ES2710282T3 - Animales no humanos que tienen un gen humanizado de una proteína reguladora de señales - Google Patents

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Abstract

Un roedor cuyo genoma comprende un reemplazo de los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPα de roedor en un locus endógeno de SIRPα de roedor con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPα humano para formar un gen de SIRPα humanizado, en donde dicho gen de SIRPα humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPα de roedor en dicho locus endógeno de SIRPα de roedor, y expresa en dicho roedor una proteína SIRPα humanizada que comprende una porción extracelular de la proteína SIRPα humana codificada por dicho gen de SIRPα humano y una porción intracelular de la proteína SIRPα de roedor codificada por dicho gen de SIRPα de roedor.

Description

DESCRIPCION
Animales no humanos que tienen un gen humanizado de una protefna reguladora de senales
Referenda cruzada con solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos num. 61/881,261, presentada el 23 de septiembre de 2013.
Antecedentes de la invencion
El sistema inmunitario se compone de varios tipos de celulas diferentes que estan implicadas en multiples procesos altamente regulados, y juntas generan respuestas inmunitarias que son eficaces en la eliminacion de protefnas extranas. Ademas, se ha encontrado que estas mismas celulas inmunitarias poseen una propiedad de autotolerancia, entre otras, para las protefnas reguladoras de membrana que regulan las interacciones de celula a celula. Este tipo de comunicacion es fundamental para la supervivencia de tales organismos, ya que se sugiere que estas mismas protefnas son un determinante importante en el trasplante de injertos. Sin embargo, no existe un sistema in vivo para determinar los aspectos moleculares de las interacciones de celula a celula del sistema inmunitario humano y su regulacion. Un sistema de este tipo proporciona una fuente para ensayos en las funciones relacionadas con el sistema inmunitario y hematopoyetico humano in vivo, asf como la identificacion de nuevas terapias y vacunas.
Breve descripcion de la invencion
La presente invencion se basa en el reconocimiento de que es conveniente disenar animales no humanos que permitan un mejor injerto de celulas madre hematopoyeticas humanas. La presente invencion se basa ademas en el reconocimiento de que los animales no humanos que tienen un gen de SIRPa humanizado y/o que expresan, contienen, o producen de cualquier otra manera una protefna SIRPa humana o humanizada son convenientes, por ejemplo para usar en el injerto de celulas madre hematopoyeticas humanas.
La invencion proporciona un roedor cuyo genoma comprende un reemplazo de los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de roedor en un locus endogeno de SIRPa de roedor con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de roedor en dicho locus endogeno de SIRPa de roedor, y expresa en dicho roedor una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de roedor codificada por dicho gen de SIRPa de roedor.
La invencion proporciona ademas un tejido o celula de roedor aislada cuyo genoma comprende un reemplazo de los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de roedor en un locus endogeno de SIRPa de roedor con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de roedor en dicho locus endogeno de SIRPa de roedor, y codifica una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de roedor codificada por dicho gen de SIRPa de roedor.
La invencion proporciona adicionalmente un metodo para obtener un roedor, que comprende: (a) reemplazar los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de roedor en un locus endogeno de SIRPa de roedor en una celula ES de roedor con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de roedor en dicho locus endogeno de SIRPa de roedor, y codifica una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de roedor codificada por dicho gen de SIRPa de roedor, para obtener de esta manera una celula ES modificada de roedor que comprende dicho gen de SIRPa humanizado; y (b) crear un roedor con el uso de la celula ES modificada obtenida en (a).
La invencion proporciona adicionalmente un metodo para evaluar la eficacia terapeutica de un farmaco para dirigirse a celulas humanas, que comprende: (a) proporcionar un roedor de acuerdo con cualquier reivindicacion 1-6 en el que se han trasplantado una o mas celulas humanas; (b) administrar un candidato a farmaco a dicho roedor; y (c) controlar las celulas humanas en el roedor para determinar la eficacia terapeutica del candidato a farmaco.
En la presente descripcion se describe un animal no humano que expresa un polipeptido de SIRPa que comprende una porcion extracelular de una protefna SIRPa humana y una porcion intracelular de una protefna SIRPa de raton.
Una porcion extracelular de una protefna SIRPa humana puede comprender aminoacidos correspondientes a los residuos 28-362 de una protefna SIRPa humana que aparece en la sec. con num. de ident.: 4.
Una porcion extracelular de una protefna SIRPa humana puede compartir un por ciento de identidad de al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % con una porcion extracelular correspondiente de una protefna SIRPa humana que aparece en la Tabla 3. Una porcion extracelular de una protefna SIRPa humana puede compartir el 100 % de identidad (o ser identica) con una porcion extracelular correspondiente de una protefna SIRPa humana que aparece en la Tabla 3.
En la presente descripcion se describe ademas un animal no humano que tampoco expresa una protefna SIRPa endogena no humana. El animal no humano puede ser un roedor que tampoco expresa una protefna SIRPa endogena de roedor. El animal no humano puede ser un raton que tampoco expresa una protefna SIRPa endogena de raton que tiene una secuencia que aparece en la Tabla 3.
En la presente descripcion se describe ademas un animal no humano que comprende un gen de SIRPa que comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano unido operativamente a un promotor de SIRPa no humano.
Un gen de SIRPa de un animal no humano descrito en el presente documento puede comprender los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de un gen endogeno de SIRPa no humano.
Un animal no humano como se describe en la presente puede ser un roedor. El roedor puede seleccionarse de un raton o una rata.
En la presente descripcion se describe ademas un polipeptido de SIRPa codificado por el gen de un animal no humano como se describe en el presente documento.
En la presente se describe ademas una celula o tejido aislado a partir de un animal no humano como se describe en la presente. Una celula puede seleccionarse a partir de un linfocito (por ejemplo, una celula B o T), una celula mieloide (por ejemplo, un macrofago, un neutrofilo, un granulocito, una celula dendrftica mieloide, y un mastocito), y una neurona. Un tejido puede seleccionarse de tejido adiposo, vejiga, cerebro, mama, medula osea, ojo, corazon, intestino, rinon, hfgado, pulmon, ganglio linfatico, musculo, pancreas, plasma, suero, piel, bazo, estomago, timo, testfculo, ovario, y/o una combinacion de estos.
En la presente descripcion se describe adicionalmente una celula o tejido aislados de raton cuyo genoma incluye un gen de SIRPa que codifica la porcion extracelular de una protefna SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protefna SIRPa de raton. El gen de SIRPa descrito en el presente documento puede unirse operativamente a un promotor de SIRPa de raton. Un gen de SIRPa descrito en el presente documento puede comprender los exones 2, 3, y 4 de un gen de SIRPa humano.
En la presente descripcion se describe ademas una celula madre embrionaria (ES) no humana cuyo genoma comprende un gen de SIRPa como se describe en el presente documento. La celula ES puede comprender los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano unidos operativamente a un promotor de SIRPa no humano. La celula ES puede ser una celula ES de roedor. Una celula madre embrionaria no humana descrita en el presente documento puede ser una celula madre embrionaria de raton o rata.
En la presente descripcion se describe ademas un embrion no humano que comprende, se produce, se obtiene, o se genera a partir de una celula madre embrionaria no humana que comprende un gen de SIRPa como se describe en el presente documento. El embrion no humano puede ser un embrion de roedor. El embrion de roedor como se describe en el presente documento puede ser un embrion de raton o rata.
En la presente descripcion se describe ademas un metodo para obtener un animal no humano que expresa una protefna SIRPa a partir de un locus endogeno de SIRPa, en donde la protefna SIRPa comprende una secuencia humana, el metodo comprende transformar un locus endogeno de SIRPa en una celula ES no humana con un fragmento genomico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protefna SIRPa humana en su totalidad o en parte; obtener una celula ES no humana modificada que comprende un locus endogeno de SIRPa que comprende dicha secuencia humana; y, crear un animal no humano mediante el uso de dicha celula ES modificada.
Como se describe en el presente documento, dicha secuencia de nucleotidos puede comprender los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano. Dicha secuencia de nucleotidos puede comprender los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano que tiene una secuencia al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % identica a un gen de SIRPa humano que aparece en la Tabla 3.
Dicha secuencia de nucleotidos puede codificar los residuos de aminoacidos 28-362 de una protefna SIRPa humana. Dicha secuencia de nucleotidos puede codificar los residuos de aminoacidos 28-362 de una protefna SIRPa humana que tiene una secuencia al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % identica a una protefna SIRPa humana que aparece en la Tabla 3.
En la presente descripcion se describe adicionalmente un metodo para proporcionar un raton cuyo genoma incluye un gen de SIRPa que codifica la porcion extracelular de una protema SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protema SlRPa de raton, el metodo comprende modificar el genoma de un raton de manera que este comprenda un gen de SIRPa que codifique la porcion extracelular de una protema SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protema SIRPa de raton para proporcionar de esta manera dicho raton. El gen de SIRPa puede ser un gen de SIRPa como se describe en el presente documento. El gen de SIRPa puede comprender los exones 2, 3, y 4 de un gen de SIRPa humano.
En la presente descripcion se describe ademas un metodo para injertar celulas humanas a un raton, el metodo comprende etapas para proporcionar un raton cuyo genoma comprende un gen de SIRPa que codifica la porcion extracelular de una protema SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protema SIRPa de raton, y trasplantar una o mas celulas humanas al raton. El metodo puede comprender, ademas, como una etapa, ensayar el injerto de una o mas celulas humanas en el raton. La etapa de ensayar puede comprender comparar el injerto de una o mas celulas humanas con el injerto en uno o mas ratones de tipo silvestre. La etapa de ensayar puede comprender comparar el injerto de una o mas celulas humanas con el injerto en uno o mas ratones cuyo genoma no comprende un gen de SIRPa que codifica la porcion extracelular de una protema SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protema SIRPa de raton.
Las celulas humanas pueden ser celulas madre hematopoyeticas. Las celulas humanas pueden trasplantarse por via intravenosa. Las celulas humanas pueden trasplantarse por via intraperitoneal. Las celulas humanas pueden trasplantarse por via subcutanea.
En la presente descripcion se describe ademas un metodo que comprende las etapas de proporcionar una o mas celulas cuyo genoma incluye un gen de SIRPa que codifica la porcion extracelular de una protema SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protema SIRPa de raton, incubar una o mas celulas con un sustrato marcado, y medir la fagocitosis del sustrato marcado por una o mas celulas. Las celulas pueden ser celulas de raton.
El sustrato puede estar marcado fluorescentemente. El sustrato puede estar marcado con un anticuerpo. El sustrato puede ser uno o mas globulos rojos. El sustrato puede ser una o mas celulas bacterianas.
En la presente descripcion se describe adicionalmente un metodo que comprende las etapas de proporcionar un raton cuyo genoma incluye un gen de SIRPa que codifica la porcion extracelular de una protema SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protema SIRPa de raton, exponer el raton a un antfgeno, y medir la fagocitosis del antfgeno por una o mas celulas del raton. La etapa de exponer puede comprender exponer el raton a un antfgeno que esta marcado fluorescentemente. La etapa de exponer puede comprender exponer el raton a una o mas celulas que comprenden el antfgeno. La etapa de exponer puede comprender exponer el raton a una o mas celulas humanas que comprenden el antfgeno. La etapa de exponer puede comprender exponer el raton a una o mas celulas bacterianas que comprenden el antfgeno.
Un gen de SIRPa descrito en el presente documento comprende los exones 2, 3, y 4 de un gen de SIRPa humano. Una porcion extracelular de una protema SIRPa humana descrita en el presente documento puede comprender los aminoacidos correspondientes a los residuos 28-362 de una protema SIRPa humana que aparece en la Tabla 3. Un gen de SIRPa descrito en el presente documento puede unirse operativamente a un promotor de SIRPa de raton.
En la presente descripcion se describe ademas un animal no humano que puede obtenerse por los metodos segun se describen en el presente documento. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden no expresar de manera detectable una porcion extracelular de una protema SIRPa endogena.
En la presente descripcion se describen ademas metodos para la identificacion o validacion de un farmaco o vacuna, el metodo comprende las etapas de suministrar un farmaco o vacuna a un animal no humano como se describe en el presente documento, y controlar una o mas de las respuestas inmunitarias al farmaco o vacuna, el perfil de seguridad del farmaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afeccion. El control del perfil de seguridad puede incluir la determinacion de si el animal no humano exhibe un efecto secundario o reaccion adversa como resultado del suministro del farmaco o vacuna. Un efecto secundario o reaccion adversa puede seleccionarse de morbilidad, mortalidad, alteracion del peso corporal, alteracion del nivel de una o mas enzimas (por ejemplo, hepaticas), alteracion en el peso de uno o mas organos, perdida de funcion (por ejemplo, sensorial, motora, de organos, etcetera), aumento de la susceptibilidad a una o mas enfermedades, alteraciones al genoma del animal no humano, aumento o disminucion del consumo de alimentos y complicaciones de una o mas enfermedades.
En la presente descripcion se describe adicionalmente el uso de un animal no humano de la presente invencion en el desarrollo de un farmaco o vacuna para su uso en medicina, tal como su uso como un medicamento.
En la presente descripcion se describe ademas el uso de un animal no humano descrito en el presente documento para evaluar la eficacia de un farmaco terapeutico que se dirige a celulas humanas. Un animal no humano descrito en el presente documento puede trasplantarse con celulas humanas, y puede administrarse al animal un candidato a farmaco que se dirige a tales celulas humanas. La eficacia del farmaco se determina mediante el control de las celulas humanas en el animal no humano despues de la administracion del farmaco.
Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden ser roedores, preferentemente un raton o una rata.
Como se usa en esta solicitud, los terminos "alrededor de" y "aproximadamente" se usan como equivalentes. Cualquier numero usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente pretende abarcar cualquiera de las fluctuaciones normales apreciadas por un experto en la tecnica en cuestion.
Otras caracterfsticas, objetivos, y ventajas de la presente invencion son evidentes en la descripcion detallada a continuacion. Debe entenderse, sin embargo, que la descripcion detallada, si bien indica modalidades de la presente invencion, se proporciona solamente a modo de ilustracion, no de limitacion. Diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invencion resultaran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion detallada.
Breve descripcion de las figuras
La figura incluida en la presente descripcion solamente tiene propositos ilustrativos y no de limitacion.
