KR20160056900A - 인간화된 신호-조절 단백질 유전자를 가지는 비-인간 동물 - Google Patents

인간화된 신호-조절 단백질 유전자를 가지는 비-인간 동물 Download PDF

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Abstract

유전자 변형된 비-인간 동물 및 그것을 제조하기 위한 방법 및 조성물이 제공되는데, 이때 유전자 변형은 내인성 신호-조절 단백질 유전자의 인간화, 특히 SIRPα 유전자의 인간화를 포함한다. 내인성 SIRPα 유전자좌로부터 인간 또는 인간화된 SIRPα 단백질을 발현하는 마우스들을 포함하여, 유전자 변형된 마우스들이 기술된다.

Description

인간화된 신호-조절 단백질 유전자를 가지는 비-인간 동물{NON-HUMAN ANIMALS HAVING A HUMANIZED SIGNAL-REGULATORY PROTEIN GENE}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2013년 9월 23일에 출원된 미국 임시 출원 번호 61/881,261호의 우선권의 유익을 주장하며, 상기 출원은 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 인간화된 신호-조절 단백질 유전자를 가지는 비-인간 동물에 관한 것이다.
면역 시스템은 고도로 조절된 다수의 과정에 포함되고 함께 외래 단백질을 제거하는 데 효과적인 면역 반응들을 생성하는 여러 상이한 세포 유형들로 구성된다. 나아가, 이들 동일한 면역 세포들은 다른 것들 중에서도, 세포-대-세포 상호작용을 조절하는 조절 막 단백질들에 의해 자체-인식 특성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 이들 동일 단백질들이 이식 접목의 중요한 결정 요인인 것으로 제시되기 때문에, 그런 소통은 그런 유기체의 생존에 중요하다. 그러나, 인간 면역 세포-대-세포 상호작용 및 그것의 조절의 분자적 측면들을 측정하기 위한 생체 내 시스템은 존재하지 않는다. 그런 시스템은 신규한 치료법 및 백신을 확인시켜주는, 인간 조혈 및 면역 시스템 관련된 기능들의 생체 내 분석에 대한 공급원을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 인간 조혈 줄기세포의 향상된 이식을 허용하기 위하여 비-인간 동물을 엔지니어링하는 것이 바람직하다는 인식을 포함한다. 본 발명은 또한 인간 조혈 줄기세포의 이식에 유용한 인간화된 SIRPα 유전자를 가지는 및/또는 그렇지 않으면 인간 또는 인간화된 SIRPα 단백질을 발현하거나, 함유하거나 또는 생성하는 비-인간 동물이 바람직하다는 인식을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분과 마우스 SIRPα 단백질의 세포 내 부분을 포함하는 SIRPα 폴리펩티드를 발현한다.
일부 구체예에서, 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분은 SEQ ID NO:4에 나타낸 인간 SIRPα 단백질의 잔기 28 내지 362에 해당하는 아미노산을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분은 표 3에 나타낸 인간 SIRPα 단백질의 해당하는 세포 외 부분과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 % 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분은 표 3에 나타낸 인간 SIRPα 단백질의 해당하는 세포 외 부분과 적어도 100%의 동일성을 공유한다 (또는 동일하다).
일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 또한 내인성 비-인간 SIRPα 단백질을 발현하지 못한다. 일부 구체예에서, 비-인간 동물은 설치류이고 또한 내인성 설치류 SIRPα 단백질을 발현하지 못한다. 일부 구체예에서, 비-인간 동물은 마우스이고 또한 표 3에 나타낸 서열을 가지는 내인성 마우스 SIRPα 단백질을 발현하지 못한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 비-인간 SIRPα 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 인간 SIRPα의 엑손 2, 3 및 4를 포함하는 SIRPα 유전자를 포함하는 비-인간 동물을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물의 SIRPα 유전자는 내인성 비-인간 SIRPα 유전자의 엑손 1, 5, 6, 7 및 8을 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 설치류이다. 일부 특정 구체예에서, 본 발명의 설치류는 마우스 또는 쥐로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 비-인간 동물의 유전자에 의해 코드화된 SIRPα 폴리펩티드를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 비-인간 동물로부터 분리된 세포 또는 조직을 제공한다. 일부 구체예에서, 세포는 림프구 (예컨대 B 또는 T 세포), 골수성 세포 (예컨대 마크로파지, 호중구, 과립구, 골수성 수지상 세포 및 비만 세포) 및 뉴런으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 조직은 지방 조직, 방광, 뇌, 유방, 골수, 눈, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 근육, 췌장, 혈장, 혈청, 피부, 비장, 위, 흉선, 고환, 난소 및/또는 그것들의 조합으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 그것의 게놈이 마우스 SIRPα 단백질의 세포 내 부분에 연결되어 있는 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분을 코드화하는 SIRPα 유전자를 포함하는 분리된 마우스 세포 또는 조직을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 SIRPα 유전자는 마우스 SIRPα 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 SIRPα 유전자는 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 그것의 게놈이 본원에 기술되는 SIRPα 유전자를 포함하는 비-인간 배아 줄기 (ES) 세포를 제공한다. 일부 구체예에서, ES 세포는 비-인간 SIRPα 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함한다. 일부 특정 구체예에서, ES 세포는 설치류 ES 세포이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 배아 줄기세포는 마우스 또는 쥐 배아 줄기세포이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술되는 SIRPα 유전자를 포함하는 비-인간 배아 줄기세포를 포함하는, 그것으로부터 제조된, 그것으로부터 얻어진 또는 그것으로부터 생성된 비-인간 배아를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 배아는 설치류 배아이다. 일부 구체예에서, 본원에 기술되는 설치류 배아는 마우스 또는 쥐 배아이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 내인성 SIRPα 유전자좌로부터 SIRPα 단백질을 발현하는 비-인간 동물의 제조 방법을 제공하는데, 이때 SIRPα 단백질은 인간 서열을 포함하고, 그 방법은 비-인간 ES 세포의 내인성 SIRPα 유전자좌를 인간 SIRPα 단백질을 전체 또는 부분적으로 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈 단편으로 표적화하는 단계; 상기 인간 서열을 포함하는 내인성 SIRPα 유전자좌를 포함하는 변형된 비-인간 ES 세포를 얻는 단계; 및 상기 변형된 ES 세포를 사용하여 비-인간 동물을 제조하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 표 3에 나타낸 인간 SIRPα 유전자에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 서열을 가지는 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 인간 SIRPα 단백질의 아미노산 잔기 28 내지 362를 코드화한다. 일부 구체예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 표 3에 나타낸 인간 SIRPα 단백질에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 서열을 가지는 인간 SIRPα 단백질의 아미노산 잔기 28 내지 362를 코드화한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 그것의 게놈이 마우스 SIRPα 단백질의 세포 내 부분에 연결되어 있는 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분을 코드화하는 SIRPα 유전자를 포함하는 마우스를 제공하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 마우스의 게놈이 마우스 SIRPα 단백질의 세포 내 부분에 연결되어 있는 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분을 코드화하는 SIRPα 유전자를 포함하도록 마우스의 게놈을 변형시키고 그로써 상기 마우스를 제공하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, SIRPα 유전자는 본원에 기술되는 SIRPα 유전자이다. 일부 구체예에서, SIRPα 유전자는 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 마우스에 인간 세포를 이식시키는 방법을 제공하는데, 그 방법은 그것의 게놈이 마우스 SIRPα 단백질의 세포 내 부분에 연결되어 있는 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분을 코드화하는 SIRPα 유전자를 포함하는 마우스를 제공하는 단계, 및 하나 또는 그 이상의 인간 세포를 그 마우스에 이식시키는 단계를 포함한다. 일부 특정 구체예에서, 방법은 추가로 하나 또는 그 이상의 세포를 마우스에 이식하는 것을 분석하는 단계를 더 포함한다. 일부 특정 구체예에서, 분석 단계는 하나 또는 그 이상의 인간 세포의 이식을 하나 또는 그 이상의 야생형 마우스에서의 이식에 비교하는 것을 포함한다. 일부 특정 구체예에서, 분석 단계는 하나 또는 그 이상의 인간 세포의 이식을 그것의 게놈이 마우스 SIRPα 단백질의 세포 내 부분에 연결되어 있는 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분을 코드화하는 SIRPα 유전자를 포함하지 않는 하나 또는 그 이상의 마우스에서의 이식에 비교하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 세포는 조혈 줄기세포이다. 일부 구체예에서, 인간 세포는 정맥 내로 이식된다. 일부 구체예에서, 인간 세포는 복강 내로 이식된다. 일부 구체예에서, 인간 세포는 피하로 이식된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 그것의 게놈이 마우스 SIRPα 단백질의 세포 내 부분에 연결되어 있는 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분을 코드화하는 SIRPα 유전자를 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포를 제공하는 단계, 그 하나 또는 그 이상의 세포를 표지된 기질과 함께 인큐베이션하는 단계 및 그 하나 또는 그 이상의 세포에 의한 표지된 기질의 식세포 작용을 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 세포는 마우스 세포이다.
일부 구체예에서, 기질은 형광으로 표지된다. 일부 구체예에서, 기질은 항체로 표지된다. 일부 구체예에서, 기질은 하나 또는 그 이상의 적혈구이다. 일부 구체예에서, 기질은 하나 또는 그 이상의 박테리아 세포이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 그것의 게놈이 마우스 SIRPα 단백질의 세포 내 부분에 연결되어 있는 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분을 코드화하는 SIRPα 유전자를 포함하는 마우스를 제공하는 단계, 그 마우스를 항원에 노출시키는 단계 및 그 마우스의 하나 또는 그 이상의 세포에 의한 항원의 식세포 작용을 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 노출 단계는 마우스를 형광으로 표지된 항원에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 노출 단계는 항원을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포에 마우스를 노출시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 노출 단계는 항원을 포함하는 하나 또는 그 이상의 인간 세포에 마우스를 노출시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 노출 단계는 항원을 포함하는 하나 또는 그 이상의 박테리아 세포에 마우스를 노출시키는 것을 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 SIRPα 유전자는 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함한다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분은 표 3에 나타낸 인간 SIRPα 단백질의 잔기 28 내지 362에 해당하는 아미노산을 포함한다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 SIRPα 유전자는 마우스 SIRPα 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술되는 방법에 의해 얻을 수 있는 비-인간 동물을 제공한다. 일부 특정 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 내인성 SIRPα 단백질의 세포 외 부분을 검출가능하게 발현하지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명은 약물 또는 백신의 확인 또는 인증 방법을 제공하는데, 그 방법은 본원에 기술되는 비-인간 동물에 약물 또는 백신을 전달하는 단계 및 그 약물 또는 백신에 대한 하나 또는 그 이상의 면역 반응, 그 약물 또는 백신의 안전성 프로필 또는 질환 또는 상태에 미치는 영향을 모니터링하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 안전성 프로필을 모니터링하는 것은 비-인간 동물이 약물 또는 백신을 전달한 결과로서 부작용 또는 거부 반응을 나타내는 지의 여부를 측정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 부작용 또는 거부 반응은 이환율, 사망률, 체중의 변화, 하나 또는 그 이상의 효소 수준의 변화 (예컨대 간에서의), 하나 또는 그 이상의 기관의 중량의 변화, 기능의 손실 (예컨대 감각기관, 운동기관, 장기 등), 하나 또는 그 이상의 질환에 대한 민감성의 증가, 비-인간 동물의 게놈에 대한 변화, 음식물 소모의 증가 또는 감소 및 하나 또는 그 이상의 질환의 합병증으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 약물 또는 백신의 의학에서의 사용, 예컨대 의약으로서의 사용을 위한 개발에 본 발명의 비-인간 동물을 사용하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 인간 세포를 표적화하는 치료 약물의 효능을 평가하기 위해 본원에 기술된 비-인간 동물을 사용하는 것을 제공한다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 인간 세포로 이식되고, 그런 인간 세포를 표적화하는 약물 후보가 동물에 투여된다. 그 약물의 효능은 약물의 투여 후에 비-인간 동물에서 인간 세포를 모니터링함으로써 측정된다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 설치류, 바람직하게 마우스 또는 쥐이다.
본 출원에서 사용되는 용어 "약" 및 "대략"은 동등하게 사용된다. 본 출원에서 약/대략을 포함하거나 포함하지 않으면서 사용되는 어떠한 숫자든지 관련 기술의 숙련자에 의해 인지되는 어떠한 정상 변동을 다 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 특징, 대상 및 장점들은 이어지는 상세한 설명에서 드러난다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 구체예를 나타내는 한편으로, 제한이 아닌 단지 예시를 위해 제공되는 것이 인지되어야 한다. 발명의 범주 내에 있는 다양한 변화 및 수정이 상세한 설명으로부터 기술분야의 숙련자들에게 드러날 것이다.
본원에 포함된 도면은 제한하기 위한 것이 아니라 단지 예시를 목적으로 한다.
도 1은 넘버링된 각각의 엑손을 가지는 내인성 쥐과 SIRPα 유전자 (상부)의, 실제 크기가 아닌 도표를 도시한다. 인간화된 내인성 SIRPα 유전자 (하부)는 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4와, 양옆에 부위-특이적 재조합효소 인식 부위 (예컨대 loxP)가 있는 네오마이신 선택 카세트 (Ub-Neo)를 함유하는 것으로 도시된다. 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4의 표적화된 삽입은 인간 SIRPα 단백질에 해당하는 세포외재성 영역을 가지는 인간화된 SIRPα 유전자를 발현하는 내인성 유전자를 초래한다.
도 2는 인간화된 SIRPα 유전자에 대한 야생형 및 이형접합성 마우스의 SIRPα 발현의 오버레이 (overlay)를 도시한다.
도 3은 인간 CD34+ 세포로 이식된 마우스들의 상이한 계통에서의 CD45+ 세포의 %를 도시한다.
도 4는 인간 CD34+ 세포로 이식된 마우스들의 상이한 계통에서의 CD45+CD3+ 세포의 %를 도시한다.
도 5는 인간 CD34+ 세포로 이식된 마우스들의 상이한 계통에서의 CD45+CD19+ 세포의 %를 도시한다.
도 6은 hCD34+ 이식된 SIRPα BRG 마우스에서의 용량-의존 방식의 Raji 종양의 Ab 1 억제된 성장을 도시한다. Raji 종양 부피는 종양 이식 후 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 및 34일에 측정되었다. 개별 동물 (패널 A 내지 D)에 대한 데이터가 제시된다. hCD34+ 이식된 SIRPα BRG 마우스들에게 0일에 2xl06 Raji 종양 세포가 피하로 투여되었다. 대조 그룹은 항체를 받지 않았다 (비히클 대조표준) (패널 A). 실험 그룹들에 대해, 0일에 마우스들은 0.4 mg/kg (패널 B)의 비-결합 대조표준 Ab (대조표준 Ab 5) 또는 0.4 mg/kg (패널 C) 또는 0.04 mg/kg (패널 D)의 Ab 1의 IP 용량으로 처리되었고, 이어서 연구 기간 동안 주 2회 용량으로 처리되었다. 모든 개별 시험 그룹에 대한 합성 데이터는 도 7에 도시된다.
도 7은 Ab 1이 hCD34+ 이식된 SIRPα BRG 마우스들에서 대조표준에 비해 Raji 종양의 성장을 상당히 억제한 것을 보여준다. 데이터는 도 6에 도시된 그룹당 n=4 내지 5마리의 마우스들로부터의 합성 데이터를 나타낸다. 데이터는 평균 (SEM)으로서 표시되고 유효 영향 (significant effect)을 탐색하기 위해 변량 (ANOVA)의 분석 및 사후검증을 사용하여 분석되었다 (Tukey'의 이원 변량 분석). 비히클 대조 그룹, 대조표준 Ab 5 그룹 및 Ab 1 0.4mg/kg 그룹의 한 마우스는 조기 사망으로 인해 이원 변량 분석에 의한 데이터 분석을 위해 이 합성 그래프로부터 제외시켰다.
도 8은 Ab 1이 hCD34+ 이식된 SIRPα BRG 마우스들에서 체중에 영향을 주지 않았음을 보여준다. 체중은 종양 이식 후 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 및 34일에 측정되었다. 개별 동물 (패널 A 내지 D)에 대한 데이터가 측정되었다. hCD34+ 이식된 SIRPα BRG 마우스들에게 0일에 2xl06 Raji 종양 세포가 피하로 투여되었다. 대조 그룹은 항체를 주지 않았다 (비히클 대조표준) (패널 A). 실험 그룹들에 대해, 0일에 마우스들은 0.4 mg/kg (패널 B)의 Ig 비-결합 대조표준 Ab 5 또는 0.4 mg/kg (패널 C) 또는 0.04 mg/kg (패널 D)의 Ab 1의 IP 용량으로 처리되었고, 이어서 연구 기간 동안 주 2회 용량으로 처리되었다.
