淋巴细胞、骨髓细胞(包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、骨髓树突细胞和肥大细胞)和神经元上表达(例如参见Barclay and Brown,2006,Nat Rev Immunol 6,457-464)。存在几种已报道的SIRP基因，它们可以根据它们各自的配体和它们涉及的信号传导类型而被分类。SIRPα(也被称为CD172A、SHPS1、P84、MYD-1、BIT和PTPNS1)在髓系免疫细胞上表达，并且通过免疫受体的基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)起抑制受体的作用。在神经元上也观察到SIRPα的表达。已报道的SIRPα的配体包括，最主要的，CD47，但还包括表面活性蛋白A和D。SIRPβ(也被称为CD172b)在巨噬细胞和嗜中性粒细胞上表达，但是没有已知的配体被报道。SIRPβ与SIRPα相比含有短胞质区域，并且已知与被称为DNAX活化蛋白12(DAP12)的信号传导成分相结合。因此，SIRPβ被认为是活化受体。SIRPγ(也被称为CD172g和SIRPβ2)在淋巴细胞和自然杀伤细胞上表达，并且也结合CD47，但是，没有信号传导功能被报道，因为胞质尾仅含有四个氨基酸，缺乏帮助结合DAP12的序列。另一个成员，SIRPδ，已有描述并作为可溶性受体存在。

特别地，研究了SIRPα的作用，涉及它在宿主细胞经由巨噬细胞的吞噬中的抑制作用。例如，CD47与巨噬细胞上的SIRPα的结合，引发抑制信号，该信号对吞噬作用进行负调节。或者，通过SIRPα结合介导的正信号传导作用已有报道(Shultz et al.,1995,JImmunol 154,180-91)。

SIRPα序列

人和小鼠的示例性的SIRPα序列在表3中给出。对于cDNA序列，连续的外显子由交替下划线文本分隔开。对于蛋白质序列，信号肽以下划线表示，跨膜和胞质序列以斜体表示。

表3

人源化SIRPα非人动物

提供在非人动物的免疫细胞(例如骨髓细胞)的表面上表达人源化人SIRPα蛋白的非人动物，所述非人动物由对编码SIRPα蛋白的非人动物的内源基因座的基因修饰获得。本文所述的合适的实例包括啮齿动物，特别是小鼠。

人源化SIRPα基因，在一些实施方案中，包含来自异源物种(例如人)的遗传材料，其中人源化SIRPα基因编码SIRPα蛋白，所述SIRPα蛋白包含来自异源物种的遗传材料的编码部分。在一些实施方案中，本发明的人源化SIRPα基因包含异源物种的基因组DNA，所述基因组DNA相应于在细胞质膜上表达的SIRPα蛋白的胞外部分。还提供含有所述人源化SIRPα基因的非人动物，胚胎，细胞和用于制备非人动物、胚胎、细胞的靶向构建体。

在一些实施方案中，内源SIRPα基因被缺失。在一些实施方案中，内源SIRPα基因被改变，其中一部分内源SIRPα基因被替换为异源序列(例如全部或部分人SIRPα基因)。在一些实施方案中，全部或基本上全部的内源SIRPα基因被替换为异源基因(例如人SIRPα基因)。在一些实施方案中，异源SIRPα基因的一部分被插入到内源SIRPα基因座上的内源非人SIRPα基因中。在一些实施方案中，异源基因是人基因。在一些实施方案中，对内源SIRPα基因的两个拷贝中的一个进行修饰或人源化，获得人源化SIRPα基因杂合的非人动物。在其它实施方案中，提供人源化SIRPα基因杂合的非人动物。

本发明的非人动物在内源非人SIRPα基因座上含有全部或部分人SIRPα基因。因此，这种非人动物可以被描述为具有异源SIRP基因。可以通过多种方法检测内源SIRPα基因座上的被替换、插入或修饰的SIRPα基因，例如，PCR、Western印迹、Southern印迹、限制性片段长度多态性(RFLP)或者等位基因的获得或丢失的测定。在一些实施方案中，非人动物是人源化SIRPα基因杂合的。

在不同的实施方案中，根据本发明的人源化SIRPα基因包括具有第二、第三和第四外显子的SIRPα基因，所述第二、第三和第四外显子每个具有与表3的人SIRPα基因中所示的第二、第三和第四外显子至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列。

在不同的实施方案中，根据本发明的人源化SIRPα基因包括具有核苷酸编码序列(例如cDNA序列)的SIRPα基因，所述核苷酸编码序列与表3的人SIRPα基因中所示的核苷酸352-1114至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同。

在不同的实施方案中，由本发明的非人动物产生的人源化SIRPα蛋白具有胞外部分，所述胞外部分具有与表3中所示的人SIRPα蛋白的胞外部分至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列。

在不同的实施方案中，由本发明的非人动物产生的人源化SIRPα蛋白具有胞外部分，所述胞外部分具有与表3的人SIRPα蛋白中所示的氨基酸残基28-362至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列。

在不同的实施方案中，由本发明的非人动物产生的人源化SIRPα蛋白具有与表3中所示的人SIRPα蛋白的氨基酸残基至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的氨基酸序列。

提供制备非人动物的组合物和方法，所述非人动物表达人源化SIRPα蛋白，包括特定的多态性形式或等位基因变体(例如单氨基酸差异)，包括用于制备从人启动子和人调节序列表达这种蛋白的非人动物的组合物和方法。在一些实施方案中，还提供用于制备从内源启动子和内源调节序列表达这种蛋白的非人动物的组合物和方法。该方法包括将编码全部或部分人SIRPα蛋白的遗传材料插入到非人动物基因组中相应于内源SIRPα基因的精确位置，由此产生表达全部或部分人SIRPα蛋白的人源化SIRPα基因。在一些实施方案中，该方法包括将相应于人SIRPα基因的外显子2-4的基因组DNA插入到非人动物中，由此产生编码SIRPα蛋白的的人源化基因，所述SIRPα蛋白含有人部分，该人部分含有由插入的外显子编码的氨基酸。

