ES2716735T3 - Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado - Google Patents

Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado Download PDF

Info

Publication number
ES2716735T3
ES2716735T3 ES15813960T ES15813960T ES2716735T3 ES 2716735 T3 ES2716735 T3 ES 2716735T3 ES 15813960 T ES15813960 T ES 15813960T ES 15813960 T ES15813960 T ES 15813960T ES 2716735 T3 ES2716735 T3 ES 2716735T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
human
gene
rodent
humanized
endogenous
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15813960T
Other languages
English (en)
Inventor
Cagan Gurer
Ella Ioffe
Alexander Mujica
Gavin Thurston
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54979926&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2716735(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2716735T3 publication Critical patent/ES2716735T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/5055—Cells of the immune system involving macrophages
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Description

DESCRIPCIÓN
Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 62/087,992, presentada el 05 de diciembre de 2014.
Listado de secuencias
Un listado de secuencias en el archivo de texto ASCII, denominado 32584_10108WO01_SequenceListing.txt de 96,0 KB y creado el 23 de noviembre de 2015, se presentó a la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos por medio de EFS-Web.
Antecedentes de la invención
La terapia contra el cáncer puede dividirse en cuatro categorías principales: quimio/radioterapia, terapia hormonal, terapia dirigida, e inmunoterapia. Aunque en la investigación y el desarrollo de la medicina se ha dedicado un gran interés a la terapia dirigida y se han realizado avances significativos, el cáncer es aún un desafío importante para los pacientes y para el campo de la salud en todo el mundo. Este desafío importante se debe, en parte, a la capacidad de las células cancerosas de evadir los mecanismos de control de los sistemas inmunitarios innato y adaptativo, lo que es, parcialmente, el resultado de la inhibición de la eliminación fagocítica. Actualmente, no existe un sistema in vivo para determinar de manera óptima el potencial terapéutico de nuevas terapias contra el cáncer que se diseñan para activar la eliminación fagocítica de células cancerosas y determinar los aspectos moleculares de cómo las células cancerosas proporcionan señales inhibitorias a los macrófagos y las células fagocíticas. Un sistema de este tipo proporciona una fuente para ensayos en fagocitosis y funciones de macrófagos in vivo, e identificación de nuevas terapias contra el cáncer que se dirigen a proporcionar un ambiente antitumoral al promover señales profagocíticas al sistema inmunitario.
El documento WO2007/033221 se refiere a los métodos y composiciones para la inhibición de las respuestas inmunitarias. El documento WO2013/063556 se refiere a un IL-6 humanizado y receptor de IL-6.
Sumario
La presente invención se basa en el reconocimiento de que es conveniente diseñar animales no humanos para permitir sistemas mejorados para la identificación y el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer. La presente invención se basa también en el reconocimiento de que es conveniente diseñar animales no humanos que permitan un mejor injerto de células madre hematopoyéticas humanas. Además, la presente invención se basa también en el reconocimiento de que los animales no humanos que tienen un gen de CD47 humanizado y/o que de cualquier otra manera expresan, contienen, o producen un polipéptido de CD47 humano o humanizado son convenientes, por ejemplo para usar en la identificación y desarrollo de productos terapéuticos para el cáncer que superen la toxicidad sistémica asociada con el bloqueo de CD47 y superen la inhibición mediada por CD47, de la fagocitosis de células tumorales, y proporcionar un sistema in vivo más eficaz para el injerto de células madre hematopoyéticas humanas que proporcione un aumento en la homeostasis de un mayor número de tipos de células humanas.
La invención proporciona un roedor cuyo genoma comprende un gen de CD47 humanizado, en donde el gen de CD47 humanizado comprende el exón 1 de un gen de CD47 endógeno de roedor, los exones 2-7 de un gen de CD47 humano, y los exones corriente abajo del exón 7 del gen de CD47 endógeno de roedor, en donde el gen de CD47 humanizado se une operativamente a un promotor de CD47 endógeno de roedor.
La invención también proporciona una célula o tejido aislado de roedor cuyo genoma comprende un gen de CD47 humanizado, en donde el gen de CD47 humanizado comprende el exón 1 de un gen de CD47 endógeno de roedor, los exones 2-7 de un gen de CD47 humano, y los exones corriente abajo del exón 7 del gen de CD47 endógeno de roedor, en donde el gen de CD47 humanizado se une operativamente a un promotor de CD47 endógeno de roedor, y opcionalmente la célula o tejido de roedor es una célula de ratón o tejido de ratón, o una célula de rata o tejido de rata.
La invención proporciona adicionalmente un embrión de roedor generado a partir de la célula madre embriónica de la invención.
La invención adicionalmente proporciona un método para proporcionar un roedor cuyo genoma comprende un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano unido a una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno, el método que comprende modificar el genoma de un roedor de manera que comprenda un gen de CD47 humanizado, en donde el gen de CD47 humanizado comprende el exón 1 de un gen de CD47 endógeno de roedor, los exones 2-7 de un gen de CD47 humano, y los exones corriente abajo del exón 7 del gen de CD47 endógeno de roedor, en donde el gen de CD47 humanizado se une operativamente a un promotor de CD47 endógeno de roedor, se proporciona así dicho roedor.
La invención también proporciona un método para evaluar el injerto de células humanas, en donde dicho método comprende evaluar el injerto de células humanas en un roedor de la invención, en donde opcionalmente las células humanas son células madre hematopoyéticas.
La invención además proporciona un método para evaluar la eficacia terapéutica de un fármaco dirigido a células humanas, el método que comprende: administrar un candidato a fármaco a un roedor de la invención al cual una o más células humanas se han transplantado; y monitorear las células humanas en el roedor para determinar la eficacia terapéutica del candidato a fármaco.
Se describe en la presente un animal no humano que tiene un genoma que comprende un gen de CD47 que incluye material genético de dos especies diferentes (por ejemplo, un ser humano y uno no humano). El gen de CD47 de los animales no humanos como se describe en la presente descripción puede codificar un polipéptido de CD47 que contiene porciones humanas y no humanas, en donde las porciones humanas y no humanas se unen entre sí y forman un polipéptido de CD47 funcional.
Un animal no humano descrito en la presente puede comprender un gen de CD47 que comprende una porción endógena y una porción humana, en donde las porciones endógena y humana se unen operativamente a un promotor endógeno.
Una porción endógena puede comprender el exón 1 y los exones corriente abajo del exón 7 de un gen de CD47 endógeno. El exón 1 y los exones corriente abajo del exón 7 de un gen de CD47 endógeno pueden ser al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idénticos al correspondiente exón 1 y los exones corriente abajo del exón 7 de un gen de CD47 de ratón que aparece en la Tabla 3. El exón 1 y los exones corriente abajo del exón 7 de un gen de CD47 endógeno pueden ser idénticos al correspondiente exón 1 y los exones corriente abajo del exón 7 de un gen de CD47 de ratón que aparece en la Tabla 3.
Una porción humana puede codificar los aminoácidos 16-292 de un polipéptido de CD47 humano. Una porción humana puede codificar los aminoácidos 19-292 de un polipéptido de CD47 humano. Una porción humana puede codificar los aminoácidos 19-141 de un polipéptido de CD47 humano. Una porción humana puede codificar los aminoácidos 19­ 127 de un polipéptido de c D47 humano. Una porción humana puede comprender los exones 2-7 de un gen de CD47 humano.
Los exones 2-7 de un gen de CD47 humano pueden ser al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idéntico a los correspondientes exones 2-7 de un gen de CD47 humano que aparece en la Tabla 3. Los exones 2-7 de un gen de CD47 humano pueden ser idénticos a los correspondientes exones 2-7 de un gen de CD47 humano que aparece en la Tabla 3.
Un animal no humano descrito en la presente invención puede expresar un polipéptido de CD47 que comprende una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano y una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno. Un polipéptido de CD47 puede comprender una porción transmembrana de un polipéptido de CD47 humano. Un polipéptido de CD47 puede comprender una porción transmembrana de un polipéptido de CD47 no humano. Un polipéptido de CD47 puede traducirse en una célula de un animal no humano con un péptido señal no humano. Un péptido señal no humano puede ser un péptido señal de un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata).
Un polipéptido de CD47 descrito en la presente descripción puede expresarse a partir de un gen de CD47 endógeno no humano.
Una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno puede comprender una cola intracitoplasmática que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idéntica a una cola intracitoplasmática de un polipéptido de CD47 de ratón que aparece en la Tabla 3. Una porción intracelular del polipéptido de CD47 endógeno puede comprender una cola intracitoplasmática que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una cola intracitoplasmática de un polipéptido de CD47 de ratón que aparece en la Tabla 3.
Una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano puede comprender los aminoácidos correspondientes a los residuos 19-141 de un polipéptido de CD47 humano. Una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano puede comprender los aminoácidos correspondientes a los residuos 19-127 de un polipéptido de CD47 humano. La porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idéntica a una correspondiente secuencia de aminoácidos de una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano que aparece en la Tabla 3. Una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano puede comprender una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente de una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano que aparece en la Tabla 3.
En la presente descripción se describe además un polipéptido de CD47 codificado por el gen CD47 de un animal no humano como se describe en el presente documento. Un polipéptido de CD47 codificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idéntica a la sec. con núm. de ident.: 17, sec. con núm. de ident.: 18, sec. con núm. de ident.: 19, o sec. con núm. de ident.: 20. Un polipéptido de CD47 codificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la sec. con núm. de ident.: 17, sec. con núm. de ident.: 18, sec. con núm. de ident.: 19, o sec. con núm. de ident.: 20.
Un gen de CD47 humanizado que comprende uno o más exones de un gen de CD47 no humano unido operativamente a uno o más exones de un gen de CD47 humano. Un gen de CD47 humanizado de la presente invención comprende exones no humanos que codifican una porción intracelular de un polipéptido de CD47 y exones humanos que codifican una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano. Un gen de CD47 humanizado puede comprender además exones humanos que codifican una porción transmembrana de un polipéptido de CD47 humano. Un gen de CD47 humanizado de la presente invención comprende exones no humanos que codifican un péptido señal, en su totalidad o en parte, y una porción intracelular de un polipéptido de CD47, y exones humanos que codifican una porción extracelular y opcionalmente una porción transmembrana de un polipéptido de CD47.
En la presente se describe además una célula o tejido aislado a partir de un animal no humano como se describe en la presente. Se describe una célula o tejido aislado que comprende un gen de CD47 como se describe en la presente descripción. Una célula puede seleccionarse de una célula dendrítica, un linfocito (por ejemplo, una célula B o T), un macrófago y un monocito. Un tejido puede seleccionarse de tejido adiposo, vejiga, cerebro, mama, médula ósea, ojo, corazón, intestino, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, músculo, páncreas, plasma, suero, piel, bazo, estómago, timo, testículo, ovario, y una combinación de estos.
En la presente descripción se describe además una célula madre embrionaria no humana cuyo genoma comprende un gen de CD47 como se describe en el presente documento. Una célula madre embrionaria no humana puede ser una célula madre embrionaria de ratón y es de una cepa 129, una cepa C57BL/6 o una cepa BALB/c. Una célula madre embrionaria no humana puede ser una célula madre embrionaria de ratón y es de una mezcla de las cepas 129 y C57BL/6.
En la presente se describe además el uso de una célula madre embrionaria no humana como se describe en la presente para producir un animal no humano. Una célula madre embrionaria no humana puede ser una célula madre embrionaria de ratón y puede usarse para producir un ratón que comprende un gen de CD47 como se describe en la presente descripción. Una célula madre embrionaria no humana puede ser una célula madre embrionaria de rata y puede usarse para producir una rata que comprende un gen de c D47 como se describe en la presente descripción.
En la presente descripción se describe además un embrión no humano que comprende, se produce, se obtiene, o se genera a partir de una célula madre embrionaria no humana que comprende un gen de CD47 como se describe en el presente documento. Un embrión no humano puede ser un embrión de roedor. Un embrión de roedor puede ser un embrión de ratón. Un embrión de roedor puede ser un embrión de rata.
Se describe además en la presente un método para producir un animal no humano que expresa un polipéptido de CD47 a partir de un gen de CD47 endógeno, en donde el polipéptido de CD47 comprende una secuencia humana, el método comprende insertar un fragmento genómico en un gen de CD47 endógeno en una célula madre embrionaria no humana, dicho fragmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de CD47 humano en su totalidad o en parte; obtener una célula madre embrionaria no humana que comprende un gen de CD47 endógeno que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de CD47 humano en su totalidad o en parte; y crear un animal no humano mediante el uso de la célula madre embrionaria no humana que comprende dicha secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de CD47 humano en su totalidad o en parte.
Una secuencia humana puede comprender los aminoácidos correspondientes a los residuos 19-141 (o 19-292) de un polipéptido de CD47 humano. Una secuencia humana puede comprender los aminoácidos correspondientes a los residuos 19-127 de un polipéptido de CD47 humano.
Una secuencia de nucleótidos puede comprender los exones 2-7 de un gen de CD47 humano. Una secuencia de nucleótidos puede comprender uno o más marcadores de selección. Una secuencia de nucleótidos puede comprender uno o más sitios de recombinación sitio específico.