정의
본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건들이 다를 수 있기 때문에, 그것들에 한정되지 않는다. 또한 본원에서 사용된 기술은 특정 구체예를 설명할 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범주는 청구범위에 의해 정의되기 때문에, 한정하는 것으로 의도되지 않는 것이 인지되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어 및 구절은 그 용어 또는 구절이 사용되는 맥락으로부터 반대되는 것이 명백하게 표시되거나 드러나지 않는 한, 기술분야에서 그 용어 및 구절이 얻은 것과 동일한 의미를 포함한다. 비록 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 어떠한 방법들 및 물질들이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 특정 방법들 및 물질들을 이제 기술하기로 한다. 언급된 모든 공개물은 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 관심의 하나 또는 그 이상의 값에 대해 적용되는 용어 "대략"은 표시된 참조 값에 유사한 값을 말한다. 특정 구체예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 맥락으로부터 다르게 표시되지 않는 한 또는 다르게 드러나지 않는 한 (그런 숫자가 가능한 값의 100%를 초과할 경우는 제외하고) 표시된 참조 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만에 속하는 값들의 범위를 말한다.
본원에 사용되는 용어 "생물학적으로 활성"은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 (예컨대 유기체 내에서), 생물학적 시스템에서 활성을 가지는 어떠한 제제의 특징을 말한다. 예를 들어, 유기체에 존재할 때 그 유기체 내에서 생물학적 효과를 나타내는 제제는 생물학적으로 활성인 것으로 여겨진다. 특정 구체예에서, 단백질 또는 폴리펩티드가 생물학적으로 활성인 경우, 그 단백질 또는 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 공유하는 그 단백질 또는 폴리펩티드의 일부는 전형적으로 "생물학적으로 활성" 부분으로서 언급된다.
본원에서 사용되는 용어 "비교할만한"은 서로 동일하지 않을 수 있지만, 그들 사이에 비교를 허용할 정도로 충분히 유사하여 관찰된 차이 또는 유사성을 기초로 결론을 타당하게 이끌어낼 수 있을 둘 또는 그 이상의 제제, 독립체, 상황, 상태의 세트 등을 말한다. 기술분야의 숙련자들은 맥락에서, 어떠한 주어진 상황에서 둘 또는 그 이상의 그런 제제, 독립체, 상황, 상태의 세트 등이 비교할만한 것으로 간주되기 위해서는 어느 정도의 동일성이 필요하다는 것을 인지할 것이다.
본원에서 보존성 아미노산 치환을 설명하기 위해 사용되는 용어 "보존성"은 한 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (예컨대 전하 또는 소수성)을 가지는 측쇄 R 기를 가지는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것을 말한다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 실질적으로 단백질의 관심의 기능적 특성, 예를 들면 리간드에 결합하는 수용체의 능력을 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성을 가지는 측쇄들을 가지는 아미노산 그룹의 실례는 글리신, 알라닌, 발린, 로이신 및 아이소로이신과 같은 지방족 측쇄; 세린 및 쓰레오닌과 같은 지방족-하이드록실 측쇄; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드-함유 측쇄; 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황-함유 측쇄를 포함한다. 보존성 아미노산 치환 그룹은 예를 들면 발린/로이신/아이소로이신, 페닐알라닌/타이로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파테이트 및 아스파라긴/글루타민을 포함한다. 일부 구체예에서, 보존성 아미노산 치환은 예를 들면 알라닌 주사 돌연변이생성에서 사용되는 것과 같이, 단백질에서 어떠한 천연 잔기의 알라닌으로의 치환일 수 있다. 일부 구체예에서, Gonnet 등에 개시된 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 포지티브 값을 가지는 보존성 치환이 만들어진다 (Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45, 본원에 참조로 포함됨). 일부 구체예에서, 치환은 그 치환이 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 비-네거티브 값을 가지는 중간 보존성 치환이다.
본원에서 사용되는 용어 "붕괴"는 DAN 분자로 상동 재조합 사건이 일어난 결과를 말한다 (예컨대 유전자 또는 유전자좌와 같은 내인성 상동 서열을 사용함). 일부 구체예에서, 붕괴는 DNA 서열(들)의 삽입, 결실, 치환, 대체, 미스센스 돌연변이 또는 프레임-쉬프트, 또는 그것들의 조합을 이루거나 나타낼 수 있다. 삽입은 내인성 서열 이외의 기원을 가질 수 있는 전체 유전자 또는 유전자들의 단편, 예컨대 엑손의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 (예컨대 유전자에 의해 코드화된 단백질의) 발현 및/또는 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 코드화된 유전자 또는 유전자 생성물 (예컨대 코드화된 단백질)의 서열을 변경시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 코드화된 유전자 생성물 (예컨대 코드화된 단백질)을 절단 또는 단편화할 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 코드화된 유전자 생성물을 연장시킬 수 있고; 일부 그런 구체예에서, 붕괴는 융합 단백질의 조립을 이룰 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 활성이 아닌 수준에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 수준이 아닌 활성에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 수준에 중요한 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 활성에 중요한 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 수준 또는 활성 중 어느 것에든지 중요한 영향을 미치지 않을 수 있다.
본원에 사용되는 구절 "내인성 유전자좌" 또는 "내인성 유전자"는 본원에서 기술되는 붕괴, 결실, 대체, 변경 또는 변형의 도입 전에 원래의 또는 참조 유기체에서 발견되는 유전자의 유전자좌를 말한다. 일부 구체예에서, 내인성 유전자좌는 자연적으로 발견되는 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 내인성 유전자좌는 야생형이다. 일부 구체예에서, 참조 유기체는 야생형 유기체이다. 일부 구체예에서, 참조 유기체는 엔지니어링된 유기체이다. 일부 구체예에서, 참조 유기체는 (야생형이거나 엔지니어링된 것이거나) 실험실-사육된 유기체이다.
구절 "내인성 프로모터"는 예컨대 야생형 유기체에서, 내인성 유전자와 자연적으로 결합되는 프로모터를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "이종성"은 상이한 공급원으로부터의 제제 또는 독립체를 말한다. 예를 들어, 폴리펩티드, 유전자 또는 유전자 생성물과 관련하여 사용될 때 또는 특정 세포 또는 유기체에 존재하는 경우 그 용어는 관련된 폴리펩티드, 유전자 또는 유전자 생성물이 1) 인간의 손에 의해 엔지니어링되었거나; 2) 인간의 손을 통해 (예컨대 유전자 엔지니어링을 통해) 세포 또는 유기체 (또는 그것의 전구체) 안에 도입되었거나; 및/또는 3) 관련된 세포 또는 유기체 (예컨대 관련된 세포 유형 또는 유기체 유형)에 의해 자연적으로 생성되지 않거나 자연적으로 존재하지 않는 것을 분명하게 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "숙주 세포"는 그 안에 이종성 (예컨대 외인성) 핵산 또는 단백질이 도입되어 있는 세포를 말한다. 숙련자들은 본 개시를 읽음에 따라 그런 용어들이 특정 대상 세포를 언급할뿐만 아니라, 그런 세포의 자손을 언급하는 데에도 사용되는 것을 인지할 것이다. 돌연변이 또는 환경적 영향 중 어느 한 가지로 인해 이어지는 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 그런 자손은 실제로, 부모 세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 여전히 본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"의 범주에 포함된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포이거나 그것을 포함한다. 일반적으로 숙주 세포는 그 세포가 지정되는 삶의 터전과 관계없이, 이종성 핵산 또는 단백질을 수용하거나 및/또는 생성하기에 적합한 모든 세포이다.. 예시적인 세포는 원핵세포 및 진핵세포 (단일 세포 또는 다중 세포), 박테리아 세포 (예컨대 대장균, 바실루스 종, 스트렙토마이세스 종 등의 균주들), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포 (예컨대 맥주 효모균, 사카로마이세스 폼베, P. 파스토리스, P. 메타놀리카 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예컨대 SF-9, SF-21, 배큘로바이러스-감염 곤충 세포, 트라이코플러시아 니 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포 또는, 예를 들면 하이브리도마 또는 쿼드로마와 같은 세포 융합물을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 쥐 또는 마우스 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 진핵세포이고 다음 세포들로부터 선택된다: CHO (예컨대 CHO Kl, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예컨대 COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예컨대 HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예컨대 BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3 A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 상기 언급된 세포로부터 유도된 셀라인. 일부 구체예에서, 세포는 하나 또는 그 이상의 바이러스 유전자, 예컨대 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (예컨대 PER.C6TM 세포)를 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 분리된 세포이거나 그것을 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 조직의 일부이다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 유기체의 일부이다.
본원에서 사용되는 용어 "인간화된"은 그것의 구조 (즉 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열)가 비-인간 동물에서 자연적으로 발견되는 특정 유전자 또는 단백질의 구조에 실질적으로 일치하거나 동일하게 일치하는 부분을 포함하고, 또한 관련된 특정 비-인간 유전자 또는 단백질에서 발견되는 것과 상이하고 대신 해당하는 인간 유전자 또는 단백질에서 발견되는 비교할만한 구조들과 보다 밀접하게 일치하는 부분들을 포함하는 핵산 또는 단백질을 나타내는 것으로 기술분야에서 인지되는 의미를 따른다. 일부 구체예에서, "인간화된" 유전자는 실질적으로 인간 폴리펩티드 (예컨대 인간 단백질 또는 그것의 부분 - 예컨대 그것의 특징적인 부분)의 아미노산 서열과 같은 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 유전자이다. 한 가지 실례로서, 막 수용체의 경우에, "인간화된" 유전자는 인간 세포 외 부분의 아미노산 서열과 같은 아미노산 서열 및 비-인간 (예컨대 마우스) 폴리펩티드의 서열과 같은 나머지 서열을 가지는 세포 외 부분을 가지는 폴리펩티드를 코드화할 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화된 유전자는 인간 유전자의 DNA 서열의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화된 유전자는 인간 유전자의 전체 DNA 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화된 단백질은 인간 단백질에서 나타나는 부분을 가지는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화된 단백질은 인간 단백질의 전체 서열을 포함하고 인간 유전자의 상동체 또는 오르토로그에 해당하는 비-인간 동물의 내인성 유전자좌로부터 발현된다.
본원에서 서열의 비교와 관련하여 사용되는 용어 "동일성"은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는, 기술분야에서 공지되어 있는 많은 상이한 알고리즘에 의해 측정되는 것과 같은 동일성을 말한다. 일부 구체예에서, 본원에서 기술되는 동일성은 10.0의 오픈 갭 페널티, 0.1의 연장 갭 페널티를 사용하는 ClustalW v. 1.83 (느린) 배열을 사용하고, Gonnet 유사성 매트릭스 (MACVECTORTM 10.0.2, Mac Vector Inc., 2008)를 사용하여 측정된다.
본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 (1) 처음에 생성될 때 (자연적으로 및/또는 실험적 환경에서 어느 쪽이든) 그것과 결합된 성분들의 적어도 일부로부터 분리된, 및/또는 (2) 인간의 손에 의해 디자인되거나, 생성되거나, 제조되거나 및/또는 제작된 물질 및/또는 독립체를 말한다. 분리된 물질 및/또는 독립체는 처음에 결합되었던 다른 성분들의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 이상으로부터 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 분리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 이상 순수하다. 본원에서 사용될 때, 물질은 다른 성분들이 실질적으로 없다면 "순수"하다. 일부 구체예에서, 기술분야의 숙련자들에 의해 인지될 것과 같이, 물질은 예를 들면 하나 또는 그 이상의 담체 또는 부형제 (예컨대 완충액, 용매, 물 등)와 같은 특정한 다른 성분들과 조합된 후에, 여전히 "분리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 여겨질 수 있고; 그런 구체예에서, 물질의 % 분리 또는 순도는 그런 담체 또는 부형제를 포함하지 않고 계산된다. 실례로서, 일부 구체예에서, 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 생물학적 중합체는 a) 그것의 기원 또는 유도체화의 공급원에 의해 자연적으로 그것의 천연 상태에서 수반되는 성분들의 일부 또는 전부와 결합되어 있지 않은 경우; b) 자연적으로 그것을 생성하는 종들로부터 동일 종의 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 실질적으로 없는 경우; c) 자연적으로 그것을 생성하는 종의 것이 아닌 세포 또는 다른 발현 시스템으로부터의 성분들에 의해 발현되거나 그렇지 않으면 그런 성분들과 결합되어 있는 경우에 "분리된" 것으로 여겨진다. 그러므로, 예를 들어, 일부 구체예에서, 화학적으로 합성되거나 또는 자연적으로 그것을 생성하는 것과 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩티드는 "분리된" 폴리펩티드인 것으로 여겨진다. 다르게는 또는 추가로, 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 정제 기법이 시행된 폴리펩티드는 그것이 a) 자연적으로 결합되어 있거나; 및/또는 b) 처음에 생성될 때에 결합되어 있던 다른 성분들로부터 분리된 정도로 "분리된" 폴리펩티드인 것으로 여겨질 수 있다.
본원에서 사용되는 구절 "비-인간 동물"은 인간이 아닌 어떠한 척추동물 유기체를 말한다. 일부 구체예에서, 비-인간 동물은 원구류, 경골어류, 연골어류 (예컨대 상어 또는 가오리), 양서류, 파충류, 포유류 및 조류이다. 일부 구체예에서, 비-인간 동물은 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소 또는 설치류이다. 일부 구체예에서, 비-인간 동물은 쥐 또는 마우스와 같은 설치류이다.
본원에서 사용되는 구절 "핵산"은 가장 광범위한 의미로, 올리고뉴클레오티드 사슬이거나 그 안으로 통합될 수 있는 어떠한 화합물 및/또는 물질을 말한다. 일부 구체예에서, 핵산은 올리고뉴클레오티드 사슬이거나 포스포다이에스테르 연쇄를 통해 그 안으로 통합될 수 있는 어떠한 화합물 및/또는 물질을 말한다. 맥락으로부터 명백해지는 것과 같이, 일부 구체예에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기들 (예컨대 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)을 말하고; 일부 구체예에서 "핵산"은 개별적인 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 말한다. 일부 구체예에서, "핵산"은 RNA이거나 그것을 포함하고; 일부 구체예에서, "핵산"은 DNA이거나 그것을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 그것을 포함하거나, 그것으로 구성된다. 일부 구체예에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 핵산 유사체이거나, 그것을 포함하거나, 그것으로 구성된다. 일부 구체예에서, 핵산 유사체는 포스포다이에스테르 골격을 활용하지 않는다는 점에서 핵산과 다르다. 예를 들어 일부 구체예에서, 핵산은 기술분야에 공지되어 있고 골격에 포스포다이에스테르 결합 대신 펩티드 결합을 가지며, 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 여겨지는, 하나 또는 그 이상의 "펩티드 핵산"이거나, 그것을 포함하거나, 그것으로 구성된다. 다르게는 또는 추가로, 일부 구체예에서, 핵산은 포스포다이에스테르 결합보다는 하나 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포라미다이트 연쇄를 가진다. 일부 구체예에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 천연 뉴클레오시드 (예컨대 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 및 데옥시시티딘)이거나, 그것을 포함하거나, 그것으로 구성된다. 일부 구체예에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드 유사체 (예컨대 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화된 염기, 삽입된 염기 및 그것들의 조합)이거나, 그것을 포함하거나, 그것으로 구성된다. 일부 구체예에서, 핵산은 천연 핵산에서의 것들과 비교하여 하나 또는 그 이상의 변형 당 (예컨대 2'-플루오로리보오스, 리보오스, 2'-데옥시리보오스, 아라비노오스 및 헥소오스)을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 RNA 또는 단백질과 같은 기능성 유전자 생성물을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 인트론을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 천연 공급원으로부터의 분리, 상보하는 주형을 기초로 한 중합화에 의한 효소적 합성 (생체 내에서 또는 시험관 내에서의), 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생 및 화학적 합성 중 하나 또는 그 이상에 의해 제조된다. 일부 구체예에서, 핵산은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 또는 그 이상의 잔기의 길이이다. 일부 구체예에서, 핵산은 단일 가닥이고; 일부 구체예에서, 핵산은 이중 가닥이다. 일부 구체예에서 핵산은 폴리펩티드를 코드화하는, 또는 폴리펩티드를 코드화하는 서열의 상보물인 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 핵산은 효소적 활성을 가진다.