人源化SIRPα基因方法利用对内源基因的相对最小的改变，在非人动物中获得天然的SIRPα-介导的信号传导，在不同的实施方案中，因为在单个片段上改造了SIRPα序列的基因组序列，因此通过包括必需的调节序列而保留了正常的功能性。因此，在这样的实施方案中，SIRPα基因改造不影响其它周围的基因或其它内源SIRP基因。进一步，在不同的实施方案中，该改造不影响质膜上功能受体的组装，并且通过未受改造影响的受体的胞质部分的结合和后续信号传导而保持正常的效应子功能。

图1中提供内源鼠SIRPα基因和人源化SIRPα基因的示意图(非成比例的)。如图所示，含有人SIRPα基因的外显子2-4的基因组DNA通过靶向构建体被插入到内源鼠SIRPα基因座中。该基因组DNA包含编码人SIRPα蛋白的负责配体连接的胞外部分(例如氨基酸残基28-362)的基因部分。

在内源SIRPα基因座上具有人源化SIRPα基因的非人动物(例如小鼠)可以通过本领域已知的任何方法制备。例如，可以制备引入具有可选择标记基因的全部或部分人SIRPα基因的靶向载体。图1显示了包含人SIRPα的外显子2-4的插入物的小鼠基因组。如所示的，靶向构建体含有5'同源臂和3'同源臂，该5'同源臂含有内源鼠SIRPα基因的外显子2上游的序列、接着含有人SIRPα基因的外显子2-4的基因组DNA、药物选择盒(例如两侧为loxP序列的新霉素抗性基因)，该3'同源臂含有内源鼠SIRPα基因的外显子4下游的序列。通过同源重组，内源鼠SIRPα基因的外显子2-4被靶向载体中含有的序列替换。产生人源化SIRPα基因，获得细胞或非人动物，所述细胞或非人动物表达含有人SIRPα基因的外显子2-4编码的氨基酸的人源化SIRPα蛋白。药物选择盒可以任选地通过后续加入重组酶(例如通过Cre处理)而被去除。

除了本文所述的具有人源化SIRPα基因的小鼠之外，本文还提供其它包含人源化SIRPα基因的基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，这些非人动物包含与内源SIRPα启动子可操作连接的人源化SIRPα基因。在一些实施方案中，这些非人动物从内源基因座表达人源化SIRPα蛋白，其中该人源化SIRPα蛋白包含人SIRPα蛋白的氨基酸残基28-362.

这种非人动物可以选自由小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、白鼬、灵长动物(例如狨猴、猕猴)组成的组。对于不容易获得合适的课基因修饰的ES细胞的非人动物，使用其它方法制备包含本文所述的基因修饰的非人动物。这些方法包括，例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导的多能细胞)，并利用核转移将修饰的基因组转移到合适的细胞，例如卵母细胞中，并在合适的条件下在非人动物中使修饰的细胞(例如修饰的卵母细胞)孕育以形成胚胎。

在一些实施方案中，本发明的非人动物是哺乳动物。在一些实施方案中，本发明的非人动物是小哺乳动物，例如跳鼠科或鼠科超家族的哺乳动物。在一些实施方案中，本发明的基因修饰的动物是啮齿动物。在一些实施方案中，本发明的啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方案中，本发明的啮齿动物选自鼠科超家族。在一些实施方案中，本发明的基因修饰的动物来自于选自丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如类似小鼠的仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真正的小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠毛鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(Platacanthomyidae)(例如刺睡鼠(spiny dormice))和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如鼹形鼠、竹鼠和鼢鼠)的家族。在一些特定的实施方案中，本发明的基因修饰的啮齿动物选自真正的小鼠或大鼠(鼠科家族)、沙鼠、棘鼠和冠毛鼠。在一些特定的实施方案中，本发明的基因修饰的啮齿动物来自于鼠科家族的成员。在一些实施方案中，本发明的非人动物是啮齿动物。在一些特定的实施方案中，本发明的啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施方案中，本发明的啮齿动物是小鼠。

在一些实施方案中，本发明的非人动物是C57BL株的小鼠，所述C57BL株选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/O1a。在一些特定的实施方案中，本发明的小鼠是选自由129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129Sl/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2组成的组的129株(参见例如，Festing et al.,1999,Mammalian Genome 10:836；Auerbachet al.,2000,Biotechniques 29(5):1024-1028,1030,1032)。在一些特定的实施方案中，本发明的基因改造的小鼠是上述的129株和上述的C57BL/6株的杂交体。在一些特定的实施方案中，本发明的基因改造的小鼠是上述的129株的杂交体，或上述的BL/6株的杂交体。在一些特定的实施方案中，本文所述的杂交体中的129株是129S6(129/SvEvTac)株。在一些实施方案中，本发明的小鼠是BALB株，例如BALB/c株。在一些实施方案中，本发明的小鼠是BALB株和另一种上述株的杂交体。

在一些实施方案中，本发明的非人动物是大鼠。在一些特定的实施方案中，本发明的大鼠选自Wistar大鼠、LEA株、Sprague Dawley株、Fischer株、F344、F6和Dark Agouti。在一些特定的实施方案中，本文所述的大鼠株是选自由Wistar、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti组成的组的两个或更多个株的杂交体。