El método puede comprender además una etapa de insertar un fragmento genómico en un gen de SIRPa endógeno de una célula madre embrionaria no humana, dicho fragmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de SIRPa humano en su totalidad o en parte (por ejemplo, codifica una porción extracelular de un polipéptido de SlRPa humano). Un fragmento genómico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de SIRPa humano en su totalidad o en parte (por ejemplo, codifica una porción extracelular de un polipéptido de SIRPa humano) se inserta en un gen de SIRPa endógeno de la célula madre embrionaria no humana antes de una inserción en un gen de CD47 endógeno.
El método comprende además cruzar un animal no humano puede comprender un gen de CD47 endógeno que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de CD47 humano, en su totalidad o en parte, con un segundo animal no humano, dicho segundo animal no humano tiene un genoma que comprende un gen de SIRPa que codifica un polipéptido de SIRPa que comprende una porción extracelular de un polipéptido de SIRPa humano (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362 de un polipéptido de SIRPa humano) y una porción intracelular de un polipéptido de SIRPa endógeno.
Se describe además en la presente un método para proporcionar un animal no humano cuyo genoma comprende un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano unido a una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno, el método comprende modificar el genoma de un animal no humano de manera que comprenda un gen de CD47 que codifica la porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano unido a la porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno para proporcionar de esta manera dicho animal no humano. Un gen de CD47 puede codificar un polipéptido de CD47 que comprende una porción extracelular y una porción transmembrana de un polipéptido de CD47 humano unido a una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno no humano. Un gen de CD47 puede codificar un polipéptido de CD47 que comprende una porción extracelular y una porción transmembrana de un polipéptido de CD47 humano unido a una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno no humano.
La modificación del genoma de un animal no humano puede realizarse en una célula madre embrionaria no humana. La célula madre embrionaria no humana puede ser una célula madre embrionaria de roedor; una célula madre embrionaria de ratón; o una célula madre embrionaria de rata.
El método puede comprender además modificar el genoma del animal no humano de manera que comprenda un gen de SIRPa que codifica la porción extracelular de un polipéptido de SIRPa humano (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362 de un polipéptido SIRPa humano) unido a la porción intracelular de un polipéptido SIRPa endógeno. La modificación del genoma del animal no humano de manera que comprenda un gen de SIRPa que codifica la porción extracelular de un polipéptido de SIRPa humano (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362 de un polipéptido de SIRPa humano) unida a la porción intracelular de un polipéptido de SIRPa endógeno, puede realizarse antes de modificar el genoma del animal no humano de manera que comprenda un gen de CD47 que codifica la porción extracelular y opcionalmente una porción transmembrana de un polipéptido de CD47 humano unida a la porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno.
El método puede comprender además cruzar un animal no humano cuyo genoma comprende un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano unida a una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno con un segundo animal no humano, dicho segundo animal no humano tiene un genoma que comprende un gen de SIRPa que codifica un polipéptido de SIRPa que comprende una porción extracelular de un polipéptido de SIRPa humano (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362 de un polipéptido de SIRPa humano) y una porción intracelular de un polipéptido de SIRPa endógeno.
En la presente descripción se describe además un animal no humano que puede obtenerse por los métodos según se describen en el presente documento.
Se describe además en la presente un método para injertar células humanas en un animal no humano, el método comprende las etapas de proporcionar un animal no humano cuyo genoma comprende un gen de CD47 que codifica la porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano unida a la porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno; y trasplantar una o más células humanas en dicho animal no humano. El método puede comprender además una etapa de ensayar el injerto de una o más células humanas en dicho animal no humano. Una etapa de ensayo puede comprender comparar el injerto de una o más células humanas con el injerto en uno o más animales no humanos de tipo silvestre o en uno o más animales no humanos cuyo genoma no comprende un gen de CD47 que codifica la porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano unida a la porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno.
Las células humanas pueden ser células madre hematopoyéticas. Las células humanas pueden trasplantarse por vía intravenosa. Las células humanas pueden trasplantarse por vía intraperitoneal. Las células humanas pueden trasplantarse por vía subcutánea.
Se describe además en la presente un método para evaluar la eficacia terapéutica de un fármaco dirigido a células humanas, el método comprende proporcionar un animal no humano cuyo genoma comprende un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano unida a una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno; trasplantar una o más células humanas en dicho animal no humano; administrar un candidato a fármaco a dicho animal no humano; y controlar las células humanas en el animal no humano para determinar la eficacia terapéutica del candidato a fármaco.
Las células humanas pueden ser células cancerosas y el candidato a fármaco puede ser un candidato a fármaco anticanceroso. Un candidato a fármaco puede ser un anticuerpo.
Un animal no humano puede comprender además células inmunitarias humanas. Un candidato a fármaco puede ser un anticuerpo biespecífico que se une a CD47 humano y un antígeno en células cancerosas humanas trasplantadas.
Se describe además en la presente un método que comprende proporcionar una o más células cuyo genoma incluye un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano unida a una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno; incubar una o más células con un sustrato marcado; y medir la fagocitosis del sustrato marcado por las una o más células. El sustrato puede estar marcado fluorescentemente. El sustrato puede estar marcado con un anticuerpo. El sustrato puede ser uno o más glóbulos rojos. El sustrato puede ser una o más células bacterianas. El sustrato puede ser uno o más células tumorales.
Se describe además en la presente un método que comprende proporcionar un animal no humano cuyo genoma incluye un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano unida a una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno; exponer el animal no humano a un antígeno; y medir la fagocitosis del antígeno por una o más células del animal no humano. La etapa de exposición puede comprender exponer el animal no humano a un antígeno que se marca de manera fluorescente. La etapa de exposición puede comprender exponer el animal no humano a una o más células que comprenden el antígeno. La etapa de exposición puede comprender exponer el animal no humano a una o más células humanas que comprenden el antígeno o a una o más células bacterianas que comprenden el antígeno. La etapa de exposición puede comprender exponer el animal no humano a una o más células que se han transformado con el antígeno de manera que el antígeno se expresa en la superficie de una o más células transformadas. La etapa de exposición puede comprender exponer el animal no humano a una o más células tumorales que comprenden el antígeno.
Se describen además en la presente métodos para la identificación o validación de un fármaco o vacuna, el método comprende las etapas de suministrar un fármaco o vacuna a un animal no humano cuyo genoma incluye un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano unida a una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno, y controlar una o más de las respuestas inmunitarias al fármaco o vacuna, el perfil de seguridad del fármaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afección. El control del perfil de seguridad puede incluir la determinación de si el animal no humano exhibe un efecto secundario o reacción adversa como resultado del suministro del fármaco o vacuna. Un efecto secundario o reacción adversa puede seleccionarse de morbilidad, mortalidad, alteración del peso corporal, alteración del nivel de una o más enzimas (por ejemplo, hepáticas), alteración en el peso de uno o más órganos, pérdida de función (por ejemplo, sensorial, motora, de órganos, etcétera), aumento de la susceptibilidad a una o más enfermedades, alteraciones al genoma del animal no humano, aumento o disminución del consumo de alimentos y complicaciones de una o más enfermedades.
En la presente se describe además el uso de un animal no humano como se describe en la presente en el desarrollo de un fármaco o vacuna para usar en medicina, tal como su uso como un medicamento.
Se describe además en la presente el uso de un animal no humano como se describe en la presente descripción en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o una neoplasia.
En la presente descripción se describe además el uso de un animal no humano descrito en el presente documento para evaluar la eficacia de un fármaco terapéutico que se dirige a células humanas. Un animal no humano descrito en el presente documento puede trasplantarse con células humanas, y puede administrarse al animal un candidato a fármaco que se dirige a tales células humanas. La eficacia del fármaco puede determinarse mediante el control de las células humanas en el animal no humano después de la administración del fármaco.
Se describe además en la presente un animal o célula no humanos como se describe en la presente para usar en el desarrollo y/o identificación de un fármaco (por ejemplo, un anticuerpo) para terapia o diagnóstico.
Se describe además en la presente un animal o célula no humanos como se describe en la presente para usar en el desarrollo y/o la identificación de un fármaco (por ejemplo, un anticuerpo) para el tratamiento, la prevención o la mejoría de un cáncer o una neoplasia.
Se describe además en la presente un método para evaluar la farmacocinética de un fármaco dirigido a CD47 humano, el método comprende las etapas de administrar el fármaco a un animal no humano como se describe en la presente, y realizar un ensayo para determinar una o más propiedades farmacocinéticas del fármaco dirigido a CD47 humano.
Se describe además en la presente un método para evaluar la toxicidad por acción en el objetivo de un fármaco dirigido a CD47 humano, el método comprende las etapas de administrar el fármaco a un animal no humano como se describe en la presente, y realizar un ensayo para determinar uno o más parámetros asociados con la toxicidad por acción en el objetivo de un fármaco.
Se describe además en la presente un método para evaluar la toxicidad por acción fuera del objetivo de un fármaco dirigido a CD47 humano, el método comprende las etapas de administrar el fármaco a un animal no humano como se describe en la presente, y realizar un ensayo para determinar uno o más parámetros asociados con la toxicidad por acción fuera del objetivo de un fármaco.
Un animal no humano como se describe en la presente descripción puede ser un roedor cuyo genoma incluye un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano unida a una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno; un roedor puede ser un ratón; un roedor puede ser una rata.
Un fármaco dirigido a CD47 humano puede ser un antagonista de CD47. Un antagonista de CD47 puede ser un anticuerpo anti-CD47. Un fármaco dirigido a CD47 humano puede ser un agonista CD47.
Un gen de CD47 descrito en la presente descripción puede incluir un gen de CD47 como se describe en la presente descripción. Un polipéptido de CD47 descrito en la presente descripción puede incluir un polipéptido de CD47 como se describe en la presente descripción.
Un animal no humano descrito en la presente descripción puede no expresar de manera detectable un polipéptido de CD47 no humano endógeno de longitud completa. Un animal no humanos descritos en el presente documento pueden no expresar de manera detectable una porción extracelular de un polipéptido CD47 endógeno. Un animal no humano descrito en la presente descripción puede no expresar de manera detectable una porción extracelular de un polipéptido CD47 endógeno y un polipéptido de SIRPa endógeno.
Una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano puede comprender los aminoácidos correspondientes a los residuos 19-127 de un polipéptido de CD47 humano, como se describe en la presente.
Un dominio V inmunoglobulínico N-terminal de un polipéptido de CD47 humano puede comprender los aminoácidos correspondientes a los residuos 19-127 de un polipéptido de CD47 humano como se describe en la presente.
Los animales no humanos, las células, los tejidos, las células madre embrionarias y/o los embriones de la presente invención tienen un genoma que comprende además un gen de SIRPa que codifica un polipéptido de SlRPa que comprende una porción extracelular de un polipéptido de SIRPa humano (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362 de un polipéptido de SIRPa humano) y una porción intracelular de un polipéptido de SIRPa endógeno.
Un animal no humano como se describe en la presente puede ser un roedor, un ratón o una rata.
Como se usa en esta solicitud, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" se usan como equivalentes. Cualquier número usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente pretende abarcar cualquiera de las fluctuaciones normales apreciadas por un experto en la técnica en cuestión.
Otras características, objetos y ventajas descritas en la presente descripción se hacen evidentes en la descripción detallada que sigue. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, si bien indica modalidades como se describe en la presente, se proporciona solamente a modo de ilustración, no de limitación. Diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.
Breve descripción de las figuras
El archivo de la patente o solicitud contiene al menos un dibujo a color. Copias de esta patente o solicitud de publicación de patente con dibujos(s) a color se proporcionarán por la Oficina y previa solicitud y pago de la cuota necesaria. Los dibujos incluidos en la presente descripción, que se componen de las siguientes Figuras, son solamente con propósitos de ilustración y no de limitación.
La Figura 1 muestra un diagrama, que no está a escala, de la organización genómica de los genes del grupo de diferenciación 47 (CD47) no humano (por ejemplo, de ratón) y humano. Los exones se enumeran debajo de cada exón.
La Figura 2 muestra un diagrama, que no está a escala, de un método ilustrativo para la humanización de un gen del grupo de diferenciación 47 (CD47) no humano.
La Figura 3 muestra un diagrama, que no está a escala, de la organización genómica de los genes del grupo de diferenciación 47 (CD47) de ratón y humano. Se indican las ubicaciones de las sondas usadas en un ensayo descrito en el Ejemplo 1.
La Figura 4 muestra un histograma ilustrativo de la expresión de CD47 en glóbulos rojos de ratones con CD47 humanizado, que se detectó por anticuerpos anti-CD47. Ac A, Ac B, Ac C, Ac D y Ac E: anticuerpos anti-CD47; hIgG4s: IgG4 humana de especificidad irrelevante con la región Fc modificada que tiene reducción de la función efectora; hIgG4: anticuerpo IgG4 humano de especificidad irrelevante.