본원에서 사용되는 구절 "작동가능하게 연결되어 있는"은 기술된 화합물들이 그것들의 의도된 방식으로 기능하는 것을 허용하는 관계로 존재하는 병렬상태를 말한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결되어 있는" 대조 서열은 코딩 서열의 발현이 대조 서열과 부합하는 조건하에서 이루어지는 그런 방식으로 결찰된다. "작동가능하게 연결되어 있는" 서열은 관심의 유전자와 연속적인 발현 제어 서열 및 관심의 유전자를 제어하기 위해 트랜스로 또는 거리를 두고 작용하는 발현 제어 서열 둘 다를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "발현 제어 서열"은 결찰되는 코딩 서열의 발현 및 프로세싱을 이루기 위해 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효과적인 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증강시키는 서열 (즉 Kozac 일치 서열); 단백질 안정성을 증강시키는 서열; 및 필요한 경우 단백질 분비를 증강시키는 서열을 포함한다. 그런 제어 서열의 본질은 숙주 유기체에 따라 상이하다. 예를 들어, 원핵세포에서, 그런 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜성 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하는 한편, 진핵세포에서는 전형적으로 그런 제어 서열은 프로모터와 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "제어 서열"은 그것의 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 성분들을 포함하는 것으로 의도되고, 또한 그것의 존재가 유익한 추가 성분들, 예를 들면 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 아미노산들의 어떠한 중합체 사슬을 말한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 아미노산 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 인간의 손을 통해 디자인되고 및/또는 생성된다는 점에서 엔지니어링되는 아미노산 서열을 가진다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합"은 재조합 수단에 의해 디자인되거나, 엔지니어링되거나, 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 분리되는 폴리펩티드 (예컨대 본원에서 기술되는 신호-조절 단백질), 예컨대 숙주 세포 안에 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩티드, 재조합된 조합 인간 폴리펩티드 라이브러리로부터 분리된 폴리펩티드 (Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., and Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자 도입된 동물 (예컨대 마우스)로부터 분리된 항체 (예컨대 Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370 참조) 또는 서로에 대해 선택된 서열 요소를 스플라이싱하는 것을 포함하는 어떠한 다른 수단에 의해 제조된, 발현된, 생성된 또는 분리된 폴리펩티드를 말하는 것으로 의도된다. 일부 구체예에서, 그렇게 선택된 하나 또는 그 이상의 서열 요소는 자연적으로 발견된다. 일부 구체예에서, 그렇게 선택된 하나 또는 그 이상의 서열 요소는 가상 환경에서 디자인된다. 일부 구체예에서, 그렇게 선택된 하나 또는 그 이상의 서열 요소는 공지된 서열 요소의 돌연변이생성으로부터 (예컨대 생체 내 또는 시험관 내에서의), 예컨대 천연 또는 합성 공급원으로부터 유발된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 관심의 공급 유기체 (예컨대 인간, 마우스 등)의 게놈에서 발견되는 서열들로 구성된다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 돌연변이생성으로부터 (예컨대 시험관 내에서 또는 생체 내에서, 예를 들면 비-인간 동물에서) 유발된 아미노산 서열을 가짐으로써, 그 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리펩티드 서열로부터 기원하고 그것과 관련되는 한편으로, 비-인간 동물의 게놈 내에서 생체 내에서 자연적으로 존재하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대체"는 숙주 유전자좌 (예컨대 게놈)에서 발견되는 "대체된" 핵산 서열 (예컨대 유전자)이 그 유전자좌로부터 제거되고 상이한, "대체" 핵산이 그 자리에 위치하게 되는 과정을 말한다. 일부 구체예에서, 대체된 핵산 서열 및 대체 핵산 서열은 예를 들면, 그것들이 서로에 대해 상동하고 및/또는 해당하는 요소들 (예컨대 단백질-코딩 요소, 조절 요소 등)을 함유한다는 점에서 서로에 비교할 만한다. 일부 구체예에서, 대체된 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 프로모터, 인핸서, 스플라이스 공여 부위, 스플라이스 수용 부위, 인트론, 엑손, 미번역 영역 (UTR)을 포함하고; 일부 구체예에서, 대체 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 코딩 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 대체 핵산 서열은 대체된 핵산 서열의 상동체이다. 일부 구체예에서, 대체 핵산 서열은 대체된 서열의 오르토로그이다. 일부 구체예에서, 대체 핵산 서열은 인간 핵산 서열이거나 그것을 포함한다. 대체 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 그것을 포함하는 것을 포함하는 일부 구체예에서, 대체된 핵산 서열은 설치류 서열 (즉 마우스 서열)이거나 그것을 포함한다. 그렇게 배치된 핵산 서열은 그렇게 배치된 서열을 얻기 위해 사용된 공급원 핵산 서열의 일부인 하나 또는 그 이상의 조절 서열 (예컨대 프로모터, 인핸서, 5'- 또는 3'-미번역 영역 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 구체예에서, 대체는 그렇게 배치된 핵산 서열 (이종성 서열을 포함함)로부터 유전자 생성물을 생성하지만, 내인성 서열은 발현하지 않는 이종성 서열로 내인성 서열을 치환하는 것이고; 대체는 내인성 서열에 의해 코드화된 단백질과 유사한 기능을 가지는 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 가지는 내인성 게놈 서열의 것이다 (예컨대 내인성 게놈 서열은 SIRPα 단백질을 코드화하고, DNA 단편은 하나 또는 그 이상의 인간 SIRPα 단백질을 코드화한다). 다양한 구체예에서, 내인성 유전자 또는 그것의 단편은 해당하는 인간 유전자 또는 그것의 단편으로 대체된다. 해당하는 인간 유전자 또는 그것의 단편은, 구조 및/또는 기능에서, 대체되는 내인성 유전자 또는 그것의 단편의 오르토로그이거나, 또는 그것과 실질적으로 유사하거나 동일한 인간 유전자 또는 단편이다.
본원에서 사용되는 구절 "신호-조절 단백질" 또는 "SIRP"는 신호-조절 단백질 수용체, 예컨대 SIRPα 수용체를 말한다. SIRP는 세포 표면에서 발현되고 백혈구 상에서 막표면 단백질들 사이의 상호작용에 포함된 조절 단백질로서 작용하는 원혈질막 수용체를 포함한다. SIRP 유전자 내에서, 다형태 변이체가 인간 대상에서 기술되어 있다. 인간 및 마우스 SIRP 유전자의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 표 1에 예시로 제공된다. 숙련자들은 본 개시를 읽을 때에 게놈의 하나 또는 그 이상의 (또는 전부의) 내인성 SIRP 수용체 유전자가 하나 또는 그 이상의 이종성 SIRP 유전자 (예컨대 다형태 변이체, 하위유형 또는 돌연변이, 다른 종으로부터의 유전자들, 인간화된 형태 등)에 의해 대체될 수 있음을 인지할 것이다.
본원에서 사용되는 "SIRP -발현 세포"는 신호-조절 단백질 수용체를 발현하는 세포를 말한다. 일부 구체예에서, SIRP-발현 세포는 그것의 표면에 신호-조절 단백질 수용체를 발현한다. 일부 구체예에서, SIRP 단백질은 세포 표면에 발현된 SIRP 단백질을 통해 세포-대-세포 상호작용을 중재하기에 충분한 양으로 세포 표면에 발현된다. 예시적인 SIRP-발현 세포는 뉴런, 림프구, 골수성 세포, 마크로파지, 호중구 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. SIRP-발현 세포는 다양한 외래 항원 또는 병원체에 대한 면역 반응을 조절하기 위해 면역 세포들의 상호작용을 조절한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 비-인간 동물의 하나 또는 그 이상의 세포의 표면상에 발현된 인간화된 SIRP 수용체들을 통한 면역 세포 조절을 증명한다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 관심의 특징 또는 특성을 전체적인 또는 거의 전체적인 크기 또는 정도로 나타내는 질적인 상태를 말한다. 생물학적 기술분야의 숙련자는 생물학적 및 화학적 현상은 완성되거나 및/또는 완전하게 진행되거나 또는 절대적인 결과를 이루거나 회피하는 경우는 거의 없다는 것을 인지할 것이다. 그러므로 용어 "실질적으로"는 본원에서 많은 생물학적 및 화학적 현상에 고유한 완전성의 잠재적인 결핍을 포착하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 구절 "실질적인 상동성"은 아미노산 또는 핵산 서열들 사이의 비교를 말한다. 기술분야의 숙련자들에 의해 인지되는 것과 같이, 두 개의 서열은 일반적으로, 만약 해당하는 위치에 상동하는 잔기를 함유한다면 "실질적으로 상동하는" 것으로 여겨진다. 상동성 잔기는 동일한 잔기일 수 있다. 다르게는, 상동하는 잔기는 동일하지 않은 잔기일 수 있고, 적절하게 유사한 구조적 및/또는 기능적 특성을 가질 것이다. 예를 들어 기술분야의 숙련자들에 의해 인지되는 것과 같이, 특정 아미노산들은 전형적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로, 및/또는 "극성" 또는 "비-극성" 측쇄를 가지는 것으로서 분류된다. 동일 유형의 다른 아미노산에 대한 한 아미노산의 치환은 자주 "상동성" 치환으로서 여겨질 수 있다. 전형적인 아미노산 범주화를 표 1 및 2에 요약한다.
알라닌 Ala A 비극성 중성 1.8
아르기닌 Arg R 극성 포지티브 -4.5
아스파라긴 Asn N 극성 중성 -3.5
아스파르트산 Asp D 극성 네거티브 -3.5
시스테인 Cys C 비극성 중성 2.5
글루탐산 Glu E 극성 네거티브 -3.5
글루타민 Gln Q 극성 중성 -3.5
글리신 Gly G 비극성 중성 -0.4
히스티딘 His H 극성 포지티브 -3.2
아이소로이신 Ile I 비극성 중성 4.5
로이신 Leu L 비극성 중성 3.8
라이신 Lys K 극성 포지티브 -3.9
메티오닌 Met M 비극성 중성 1.9
페닐알라닌 Phe F 비극성 중성 2.8
프롤린 Pro P 비극성 중성 -1.6
세린 Ser S 극성 중성 -0.8
쓰레오닌 Thr T 극성 중성 -0.7
트립토판 Trp W 비극성 중성 -0.9
타이로신 Tyr Y 극성 중성 -1.3
발린 Val V 비극성 중성 4.2
명료하지 않은 아미노산 3-문자 1-문자
아스파라긴 또는 아스파르트산 Asx B
글루타민 또는 글루탐산 Glx Z
로이신 또는 아이소로이신 Xle J
명시되지 않거나 미지의 아미노산 Xaa X
본 기술분야에서 잘 알려져 있는 것과 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열에 대한 BLASTN 및 아미노산 서열에 대한 BLASTP, 갭이 있는 BLAST 및 PSI-BLAST와 같은 상업적 컴퓨터 프로그램들 중에서 이용 가능한 것들을 포함하여, 다양한 알고리즘 중 어느 것을 사용하여 비교될 수 있다. 예시적인 그런 프로그램들은 문헌에 기술되어 있다 (Altschul, et al, Basic local alignment search tool, J. Mol . Biol ., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al, Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999). 상동성 서열의 확인 외에, 상기 언급된 프로그램들은 전형적으로 상동성 정도의 지표를 제공한다. 일부 구체예에서, 두 개의 서열은 그것들의 해당하는 잔기의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 관련된 잔기들의 구역에 걸쳐 상동성이라면 실질적으로 상동하는 것으로 여겨진다. 일부 구체예에서, 관련된 구역은 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 그 이상의 잔기이다. 일부 구체예에서, 관련된 구역은 완전한 서열을 따라 연속적인 잔기들을 포함한다. 일부 구체예에서, 관련된 구역은 완전한 서열을 따라 불연속적인 잔기들을 포함한다. 일부 구체예에서, 관련된 구역은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 잔기이다.
본원에서 사용되는 구절 "실질적인 동일성"은 아미노산 또는 핵산 서열들 사이의 비교를 말한다. 기술분야의 숙련자들에 의해 인지되는 것과 같이, 두 개의 서열은 일반적으로 해당하는 위치들에 동일한 잔기들을 함유한다면 "실질적으로 동일한" 것으로 여겨진다. 본 기술분야에 잘 알려져 있는 것과 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열에 대한 BLASTN 및 아미노산 서열에 대한 BLASTP, 갭이 있는 BLAST 및 PSI-BLAST와 같은 상업적 컴퓨터 프로그램들 중에서 이용 가능한 것들을 포함하여, 다양한 알고리즘 중 어느 것을 사용하여 비교될 수 있다. 예시적인 그런 프로그램들은 문헌에 기술되어 있다 (Altschul, et al, Basic local alignment search tool, J. Mol . Biol ., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al, Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999). 동일한 서열의 확인 외에, 상기 언급된 프로그램들은 전형적으로 동일성 정도의 지표를 제공한다. 일부 구체예에서, 두 개의 서열은 그것들의 해당하는 잔기의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 관련된 잔기들의 구역에 걸쳐 동일하다면 실질적으로 동일한 것으로 여겨진다. 일부 구체예에서, 관련된 구역은 완전한 서열이다. 일부 구체예에서, 관련된 구역은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 잔기이다.
본원에서 사용되는 구절 "표적화 벡터" 또는 "표적화 구성물"은 표적화 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 말한다. 표적화 영역은 표적 세포, 조직 또는 동물의 서열에 동일하거나 또는 실질적으로 동일하고 상동 재조합을 통해 세포, 조직 또는 동물의 게놈 내에 있는 위치에 표적화 구성물의 통합을 제공하는 서열을 포함한다. 부위-특이적 재조합효소 인식 부위 (예컨대 loxP 또는 Frt 부위)를 사용하여 표적화하는 표적화 영역이 또한 포함된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 표적화 구성물은 추가로 특별한 관심의 핵산 서열 또는 유전자, 선택가능한 마커, 제어 및 또는 조절 서열 및 그런 서열들을 포함하는 재조합을 보조하거나 촉진하는 단백질의 외인성 첨가를 통해 중재된 재조합을 허용하는 다른 핵산 서열들을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 표적화 구성물은 추가로 관심의 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 포함하며, 이때 관심의 유전자는 내인성 서열에 의해 코드화된 단백질과 유사한 기능을 가지는 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 코드화하는 이종성 유전자이다.
본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 참조 독립체와 비교하여 하나 또는 그 이상의 화학적 부분의 존재 또는 수준에서 참조 독립체와 구조적으로 상이하지만 참조 독립체와 상당한 구조적 동일성을 보이는 독립체를 말한다. 많은 구체예에서, 변이체는 또한 참조 독립체와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 독립체가 참조 독립체의 "변이체"인 것으로 적절하게 여겨지는 여부는 그것과 참조 독립체와의 구조적 동일성 정도를 기초로 한다. 기술분야의 숙련자들에 의해 인지되는 것과 같이, 어떠한 생물학적 또는 화학적 참조 독립체는 특정한 특징적인 구조적 요소를 가진다. 변이체는, 정의에 의하면, 하나 또는 그 이상의 그런 특징적인 구조적 요소를 공유하는 구별되는 화학적 독립체이다. 일부 실례로, 작은 분자는 특징적인 코어 구조 요소 (예컨대 거대고리 코어) 및/또는 하나 또는 그 이상의 특징적인 펜던트 부분을 가질 수 있어서, 작은 분자의 변이체는 코어 구조 요소 및 특징적인 펜던트 부분을 공유하지만 다른 펜던트 부분 및/또는 코어 내에 존재하는 결합의 유형에서 상이한 (단일 대 이중, E 대 Z 등) 것이고, 폴리펩티드는 선상으로 또는 삼차원 공간으로 서로 관련된 표시된 위치를 가지고 및/또는 특정 생물학적 기능에 기여하는 다수의 아미노산으로 구성되는 특징적인 요소를 가질 수 있으며, 핵산은 선상으로 또는 삼차원 공간에서 서로와 관련된 표시된 위치를 가지는 다수의 뉴클레오티드 잔기들로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 변이 폴리펩티드는 폴리펩티드 골격에 공유적으로 부착된 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상의 차이 및/또는 화학적 부분 (예컨대 탄수화물, 지질 등)의 하나 또는 그 이상의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 일부 구체예에서, 변이 폴리펩티드는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 99%인, 참조 폴리펩티드와의 전체적인 서열 동일성을 나타낸다. 다르게는 또는 추가로, 일부 구체예에서, 변이 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 구체예에서, 참조 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 가진다. 일부 구체예에서, 변이 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 공유한다. 일부 구체예에서, 변이 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성이 부족하다. 일부 구체예에서, 변이 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 비교하여 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성의 감소된 수준을 보여준다. 많은 구체예에서, 관심의 폴리펩티드는, 관심의 폴리펩티드가 원래의 아미노산 서열과 동일하지만 특정 위치에서 적은 수의 서열 변경을 가지는 아미노산 서열을 가진다면 원래의 또는 참조 폴리펩티드의 "변이체"인 것으로 여겨진다. 전형적으로, 변이체의 잔기의 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%보다 적은 잔기들이 원래의 것들과 비교하여 치환된다. 일부 구체예에서, 변이체는 원래의 것과 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 치환된 잔기를 가진다. 보통, 변이체는 매우 적은 수의 (예컨대 5, 4, 3, 2 또는 1보다 적은) 치환된 기능성 잔기 (즉 특정 생물학적 활성에 관여하는 잔기)를 가진다. 나아가, 변이체는 전형적으로 5, 4, 3, 2 또는 1개보다 많지 않은 첨가 또는 결실을 가지며, 보통 원래의 것과 비교하여 첨가 또는 결실을 갖지 않는다. 더욱이, 어떠한 첨가 또는 결실이든지 전형적으로 약 25, 약 20, 약 19, 약 18, 약 17, 약 16, 약 15, 약 14, 약 13, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6개보다 적으며, 통상 약 5, 약 4, 약 3 또는 약 2개 잔기보다 적다. 일부 구체예에서, 원래의 또는 참조 폴리펩티드는 자연적으로 발견되는 것이다. 기술분야의 숙련자들에 의해 인지되는 것과 같이, 관심의 특정 폴리펩티드의 다수의 변이체들은 보통, 특히 관심의 폴리펩티드가 감염성 제제 폴리펩티드인 경우, 자연적으로 발견될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 그것이 결합되는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 말하다. 일부 구체예에서, 벡터는 진핵세포 및/또는 원핵세포와 같은 숙주 세포에서 연결되어 있는 핵산을 염색체-외 복제 및/또는 발현시킬 수 있다. 작동가능하게 연결되어 있는 유전자들의 발현을 지시할 수 있는 벡터들은 본원에서 "발현 벡터"로서 언급된다.