使用具有人源化SIRPα非人动物的方法

已报道了SIRPα突变体和转基因非人动物(例如小鼠)(Inagaki et al.,2000,EMBO Journal 19(24):6721-6731；Strowig et al.,2011,Proc.Nat.Acad.Sci.108(32):13218-13223)。在多种测定中利用这种动物来确定SIRPα表达、功能和调节的分子方面。但是，它们并非是没有限制。例如，由于含有SIRPα的突变体形式的细胞不能传递信号导致受损伤的健康状况，从而使SIRPα突变体的使用受到限制。进一步，由于CD47，SIRPα的配体可能与SIRPα的突变体形式存在于同一个细胞上，并且这两种蛋白都能够提供胞内信号，所以不能分辨这种结果是来自于SIRPα信号传导的缺乏还是来自于CD47结合的缺乏。在人SIRPα转基因小鼠的情况中，小鼠SIRPα是完整的并且具有功能。因此在这些小鼠中，不同生物过程(例如移植)中的依赖于SIRPα的功能不能清楚地归因于单独的人SIRPα或小鼠SIRPα的功能，因为人和小鼠SIRPα受体都存在并且都具有功能。

本发明的非人动物提供表达人SIRPα的生物材料(例如细胞)的改进的体内系统和来源，其对于多种测定是有用的。在不同的实施方案中，本发明的非人动物用于开发靶向SIRPα和/或调解SIRPα-CD47信号传导的疗法。在不同的实施方案中，本发明的小鼠用于筛选和开发与人SIRPα结合的候选治疗剂(例如抗体)。在不同的实施方案中，本发明的非人动物用于确定拮抗剂和/或激动剂与本文所述的非人动物的细胞表面上的人源化SIRPα的结合模式。

在不同的实施方案中，本发明的非人动物用于测量阻断或调解SIRPα信号传导(例如磷酸化)的治疗效果和细胞变化对于基因表达的影响。在不同的实施方案中，本发明的非人动物以及由其分离的细胞被暴露于候选治疗剂，所述候选治疗剂与该非人动物的细胞表面上的人SIRPα结合，并且在后来的一段时间之后，分析对于依赖于SIRPα的过程，例如B和/或T细胞增殖、血小板清除和细胞因子表达的诱导的作用。

本发明的非人动物表达人源化SIRPα蛋白，因此可以产生细胞、细胞系和细胞培养物作为结合和功能测定中所使用的人源化SIRPα的来源，例如，以测定SIRPα拮抗剂或激动剂的结合或功能，特别是当该拮抗剂或激动剂对于人SIRPα序列或表位是特异性的时候。在不同的实施方案中，由本文所述的非人动物表达的人源化SIRPα蛋白可以包含变体氨基酸序列。已报道了具有与配体结合残基相关的变化的变体人SIRPα蛋白。在不同的实施方案中，本发明的非人动物表达人源化SIRPα蛋白变体。在不同的实施方案中，变体在与配体结合相关的氨基酸位置上具有多态性。在不同的实施方案中，本发明的非人动物用于通过与人SIRPα的多态性变体的相互作用来确定配体结合的效果。

来自本发明的非人动物的细胞可以被分离并随时使用，或者可以在培养物中保持许多代。在不同的实施方案中，来自本发明的非人动物的细胞被永生化，并在培养物中无限期保持(例如在连续培养中)。

在不同的实施方案中，本发明的非人动物的细胞被用在细胞迁移或伸展测定中，以筛选和开发调节人SIRPα的候选治疗剂。这种过程对于许多细胞过程，包括伤口愈合、分化、增殖和存活来说是必需的。

在不同的实施方案中，本发明的非人动物的细胞被用在巨核细胞集落形成细胞的克隆测定上，用于测试靶向人SIRPα的候选治疗剂的药学毒理学方面。

在不同的实施方案中，本发明的非人动物的细胞被用在吞噬作用的测定上，以确定化合物或生物制剂调节吞噬作用的依赖于SIRPα的调控的治疗潜能。

本发明的非人动物为药物或疫苗的分析和测试提供体内系统。在不同的实施方案中，候选药物或疫苗可以被递送到本发明的一个或多个非人动物中，然后监测非人动物，以确定对于该药物或疫苗的一种或多种免疫反应、药物或疫苗的安全性状况或者对于疾病或病况的效果。可以在这种非人动物中改进和/或开发这种药物或疫苗。

本发明的非人动物提供改进的体内系统，其通过过继转移说明了人细胞间相互作用的机理。在不同的实施方案中，本发明的非人动物可以被植入肿瘤异种移植物，然可以通过过继转移在非人动物中第二次植入肿瘤浸润淋巴细胞，以确定消除实体肿瘤或其它恶性肿瘤的效果。这些实验可以用人细胞进行，因为其中只存在人SIRPα，不与非人动物的内源SIRPα竞争。进一步，可以在这种非人动物中改进和/或开发用于异种移植的疗法和药物。

本发明的非人动物提供改进的体内系统，用于通过移植使人造血干细胞维持并发育。在不同的实施方案中，本发明的非人动物提供改进的人干细胞在非人动物中的发育和维持。在不同的实施方案中，在非人动物的血液、骨髓、脾和胸腺中观察到增加的分化人B和T细胞群落。在不同的实施方案中，本发明的非人动物提供与表达小鼠和人SIRPα二者的非人动物相比，人细胞移植水平上的增加。

本发明的非人动物可用于评价靶向人细胞的治疗药物的效力。在不同的实施方案中，给本发明的非人动物移植人细胞，然后给该动物施用靶向该人细胞的药物候选物。然后在施用药物之后，通过监测非人动物中的人细胞确定该药物的治疗效力。可以在非人动物中测试的药物包括小分子化合物，即分子量小于1500kD、1200kD、1000kD或800道尔顿的化合物，和大分子化合物(例如蛋白质，如抗体)，它们通过靶向(例如与其结合和/或作用于其上)人细胞而具有预期的治疗人疾病和病况的治疗效果。

在一些实施方案中，药物是抗癌药物，并且人细胞是癌细胞，其可以是原发癌的细胞或者从原发癌建立的细胞系的细胞。在这些实施方案中，给本发明的非人动物移植人癌细胞，并将抗癌药物给予给非人动物。可以通过评价非人动物中人癌细胞的生长或转移是否因药物的使用而被抑制来确定药物的效力。