La Figura 5 muestra hemaglutinación ilustrativa de los glóbulos rojos de ratón a partir de ratones de tipo silvestre (n=2) y con CD47 humanizado (n=2) mediante anticuerpos anti-CD47. WT: de tipo silvestre; HuCD47: c D47 humanizado; Ac A, Ac B, Ac C, Ac D y Ac E: anticuerpos anti-CD47; hIgG4s: IgG4 humana de especificidad irrelevante con región Fc modificada que tiene reducción de la función efectora; hIgG4: anticuerpo IgG4 humano de especificidad irrelevante.
La Figura 6 muestra perfiles farmacocinéticos ilustrativos de anticuerpos anti-CD47 en ratones con CD47 humanizado representados como concentración de anticuerpos (en |jg/ml, eje y) en el tiempo (en días, eje x); Ac F, Ac G, Ac H y Ac I: anticuerpos anti-CD47; hIgG4s: anticuerpo IgG4 humano de especificidad irrelevante con región Fc modificada que tiene reducción de la función efectora.
La Figura 7 muestra perfiles farmacocinéticos ilustrativos de anticuerpos anti-CD47 en ratones con CD47/SIRPa humanizados (CD47hu/huSIRPahu/hu) representados como concentración de anticuerpos (en mcg/ml, eje y) en el tiempo (en días, eje x). Ac J, Ac F, Ac G y Ac I: anticuerpos anti-CD47; hIgG4s: anticuerpo IgG4 humano de especificidad irrelevante con región Fc modificada que tiene reducción de la función efectora.
La Figura 8 muestra perfiles farmacocinéticos ilustrativos de anticuerpos anti-CD47 en ratones con CD47/SIRPa humanizados (CD47hu/huSIRPahu/hu) representados como concentración de anticuerpos (en mcg/ml, eje y) en el tiempo (en días, eje x). Ac J, Ac F: anticuerpos anti-CD47; Ac Fs: Ac F con región Fc modificada que tiene reducción de la función efectora; Ac Fmono: versión monovalente del Ac F; hIgG4s: anticuerpo IgG4 humano de especificidad irrelevante con región Fc modificada que tiene reducción de la función efectora.
La Figura 9 muestra perfiles farmacocinéticos ilustrativos de anticuerpos anti-CD47 en ratones de tipo silvestre representados como concentración de anticuerpos (en mcg/ml, eje y) en el tiempo (en días, eje x). Los ratones que demostraron respuesta de anticuerpos de ratón anti-humano (MAHA) se excluyeron. Ac J, Ac F, Ac I y Ac G: anticuerpos anti-CD47; hIgG4s: anticuerpo IgG4 humano de especificidad irrelevante con región Fc modificada que tiene reducción de la función efectora (estrella: todos los puntos después de 15 días se excluyeron del grupo de tratamiento con hIgG4s debido a MAHA); Ac J F(ab')2: F(ab')2 fragmento de Ac J.
Definiciones
Esta invención no se limita a los métodos y condiciones experimentales particulares descritas en la presente descripción, ya que estos métodos y condiciones pueden variar. Además, debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción es solamente para el propósito de describir modalidades particulares, y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos y frases usados en la presente descripción incluyen los significados que se atribuyen a los términos y frases en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o resulte claramente evidente a partir del contexto en el cual se usa el término o frase. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, a continuación se describirán métodos y materiales particulares.
El término "aproximadamente" como se aplica en la presente a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. El término "aproximadamente" o "alrededor de" puede referirse a un intervalo de valores que caen dentro de 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia indicado a menos que se indique de cualquier otra manera o resulte evidente de cualquier otra manera a partir del contexto (excepto cuando tal número exceda el 100 % de un valor posible).
El término “biológicamente activo” como se usa en la presente descripción se refiere a una característica de cualquier agente que tenga actividad en un sistema biológico, in vitro o in vivo (por ejemplo, en un organismo). Por ejemplo, un agente que, cuando está presente en un organismo, tiene un efecto biológico dentro de ese organismo, se considera biológicamente activo. En casos particulares, cuando una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido puede denominarse típicamente una porción "biológicamente activa".
El término "comparable", como se usa en la presente, se refiere a dos o más agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etcétera, que pueden no ser idénticos entre sí pero que son suficientemente similares para permitir la comparación entre ellos de manera que puedan obtenerse conclusiones de manera razonable en base a las diferencias o las similitudes observadas. Los expertos en la técnica comprenderán, en contexto, el grado de identidad necesario en cualquier circunstancia determinada para dos o más de tales agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etcétera, para considerarse comparables.
El término "conservador" como se usa en la presente descripción para describir una sustitución de aminoácidos conservadora, se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de un receptor de unirse a un ligando. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen: cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; cadenas laterales hidroxialifáticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina, y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina, e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. Una sustitución de aminoácido conservadora puede ser una sustitución de cualquier residuo nativo en una proteína con alanina, como se usa, por ejemplo, en la mutagénesis por barrido de alanina. Una sustitución conservadora puede ser una que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 descrita en Gonnet y otros (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. La sustitución puede ser una sustitución moderadamente conservadora en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
El término “control”, como se usa en la presente descripción, se refiere al significado que se entiende en la técnica de un “control” que es un estándar contra el cual se comparan los resultados. Típicamente, los controles se usan para aumentar la integridad en los experimentos mediante el aislamiento de variables para llegar a una conclusión sobre tales variables. Un control puede ser una reacción o un ensayo que se realiza simultáneamente con una reacción o un ensayo de prueba para proporcionar un comparador. Como se usa en la presente descripción, un “control” puede referirse a un “animal de control”. Un “animal de control” puede tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción, o puede no tener modificaciones (es decir, un animal de tipo silvestre). En un experimento, se aplica la "prueba" (es decir, la variable que se somete a prueba). En el segundo experimento, el "control," no se aplica la variable que se somete a prueba. Un control puede ser un control histórico (es decir, de una prueba o un ensayo realizados anteriormente, o una cantidad o resultado que se conoce previamente). Un control puede ser o comprender un registro impreso o guardado de cualquier otra manera. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.
El término "interrupción” como se usa en la presente descripción puede referirse al resultado de un evento de recombinación homóloga con una molécula de ADN (por ejemplo, con una secuencia homóloga endógena tal como un gen o locus génico). Una interrupción puede lograr o representar una inserción, una deleción, una sustitución, un reemplazo, una mutación con pérdida de sentido, o un desplazamiento del marco de una(s) secuencia(s) de ADN, o cualquier combinación de estos. Las inserciones pueden incluir la inserción de genes completos o fragmentos de genes, por ejemplo, exones, que pueden ser de un origen distinto al de la secuencia endógena (por ejemplo, una secuencia heteróloga). Una interrupción puede aumentar la expresión y/o actividad de un gen o un producto génico (por ejemplo, de una proteína codificada por un gen). Una interrupción puede disminuir la expresión y/o actividad de un gen o un producto génico. Una interrupción puede alterar la secuencia de un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). Una interrupción puede truncar o fragmentar un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). Una interrupción puede extender un gen o un producto génico codificado; en algunos de estos casos, una interrupción puede lograr el ensamblaje de una proteína de fusión. Una interrupción puede afectar el nivel pero no la actividad de un gen o un producto génico. Una interrupción puede afectar la actividad pero no el nivel de un gen o un producto génico. Una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel de un gen o un producto génico. Una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre la actividad de un gen o un producto génico. Una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel o la actividad de un gen o un producto génico.
Los términos “determinar”, “medir”, “evaluar”, “valorar”, “ensayar” y “analizar” se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a cualquier forma de medición, e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones cuantitativas y/o cualitativas. El ensayo puede ser relativo o absoluto. “Ensayar para determinar la presencia de” puede ser determinar la cantidad de algo presente y/o determinar si está presente o ausente.
La frase "locus endógeno" o "gen endógeno", como se usa en la presente descripción, se refiere a un locus genético encontrado en un organismo original o de referencia antes de la introducción de una interrupción, deleción, reemplazo, alteración, o modificación como se describe en la presente. El locus endógeno puede tener una secuencia que se encuentra en la naturaleza. El locus endógeno puede ser locus de tipo silvestre. El organismo de referencia puede ser un organismo de tipo silvestre. El organismo de referencia puede ser un organismo modificado genéticamente. El organismo de referencia puede ser un organismo criado en el laboratorio (ya sea de tipo silvestre o modificado genéticamente).
La frase "promotor endógeno" se refiere a un promotor que se asocia naturalmente, por ejemplo, en un organismo de tipo silvestre, con un gen endógeno.
El término "heterólogo”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un agente o entidad de una fuente diferente. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a un polipéptido, un gen, o un producto génico presente en una célula u organismo particular, el término aclara que el polipéptido, gen, o producto génico en cuestión: 1) se modificó genéticamente por acción del hombre; 2) se introdujo en la célula u organismo (o un precursor de estos) a través de la acción del hombre (por ejemplo, por medio de ingeniería genética); y/o 3) no se produce o no está presente naturalmente en la célula u organismo relevante (por ejemplo, el tipo de célula o el tipo de organismo relevante).
El término "célula huésped", como se usa en la presente, se refiere a una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico o una proteína heterólogos (por ejemplo, exógenos). Después de leer esta descripción los expertos entenderán que tales términos no se refieren solamente a la célula particular en cuestión, sino que se usan, además, para referirse a la progenie de tal una célula. Dado que pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a una mutación o influencias ambientales, dicha progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula parental, pero aun así se incluye dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente descripción. Una célula huésped puede ser o puede comprender una célula procariota o eucariota. En general, una célula huésped es cualquier célula que sea adecuada para recibir y/o producir un ácido nucleico o una proteína heterólogos, independientemente del reino de la vida al que pertenece la célula. Las células ilustrativas incluyen las de organismos procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etcétera), células de micobacterias, células fúngicas, células de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etcétera), células vegetales, células de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insectos infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etcétera), células de animales no humanos, células humanas, o fusiones de células tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. La célula puede ser una célula humana, de mono, simio, hámster, rata, o ratón. La célula puede ser eucariota y puede seleccionarse de las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de retina, Vero, CV1, renal (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. La célula puede comprender uno o más genes virales, por ejemplo, una célula de la retina que expresa un gen viral (por ejemplo, una célula PER.C6™). Una célula huésped puede ser o puede comprender una célula aislada. Una célula huésped puede ser parte de un tejido, una célula huésped es parte de un organismo.
El término "humanizado" se usa en la presente descripción de acuerdo con el significado que se entiende en la técnica para referirse a ácidos nucleicos o proteínas cuyas estructuras (es decir, secuencias de nucleótidos o aminoácidos) incluyen porciones que se corresponden sustancial o idénticamente con estructuras de un gen o proteína particulares que se encuentran en la naturaleza en un animal no humano, e incluyen, además, porciones que se diferencian de la encontrada en el gen o proteína no humanos particulares en cuestión y en lugar de eso se corresponden de manera más cercana con estructuras comparables que se encuentran en un gen o proteína humanos correspondientes. Un gen "humanizado" puede ser uno que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la de un polipéptido humano (por ejemplo, una proteína humana o porción de esta - por ejemplo, una porción característica de esta). Para dar un ejemplo, en el caso de un receptor de membrana, un gen “humanizado” puede codificar un polipéptido que tiene una porción extracelular que tiene una secuencia de aminoácidos igual a la de una porción extracelular humana y la secuencia restante igual a la de un polipéptido no humano (por ejemplo, de ratón). Un gen humanizado puede comprender al menos una porción de una secuencia de ADN de un gen humano. Un gen humanizado puede comprender una secuencia de ADN completa de un gen humano. Una proteína humanizada puede comprender una secuencia que tiene una porción que aparece en una proteína humana. Una proteína humanizada puede comprender una secuencia completa de una proteína humana y se expresa a partir de un locus endógeno de un animal no humano que corresponde al homólogo o al ortólogo del gen humano.
El término "identidad" como se usa en la presente descripción en relación con una comparación de secuencias, se refiere a la identidad determinada mediante una serie de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos. Las identidades como se describe en la presente pueden determinarse con el uso de un alineamiento ClustalW v. 1.83 (lento) que emplea una penalización por apertura de brecha de 10,0, una penalización por extensión de brecha de 0,1, y usa una matriz de similitud de Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).
El término "aislado", como se usa en la presente, se refiere a una sustancia y/o entidad que (1) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente (en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) se ha diseñado, producido, preparado, y/o fabricado por la acción del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o más de aproximadamente 99 % de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. Los agentes aislados pueden ser alrededor de 80 %, alrededor de 85 %, alrededor de 90 %, alrededor de 91 %, alrededor de 92 %, alrededor de 93 %, alrededor de 94 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 %, o más de alrededor de 99 % puros. Como se usa en la presente, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Como entenderán los expertos en la técnica, una sustancia aún puede considerarse "aislada" o incluso "pura", después de combinarse con otros componentes determinados tales como, por ejemplo, uno o más vehículos o excipientes (por ejemplo, tampón, disolvente, agua, etcétera); en tales casos, el porcentaje de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir tales vehículos o excipientes. Solo para proporcionar un ejemplo, un polímero biológico tal como un polipéptido o un polinucleótido que se produce en la naturaleza puede considerarse "aislado" cuando, a) en virtud de su origen o fuente de obtención no se asocia con algunos o todos los componentes que lo acompañan en su estado nativo en la naturaleza; b) está sustancialmente libre de otros polipéptidos o ácidos nucleicos de la misma especie que la especie que lo produce en la naturaleza; o c) se expresa por o se encuentra de cualquier otra manera en asociación con componentes de una célula u otro sistema de expresión que no es de la especie que lo produce en la naturaleza. Así, por ejemplo, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente al que lo produce en la naturaleza puede considerarse un polipéptido "aislado". Alternativamente o adicionalmente, un polipéptido que se ha sometido a una o más técnicas de purificación puede considerarse un polipéptido "aislado" en la medida que se ha separado de otros componentes a) con los que se asocia en la naturaleza; y/o b) con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente.