본원에서 사용되는 용어 "야생형"은 자연에서 "정상" (돌연변이, 질환에 걸린, 변경된 등과 대조적인) 상태 또는 맥락에서 발견되는 것과 같은 구조 및/또는 활성을 가지는 독립체를 나타내는, 기술분야에서 인지되는 의미를 가진다. 기술분야의 숙련자들은 야생형 유전자 및 폴리펩티드들인 보통 다수의 상이한 형태 (예컨대 대립유전자)로 존재하는 것을 인지할 것이다.
상세한 설명
본 발명은, 다른 것들 중에서도, 이식 접목, 식세포 작용의 활성화 및 신호 변환에서의 평가를 위해 신호-조절 단백질 (예컨대 SIRP)을 코드화하는 인간화된 유전자 물질을 가지는 개선된 및/또는 엔지니어링된 비-인간 동물을 제공한다. 그런 비-인간 동물은 인간 세포의 이식 접목에서 개선을 제공하는 것으로 여겨진다. 그러므로, 본 발명은 비-인간 동물에서 인간 조혈 세포를 유지하는 데 특히 유용하다. 특히, 본 발명은 비-인간 동물의 세포의 원형질막 표면에서 인간화된 단백질의 발현을 초래하는 설치류 SIRPα 유전자의 인간화를 포함한다. 그런 인간화된 단백질은 이식된 인간 세포의 표면상에 존재하는 인간화된 SIRPα 단백질 및 리간드의 맞물림을 통해 이식된 인간 세포를 인식하는 능력을 가진다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 이식된 인간 조혈 세포를 수용할 수 있고; 일부 구체예에서, 그런 비-인간 포유류는 인간 세포를 포함하는 면역 시스템을 발생시키거나 및/또는 가진다. 일부 구체예에서, 인간화된 SIRPα 단백질은 인간 SIRPα 단백질의 아미노산 잔기 28 내지 362에 해당하는 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 비-인간 동물 및 이종성 종 (예컨대 인간)으로부터의 유전자 물질을 함유하는 내인성 SIRPα 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 인간화된 SIRPα 유전자를 포함하고, 이때 인간화된 SIRPα 유전자는 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함한다.
발명의 다양한 측면이 다음 단원들에서 상세하게 설명된다. 단원들의 사용은 발명을 제한하는 것을 의미하지 않는다. 각 단원은 발명의 어떠한 측면에든지 적용될 수 있다. 본 출원에서 "또는"의 사용은 다른 언급이 없는 한 "및/또는"을 의미한다.
신호-조절 단백질 ( SIRP ) 유전자 패밀리
신호-조절 단백질 (SIRP)은 림프구, 골수성 세포 (마크로파지, 호중구, 과립구, 골수성 수지상 세포 및 비만 세포를 포함함) 및 뉴런 상에서 발현되는 세포 표면 당단백질의 패밀리를 구성한다 (예컨대 Barclay and Brown, 2006, Nat Rev Immunol 6, 457-464 참조). 여러 SIRP 유전자가 보고되어 있고, 그것들은 각각의 리간드 및 그것들의 포함되는 신호화 유형에 의해 범주화될 수 있다. SIRPα (또한 CD172A, SHPS1, P84, MYD-1, BIT 및 PTPNS1로도 언급됨)는 골수종 계통의 면역 세포들상에서 발현되고, 면역수용체 타이로신-기초 억제 모티프 (ITEM)를 통해 억제 수용체로서 기능한다. SIRPα 발현은 또한 뉴런들 상에서도 관찰되었다. SIRPα에 대해 보고된 리간드들은 가장 현저하게는 CD47을 포함하지만, 또한 계면활성제 단백질 A 및 D를 포함한다. SIRPβ (또한 CD 172b로서도 언급됨)는 마크로파지 및 호중구 상에서 발현되지만, 알려진 리간드들은 보고된 것이 없다. SIRPβ는 SIRPα에 비교하여 짧은 세포질 영역을 함유하고 DNAX 활성화 단백질 12 (DAP12)로서 알려져 있는 신호화 성분과 결합하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, SIRPβ는 활성화 수용체인 것으로 여겨진다. SIRPγ (또한 CD172g 및 SIRPβ2로서도 언급됨)는 림프구 및 천연 킬러 세포상에서 발현되고 또한 CD47에 결합하지만, 세포질 꼬리만이 4개의 아미노산을 함유하고 DAP12와의 결합을 촉진할 서열이 부족하기 때문에 신호화 기능이 보고된 것은 없다. 다른 구성원, SIRPδ도 기술되었고 가용성 수용체로서 존재한다.
특히 SIRPα의 역할은 마크로파지에 의한 숙주 세포의 식세포 작용에서 그것의 억제 역할의 관점에서 조사되었다. 예를 들어 마크로파지상에서 SIRPα에 대한 CD47 결합은 억제 신호를 야기하고, 그것은 식세포 작용을 네거티브하게 조절한다. 다르게는, SIRPα 결합을 통해 중재된 포지티브 신호화가 보고되었다 (Shultz et al., 1995, J Immunol 154, 180-91).
SIRPα 서열
인간 및 마우스에 대한 예시적인 SIRPα 서열들은 표 3에 나타낸다. cDNA 서열에 대해, 연속적인 엑손들은 번갈아 있는 밑줄친 텍스트에 의해 분리된다. 단백질 서열에 대해, 신호 펩티드들에 밑줄이 그어졌고, 경막 및 세포질 서열들은 이탤릭체로 표시된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
인간화된 SIRPα 비-인간 동물
SIRPα 단백질을 코드화하는 비-인간 동물의 내인성 유전자좌의 유전자 변형으로부터 유발되는 비-인간 동물의 면역 세포들 (예컨대 골수성 세포들)의 표면상에서 인간화된 SIRPα 단백질을 발현하는 비-인간 동물들이 제공된다. 본원에 기술된 적합한 실례들은 설치류, 특히 마우스를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간화된 SIRPα 유전자는 이종성 종 (예컨대 인간)으로부터의 유전자 물질을 포함하고, 이때 인간화된 SIRPα 유전자는 이종성 종으로부터의 유전자 물질의 코드화된 부분을 포함하는 SIRPα 단백질을 코드화한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 인간화된 SIRPα 유전자는 세포의 원형질막 상에서 발현되는 SIRPα 단백질의 세포 외 부분에 해당하는 이종성 종들의 게놈 DNA를 포함한다. 상기 인간화된 SIRPα 유전자를 함유하는 비-인간 동물, 비-인간 배아 및 세포를 제조하기 위한 비-인간 동물, 배아, 세포 및 표적화 구성물 또한 제공된다.
일부 구체예에서, 내인성 SIRPα 유전자가 결실된다. 일부 구체예에서, 내인성 SIRPα 유전자가 변경되는데, 이때 내인성 SIRPα 유전자의 일부분은 이종성 서열 (예컨대 전체 또는 부분적인 인간 SIRPα 서열)로 대체된다. 일부 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 SIRPα 유전자는 이종성 유전자 (예컨대 인간 SIRPα 유전자)로 대체된다. 일부 구체예에서, 이종성 SIRPα 유전자의 일부분은 내인성 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 안에 삽입된다. 일부 구체예에서, 이종성 유전자는 인간 유전자이다. 일부 구체예에서, 변형 또는 인간화는 내인성 SIRPα 유전자의 두 개의 복사물 중 하나에 대해 이루어지면, 비-인간 동물에 대한 발생은 인간화된 SIRPα 유전자에 관련하여 이종접합성이다. 다른 구체예에서, 비-인간 동물은 인간화된 SIRPα 유전자에 대해 동형접합성이다.
본 발명의 비-인간 동물은 내인성 비-인간 SIRPα 유전자좌에서 전체적으로 또는 부분적으로 인간 SIRPα 유전자를 함유한다. 그러므로, 그런 비-인간 동물은 이종성 SIRP 유전자를 가지는 것으로서 기술될 수 있다. 내인성 SIRPα 유전자좌에서 대체된, 삽입된 또는 변형된 SIRPα 유전자는 예를 들면 PCR, 웨스턴 블롯팅, 서던 블롯팅, 제한 단편 길이 다형 현상 (RELP) 또는 대립유전자 획득 또는 상실 분석을 포함하여 다양한 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 비-인간 동물은 인간화된 SIRPα 유전자에 관련하여 이형접합성이다.
다양한 구체예에서, 본 발명에 따르는 인간화된 SIRPα 유전자는 각각 표 3의 인간 SIRPα 유전자에 나타낸 제 2, 제 3 및 제 4 엑손에 대해 적어도 50% (예컨대 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 가지는 제 2, 제 3 및 제 4 엑손을 가지는 SIRPα 유전자를 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 발명에 따르는 인간화된 SIRPα 유전자는 표 3의 인간 SIRPα cDNA에 나타낸 뉴클레오티드 352 내지 1114에 대해 적어도 50% (예컨대 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 뉴클레오티드 코딩 서열 (예컨대 cDNA 서열)을 가지는 SIRPα 유전자를 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물에 의해 제조된 인간화된 SIRPα 단백질은 표 3에 나타낸 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분에 대해 적어도 50% (예컨대 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 가지는 세포 외 부분을 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물에 의해 제조된 인간화된 SIRPα 단백질은 표 3에 나타낸 인간 SIRPα 단백질에 나타난 아미노산 잔기 28 내지 362에 대해 적어도 50% (예컨대 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 가지는 세포 외 부분을 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물에 의해 제조된 인간화된 SIRPα 단백질은 표 3에 나타낸 인간 SIRPα 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 50% (예컨대 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 가지는 세포 외 부분을 포함한다.
특이적인 다형 형태 또는 대립유전자 변이체 (예컨대 단일 아미노산 차이)를 포함하여 인간화된 SIRPα 단백질을 발현하는 비-인간 동물의 제조를 위한 조성물 및 방법들, 이를테면 인간 프로모터 및 인간 조절 서열로부터 그런 단백질을 발현하는 비-인간 동물의 제조를 위한 조성물 및 방법들이 제공된다. 일부 구체예에서, 내인성 프로모터 및 내인성 조절 서열로부터 그런 단백질을 발현하는 비-인간 동물의 제조를 위한 조성물 및 방법들이 또한 제공된다. 그 방법들은 내인성 SIRPα 유전자에 해당하는 비-인간 동물의 게놈의 정확한 위치에서 전체적으로 또는 부분적으로 인간 SIRPα 단백질을 코드화하는 유전자 물질을 삽입함으로써, 인간인 SIRPα 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 발현하는 인간화된 SIRPα 유전자를 생성하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 그 방법은 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4에 해당하는 게놈 DNA를 비-인간 동물의 내인성 SIRPα 유전자에 삽입함으로써 삽입된 엑손에 의해 코드화된 아미노산들을 함유하는 인간 부분을 함유하는 SIRPα 단백질을 코드화하는 인간화된 유전자를 생성하는 것을 포함한다.
인간화된 SIRPα 유전자 접근법은, 다양한 구체예에서, SIRPα 서열의 게놈 서열이 단일 단편에서 변형되고 따라서 필요한 조절 서열들을 포함함으로써 정상적인 기능성을 보유하기 때문에, 내인성 유전자의 상대적으로 최소한의 변형을 사용하고 비-인간 동물에서 자연적인 SIRPα-중재된 신호 변환을 초래한다. 그러므로 그런 구체예에서, SIRPα 유전자 변형은 다른 주변 유전자 또는 다른 내인성 SIRP 유전자들에 영향을 미치지 않는다. 나아가, 다양한 구체예에서, 변형은 혈장 상의 기능성 수용체의 조립에 영향을 미치지 않고 결합 및 변형에 의해 영향을 받지 않는 수용체의 세포질 부분을 통한 후속적인 신호 변환을 통해 정상적인 이펙터 기능을 유지한다.
내인성 쥐과 SIRPα 유전자 및 인간화된 SIRPα 유전자의 개략적인 예시 (실제 크기는 아님)는 도 1에 제공된다. 예시된 것과 같이, 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 함유하는 게놈 DNA는 표적화 구성물에 의해 내인성 쥐과 SIRPα 유전자의 유전자와에 삽입된다. 이 게놈 DNA는 리간드 결합의 원인이 되는 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분 (예컨대 아미노산 잔기 28 내지 362)을 코드화하는 유전자의 부분을 포함한다.
내인성 SIRPα 유전자좌에 인간화된 SIRPα 유전자를 가지는 비-인간 동물 (예컨대 마우스)은 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 방법에 의해서든 제조될 수 있다. 예를 들어, 인간 SIRPα 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 선택가능한 마커 유전자와 함께 도입시키는 표적 벡터가 제조될 수 있다. 도 1은 인간 SIRPα 의 엑손 2 내지 4의 삽입을 포함하는 마우스 게놈을 예시한다. 예시된 것과 같이, 표적화 구성물은 내인성 쥐과 SIRPα 유전자의 엑손 2의 상류에 있는 서열을 함유하는 5' 상동성 아암과, 이어서 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 함유하는 게놈 DNA 단편, 약물 선택 카세트 (예컨대 loxP 서열이 양옆에 있는 네오마이신 내성 유전자) 및 내인성 쥐과 SIRPα 유전자의 엑손 4의 하류에 있는 서열을 함유하는 3' 상동성 아암을 함유한다. 상동성 재조합시에, 내인성 쥐과 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4는 표적화 벡터에 함유된 서열에 의해 대체된다. 인간화된 SIRPα 유전자가 생성되고 결과적으로 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4에 의해 코드화된 아미노산을 함유하는 인간화된 SIRPα 단백질을 발현하는 세포 또는 비-인간 동물이 생성된다. 약물 선택 카세트는 재조합효소의 후속적인 첨가에 의해 (예컨대 Cre 처리에 의해) 임의로 제거될 수 있다.
본원에서 기술된 인간화된 SIRPα 유전자를 가지는 마우스 외에, 인간화된 SIRPα 유전자를 포함하는 다른 유전자 변형된 비-인간 동물이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 그런 비-인간 동물은 내인성 SIRPα 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 인간화된 SIRPα 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 그런 비-인간 동물은 내인성 유전자좌로부터 인간화된 SIRPα 단백질을 발현하고, 이때 인간화된 SIRPα 단백질은 인간 SIRPα 단백질의 아미노산 잔기 28 내지 362를 포함한다.
그런 비-인간 동물은 마우스, 쥐, 토끼, 돼지, 소 (예컨대 젖소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰담비, 영장류 (예컨대 마모셋, 붉은털 원숭이)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 유전적으로 변형 가능한 적합한 ES 세포가 쉽게 이용될 수 없는 비-인간 동물에 대해, 본원에서 기술되는 유전자 변형을 포함하는 비-인간 동물을 제조하기 위하여 다른 방법들이 사용된다. 그런 방법은, 예컨대 비-ES 세포 게놈 (예컨대 섬유아세포 또는 유도된 다능 세포)을 변형시키고 그 변형된 게놈을 적합한 세포, 예컨대 난모세포에 전달하기 위해 핵 전달을 사용하며, 그 변형된 세포 (예컨대 변형된 난모세포)를 비-인간 동물에 배아를 형성하기에 적합한 조건하에서 수태시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 포유류이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 작은 포유류, 예컨대 다이포도이데아 (Dipodoidea) 또는 뮤로이데아 (Muroidea) 상과 (superfamily)의 동물이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전자 변형된 동물은 설치류이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 설치류는 마우스, 쥐 및 햄스터로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 설치류는 뮤로이데아 상과로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전자 변형된 동물은 칼로미시다에 (Calomyscidae) (예컨대 마우스-유사 햄스터), 크리세티다에 (Cricetidae) (예컨대 햄스터, 뉴월드 쥐 및 마우스, 들쥐), 뮤리다에 (Muridae) (트루 마우스 및 참쥐, 게르빌루스 쥐, 아프리카가시쥐, 볏 쥐), 네소미이다에 (Nesomyidae) (클라이밍 마우스, 락 마우스, 위드 테일 랫트, 마다가스카르 쥐 및 마우스), 플라타칸쏘미이다에 (Platacanthomyidae) (예컨대 가시겨울잠쥐) 및 스팔라시다에 (Spalacidae) (예컨대 뒤쥐, 대나무쥐 및 조커(zokor))로부터 선택된 과로부터 유래된다. 일부 특정 구체예에서, 본 발명의 유전자 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 참쥐 (뮤리다에 과), 게르빌루스 쥐, 아프리카가시쥐 및 볏 쥐로부터 선택된다. 일부 특정 구체예에서, 본 발명의 유전자 변형된 마우스는 뮤리다에 과의 구성원으로부터 유래된다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 설치류이다. 일부 특정 구체예에서, 본 발명의 설치류는 마우스 및 쥐로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 마우스이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/01a로부터 선택된 C57BL 계통의 마우스인 설치류이다. 일부 특정 구체예에서, 본 발명의 마우스는 29P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예컨대 129S1/SV, 129Sl/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 계통으로 구성되는 군으로부터 선택된 129 계통이다 (예컨대 Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach et al., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032 참조). 일부 특정 구체예에서, 본 발명의 유전자 변형된 마우스는 상기 언급된 129 계통과 상기 언급된 C57BL 계통의 혼합물이다. 일부 특정 구체예에서, 본 발명의 마우스는 상기 언급된 129 계통들의 혼합물이거나, 상기 언급된 BL/6 계통들의 혼합물이다. 일부 특정 구체예에서, 본원에 기술되는 혼합물의 129 계통은 129S6 (129/SvEvTac) 계통이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 마우스는 BALB 계통, 예컨대 BALB/c 계통이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 마우스는 BALB 계통과 다른 상기 언급된 계통의 혼합물이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 쥐이다. 일부 특정 구체예에서, 본 발명의 쥐는 Wistar 쥐, LEA 계통, Sprague Dawley 계통, Fischer 계통, F344, F6 및 Dark Agouti로부터 선택된다. 일부 특정 구체예에서, 본원에 기술되는 쥐 계통은 Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 및 Dark Agouti로 구성되는 군으로부터 선택되는 둘 또는 그 이상의 계통의 혼합물이다.