在特定的实施方案中，抗癌药物是与人癌细胞上的抗原结合的抗体分子。在具体的实施方案中，抗癌药物是与人癌细胞上的抗原结合，并与其它人细胞，例如人免疫系统细胞(或者“人免疫细胞”)如B细胞和T细胞结合的双特异性抗体。

在一些实施方案中，给本发明的非人动物移入人免疫细胞或者分化为人免疫细胞的细胞。给具有移入的人免疫细胞的这种非人动物移植人癌细胞，并施用抗癌药物，例如与人癌细胞上的抗原结合，并与人免疫细胞(例如T细胞)上的抗原结合的双特异性抗体。可以根据双特异性抗体抑制人癌细胞在非人动物中生长或转移的能力来评价其治疗效力。在特定的实施方案中，给本发明的而非人动物移入产生人免疫细胞(由其包括T细胞、B细胞、NK细胞)的人CD34+造血祖细胞。人B细胞淋巴细胞(例如Raji细胞)被移植到具有移入的人免疫细胞的这种非人动物中，该非人动物随后被施用与CD20(正常B细胞和特定B细胞恶性肿瘤上的抗原)结合并且与T细胞受体的CD3亚基结合的双特异性抗体，以测试该双特异性抗体抑制非人动物中肿瘤生长的能力。

实施例

提供下述特定实施例是为了向本领域普通技术人员描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，而不是要限制发明人视为是他们的发明的范围。除非另外指出，所给出的温度为摄氏度，压力是大气压或近似大气压。

实施例1.内源信号调节蛋白(SIRP)基因的人源化

本实施例说明了在非人哺乳动物例如啮齿动物(例如小鼠)中对编码信号调节蛋白α(SIRPα)的内源基因人源化的方法。已知人SIRPα以至少10个等位基因的形式存在。本实施例中所述的方法可用于使用所期望的任何人等位基因或人等位基因(或等位基因片段)的组合对非人动物的内源SIRPα基因进行人源化。在本实施例中，使用人SIRPα变体1进行小鼠内源SIRPα基因的人源化。

使用技术(参见例如美国专利No.6586251和Valenzuela et al.(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression ana lysis,Nature Biotech.21(6):652-659)构建用于SIRP(例如SIRPα)基因的胞外区域的人源化的靶向构建体。

简短地说，对小鼠细菌人工染色体(BAC)克隆bMQ-261H14进行改造，以删除含有内源SIRPα基因的外显子2-4的序列，并使用人BAC克隆CTD-3035H21插入人SIRPα基因的外显子2-4。BAC克隆bMQ-261H14中的相应于内源SIRPα基因的外显子2-4的基因组DAN(～8555bp)被替换为含有BAC克隆CTD-3035H21的人SIRPα基因的外显子2-4的～8581bp的DNA片段。BAC克隆CTD-3035H21中含有的人SIRPα等位基因的序列分析表明该等位基因相应于人变体1。侧翼具有loxP位点的新霉素盒被加入到含有人SIRPα基因的外显子2-4的～8581bp的人DNA片段中(图1)。

分别从小鼠BAC DNA的外显子2和4的5'位置和3'位置获得上游和下游同源臂，并加入到～8581bp的人片段-新霉素盒中，以产生最终的用于内源SIRPα基因的人源化的靶向载体，从5'到3'含有含内源SIRPα基因的外显子2的5'的19kb小鼠DNA，含人SIRPα基因的外显子2-4的～8581bp的DNA片段，侧翼具有loxP位点的新霉素盒，和含内源SIRPα基因的外显子4的3'的21kb小鼠DNA。靶向载体的靶向插入将新霉素盒置于小鼠SIRPα基因外显子4和5之间的第五内含子中。靶向载体用SwaI消化而被线性化，然后用于细菌细胞的同源重组中，以实现用人SIRPα基因的外显子2-4替换小鼠SIRPα基因的外显子2-4(图1)。

靶向BAC DNA(如上所述)被用于对小鼠ES细胞进行电穿孔，以产生改造的ES细胞，所述改造的ES细胞包含用包含人SIRPα基因的外显子2-4的基因组片段对内源小鼠SIRPα基因中的外显子2-4的替换。使用TAQMAN探针(Lie and Petropoulos,1998.Curr.Opin.Biotechnology 9:43-48)通过定量PCR鉴别含有包含人SIRPα基因的外显子2-4的基因组片段的阳性ES细胞。横跨上游插入点的核苷酸序列包括下述序列，其表明插入点上游的内源小鼠序列(包含在下面的括号中)与插入点上存在的人SIRPα基因组序列连续连接：(AGCTCTCCTA CCACTAGACT GCTGAGACCC GCTGCTCTGC TCAGGACTCG ATTTCCAGTACACAATCTCC CTCTTTGAAA AGTACCACAC ATCCTGGGGT)GCTCTTGCAT TTGTGTGACA CTTTGCTAGCCAGGCTCAGT CCTGGGTTCC AGGTGGGGAC TCAAACACAC TGGCACGAGT CTACATTGGA TATTCTTGGT(SEQ ID NO:6)。位于新霉素盒的5'末端的横跨下游插入点的核苷酸序列包括下述序列，其表明人SIRPα基因组序列与插入点下游的盒序列(包含在下面的括号中，其中loxP序列为斜体)连续相接：GCTCCCCATT CCTCACTGGC CCAGCCCCTC TTCCCTACTC TTTCTAGCCC CTGCCTCATCTCCCTGGCTG CCATTGGGAG CCTGCCCCAC TGGAAGCCAG(TCGAG A TAA CTTCGTA TAA TGTATGCTA TA CGAA GTTA T ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG CGCCCCCCTCCTCACGGCGA)(SEQ ID NO:7)。位于新霉素盒的3'末端的横跨下游插入点的核苷酸序列包括下述序列，其表明盒序列与内源SIRPα基因的外显子4的3'小鼠基因组序列(包含在下面的括号中)连续相接：CATTCTCAGT ATTGTTTTGC CAAGTTCTAA TTCCATCAGA CCTCGACCTGCAGCCCCTAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGC(TGTCTCATAG AGGCTGGCGATCTGGCTCAG GGACAGCCAG TACTGCAAAG AGTATCCTTG TTCATACCTT CTCCTAGTGG CCATCTCCCTGGGACAGTCA)(SEQ ID NO:8)。然后使用阳性ES细胞克隆植入雌性小鼠，使用方法(参见，例如美国专利No.7294754和Poueymirou et al.2007,F0generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.25(1):91-99)，以产生含有人SIRPα基因的外显子2-4向小鼠内源SIRPα基因的插入的一窝幼崽。