La frase “animal no humano” como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier organismo vertebrado que no es un ser humano. Un animal no humano puede ser un ciclóstomo, un pez óseo, un pez cartilaginoso (por ejemplo, un tiburón o una raya), un anfibio, un reptil, un mamífero, o un ave. Un mamífero no humano puede ser un primate, una cabra, una oveja, un cerdo, un perro, una vaca, o un roedor. Un animal no humano puede ser un roedor tal como una rata o un ratón.
La frase "ácido nucleico", como se usa en la presente, en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que es una cadena oligonucleotídica o que puede incorporarse a esta. Un ácido nucleico puede ser un compuesto y/o sustancia que es una cadena oligonucleotídica o que puede incorporarse a esta por medio de un enlace fosfodiéster. Como resultará evidente a partir del contexto, "ácido nucleico" puede referirse a residuos de ácido nucleico individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos); "ácido nucleico" puede referirse a una cadena oligonucleotídica que comprende residuos de ácido nucleico individuales. Un "ácido nucleico" puede ser o comprender ARN; un "ácido nucleico" puede ser o comprender ADN. Un ácido nucleico puede ser, o comprender, o consistir en uno o más residuos de ácido nucleico naturales. Un ácido nucleico puede ser, o comprender, o consistir en uno o más análogos de ácido nucleico naturales. Un análogo de ácido nucleico puede diferir de un ácido nucleico en el hecho de que no utiliza una cadena principal con enlaces fosfodiéster. Por ejemplo, un ácido nucleico puede ser, comprender, o consistir en uno o más "ácidos nucleicos peptídicos", que se conocen en la técnica y tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la cadena principal. Alternativamente o adicionalmente, un ácido nucleico puede tener uno o más enlaces fosforotioato y/o 5'-N-fosforamidita en lugar de enlaces fosfodiéster. Un ácido nucleico puede ser, comprender, o consistir en uno o más nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina, y desoxicitidina). Un ácido nucleico puede ser, comprender, o consistir en uno o más análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas, y combinaciones de estos). Un ácido nucleico puede comprender uno o más azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa, y hexosa) en comparación con los de ácidos nucleicos naturales. Un ácido nucleico puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico funcional tal como un ARN o una proteína. Un "ácido nucleico" puede incluir uno o más intrones. Un “ácido nucleico” puede prepararse mediante uno o más de aislamiento a partir de una fuente natural, síntesis enzimática por polimerización basada en una plantilla complementaria (in vivo o in vitro), reproducción en una célula o sistema recombinante, y síntesis química. Un ácido nucleico puede ser de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o más residuos de longitud. Un "ácido nucleico" puede ser de una hebra; o un "ácido nucleico" puede ser de doble hebra. Un ácido nucleico puede tener una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un elemento que codifica, o es el complemento de una secuencia que codifica, un polipéptido. Un ácido nucleico puede tener actividad enzimática.
La frase "unido operativamente”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia control "unida operativamente" a una secuencia codificante está ligada de manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias control. Las secuencias "unidas operativamente" incluyen ambas, las secuencias de control de la expresión contiguas al gen de interés y las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de la expresión", como se usa en la presente descripción, se refiere a secuencias de polinucleótidos, que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de las secuencias codificantes a las que se unen. Las “secuencias de control de la expresión” incluyen: secuencias adecuadas de iniciación, de terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción; señales eficientes de procesamiento del ARN tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficiencia de la traducción (es decir, la secuencia consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y cuando convenga, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de tales secuencias control difiere según el organismo huésped. Por ejemplo, en procariotas, tales secuencias control generalmente incluyen promotor, sitio de unión al ribosoma, y secuencias de terminación de la transcripción, mientras que en eucariotas, típicamente, tales secuencias control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción. El término "secuencias control" está destinado a incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir, además, componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de parejas de fusión.
El término "polipéptido", como se usa en la presente, se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Un polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos que se produce en la naturaleza. Un polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos que no se produce en la naturaleza, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que contiene porciones que se producen en la naturaleza separadas entre sí (es decir, a partir de dos o más organismos diferentes, por ejemplo, porciones humanas y no humanas). Un polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos que está modificada genéticamente en el hecho de que se diseña y/o se produce por la acción del hombre.
El término "recombinante", se usa para referirse a polipéptidos (p. ej., polipéptidos CD47 como se describen en la presente descripción) que se diseñan, se modifican, se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como polipéptidos que se expresan con el uso de un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, polipéptidos aislados a partir de una biblioteca combinatoria, de polipéptidos humanos recombinantes (Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., e Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., y Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), anticuerpos aislados a partir de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulinas humanas (ver p. ej., Taylor, L. D., y otros (1992) Nucl. Acids Res.
20:6287-6295; Kellermann S-A., y Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. y otros (2000) Immunology Today 21:364-370; Murphy, A.J., y otros (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111(14):5153-5158) o polipéptidos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por cualquier otro medio que involucre el corte y empalme entre elementos de secuencia seleccionados. Uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados pueden encontrarse en la naturaleza. Uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados pueden diseñarse in silico. Uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados pueden ser el resultado de la mutagénesis (por ejemplo, in vivo o in vitro) de un elemento de secuencia conocido, por ejemplo, a partir de una fuente natural o sintética. Por ejemplo, un polipéptido recombinante puede estar compuesto por secuencias que se encuentran en el genoma de un organismo fuente de interés (por ejemplo, ser humano, ratón, etcétera). Un polipéptido recombinante puede tener una secuencia de aminoácidos que es el resultado de la mutagénesis (por ejemplo, in vitro o in vivo, por ejemplo en un animal no humano), de manera que las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos recombinantes son secuencias que, aunque se originan de secuencias de polipéptidos y se relacionan con estas, pueden no existir naturalmente dentro del genoma de un animal no humano in vivo.
El término "reemplazo" se usa en la presente descripción para referirse a un proceso a través del cual una secuencia de ácido nucleico “reemplazada” (por ejemplo, un gen) que se encuentra en un locus del huésped (por ejemplo, en un genoma) se elimina de ese locus, y un ácido nucleico diferente, de “reemplazo” se coloca en su lugar. La secuencia de ácido nucleico reemplazada y las secuencias de ácidos nucleicos de reemplazo pueden ser comparables entre sí porque, por ejemplo, son homólogas entre sí y/o contienen elementos correspondientes (por ejemplo, elementos que codifican proteínas, elementos reguladores, etcétera). Una secuencia de ácido nucleico reemplazada puede incluir uno o más de un promotor, un potenciador, un sitio donante de corte y empalme, un sitio receptor de corte y empalme, un intrón, un exón, una región no traducida (UTR); una secuencia de ácido nucleico de reemplazo puede incluir una o más secuencias codificantes. Una secuencia de ácido nucleico de reemplazo puede ser un homólogo de la secuencia de ácido nucleico reemplazada. Una secuencia de ácido nucleico de reemplazo puede ser un ortólogo de la secuencia reemplazada. Una secuencia de ácido nucleico de reemplazo puede ser o puede comprender una secuencia de ácido nucleico humana. En algunos casos, que incluyen cuando la secuencia de ácido nucleico de reemplazo es o comprende una secuencia de ácido nucleico humana, la secuencia de ácido nucleico reemplazada puede ser o puede comprender una secuencia de roedor (por ejemplo, una secuencia de ratón o rata). La secuencia de ácido nucleico así colocada puede incluir una o más secuencias reguladoras que son parte de la secuencia de ácido nucleico fuente usada para obtener la secuencia así colocada (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones 5' o 3' no traducidas, etcétera). Por ejemplo, el reemplazo es una sustitución de una secuencia endógena con una secuencia heteróloga que da como resultado la producción de un producto génico a partir de la secuencia de ácido nucleico así colocada (que comprende la secuencia heteróloga), pero no la expresión de la secuencia endógena; el reemplazo es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene una función similar a la de la proteína codificada por la secuencia endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica una proteína CD47, y el fragmento de ADN codifica una o más proteínas CD47 humanas). Un gen endógeno o un fragmento de este se reemplaza con un gen humano correspondiente o un fragmento de este. Un gen humano correspondiente o un fragmento de este es un gen humano o un fragmento que es un ortólogo de, o es sustancialmente similar o igual en estructura y/o función, al gen endógeno o fragmento de este que se reemplaza.
La frase "proteína del grupo de diferenciación 47" o “proteína CD47”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una proteína de transmembrana que pasa varias veces a través de ella que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y tiene un dominio V inmunoglobulínico extracelular amino-terminal, cinco dominios de transmembrana y una cola intracelular carboxilo-terminal corta. CD47 se expresa en la superficie celular y participa en interacciones entre proteínas de la superficie de la membrana tales como, por ejemplo, integrinas, SIRPa y trombospondina 1 (TSP-1). CD47 se expresa en tejidos normales y se regula positivamente en varios tipos de cáncer humano. Se ha demostrado que CD47 participa en varios procesos celulares tales como, por ejemplo, apoptosis, proliferación, adhesión y migración. Se han identificado varias isoformas de CD47 de corte y empalme alternativos entre el ratón y el hombre. A modo de ilustración, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los genes de CD47 de ratón y humano se proporcionan en la Tabla 3. Después de leer esta descripción los expertos reconocerán que uno o más genes de CD47 endógenos en un genoma (o todos) pueden reemplazarse con uno o más genes de CD47 heterólogos (por ejemplo, variantes polimórficas, subtipos o mutantes, genes de otras especies, formas humanizadas, etcétera).
Una "célula que expresa CD47", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa una proteína CD47 de transmembrana. Una célula que expresa CD47 expresa una proteína CD47 de transmembrana en su superficie. Una proteína CD47 se expresa en la superficie de la célula en una cantidad suficiente para mediar las interacciones célula a célula por medio de la proteína CD47 de transmembrana expresada en la superficie de la célula. Las células que expresan CD47 ilustrativas incluyen neuronas, células inmunitarias, queratinocitos, y células circulantes. Las células que expresan CD47 regulan la interacción de las células inmunitarias y las células circulantes para regular diversos procesos celulares tales como adhesión, proliferación celular y/o apoptosis, angiogénesis e inflamación. Los animales no humanos de la presente invención demuestran la regulación de diversos procesos celulares (como se describe en la presente) por medio de proteínas CD47 humanizadas expresadas en la superficie de una o más células del animal no humano.
El término “referencia” se usa en la presente descripción para describir un agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor patrón o de control contra el cual se compara un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. Un agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se somete a prueba y/o se determina sustancialmente de manera simultánea con la prueba o determinación del agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. Un agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia es una referencia histórica, materializada opcionalmente en un medio tangible. Una referencia puede referirse a un control. Como se usa en la presente descripción, una “referencia” puede referirse a un “animal de referencia”. Un “animal de referencia” puede tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción o puede no tener modificaciones (es decir, un animal de tipo silvestre). Típicamente, como entenderán los expertos en la técnica, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se determina o caracteriza en condiciones comparables a las utilizadas para determinar o caracterizar el agente, animal (por ejemplo, un mamífero), cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés.
El término “sustancialmente” como se usa en la presente descripción se refiere a la condición cualitativa de exhibir una medida o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en la técnica biológica comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, o nunca, llegan a completarse y/o proceden a completar o lograr o evitar un resultado absoluto. El término "sustancialmente" se usa, por tanto, en la presente para capturar la falta potencial de completamiento inherente en muchos fenómenos biológicos y químicos.
La frase “homología sustancial”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como se apreciará por los expertos en la materia, generalmente se considera que dos secuencias son "sustancialmente homólogas" si contienen residuos homólogos en posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos con características estructurales y/o funcionales adecuadamente similares. Por ejemplo, como se conoce bien por los expertos en la materia, determinados aminoácidos se clasifican típicamente como aminoácidos "hidrófobos" o "hidrófilos", y/o porque tienen cadenas laterales "polares" o "no polares". La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo puede considerarse frecuentemente una sustitución "homóloga". Las clasificaciones de aminoácidos típicas se resumen en la Tabla 1 y 2.