인간화된 SIRPα 유전자를 가지는 비-인간 동물을 사용하는 방법
SIRPα 돌연변이 및 유전자 도입된 비-인간 동물들 (예컨대 마우스)이 보고되었다 (Inagaki et al., 2000, EMBO Journal 19(24):6721-6731; Strowig et al., 2011, Proc. Nat. Acad. Sci. 108(32):13218-13223). 그런 동물들은 SIRPα 발현, 기능 및 조절의 분자적 측면들을 측정하기 위해 다양한 분석에서 사용되어 왔다. 그러나, 그것들에 제한이 없는 것이 아니다. 예를 들어, SIRPα 돌연변이 마우스의 사용은 SIRPα의 돌연변이 형태를 함유하는 세포가 신호를 보내지 못하는 무능력으로부터 유발된 해로운 건강 상태로 인해 제한되어 왔다. 나아가, SIRPα에 대한 리간드인 CD47은 SIRPα의 돌연변이 형태와 동일한 세포 상에 존재해야 하고 두 단백질은 둘 다 세포 내 신호를 제공할 수 있기 때문에, 그런 결과가 SIRPα 신호화의 결핍으로부터 유래되는 지 또는 CD47 결합의 결핍으로부터 유래되는 것인지를 구별하는 것은 불가능하다. 인간 SIRPα 유전자도입 마우스의 경우에, 마우스 SIRPα는 무상이고 기능적이다. 그러므로 다양한 생물학적 과정 (예컨대 이식)에서 SIRPα-의존성 기능은, 인간 및 마우스 SIRPα 수용체 둘 다 존재하고 기능적이기 때문에 이들 마우스에서 명백하게 인간 SIRPα 또는 마우스 SIRPα 중 어느 하나의 기능에 단독으로 기여할 수 없다.
본 발명의 비-인간 동물은 다양한 분석에 유용한 개선된 생체 내 시스템 및 인간 SIRPα를 발현하는 생물학적 물질의 공급원 (예컨대 세포)을 제공한다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 SIRPα를 표적화하고 및/또는 SIRPα-CD47 신호화를 조절하는 치료제를 개발하기 위해 사용된다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 마우스들은 인간 SIRPα에 결합하는 후보 치료제들 (예컨대 항체들)을 스크리닝하고 개발하기 위해 사용된다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 본원에 기술된 비-인간 동물의 세포의 표면상에서 인간화된 SIRPα의 길항제 및/또는 아고니스트의 결합 프로필을 측정하기 위해 사용된다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 SIRPα 신호 변환 (예컨대 인산화)을 차단 또는 조절하는 치료적 효과 및 세포 변환의 결과로서 유전자 발현에 미치는 효과를 측정하기 위해 사용된다. 다양한 구체예에서, 세포들이 분리되는 본 발명의 비-인간 동물들은 비-인간동물의 세포 표면에서 인간 SIRPα에 결합하는 후보 치료제에 노출되고, 계속해서 일전 시간이 지난 후, SIRPα-의존성 과정, 예를 들면 B 및/또는 T 세포 증식, 혈소판의 제거 및 사이토킨 발현의 유도에 미치는 효과에 대해 분석된다.
본 발명의 비-인간 동물들은 인간화된 SIRPα 단백질을 발현하고, 그러므로 세포, 셀라인 및 세포 배양물들은 결합 및 기능성 분석에 사용하기 위하여, 예컨대 특히 SIRPα 길항제 또는 아고니스트가 인간 SIRPα 서열 또는 에피토프에 특이적인 경우에, SIRPα 길항제 또는 아고니스트의 결합 또는 기능에 대해 분석하기 위하여, 인간화된 SIRPα의 공급원으로서 작용하기 위해 생성될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본원에 기술된 비-인간 동물에 의해 발현된 인간화된 SIRPα 단백질은 변이 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 리간드 결합 잔기들과 결합된 변이를 가지는 변이 인간 SIRPα 단백질들이 보고되었다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물들은 인간화된 SIRPα 단백질 변이체를 발현한다. 다양한 구체예에서, 변이체는 리간드 결합과 관련된 아미노산 위치에서 다양한 형태를 가진다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물들은 인간 SIRPα의 다형태적 변이체와의 상호작용을 통하여 리간드 결합의 효과를 측정하기 위해 사용된다.
본 발명의 비-인간 동물들로부터의 세포들은 분리되고 필요에 따라 사용되거나, 또는 많은 세대 동안 배양물로 유지될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물로부터의 세포들은 불멸화되고 배양물로 무한하게 유지된다 (예컨대 연속적인 배양).
다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물들의 세포들은 인간 SIRPα를 조절하는 후보 치료제를 스크리닝하고 개발하기 위한 세포 이동 또는 확산 분석에 사용된다. 그런 과정들은 상처 치유, 분화, 증식 및 생존을 포함하여 많은 세포 과정들에 대해 필요하다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물들의 세포들은 인간 SIRPα를 표적으로 하는 후보 치료제의 약물-독물학적 측면을 시험하기 위한 거핵구 콜로니-형성 세포들에 대한 클론성 분석에 사용된다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물들의 세포들은 식세포 작용의 SIRPα-의존성 조절을 조절하는 화합물 또는 생물학적 제제들의 치료적 잠재력을 측정하기 위한 식세포 작용 분석에 사용된다.
본 발명의 비-인간 동물들은 약물 또는 백신의 분석 및 시험을 위한 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구체예에서, 후보 약물 또는 백신은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 비-인간 동물에게 전달되고, 이어서 그 약물 또는 백신에 대한 하나 또는 그 이상의 면역 반응, 그 약물 또는 백신의 안전성 프로필 또는 질환 또는 상태에 미치는 영향을 측정하기 위해 비-인간 동물들이 모니터링될 수 있다. 그런 약물 또는 백신들은 그런 비-인간 동물들에서 개선되고 및/또는 개발될 수 있다.
본 발명의 비-인간 동물들은 채택된 전달을 통한 인간 세포-대-세포 상호작용의 메커니즘을 설명하는 개선된 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 종양 이종이식편으로 이식되고, 이어서 고체 종양 또는 다른 악성 종양의 근절에서의 유효성을 측정하기 위해 채택된 전달에 의해 림프구를 침투하는 종양의 제 2 이식이 비-인간 동물에 이식될 수 있다. 그런 실험은 비-이간 동물의 내인성 SIRPα와 경합하는 일 없이 인간 SIRPα의 독점적인 존재로 인해 인간 세포를 사용하여 시행될 수 있다. 나아가, 이종이식에 사용하기 위한 치료제 및 약제들은 그런 비-인간 동물에서 개선되고 및/또는 개발될 수 있다.
본 발명의 비-인간 동물들은 이식을 통한 인간 조혈 줄기세포의 유지 및 개발을 위한 개선된 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물들은 비-인간 동물 내에서 인간 줄기세포의 개선된 개발 및 유지를 제공한다. 다양한 구체예에서, 분화된 인간 B 및 T 세포의 증가된 집단이 비-인간 동물의 혈액, 골수, 비장 및 흉선에서 관찰된다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물들은 마우스 및 인간 SIRPα 둘 다를 발현하는 비-인간 돈물에 비교하여 인간 세포의 이식의 수준의 증가를 제공한다.
본 발명의 비-인간 동물들은 인간 세포를 표적화하는 치료 약물의 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물들은 인간 세포로 이식되고, 그런 인간 세포를 표적화하는 약물 후보가 그런 동물에 투여된다. 그런 다음 그 약물의 치료 효능은 약물의 투여 후에 비-인간 동물에서 인간 세포를 모니터링함으로써 측정된다. 비-인간 동물에서 시험될 수 있는 약물은 인간 세포를 표적화함으로써 (예컨대 인간 세포에 결합 및/또는 인간 세포상에서 작용함) 인간 질환 및 상태의 치료에 대한 의도된 치료 효과를 가지는, 작은 분자 화합물, 즉 분자량이 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD 또는 800 달톤 미만인 화합물들과 큰 분자 화합물 (예컨대 단백질, 예를 들면 항체) 둘 다이다.
일부 구체예에서, 약물은 항암 약물이고, 인간 세포는 암세포이며, 암세포는 일차 암세포 또는 일차 암으로부터 수립된 셀라인의 세포일 수 있다. 이들 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 인간 암세포로 이식되고, 항암 약물이 그 비-인간 동물에 제공된다. 약물의 효능은 비-인간 동물에서 인간 암세포의 성장 또는 전이가 약물의 투여의 결과로서 억제되었는지의 여부를 평가함으로써 측정될 수 있다.
특정 구체예에서, 항암 약물은 인간 암세포 상에서 항원에 결합하는 항체 분자이다. 특정 구체예에서, 항암 약물은 인간 암세포 상에서 항원에 결합하고, 다른 인간 세포 상에서, 예를 들면 예컨대 B 세포 및 T 세포와 같은 인간 면역 시스템의 세포 (또는 "인간 면역 세포") 상에서 항원에 결합하는 이중특이성 항체이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 인간 면역 세포 또는 인간 면역 세포로 분화하는 세포들로 이식된다. 인간 면역 세포들이 이식되어 있는 그런 비-인간 동물은 인간 암세포로 이식되고, 항암 약물, 예컨대 인간 암세포 상에서 항원에 결합하고 인간 면역 세포 (예컨대 T-세포) 상에서 항원에 결합하는 이중특이성 항체로 투여된다. 이중특이성 항체의 치료 효능은 비-인간 동물에서 인간 암세포의 성장 또는 전이를 억제하는 항체의 능력을 토대로 평가될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 인간 면역 세포 (다른 것들 중에서도 T 세포, B 세포, NK 세포를 포함함)를 발생시키는 인간 CD34+ 조혈 선구 세포로 이식된다. 인간 B 세포 림프종 세포 (예컨대 Raji 세포)가 인간 면역 세포로 이식되어 있는 그런 비-인간 동물안에 이식되고, 그런 다음 비-인간 동물에서 종양 성장을 억제하는 이중특이성 항체의 능력을 시험하기 위하여, CD20 (정상 B 세포 및 특정 B 세포 악성 종양 상의 항원) 및 T-세포의 CD3 하위유닛에 결합하는 이중특이성 항체로 투여된다.
실시예
다음의 실시예들은 발명의 제조 방법 및 사용 방법 및 조성물들을 기술분야의 숙련자들에게 설명하기 위해 제공되고, 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 다르게 표시되지 않는 한, DSH도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.
실시예 1. 내인성 신호-조절 단백질 ( SIRP ) 유전자의 인간화
이 실시예는 설치류 (예컨대 마우스)와 같은 비-인간 포유류에서 신호-조절 단백질 알파 (SIRPα)를 코드화하는 내인성 유전자를 인간화하는 예시적인 방법을 설명한다. 인간 SIRPα는 적어도 10개의 대립유전자 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다. 이 실시예에서 기술되는 방법들은 어떠한 인간 대립유전자, 또는 인간 대립유전자들 (또는 대립유전자 단편들)의 조합을 필요에 따라 사용하여 비-인간 동물의 내인성 SIRPα 유전자를 인간화하기 위해 사용될 수 있다. 이 실시예에서, 인간 SIRPα 변이체 1을 마우스의 내인성 SIRPα 유전자를 인간화하는 데 사용한다.
SIRP (예컨대 SIRPα) 유전자의 세포외재성 영역의 인간화를 위한 표적화 벡터를 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 구성하였다 (예컨대 미국 특허 제 6,586,251호 및 Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659 참조).
간단히 설명하면, 마우스 박테리아 인공 염색체 (BAC) 클론 bMQ-261H14를 변형시켜서 내인성 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 함유하는 서열을 결실시키고 인간 BAC 클론 CTD-3035H21을 사용하여 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 삽입하였다. 내인성 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4에 해당하는 게놈 DNA (~8555 bp)를 BAC 클론 bMQ-261H14에서 BAC 클론 CTD-3035H21로부터의 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 함유하는 ~8581bp의 DNA 단편으로 대체하였다. BAC 클론 CTD-3035H21에 함유된 인간 SIRPα 대립유전자의 서열 분석은 인간 변이체 1에 해당하는 대립유전자를 나타냈다. 양옆에 loxP 부위가 있는 네오마이신 카세트를 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 함유하는 ~8581bp의 인간 DNA 단편의 단부에 첨가하였다 (도 1).
상류 및 하류 상동성 아암을 마우스 BAC DNA로부터 각각 엑손 2 및 4의 5' 및 3' 위치에서 얻었고, 그것을 ~8581bp의 인간 단편-네오마이신 카세트에 첨가하여 내인성 SIRPα 유전자의 인간화를 위한 최종 표적화 벡터를 만들었는데, 그것은 5'에서 3' 방양으로 내인성 SIRPα 유전자의 엑손 2의 마우스 DNA 5'의 19 kb를 함유하는 5' 상동성 아암, 양옆에 loxP 부위가 있는 네오마이신 카세트 및 내인성 SIRPα 유전자의 엑손 4의 마우스 DNA 3'의 21 kb를 함유하는 3' 상동성 아암을 함유하였다. 표적화 벡터의 표적화된 삽입은 엑손 4와 5 사이의 마우스 SIRPα 유전자의 제 5 인트론에 네오마이신 카세트를 위치시켰다. 표적화 벡터를 SwaI을 사용한 소화에 의해 선형화한 후 박테리아 세포에서의 상동성 재조합에 사용하여, 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4로 마우스 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4의 표적화된 대체를 이루었다 (도 1).
표적화된 BAC DNA (상기 기술됨)를 사용하여 마우스 ES 세포를 일렉트로포레이션하여 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 포함하는 게놈 단편으로 내인성 마우스 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4의 대체를 포함하는 변형된 ES 세포를 생성하였다. 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 포함하는 게놈 단편을 함유하는 포지티브 ES 세포를 TAQMANTM 프로브를 사용한 정량 PCR에 의해 확인하였다 (Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). 상류 삽입 지점을 가로지르는 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였고, 그것은 삽입 지점에 존재하는 인간 SIRPα 게놈 서열에 연속적으로 연결된 삽입 지점 (아래에서 괄호 안에 포함됨)의 상류의 내인성 마우스 서열을 나타낸다: (AGCTCTCCTA CCACTAGACT GCTGAGACCC GCTGCTCTGC TCAGGACTCG ATTTCCAGTA CACAATCTCC CTCTTTGAAA AGTACCACAC ATCCTGGGGT) GCTCTTGCAT TTGTGTGACA CTTTGCTAGC CAGGCTCAGT CCTGGGTTCC AGGTGGGGAC TCAAACACAC TGGCACGAGT CTACATTGGA TATTCTTGGT (SEQ ID NO:6). 네오마이신 카세트의 5' 단부에서 하류 삽입 지점을 가로지르는 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였고, 그것은 삽입 지점 (이탤릭체로 표시된 loxP 서열을 가지는 아래 괄호 안에 포함됨)의 하류에 카세트 서열과 연속적인 인간 SIRPα 게놈 서열을 나타낸다: GCTCCCCATT CCTCACTGGC CCAGCCCCTC TTCCCTACTC TTTCTAGCCC CTGCCTCATC TCCCTGGCTG CCATTGGGAG CCTGCCCCAC TGGAAGCCAG (TCGAG A TAA CTTCGTA TAA TGTA TGCTA TA CGAA GTTA T ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG CGCCCCCCTC CTCACGGCGA) (SEQ ID NO:7). 네오마이신 카세트의 3' 단부에서 하류 삽입 지점을 가로지르는 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였고, 그것은 내인성 SIRPα 유전자 (아래에서 괄호 안에 포함됨)의 엑손 4의 마우스 게놈 서열 3'과 연속적인 카세트 서열을 나타낸다: CATTCTCAGT ATTGTTTTGC CAAGTTCTAA TTCCATCAGA CCTCGACCTG CAGCCCCTAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGC (TGTCTCATAG AGGCTGGCGA TCTGGCTCAG GGACAGCCAG TACTGCAAAG AGTATCCTTG TTCATACCTT CTCCTAGTGG CCATCTCCCT GGGACAGTCA) (SEQ ID NO:8). 그런 다음 포지티브 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스에 VELOCIMOUSE® 방법을 사용하여 이식함으로써 (예컨대 미국 특허 제 7,294,754호 및 Poueymirou et al. 2007, F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(l):91-99 참조) 마우스의 내인성 SIRPα 유전자 안에 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4가 삽입되어 있는 한배 새끼들을 제조하였다.