上述的靶向ES细胞被用作供体ES细胞，并通过方法(见上文)被引入到8-细胞期的小鼠胚胎中。用改进的等位基因测定(Valenzuela et al.,见上文)进行基因型分析，检测人SIRPα基因序列的存在，由此鉴别带有内源SIRPα基因的外显子2-4的人源化的小鼠。

可以将带有人源化SIRPα基因构建体的小鼠(即在小鼠SIRPα基因中含有人SIRPα外显子)培育成Cre缺失小鼠株(参见，例如，国际专利申请公开号No.WO2009/114400)，以除去任何由靶向载体引入的，在ES细胞期或在胚胎中没有被除去的lox化(loxed)的新霉素盒。任选地，在小鼠中保留新霉素盒。

对幼崽进行基因型分析，对人源化SIRPα基因构建体杂合的幼崽被选择用于进行特征描述。

实施例2.人源化SIRPα在非人动物中的表达

本实施例说明了SIRPα蛋白在非人动物的细胞表面上的特征表达，所述非人动物被工程化以在内源SIRPα基因座上含有实施例1所述的人源化SIRPα基因构建体。

简短地说，从野生型(WT)和人源化SIRPα基因杂合的小鼠分离脾。然后给脾灌注胶原酶D(Roche Bioscience)并用ACK裂解缓冲液裂解红细胞，根据制造商的说明进行。使用荧光染料缀合的抗-CD3(17A2)、抗-CD19(1D3)、抗-CD11b(M1/70)、抗人SIRPα(SE5A5)和抗小鼠SIRPα(P84)通过FACS分析小鼠和人SIRPα的细胞表面表达。使用BD LSRFORTESSA进行流式细胞术。所检测到的示例性的CD11b+单核细胞表面上人和小鼠SIRPα的表达如图2所示。

如图2所示，小鼠和人源化SIRPα的表达在杂合小鼠的CD11b⁺单核细胞表面上都是可以清楚检测到的。

实施例3.人源化SIRP非人动物中人细胞的移入

本实施例说明在本发明的具有人源化SIRPα基因的非人动物中的改进的人造血干细胞的移入。

简短地说，具有或不具有人源化SIRPα基因的Rag2KO IL2Rγ^缺失小鼠在无病原体的条件下饲养。新生小鼠(2-5天龄)用240cGy辐照，并肝内注射1x10⁵CD34⁺人造血干细胞。移入后10-12周对小鼠取血，使用荧光染料缀合的抗-人CD45(HI 30)、抗-人CD3(SK7)、抗-人CD19(HIB19)和抗-小鼠CD45(30-F11)通过FACS分析血液，以检查人免疫系统的重建。小鼠的遗传背景是BALB/cTa x 129/SvJae。

人CD34⁺细胞在野生型、人SIRPα杂合小鼠、人源化SIRPα杂合小鼠和BALB-Rag2^-/-IL2Rγc^-/-(DKO)小鼠中示例性百分比如图3-5所示。

如本实施例中所示，人源化SIRPα基因杂合的小鼠与其它测试株相比，提供了外周(例如血液)中的最高人CD34⁺细胞百分比，证明人CD34⁺细胞的移入被改进。

综合起来，这些数据证明人源化SIRPα通过在小鼠细胞表面上表达，在本文所述的小鼠中是有功能的，并且开始能够支持人CD34⁺造血干细胞的移入。

实施例4.评价Ab 1对于BRG小鼠中Raji淋巴瘤肿瘤生长的效力

概述

Ab 1是双特异性抗体(bsAb)，它与CD3，与T细胞受体(TCR)复合物结合的T细胞抗原，和CD20，正常B细胞和几种B细胞系恶性肿瘤上存在的B细胞表面抗原结合。Ab 1被设计以通过结合TCR的CD3亚基将表达CD20的细胞与细胞毒性T细胞连接起来，导致CD20-指导的多克隆T细胞杀伤。CD20是得到临床验证的免疫治疗的靶；嵌合抗体利妥昔单抗被证明可用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。虽然患者可能变得用利妥昔单抗难以治疗，但通常不会观察到CD20的表达的消失。因此，连接CD20阳性肿瘤细胞与细胞毒性T细胞的双特异性抗体代表了潜在的抗肿瘤策略。

在本研究中，在小鼠肿瘤模型中检查用CD20xCD3bsAb Ab 1治疗对于人B细胞淋巴瘤(Raji)肿瘤生长的作用。该模型使用SIRPα人源化的移入hCD34+的BALB/c-Rag2缺失IL2rγ缺失(BALB/c-Rag2null IL2rγnull，BRG)小鼠。这些小鼠，具有人T、B和NK细胞，以及粒细胞、单核细胞和树突细胞(DCs)，用Ab 1治疗，每周2次，与载体对照和非结合性对照mAb，对照Ab 5相比，导致Raji肿瘤生长的显著抑制。在整个治疗期中，与载体对照组相比，0.4mg/kg和0.04mg/kg的Ab 1治疗都以更大的显著性抑制肿瘤生长(p<0.0001)。在任何治疗组中都没有观察到显著的体重减轻。这些结果表明Ab 1靶向具有人免疫细胞的Raji肿瘤，导致显著的肿瘤抑制。