TABLA 1
Alanina Ala A No polar Neutro 1,8 Arginina Arg R Polar Positivo -4,5 Asparagina Asn N Polar Neutro -3,5
Ácido aspártico Asp D Polar Negativo -3,5 Cisteína Cys C No polar Neutro 2,5
Ácido glutámico Glu E Polar Negativo -3,5 Glutamina Gln Q Polar Neutro -3,5
Glicina Gly G No polar Neutro -0,4 Histidina His H Polar Positivo -3,2 Isoleucina Ile I No polar Neutro 4,5 Leucina Leu L No polar Neutro 3,8
Lisina Lys K Polar Positivo -3,9 Metionina Met M No polar Neutro 1,9 Fenilalanina Phe F No polar Neutro 2,8
Prolina Pro P No polar Neutro -1,6
Serina Ser S Polar Neutro -0,8 Treonina Thr T Polar Neutro -0,7 Triptófano Trp W No polar Neutro -0,9 Tirosina Tyr Y Polar Neutro -1,3
Valina Val V No polar Neutro 4,2
TABLA 2
Aminoácidos ambiguos 3-Letras 1-Letra Asparagina o ácido aspártico Asx B Glutamina o ácido glutámico Glx Z
Leucina o Isoleucina Xle J Aminoácido no especificado o desconocido Xaa X
Como se conoce bien en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse con el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para las secuencias de nucleótidos y BLASTP, gapped BLAST, y PSI-BLAST para las secuencias de aminoácidos. Tales programas ilustrativos se describen en Altschul y otros (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul y otros. (1997) Methods in Enzymology; Altschul y otros, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis y otros (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; y Misener y otros, (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Además de identificar las secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. Dos secuencias pueden considerarse sustancialmente homólogas si al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son homólogos en un segmento relevante de residuos. El segmento relevante puede ser una secuencia completa. El segmento relevante puede ser de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o más residuos. El segmento relevante puede incluir residuos contiguos a lo largo de una secuencia completa. El segmento relevante puede incluir residuos discontinuos a lo largo de una secuencia completa. El segmento relevante puede ser de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más residuos.
La frase “ identidad sustancial”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la materia, dos secuencias generalmente se consideran "sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos en las posiciones correspondientes. Como se conoce bien en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse con el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para las secuencias de nucleótidos y BLASTP, gapped BLAST, y PSI-BLAST para las secuencias de aminoácidos. Tales programas ilustrativos se describen en Altschul y otros (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul y otros, Methods in Enzymology; Altschul y otros (1997) Nucleic Acids Res.
25:3389-3402; Baxevanis y otros (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; y Misener y otros, (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. Dos secuencias pueden considerarse sustancialmente idénticas si al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son idénticos en un segmento relevante de residuos. El segmento relevante puede ser una secuencia completa. El segmento relevante puede ser de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más residuos.
La frase "vector de transformación" o "construcción de transformación", como se usa en la presente descripción, se refiere a una molécula polinucleotídica que comprende una región de transformación. Una región de transformación comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia en una célula, tejido o animal diana y proporciona la integración del constructo de transformación en una posición dentro del genoma de la célula, tejido o animal por medio de la recombinación homóloga. Se incluyen, además, las regiones de transformación que se dirigen hacia el objetivo con el uso de sitios de reconocimiento de recombinasas sitio específicas (por ejemplo, sitios loxP o Frt). Un constructo de transformación como se describe en la presente puede comprender además una secuencia de ácido nucleico o gen de interés particular, un marcador de selección, secuencias de control y/o reguladoras, y otras secuencias de ácidos nucleicos que permiten la recombinación mediada por la adición exógena de proteínas que ayudan o facilitan la recombinación que involucra a tales secuencias. Un constructo de transformación como se describe en la presente puede comprender además un gen de interés en su totalidad o en parte, en donde el gen de interés es un gen heterólogo que codifica una proteína en su totalidad o en parte que tiene una función similar a la de una proteína codificada por una secuencia endógena. Un constructo de transformación comprende, además, un gen humanizado de interés, en su totalidad o en parte, en donde el gen humanizado de interés codifica una proteína, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de una proteína codificada por la secuencia endógena.
El término "variante", como se usa en la presente, se refiere a una entidad que muestra una identidad estructural significativa con una entidad de referencia pero difiere estructuralmente de la entidad de referencia en la presencia o el nivel de una o más porciones químicas en comparación con la entidad de referencia. Una variante también puede diferir funcionalmente de su entidad de referencia. En general, el hecho de que una entidad particular se considere adecuadamente como una "variante" de una entidad de referencia se basa en su grado de identidad estructural con la entidad de referencia. Como apreciarán los expertos en la técnica, cualquier entidad de referencia biológica o química tiene determinados elementos estructurales característicos. Una “variante”, por definición, es una entidad química definida que comparte uno o más de tales elementos estructurales característicos. Para proporcionar algunos ejemplos, una molécula pequeña puede tener un elemento estructural central característico (por ejemplo, un macrociclo central) y/o una o más porciones colgantes características de manera que una variante de la molécula pequeña es una que comparte el elemento estructural central y las porciones colgantes características pero se diferencia en otras porciones colgantes y/o en los tipos de enlaces presentes (simples vs. dobles, E vs. Z, etcétera) dentro del núcleo central, un polipéptido puede tener un elemento de secuencia característico que comprende una pluralidad de aminoácidos que tienen posiciones designadas relacionadas entre sí en el espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen a una función biológica particular, un ácido nucleico puede tener un elemento de secuencia característico que comprende una pluralidad de residuos de nucleótidos que tienen posiciones designadas con respecto a otras en el espacio lineal o tridimensional. Por ejemplo, una “variante de polipéptido” puede diferenciarse de un polipéptido de referencia como resultado de una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos y/o una o más diferencias en las porciones químicas (por ejemplo, carbohidratos, lípidos, etcétera) unidas covalentemente a la cadena principal del polipéptido. Una variante de polipéptido puede mostrar una identidad de secuencia general con un polipéptido de referencia que es de al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, o 99 %. Alternativamente o adicionalmente, una variante de polipéptido puede no compartir al menos un elemento de secuencia característico con un polipéptido de referencia. El polipéptido de referencia puede tener una o más actividades biológicas. Una variante de polipéptido puede compartir una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. Una variante de polipéptido puede carecer de una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. Una variante de polipéptido puede mostrar un nivel reducido de una o más actividades biológicas en comparación con el polipéptido de referencia. Un polipéptido de interés puede considerarse una "variante" de un polipéptido original o de referencia si el polipéptido de interés tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la del original excepto por un número pequeño de alteraciones de la secuencia en posiciones particulares. Típicamente, menos de 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % de los residuos en la variante están sustituidos en comparación con el original. Una variante puede tener 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuo sustituido en comparación con un original. Frecuentemente, una “variante” tiene un número muy pequeño (por ejemplo, menos de 5, 4, 3, 2, o 1) de residuos funcionales sustituidos (es decir, residuos que participan en una actividad biológica particular). Además, típicamente, una “variante” no tiene más de 5, 4, 3, 2, o 1 adiciones o deleciones, y frecuentemente no tiene adiciones o deleciones, en comparación con el original. Por otra parte, cualquiera de las adiciones o deleciones son típicamente menores que aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 19, aproximadamente 18, aproximadamente 17, aproximadamente 16, aproximadamente 15, aproximadamente 14, aproximadamente 13, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, y comúnmente son menores que aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, o aproximadamente 2 residuos. El polipéptido original o de referencia puede ser uno que se encuentra en la naturaleza. Como entenderán los expertos en la técnica, una pluralidad de variantes de un polipéptido de interés particular puede encontrarse comúnmente en la naturaleza, particularmente cuando el polipéptido de interés es un polipéptido agente infeccioso.
El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se asocia. Los vectores pueden ser capaces de replicarse de manera extracromosómica y/o expresar los ácidos nucleicos a los que se encuentran unidos en una célula huésped tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se denominan en la presente "vectores de expresión."
El término "de tipo silvestre", como se usa en la presente, tiene el significado que se entiende en la técnica que se refiere a una entidad que tiene una estructura y/o actividad como la que se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto "normal" (a diferencia del mutante, enfermo, alterado, etcétera). Los expertos en la técnica apreciarán que los genes y polipéptidos de tipo silvestre existen frecuentemente en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).
Descripción detallada de determinadas modalidades
Se describen en la presente descripción, entre otras cosas, animales no humanos mejorados y/o modificados que tienen material genético humanizado que codifica un gen del grupo de diferenciación 47 (CD47) para determinar la eficacia terapéutica de antagonistas de CD47 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD47) para el tratamiento del cáncer, y ensayos en trasplante de injertos, activación y fagocitosis y transducción de señales. Se contempla que tales animales no humanos proporcionan una mejora en la determinación de la eficacia terapéutica de antagonistas de CD47 y su potencial para el bloqueo de CD47. Se contempla además que tales animales no humanos proporcionan un mejoramiento en el trasplante de injertos de células humanas. Por lo tanto, la presente descripción es particularmente útil para el desarrollo de terapias anti-CD47 para el tratamiento de diversos tipos de cáncer, así como para mantener células hematopoyéticas humanas en animales no humanos. Particularmente, la presente descripción abarca la humanización de un gen de CD47 murino que da como resultado la expresión de una proteína CD47 humanizada en la superficie de células del animal no humano. Tales proteínas CD47 humanizadas tienen la capacidad de proporcionar una fuente de células CD47+ humanas para determinar la eficacia de productos terapéuticos anti-CD47 para activar la fagocitosis de células tumorales. Además, tales proteínas CD47 humanizadas tienen la capacidad de reconocer células humanas injertadas por medio de la participación de otras proteínas de la superficie celular y los ligandos presentes en la superficie de las células humanas injertadas (por ejemplo, SIRPa). Los animales no humanos de la presente invención son capaces de activar la fagocitosis por medio del bloqueo de la señalización de CD47 a través de la proteína CD47 humanizada expresada en la superficie de las células del animal no humano. Los animales no humanos descritos en la presente pueden ser capaces de recibir células hematopoyéticas humanas trasplantadas; tales mamíferos no humanos pueden desarrollar y/o tener un sistema inmunitario que comprende células humanas. Las proteínas CD47 humanizadas tienen una secuencia correspondiente al dominio V inmunoglobulínico N-terminal de una proteína CD47 humana. Las proteínas CD47 humanizadas tienen una secuencia correspondiente a una porción N-terminal de una proteína CD47 humana que comprende una porción extracelular y una porción transmembrana de una proteína CD47 humana, en donde la porción extracelular incluye el dominio V inmunoglobulínico N-terminal de la proteína CD47 humana y la porción transmembrana incluye los cinco dominios de transmembrana de la proteína CD47 humana. Las proteínas CD47 humanizadas tienen una secuencia correspondiente a la cola intracitoplasmática de una proteína CD47 no humana (por ejemplo, murina). Las proteínas CD47 humanizadas pueden tener una secuencia correspondiente a los residuos de aminoácidos 19-292 (o 19-141, o 19-127) de una proteína CD47 humana. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden comprender un gen de CD47 endógeno que contiene material genético del animal no humano y una especie heteróloga (por ejemplo, un ser humano). Los animales no humanos de la presente invención pueden comprender un gen de CD47 humanizado, en donde el gen de CD47 humanizado comprende exones de un gen de CD47 humano que codifican una porción extracelular que incluye el dominio V inmunoglobulínico N-terminal de un gen de CD47 humano. El gen de CD47 humanizado puede comprender exones de CD47 humano, por ejemplo, los exones 2-7, que codifican una porción N-terminal de una proteína CD47 humana que comprende una porción extracelular y una porción transmembrana de una proteína CD47 humana, en donde la porción extracelular incluye el dominio V inmunoglobulínico N-terminal de la proteína CD47 humana y la porción transmembrana incluye los cinco dominios de transmembrana de la proteína CD47 humana. El gen de c D47 humanizado puede comprender exones de CD47 no humanos que codifican el péptido señal, en su totalidad o en parte, y la cola intracitoplasmática de una proteína CD47 no humana. El gen de CD47 humanizado puede comprender el exón 1 de CD47 no humano y el o los exones corriente abajo del exón 7 que codifican la cola intracitoplasmática y la UTR 3'. En dependencia de las isoformas, pueden existir uno o más exones corriente abajo del exón 7, donde el codón de parada y la UTR 3' están presentes en el último exón para todas las isoformas. Por ejemplo, la isoforma 2 tanto de CD47 de ratón como humana mostradas en la Tabla 3 tienen dos exones corriente abajo del exón 7, designados como exón 8 y 9.
Diversos aspectos de la invención se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no significa que limite la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de “o” significa “y/o” a menos que se indique de cualquier otra manera.
Gen del grupo de diferenciación 47 (CD47)
CD47, denominado originalmente como proteína asociada a integrina (IAP) por su papel en la transducción de señales de las integrinas en células inmunitarias, es una proteína de transmembrana que incluye un dominio V inmunoglobulínico (IgV) N-terminal, cinco dominios de transmembrana, y una cola intracitoplasmática corta en C-terminal. La cola intracitoplasmática se diferencia en la longitud de acuerdo con cuatro isoformas de corte y empalme alternativos que se han identificado. Inicialmente se describió que CD47 (o IAP) se expresa en todos los tejidos (isoforma 2), neuronas (isoforma 4) y queratinocitos y macrófagos (isoforma 1; ver Reinhold y otros (1995) J. Cell Sci.