La Figura 1 muestra un diagrama, no a escala, de un gen murino endogeno de SIRPa (superior) con cada exon numerado. Se muestra un gen endogeno de SIRPa humanizado (inferior) que contiene los exones 2-4 de un gen de SIRPa humano y un casete de seleccion de neomicina (Ub-Neo) flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasas sitio especfficas (por ejemplo, loxP). La insercion dirigida de los exones 2-4 de un gen de SIRPa humano da como resultado un gen endogeno que expresa un gen de SIRPa humanizado que tiene una region extracelular correspondiente a una protefna SIRPa humana.
La Figura 2 muestra una superposicion de la expresion de SIRPa de ratones de tipo silvestre y heterocigotos para un gen de SIRPa humanizado.
La Figura 3 muestra el por ciento de celulas CD45+ en diferentes cepas de ratones injertados con celulas CD34+ humanas.
La Figura 4 muestra el por ciento de celulas CD45+CD3+ en diferentes cepas de ratones injertados con celulas CD34+ humanas.
La Figura 5 muestra el por ciento de celulas CD45+CD19+ en diferentes cepas de ratones injertados con celulas CD34+ humanas.
La Figura 6 muestra que Ac 1 suprimio el crecimiento de tumores Raji de manera dependiente de la dosis en ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+. El volumen de los tumores Raji se midio en los dfas 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 y 34 despues de la implantacion del tumor. Se presentan los datos de los animales individuales (Paneles A-D). Los ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+ recibieron la administracion de 2 x 106 celulas tumorales Raji por via subcutanea en el Dfa 0. Los grupos control no recibieron anticuerpo (control de vehfculo) (Panel A). Para los grupos experimentales, en el Dfa 0 los ratones se trataron con una dosis IP de un Ac control de no union (control Ac 5) a 0,4 mg/kg (Panel B), o Ac 1 a 0,4 mg/kg (Panel C) o 0,04 mg/kg (Panel D), seguido por dosis dos veces a la semana por la duracion del estudio. Los datos compuestos para todos los grupos de prueba individuales se muestran en la Figura 7.
La Figura 7 muestra que el Ac 1 suprimio significativamente el crecimiento de tumores Raji en comparacion con los controles en ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+. Los datos representan los datos compuestos de n=4-5 ratones por grupo como se muestra en la Figura 6. Los datos se expresan como media (SEM) y se analizaron mediante el uso de analisis de varianza (ANOVA) y pruebas post hoc para determinar los efectos significativos (prueba de Tukey para el ANOVA de dos vfas). Un raton en el grupo control de vehfculo, el grupo Control de Ac 5, y el grupo de Ac 1 a 0,4 mg/kg se excluyeron de este grafico compuesto debido a una muerte temprana, para analizar los datos mediante ANOVA de dos vfas.
La Figura 8 muestra que el Ac 1 no afecto el peso corporal en ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+. Los pesos corporales se midieron en los dfas 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 y 34 despues de la implantacion del tumor. Se midieron los datos para los animales individuales (Paneles A-D). Los ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+ recibieron la administracion de 2 x 106 celulas tumorales Raji por via subcutanea en el Dfa 0. Los grupos controles no recibieron anticuerpo (control vehfculo) (Panel A). Para los grupos experimentales, en el Dfa 0 los ratones se trataron con una dosis IP del Ac control de no union IgG1 5 a 0,4 mg/kg (Panel B), o Ac 1 a 0,4 mg/kg (Panel C) o 0,04 mg/kg (Panel D), seguido por dosis dos veces a la semana por la duracion del estudio.
Definiciones
Esta invencion no se limita a los metodos particulares, y condiciones experimentales descritos, ya que tales metodos y condiciones pueden variar. Ademas, debe entenderse que la terminologfa usada en la presente descripcion es solamente para el proposito de describir modalidades particulares, y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invencion se define en las reivindicaciones.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los terminos y frases usados en la presente descripcion incluyen los significados que se atribuyen a los terminos y frases en la tecnica, a menos que se indique claramente lo contrario o resulte claramente evidente a partir del contexto en el cual se usa el termino o frase. Aunque cualquiera de los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripcion puede usarse en la practica o prueba de la presente invencion, a continuacion se describiran metodos y materiales particulares.
El termino "aproximadamente" como se aplica en la presente a uno o mas valores de interes, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En modalidades determinadas, el termino “aproximadamente” o “alrededor de” se refiere a un intervalo de valores que caen dentro de 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o menos en cualquier direccion (mayor o menor) del valor de referencia indicado a menos que se indique de cualquier otra manera o resulte evidente de cualquier otra manera a partir del contexto (excepto cuando tal numero exceda el 100 % de un valor posible).
El termino "biologicamente activo" como se usa en la presente se refiere a una caracterfstica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biologico, in vitro o in vivo (por ejemplo, en un organismo). Por ejemplo, un agente que, cuando esta presente en un organismo, tiene un efecto biologico dentro de ese organismo, se considera biologicamente activo. En modalidades particulares, cuando una protefna o polipeptido es biologicamente activo, una porcion de esa protefna o polipeptido que comparte al menos una actividad biologica de la protefna o polipeptido se refiere tfpicamente como una porcion “biologicamente activa”.
El termino "comparable", como se usa en la presente, se refiere a dos o mas agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etcetera, que pueden no ser identicos entre sf pero que son suficientemente similares para permitir la comparacion entre ellos de manera que puedan obtenerse conclusiones de manera razonable en base a las diferencias o las similitudes observadas. Los expertos en la tecnica comprenderan, en contexto, el grado de identidad necesario en cualquier circunstancia determinada para dos o mas de tales agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etcetera, para considerarse comparables.
El termino "conservadora" como se usa en la presente para describir una sustitucion de aminoacido conservadora se refiere a la sustitucion de un residuo de aminoacido por otro residuo de aminoacido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades qufmicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitucion de aminoacido conservadora no cambiara sustancialmente las propiedades funcionales de interes de una protefna, por ejemplo, la capacidad de un receptor de unirse a un ligando. Los ejemplos de grupos de aminoacidos que tienen cadenas laterales con propiedades qufmicas similares incluyen cadenas laterales alifaticas tales como glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; cadenas laterales hidroxialifaticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromaticas tales como fenilalanina, tirosina, y triptofano; cadenas laterales basicas tales como lisina, arginina, e histidina; cadenas laterales acidas tales como acido aspartico y acido glutamico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cistefna y metionina. Los grupos de sustituciones conservadoras de aminoacidos incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. En algunas modalidades, una sustitucion de aminoacido conservadora puede ser una sustitucion de cualquier residuo nativo en una protefna con alanina, como se usa, por ejemplo, en la mutagenesis por barrido de alanina. En algunas modalidades, se produce una sustitucion conservadora que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarftmica PAM250 descrita en Gonnet y otros (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. En algunas modalidades, la sustitucion es una sustitucion moderadamente conservadora en donde la sustitucion tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarftmica PAM250.
El termino "interrupcion” como se usa en la presente descripcion se refiere al resultado de un evento de recombinacion homologa con una molecula de ADN (por ejemplo, con una secuencia homologa endogena tal como un gen o locus genico). En algunas modalidades, una interrupcion puede lograr o representar una insercion, una delecion, una sustitucion, un reemplazo, una mutacion con perdida de sentido, o un desplazamiento del marco de una(s) secuencia(s) de ADN, o cualquier combinacion de estos. Las inserciones pueden incluir la insercion de genes completos o fragmentos de genes, por ejemplo, exones, que pueden ser de un origen distinto al de la secuencia endogena. En algunas modalidades, una interrupcion puede aumentar la expresion y/o actividad de un gen o producto genico (por ejemplo, de una protefna codificada por un gen). En algunas modalidades, una interrupcion puede disminuir la expresion y/o actividad de un gen o producto genico. En algunas modalidades, una interrupcion puede alterar la secuencia de un gen o un producto genico codificado (por ejemplo, una protefna codificada). En algunas modalidades, una interrupcion puede truncar o fragmentar un gen o un producto genico codificado (por ejemplo, una protefna codificada). En algunas modalidades, una interrupcion puede extender un gen o un producto genico codificado; en algunas de tales modalidades, una interrupcion puede lograr el ensamblaje de una protefna de fusion. En algunas modalidades, una interrupcion puede afectar el nivel pero no la actividad de un gen o producto genico. En algunas modalidades, una interrupcion puede afectar la actividad pero no el nivel de un gen o producto genico. En algunas modalidades, una interrupcion puede no tener un efecto significativo sobre el nivel de un gen o producto genico. En algunas modalidades, una interrupcion puede no tener un efecto significativo sobre la actividad de un gen o producto genico. En algunas modalidades, una interrupcion puede no tener un efecto significativo sobre el nivel o la actividad de un gen o producto genico.
La frase "locus endogeno" o "gen endogeno" como se usa en la presente descripcion se refiere a un locus genetico encontrado en un organismo parental o de referencia antes de la introduccion de una interrupcion, delecion, reemplazo, alteracion, o modificacion como se describe en el presente documento. En algunas modalidades, el locus endogeno tiene una secuencia que se encuentra en la naturaleza. En algunas modalidades, el locus endogeno es un locus de tipo silvestre. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo de tipo silvestre. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo modificado geneticamente. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo criado en un laboratorio (ya sea de tipo silvestre o modificado geneticamente).
La frase "promotor endogeno" se refiere a un promotor que se asocia naturalmente, por ejemplo, en un organismo de tipo silvestre, con un gen endogeno.
El termino "heterologo" como se usa en la presente se refiere a un agente o entidad de una fuente diferente. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a un polipeptido, gen, o producto genico o presente en una celula u organismo particular, el termino aclara que el polipeptido, gen, o producto genico relevante 1) se modifico por la accion del hombre; 2) se introdujo en la celula u organismo (o un precursor de este) por la accion del hombre (por ejemplo, por medio de ingenierfa genetica); y/o 3) no se produce o no esta presente naturalmente en la celula u organismo relevante (por ejemplo, el tipo de celula o el tipo de organismo relevante).
El termino "celula huesped", como se usa en la presente, se refiere a una celula en la que se ha introducido un acido nucleico o una protefna heterologos (por ejemplo, exogenos). Despues de leer esta descripcion los expertos entenderan que tales terminos no se refieren solamente a la celula particular en cuestion, sino que se usan, ademas, para referirse a la progenie de tal una celula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones posteriores ya sea debido a una mutacion o a influencias del ambiente, tal progenie puede no ser, de hecho, identica a la celula parental, pero aun asf se incluye dentro del alcance del termino "celula huesped" como se usa en la presente descripcion. En algunas modalidades, una celula huesped es, o comprende, una celula procariota o eucariota. En general, una celula huesped es cualquier celula que sea adecuada para recibir y/o producir un acido nucleico o una protefna heterologos, independientemente del reino de la vida al que pertenece la celula. Las celulas ilustrativas incluyen las de organismos procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), celulas bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etcetera), celulas de micobacterias, celulas fungicas, celulas de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etcetera), celulas vegetales, celulas de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, celulas de insectos infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etcetera), celulas de animales no humanos, celulas humanas, o fusiones de celulas tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas modalidades, la celula es una celula humana, de mono, simio, hamster, rata, o raton. En algunas modalidades, la celula es eucariota y se selecciona de las siguientes celulas: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), celula de retina, Vero, CV1, renal (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermica), CV-1, U937, 3T3, celula L, celula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, celula de Sertoli, celula BRL 3A, celula HT1080, celula de mieloma, celula tumoral, y una lfnea celular derivada de una celula mencionada anteriormente. En algunas modalidades, la celula comprende uno o mas genes virales, por ejemplo, una celula de retina que expresa un gen viral (por ejemplo, una celula PER.C6™). En algunas modalidades, una celula huesped es, o comprende, una celula aislada. En algunas modalidades, una celula huesped es parte de un tejido. En algunas modalidades, una celula huesped es parte de un organismo.
El termino "humanizado" se usa en la presente descripcion de acuerdo con el significado que se entiende en la tecnica para referirse a acidos nucleicos o protefnas cuyas estructuras (es decir, secuencias de nucleotidos o aminoacidos) incluyen porciones que se corresponden sustancial o identicamente con estructuras de un gen o protefna particulares que se encuentran en la naturaleza en un animal no humano, e incluyen, ademas, porciones que se diferencian de la encontrada en el gen o protefna no humanos particulares en cuestion y en lugar de eso se corresponden de manera mas cercana con estructuras comparables que se encuentran en un gen o protefna humanos correspondientes. Un gen "humanizado" puede ser uno que codifica un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a la de un polipeptido humano (por ejemplo, una protefna humana o porcion de esta - por ejemplo, una porcion caracterfstica de esta). Para dar un ejemplo, en el caso de un receptor de membrana, un gen “humanizado” puede codificar un polipeptido que tiene una porcion extracelular que tiene una secuencia de aminoacidos igual a la de una porcion extracelular humana y la secuencia restante igual a la de un polipeptido no humano (por ejemplo, de raton). Un gen humanizado puede comprender al menos una porcion de una secuencia de ADN de un gen humano. Un gen humanizado puede comprender una secuencia de ADN completa de un gen humano. Una protefna humanizada puede comprender una secuencia que tiene una porcion que aparece en una protefna humana. Una protefna humanizada puede comprender una secuencia completa de una protefna humana y se expresa a partir de un locus endogeno de un animal no humano que corresponde al homologo o al ortologo del gen humano.
El termino "identidad" como se usa en la presente descripcion en relacion con una comparacion de secuencias, se refiere a la identidad determinada mediante una serie de algoritmos diferentes conocidos en la tecnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleotidos y/o aminoacidos. En algunas modalidades, las identidades como se describen en la presente se determinan con el uso de un alineamiento ClustalW v. 1.83 (lento) que emplea una penalizacion por apertura de interrupcion de 10.0, una penalizacion por extension de interrupcion de 0.1, y el uso de una matriz de similitud de Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).