材料与方法

材料

测试化合物和对照抗体

测试化合物：Ab 1。

对照抗体：对照Ab 5。

试剂

表4：试剂列表

测试系统

在本报告中显示的肿瘤研究利用信号调节蛋白α(SIRPα)人源化的24-32周龄的雄性和雌性BALB/C-Rag2缺失IL2rγ缺失(BRG)免疫缺陷小鼠。这些小鼠在Regeneron通过胚胎干(ES)细胞靶向产生(Strowig et al.,Proc Natl Acad Sci USA,108(32):13218-13223(2011))。在识别CD47之后，SIRPα抑制巨噬细胞对CD47阳性细胞的清除。之前的研究显示表达人SIRPα转基因的BRG小鼠具有增强的人HSC移入(Strowig et al.,Proc NatlAcad Sci USA,108(32):13218-13223(2011))。

新生的SIRPαBRG幼崽被辐照并移入来自胎儿肝脏的hCD34+造血祖细胞(Traggiai,et al.,Science,304(5667):104-107(2004))。这些人HSCs产生人T、B和NK细胞，以及粒细胞、单核细胞和树突细胞(DCs)。由于循环人B细胞的低水平，存在低水平的循环人IgG。而且，这些小鼠不发育生发中心，缺乏淋巴结并且当T和B细胞耗尽的时候，这些细胞的补充有限。鼠单核细胞、DCs和粒细胞仍然存在。通过血液的流式细胞术验证免疫细胞组合物，并且在用于进行肿瘤研究之前，将小鼠按照人CD45移入的％随机划分。在第0天给小鼠植入Raji肿瘤细胞，并测试Ab 1在4周中阻断肿瘤生长的能力。在植入后第3、6、9、13、16、20、23、27、30和34天记录体重和肿瘤体积。

实验设计

SIRPαBRG小鼠中人免疫系统的重建

在Regeneron的动物房的无菌隔离室中培养免疫缺陷的BALB/c Rag2/-γc-/-(BRG)人SIRPα(SIRPαBRG)小鼠。初生小鼠在注射从人胎儿肝脏分离的人CD34+造血干细胞(HSC)之前8-24h用单次300cGrey剂量辐照。允许移入进行12-16周，周期性地通过流式细胞术评价移入细胞的数量。在整个实验进行期间，动物被安置在Regeneron的动物房中，置于标准条件下，12小时日/夜周期，随意获取食物和水。每个笼子内的动物数量限制为最多5只小鼠。

分析小鼠血液以在开始研究之前确定移入水平百分比。将全血收集到两个含有150uL的2％EDTA(乙二胺四乙酸；15mg/mL)的毛细管中。使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞3分钟，用PBS(无钙或镁)中和缓冲液。用Fc Block在4℃阻断细胞5分钟，然后用人CD45、NKp46、CD19、CD3和CD14在4℃染色30分钟。通过5-激光流式细胞术(BD Fortessa)分析样品。移入百分比确定为总细胞中人CD45+细胞的％。

在SIRPαBRG小鼠小鼠中Raji肿瘤研究过程

在第0天，给5只SIRPαBRG小鼠的组皮下施用2x10⁶Raji肿瘤细胞。在同一天，用腹膜内给药的Ab 1(0.4或0.04mg/kg)、剂量为0.4mg/kg的非结合性的对照mAb对照Ab 5(其结合猫抗原，对人CD20或CD3没有交叉反应性)或单独的载体治疗小鼠。小鼠随后接受每周两次的抗体给药，持续4周。在第3、6、9、13、16、20、23、27、30和34天用卡尺测量肿瘤生长。研究组总结在表5中。

表5：SIRPαBRG小鼠中治疗组的概况

具体程序

试剂的制备

将Ab 1和对照Ab 5每一个在载体(10mM组氨酸，5％蔗糖，pH 5.8)中稀释到所希望的浓度。从Regeneron核心实验室(通道4)获得Raji细胞并维持在培养基：RPMI 1640+10％PBS+Pen Strep-L-Glu+巯基乙醇中。将Raji细胞在培养基中稀释到所希望的浓度。

统计分析

使用GraphPad软件Prism 5.0(MacIntosh版本)进行统计分析。由使用Tukey's多重比较事后检验的两因素ANOVA确定统计学显著性。在处理组中比较每个读数的数据。p<0.05的阈值被认为是具有统计学上的显著性，用*指示。在研究接受之前死亡的小鼠从所示的综合肿瘤生长曲线(但不从个体小鼠生长曲线)图和统计分析中移除，以通过两因素ANOVA进行分析。

结果

Ab 1抑制Raji肿瘤细胞在移入hCD34+的SIRPαBRG小鼠中的生长

在移入hCD34+的SIRPαBRG小鼠中，Ab 1与载体对照和非结合性的对照相比，抑制Raji肿瘤生长(图6)。新生SIRPαBRG幼崽被辐照并移入hCD34+胎儿肝脏细胞(Traggiai,etal,Science,304(5667):104-107(2004))，所述hCD34+胎儿肝脏细胞作为造血祖细胞，产生人T、B和NK细胞，以及粒细胞、单核细胞和DCs。在第0天，给移入hCD34+的SIRPαBRG小鼠皮下施用2x10⁶Raji肿瘤细胞。在同一天，腹膜内(IP)给药Ab 1(0.4或0.04mg/kg)或非结合性对照mAb对照Ab 5或单独的载体治疗小鼠，然后在整个研究中每周给药两次。