상기 기술된 표적화된 ES 세포들을 공여 ES 세포들로서 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 (상기 동일) 8-세포 단계 마우스 배아에 도입하였다. 내인성 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4의 인간화를 포함하는 마우스들을 인간 SIRPα 유전자 서열의 존재를 검출하는 대립유전자 분석 (Valenzuela et al., 상기 동일)을 변형시켜 사용하는 유전자 분류에 의해 확인하였다.
인간화된 SIRPα 유전자 구성물 (즉 마우스 SIRPα 유전자에 인간 SIRPα 엑손 2 내지 4를 함유함)을 내포하는 마우스들을 Cre 딜리터 (deletor) 마우스 계통으로 사육하여 (예컨대 국제 특허 출원 공보 WO 2009/114400호 참조), 예컨대 ES 세포 단계에서 또는 배아에서 제거되지 않는 표적화 벡터에 의해 도입된 어떠한 록스드 (loxed, 양옆에 loxP가 있는) 네오마이신 카세트를 제거할 수 있다. 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 보유된다.
새끼들을 유전형으로 분류하고 인간화된 SIRPα 유전자 구성물에 대해 이형접합성인 새끼를 특성확인을 위해 선택한다.
실시예 2: 비-인간 동물에서의 인간화된 SIRPα의 발현
이 실시예는 내인성 SIRPα 유전자좌에서 실시예 1에 기술된 인간화된 SIRPα 유전자 구성물을 함유하도록 엔지니어링된 비-인간 동물로부터의 세포 표면상에서의 SIRPα 단백질의 특징적인 발현을 예시한다.
간단히 설명하면, 비장을 야생형 (WT) 및 인간화된 SIRPα 유전자에 대해 이형접합성인 마우스들로부터 분리하였다. 그런 다음 비장을 콜라게나제 D (Roche Bioscience)로 관류시키고 제조업체의 명세를 따라 적혈구를 ACK 용해 완충액으로 용해시켰다. 마우스 및 인간 SIRPα의 세포 표면 발현을 형광 색소-포합된 항-CD3 (17A2), 항-CD19 (1D3), 항-CD11b (M1/70), 항-인간 SIRPα (SE5A5)및 항-마우스 SIRPα (P84)를 사용하여 FACS에 의해 분석하였다. 유동 세포분석을 BD LSRFORTESSATM을 사용하여 수행하였다. CD11b+ 단핵세포의 표면 상에서 검출되는 인간 및 마우스 SIRPα의 예시적인 발현을 도 2에 도시한다.
도 2에서 알 수 있는 것과 같이, 마우스 및 인간화된 SIRPα 둘 다의 발현은 분명하게 이형접합성 마우스로부터의 CD11b+ 단핵세포의 표면 상에서 검출가능하였다.
실시예 3. 인간화된 SIRP 비-인간 동물에서 인간 세포 이식
이 실시예는 인간화된 SIRPα 유전자를 가지는 본 발명의 비-인간 동물에서 인간 조혈 줄기세포의 개선된 이식을 예시한다.
간단히 설명하면, 인간화된 SIRPα 유전자가 있거나 없는 Rag2 KO IL2Rγnu11 마우스들을 병원체-없는 조건하에서 길렀다. 신생 마우스 (2 내지 5일령)들을 240 cGy로 조사하고 1x1O5 CD34+ 인간 조혈 줄기세포를 간-내로 주입하였다. 마우스들을 이식후 10 내지 12주 후에 출혈시키고 혈액을 형광색소-포합된 항-인간 CD45 (HBO), 항-이간 CD3 (SK7), 항-인간 CD19 (HIB19) 및 항-마우스 CD45 (30-F11)를 사용하여 FACS에 의해 분석하여 인간 면역 시스템의 재구성에 대해 조사하였다. 마우스의 유전적 배경은 BALB/cTa x 129/SvJae이다.
야생형, 인간화된 SIRPα에 대해 이형접합성인 마우스, 인간화된 SIRPα에 대해 동형접합성인 마우스 및 ALB-Rag2-/-IL2Rγc-/- (DKO) 마우스에서의 인간 CD34+ 세포의 예시적인 백분율을 도 3 내지 5에 나타낸다.
이 실시예에서 알 수 있는 것과 같이, 인간화된 SIRPα 유전자에 동형접합성인 마우스들은 시험된 다른 계통에 비교하여 말초 (예컨대 혈액)에 최고 백분율의 인간 CD34+ 세포를 제공함으로써 인간 CD34+ 세포의 개선된 이식을 증명한다.
이들 데이터를 함께 취합하면, 인간화된 SIRPα는 본원에서 기술되는 마우스에서 마우스의 세포 표면상에서의 발현을 통해 기능적이며, 인간 CD34+ 조혈 줄기세포의 이식을 지지할 수 있음을 증명한다.
실시예 4. BRG 마우스에서 Raji 림프종 종양 성장에 미치는 Ab 1의 효능의 평가
요약
Ab 1은 T 세포 수용체 (TCR) 복합체와 결합된 T 세포 항원인 CD3, 및 정상적인 B 세포 및 여러 B 세포 계통 악성 종양에 존재하는 B 세포 표면 항원인 CD20에 결합하는 이중특이성 항체 (bsAb)이다. Ab 1은 TCR의 CD3 하위유닛에 결합함으로써 세포독성 T 세포와 CD20-발현 세포를 가교시키기 위해 디자인되고, 결과적으로 CD20-지시된 다클론성 T 세포 사멸을 초래한다. CD20은 면역치료법에 대해 임상적으로 인증된 표적이고; 키메라 항체인 리툭시맙은 비호지킨 림프종 (NHL) 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL)의 치료에 대해 승인되었다. 비록 환자들이 리툭시맙에 대해 내성이 될 수는 있지만, CD20의 발현의 손실은 전형적으로 관찰되지 않는다. 그러므로, CD20-포지티브 종양 세포를 세포독성 T 세포에 가교시키는 이중특이성 항체는 잠재적인 항-종양 전략을 나타낸다.
이 연구에서, 인간 B 세포 림프종 (Raji) 종양 성장에 미치는 CD20xCD3 bsAb Ab 1을 사용한 치료 효과를 마우스 종양 모델에서 조사하였다. 모델은 SIRPα에 대해 인간화된 hCD34+ 이식된 BALB/c-Rag2null IL2rγnull (BRG) 마우스를 활용하였다. 인간 T, B 및 NK 세포뿐만 아니라 과립구, 단핵세포 및 수지상 세포 (DC)를 가지는 이들 마우스를 Ab 1로 주 2회 처리하였고, 그 결과 비히클 대조표준 및 비-결합 대조표준 mAb, 대조표준 Ab 5와 비교하여 Raji 종양 성장의 상당한 억제를 초래하였다. Ab 1 처리는 0.4 mg/kg 및 0.04 mg/kg 둘 다에서 전 처리기간을 통해 비히클 대조표준 그룹보다 큰 유의미로 (p<0.0001) 종양 성장을 억제하였다. 어떠한 처리 그룹에서도 유의미한 체중 손실은 관찰되지 않았다. 이들 결과는 인간 면역 세포를 가지는 마우스에서 Ab 1이 Raji 종양을 표적화하고, 결과적으로 상당한 종양 억제를 초래하는 것을 보여준다.
물질 및 방법
물질
시험 화합물 및 대조 항체
시험 화합물: Ab 1.
대조 항체: 대조표준 Ab 5.
시약
Figure pct00006
시험 시스템
이 보고에서 제시된 종양 연구는 신호 조절 단백질 알파 (SIRPα) 유전자에 대해 인간화된 24 내지 32주령의 수컷 및 암컷 BALB/c-Rag2null IL2rγnull (BRG) 면역결핍 마우스를 사용하였다. 이것들은 Regeneron에서 배아 줄기 (ES) 세포 표적화에 의해 제조하였다 (Strowig et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 108(32): 13218-13223 (2011)). CD47을 인식할 때, SIRPα는 마크로파지에 의한 CD47 포지티브 세포의 제거를 억제한다. 이전 연구들은 인간 SIRPα 트랜스유전자를 발현하는 BRG 마우스들이 인간 HSC의 이식을 증강시켰음을 보여주었다 (Strowig et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 108(32):13218-13223 (2011)).
신생 SIRPα BRG 새끼들을 조사하였고 (irradiated) 태아 간으로부터 유도된 hCD34+ 조혈 선구 세포로 이식하였다 (Traggiai, et al., Science, 304(5667): 104-107 (2004)). 이들 인간 HSC는 인간 T,B 및 NK 세포뿐 아니라, 과립구, 단핵세포 및 수지상 세포 (DC)에 대해 발생한다. 순환하는 인간 B 세포의 낮은 수준으로 인해, 순환하는 인간 IgG의 수준도 낮다. 나아가, 이들 마우스는 배중심 (germinal center)을 발생시키지 않고, 림프절이 부족하며 T 및 B 세포가 고갈된다면 제한된 T 및 B 세포 보충을 가진다. 쥐과 단핵세포, DC 및 과립구는 마찬가지로 존재가 유지된다. 면역 세포 조성을 혈액의 유동 세포분석에 의해 확인하였고, 마우스들을 종양 연구에 사용하기 전에 % 인간 CD45 이식에 의해 랜덤화하였다. 마우스들을 0일에 Raji 종양 세포로 이식하고, 종양 성장을 차단하는 Ab 1의 능력을 4주에 걸쳐 시험하였다. 체중 및 종양 부피를 이식 후 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 및 34일에 기록하였다.
실험 디자인
SIRPα BRG 마우스에서 인간 면역 시스템의 재구성
면역결핍 BALB/c Rag2 /-γc-/- (BRG) 인간 SIRP alpha (SIRPα BRG) 마우스들을 Regeneron 동물 시설의 무균 분리기에서 사육하였다. 신생 마우스들을 인간 태아 간으로부터 분리한 인간 CD34+ 조혈 줄기세포 (HSC)를 주사하기 8 내지 24시간 전에 1 용량의 300cGrey로 조사하였다. 이식으로 12 내지 16주 동안 발생을 허용하고 이식된 세포의 수를 주기적으로 유동 세포분석에 의해 평가하였다. 전체 실험 기간 동안 동물들을 Regeneron 동물 시설에서 12-시간 주간/야간 리듬의 표준 조건하에 하우징하였고, 음식물과 물은 임의로 섭취하에 하였다. 우리 (cage) 당 동물의 수는 최대 5마리로 제한하였다.
마우스 혈액을 분석하여 연구 전에 % 이식 수준을 측정하였다. 전형를 150 μL의 2% EDTA (에틸렌다이아민테트라아세트산; 15 mg/mL)를 함유하고 있는 2개의 모세관 튜브에 수집하였다. 적혈구를 ACK 용해 완충액을 사용하여 3분 동안 용해시키고, 완충액을 PBS (칼슘 또는 마그네슘이 없음)로 중화시켰다. 세포를 Fc 블록으로 5분 동안 4℃에서 차단한 후 인간 CD45, NKp46, CD19, CD3 및 CD14로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 샘플을 5-레이저 유동 세포분석 (BD Fortessa)에 의해 분석하였다. % 이식을 총 세포의 % 인간 CD45+ 세포로서 측정하였다.
SIRPα BRG 마우스에서 Raji 종양 연구 과정
0일에, 5마리씩의 SIRPα BRG 마우스 그룹에 2xl06의 Raji 종양 세포를 피하로 투여하였다. 동일한 날에, 마우스들을 복강 내 (IP) 용량의 Ab 1 (0.4 또는 0.04 mg/kg), 0.4 mg/kg 용량의 비-결합 대조 mAb 대조표준 Ab 5 (인간 CD20 또는 CD3에 대한 교차-반응성 없이 고양이 항원에 결합함) 또는 비히클 단독으로 처리하였다. 마우스들에게 2 용량의 항체/주를 4주 동안 피하로 주었다. 종양 성장을 캘리퍼스로 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 및 34일에 측정하였다. 연구 그룹을 표 5에 요약한다.
Figure pct00007
특수한 과정
시약의 제조
Ab 1 및 대조표준 Ab 5를 각각 원하는 농도로 비히클 (10 mM 히스티딘, 5% 수크로오스, pH 5.8)로 희석하였다. Regeneron 코어 시설로부터 Raji 세포를 얻어서 (4 계대) 배양 배지: RPMI 1640 +10% FBS + Pen Strep-L-Glu + 머캡토에탄올에 유지하였다. Raji 세포를 원하는 농도로 배지에서 희석하였다.
통계학적 분석
GraphPad 소프트웨어 Prism 5.0 (Macintosh 버전)을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 통계상의 유의미를 Tukey의 시험-후 다중 비교를 사용하여 이원변량분석에 의해 측정하였다. 각각의 판독값으로부터의 데이터를 처리 그룹 전체에 걸쳐 비교하였다. p<0.05의 한계값을 통계학적으로 유의미한 것으로 간주하였고, *로 표시하였다. 연구가 끝나기 전에 사망한 마우스들은 이원변량분석에 의해 분석하기 위하여 표시된 통계학적 분석으로서의 조합된 종양 성장 곡선 (개별적인 마우스 성장 곡선이 아님) 그래프로부터 제외시켰다.
결과
Ab 1은 hCD34 + 이식된 SIRPα BRG 마우스에서 Raji 종양 세포 성장을 억제한다
Ab 1은 hCD34+ 이식된 SIRPα BRG 마우스들에서 비히클 대조표준 및 비-결합 대조표준과 비교하여 Raji 종양 성장을 억제하였다 (도 6). 신생 SIRPα BRG 새끼들을 조사하였고 (irradiated) 인간 T, B 및 NK 세포뿐 아니라 과립구, 단핵세포 및 DC에 대해 발생된 조혈 선구 세포 (Traggiai, et al, Science, 304(5667):104-107 (2004))로서 hCD34+ 태아 간 세포로 이식하였다. 0일에, hCD34+ 이식된 SIRPα BRG 마우스들에게 2xl06의 Raji 종양 세포를 피하로 투여하였다. 동일한 날에 마우스들을 복강내 (IP) 용량의 Ab 1 (0.4 또는 0.04 mg/kg) 또는 비-결합 대조 mAb 대조표준 Ab 5 또는 비히클 단독으로 처리하고, 이어서 연구를 통틀어 주 2회 투여하였다.
비히클 대조표준 및 비-결합 대조 그룹에 비교하여, 종양 이식후 34일에 0.04 mg/kg (p<0.0001) 또는 0.4 mg/kg (p<0.0001)의 용량으로 투여된 Ab 1은 Raji 종양 생장을 상당히 억제하였다 (도 7). 나아가, Ab 1 처리의 효과는 용량-의존적이었고, 0.04 mg/kg Ab 1과 비교하여 0.4 mg/kg Ab 1이 연구를 통틀어 성장을 완전하게 억제하였는데, 30일에 종양 성장을 완전하게 억제하였다. Ab 1 또는 비-결합 대조 mAb 중 어느 것도 연구를 통틀어 마우스 체중에는 유의미한 영향을 나타내지 않았다 (도 8).
결론
Raji 종양 성장에 미치는 Abl, CD20xCD3 bsAb로의 치료 효과를 마우스 모델에서 조사하였다. Ab 1은 인간 T, B 및 NK 세포뿐 아니라 과립구, 단핵세포 및 DC를 가지는 hCD34+ 이식된 SIRPα BRG 마우스에서의 종양 성장 억제에 효과적이었다. Ab 1으로의 주 2회 치료는 비히클 대조표준 및 비-결합 대조표준에 비교하여 Raji 인간 B 세포 림프종 종양 성장의 상당하고 용량-의존적인 억제를 초래하였다. 유의미한 체중 손실은 어떠한 치료 그룹에서도 관찰되지 않았다. 이들 결과는 인간 면역 세포를 가지는 마우스에서 Ab 1이 Raji 종양을 표적화하고, 결과적으로 상당한 종양 성장 억제를 초래함을 보여준다.
등가물
상기 기술된 본 발명의 적어도 하나의 구체예의 여러 측면을 가지면, 기술분야의 숙련자들에 의해 다양한 변경, 변형 및 개선이 기술분야의 숙련자들에게 쉽게 일어날 것이라는 것이 인지될 것이다. 그런 변경, 변형 및 개선은 본 개시의 일부인 것으로 의도되며 발명의 사상 및 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 전술한 설명 및 도면은 실례로만 제공되고 발명은 이어지는 청구범위에 의해 상세하게 기술된다.