El termino "aislado", como se usa en la presente, se refiere a una sustancia y/o entidad que (1) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente (en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) se ha disenado, producido, preparado, y/o fabricado por la accion del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o mas de aproximadamente 99 % de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas modalidades, los agentes aislados son aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o mas de aproximadamente 99 % puros. Como se usa en la presente, una sustancia es "pura" si esta sustancialmente libre de otros componentes. En algunas modalidades, como entenderan los expertos en la tecnica, una sustancia aun puede considerarse “aislada” o incluso “pura”, despues de combinarse con otros componentes determinados tales como, por ejemplo, uno o mas portadores o excipientes (por ejemplo, tampon, disolvente, agua, etcetera); en tales modalidades, el porcentaje de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir tales portadores o excipientes. Solo para dar un ejemplo, en algunas modalidades, un polfmero biologico tal como un polipeptido o un polinucleotido que se produce en la naturaleza se considera “aislado” cuando: a) en virtud de su origen o fuente de obtencion no se asocia con algunos o todos los componentes que lo acompanan en su estado nativo en la naturaleza; b) esta sustancialmente libre de otros polipeptidos o acidos nucleicos de la misma especie de la especie que lo produce en la naturaleza; o c) se expresa por, o se encuentra de cualquier otra manera en asociacion con componentes de una celula u otro sistema de expresion que no es de la especie que lo produce en la naturaleza. Asf, por ejemplo, en algunas modalidades, un polipeptido que se sintetiza qufmicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente al que lo produce en la naturaleza se considera un polipeptido "aislado". Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, un polipeptido que se ha sometido a una o mas tecnicas de purificacion puede considerarse un polipeptido “aislado” en la medida que se ha separado de otros componentes a) con los que se asocia en la naturaleza; y/o b) con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente.
La frase “animal no humano” como se usa en la presente descripcion se refiere a cualquier organismo vertebrado que no es un ser humano. En algunas modalidades, un animal no humano es un ciclostomo, un pez oseo, un pez cartilaginoso (por ejemplo, un tiburon o una raya), un anfibio, un reptil, un mamffero, y un ave. En algunas modalidades, un mamffero no humano es un primate, una cabra, una oveja, un cerdo, un perro, una vaca, o un roedor. En algunas modalidades, el animal no humano es un roedor tal como una rata o un raton.
La frase "acido nucleico", como se usa en la presente, en su sentido mas amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que es una cadena oligonucleotfdica o que puede incorporarse a esta. En algunas modalidades, un acido nucleico es un compuesto y/o sustancia que es una cadena de oligonucleotido, o que puede incorporarse a ella, mediante un enlace fosfodiester. Como resultara evidente a partir del contexto, en algunas modalidades, “acido nucleico” se refiere a residuos de acidos nucleicos individuales (por ejemplo, nucleotidos y/o nucleosidos); en algunas modalidades, “acido nucleico” se refiere a una cadena oligonucleotfdica que comprende residuos de acidos nucleicos individuales. En algunas modalidades, un “acido nucleico” es o comprende ARN; en algunas modalidades, un “acido nucleico” es o comprende ADN. En algunas modalidades, un acido nucleico es, comprende, o consiste en uno o mas residuos de acido nucleico naturales. En algunas modalidades, un acido nucleico es, comprende, o consiste en uno o mas analogos de acido nucleico. En algunas modalidades, un analogo de acido nucleico difiere de un acido nucleico en el hecho de que no utiliza una cadena con enlaces fosfodiester. Por ejemplo, en algunas modalidades, un acido nucleico es, comprende, o consiste en uno o mas “acidos nucleicos peptfdicos”, que se conocen en la tecnica y tienen enlaces peptfdicos en lugar de enlaces fosfodiester en la cadena principal, y se consideran dentro del alcance de la presente invencion. Alternativa o adicionalmente, en algunas modalidades, un acido nucleico tiene uno o mas enlaces fosforotioato y/o 5'-N-fosforamidita en lugar de enlaces fosfodiester. En algunas modalidades, un acido nucleico es, comprende, o consiste en uno o mas nucleosidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina, y desoxicitidina). En algunas modalidades, un acido nucleico es, comprende, o consiste en uno o mas analogos de nucleosidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3 -metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-iodouridina, C5-propinil-uridina, C5 -propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, 0(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas y combinaciones de estos). En algunas modalidades, un acido nucleico comprende uno o mas azucares modificados (por ejemplo, 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa, y hexosa) en comparacion con los de acidos nucleicos naturales. En algunas modalidades, un acido nucleico tiene una secuencia de nucleotidos que codifican un producto genico funcional tal como un ARN o protefna.
En algunas modalidades, un acido nucleico incluye uno o mas intrones. En algunas modalidades, los acidos nucleicos se preparan mediante uno o mas de lo siguiente: aislamiento a partir de una fuente natural, smtesis enzimatica por polimerizacion basada en un molde complementary (in vivo o in vitro), reproduccion en una celula o sistema recombinantes, y smtesis qmmica. En algunas modalidades, un acido nucleico es de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o mas residuos de longitud. En algunas modalidades, un acido nucleico es monocatenario; en algunas modalidades, un acido nucleico es bicatenario. En algunas modalidades un acido nucleico tiene una secuencia de nucleotidos que comprende al menos un elemento que codifica, o es el complemento de una secuencia que codifica, un polipeptido. En algunas modalidades, un acido nucleico tiene actividad enzimatica.
La frase "unido operativamente", como se usa en la presente descripcion, se refiere a una yuxtaposicion en donde los componentes descritos se encuentran en una relacion que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se une de manera tal que la expresion de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "unidas operativamente" incluyen las secuencias de control de la expresion contiguas al gen de interes y las secuencias de control de la expresion que actuan en trans o a una distancia para controlar el gen de interes. El termino "secuencia de control de la expresion" como se usa en la presente descripcion se refiere a secuencias de polinucleotidos, que son necesarias para efectuar la expresion y el procesamiento de las secuencias codificantes a las que se unen. Las secuencias control de la expresion incluyen secuencias de iniciacion de la transcripcion, terminacion, promotoras y potenciadoras adecuadas; senales eficientes para el procesamiento de ARN tales como senales de corte y empalme y poliadenilacion; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmatico; secuencias que potencian la eficiencia de la traduccion (es decir, secuencia consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las protemas; y cuando sea conveniente, secuencias que potencian la secrecion de protemas. La naturaleza de tales secuencias control difiere segun el organismo huesped. Por ejemplo, en procariotas, tales secuencias control generalmente incluyen promotor, sitio de union al ribosoma, y secuencias de terminacion de la transcripcion, mientras que en eucariotas, tfpicamente, tales secuencias control incluyen promotores y secuencias de terminacion de la transcripcion. El termino "secuencias de control" se destina a incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresion y el procesamiento, y puede incluir, ademas, componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias lfder y secuencias de pareja de fusion.
El termino "polipeptido", como se usa en la presente, se refiere a cualquier cadena polimerica de aminoacidos. En algunas modalidades, un polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos presente en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que no esta presente en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos disenada por ingeniena genetica debido a que se disena y/o se produce a traves de la accion del hombre.
El termino "recombinante", como se usa en la presente, se destina a referirse a polipeptidos (por ejemplo, protemas reguladoras de senales como se describe en la presente) que se disenan, modifican geneticamente, preparan, expresan, crean o afslan por medios recombinantes, tales como polipeptidos que se expresan con el uso de un vector de expresion recombinante transfectado en una celula huesped, polipeptidos aislados a partir de una biblioteca combinatoria de polipeptidos humanos recombinantes (Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., y Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., y Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico para genes de inmunoglobulinas humanas (ver por ejemplo, Taylor, L. D., y otros (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., y Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. y otros (2000) Immunology Today 21:364-370) o polipeptidos que se preparan, expresan, crean o afslan por cualquier otro medio que involucre el corte y empalme entre elementos de secuencia seleccionados. En algunas modalidades, uno o mas de tales elementos de secuencias seleccionados se encuentran en la naturaleza. En algunas modalidades, uno o mas de tales elementos de secuencia seleccionados se disenan in silico. En algunas modalidades, uno o mas de tales elementos de secuencia seleccionados son el resultado de la mutagenesis (por ejemplo, in vivo o in vitro) de un elemento de secuencia conocido, por ejemplo, a partir de una fuente natural o sintetica. Por ejemplo, en algunas modalidades, un polipeptido recombinante se compone de secuencias que se encuentran en el genoma de un organismo fuente de interes (por ejemplo, humano, raton, etcetera). En algunas modalidades, un polipeptido recombinante tiene una secuencia de aminoacidos que es el resultado de la mutagenesis (por ejemplo, in vitro o in vivo, por ejemplo, en un animal no humano), de manera que las secuencias de aminoacidos de los polipeptidos recombinantes son secuencias que, aunque se originan de secuencias de polipeptidos y se relacionan con estas, pueden no existir naturalmente dentro del genoma de un animal no humano in vivo.
El termino "reemplazo" se usa en la presente para referirse a un proceso a traves del cual una secuencia de acido nucleico "reemplazada" (por ejemplo, un gen) que se encuentra en un locus huesped (por ejemplo, en un genoma) se elimina de ese locus y un acido nucleico diferente de "reemplazo", se ubica en su lugar. En algunas modalidades, la secuencia de acido nucleico reemplazada y las secuencias de acidos nucleicos de reemplazo son comparables entre sf porque, por ejemplo, son homologas entre sf y/o contienen elementos correspondientes (por ejemplo, elementos que codifican protemas, elementos reguladores, etcetera). En algunas modalidades, una secuencia de acido nucleico reemplazada incluye uno o mas de un promotor, un potenciador, un sitio donante de corte y empalme, un sitio receptor de corte y empalme, un intron, un exon, una region no traducida (UTR); en algunas modalidades, una secuencia de acido nucleico de reemplazo incluye una o mas secuencias codificantes. En algunas modalidades, una secuencia de acido nucleico de reemplazo es un homologo de la secuencia de acido nucleico reemplazada. En algunas modalidades, una secuencia de acido nucleico de reemplazo es un ortologo de la secuencia reemplazada. En algunas modalidades, una secuencia de acido nucleico de reemplazo es, o comprende, una secuencia de acido nucleico humana. En algunas modalidades, que incluyen cuando la secuencia de acido nucleico de reemplazo es, o comprende, una secuencia de acido nucleico humana, la secuencia de acido nucleico reemplazada es, o comprende, una secuencia de roedor (por ejemplo, una secuencia de raton). La secuencia de acido nucleico asf colocada puede incluir una o mas secuencias reguladoras que son parte de la secuencia de acido nucleico fuente usada para obtener la secuencia asf colocada (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones 5' o 3' no traducidas, etcetera). Por ejemplo, en diversas modalidades, el reemplazo es una sustitucion de una secuencia endogena con una secuencia heterologa que da como resultado la produccion de un producto genico a partir de la secuencia de acido nucleico asf colocada (que comprende la secuencia heterologa), pero no la expresion de la secuencia endogena; el reemplazo es de una secuencia genomica endogena con una secuencia de acido nucleico que codifica una protefna que tiene una funcion similar a la de la protefna codificada por la secuencia endogena (por ejemplo, la secuencia genomica endogena codifica una protefna SIRPa, y el fragmento de ADN codifica una o mas protefnas SIRPa humanas). En diversas modalidades, un gen endogeno o un fragmento de este se reemplaza con un gen humano correspondiente o un fragmento de este. Un gen humano correspondiente o un fragmento de este es un gen humano o un fragmento que es un ortologo de, o es sustancialmente similar o igual en estructura y/o funcion, al gen endogeno o fragmento de este que se reemplaza.
La frase "protefna reguladora de senales" o "SIRP" como se usa en la presente descripcion se refiere a un receptor proteico regulador de senales, por ejemplo, un receptor de SIRPa. Los genes de SIRP incluyen un receptor de la membrana plasmatica que se expresa en la superficie de una celula y sirve como una protefna reguladora implicada en las interacciones entre las protefnas de la superficie de la membrana en los leucocitos. Dentro de los genes de SIRP, se han descrito variantes polimorficas en sujetos humanos. A modo de ilustracion, las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de los genes de SIRP de raton y humano se proporcionan en la Tabla 1. Despues de leer esta descripcion los expertos reconoceran que uno o mas genes de receptores SIRP endogenos en un genoma (o todos) pueden reemplazarse con uno o mas genes de SIRP heterologos (por ejemplo, variantes polimorficas, subtipos o mutantes, genes de otras especies, formas humanizadas, etcetera).
Una "celula que expresa SIRP" como se usa en la presente descripcion se refiere a una celula que expresa un receptor proteico regulador de senales. En algunas modalidades, una celula que expresa SIRP expresa un receptor proteico regulador de senales en su superficie. En algunas modalidades, una protefna SIRP se expresa en la superficie de la celula en una cantidad suficiente para mediar las interacciones celula a celula por medio de la protefna SIRP expresada en la superficie de la celula. Las celulas que expresan SIRP ilustrativas incluyen neuronas, linfocitos, celulas mieloides, macrofagos, neutrofilos, y celulas asesinas naturales (NK). Las celulas que expresan SIRP regulan la interaccion de las celulas inmunitarias para regular la respuesta inmunitaria a diversos antfgenos o patogenos extranos. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden demostrar una regulacion de las celulas inmunitarias por medio de receptores SIRP humanizados expresados en la superficie de una o mas celulas del animal no humano.
El termino "sustancialmente" como se usa en la presente se refiere a la condicion cualitativa de exhibir una medida o grado total o casi total de una caracterfstica o propiedad de interes. Un experto en la tecnica biologica comprendera que los fenomenos biologicos y qufmicos rara vez, o nunca, llegan a completarse y/o proceden a completar o lograr o evitar un resultado absoluto. El termino "sustancialmente" se usa, por tanto, en la presente para capturar la falta potencial de completamiento inherente en muchos fenomenos biologicos y qufmicos.
La frase "homologia sustancial" como se usa en la presente se refiere a una comparacion entre secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos. Como apreciaran los expertos en la tecnica, generalmente se considera que dos secuencias son "sustancialmente homologas" si contienen residuos homologos en las posiciones correspondientes. Los residuos homologos pueden ser residuos identicos. Alternativamente, los residuos homologos pueden ser residuos no identicos con caracterfsticas estructurales y/o funcionales adecuadamente similares. Por ejemplo, como bien conocen los expertos en la tecnica, determinados aminoacidos se clasifican tfpicamente como aminoacidos “hidrofobicos” o “hidrofflicos”, y/o con cadenas laterales “polares” o “no polares”. La sustitucion de un aminoacido por otro del mismo tipo frecuentemente puede considerarse una sustitucion "homologa". Las clasificaciones de aminoacidos tfpicas se resumen en la Tabla 1 y 2.