与载体对照组和非结合性对照组相比，在植入肿瘤后第34天，以0.04mg/kg(p<0.0001)或0.4mg/kg(p<0.0001)的剂量施用Ab 1显著抑制Raji肿瘤生长(图7)。而且，Ab 1治疗的效果是剂量依赖性的，与完全抑制肿瘤生长到第30天的0.04mg/kg Ab1相比，0.4mg/kg Ab1在整个研究中完全抑制生长。Ab 1和非结合性对照mAb在整个研究中对于小鼠体重都没有显著影响(图8)。

结论

在小鼠模型中检查了用Ab 1、CD20XCD3bsAb处理对于Raji肿瘤生长的效果。在具有人T、B和NK细胞，以及粒细胞、单核细胞和DCs的移入hCD34+的SIRPαBRG小鼠中，Ab 1在肿瘤生长抑制上是有效的。用Ab 1每周治疗两次与载体对照和非结合性对照相比，导致显著的和剂量依赖的对Raji人B细胞淋巴瘤肿瘤生长的抑制。在任何治疗组中没有观察到显著的体重减轻。这些结果显示Ab 1靶向具有人免疫细胞的小鼠中的Raji肿瘤，导致显著的肿瘤生长抑制。

对应用语

因此，通过描述本发明的至少一个实施方案的几个方面，本领域技术人员应当理解，对本领域技术人员来说，各种改变、修改和改进都是易于发生的。这种改变、修改和改进是本公开的一部分，并且在本发明的精神和范围内。相应地，前述描述和图仅仅是举例的方式，本发明由后面的权利要求详细描述。

权利要求书中修饰权利要求要素的例如“第一”、“第二”、“第三”等的普通术语的使用本身并不意味着任何优先权、优先级或一个权利要求要素的顺序先于另一要素，或执行方法的动作的时间顺序，而是仅用于将具有特定名称的一个权利要求要素与另一个具有相同名称的权利要求要素区分开来(如果没有使用普通术语)，以区分权利要求要素。

本文说明书和权利要求中所使用的冠词“一(a)”和“一(an)”，除非明确有相反说明，应当被理解为包括复数引用。在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述应当被视为是满足以下情况，即组成员中的一个、多于一个，或全部存在于、被应用于给定的产品或过程中，或者另外与给定的产品或过程相关，除非有相反说明或者从上下文另外明显看出。本发明包括这样的实施方案，其中组中的一个确切成员存在于、被应用于给定的产品或过程中，或者另外与给定的产品或过程相关。本发明还包括这样的实施方案，其中多于一个组成员或全部组成员存在于、被应用于给定的产品或过程中，或者另外与给定的产品或过程相关。而且，应当理解，本发明包括所有的变形、组合和置换，其中来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条件、描述性用语被引入从属于同一个基础权利要求的另一个权利要求(或者相关的任何其它权利要求)中，除非另外指出或者除非对于本领域普通技术人员来说明显会引起矛盾或不一致。当要素以列表的形式呈现时(例如在马库什组或类似的形式中)，应当理解该要素的每个亚组也被公开，并且任何要素可以从该组中去除。应当理解，通常，当本发明或本发明的方面被表示为包含特定的要素、特征等时，本发明的特定实施方案或本发明的方面由这些要素、特征等组成或基本上由它们组成。为了简化的目的，那些实施方案并不是在每种情况下都明确用本文所述的那么多用词来具体描述。应当理解，本发明的任何实施方案或方面可以明确地从权利要求排除，不管在说明书中是否描述了这种具体排除。

本领域技术人员应当理解本文中所述的测定或其它过程中获得的值的偏差或误差的通常标准。

本文引用的用以描述本发明背景以及用以提供与其实施有关的其它细节的出版物、网站和其它参考材料通过引用合并入本文。

Claims (24)

1.小鼠基因组，其包含在内源小鼠SIRPα基因座上用人SIRPα基因的外显子2、3和4对小鼠SIRPα基因的外显子2、3和4的替换，以形成人源化SIRPα基因，其中所述人源化SIRPα基因与小鼠SIRPα启动子在所述内源小鼠SIRPα基因座上可操作连接，并且在所述小鼠中表达人源化SIRPα蛋白，所述人源化SIRPα蛋白包含由所述人SIRPα基因编码的人SIRPα蛋白的胞外部分和由所述小鼠SIRPα基因编码的小鼠SIRPα蛋白的胞内部分。

2.权利要求1的小鼠基因组，其中人源化SIRPα基因包含所述小鼠SIRPα基因的外显子1、5、6、7和8。

3.权利要求1或2的小鼠基因组，其中所述人SIRPα蛋白包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

4.权利要求3的小鼠基因组，其中所述人源化SIRPα蛋白包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

5.分离的小鼠细胞或组织，其基因组包含在内源小鼠SIRPα基因座上用人SIRPα基因的外显子2、3和4对小鼠SIRPα基因的外显子2、3和4的替换，以形成人源化SIRPα基因，其中所述人源化SIRPα基因与小鼠SIRPα启动子在所述内源小鼠SIRPα基因座上可操作连接，并且编码人源化SIRPα蛋白，所述人源化SIRPα蛋白包含由所述人SIRPα基因编码的人SIRPα蛋白的胞外部分和由所述小鼠SIRPα基因编码的小鼠SIRPα蛋白的胞内部分，其中分离的小鼠细胞或组织不是小鼠胚胎干细胞。

6.权利要求5的分离的细胞或组织，其中人源化SIRPα基因包含所述小鼠SIRPα基因的外显子1、5、6、7和8。

7.权利要求5或6的分离的细胞或组织，其中所述细胞或组织不表达小鼠SIRPα蛋白。

8.制备小鼠的方法，其包括：

(a)在小鼠ES细胞中的内源小鼠SIRPα基因座上用人SIRPα基因的外显子2、3和4替换小鼠SIRPα基因的外显子2、3和4，以形成人源化SIRPα基因，其中所述人源化SIRPα基因与小鼠SIRPα启动子在所述内源小鼠SIRPα基因座上可操作连接，并编码人源化SIRPα蛋白，所述人源化SIRPα蛋白包含由所述人SIRPα基因编码的人SIRPα蛋白的胞外部分和由所述小鼠SIRPα基因编码的小鼠SIRPα蛋白的胞内部分，从而获得包含所述人源化SIRPα基因的改造的小鼠ES细胞；以及