청구범위에서 청구 요소를 변형시키기 위해 "제 1", "제 2", "제 3" 등과 같이 서수 용어를 사용하는 것은 그 자체로서는 어떠한 우선권, 선행 또는 다른 청구 요소를 뛰어넘는 한 청구 요소의 순서 또는 방법 파트가 수행되는 시간적인 순서를 함축하는 것은 아니지만, 단순히 청구 요소들을 구별하기 위하여 어떤 명칭을 가지는 한 청구 요소를 동일 명칭을 가지는 다른 요소와 구별하기 위한 (그러나 서수 용어의 사용을 위한) 표지로서 사용된다.
본원의 명세서 및 청구범위에서 "하나"를 나타내는 단어들은 명백하게 반대로 표시되지 않는 한, 다수의 대상을 포함하는 것으로 인지되어야 한다. 그룹의 하나 또는 그 이상의 구성원들 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은 그 그룹의 구성원 중 하나, 하나 이상, 또는 전부가 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나, 사용되거나, 또는 그렇지 않고 관련된다면, 맥락으로부터 반대로 표시되거나 그렇지 않은 경우 명백하지 않는 한, 만족되는 것으로 여겨진다. 발명은 그룹의 정확하게 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나, 사용되거나 또는 그렇지 않은 경우 관련되는 구체예들을 포함한다. 발명은 또한 그룹의 하나 이상, 또는 전체 구성원이 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나, 사용되거나 또는 그렇지 않은 경우 관련되는 구체예들을 포함한다. 나아가, 발명은 다르게 표시되지 않는 한 또는 기술분야의 숙련자에게 모순 또는 불일치가 발생할 것이 명백하지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 열거된 청구범위로부터 하나 또는 그 이상의 제한, 요소, 절, 설명하는 용어 등이 동일한 기초 청구항 (또는, 적절하게, 어떠한 다른 청구항)에 대한 다른 종속항에 도입되는 모든 변화, 조합 및 치환을 포함하는 것이 인지될 것이다. 요소들이 목록으로서 제시되는 경우에 (예컨대 Markush 그룹으로 또는 유사한 포맷으로), 요소들의 각 하위그룹 또한 개시되는 것이고, 어떠한 요소(들)이든지 그 그룹으로부터 제거될 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 일반적으로, 발명 또는 발명의 측면들이 특정 요소, 특징 등을 포함하는 것으로서 언급되고, 발명 또는 발명의 측면들의 특정 구체예들이 그런 요소들로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는 것이 인지되어야 한다. 간단함을 목적으로 그런 구체예들은 모든 경우에 본원에서 구체적으로 글자 그대로 설명되지 않았다. 또한 발명의 어떠한 구체예 또는 측면은, 어떤 구체적인 배제가 명세서에서 인용되는지와 관계없이, 청구범위로부터 명백하게 배제될 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
기술분야의 숙련자들은 본원에 기술된 분석 또는 다른 과정에서 얻어진 값들에 대해 전형적인 표준편차 또는 오차가 기여한다는 것을 인지할 것이다.
발명의 배경을 기술하고 발명의 실시와 관련하여 추가의 상세한 설명을 제공하기 위하여 본원에서 참조된 공보물, 웹사이트 및 다른 참조 재료들은 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Murphy, Andrew J. <120> NON-HUMAN ANIMALS HAVING A HUMANIZED SIGNAL-REGULATORY PROTEIN GENE <130> 31014 (3400P1) <150> 61881261 <151> 2013-09-23 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4007 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gcgctcggcc gggccgccct cgcgctggcc tcgcgacggc tccgcacagc ccgcactcgc 60 tctgcgagct gtccccgctc gcgcttgctc tccgatctcc gtccccgctc cctctccctc 120 ttcctctccc cctctttcct tctccctcgc tatccgctcc cccgcccccg tgcctctggc 180 tctgcgcctg gctccctcgg gtccgctccc ctttcccgcc ggcctggccc ggcgtcacgc 240 tcccggagtc tccccgctcg gcggcgtctc attgtgggag ggggtcagat caccccgccg 300 ggcggtggcg ctggggggca gcggaggggg aggggcctta gtcgttcgcc cgcgccgccc 360 gcccgcctgc cgagcgcgct caccgccgct ctccctcctt gctctgcagc cgcggcccat 420 ggagcccgcc ggcccggccc ctggccgcct agggccgctg ctgctctgcc tgctgctctc 480 cgcgtcctgt ttctgtacag gagccacggg gaaggaactg aaggtgactc agcctgagaa 540 atcagtgtct gttgctgctg gggattcgac cgttctgaac tgcactttga cctccttgtt 600 gccggtggga cccattaggt ggtacagagg agtagggcca agccggctgt tgatctacag 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agaacctggt catacctgtg acaacacagc tgtgagccag ggcaaaccac ccactgtcac 3240 tggctcgaga gtctgggcag aggctctgac cctccaccct ttaaactgga tgccggggcc 3300 tggctgggcc caatgccaag tggttatggc aaccctgact atctggtctt aacatgtagc 3360 tcaggaagtg gaggcgctaa tgtccccaat ccctggggat tcctgattcc agctattcat 3420 gtaagcagag ccaacctgcc tatttctgta ggtgcgactg ggatgttagg agcacagcaa 3480 ggacccagct ctgtagggct ggtgacctga tacttctcat aatggcatct agaagttagg 3540 ctgagttggc ctcactggcc cagcaaacca gaacttgtct ttgtccgggc catgttcttg 3600 ggctgtcttc taattccaaa gggttggttg gtaaagctcc acccccttct cctctgccta 3660 aagacatcac atgtgtatac acacacgggt gtatagatga gttaaaagaa tgtcctcgct 3720 ggcatcctaa ttttgtctta agtttttttg gagggagaaa ggaacaaggc aagggaagat 3780 gtgtagcttt ggctttaacc aggcagcctg ggggctccca agcctatgga accctggtac 3840 aaagaagaga acagaagcgc cctgtgagga gtgggatttg tttttctgta gaccagatga 3900 gaaggaaaca ggccctgttt tgtacatagt tgcaacttaa aatttttggc ttgcaaaata 3960 tttttgtaat aaagatttct gggtaacaat aaaaaaaaaa aaaaaaa 4007 <210> 2 <211> 509 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Lys 20 25 30 Glu Leu Lys Val Thr Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly 35 40 45 Asp Ser Thr Val Leu Asn Cys Thr Leu Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly 50 55 60 Pro Ile Arg Trp Tyr Arg Gly Val Gly Pro Ser Arg Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Phe Ala Gly Glu Tyr Val Pro Arg Ile Arg Asn Val Ser Asp Thr 85 90 95 Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Asn Val Thr 100 105 110 Pro Ala Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Gln Lys Gly Ser 115 120 125 Ser Glu Pro Asp Thr Glu Ile Gln Ser Gly Gly Gly Thr Glu Val Tyr 130 135 140 Val Leu Ala Lys Pro Ser Pro Pro Glu Val Ser Gly Pro Ala Asp Arg 145 150 155 160 Gly Ile Pro Asp Gln Lys Val Asn Phe Thr Cys Lys Ser His Gly Phe 165 170 175 Ser Pro Arg Asn Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asp Gly Gln Glu Leu 180 185 190 His Pro Leu Glu Thr Thr Val Asn Pro Ser Gly Lys Asn Val Ser Tyr 195 200 205 Asn Ile Ser Ser Thr Val Arg Val Val Leu Asn Ser Met Asp Val Asn 210 215 220 Ser Lys Val Ile Cys Glu Val Ala His Ile Thr Leu Asp Arg Ser Pro 225 230 235 240 Leu Arg Gly Ile Ala Asn Leu Ser Asn Phe Ile Arg Val Ser Pro Thr 245 250 255 Val Lys Val Thr Gln Gln Ser Pro Thr Ser Met Asn Gln Val Asn Leu 260 265 270 Thr Cys Arg Ala Glu Arg Phe Tyr Pro Glu Asp Leu Gln Leu Ile Trp 275 280 285 Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Asn Asp Thr Pro Lys Asn Leu Thr 290 295 300 Lys Asn Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Val Asn 305 310 315 320 Ser Ser Ala His Arg Glu Asp Val Val Phe Thr Cys Gln Val Lys His 325 330 335 Asp Gln Gln Pro Ala Ile Thr Arg Asn His Thr Val Leu Gly Phe Ala 340 345 350 His Ser Ser Asp Gln Gly Ser Met Gln Thr Phe Pro Asp Asn Asn Ala 355 360 365 Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Cys Ala Leu 370 375 380 Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Ile Lys Gln 385 390 395 400 Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu 405 410 415 Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Ile Gln Asp Thr Asn Asp Ile Asn 420 425 430 Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro Lys Glu Lys Lys Pro Ala 435 440 445 Pro Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Glu 450 455 460 Thr Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu 465 470 475 480 Asp Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro 485 490 495 Ser Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Gln Arg Lys 500 505 <210> 3 <211> 4201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tccggcccgc acccaccccc aagaggggcc ttcagctttg gggctcagag gcacgacctc 60 ctggggaggg ttaaaaggca gacgcccccc cgccccccgc gcccccgcgc cccgactcct 120 tcgccgcctc cagcctctcg ccagtgggaa gcggggagca gccgcgcggc cggagtccgg 180 aggcgagggg aggtcggccg caacttcccc ggtccacctt aagaggacga tgtagccagc 240 tcgcagcgct gaccttagaa aaacaagttt gcgcaaagtg gagcggggac ccggcctctg 300 ggcagccccg gcggcgcttc cagtgccttc cagccctcgc gggcggcgca gccgcggccc 360 atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 420 gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 480 aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca gccactctgc gctgcactgc gacctctctg 540 atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac caggccggga attaatctac 600 aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta acaactgttt cagacctcac aaagagaaac 660 aacatggact tttccatccg catcggtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 720 tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact 780 gagctgtctg tgcgcgccaa accctctgcc cccgtggtat cgggccctgc ggcgagggcc 840 acacctcagc acacagtgag cttcacctgc gagtcccacg gcttctcacc cagagacatc 900 accctgaaat ggttcaaaaa tgggaatgag ctctcagact tccagaccaa cgtggacccc 960 gtaggagaga gcgtgtccta cagcatccac agcacagcca aggtggtgct gacccgcgag 1020 gacgttcact ctcaagtcat ctgcgaggtg gcccacgtca ccttgcaggg ggaccctctt 1080 cgtgggactg ccaacttgtc tgagaccatc cgagttccac ccaccttgga ggttactcaa 1140 cagcccgtga gggcagagaa ccaggtgaat gtcacctgcc aggtgaggaa gttctacccc 1200 cagagactac agctgacctg gttggagaat ggaaacgtgt cccggacaga aacggcctca 1260 accgttacag agaacaagga tggtacctac aactggatga gctggctcct ggtgaatgta 1320 tctgcccaca gggatgatgt gaagctcacc tgccaggtgg agcatgacgg gcagccagcg 1380 gtcagcaaaa gccatgacct gaaggtctca gcccacccga aggagcaggg ctcaaatacc 1440 gccgctgaga acactggatc taatgaacgg aacatctata ttgtggtggg tgtggtgtgc 1500 accttgctgg tggccctact gatggcggcc ctctacctcg tccgaatcag acagaagaaa 1560 gcccagggct ccacttcttc tacaaggttg catgagcccg agaagaatgc cagagaaata 1620 acacaggaca caaatgatat cacatatgca gacctgaacc tgcccaaggg gaagaagcct 1680 gctccccagg ctgcggagcc caacaaccac acggagtatg ccagcattca gaccagcccg 1740 cagcccgcgt cggaggacac cctcacctat gctgacctgg acatggtcca cctcaaccgg 1800 acccccaagc agccggcccc caagcctgag ccgtccttct cagagtacgc cagcgtccag 1860 gtcccgagga agtgaatggg accgtggttt gctctagcac ccatctctac gcgctttctt 1920 gtcccacagg gagccgccgt gatgagcaca gccaacccag ttcccggagg gctggggcgg 1980 tgcaggctct gggacccagg ggccagggtg gctcttctct ccccacccct ccttggctct 2040 ccagcacttc ctgggcagcc acggccccct ccccccacat tgccacatac ctggaggctg 2100 acgttgccaa accagccagg gaaccaacct gggaagtggc cagaactgcc tggggtccaa 2160 gaactcttgt gcctccgtcc atcaccatgt gggttttgaa gaccctcgac tgcctccccg 2220 atgctccgaa gcctgatctt ccagggtggg gaggagaaaa tcccacctcc cctgacctcc 2280 accacctcca ccaccaccac caccaccacc accaccacta ccaccaccac ccaactgggg 2340 ctagagtggg gaagatttcc cctttagatc aaactgcccc ttccatggaa aagctggaaa 2400 aaaactctgg aacccatatc caggcttggt gaggttgctg ccaacagtcc tggcctcccc 2460 catccctagg ctaaagagcc atgagtcctg gaggaggaga ggacccctcc caaaggactg 2520 gagacaaaac cctctgcttc cttgggtccc tccaagactc cctggggccc aactgtgttg 2580 ctccacccgg acccatctct cccttctaga cctgagcttg cccctccagc tagcactaag 2640 caacatctcg ctgtggacgc ctgtaaatta ctgagaaatg tgaaacgtgc aatcttgaaa 2700 ctgaggtgtt agaaaacttg atctgtggtg ttttgttttg ttttttttct taaaacaaca 2760 gcaacgtgat cttggctgtc tgtcatgtgt tgaagtccat ggttgggtct tgtgaagtct 2820 gaggtttaac agtttgttgt cctggaggga ttttcttaca gcgaagactt gagttcctcc 2880 aagtcccaga accccaagaa tgggcaagaa ggatcaggtc agccactccc tggagacaca 2940 gccttctggc tgggactgac ttggccatgt tctcagctga gccacgcggc tggtagtgca 3000 gccttctgtg accccgctgt ggtaagtcca gcctgcccag ggctgctgag ggctgcctct 3060 tgacagtgca gtcttatcga gacccaatgc ctcagtctgc tcatccgtaa agtggggata 3120 gtgaagatga cacccctccc caccacctct cataagcact ttaggaacac acagagggta 3180 gggatagtgg ccctggccgt ctatcctacc cctttagtga ccgcccccat cccggctttc 3240 tgagctgatc cttgaagaag aaatcttcca tttctgctct caaaccctac tgggatcaaa 3300 ctggaataaa ttgaagacag ccagggggat ggtgcagctg tgaagctcgg gctgattccc 3360 cctctgtccc agaaggttgg ccagagggtg tgacccagtt accctttaac ccccaccctt 3420 ccagtcgggt gtgagggcct gaccgggccc agggcaagca gatgtcgcaa gccctattta 3480 ttcagtcttc actataactc ttagagttga gacgctaatg ttcatgactc ctggccttgg 3540 gatgcccaag ggatttctgg ctcaggctgt aaaagtagct gagccatcct gcccattcct 3600 ggaggtccta caggtgaaac tgcaggagct cagcatagac ccagctctct gggggatggt 3660 cacctggtga tttcaatgat ggcatccagg aattagctga gccaacagac catgtggaca 3720 gctttggcca gagctcccgt gtggcatctg ggagccacag tgacccagcc acctggctca 3780 ggctagttcc aaattccaaa agattggctt gtaaaccttc gtctccctct cttttaccca 3840 gagacagcac atacgtgtgc acacgcatgc acacacacat tcagtatttt aaaagaatgt 3900 tttcttggtg ccattttcat tttattttat tttttaattc ttggaggggg aaataaggga 3960 ataaggccaa ggaagatgta tagctttagc tttagcctgg caacctggag aatccacata 4020 ccttgtgtat tgaaccccag gaaaaggaag aggtcgaacc aaccctgcgg aaggagcatg 4080 gtttcaggag tttattttaa gactgctggg aaggaaacag gccccatttt gtatatagtt 4140 gcaacttaaa ctttttggct tgcaaaatat ttttgtaata aagatttctg ggtaataatg 4200 a 4201 <210> 4 <211> 504 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu 20 25 30 Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly 35 40 45 Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly 50 55 60 Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu 85 90 95 Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr 100 105 110 Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser 115 120 125 Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val 130 135 140 Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser 165 170 175 Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser 180 185 190 Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser 195 200 205 Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser 210 215 220 Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu 225 230 235 240 Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu 245 250 255 Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr 260 265 270 Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu 275 280 285 Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu 290 295 300 Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val 305 310 315 320 Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp 325 330 335 Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His 340 345 350 Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn 355 360 365 Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val 370 375 380 Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys 385 390 395 400 Ala Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn 405 410 415 Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu 420 425 430 Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn 435 440 445 Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser 450 455 460 Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg 465 470 475 480 Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr 485 490 495 Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys 500 <210> 5 <211> 508 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Val Ala Gly Glu 20 25 30 Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala 35 40 45 Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val 50 55 60 Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp 85 90 95 Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile 100 105 110 Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly 115 120 125 Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 130 135 140 Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg 145 150 155 160 Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe 165 170 175 Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu 180 185 190 Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr 195 200 205 Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His 210 215 220 Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro 225 230 235 240 Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr 245 250 255 Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val 260 265 270 Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp 275 280 285 Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr 290 295 300 Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn 305 310 315 320 Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His 325 330 335 Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala 340 345 350 His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Asp Asn Asn Ala Thr 355 360 365 His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Cys Ala Leu Leu 370 375 380 Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Ile Lys Gln Lys 385 390 395 400 Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys 405 410 415 Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Ile Gln Asp Thr Asn Asp Ile Asn Asp 420 425 430 Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro Lys Glu Lys Lys Pro Ala Pro 435 440 445 Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Glu Thr 450 455 460 Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp 465 470 475 480 Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser 485 490 495 Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Gln Arg Lys 500 505 <210> 6 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 6 agctctccta ccactagact gctgagaccc gctgctctgc tcaggactcg atttccagta 60 cacaatctcc ctctttgaaa agtaccacac atcctggggt gctcttgcat ttgtgtgaca 120 ctttgctagc caggctcagt cctgggttcc aggtggggac tcaaacacac tggcacgagt 180 ctacattgga tattcttggt 200 <210> 7 <211> 199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 7 gctccccatt cctcactggc ccagcccctc ttccctactc tttctagccc ctgcctcatc 60 tccctggctg ccattgggag cctgccccac tggaagccag tcgagataac ttcgtataat 120 gtatgctata cgaagttata tgcatggcct ccgcgccggg ttttggcgcc tcccgcgggc 180 gcccccctcc tcacggcga 199 <210> 8 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 8 cattctcagt attgttttgc caagttctaa ttccatcaga cctcgacctg cagcccctag 60 ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagc tgtctcatag aggctggcga 120 tctggctcag ggacagccag tactgcaaag agtatccttg ttcatacctt ctcctagtgg 180 ccatctccct gggacagtca 200

Claims (15)

  1. 인간화된 SIRPα 유전자를 형성하기 위하여 게놈이 내인성 마우스 SIRPα 유전자좌에서 마우스 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4의 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4로의 대체를 포함하고 있는 마우스로서, 상기 인간화된 SIRPα 유전자는 상기 내인성 마우스 SIRPα 유전자좌에서 마우스 SIRPα 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 마우스에서 상기 인간 SIRPα 유전자에 의해 코드화된 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분 및 상기 마우스 SIRPα 유전자에 의해 코드화된 마우스 SIRPα 단백질의 세포 내 부분을 포함하는 인간화된 SIRPα 단백질을 발현하는 마우스.