TABLA 1
Manila Ala A no polar neutro t a
Arginine Arg R p d a r p c a B n 4.o Asparggina Asn N p d a r neutro ■3.5
Acico aspartico Asp D pda ' negati'/o -3.5
Crebeina Cys C no polar neutro 23
Arico glutamico GL E p:1ar negative -3.5
Gluts Tiina Gh G pits' neutro -3.5
Gtisn G* G no polar neutro -a.4 hfcicfcia His H polar positive -3.2
lutein ra lie 1 no polar neutro 4.5
Leucaia Lni L no polar neutro 3.3
Lisina Lys K polar pcsitivn -3.9
Metionina Met M no polar neutro 1.9
FenIala"ina P-e F no polar neutro 2.3
Prolina P-Q P no polar neutro -1.0
Senna Se' S polar neutro -o.a Treo"i„a Thr T pits' neutro -D.7
TrialafanD Trp W no polar neutro ■OS
71 "osina Tyr Y polar neutro -1.3
Valina Val V no polar neutro 4.2
TABLA 2
Ami"MDidas aTibiguas 3 -Lefaa 14_etia
As^aragina :■ aaco aspartioD A s E
Glutamina o soioc gLlamiDO C h Z
Leuatan Is oleuc "s Xte J
Ammoarido no eapecificadD c oesioncdoo Xaa X
Como se conoce bien en esta tecnica, las secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos pueden compararse con el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informaticos comerciales tales como BLASTN para las secuencias de nucleotidos y BLASTP, gapped BLAST, y PSI-BLAST para las secuencias de aminoacidos. Programas ilustrativos de este tipo se describen en Altschul, y otros, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, y otros, Methods in Enzymology; Altschul, y otros, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, y otros, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, y otros, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Ademas de identificar las secuencias homologas, los programas mencionados anteriormente tfpicamente proporcionan una indicacion del grado de homologfa. En algunas modalidades, dos secuencias se consideran sustancialmente homologas si al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de sus residuos correspondientes son homologos en un tramo de residuos en cuestion. En algunas modalidades, el segmento relevante es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo en cuestion es de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o mas residuos. En algunas modalidades, el tramo en cuestion incluye residuos contiguos a lo largo de una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo en cuestion incluye residuos discontinuos a lo largo de una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo en cuestion es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o mas residuos.
La frase "identidad sustancial" como se usa en la presente se refiere a una comparacion entre secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos. Como apreciaran los expertos en la tecnica, generalmente dos secuencias se consideran "sustancialmente identicas" si contienen residuos identicos en las posiciones correspondientes. Como se conoce bien en esta tecnica, las secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos pueden compararse con el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informaticos comerciales tales como BLASTN para las secuencias de nucleotidos y BLASTP, gapped BLAST, y PSI-BLAST para las secuencias de aminoacidos. Programas ilustrativos de este tipo se describen en Altschul, y otros, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, y otros, Methods in Enzymology; Altschul y otros, Nucleic Acids Res.
25:3389-3402, 1997; Baxevanis y otros, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, y otros, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Ademas de identificar secuencias identicas, los programas mencionados anteriormente tfpicamente proporcionan una indicacion del grado de identidad. En algunas modalidades, dos secuencias se consideran sustancialmente identicas si al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de sus residuos correspondientes son identicos en un segmento relevante de residuos. En algunas modalidades, el segmento relevante es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo en cuestion es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o mas residuos.
La frase "vector de transformacion" o "constructo de transformacion" como se usa en la presente se refiere a una molecula polinucleotfdica que comprende una region de transformacion. Una region de transformacion comprende una secuencia que es identica o sustancialmente identica a una secuencia en una celula, tejido o animal diana y proporciona la integracion del constructo de transformacion en una posicion dentro del genoma de la celula, tejido o animal por medio de la recombinacion homologa. Se incluyen, ademas, las regiones de transformacion que se dirigen hacia el objetivo con el uso de sitios de reconocimiento de recombinasas sitio especfficas (por ejemplo, sitios loxP o Frt). En algunas modalidades, una construccion de transformacion de la presente invencion comprende, ademas, una secuencia de acido nucleico o gen de interes particular, un marcador de seleccion, secuencias de control y/o reguladoras, y otras secuencias de acidos nucleicos que permiten la recombinacion mediada por la adicion exogena de protefnas que ayudan o facilitan la recombinacion que involucra a dichas secuencias. En algunas modalidades, una construccion de transformacion de la presente invencion comprende, ademas, un gen de interes en su totalidad o en parte, en donde el gen de interes es un gen heterologo que codifica una protefna, en su totalidad o en parte, que tiene una funcion similar a la de una protefna codificada por una secuencia endogena.
El termino "variante", como se usa en la presente, se refiere a una entidad que muestra una identidad estructural significativa con una entidad de referencia pero difiere estructuralmente de la entidad de referencia en la presencia o el nivel de una o mas porciones qufmicas en comparacion con la entidad de referencia. En muchas modalidades, una variante se diferencia, ademas, funcionalmente de su entidad de referencia. En general, el hecho de que una entidad particular se considere adecuadamente como una "variante" de una entidad de referencia se basa en su grado de identidad estructural con la entidad de referencia. Como apreciaran los expertos en la tecnica, cualquier entidad de referencia biologica o qufmica tiene determinados elementos estructurales caracterfsticos. Una variante, por definicion, es una entidad qufmica definida que comparte uno o mas de tales elementos estructurales caracterfsticos. Para proporcionar solo algunos ejemplos, una molecula pequena puede tener un elemento estructural central caracterfstico (por ejemplo, un macrociclo central) y/o una o mas porciones colgantes caracterfsticas de manera que una variante de la molecula pequena es una que comparte el elemento estructural central y las porciones colgantes caracterfsticas pero se diferencia en otras porciones colgantes y/o en los tipos de enlaces presentes (simples vs. dobles, E vs. Z, etcetera) dentro del nucleo central, un polipeptido puede tener un elemento de secuencia caracterfstico que se compone de una pluralidad de aminoacidos que tienen posiciones designadas unas con respecto a las otras en el espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen a una funcion biologica particular, un acido nucleico puede tener un elemento de secuencia caracterfstico que se compone de una pluralidad de residuos de nucleotidos que tienen posiciones designadas unos con respecto a otros en el espacio lineal o tridimensional. Por ejemplo, una variante de polipeptido puede diferenciarse de un polipeptido de referencia como resultado de una o mas diferencias en la secuencia de aminoacidos y/o una o mas diferencias en las porciones qufmicas (por ejemplo, carbohidratos, lfpidos, etcetera) unidas covalentemente a la cadena principal del polipeptido. En algunas modalidades, una variante de polipeptido muestra una identidad de secuencia general con un polipeptido de referencia que es al menos de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, o 99 %. Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, una variante de polipeptido no comparte al menos un elemento de secuencia caracterfstico con un polipeptido de referencia. En algunas modalidades, el polipeptido de referencia tiene una o mas actividades biologicas. En algunas modalidades, una variante de polipeptido comparte una o mas de las actividades biologicas del polipeptido de referencia. En algunas modalidades, una variante de polipeptido carece de una o mas de las actividades biologicas del polipeptido de referencia. En algunas modalidades, una variante de polipeptido muestra un nivel reducido de una o mas actividades biologicas en comparacion con el polipeptido de referencia. En muchas modalidades, un polipeptido de interes se considera una “variante” de un polipeptido original o de referencia si el polipeptido de interes tiene una secuencia de aminoacidos que es identica a la del original excepto por un pequeno numero de alteraciones de la secuencia en posiciones particulares. Tfpicamente, menos de 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % de los residuos en la variante estan sustituidos en comparacion con el original. En algunas modalidades, una variante tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuo sustituido en comparacion con un original. Frecuentemente, una variante tiene un numero muy pequeno (por ejemplo, menos de 5, 4, 3, 2 o 1) de residuos funcionales sustituidos (es decir, residuos que participan en una actividad biologica particular). Ademas, tfpicamente, una variante no tiene mas de 5, 4, 3, 2, o 1 adiciones o deleciones, y frecuentemente no tiene adiciones o deleciones, en comparacion con el original. Por otra parte, cualquiera de las adiciones o deleciones son tfpicamente menores que aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 19, aproximadamente 18, aproximadamente 17, aproximadamente 16, aproximadamente 15, aproximadamente 14, aproximadamente 13, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, y comunmente son menores que aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, o aproximadamente 2 residuos. En algunas modalidades, el polipeptido original o de referencia es uno que se encuentra en la naturaleza. Como entenderan los expertos en la tecnica, una pluralidad de variantes de un polipeptido de interes particular puede encontrarse comunmente en la naturaleza, particularmente cuando el polipeptido de interes es un polipeptido agente infeccioso.
El termino "vector', como se usa en la presente, se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al cual se asocia. En algunas modalidades, los vectores son capaces de replicarse de manera extracromosomica y/o expresar los acidos nucleicos a los que se encuentran unidos en una celula huesped tal como una celula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresion de genes unidos operativamente se denominan en la presente "vectores de expresion."
El termino “de tipo silvestre” como se usa en la presente descripcion, tiene el significado que se entiende en la tecnica que se refiere a una entidad que tiene una estructura y/o actividad como la que se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto “normal” (a diferencia del mutante, enfermo, alterado, etcetera). Los expertos en la tecnica apreciaran que los genes y polipeptidos de tipo silvestre existen frecuentemente en multiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).
Descripcion detallada de la invencion
En la presente descripcion se describen, entre otras cosas, animales no humanos mejorados y/o modificados geneticamente que tienen material genetico humanizado que codifica una protefna reguladora de senales (por ejemplo, SIRP) para ensayos de trasplante de injertos, activacion de la fagocitosis y transduccion de senales. Se contempla que tales animales no humanos proporcionan un mejoramiento en el trasplante de injertos de celulas humanas. Por lo tanto, la presente descripcion es particularmente util para mantener celulas hematopoyeticas humanas en animales no humanos. Particularmente, la presente descripcion abarca la humanizacion de un gen de SIRPa de roedor que da lugar a la expresion de una protefna humanizada en la superficie de la membrana plasmatica de celulas del animal no humano. Tales protefnas humanizadas tienen la capacidad de reconocer celulas humanas injertadas por medio de la participacion de las protefnas SIRPa humanizadas y los ligandos presentes en la superficie de las celulas humanas injertadas. En la presente descripcion se describe que los animales no humanos son capaces de recibir celulas hematopoyeticas humanas trasplantadas; tales mamfferos no humanos pueden desarrollar y/o tener un sistema inmunitario que comprende celulas humanas. Las protefnas SIRPa humanizadas pueden tener una secuencia correspondiente a los residuos de aminoacidos 28 - 362 de una protefna SIRPa humana. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden comprender un gen de SIRPa endogeno que contiene material genetico del animal no humano y una especie heterologa (por ejemplo, un ser humano). Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden comprender un gen de SIRPa humanizado, en donde el gen de SIRPa humanizado comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano.
Diversos aspectos de la invencion se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no significa que limite la invencion. Cada seccion puede aplicarse a cualquier aspecto de la invencion. En esta solicitud, el uso de “o” significa “y/o” a menos que se indique de cualquier otra manera.
Familia de genes de la protefna reguladora de senales (SIRP)
Las protefnas reguladoras de senales (SIRP) constituyen una familia de glicoprotefnas de la superficie celular que se expresan en linfocitos, celulas mieloides (que incluyen macrofagos, neutrofilos, granulocitos, celulas dendrfticas mieloides, y mastocitos) y neuronas (por ejemplo, ver Barclay y Brown, 2006, Nat Rev Immunol 6, 457-464). Se ha informado de numerosos genes de SIRP y estos pueden categorizarse por sus ligandos respectivos y los tipos de senalizacion donde estan implicados. SIRPa (referido ademas como CD172A, SHPS1, P84, MYD-1, BIT y PTPNS1) se expresa en celulas inmunitarias del linaje mieloide y funciona como un receptor inhibitorio por medio de un motivo inhibidor basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM). La expresion de SIRPa se ha observado ademas en neuronas. Los ligandos informados para SIRPa incluyen, mas notablemente, CD47, pero ademas incluyen las protefnas tensoactivas A y D. SIRPp (referido ademas como CD172b) se expresa en macrofagos y neutrofilos, sin embargo, no se han informado ligandos conocidos. SIRPp contiene una region citoplasmatica corta en comparacion con SIRPa y se conoce que se asocia con un componente de senalizacion conocido como protefna 12 de activacion de DNAX (DAP12). Asf, SIRPp parece ser un receptor de activacion. SIRPy (referido ademas como CD172g y SIRPp2) se expresa en linfocitos y celulas asesinas naturales y ademas se une a CD47, sin embargo, no se ha informado una funcion de senalizacion ya que la cola citoplasmatica solo contiene cuatro aminoacidos y carece de una secuencia que pudiera facilitar la asociacion con DAP12. Otro miembro, SIRP6, se ha descrito y existe como un receptor soluble.
El papel de SIRPa, en particular, se ha investigado con respecto a su papel inhibidor en la fagocitosis de celulas huesped por macrofagos. Por ejemplo, la union de CD47 a SIRPa en los macrofagos, activa senales inhibidoras que regulan negativamente la fagocitosis. Alternativamente, se han informado efectos de senalizacion positiva mediados a traves de la union a SIRPa (Shultz y otros, 1995, J Immunol 154, 180-91).
Secuencias de SIRPa
En la Tabla 3 se exponen secuencias ilustrativas de SIRPa para humano y raton. Para las secuencias de ADNc, los exones consecutivos estan separados por texto subrayado alternante. Para las secuencias de protefnas, los peptidos senal estan subrayados y las secuencias transmembrana y citoplasmatica estan en letras cursivas.