108:3419-3425). Se conoce poco sobre la isoforma 3 a pesar de que esta forma tiene la segunda cola intracitoplasmática más larga entre las cuatro isoformas. Además de las integrinas, se conoce que CD47 interactúa con varias otras proteínas de la superficie celular tales como, por ejemplo, trombospondina y miembros de la familia de SIRP. Lo más notable es que CD47 interactúa con SIRPa y conduce a una señalización bidireccional que regula una variedad de respuestas entre células tales como, por ejemplo, inhibición de la fagocitosis y activación de células T. De hecho, la interacción CD47-SIRPa se ha puesto de manifiesto en años recientes por su papel en proporcionar células tumorales con la capacidad de evadir la vigilancia inmunológica. La unión de CD47 a SIRPa normalmente proporciona protección a través de señales anti-fagocíticas (“no me comas”) para las células normales. Sin embargo, se ha descubierto que los tumores expresan además señales anti-fagocíticas, que incluyen CD47, para evadir la destrucción por fagocitosis. De manera interesante, se conoce que CD47 está regulada positivamente en varios cánceres hematológicos y contribuye tanto al crecimiento como a la diseminación de tumores (Chao y otros (2012) Curr Opin Immunol. 24(2): 225-232).
Se desconocen todos los efectos de dirigirse a CD47 y a la vía CD47-SIRPa como un nuevo tratamiento para el cáncer y se han explorado algunas toxicidades posibles. Una comprensión más completa y detallada de la señalización de CD47 y la vía CD47-SIRPa es necesaria para desarrollar mejores terapias dirigidas para el tratamiento del cáncer en el futuro.
Secuencias de CD47
En la Tabla 3 se exponen secuencias ilustrativas de CD47 para el ser humano y el ratón. Para las secuencias de ARNm, la letra en negritas indica la secuencia codificante y los exones consecutivos, cuando se indican, se encuentran separados por texto subrayado alterno. Para las secuencias de proteínas humana y de ratón, los péptidos señal están subrayados, las secuencias extracelulares están en letras negritas y las secuencias intracitoplasmáticas están en cursiva. Para las secuencias de proteínas humanizadas, las secuencias no humanas se indican en letra normal, las secuencias humanas se indican en letras negritas y los péptidos señal están subrayados. Como se muestra, las isoformas difieren en el número de exones. Por ejemplo, las isoformas 1-4 del gen de CD47 humano tienen un total de 8, 9, 10 y 11 exones, respectivamente, donde los exones 2-7 de cada isoforma codifican el dominio extracelular y los cinco dominios de transmembrana.
TABLA 3
Isoforma 1 de ARNm de CD47 de ratón (XM_006521810.1)
GCCTACACCGGGAGAGCAGGGAGGAGGAGTTGGACTGAGGTTGGGCGGCTC
CGAGGTCCAGGGCGAGCTTGGCCAGAGGGAGTAGAGAGCAGCGGGGCTGC
GCAGGGACGCGTGCCGTGAGTTCCGGTGAGCGTGTGTGTCCCATGCTCCCGT
CTTTCAGGCCGGCCCAGGACACGAAGCCGGAAGAGAGCTGGCTGGAGGGAC
GG GGGCCGTGAGCAGAGAGTGCAACCCGCGCAGCCCCGGGGACAGGCTGA
TTCTTGGCGCTCTCCGCCGGAGCCTGCCCAGGGCTGGGTGTGAGGCTGGCGT
CACGTCAACGAGCAGAGGCGGCCAGGCGGGGCGGAGTGCGCGTGCGCGGG
GCGG CG AG CA CGCGCGCGCGCGCACCCCCGGGCAGCCTGGGCGGCCGCTCC
TGCCTGTCACTGCTGCGGCGCTGCTGGTCGGTCGTTTCCCTTGAAGGCAGCA
GCGG A GGCGG CGGCTGCTCCAGACACCTGCGGCGGCGACCCCCCGGCGGCG
C G G A G A TG TG G CCCTTG G CG G CG G CG CTG TTG CTG G G CTCCTG CTG CT
GC GGTT C AGC T C AAC T AC TG TTT AGT AAC GT C AAC T C C AT AG AGTT C AC TTCATGCAATGAAACTGTGGTCATCCCTTGCATCGTCCGTAATGTGGAG GCGCAAAGCACCGAAGAAATGTTTGTGAAGTGGAAGTTGAACAAATCG T AT ATTTTC AT C T ATGAT GGAAAT AAAAAT AGC AC T ACTAC AGAT C AAA ACTTTACCAGTGCAAAAATCTCAGTCTCAGACTTAATCAATGGCATTGC CTCTTTGAAAATGGATAAGCGCGATGCCATGGTGGGAAACTACACTTGC GAAGTGACAGAGTTATCCAGAGAAGGCAAAACAGTTATAGAGCTGAAA AACCGCACGGCCTTCAACACTGACCAAGGATCAGCCTGTTCTTACGAGG AGGAGAAAGGAGGTTGCAAATTAGTTTCGTGGTTTTCTCCAAATGAAAA GATCCTCATTGTTATTTTCCCAATTTTGGCTATACTCCTGTTCTGGGGAA AGTTTGGTATTTTAACACTCAAATATAAATCCAGCCATACGAATAAGAG AATCATTCTGCTGCTCGTTGCCGGGCTGGTGCTCACAGTCATCGTGGTT GTTGGAGCCATCCTTCTCATCCCAGGAGAAAAGCCCGTGAAGAATGCTT CTGGACTTGGCCTCATTGTAATCTCTACGGGGATATTAATACTACTTCA GTACAATGTGTTTATGACAGCTTTTGGAATGACCTCTTTCACCATTGCC ATATTGATCACTCAAGTGCTGGGCTACGTCCTTGCTTTGGTCGGGCTGT GTCTCTGCATCATGGCATGTGAGCCAGTGCACGGCCCCCTTTTGATTTC AGGTTTGGGGATCATAGCTCTAGCAGAACTACTTGGATTAGTTTATATG AAGTTTGTCGAATAGGTGAAGGGAAGTGACGGACTGTAACTTGGAAGTCA GAAATGGAAGAATACAGTTGTCTAAGCACCAGGTCTTCACGACTCACAGCT GGAAGGAACAGACAACAGTAACTGACTTCCATCCAGGAAAACATGTCACAT AAAT GATT ACT AAGTTT AT ATT C AAAGC AGCTGT ACTTT AC AT AAT AAAAAA AATATGATGTGCTGTGTAACCAATTGGAATCCCATTTTTCTATTGTTTCTACT CAACTAGGGGCAAACGTTTCAGGGGCAACTTCCAAGAATGATGCTTGTTAG AT C CT AGAGT CTCT G AAC ACT GAGTTT AA ATT GATTCCG AGT G AGACTCGC C AAGCACT AACCTGAGGGTT AGTT ACCCAGAGAT ACCTAT GAAAAAC AGTGG TATCCAGCAAGCCTTAGTAAACTCAGGTTGCCAGCAGCTTTGCCACTTCCGC TGCTAGCTGAATAACAAGACTGCCACTTCTGGGTCATAGTGATAGAGACTG AAGTAGAAAAACGAATGTGGTTGGGCAAATCCCGTGTGGCCCCTCTGTGTG CT ATGAT ATTGATGGCACTGGTGTCTTC ATTCTTGGGGGTTGCCATCATTC AC AC AC ACCC CTTT G AC AT AC AGT GC ACCC C AGTTTT G AAT AC ATTTTTTTT GC A CCCTGTCCCGTTCTGCTACTTTGATTTGCGTTATGATATATATATATATATAT AATACCTTTTCTCCTCTTTAAACATGGTCCTGTGACACAATAGTCAGTTGCA GAAAGGAGCCAGACTTATTCGCAAAGCACTGTGCTCAAACTCTTCAGAAAA AAAGG AAAAAAAAAAAAAGCTAT AGTT GT AAC AT AT GT ATT C C AG ACCT CT GGTTT AAAGGC AAAAGAAAAAAAAT CT AC AGTGTTTCTT CT C AT GTTTTCTG AT C GGAGGC AT GAC AAAGC AAGACT GAA ATCT GAACT GT GT CTC CT GC ATG GCAACACGTGTCTCCGTCAGGCCCTCGCAAGGCCCGGGGAGGGGGTTCTAC GCCTCTTGTCTCTTTGTTGCATGCTGAACACTCATCGCCTTCCTACTGTATCC TGCCTCCTGCAGCCTCCCTCTTCCTCCTCCTCTTCCTCTTCCTCCTCTTCCTCC TCCTCCTCCTCTTCCTCCAAGTTTGAAAGGTCAAACAAAACTACCACATTCC CTACCCAGTTAGAAGAAAACCACCGTCCTGACAGTTGTGATCGCATGGAGT ACTTTTAGATTATTAGCACCTGTTTTTACCTCGTTTGTGGGCGTGTTTGTATG TGCACATGTATGAAGTCGGCACATGCACCTTCTGTATGGGCAGAGGCGTGG C AT CT ACAG AAG AGC AGAT GCC AACTTT GTGCTTTT AGT GAAT AC ATT AAAA AAAAAAAAC C AACGGTC CTT ATT G AGT GG AATT CT ATTT GAT GC AAAT ATTT GAGCT CTTT AAG ACTTTAAAACT AGAT AAT GT GC C AAGCTTTT AGG ACT GCT CACCAGTGCCCTCTGAAGAAACACCAGTACTTTTTCCTGTTTGTGTAATAAA GGC AT ATTT GT ATTT GT GTTT GC AT C ACT AAT GGTT ATTTCTT CTT AGT CC AC TGAATGTTTCCATGTGCCTCTCGTATGCCAAACTTTTTGTCATCTTTCATGTG GGGACCAAATGGTTTGTCTGTGGCAAACCTAAACCTATGACCTGCTGAGGCC TCTCAGAAAACTGACCACAGTACCAAGATAGTACTTCGCAAAGAAAAGTAG GTTCCCTCCCTGGTTTTGTAGCTGTCGCCAATATTAGCGTAATTCCAAGGAG CTGAACGCCTTTATATAAATCTGATGGCACCTGATGCTTTTAGTTCTGAAAA TATTTACACTCGGATCATGTTGTTGATGACTTAAACAAAGTTTTGATGAAGA GAGCAAAAAAAAAGCAGGTGGATTTGGAACAGTTTCAGGGTTTTTTTTGTTT TTTGTTTTTTGTTTTTGTTTTTTTTTTTTTATTTTTGTTTTTCTGTTCTCTGTTAG AAAAGTCAGGTGTTCTCTGTCAGGCTATCTTTATAGTCAATTTTTTTTACGAA CTAAAGTAGTACCTTTTAATATGTAGTCAACGCCCCTCTGCTCGGGGTTCAG TTTTGGGTCTTAACCAGCTGTCATGTTCTCTATGCTGCCTGCCACTTGAGGCA CTGAGTGCCCTAGACAGTCCCATCGGTGGTAGCCAGGGAAACGAAAGACGA ACTCAACTCTTGCTCCTAATAATCAACTCTCTGTATGAAGGATGGCAGCATT AAGAGTCCTCCTGCCTGGGCATTATTGGGCCAGTTCACCCTCTTTAAATCAA ACCCGCAGTGGCTCCCAGTTCTCGTCCCATCAGATTTAAATTGCTAACAGTA TGGGGGGCACCACGCATCTGTTTTGTCCCACAATGCGCTTTTCTCTCCCAAA TCCCGATTTCTGCTGTCATAGCCTCTATTCAATTTTTATTTATTGTCTGCCCTC