  2. 제 1항에 있어서, 인간화된 SIRPα 유전자는 상기 마우스 SIRPα 유전자의 엑손 1, 5, 6, 7 및 8을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 인간 SIRPα 단백질은 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 인간화된 SIRPα 단백질은 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스는 마우스 SIRPα 단백질을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 마우스.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화된 SIRPα 단백질은 상기 마우스에서 세포 표면상에 발현되고 인간 CD34+ 조혈 줄기세포의 이식을 지지하는 것을 특징으로 하는 마우스.
  7. 인간화된 SIRPα 유전자를 형성하기 위하여 게놈이 내인성 마우스 SIRPα 유전자좌에서 마우스 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4의 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4로의 대체를 포함하고 있는 분리된 마우스 세포 또는 조직으로서, 상기 인간화된 SIRPα 유전자는 상기 내인성 마우스 SIRPα 유전자좌에서 마우스 SIRPα 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 인간 SIRPα 유전자에 의해 코드화된 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분 및 상기 마우스 SIRPα 유전자에 의해 코드화된 마우스 SIRPα 단백질의 세포 내 부분을 포함하는 인간화된 SIRPα 단백질을 코드화하는, 분리된 마우스 세포 또는 조직.
  8. 제 7항에 있어서, 인간화된 SIRPα 유전자는 상기 마우스 SIRPα 유전자의 엑손 1, 5, 6, 7 및 8을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 세포 또는 조직.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 세포 또는 조직은 마우스 SIRPα 단백질을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 세포 또는 조직.
  10. (a) 마우스 ES 세포의 내인성 마우스 SIRPα 유전자좌에서 마우스 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4로 대체시켜서 인간화된 SIRPα 유전자를 형성하고, 이때 상기 인간화된 SIRPα 유전자는 상기 내인성 마우스 SIRPα 유전자좌에서 마우스 SIRPα 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 인간 SIRPα 유전자에 의해 코드화된 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분 및 상기 마우스 SIRPα 유전자에 의해 코드화된 마우스 SIRPα 단백질의 세포 내 부분을 포함하는 인간화된 SIRPα 단백질을 코드화하며, 그로써 상기 인간화된 SIRPα 유전자를 포함하는 변형된 마우스 ES 세포를 얻는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 얻어진 변형된 ES 세포를 사용하여 마우스를 제조하는 단계를 포함하는, 마우스의 제조 방법.
  11. (a) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따르는 마우스를 제공하는 단계; 및
    (b) 그 마우스 안에 하나 또는 그 이상의 인간 세포를 이식하는 단계를 포함하는, 마우스에 인간 세포를 이식하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 인간 세포는 인간 조혈 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 마우스에 인간 세포를 이식하는 방법.
  13. (a) 인간화된 SIRPα 유전자를 형성하기 위하여 게놈이 내인성 마우스 SIRPα 유전자좌에서 마우스 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4의 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3 및 4로의 대체를 포함하고 있는 하나 또는 그 이상의 마우스 세포를 제공하는 단계로서, 이때 상기 인간화된 SIRPα 유전자는 상기 내인성 마우스 SIRPα 유전자좌에서 마우스 SIRPα 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 인간 SIRPα 유전자에 의해 코드화된 인간 SIRPα 단백질의 세포 외 부분 및 상기 마우스 SIRPα 유전자에 의해 코드화된 마우스 SIRPα 단백질의 세포 내 부분을 포함하는 인간화된 SIRPα 단백질을 코드화하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 하나 또는 그 이상의 세포를 표지된 기질과 함께 인큐베이션하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 하나 또는 그 이상의 세포에 의한 표지된 기질의 식세포 작용을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  14. (a) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따르는 마우스를 제공하는 단계;
    (b) 그 마우스를 항원에 노출시키는 단계; 및
    (c) 마우스의 하나 또는 그 이상의 세포에 의한 항원의 식세포 작용을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  15. (a) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따르는 마우스를 제공하는 단계;
    (b) 하나 또는 그 이상의 인간 세포를 그 마우스에 이식하는 단계;
    (c) 상기 마우스에 약물 후보를 투여하는 단계; 및
    (d) 약물 후보의 치료 효능을 측정하기 위하여 마우스에서 인간 세포를 모니터링하는 단계를 포함하는,
    인간 세포를 표적화하는 약물의 치료 효능을 평가하는 방법.
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ZA (1) ZA201601138B (ko)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8541646B2 (en) 2009-10-06 2013-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice and engraftment
KR102109172B1 (ko) 2011-02-15 2020-05-12 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화된 ｍ－ｃｓｆ 마우스
IL282472B2 (en) 2012-09-07 2024-04-01 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals and methods of their use
SG10201707449TA (en) 2012-11-05 2017-10-30 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals and methods of use thereof
CA2925564C (en) * 2013-09-23 2023-03-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene
EP3138397B1 (en) 2013-10-15 2018-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized il-15 animals
SI3129400T1 (sl) 2014-04-08 2020-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Živali, ki niso človek in imajo humanizirane receptorje FC-gama
NO2785538T3 (ko) 2014-05-07 2018-08-04
ES2854276T3 (es) 2014-05-19 2021-09-21 Regeneron Pharma Animales no humanos modificados genéticamente que expresan EPO humana
LT3157956T (lt) 2014-06-19 2020-05-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nepriklausantys žmonėms gyvūnai, turintys humanizuotą užprogramuotos ląstelių žūties 1 geną
PL3689140T3 (pl) 2014-11-24 2022-09-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Zwierzęta inne niż ludzie eksprymujące humanizowany kompleks CD3
TR201903891T4 (tr) 2014-12-05 2019-04-22 Regeneron Pharma Bir insanlaştırılmış farklılaşma kümesi 47 genine sahip olan insan dışı hayvanlar.
WO2016168212A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized sirpa-il15 knockin mice and methods of use thereof
CN104904661B (zh) * 2015-06-05 2018-07-24 杭州正因生物技术有限公司 一种人源化小鼠
RU2740672C2 (ru) 2015-08-07 2021-01-19 ЭйЭлЭкс Онколоджи Инк. Конструкции, имеющие sirp-альфа домен или его вариант
SI3376857T1 (sl) 2015-11-20 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nehumane živali, ki imajo humaniziran gen 3 za aktivacijo limfocitov
CN108779159B (zh) 2016-02-04 2022-12-30 瑞泽恩制药公司 具有经改造的angptl8基因的非人动物
DK3422845T3 (da) 2016-02-29 2021-08-30 Regeneron Pharma Gnavere med et humaniseret tmprss-gen
WO2018177441A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Beijing Biocytogen Co., Ltd GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα
CN108588126B (zh) 2017-03-31 2020-04-10 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
CN109136261B (zh) 2017-06-19 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化cd28基因改造动物模型的制备方法及应用
WO2018233608A1 (en) * 2017-06-19 2018-12-27 Beijing Biocytogen Co., Ltd NON-HUMAN ANIMAL GENETICALLY MODIFIED TO CD28 HUMAN OR CHIMERIC
CA3067872A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof
US11021719B2 (en) 2017-07-31 2021-06-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for assessing CRISPER/Cas-mediated disruption or excision and CRISPR/Cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
CN111163633B (zh) * 2017-09-29 2022-09-09 瑞泽恩制药公司 包含人源化ttr基因座的非人类动物及其使用方法
AU2018375796A1 (en) 2017-11-30 2020-04-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized TRKB locus
AU2019239880B2 (en) 2018-03-19 2023-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using CRISPR/Cas systems
MA52177A (fr) 2018-03-26 2021-02-17 Regeneron Pharma Rongeurs humanisés pour tester des agents thérapeutiques
AU2019308205A1 (en) 2018-07-16 2020-11-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animal models of DITRA disease and uses thereof
US20220120731A1 (en) * 2019-02-01 2022-04-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University SIRPa EXPRESSION ON T CELLS IS A BIOMARKER FOR FUNCTIONAL T CELLS DURING EXHAUSTION
SG11202108454RA (en) 2019-04-04 2021-09-29 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
WO2020243338A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 ALX Oncology Inc. Methods of treating cancer with sirp alpha fc fusion in combination with an immune checkpoint inhibitor
EP3801011A1 (en) 2019-06-04 2021-04-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use
MX2021015122A (es) 2019-06-07 2022-04-06 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus de albumina humanizado.
CN113122574A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 一种免疫缺陷型人源化非人动物的构建方法
CN116075221A (zh) 2020-04-21 2023-05-05 瑞泽恩制药公司 具有人源化cxcl13基因的非人动物
IL303724A (en) 2020-12-21 2023-08-01 Regeneron Pharma Non-human animals with a humanized TSLP gene, a humanized TSLP receptor gene, and/or a humanized IL7RA gene
CN115997729A (zh) * 2022-01-25 2023-04-25 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 Nkp46基因人源化非人动物及其构建方法和应用
US20240102045A1 (en) 2022-07-19 2024-03-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same
WO2024073679A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5149635A (en) * 1986-09-12 1992-09-22 Abbott Biotech, Inc. Messenger RNA stabilization in animal cells
WO1999012965A2 (en) * 1997-09-12 1999-03-18 Biogen, Inc. April- a novel protein with growth effects
WO2006128163A2 (en) * 2005-05-27 2006-11-30 Memory Pharmaceuticals Corp. Transgenic alzheimer's mouse model vectors and uses thereof
US20070028316A1 (en) * 2005-06-02 2007-02-01 Xiaoxia Li Transgenic non-human Act1-deficient mammals and uses thereof
WO2012112544A2 (en) * 2011-02-15 2012-08-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized m-csf mice
US20180295818A1 (en) * 2015-04-30 2018-10-18 Institute Of Immunology Co., Ltd. TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMAL EXPRESSING HUMAN SPECIFIC MOLECULE AND HUMAN FCy RECEPTOR FAMILY

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP4936899B2 (ja) * 2003-12-24 2012-05-23 ジー２ インフラメイション ピーティーワイ エルティーディー ヒトまたはヒト化Ｃ５ａＲをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物
WO2006044962A1 (en) 2004-10-19 2006-04-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
JP2011500005A (ja) * 2007-10-11 2011-01-06 ユニバーシティー ヘルス ネットワーク ヒト造血幹細胞の生着を増加させるためのＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用の調節およびそのための化合物
US20090271884A1 (en) 2008-03-07 2009-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ES Cell-Derived Mice From Diploid Host Embryo Injection
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
US8541646B2 (en) 2009-10-06 2013-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice and engraftment
EP2618656B1 (en) * 2010-09-20 2018-06-20 Yale University, Inc. HUMAN SIRPalpha TRANSGENIC ANIMALS AND THEIR METHODS OF USE
CN104774871A (zh) * 2011-02-14 2015-07-15 雷维维科公司 用于血管化异种移植物及其衍生物的异种移植的遗传修饰的猪
MX355725B (es) 2011-10-28 2018-04-27 Regeneron Pharma Ratones con complejo principal de histocompatibilidad modificado geneticamente.
RU2660564C2 (ru) 2011-10-28 2018-07-06 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Генетически модифицированные мыши, экспрессирующие химерные молекулы главного комплекса гистосовместимости
MX358390B (es) * 2011-10-28 2018-08-17 Regeneron Pharma Interleucina 6 y receptor de interleucina 6, humanizados.
US8962913B2 (en) 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
IL282472B2 (en) 2012-09-07 2024-04-01 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals and methods of their use
SG10201707449TA (en) 2012-11-05 2017-10-30 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals and methods of use thereof
SI2958938T1 (sl) 2013-02-20 2019-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miši, ki izražajo humanizirane koreceptorje za celice T
RS57963B1 (sr) 2013-02-22 2019-01-31 Regeneron Pharma Miševi koji eksprimiraju humanizovani glavni kompleks histokompatibilnosti
CA2925564C (en) 2013-09-23 2023-03-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5149635A (en) * 1986-09-12 1992-09-22 Abbott Biotech, Inc. Messenger RNA stabilization in animal cells
WO1999012965A2 (en) * 1997-09-12 1999-03-18 Biogen, Inc. April- a novel protein with growth effects
WO2006128163A2 (en) * 2005-05-27 2006-11-30 Memory Pharmaceuticals Corp. Transgenic alzheimer's mouse model vectors and uses thereof
US20070028316A1 (en) * 2005-06-02 2007-02-01 Xiaoxia Li Transgenic non-human Act1-deficient mammals and uses thereof
WO2012112544A2 (en) * 2011-02-15 2012-08-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized m-csf mice
US20180295818A1 (en) * 2015-04-30 2018-10-18 Institute Of Immunology Co., Ltd. TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMAL EXPRESSING HUMAN SPECIFIC MOLECULE AND HUMAN FCy RECEPTOR FAMILY

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Improving human hemato-lymphoidsystem mice by cytokine knock-in gene replacement, vol.32 no.7 pp.321-327, 2011 *
J Clin Invest vol.109 no.12 pp.1587-1598, 2002 *
J immunol. vol.175 no.1 pp.319-328 2005 *
mproving human hemato-lymphoidsystem mice by cytokine knock-in gene replacement, vol.32 no.7 pp.321-327 2011 *
PLoS One vol.3 no.9 pp.e3192 2008 *
PNAS vol.101 no.11 pp.3903-3908, 2004 *
Semin Immunol. vol.18 no.5 pp.263-275 2006 *
Semin Immunol. vol.18 no.5 pp.263-275, 2006 *

Also Published As

Publication number Publication date
PT2922394T (pt) 2017-05-22
RS64573B1 (sr) 2023-10-31
US9462794B2 (en) 2016-10-11
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JP2019047818A (ja) 2019-03-28
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US20200187468A1 (en) 2020-06-18
ES2959333T3 (es) 2024-02-23
AU2014321187B2 (en) 2020-09-17
RU2016110462A (ru) 2017-10-30
US20150089679A1 (en) 2015-03-26
JP6453893B2 (ja) 2019-01-16
ES2624614T3 (es) 2017-07-17
EP3434101A1 (en) 2019-01-30
IL262958A (en) 2018-12-31
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AU2020286187A1 (en) 2021-01-07
US20170265442A1 (en) 2017-09-21
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US9193977B2 (en) 2015-11-24
JP6875573B2 (ja) 2021-05-26
EP3175706B1 (en) 2018-11-07
US20160374321A1 (en) 2016-12-29
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IL297607A (en) 2022-12-01
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WO2015042557A1 (en) 2015-03-26
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IL278679B2 (en) 2023-04-01
JP2016537015A (ja) 2016-12-01
PT3434101T (pt) 2023-09-19
US10206379B2 (en) 2019-02-19
SG10201902547SA (en) 2019-04-29
US9127292B2 (en) 2015-09-08
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DK3434101T3 (da) 2023-10-02
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PL3175706T3 (pl) 2019-05-31
US9700027B2 (en) 2017-07-11
JP2020114209A (ja) 2020-07-30
EP2922394B1 (en) 2017-02-22
JP6665269B2 (ja) 2020-03-13
CY1121410T1 (el) 2020-05-29
PH12016500342A1 (en) 2016-05-02
IL297607B2 (en) 2024-01-01
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