TABLA 3
ADNc de raton de
SIRPq GCGCTCGGCCGGGCCGCCCTCGCGCTGGCCTCGCGACGGCTC
NM_007547.3 CGCACAGCCCGCACTCGCTCTCCGAGCTGTCCCCGCTCCCGCT
TGCTCTCCGATCTCCGTCCCCGCTCCCTCTCCCTCTTCCTCTCC CC CTCTTTCCTTCTCCCTCGCTAT C CGCT CCCC CGCC CCCGTG C CTCTGG CTCTGCG CCTGGCTCCCTC G GGTCCGCTCCCCTTTCCC GCCGGCCTGGCCCGGCGTCACGCTCCCGtjAGTCTCCCCtjCTCG
GC G GC GTCT CATTGTGGGAGGGG GTCAGATCACCCC GCCGGG C G GTG GCGCT GG G G G G GAG CGGAGGG G GAGG GGCCTTAGTC GTTC G CCCGCG CCGCCCG CCCC CCTGCCG AC CGCGCT CACC G C CGCTCTCCCTCCTTGCTCTGCAGCCCCGGCCCATGGAGCCCGC CGG CCCGGCCCCTGG CCGCCT AGGGC CGCT GCT GCTCTGCCT G CTGCTCTCCGCGTtt T G T T K TG T A( ’ AGG AGC C ACGGGG A AGG
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Protema SlRPo de
ratdn M E PA GPAP GRLGPLLLCLLLSASCFCTGATGKE LKVTOPE K $ V $ V NP_031573.2 AAGD S TVLN CTLTSLLPVGPIRWTRGV GPS RLLIY S FAGEYVPRI RNVSDTTKRNNMDFS1BJSNVTPADAGIYYC VKFQKGSSEPDTEI QSGGCT E V Y V L AKPS P P EVSG PADRG1P DQKVN FTC KSHGFSPRN ITLKWFKDGQELHPL ETTVNPSGKNVSYMSSTVEW LNSMDVN SKVTCEVAHITLDRSPLRGIANLSNFIRVSPTVKVTQQSPTSMNQV N LTCR A CRT Y PCD LQ LI WLENGNVS RN DTPKN LTKN1 D GT YN Y T SLFLVNSSAHREDVVFTCQVKHDQQPAITRNHTVLGFAHSSrXJG SMQTF p DNNA THNWNVFIG EG’ VA CALL VVL LMA ALYLL RIKQKKAK GSTSSTRLHEPEKNA REiTQIQD TNDINDITYADLNLPKEKKPAPRA P EPNNHTE YASIE TGKVPRPED TL TYA DLDMVHLSRA QPA PKPEPSFS EYASVQVQRK (sec. con num. de ident.: 2)
ADM humano de
SIRPa T CCGGCC C G CACC CA CCC C C AAGAGGGG CCTTC AGCTTTGGG NM_ 001040022.1 GCTCAGAGGCACGACCTCCTGGGGAGG GTTAA AAGGCAGACG CCCCCCCGCCCCCC G CG CC CCCGC GCCCCG ACTC C TTCGC CC C CTCC A G CCTCTC G CC A GTGGG A AGCGGGG AGC A G CCGCGCGG CCGG A GTCCGG AGGCG AGGG GAGGTCG G CCGC A ACTTCCCCG GTCCACCTTAAG AGO ACG ATOTAG CCAGCTCGCAG CG CTGAC CTTA G A A A A AC A AG'JTIGCGC A A A G 1GG AGCGGGG ACCCGGC CTCTGGGCAGCCCCGGCGGCGCTTCCAGTGCCTT CC AGCCCTC GCGGGCGG CGCAGC CGCGGCCCATGGAGCCC GCCGGCC CGGC CCCCGCCCGCCTCGGGCCGCTG(:TCTGrcTG(TGCTCGC(’G rG T (’(T(}CG(XTGGTCAGfiAGTC,G(’GGCiTf}AGf}AGGAGrTfiCAG GTGATTCAGCCTGACAAGTCCGTGTTGGTTGCAGCTGGAGAG ACAOCC ACTCTGCGCTGCACIGCG AOCTCTCTGA rC CCTGTGG GGCCC ATCC AGTGGTTC A G AGG AGCTGG ACC AGGCCGGG A AT TAATCTA C A ATC A A A A A G A A G G CC ACTTCCCCCGGGT A AC A A CTGTTTCAGACCTC AC AAAG AG AAAC AAC ATGGACTTTTCCAT CCGC ATCGGTAACATC ACCCC AGCAGATGCCGGCACCTACTA
C 1G 1 G 1G A AGP r CCG G A A AGGG AGCCCCG ATG ACG IGG AGTT T AAGTCTGG A GCAGGCACT GAG CTGTCT GTGGGC G CCAAACC CTCTG CCC CCGTG GT ATC GGGCCCTG CG G CG A GGGCC A C A CCT CAGC AC ACAHTG AnCTTCACCTGCG AGTCCCACGGCTTCTCAC CC AGAG AC ATC ACCCTGAAATGGTTCAAAAATGGG AATG AGC TCTC: A G A C TTf XT AG ACC AA f ’( JTG G ACC ( CGT A GG A G A G A G.CG TO'rC CTAC AGC ATCC A C AG C AC AGC C A A G G IGG 1 GC 1G ACC C GCG A G G A CGT L C AC 1CTCAAGTCATCTGCG AG G I GGCC C A CG TC ACCTTGC A GGGGG A CCC TC TTC GTG G G A CTGCC A A CTTGTC TO A GA CCATCCG AGTTCCAC CCA CCTTGGAG G TTA CTCA ACAC CCCCTGAGCCCAGAGAACCAGCTGAATGTCACCTGCCAGGTG AGCAAGTTCTACCCCCAGAGACTACAGCTGACCTGGTTGGAG AATGGAAACGTGTCCCG GAC AG A A ACGGCCTCAACCGTTACA G AG A AC A AGG ATGGT ACCT AC A ACTGG ATG AGCTG GCTCCTG GTGAATGTATCT GCCCACAGG GATGATGT GAAGCT CACCTGC CAGGTGGAGCATGACGGGCAGCCAGCGGTCAGCAAAAGCCAT GAC CTG AA GGTCTC A GC DC AC CC GAAGG AG€ A GGGCTCAAAT AC CGCC G CTGAGAACACTGGATCTAATGAACGG AACAT C TAT ATTGTGGTGGGTGTGGTGTGCACCFTGCTGOrOGCCCTACTGA TOGCGGCCC' 1 C r ACC FCGTCCG A A'DCA GACAG A A G A A AG CC(: AGG G t ICC AC IT C 1 IT T ACAAGCTTG C A IG AGCCC G AG A A GA atgccagagaaataacacaggacacaaatgatatcacatatg C AG ACCTG A ACCTGC CC A AGGG G A AG A AGCCT GCTCC CC AGG CTGC GG AGCC CA ACA ACC AC ACGG AGT ATGCCA GCATTCA G A CC AGCCCG C AGCCCGCGTCGG AGG AC AC CCTC ACCT ATGCTG AC CTOG AC ATOGTCC ACCTCAACCG Q AC CC CCAAGC AGCCG G CCC CC A A GCtTTGA GCCGTCC TTCTCAGAG TACGCC A GC GTCC A GGTC CC GAGGAAGTGAATGGGAC CGTGG TTTGC TCTAGCAC C CATC TCTACGCGCTTTCTTGTCCCAC AG G GAGC C G CC GTGATO AGCACAGCCAACCCAGTTCCCGGAGGGCTGGGGCGGTGCAGG CTCTGGG AC CC AGGGGCC A GGGTGGCTCTTCTCTCC CC ACGCC TCCTTGGCTCTCXAGCA CTTCCTGGGC AGCCACGGCC CC CTCC CCC CAC ATTGCCACAT ACC TG Q AGGCTGA CGTTO CCAAACCA GC CAG G GAACC AACCTG GGAAG TG GCCAGAACTG CC TC. GGGT CCAAGAACTC TTGTGCCT CC G TCCAT CACCATGTGG GT T TTGA AG A CCCTCG ACTGCCTCCCCG ATGCTCCGA A GC CTG ATCTTCC AGGGTGGGGAGGAGAAAATCCCACCTCCCCTGACCTCCACCA CCTCCACCACC ACCAC CACCACCACCACC ACC ACTACCACCAC CACC CAA CTGOG GCTAG AGT GGGG AAGATTTCCC CTTT A GAT CAAACTGOCCCTTCCATGGAAAAGCTGGAAAAAAACTCTGGA ACCC ATATCC AGG CTT GGTGAGGTTGCTGC CAACAGTCCTGGC CTCCCCCATCCCTAGGCTAAAGAGCCATGAGTCCTGGAGGAG GAG AGG ACCCCTCOC A A A GG ACTGG AG A C A A AACCCTCIGCT TCC TTGGGTCCCTC CAAGACTCCC TGGGGCCCAA CTGTGTTGC TCCACCCGG ACCC AT CTCTCCCTT CT AG ACCTG AGCTTGCCCC TCC AGCT AGCAC l A A GC A A CATCTCGCTGTGG ACGCCTGT A A A r FACTGAG A A A i’G 1GAAACG 1 GCA A 1C \ IGA AAC TO AG GTG TTA G A A A ACTTG ATC T GT GGTG T T T T G m LG I I 11 ITTTCTTA AAACAACAGCAACGTGATCTTGGCTGTCTGTCATGTGTTGAAG TCCATGGTTGCGTCTTGTGAAGTCTGACGTTTAACACTTTGTT GTCCTGG AGGG A 1TT1CTIACAG CGAAGA CTTGAGTTCCTCC A AGTC CC AGAACC CCAAGAATGG G C AAGAAGGATCAGGTCAGC
(:AC TCtXTG G AG ACAC AGCCTTCTGGCTGGG A CTG A CTTGGCC ATGTTt^TC AGCTG AGCCA CGCGGCTGGT AGTGC AGCCTTC^TGT GACCCCGCTGTGGTA A OTCCAOCCTGC CCAOOGCT G CTGAG G GCTGCCTCTTGAC AGTGC AGTCTTATCGAG AC CCA ATGC CTC A GTCTGCTC A TCC GT A A ACTGG GG AT AGTG A AG ATG AC AGCCC TCC CCAC C AC CTC TCATAAGCAC T IT AGG AAC AC AC AG AGGG TAGGGATAG TG G C C CTGGC CGTCTATCCTACC CCTTTAGTGAC CGCCCCCATCCCGGCTTTCTGAGCTGA TCGTTG A A G A A G A A AT CTTCC ATTTCTGCTCTC A A AGCCT ACTGGGATCAAACTGGAAT AAA TTG A AG AC AGCC AGGG GG ATGGT GC.AGCTGTG A AGCTCG GGC TGATTCC CCCTCTGTCCCAQAAG GTTGGC CAQA GGGTGTG AC CCAGTTACC C TTTAACCC CCAC CC TTC CAGT CGG GTG T G AG GGC CTGA TT CC G GGCCC AGG G CAAG C A G ATGTCGCAAG CC CT AT ATTC AGTCTT C ACTA 1 AAC TCT FAG AGTTG AG ACGCJ AATG TTCATGACTCCT g g c c t t g o g ATGC CCa a GGG ATTTC t g g c t c AGGCt G t Aa a a Gt a GCTGAGC Ca t CCt G CCC A tT C CTGGA GG fCCTACAGGTG A AA CTGC AGC AG CTCA G CATAC ACCCAGCTC TCTG G G GG ATGGTC ACCTGGTG ATTTC A ATG ATGGC ATCCAGG A ATTAGCTG AGCC A AC AG ACC ATG TG G AC AGCTTTGG CC AG A GCTCCCGTGTGGC ATCTGG G A GC C AC AGTC ACCC AGCC ACCT GGCTC A G G CT AGTTC C A A A TTCC A A A AG ATTGGCTTGT A A A CC
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(sec. con num. de ident.: 3)
proteins SIRPa
humana MEPAGPAP G FLLGPL L C L L LAAS CAWS GVAGEE ELOVIOPDKSVL
NP_ 001035111.1 VAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPR
Y TTV SD LTKRNNMDF SIRIGNTTPADAGTYYCVKFRKGS FDDVEF KSG A GT ELS VR A KP S A P W S G P A A R ATPQ HT V S FTC ES H G F SPRD ITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYS1HSTAKWLTREDVHS QVIC EVAHVTLQ QDPL RGTANL SET IRVP PTLEVTQQPVRAENQV NVTCQVRKFYP QRLQLTWLENG NVS RT ET.AS TVT ENKD G TYNW MSWLLVNVSAHRDDVK1TCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPK EQGSNTAA ENTGSNERNIIIYVG VYCTLL VA LIMA ALYL VRiRQKKA QGSTSSTRL HEPEKNASE. JTQDTNDJTYA DLNLPKGKKPA PQA AEPN
NH TE YASIQTSPQPA SED TL TYADLDMVHLNR TPKOPA PKPEPSF5EY ASVQVPRK (sec. con num. de ident.: A)
proteins SIRPa
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Animates no humanos con SIRPa humanizado
Se describen animales no humanos que expresan protefnas SIRPa humanizadas en la superficie de celulas inmunitarias (por ejemplo, celulas mieloides) de los animales no humanos como resultado de una modificacion genetica de un locus endogeno del animal no humano que codifica una protefna SIRPa. Los ejemplos adecuados descritos en la presente descripcion incluyen roedores, particularmente, ratones.
Un gen de SIRPa humanizado, descrito en el presente documento puede comprender material genetico de una especie heterologa (por ejemplo, seres humanos), en donde el gen de SIRPa humanizado codifica una protefna SIRPa que comprende la porcion codificada del material genetico de la especie heterologa. Un gen de SIRPa humanizado descrito en el presente documento puede comprender ADN genomico de una especie heterologa que corresponde a la porcion extracelular de una protefna SIRPa que se expresa en la membrana plasmatica de una celula. Se proporcionan, ademas, animales no humanos, embriones, celulas y construcciones de transformacion para producir animales no humanos, embriones no humanos, y celulas que contienen dicho gen de SIRPa humanizado.
Puede eliminarse un gen endogeno de SIRPa. Un gen endogeno de SIRPa puede alterarse, en donde una porcion del gen endogeno de SIRPa se reemplaza con una secuencia heterologa (por ejemplo, una secuencia de SIRPa humana en su totalidad o en parte). La totalidad o sustancialmente la totalidad de un gen de SIRPa endogeno se reemplaza con un gen heterologo (por ejemplo, un gen de SIRPa humano). Una porcion de un gen heterologo de SIRPa puede insertarse en un gen endogeno de SIRPa no humano en un locus endogeno de SIRPa. El gen heterologo puede ser un gen humano. La modificacion o humanizacion puede realizarse a una de las dos copias del gen endogeno de SIRPa, lo que da lugar a un animal no humano que es heterocigoto con respecto al gen de SIRPa humanizado. Se describe un animal no humano que es homocigoto para un gen de SIRPa humanizado.
Un animal no humano descrito en el presente documento contiene un gen de SIRPa humano en su totalidad o en parte en un locus endogeno de SIRPa no humano. Asf, tales animales no humanos pueden describirse como que tienen un gen de SIRPa heterologo. El gen de SIRPa reemplazado, insertado o modificado en el locus de SIRPa endogeno puede detectarse con el uso de una variedad de metodos que incluyen, por ejemplo, PCR, transferencia de Western, transferencia de Southern, polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccion (RFLP), o un ensayo de ganancia o perdida de alelos. El animal no humano puede ser heterocigoto con respecto al gen de SIRPa humanizado
Un gen de SIRPa humanizado descrito en el presente documento incluye un gen de SIRPa que tiene un segundo, tercero y cuarto exones donde cada uno tiene una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) identica a un segundo, tercero y cuarto exones que aparecen en un gen de SIRPa humano de la Tabla 3.