CACTTATACAATCGTAGAGAGCAATGCCATTTGTCACTTTCTGCAACAGTTT TTTGAGCCTTTATGGCTGAATCCCATTTTTCTTCTCTTTCAAACTGTTTGCTCC ATTGCTCCTCCCGCACGGCTGTCCGTACAGTCATCCCATCCATCTGGGGGCC TCTTTCATCTCTCACCCTTCCTGGTGCTTCGTGGATCTCTGCTTACCTCTGTG GGTTTTTTTTTTTTTTTTTG ACTT ATTCTTCTC ACT GG AC’TTT A AG ATT ACTTC CACAGCGAAAGTGCTGCCTCCCTTTTCTGCCCGCAGTGTTCTGCGTACTTTA GATACTACTCAGTGCTGACATTTGATGGCAAAAGTTGCCTGCACTTAAATTT CT CTTTTT AAT AGGGT G AACT AG AGTTGG AGTTTTTTT CT CTTTTTT CT CTTTT CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTCCCTCCCTC CCTCCCTCCCTCCCTCCCTCTCTCTCTCTTTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCT TTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTnCTTTTTTTGACAAATCTCACAGGCTTTGA GAATTATAAAAGGTGACAGTTCACCTGAAAATCACAGGTCTGGTCTGTTTAA ATTGTTGAGAAATATCCGATTAAAAGTCTTGTGGCTGTGTCCTAATAGGCTC TCTTTCAGGACGTTGTAGTCAATAGAGTGGCTGAACCATACTTGAGTTTATA A AGCTC AAA A ACTG ATGC ACCC ACTCT GCT ATT ATCGTGTTAGT A AG AGTT C AGCTGTATATCATTGTCTAGGTTTATCTTGTCCTACAGTGGGTATTCAAATAT GGCCACCAGAGGATATGTGTAAATATAAGCACCTGTATTTGCCTGTTGTTGA GAACTGGAGGGAAAACAAAAAATGTCTGGCAACCCTTTGCCTTTTTAACCGT AATTAATTGACAGTTTATTTAGAGATAAGAGTTTTCAAAAATCTCTTAACTG CCACAACCCACAGAGGGTCTTGTTTTGCCATCTTCAGTGGCTCACAGATATG ATCCAAGTTAACTTGAAAGAGATGAGCAGTACCCAGGAAATTGTCCTGCCTT TAACTCTGGCTGTCCTTAATTATGACTGTTTAATGCTGAATTTTCCATCCGTC T AGTGTTTG AGGGTA AAG A A AAGCCTTTTTT A AAT AAGT ATTTCTGT A AAAC GGCATCGGTGGGATCTTCTGTGTTGCTATCACGGGTGAAAGAGGGAAACAT TT CTTATTTTTATT A AGCAG AGCATT ATTT AC'AG AAAGCC ATT GTTGAG AATT AGTTCCCACATCATATAAATATCCATTAACCATTCTAAATTGTAAGAGAACT CCAGTGTTGCTATGCACAAGGAACTCTCCTGGGGGCCTTTTTTTGCATAGCA ATTAAAGGTATGCTATTTGTCAGTAGCCATTTTTTGCAGTGATTTAAAGACC A AAGTTGTTTTACAGCTGTGTT ACCCTT AAAGGTTTTTTTTTTATGT ATT AAA TCAATTTATCACTGTTTGAAGCTTTGAATACCTGCAATCTTTGCCAAGATACT TTTTTATTT AA AAAA AT.AACT GTGT A AAT ATT ACCCTGTAATATT AT AT AT AC
TTAATAAAACATTTTAAGCTA (sec. con núm de ident.: 1)
Isoforma 1 de aminoácidos de CD47 de ratón (XP_006521873.1)
MWPLAAALLLGSCCCGSAQLLFSNVNSIEFTSCNETVVIPCIVRNVEAOSTEE MFVKWKLNKSYIFIYDGNKNSTTTDQNFTSAKISVSDLINGIASLKMDKRDA MVGNYTCEVTELSREGKTVIELKNRTAFNTDQGSACSYEEEKGGCKLVSW FSPNEKILIVIFPILAILLFWGKFGILTLKYKSSHTNKRIILLLVAGLVLTVIVVVG AILLIPGEK.PVK.NASGLGLIVISTGILILLQYNVFMTAFGMTSFTIAILITQVLGYV LALVGLCLCIMACEPVHGPLLISGLGIIALAELLGLVYMKFV£’(sec con núm de ident: 2)
Isoforma 2 de ARNm de CD47 de ratón (XM_006521811.1)
GCCTACACCGGGAGAGCAGGGAGGAGGAGTTGGAC'TGAGGTTGGGCGGCTC CGAGGTCCAGGGCGAGCTTGGCCAGAGGGAGTAGAGAGCAGCGGGGCTGC GCAGGGACGCGTGCCGTGAGTTCCGGTGAGCGTGTGTGTCCCATGCTCCCGT CTTTCAGGCCGGCCCAGGACACGAAGCCGGAAGAGAGCTGGCTGGAGGGAC GGGGGCCGTGAGCAGAGAGTGCAACCCGCGCAGCCCCGGGGACAGGCTGA TTCTTGGCGCTCTCCGCCGGAGCCTGCCCAGGGCTGGGTGTGAGGCTGGCGT CACGTCAACGAGCAGAGGCGGCCAGGCGGGGCGGAGTGCGCGTGCGCGGG GCGGCGAGCACGCGCGCGCGCGCACCCCCGGGCAGCCTGGGCGGCCGCTCC TGCCTGTCACTGCTGCGGCGCTGCTGGTCGGTCGTTTCCCTTGAAGGCAGCA GCGGAGGCGGCGGCTGCTCCAGACACCTGCGGCGGCGACCCCCCGGCGGCG CGGAGATGTGGCCCTTGGCGGCGGCGCTGTTGCTGGGCTCCTGCTGCT GCGGTTCAGCTCAACTACTGTTTAGTAACGTCAACTCCATAGAGTTCAC TTCATGCAATG.AAACTGTGGTCATCCCTTGCATCGTCCGTAATGTGGAG GCGCAAAGCACCGAAGAAATGTTTGTGAAGTGGAAGTTGAACAAATCG T AT ATTTTCATCT ATG ATGG AA AT AA A A AT AGCACT ACT AC AG ATC A A A ACTTTACCAGTGCAAAAATCTCAGTCTCAGACTTAATCAATGGCATTGC CTCTTTGAAAAI GGA rAAGCGCGATGCCA I'GGTGGGAAACTAC ACTTGC GAAGTGACAGAGTTATCCAGAGAAGGCAAAACAGTTATAGAGCTGAAA A ACCGCACGGTTTCGTGGTTTTCTCCAAATGA AA AG ATCCTC ATTGTT A TTTTCCCAATTTTGGCTATACTCCTGTTCTGGGGAAAGTTTGGTATTTTA ACACTCAAATATAAATCCAGCCATACGAATAAGAGAATCATTCTGCTGC TCGTTGCCGGGCTGGTGCTCACAGTCATCGTGGTTGTTGGAGCCATCCT TCTCATCCCAGGAGAAAAGCCCGTGAAGAATGCTTCTGGACTTGGCCTC ATTGTAATCTCTACGGGGATATTAATACTACTTCAGTACAATGTGTTTAT GACAGCTTTTGGAATGACCTCTTTCACCATTGCCATAFTGATCACTCAA GTGCTGGGCTACGTCCTTGCTTTGGTCGGGCTGTGTCTCTGCATCATGG CATGTGAGCCAGTGCACGGCCCCCTTTTGATTTCAGGTTTGGGGATCAT AGCTCTAGCAGAACTACTTGGATTAGTTTATATGAAGTTTGTCGCTTCC AACCAGAGGACTATCCAACCTCCTAGGAATAGGTGAAGGGAAGTGACGG ACTGTAACTTGGAAGTCAGAAATGGAAGAATACAGTTGTCTAAGCACCAGG TCTTCACGACTCACAGCTGGAAGGAACAGACAACAGTAACTGACTTCCATC CAGGAAAACATGTCACATAAATGATTACTAAGTTTATATTCAAAGCAGCTGT ACTTTACATAATAAAAAAAATATGATGTGCTGTGTAACCAATTGGAATCCCA TTTTTCTATTGTTTCTACTCAACTAGGGGCAAACGTTTCAGGGGCAACTTCCA AGAATGATGCTTGTTAGATCCTAGAGTCTCTGAACACTGAGTTTAAATTGAT TCCG AGT G AG ACTCGCC AAGC ACT AACCTG AGGGTT AGTT ACCC AG AGATA rrTA Tr.A a a a a p a r.Tr.r.TaTr r ar ,r a ar .r r T T ar,T a a A rTrA r.r>TTr.rrA r, C AC CTTTGCC ACTTCCGCTGCTAGC1G A ATA A C A AG ACTGCC ACTTCTGG G I C A T AGTG A T A G AG ACTG A A G T A G A A A A ACG A A TGTGGTTGGGC A A A TCCCG TGTGGCCCCTClGTGTGCTATGA-TATTGATGOCACTGGTGTCTTCATTCrTGG GGGTTGCCATCATTCACACACACCCCTTTGACATACAGTGCACCCCAGTTTT
0 A A T A C A TTT TTTTTGC A CCCTG TGCCGTTCTGCT A CTTTG ATTTGCGTTA TG A IA JA IA I AT A I 'ATATAl A A IACCTTTTC TCCl 'CTTTAA ACA IGG J CCTG I G A CACA A T A G TC A GTTG C AG A A A C G AGCC AG ACTT ATTCGCA A AG C A CTGTGC TC A A A t ’TCTTC AG A A A A A A AGC i A A A A A A A A A A A A AGCT AT AGTTGT A AC AT A IGTATTCCAGACCTCTGGT r IA A AG GC A A A AG A A A A A A A ATCT AC A GlGT TTCTTCTCATGTTTrCTGATCGGAGGCATGACAAAGCAAGACTGAAATCTGA AjCTGTGTCTCCTGCATGGCAACACGTGTCTCCGTCAGGOCCTCGCAAGGCCC G GGG AGGGGGTTCTAC GCCTCTT GTC TCTT TGTTGCATGCTGAACA C TCATC GCCTTCCT A CTGTATCCT GCCTCCTGCAG C C TCCCT C TTCC T C C TCCTCT TCC T
c t t c c t c c t c t t c c t c c t c c t c c t c c t c t t c c t c c a a g t t t g AAAGGTCA A AC AAAACTACCACATTCC C TACCC AGTTAGAAGAAAACCACCG TCCTGACAGTT GTGATCGC AT GG AGT ACTTTT AGATT ATT AGCACCTGTTTTTACCTCGTTTGT GGGCGTGTTTGTATGTGCACATGTATGAAGTOGGCACATGCACXTTCrGTAT GG GC AG AG GC G TGGC ATC T A C AG AAG AGCAG ATGCC A ACT I TGTGCTTT T A GTGAATACAT TAAAAAAAAAAAAC CAACGGTCCTTATTGAG TGGAATTC TA TTTGAI GCAAAI ATT I GAGCTC J l l AAGACTTTAAAACI AGATAATGTGCCA AGCTTTT A GG ACTGC TC ACC AGT GC C CTCT G A AG A A AC ACC AGT ACTTT TTC CTGTT TG TG T AAT AAAGG C AT ATTTGT ATTTGT GTTT GCAT C ACT AAT GGTTA
Tt t c t TCTTAGTCC ACTG A ATGTTTCC ATGTGC CT CTCG T ATC CC A A ACTTTT TGTC ATCTTTC ATGTC GGG A CC A A ATGGTTTGTC TGTG GCAAA CCTA A A CCT ATGACCTGCTG AGGCCTCTCAG A A A ACTQACC ACAG T ACC A AC IATAGTACT TCGCAAAG AAAAGTAGG r i CCCTCCCTCGTTTTG I AÜCI GTCGCCAATATTA GCGTAATTCCAAGG AGCTGAACGCCTTT AT AT AAATCTG ATGGCACCTG ATG CTTTTAGTTC T í! A A A AT ATTT AC ACTGC K ¡ ATC ATC! TTGTTG ATG ACTT A A AC A AAGTTTTGATG AAG AG AGC AAAAAAAAAG C AGGTGGATTTG GAACAGTTT C AGGGTTTTTTTTGTTTTTTGTTTTTTGTTTTTGTTTTTTTTTTTTTATTTTTGTTT
1 l'C IG [ I C TC TG T I7U j A \ A A i , l i AC r(.. I (.-TIC l'C'T G'l CAGGC'Í Al C I l'TAT AGT CAATTTTTTTTA CG A ACT A A AGT AG T ACCTTTT A AT ATGT AGTCAACGCCCCT CTGCTC GGGGTTC AGTTTTGGC TC TT A ACC AGCTGTC ATGTTCTCT ATGC TGC CTGCCACTIGAGGCACTGAGTGCCCTAGACAGTCCCATCGGTGGTAGCCAG GG A AACGA A AG ACG A A C TC A ACTCTTGCTCCT A A T A A TC A ACTCTCTGT ATG A AGG ATGGC AGC ATT A AG AGTCCTCCTGCCTGGGC A TT ATTGGGCC AGTTC A CCCTCT ri'AAATCAAACCCGCAGTGGCTCCCAGTTCTCGTCCCATCAGATT I A A A TTGCT A A C A GT A TGGGGGGC A CC ACGC ATCTGTT TTGTCCCACAA TGCG CTTTTC TCTCCC A A A TCCCG A TTTCTGCTCiTC A T AGCCTCT ATTC A ATTTTT AT TT ATTGTCTGCCCTCC ACTT AT AC A ATCGT AG AG AGC A A TGCC A TT TG TC A CT TTCTGC A AC AGTTTT TTGAGCC TTT ATGGCTG A A TCCC ATTTTTCTTCTCTTTC AAACT O ír rOCTC CA TTG CTCCT C C C G CACGG CTGT C CGTAC AGT CATCCCAT CC ATCTGGGGGCCTCTTTCATC TCTCACCCTTCCTGGTGCTTC GTGGATC TCT