(b)使用(a)中获得的改造的ES细胞产生小鼠。

9.权利要求8的方法，其中人源化SIRPα基因包含所述小鼠SIRPα基因的外显子1、5、6、7和8。

10.权利要求8的方法，其中所述人SIRPα蛋白包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

11.权利要求10的方法，其中所述人源化SIRPα蛋白包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

12.权利要求8的方法，其中小鼠不表达小鼠SIRPα蛋白。

13.权利要求8的方法，其中所述人源化SIRPα蛋白表达于所述小鼠的细胞表面上并支持人CD34+造血干细胞的移入。

14.将人细胞移入到小鼠中的方法，其包括以下步骤：

(a)提供小鼠，其基因组包含在内源小鼠SIRPα基因座上用人SIRPα基因的外显子2、3和4对小鼠SIRPα基因的外显子2、3和4的替换，以形成人源化SIRPα基因，其中所述人源化SIRPα基因与小鼠SIRPα启动子在所述内源小鼠SIRPα基因座上可操作连接，并且在所述小鼠中表达人源化SIRPα蛋白，所述人源化SIRPα蛋白包含由所述人SIRPα基因编码的人SIRPα蛋白的胞外部分和由所述小鼠SIRPα基因编码的小鼠SIRPα蛋白的胞内部分；以及

(b)将一个或多个人细胞移植到小鼠中。

15.权利要求14的方法，其中人细胞是人造血干细胞。

16.测量小鼠的一个或多个细胞对标记的底物的吞噬作用的方法，其包括：

(a)提供一个或多个小鼠细胞，其基因组包含在内源小鼠SIRPα基因座上用人SIRPα基因的外显子2、3和4对小鼠SIRPα基因的外显子2、3和4的替换，以形成人源化SIRPα基因，其中所述人源化SIRPα基因与小鼠SIRPα启动子在所述内源小鼠SIRPα基因座上可操作连接，并且编码人源化SIRPα蛋白，所述人源化SIRPα蛋白包含由所述人SIRPα基因编码的人SIRPα蛋白的胞外部分和由所述小鼠SIRPα基因编码的小鼠SIRPα蛋白的胞内部分；

(b)将步骤(a)的一个或多个细胞与标记的底物温育；以及

(c)测量步骤(b)的一个或多个细胞对标记的底物的吞噬作用。

17.测量小鼠的一个或多个细胞对抗原的吞噬作用方法，其包括：

(a)提供小鼠，其基因组包含在内源小鼠SIRPα基因座上用人SIRPα基因的外显子2、3和4对小鼠SIRPα基因的外显子2、3和4的替换，以形成人源化SIRPα基因，其中所述人源化SIRPα基因与小鼠SIRPα启动子在所述内源小鼠SIRPα基因座上可操作连接，并且在所述小鼠中表达人源化SIRPα蛋白，所述人源化SIRPα蛋白包含由所述人SIRPα基因编码的人SIRPα蛋白的胞外部分和由所述小鼠SIRPα基因编码的小鼠SIRPα蛋白的胞内部分；

(b)使小鼠暴露于抗原；以及

(c)测量小鼠的一个或多个细胞对抗原的吞噬作用。

18.小鼠在制备用于评价靶向人细胞的药物的治疗效力的动物模型中的用途，其中：

小鼠基因组包含在内源小鼠SIRPα基因座上用人SIRPα基因的外显子2、3和4对小鼠SIRPα基因的外显子2、3和4的替换，以形成人源化SIRPα基因，其中所述人源化SIRPα基因与小鼠SIRPα启动子在所述内源小鼠SIRPα基因座上可操作连接，并且在所述小鼠中表达人源化SIRPα蛋白，所述人源化SIRPα蛋白包含由所述人SIRPα基因编码的人SIRPα蛋白的胞外部分和由所述小鼠SIRPα基因编码的小鼠SIRPα蛋白的胞内部分。

19.小鼠在方法中作为动物模型的用途，所述方法包括：

(a)提供小鼠，其基因组包含在内源小鼠SIRPα基因座上用人SIRPα基因的外显子2、3和4对小鼠SIRPα基因的外显子2、3和4的替换，以形成人源化SIRPα基因，其中所述人源化SIRPα基因与小鼠SIRPα启动子在所述内源小鼠SIRPα基因座上可操作连接，并且在所述小鼠中表达人源化SIRPα蛋白，所述人源化SIRPα蛋白包含由所述人SIRPα基因编码的人SIRPα蛋白的胞外部分和由所述小鼠SIRPα基因编码的小鼠SIRPα蛋白的胞内部分；

(b)使小鼠暴露于抗原；以及

(c)测量小鼠的一个或多个细胞对抗原的吞噬作用。

20.权利要求14、16或17的方法或权利要求18或19的用途，其中人源化SIRPα基因包含所述小鼠SIRPα基因的外显子1、5、6、7和8。

21.权利要求14、16或17的方法或权利要求18或19的用途，其中所述人SIRPα蛋白包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

22.权利要求21的方法或用途，其中所述人源化SIRPα蛋白包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

23.权利要求14、16或17的方法或权利要求18或19的用途，其中小鼠不表达小鼠SIRPα蛋白。

24.权利要求14、16或17的方法或权利要求18或19的用途，其中所述人源化SIRPα蛋白表达于所述小鼠的细胞表面上并支持人CD34+造血干细胞的移入。