Un gen de SIRPa humanizado descrito en el presente documento incluye un gen de SIRPa que tiene una secuencia nucleotfdica codificante (por ejemplo, una secuencia de ADNc) al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) identica a los nucleotidos 352 - 1114 que aparecen en un ADNc humano de una secuencia de SIRPa de la Tabla 3.
Una protefna SIRPa humanizada producida por un animal no humano descrito en el presente documento puede tener una porcion extracelular con una secuencia que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) identica a una porcion extracelular de una protefna SIRPa humana que aparece en la Tabla 3.
Una protefna SIRPa humanizada producida por un animal no humano descrito en el presente documento puede tener una porcion extracelular que tiene una secuencia que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) identica a los residuos de aminoacidos 28 - 362 que aparecen en una protefna SIRPa humana de la Tabla 3.
Una protefna SIRPa humanizada producida por un animal no humano descrito en el presente documento puede tener una secuencia de aminoacidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) identica a una secuencia de aminoacidos de una protefna SIRPa humanizada que aparece en la Tabla 3.
Se describen composiciones y metodos para producir animales no humanos que expresan una protefna SIRPa humanizada, que incluye formas polimorficas especfficas o variantes alelicas (por ejemplo, diferencias en un solo aminoacido) que incluyen composiciones y metodos para producir animales no humanos que expresan tales protefnas a partir de un promotor humano y una secuencia reguladora humana. Se describen ademas composiciones y metodos para producir animales no humanos que expresan tales protefnas a partir de un promotor endogeno y una secuencia reguladora endogena. Los metodos incluyen insertar el material genetico que codifica una protefna SIRPa humana en su totalidad o en parte en una ubicacion precisa en el genoma de un animal no humano que corresponde a un gen endogeno de SIRPa para crear de esta manera un gen de SIRPa humanizado que expresa una protefna SIRPa que es humana en su totalidad o en parte. Los metodos pueden incluir insertar ADN genomico correspondiente a los exones 2 - 4 de un gen de SIRPa humano en un gen endogeno de SIRPa del animal no humano para crear de esta manera un gen humanizado que codifica una protefna SIRPa que contiene una porcion humana que contiene los aminoacidos codificados por los exones insertados.
Un enfoque de un gen de SIRPa humanizado emplea una modificacion relativamente minima del gen endogeno y puede dar como resultado una transduccion natural de senales mediadas por SIRPa en el animal no humano, porque la secuencia genomica de las secuencias de SIRPa se modifican en un solo fragmento y por lo tanto retienen la funcionalidad normal al incluir las secuencias reguladoras necesarias. Asf, la modificacion del gen de SIRPa puede no afectar otros genes cercanos u otros genes endogenos de SIRP. Ademas, la modificacion puede no afectar el ensamblaje de un receptor funcional en la membrana celular y mantiene sus funciones efectoras normales por medio de la union y posterior transduccion de senales a traves de la porcion citoplasmatica del receptor que no se afecta por la modificacion.
Una ilustracion esquematica (no a escala) de un gen de SIRPa endogeno murino y un gen de SIRPa humanizado se proporciona en la Figura 1. Como se ilustra, el ADN genomico que contiene los exones 2 - 4 de un gen de SIRPa humano se inserta en un locus de un gen de SIRPa endogeno murino mediante una construccion de transformacion. Este ADN genomico incluye la porcion del gen que codifica una porcion extracelular (por ejemplo, los residuos de aminoacidos 28 - 362) de una protefna SIRPa humana responsable de la union a ligandos.
Un animal no humano (por ejemplo, un raton) que tiene un gen de SIRPa humanizado en el locus de SIRPa endogeno puede producirse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, puede producirse un vector de transformacion que introduce un gen de SIRPa humano en su totalidad o en parte con un gen marcador de seleccion. La Figura 1 ilustra un genoma de raton que comprende una insercion de los exones 2 - 4 de un SIRPa humano. Como se ilustra, la construccion de transformacion contiene un brazo de homologfa en 5' que contiene una secuencia corriente arriba del exon 2 de un gen de SIRPa endogeno murino, seguido por un fragmento de ADN genomico que contiene los exones 2 - 4 de un gen de SIRPa humano, un casete de seleccion por farmacos (por ejemplo, un gen de resistencia a la neomicina flanqueado en ambos extremos por secuencias loxP), y un brazo de homologfa en 3' que contiene una secuencia corriente abajo del exon 4 de un gen de SIRPa endogeno murino. Despues de la recombinacion homologa, los exones 2 - 4 de un gen de SIRPa endogeno murino se reemplaza por la secuencia contenida en el vector de transformacion. Se crea un gen de SIRPa humanizado que da como resultado una celula o animal no humano que expresa una protefna SIRPa humanizada que contiene los aminoacidos codificados por los exones 2 - 4 de un gen de SIRPa humano. El casete de seleccion por farmacos puede eliminarse opcionalmente mediante la adicion posterior de una recombinasa (por ejemplo, mediante tratamiento con Cre).
Ademas de ratones que tienen genes de SIRPa humanizados como se describe en el presente documento, en el presente documento se describen ademas otros animales no humanos modificados geneticamente que comprenden genes de SIRPa humanizados. Tales animales no humanos pueden comprender un gen de SIRPa humanizado unido operativamente a un promotor endogeno de SIRPa. Tales animales no humanos pueden expresar una protefna SIRPa humanizada a partir de un locus endogeno, en donde la protefna SIRPa humanizada comprende los residuos de aminoacidos 28 - 362 de una protefna SIRPa humana.
Tales animales no humanos pueden seleccionarse del grupo que consiste en un raton, rata, conejo, cerdo, bovino (por ejemplo, vaca, toro, bufalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, huron, primate (por ejemplo, titf, mono rhesus). Para los animales no humanos donde las celulas Es modificables geneticamente no estan disponibles facilmente, se emplean otros metodos para producir un animal no humano que comprende las modificaciones geneticas descritas en el presente documento. Tales metodos incluyen, por ejemplo, la modificacion de un genoma de celulas que no son ES (por ejemplo, un fibroblasto o una celula pluripotente inducida) y el empleo de la transferencia nuclear para transferir el genoma modificado a una celula adecuada, por ejemplo, un ovocito, y la gestacion de la celula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un animal no humano en condiciones adecuadas para formar un embrion.
Un animal no humano descrito en el presente documento puede ser un mamffero. Un animal no humano descrito en el presente documento puede ser un mamffero pequeno, por ejemplo, de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. Un animal modificado geneticamente descrito en el presente documento puede ser un roedor. Un roedor descrito en la presente descripcion puede seleccionarse de un raton, una rata, y un hamster. Un roedor puede seleccionarse de la superfamilia Muroidea. Un animal modificado geneticamente descrito en el presente documento puede ser de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hamsteres similares a raton), Cricetidae (por ejemplo, hamster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, ratones campestres), Muridae (ratones y ratas verdaderos, jerbos, ratones espinosos, ratas crestadas), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de roca, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirones espinosos), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas de bambu, y zokor). Un roedor modificado geneticamente descrito en el presente documento puede seleccionarse de un raton o una rata verdaderos (familia Muridae), un jerbo, un raton espinoso, y una rata crestada. Un raton modificado geneticamente descrito en el presente documento puede ser un miembro de la familia Muridae. Un animal no humano como se describe en la presente puede ser un roedor. Un roedor descrito en el presente documento puede seleccionarse de un raton y una rata. En algunas modalidades, un animal no humano descrito en el presente documento puede ser un raton.
En algunas modalidades, un raton de la presente invencion es de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En algunas modalidades determinadas, un raton de la presente invencion es de una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3,129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, por ejemplo, Festing y otros, 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach y otros, 2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). En algunas modalidades determinadas, un raton modificado geneticamente de la presente invencion es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En algunas modalidades determinadas, un raton de la presente invencion es una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente.
En algunas modalidades determinadas, una cepa 129 de la mezcla como se describe en la presente descripcion es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En algunas modalidades, un raton de la presente invencion es de una cepa BALB, por ejemplo, la cepa BALB/c. En algunas modalidades, un raton de la presente invencion es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente.
Un animal no humano descrito en el presente documento puede ser una rata. En algunas modalidades determinadas, una rata de la presente invencion se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F6, y Dark Agouti. En algunas modalidades determinadas, una cepa de rata como se describe en la presente descripcion, es una mezcla de dos o mas cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6, y Dark Agouti.
Metodos que emplean animales no humanos que tienen genes de SIRPa humanizados
Se han informado animales no humanos mutantes y transgenicos para SIRPa (por ejemplo, ratones) (Inagaki y otros, 2000, EMBO Journal 19(24):6721-6731; Strowig y otros, 2011, Proc. Nat. Acad. Sci. 108(32):13218-13223). Tales animales se han empleado en una variedad de ensayos para determinar los aspectos moleculares de la expresion, funcion y regulacion de SIRPa. Sin embargo, no lo han sido sin limitacion. Por ejemplo, el uso de ratones mutantes para SIRPa se ha limitado debido a las condiciones perjudiciales para la salud que resultan de la incapacidad de las celulas que contienen la forma mutante de SIRPa frente a la senal. Ademas, dado que CD47, un ligando de SIRPa, pudiera estar presente en la misma celula que la forma mutante de SIRPa y ambas protefnas son capaces de proporcionar senales intracelulares, no es posible distinguir si tales resultados provienen de la ausencia de senalizacion de SIRPa o la ausencia de union a CD47. En el caso de los ratones transgenicos para SIRPa humano, el SIRPa de raton esta intacto y funcional. Asf, las funciones dependientes de SIRPa en diversos procesos biologicos (por ejemplo, injertos) no pueden atribuirse claramente a la funcion de SIRPa humano o SIRPa de raton solas en estos ratones ya que ambos receptores SIRPa humano y de raton estan presentes y funcionales.
Los animales no humanos descritos en el presente documento proporcionan un sistema in vivo mejorado y una fuente de materiales biologicos (por ejemplo, celulas) que expresan SIRPa humano, los cuales son utiles para una variedad de ensayos. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse para desarrollar agentes terapeuticos que se dirijan a SIRPa y/o modulen la senalizacion SIRPa-CD47. En diversas modalidades, los ratones de la presente invencion se usan para tamizar y desarrollar agentes terapeuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos) que se unen al SIRPa humano. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse para determinar el perfil de union de antagonistas y/o agonistas al SIRPa humanizado en la superficie de una celula de un animal no humano como se describe en el presente documento.
Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse para medir el efecto terapeutico de bloquear o modular la transduccion de senales de SIRPa (por ejemplo, fosforilacion) y el efecto sobre la expresion genica como resultado de cambios celulares. Un animal no humano descrito en el presente documento o celulas aisladas a partir de el pueden exponerse a un agente terapeutico candidato que se une a un SIRPa humano en la superficie de una celula del animal no humano y, despues de un perfodo de tiempo posterior, analizarse para determinar los efectos sobre los procesos dependientes de SIRPa, por ejemplo, proliferacion de celulas B y/o T, aclaramiento de plaquetas, e induccion de la expresion de citocinas.
Los animales no humanos descritos en el presente documento expresan una protefna SIRPa humanizada, por lo tanto pueden generarse celulas, lfneas celulares, y cultivos celulares para servir como una fuente de SIRPa humanizado para usar en ensayos de union y funcionalidad, por ejemplo, para ensayar la union o funcion de un antagonista o agonista de SIRPa, particularmente cuando el antagonista o agonista es especffico para una secuencia o epftopo de SIRPa humano. Una protefna SIRPa humanizada expresada por un animal no humano como se describe en el presente documento puede comprender una variante de la secuencia de aminoacidos. Se han informado variantes de protefnas SIRPa humanas que tienen variaciones asociadas con los residuos de union al ligando. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden expresar una variante de una protefna SIRPa humanizada. La variante puede ser polimorfica en una posicion de aminoacido asociada con la union al ligando. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse para determinar el efecto de union al ligando a traves de la interaccion con una variante polimorfica de SIRPa humana.
Las celulas de los animales no humanos descritos en el presente documento pueden aislarse y usarse sobre una base ad hoc, o pueden mantenerse en cultivo por muchas generaciones. Las celulas de un animal no humano descrito en el presente documento pueden inmortalizarse y mantenerse en cultivo indefinidamente (por ejemplo, en cultivos en serie).
Las celulas de animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse en un ensayo de dispersion o migracion celular para tamizar y desarrollar agentes terapeuticos candidatos que modulen el SIRPa humano. T ales procesos son necesarios para muchos procesos celulares que incluyen la cicatrizacion de heridas, la diferenciacion, la proliferacion y la supervivencia.
Las celulas de animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse en ensayos de clonacion para celulas megacariodticas formadoras de colonias para analizar los aspectos farmacotoxicologicos de agentes terapeuticos candidatos que se dirigen a SIRPa humano.
Las celulas de animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse en ensayos de fagocitosis para determinar el potencial terapeutico de compuestos o agentes biologicos que modulen la regulacion de la fagocitosis dependiente de SIRPa.
Los animales no humanos descritos en el presente documento proporcionan un sistema in vivo para el analisis y prueba de un farmaco o vacuna. Un farmaco o vacuna candidato puede suministrarse a uno o mas animales no humanos descritos en el presente documento, seguido del control de los animales no humanos para determinar una o mas respuestas inmunitarias frente al farmaco o vacuna, el perfil de seguridad del farmaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afeccion. Tales farmacos o vacunas pueden mejorarse y/o desarrollarse en tales animales no humanos.
Los animales no humanos descritos en el presente documento proporcionan un sistema in vivo mejorado para elucidar los mecanismos de la interaccion de celula a celula humana a traves de transferencia adoptiva. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden implantarse con un xenoinjerto de tumor, seguido de un segundo implante de linfocitos infiltrantes de tumores que pueden implantarse en los animales no humanos mediante transferencia adoptiva para determinar la eficacia en la erradicacion de tumores solidos u otras enfermedades malignas. Tales experimentos pueden realizarse con celulas humanas debido a la presencia exclusiva de SIRPa humano sin competencia con SIRPa endogeno del animal no humano. Ademas, las terapias y los agentes farmaceuticos para usar en el xenotrasplante pueden mejorarse y/o desarrollarse en tales animales no humanos.
Los animales no humanos descritos en el presente documento proporcionan un sistema in vivo mejorado para el mantenimiento y desarrollo de celulas madre hematopoyeticas humanas a traves del injerto. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden proporcionar un mejor desarrollo y mantenimiento de las celulas madre humanas dentro del animal no humano. Puede observarse un aumento de las poblaciones de celulas B y T humanas diferenciadas en la sangre, la medula osea, el bazo y el timo del animal no humano. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden proporcionar un aumento en el nivel del injerto de celulas humanas en comparacion con animales no humanos que expresan SIRPa de raton y humana.
Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden emplearse para evaluar la eficacia de un farmaco terapeutico dirigido a celulas humanas. Un animal no humano descrito en el presente documento puede recibir un trasplante de celulas humanas, y un candidato a farmaco dirigido a dichas celulas humanas se administra a dicho animal no humano. Despues se determina la eficacia terapeutica del farmaco mediante el control de las celulas humanas en el animal no humano despues de la administracion del farmaco. Los farmacos que pueden someterse a prueba en los animales no humanos incluyen compuestos moleculares pequenos, es decir, compuestos de pesos moleculares menores que 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD, u 800 dalton, y compuestos moleculares grandes (tales como protemas, por ejemplo, anticuerpos), que tienen efectos terapeuticos previstos para el tratamiento de enfermedades y afecciones humanas al dirigirse a celulas humanas (por ejemplo, union a ellas y/o accion sobre ellas).
El farmaco puede ser un farmaco anticancengeno, y las celulas humanas pueden ser celulas cancerosas, que pueden ser celulas de un cancer primario o celulas de lmeas celulares establecidas a partir de un cancer primario. En estos aspectos, un animal no humano descrito en el presente documento recibe un trasplante de celulas cancerosas humanas, y se le suministra un farmaco anticancengeno al animal no humano. La eficacia del farmaco puede determinarse al evaluar si el crecimiento o la metastasis de las celulas cancerosas humanas en el animal no humano se inhibe como resultado de la administracion del farmaco.
El farmaco anticancengeno puede ser una molecula de anticuerpo, que se une a un antfgeno en las celulas cancerosas humanas. El farmaco anticancengeno puede ser un anticuerpo biespedfico que se une a un antfgeno en las celulas cancerosas humanas, y a un antfgeno en otras celulas humanas, por ejemplo, celulas del sistema inmunitario humano (o "celulas inmunitarias humanas") tales como celulas B y celulas T.
Un animal no humano descrito en el presente documento puede recibir un injerto de celulas inmunitarias humanas o celulas que se diferencian en celulas inmunitarias humanas. Dicho animal no humano con las celulas inmunitarias humanas injertadas recibe un trasplante de celulas cancerosas humanas, y recibe una administracion de un farmaco anticancengeno, tal como un anticuerpo biespedfico que se une a un antfgeno sobre las celulas cancerosas humanas y a un antfgeno sobre las celulas inmunitarias humanas (por ejemplo, celulas T). La eficacia terapeutica del anticuerpo biespedfico puede evaluarse en base a su capacidad para inhibir el crecimiento o las metastasis de las celulas cancerosas humanas en el animal no humano. El animal no humano descrito en el presente documento puede recibir un injerto de celulas progenitoras hematopoyeticas humanas CD34+ que producen celulas inmunitarias humanas (que incluyen celulas T, celulas B, celulas NK, entre otras). Las celulas de linfoma de celulas B humanas (por ejemplo, celulas Raji) se trasplantan en dicho animal no humano con celulas inmunitarias humanas injertadas, el cual se administra despues con un anticuerpo biespedfico que se une a CD20 (un antfgeno en las celulas B normales y determinados tumores malignos de celulas B) y a la subunidad CD3 del receptor de celulas T, para probar la capacidad del anticuerpo biespedfico para inhibir el crecimiento del tumor en el animal no humano.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la tecnica como realizar y usar los metodos y composiciones descritos en el presente documento, y no estan destinados a limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invencion. A menos que se indique de cualquier otra manera, la temperatura se indica en Celsius, y la presion es la atmosferica o cercana a ella.
Ejemplo 1. Humanizacion de un gen endogeno de protema reguladora de senales (SIRP).
Este ejemplo muestra metodos ilustrativos para la humanizacion de un gen endogeno que codifica la protema reguladora de senales alfa (SIRPa) en un mairnfero no humano tal como un roedor (por ejemplo, un raton). Se conoce que SIRPa humano existe en al menos 10 formas alelicas. Los metodos descritos en este ejemplo pueden emplearse para humanizar un gen de SIRPa endogeno de un animal no humano con el uso de cualquier alelo humano, o combinacion de alelos humanos (o fragmentos de alelos) segun convenga. En este ejemplo, la variante 1 de SIRPa humano se emplea para humanizar un gen endogeno de SIRPa de un raton.
Se construyo un vector de transformacion para la humanizacion de una region extracelular de un gen de SIRP (por ejemplo, SIRPa) mediante la tecnologfa VELOCIGENE® (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos num.
6,586,251 y Valenzuela y otros (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659).
Brevemente, el clon de cromosoma artificial bacteriano (BAC) de raton bMQ-261H14 se modifico para eliminar la secuencia que contiene los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa endogeno e insertar los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano mediante el uso del clon de BAC humano CTD-3035H21. El ADN genomico correspondiente a los exones 2 a 4 de un gen endogeno de SIRPa (-8555 pb) se reemplazo en el clon de BAC bMQ-261H14 con un fragmento de ADN de -8581 pb que contiene los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano del clon de BAC CTD-3035H21. El analisis de secuencia del alelo de SIRPa humano contenido en el clon CTD-3035H21 de BAC revelo que el alelo corresponde a la variante humana 1. Un casete de neomicina flanqueado por sitios loxP se anadio al extremo del fragmento de ADN humano de -8581 pb que contiene los exones 2 a 4 del gen de SIRPa humano (Figura 1).
Los brazos de homologfa corriente arriba y corriente abajo se obtuvieron a partir del ADN de BAC en raton en las posiciones 5' y 3' de los exones 2 y 4, respectivamente, y se anadieron al casete de resistencia a neomicina-fragmento humano de 8581 pb para crear el vector de transformacion final para la humanizacion de un gen endogeno de SIRPa, que contiene de 5' a 3' un brazo de homologfa en 5' que contiene 19 kb del ADN de raton en 5' del exon 2 del gen endogeno de SIRPa, un fragmento de ADN de 8581 pb que contiene los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano, un casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP, y un brazo de homologfa en 3' que contiene 21 kb de ADN de raton en 3' del exon 4 de un gen endogeno de SIRPa. La insercion dirigida del vector de transformacion ubico el casete de resistencia a neomicina en el quinto intron de un gen de SIRPa de raton entre los exones 4 y 5. El vector de transformacion se linealizo mediante digestion con SwaI y despues se uso en la recombinacion homologa en celulas bacterianas para lograr un reemplazo dirigido de los exones 2 a 4 en un gen de SIRPa de raton con los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano (Figura 1).
El ADN de BAC transformado (descrito anteriormente) se uso para someter a electroporacion las celulas ES de raton para crear celulas ES modificadas que comprenden un reemplazo de los exones 2 a 4 en un gen endogeno de SIRPa de raton con un fragmento genomico que comprende los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano. Las celulas ES positivas que contienen un fragmento genomico que comprende los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano se identificaron mediante PCR cuantitativa con el uso de sondas TAQMAN™ (Lie y Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). La secuencia de nucleotidos a traves del punto de insercion corriente arriba incluyo lo siguiente, que indica la secuencia endogena de raton corriente arriba del punto de insercion (contenida dentro del parentesis mas abajo) unida de manera contigua a una secuencia genomica de SIRPa humana presente en el punto de insercion: (AGCTCTCCTA CCACTAGACT GCTGAGACCC GCTGCTCTGC TCAGGACTCG ATTTCCAGTA CACAATCTCC CTCTTTGAAA AGTACCACAC ATCCTGGGGT) GCTCTTGCAT TTGTGTGACA CTTTGCTAGC CAGGCTCAGT CCTGGGTTCC AGGTGGGGAC TCAAACACAC TGGCACGAGT CTACATTGGA TATTCTTGGT
(Sec. con num. de ident.: 6) La secuencia de nucleotidos a traves del punto de insercion corriente abajo en el extremo 5' del casete de resistencia a neomicina incluyo lo siguiente, que indica una secuencia genomica de SIRPa humana contigua con la secuencia del casete corriente abajo del punto de insercion (contenida dentro del parentesis mas abajo con la secuencia loxP en letras cursivas): GCTCCCCATT CCTCACTGGC CCAGCCCCTC TTCCCTACTC TTTCTAGCCC CTGCCTCATC TCCCTGGCTG CCATTGGGAG CCTGCCCCAC T GGAAGCCAG (TCGAG ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG CGCCCCCCTC CTCACGGCGA) (Sec. con num. de ident.: 7) La secuencia de nucleotidos a traves del punto de insercion corriente abajo en el extremo 3' del casete de resistencia a neomicina incluyo lo siguiente, que indica la secuencia del casete contigua con la secuencia genomica de raton en 3' del exon 4 de un gen endogeno de SIRPa (contenida dentro del parentesis mas abajo): CATTCTCAGT ATTGTTTTGC CAAGTTCTAA TTCCATCAGA CCTCGACCTG CAGCCCCTAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGC (TGTCTCATAG AGGCTGGCGA TCTGGCTCAG GGACAGCCAG TACTGCAAAG AGTATCCTTG TTCATACCTT CTCCTAGTGG CCATCTCCCT GGGACAGTCA) (Sec. con num. de ident.: 8) Los clones positivos de celulas ES se usaron despues para implantar ratones hembras mediante el uso del metodo VELOCIMOUSE® (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos num. 7,294,754 y Poueymirou 2007, y otros, F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99) para generar una camada de crfas que contienen una insercion de los exones 2-4 de un gen de SIRPa humano en un gen de SIRPa endogeno de un raton.
Las celulas ES transformadas descritas anteriormente se usaron como celulas ES donantes y se introdujeron en un embrion de raton en etapa de 8 celulas mediante el metodo VELOCIMOUSE® (mas arriba). Los ratones que portan la humanizacion de los exones 2 a 4 de un gen endogeno de SIRPa se identificaron mediante genotipado con el uso de una modificacion de un ensayo de alelos (Valenzuela y otros, mas arriba) que detecta la presencia de las secuencias genicas de SIRPa humano.
Los ratones que portan la construccion del gen de SIRPa humanizado (es decir, que contienen los exones 2 a 4 de SIRPa humana en un gen de SIRPa de raton) pueden cruzarse con una cepa de raton Cre deletor (ver, por ejemplo, la publicacion de la solicitud de patente Internacional num. WO 2009/114400) para eliminar cualquier casete de resistencia a neomicina con sitios lox introducidos por el vector de transformacion que no se elimina, por ejemplo, en la etapa de celula ES o en el embrion. Opcionalmente, el casete de resistencia a neomicina se mantiene en los ratones.
Las crfas se genotipifican y una crfa heterocigota para la construccion del gen de SIRPa humanizado se selecciona para su caracterizacion.
Ejemplo 2. Expresion de SIRPa humanizado en animales no humanos.
Este ejemplo ilustra la expresion caracterfstica de la protefna SIRPa en la superficie de celulas de animales no humanos disenados geneticamente para contener una construccion del gen de SIRPa humanizado como se describe en el Ejemplo 1 en un locus endogeno de SIRPa .
Brevemente, los bazos se aislaron a partir de ratones de tipo silvestre (WT) y heterocigotos para un gen de SIRPa humanizado. Los bazos se prefundieron despues con Colagenasa D (Roche Bioscience) y los eritrocitos se lisaron con tampon de lisis ACK de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La expresion en la superficie celular de SIRPa humano y de raton se analizo mediante FACS con el uso de anticuerpos anti-CD3 (17A2), anti-CD19 (1D3), anti-CD11b (M1/70), anti-SIRPa humana (SE5A5), y anti-SIRPa de raton (P84) conjugados con fluorocromo. La citometrfa de flujo se realizo mediante el uso de BD LSRFORTESSA™. La expresion ilustrativa de SIRPa humano y de raton segun se detecto en la superficie de monocitos CD11b+ se muestra en la Figura 2.
Como se muestra en la Figura 2, la expresion de SIRPa de raton y humanizado pudo detectarse claramente en la superficie de monocitos CD11b+ de ratones heterocigotos.
Ejemplo 3. Injerto de celulas humanas en animales no humanos humanizados para SIRP.
Este ejemplo ilustra un injerto mejorado de celulas madre hematopoyeticas humanas en animales no humanos que tienen un gen de SIRPa humanizado.
Brevemente, los ratones Rag2 KO IL2Ry nulos con o sin un gen de SIRPa humanizado se llevaron a condiciones libres de patogenos. Los ratones recien nacidos (2 a 5 dfas de edad) se irradiaron con 240 cGy y se inyectaron de manera intrahepatica con 1x105 CD34+ celulas madre hematopoyeticas humanas CD34+. Se tomaron muestras de sangre de los ratones 10 a 12 semanas despues del injerto y la sangre se analizo mediante FACS con el uso de anticuerpos anti-CD45 humano (HI30), anti-CD3 humano (s K7), anti-CD19 humano (HIB19) y anti-CD45 de raton (30-F11) conjugados con fluorocromo para verificar la reconstitucion del sistema inmunitario humano. El fondo genetico de los ratones es BALB/cTa x 129/SvJae.
Los porcentajes ilustrativos de celulas CD34+ humanas en ratones de tipo silvestre, heterocigotos para SIRPa humanizado, ratones homocigotos para SIRPa humanizado y ratones BALB-Rag2'/'IL2RYC/' (DKO) se muestran en las Figuras 3 - 5.
Como se muestra en este ejemplo, los ratones homocigotos para un gen de SIRPa humanizado demuestran un injerto mejorado de celulas CD34+ humanas al proporcionar el mayor porcentaje de celulas CD34+ humanas en la periferia (por ejemplo, en sangre) en comparacion con otras cepas analizadas.
En conjunto, estos datos demuestran que SIRPa humanizado es funcional en los ratones como se describe en la presente descripcion a traves de la expresion en la superficie de celulas en el raton y ser capaz de sustentar el injerto de celulas madre hematopoyeticas CD34+ humanas.
Ejemplo 4. Evaluacion de la eficacia del Ac 1 sobre el crecimiento tumoral de linfoma en celulas Raji en ratones BRG.
Sumario
El Ac 1 es un anticuerpo biespecffico (bsAc) que se une a CD3, un antfgeno de celulas T asociado con el complejo del receptor de celulas T (TCR), y a CD20, un antfgeno de la superficie de celulas B presente en celulas B normales y varios tumores malignos del linaje de celulas B. El Ac 1 esta disenado para unir las celulas que expresan CD20 con las celulas T citotoxicas mediante la union a la subunidad CD3 del TCR, lo que resulta en la muerte de celulas T policlonales dirigida por CD20. CD20 es una diana validada clfnicamente para la inmunoterapia; el anticuerpo quimerico rituximab esta aprobado para el tratamiento de los linfomas no Hodgkin (NHL) y la leucemia linfocftica cronica (CLL). Aunque los pacientes pueden llegar a ser refractarios al rituximab, tfpicamente no se observa perdida de la expresion de CD20. Por lo tanto, un anticuerpo biespecffico que una las celulas tumorales CD20 positivas con las celulas T citotoxicas representa una estrategia antitumoral potencial.
En este estudio, el efecto de tratamiento con el bsAc CD20xCD3 Ac 1 sobre el crecimiento tumoral de linfoma de celulas B humanas (Raji) se examino en un modelo tumoral en raton. El modelo utilizo ratones BALB/c-Rag2nulo IL2rYnulo (BRG) injertados con hCD34+ que se humanizaron para SIRPa . Estos ratones, con celulas T, B, y NK humanas, asf como granulocitos, monocitos, y celulas dendrfticas (DC), se trataron con Ac 1 dos veces a la semana, lo que dio como resultado una supresion significativa del crecimiento de tumores Raji en comparacion con el control de vehfculo y el AcM control de no union, Ac 5 Control. El tratamiento con el Ac 1 suprimio el crecimiento tumoral a 0,4 mg/kg y 0,04 mg/kg con un mayor nivel de significacion que el grupo control de vehfculo a todo lo largo del perfodo de tratamiento (p<0,0001). No se observo una perdida del peso significativa en ningun grupo de tratamiento. Estos resultados muestran que el Ac 1 se dirige a tumores Raji en ratones con celulas inmunitarias humanas, lo que da lugar a una supresion tumoral significativa.
Materiales y metodos
Materiales
Compuesto de prueba y anticuerpo control
Compuesto de prueba: Ac 1.
Anticuerpo control: Ac 5 Control.
Reactivos
Tabla 4: Lista de reactivos
Reactive Fuente Identification
Instalacion central Raji P 1-4-10 Pase num.
Celulas Raji de Regeneron 4
Celulas mad re hematopoyeticas (HSC) CD34+ Advanced
humanas aisladas de hfgados fetales humanos Biosciences
Resource, Inc.
hPBMC Reachbio Catalogo num. 0500-300,
Lote num. 130322
Catalogo num. 181164­
L-Histidina Amresco 100G, Lote num.
3363E344
Sacarosa Biosolutions Catalogo num. B10640- 07, Lote num. 0816012
RPMI Irvine Scientific Catalogo num. 9160,
Lote num. 9160100803
FBS Tissue Culture Catalogo num. 101, Lote
Biolog icals num. 107062
Pen icil ina/Es trepto micina/L-G luta mina Gibco Catalogo nun. 10376­
016, Lote num. 1411400
2-Mercaptoetanol Gibco Catalogo nun. 21935­
023, Lote num. 762405
Anti-CD45 humane Invitfogen Catalogo num.
MHCD4518, Cion H130
Anti-NKp46 humane BD Biosciences Catalogo num. 55&051,
Cion 9E2
Figure imgf000026_0001
Sistemas de prueba
Los estudios en tumores presentados en este informe emplearon ratones inmunodeficientes BALB/c-Rag2nulos IL2rYnulos (BRG) de 24-32 semanas de edad, machos y hembras, humanizados para el gen de la protema reguladora de senales alfa (SIRPa). Estos se generaron en Regeneron mediante transformacion de celulas madre embrionarias (ES) (Strowig y otros, Proc Natl Acad Sci USA, 108(32): 13218-13223 (2011)). Despues del reconocimiento de CD47, SIRPa inhibe el aclaramiento de celulas CD47 positivas por los macrofagos. Estudios anteriores han demostrado que los ratones BRG que expresan el transgen SlRPa humano tienen un injerto mejorado de HSC humanas (Strowig y otros, Proc Natl Acad Sci USA, 108(32): 13218-13223 (2011)).
Las cnas BRG SIRPa recien nacidas se irradiaron e injertaron con celulas progenitoras hematopoyeticas hCD34+ derivadas de hngado fetal (Traggiai, y otros, Science, 304(5667): 104-107 (2004)). Estas HSC humanas dan lugar a celulas T, B, y NK humanas, asf como a granulocitos, monocitos, y celulas dendnticas (DC). Debido a los bajos niveles de celulas B humanas circulantes, hay bajos niveles de IgG humana circulante. Ademas, estos ratones no desarrollan centros germinales, carecen de ganglios linfaticos y tienen una reposicion limitada de celulas T y B si se agotan estas celulas. Los monocitos murinos, las DC, y los granulocitos continuan presentes tambien. La composicion de celulas inmunitarias se confirmo mediante citometna de flujo de sangre, y los ratones se asignaron al azar por el % de injerto CD45 humano antes de su uso en los estudios de tumores. Los ratones se implantaron con celulas tumorales Raji en el Dfa 0, y se analizo la capacidad del Ac 1 para bloquear el crecimiento tumoral en 4 semanas. Los pesos corporales y los volumenes tumorales se registraron en los dfas 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 y 34 despues de la implantacion.
Diseno experimental
Reconstitucion del sistema inmunitario humano en ratones BRG SIRPa
Los ratones BALB/c Rag2 /-yc-/- (BRG) con SIRP alfa humano (BRG SIRPa) inmunodeficientes se criaron en los aisladores libres de germenes en las instalaciones de animales de Regeneron. Los ratones neonatos se irradiaron con una dosis de 300 cGrey, 8-24 horas antes de la inyeccion de celulas madre hematopoyeticas (HSC) CD34+ humanas aisladas a partir de hngados fetales humanos. El injerto se dejo desarrollar durante 12-16 semanas y la cantidad de celulas injertadas se evaluo periodicamente mediante citometna de flujo. Durante toda la duracion del experimento, los animales se alojaron en las instalaciones de animales de Regeneron en condiciones estandar en un ciclo dfa/noche de 12 horas con acceso a la comida y al agua ad libitum. La cantidad de animales por caja se limito a un maximo de 5 ratones.
Se analizo la sangre de los ratones para determinar el por ciento de los niveles de injerto antes de iniciar el estudio. Se tomaron muestras de sangre completa en dos tubos capilares que conteman 150 ul de EDTA al 2 % (acido etilendiaminotetraacetico; 15 mg/ml). Los globulos rojos se lisaron mediante el uso del tampon de lisis ACK durante 3 minutos y el tampon se neutralizo con PBS (sin calcio ni magnesio). Las celulas se bloquearon con Bloqueo de Fc durante 5 minutos a 4 °C y despues se tineron con CD45 humano, NKp46, CD19, CD3 y CD14 durante 30 minutos a 4 °C. Las muestras se analizaron mediante citometna de flujo con 5 laseres (BD Fortessa). El por ciento de injerto se determino como el % de celulas CD45+ humanas de las celulas totales.
Procedimiento de estudio de tumores Raji en ratones BRG SIRPa
En el dfa 0, los grupos de 5 ratones BRG SIRPa recibieron la administracion de 2x106 celulas tumorales Raji por via subcutanea. El mismo dfa, los ratones se trataron con una dosis intraperitoneal (IP) de Ac 1 (0,4 o 0,04 mg/kg), Control de AcM control de no union Ac 5 (que se une un antfgeno felino sin reactividad cruzada con CD20 o CD3 humanos) a una dosis de 0,4 mg/kg o vehfculo solo. Posteriormente los ratones recibieron dos dosis de anticuerpo/semana durante 4 semanas. El crecimiento tumoral se midio con calibres en los dfas 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 y 34. Los grupos de estudio se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5: Resumen de los grupos de tratamiento en ratones BRG SIRPa
Figure imgf000027_0001
Procedimientos especfficos
Preparacion de reactivos
Cada uno del Ac 1 y el Ac 5 Control se diluyeron hasta la concentracion deseada en vehfculo (histidina 10 mM, 5 % de sacarosa, pH 5,8). Las celulas Raji se obtuvieron de la instalacion central de Regeneron (pase 4) y se mantuvieron en medio de cultivo: RPMI 1640 10 % FBS Pen Strep-L-Glu Mercaptoetanol. Las celulas Raji se diluyeron hasta la concentracion deseada en medio.
Analisis estadfstico
Los analisis estadfsticos se realizaron mediante la utilizacion del programa GraphPad Prism 5.0 (Version Macintosh). El nivel de significacion estadfstica se determino mediante ANOVA de dos vfas y posteriormente la prueba de comparaciones multiples de Tukey. Los datos de cada una de las lecturas se compararon entre los grupos de tratamiento. Un umbral de p<0,05 se considero estadfsticamente significativo, como se indica por *. Los ratones que murieron antes del final del estudio se eliminaron de los graficos de las curvas de crecimiento tumoral combinadas (pero no de la curva de crecimiento de los ratones individuales) como se indica y el analisis estadfstico para analizar mediante ANOVA de dos vfas.
Resultados
El Ac 1 suprime el crecimiento de celulas tumorales Raji en ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+
El Ac 1 suprimio el crecimiento de tumores Raji en comparacion con el control de vehfculo y el control de no union en ratones b Rg SIRPa injertados con hCD34+ (Figura 6). Las crfas recien nacidas SIRPa BRG se irradiaron e injertaron con celulas hepaticas fetales hCD34+ como celulas progenitoras hematopoyeticas (Traggiai, y otros, Science, 304(5667): 104-107 (2004)), que dan lugar a las celulas humanas T, B, y NK, asf como tambien a granulocitos, monocitis, y DC. En el dfa 0, los ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+ recibieron la administracion de 2x106 celulas tumorales Raji por via subcutanea. El mismo dfa, los ratones se trataron con una dosis intraperitoneal (IP) de Ac 1 (0,4 o 0,04 mg/kg) o el Control de AcM control de no union Ac 5, o control de vehfculo, seguido de dos dosis semanales a todo lo largo del estudio.
En comparacion con los grupos control de vehfculo y los grupos control de no union, el Ac 1 suprimio significativamente el crecimiento de tumores Raji, administrado en dosis de 0,04 mg/kg (p<0,0001) o 0,4 mg/kg (p<0,0001) en el dfa 34 despues de la implantacion del tumor (Figura 7). Ademas, los efectos del tratamiento con el Ac 1 fueron dependientes de la dosis, donde el Ac 1 a 0,4 mg/kg suprimio el crecimiento completamente a todo lo largo del estudio, en comparacion con el Ac 1 a 0,04 mg/kg, que suprimio el crecimiento tumoral completamente hacia el Dfa 30. Ni el Ac 1 ni el AcM control de no union tuvieron un efecto significativo sobre el peso corporal de los ratones a todo lo largo del estudio (Figura 8).
Conclusiones
El efecto del tratamiento con Ac1, un bsAc CD20xCD3, sobre el crecimiento de tumores Raji se examino en un modelo de raton. El Ac 1 fue eficaz en la supresion del crecimiento tumoral en ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+ con celulas T, B, y NK humanas, asf como granulocitos, monocitos, y DC. El tratamiento dos veces a la semana con Ac 1 dio como resultado una supresion significativa y dependiente de la dosis del crecimiento tumoral de linfoma de celulas B humanas Raji en comparacion con el control de vehfculo y el control de no union. No se observo una perdida del peso significativa en ningun grupo de tratamiento. Estos resultados muestran que el Ac 1 se dirige a tumores Raji en ratones con celulas inmunitarias humanas, lo que da lugar a una supresion significativa del crecimiento tumoral.
Equivalentes

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un roedor cuyo genoma comprende un reemplazo de los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de roedor en un locus endogeno de SIRPa de roedor con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de roedor en dicho locus endogeno de SIRPa de roedor, y expresa en dicho roedor una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de roedor codificada por dicho gen de SIRPa de roedor.
2. El roedor de conformidad con la reivindicacion 1, en donde el gen de SIRPa humanizado comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de dicho gen de SIRPa de roedor.
3. El roedor de conformidad con la reivindicacion 1 o 2, en donde dicha protefna SIRPa humana comprende la secuencia de aminoacidos como se expone en la sec. con num. de ident.: 4.
4. El roedor de conformidad con la reivindicacion 3, en donde dicha protefna SIRPa humanizada comprende los residuos de aminoacidos 28-362 de la sec. con num. de ident.: 4.
5. El roedor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el roedor no expresa una protefna SIRPa de roedor.
6. Un tejido o celula de roedor aislada cuyo genoma comprende un reemplazo de los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de roedor en un locus endogeno de SIRPa de roedor con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de roedor en dicho locus endogeno de SIRPa de roedor, y codifica una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de roedor codificada por dicho gen de SIRPa de roedor.
7. La celula o tejido aislados de conformidad con la reivindicacion 6, en donde el gen de SIRPa humanizado comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de dicho gen de SIRPa de roedor.
8. La celula o tejido aislados de conformidad con la reivindicacion 6 u 7, en donde la celula o tejido no expresa una protefna SIRPa de roedor.
9. La celula de roedor aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde la celula de roedor es una celula madre embrionaria de roedor.
10. Un metodo para obtener un roedor, que comprende:
(a) reemplazar los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de roedor en un locus endogeno de SIRPa de roedor en una celula ES de roedor con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de roedor en dicho locus endogeno de SIRPa de roedor, y codifica una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de roedor codificada por dicho gen de SIRPa de roedor, para obtener de esta manera una celula ES modificada de roedor que comprende dicho gen de SIRPa humanizado; y
(b) crear un roedor con el uso de la celula ES modificada obtenida en (a).
11. El metodo de conformidad con la reivindicacion 10, en donde el gen de SIRPa humanizado comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de dicho gen de SIRPa de roedor.
12. El metodo de conformidad con la reivindicacion 10 u 11, en donde dicha protefna SIRPa humana comprende la secuencia de aminoacidos como se expone en la sec. con num. de ident.: 4.
13. El roedor de conformidad con la reivindicacion 12, en donde dicha protefna SIRPa humanizada comprende los residuos de aminoacidos 28-362 de la sec. con num. de ident.: 4.
14. Un metodo para evaluar la eficacia terapeutica de un farmaco para dirigirse a celulas humanas, que comprende:
(a) proporcionar un roedor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en el cual se han trasplantado una o mas celulas humanas;
(b) administrar un candidato a farmaco a dicho raton; y
(c) monitorear las celulas humanas en el roedor para determinar la eficacia terapeutica del candidato a farmaco.
15. El roedor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, la celulas o tejidos de roedor asiladode conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9 o el metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en donde el roedor es una rata.
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