C iC:TT ACCTCTGTGC ;GTTTTTTTTTTTTTTTTTG ACTT A TTC ’TTCTC AC ’TGGACT TT A AG ATT ACTTCC AC A G CG A A AGTG CTG CCTCCCTTTTCTGCCCGC AGTGTT CTGCGTACTTTAGATACTACTCAGTGCTGACATTTGATGGCAAAAGTTGCCT GCACTTAAATTTCTCTTTTTAATAjGGGTGAACT AGAGTTGGAjGTTTTTTTCTC TTTTTTCTCTTTTCTCTCTCT CTCT ClCTCTCT CTCTCT CTCTCT CTCTCT CTCT CCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCTCTCTCTCTTTTTCTTTCTTTC TTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTTTTTGACAAATCT CACAGGCTTTGAGAATTATAAAAGGTGACAGTTCACCTGAAAATC'ACAGGT CTGGTCT GTTTAAATT GTT GAG AAAT ATCCGATT AAAAGTCTTGTGGCT GT G TCCTAATAGGCTCTCTTTCAGGACGTTGTAGTCAATAGAGTGGCTGAACCAT ACTTGAGTTTATAAAGCTCAAAAACTGATGCACCCACTCTGCTATTATCGTG TTAGTAAGAGTTCAGCTGTATATCATTGTCTAGGTTTATCTTGTCCTACAGTG GGT ATT CAAAT ATGGCC ACC AG AGG AT ATGTGT AAATATAAGC ACCT GT ATT TGCCTGTTGTTGAGAACTGGAGGGAAAACAAAAAATGTCTGGCAACCCTTT GCCTTTTT AACCGTAATTAATTGAC AGTTT ATTT AG AG AT A AG AGTTTTCAA AAATCTCTTAACTGCCACAACCCACAGAGGGTCTTGTTTTGCCATCTTCAGT GGCTCACAGATATGATCCAAGTTAACTTGAAAGAGATGAGCAGTACCCAGG AAATTGTCCTGCCTTTAACTCTGGCTGTCCTTAATTATGACTGTTTAATGCTG A ATTTTCC ATCCGTCTAGTGTTTGAGGGTA AAGAAAAGCCTTTTTT AAAT AA GTATTTCTGTAAAACGGCATCGGTGGGATCTTCTGTGTTGCTATCACGGGTG AAAGAGGGAAACATTTCTTATTTTTATTAAGCAGAGCATTATTTACAGAAAG CCATTGTTGAGAATTAGTTCCCACATCATATAAATATCCATTAACCATTCTA AATTGTAAGAGAAC'TCCAGTGTTGCTATGCACAAGGAACTCTCCTGGGGGC CTTTTTTTGCAT AGC A ATT A AAGGT ATGCT ATTTGTCAGT AGCCATTTTTTGC AGTGATTTAAAGACCAAAGTTGTTTTACAGCTGTGTTACCCTTAAAGGTTTT TTTTTT ATGT ATT A A ATCAATTT ATCACTGTTTGA AGCTTTGA ATACCTGCA A TCTTTGCC A AG AT ACTTTTTT ATTT A A A A AAAT A AC’TGTGT A A ATATT AC'CCT GT AAT ATT AT AT AT ACTT AAT AAAAC ATTTT AAGCT A (sec. con núm de ident.: 3)
Isoforma 2 de aminoácidos de CD47 de ratón (XP_006521874.1)
MWPLAAALLLGSCCCGSAOLLFSNVNSIEFTSCMETVVTPCIVRNVEAOSTEE MFVKWKLNKSYIFIYDGNKNSTTTDQNFTSAKISVSDLINGIASLKMDKRDA MVGNYTCEVTELSREGKTVTELKNRTVSWFSPNEKILIVIFPILAILLFWGKFG ILTLKYKSSHTNK.RIILLLVAGLVLTVIVVVGAILLIPGEK.PVK.NASGLGLIVISTG ILILLQYNVFMTAFGMTSFTIAILITQVLGYVLALVGLCLCIMACEPVHGPLLISG LGllALAELLGLVYMKÍV/l5Aí?/?r/{?mW/?(sec. con núm de ident.: 4)
Isoforma 3 de ARNm de CD47 de ratón (XM_006521807.1)
GCCTACACCGGGAGAGCAGGGAGGAGGAGTTGGACTGAGGTTGGGCGGCTC CGAGGTCCAGGGCGAGCTTGGCCAGAGGGAGTAGAGAGCAGCGGGGC’TGC GCAGGGACGCGTGCCGTGAGTTCCGGTGAGCGTGTGTGTCCCATGCTCCCGT CTTTCAGGCCGGCCCAGGACACGAAGCCGGAAGAGAGCTGGCTGGAGGGAC GGGGGCCGTGAGCAGAGAGTGCAACCCGCGCAGCCCCGGGGACAGGCTGA TTCTTGGCGCTCTCCGCCGGAGCCTGCCCAGGGCTGGGTGTGAGGCTGGCGT CACGTCAACGAGCAGAGGCGGCCAGGCGGGGCGGAGTGCGCGTGCGCGGG GCGGCGAGCACGCGCGCGCGCGCACCCCCGGGCAGCCTGGGCGGCCGCTCC TGCCTGTCACTGCTGCGGCGCTGCTGGTCGGTCGTTTCCCTTGAAGGCAGCA GCGGAGGCGGCGGCTGCTCCAGACACCTGCGGCGGCGACCCCCCGGCGGCG CGGAGATGTGGCCCTTGGCGGCGGCGCTGTTGCTGGGCTCCTGCTGCT GCGGTTCAGCTCAACTACTGTTTAGTAACGTCAACTCCATAGAGTTCAC TTCATGCAATGAAACTGTGGTCATCCCTTGCATCGTCCGTAATGTGGAG GCGCAAAGCACCGAAGAAATGTTTGTGAAGTGGAAGTTGAACAAATCG TATATTTTCATCTATGATGGAAATAAAAATAGCACTACTACAGATCAAA ACTTTACCAGTGCAAAAATCTCAGTCTCAGACTTAATCAATGGCATTGC CTCTTTGAAAATGGATAAGCGCGATGCCATGGTGGGAAACTACACTTGC GAAGTGACAGAGTTATCCAGAGAAGGCAAAACAGTTATAGAGCTGAAA AACCGCACGGCCTTCAACACTGACCAAGGATCAGCCTGTTCTTACGAGG AGGAGAAAGGAGGTTGCAAATTAGTTTCGTGGTTTTCTCCAAATGAAAA GATCCTC ATTGTT ATTTTCCC AATTTTGGCT AT ACTCCTGTTCTGGGG AA
a g t t t g g t a t t t t a a c a c t c a a a t a t a a a t c c a g c c a t a c g a a t a a g a g AATCATTCTGCTGCTCGTTGCCGGGCTGGTGCTCACAGTCATCGTGGTT GTTGGAGCCATCCTTCTCATCCCAGGAGAAAAGCCCGTGAAGAATGCTT CTGGACTTGGCCTC ATTGT A ATCTCT ACGGGG AT ATT A AT ACTACTTC A GTACAATGTGTTTATGACAGCTTTTGGAATGACCTCTTTCACCATTGCC ATATTGATCACTCAAGTGCTGGGCTACGTCCTTGCTTTGGTCGGGCTGT GTCTCTGCATCATGGCATGTGAGCCAGTGCACGGCCCCCTTTTGATTTC AGGTTTGCGGATCATAGCTCTAGCAGAACTACTTCCATTAGTTTATATG AAGTTTGTCGCTTCCAACCAGAGGACTATCCAACCTCCTAGGAAAGCTG TAGAGGAACCCCTTAACGAATAGGTGAAGGGAAGTGACGGACTGTAACTT GG AAGTC AG AAATGG AAG AAT AC AGTT GT CT AAGC ACC AGGT CTTC ACG AC TCACAGCTGGAAGGAACAGACAACAGTAACTGACTTCCATCCAGGAAAACA TGTCACATAAATGATTACTAAGTTTATATTCAAAGCAGCTGTACTTTACATA ATAAAAAAAA rATGATGTGCTGTGTAACCAATTGGAATCCCATnTrC'TATT GTTTCTACTCAACTAGGGGCAAACGTTTCAGGGGCAACTTCCAAGAATGATG CTTGTT AGATCCT AG AGTCTCTGA AC ACTG AGTTT A A ATTG ATTCCGAGTG A G ACT CGC C AAGC ACT AACCTG AGGGTT AGTT ACCC AG AG AT ACCT AT G A AA AACAGTGGTATCCAGCAAGCCTTAGTAAACTCAGGTTGCCAGCAGCTTTGCC ACTTCCGCTGCT AGCTG AATAAC AAG ACT GCC ACTTCT GGGT C ATAGTG AT A GAGACTGAAGTAGAAAAACGAATGTGGTTGGGCAAATCCC'GTGTGGCCCCT CTGTGTGCTATGATATTGATGGCACTGGTGTCTTCATTCTTGGGGGTTGCCAT CATTCACACACACCCCTTTGACATACAGTGCACCCCAGTTTTGAATACATTT TTTTTGCACCCTGTCCCGTTCTGCTACTTTGATTTGCGTTATGATATATATAT ATATATATAATACCTTTTCTCCTCTTTAAACATGGTCCTGTGACACAATAGTC AGTTGCAGAAAGGAGCCAGACTTATTCGCAAAGCACTGTGCTCAAACTCTTC AGAAAAAAAGGAAAAAAAAAAAAAGCTATAGTTGTAACATATGTATTCCAG ACCTCTGGTTTAAAGGCAAAAGAAAAAAAATCTACAGTGTTTCTTCTCATGT TTTCTGATCGGAGGCATGACAAAGCAAGACTGAAATCTGAACTGTGTCTCCT GCATGGCAACACGTGTCTCCGTCAGGCCCTCGCAAGGCCCGGGGAGGGGGT TCTACGCCTCTTGTCTCTTTGTTGCATGCTGAACACTCATCGC’CTTCCTACTG TATCCTGCCTCCTGCAGCCTCCCTCTTCCTCCTCCTCTTCCTCTTCCTCCTCTT CCTCCTCCTCCTCCTCTTCCTCCAAGTTTGAAAGGTCAAACAAAACTACCAC ATTCCCTACCCAGTTAGAAGAAAACCACCGTCCTGACAGTTGTGATCGCATG GAGTACTTTTAGATTATTAGCACCTGTTTTTACCTCGTTTGTGGGCGTGTTTG TATGTGCACATGTATGAAGTCGGCACATGCACCTTCTGTATGGGCAGAGGCG TGGCATCTACAGAAGAGCAGATGCCAACTTTGTGCTTTTAGTGAATACATTA AAAAAAAAAAACCAAGGGTCC r IA 1TGAGTGGAATICIA11 I GATGC’AAA I ATTTGAGCTCTTTAAGACTTTAAAACTAGATAATGTGCCAAGCTTTTAGGAC TGCTCACCAGTGCCCTCTGAAGAAACACCAGTACTTTTTCCTGTTTGTGTAAT AAAGGCATATTTGTATTTGTGTTTGCATCACTAATGGTTATTTCTTCTTAGTC CACTGAATGTTTCCATGTGCCTCTCGTATGCCAAACTTTTTGTCATCTTTCAT GTGGGGACCAAATGGTTTGTCTGTGGCAAACCTAAACCTATGACCTGCTGAG GCCTCTCAGAAAACTGACCACAGTACCAAGATAGTACTTCGCAAAGAAAAG TAGGTTCCCTCCCTGGTTTTGTAGCTGTCGCCAATATTAGCGTAATTCCAAG GAGCTGAACGCCTTTATATAAATCTGATGGCACCTGATGCTTTTAGTTCTGA AAATATTTACACTCGGATCATGTTGTTGATGACTTAAACAAAGTTTTGATGA AGAGAGCAAAAAAAAAGCAGGTGGATTTGGAACAGTTTCAGGGTTTTTTTT GTTTTTT GTTTTTT GTTTTT GTTTTTTTTTTTTT ATTTTTGTTTTTCTGTTCTCT G TT AG A A A AGT C AGGT GTT CTCT GTC AGGCT AT CTTT AT AGT C A ATTTTTTTT A CG AACT A A AGT AGT ACCTTTT A AT AT GT AGT C A ACGCCCCT CTGCTCGGGGT TCAGTTTTGGGTCTTAACCAGCTGTCATGTTCTCTATGCTGCCTGCCACTTGA GGCACTGAGTGCCCTAGACAGTCCCATCGGTGGTAGCCAGGGAAACGAAAG ACÜAACTC AAC1C TI ÜCTCCTAATAATCAACTCTC TGTATÜ AAÜG ATÜÜCAÜ CATTAAGAGTCCTCCTGCCTGGGCATTATTGGGCCAGTTCACCCTCTTTAAA TCAAACCCGCAGTGGCTCCCAGTTCTCGTCCCATCAGATTTAAATTGCTAAC AGTATGGGGGGCACCACGCATCTGTTTTGTCCCACAATGCGCTTTTCTCTCC CAAATCCCGATTTCTGCTGTCATAGCCTCTATTCAATTTTTATTTATTGTCTG CCCTCCACTTATACAATCGTAGAGAGCAATGCCATTTGTCACTTTCTGCAAC AGTTTTTTGAGCCTTTATGGCTGAATCCCATTTTTCTTCTCTTTCAAACTGTTT GCTCCATTGCTCCTCCCGC’ACGGCTGTCCGTACAGTCATCCCATCCATCTGG GGGCCTCTTTCATCTCTCACCCTTCCTGGTGCTTCGTGGATCTCTGCTTACCT CT GT GGGTTTTTTTTTTTTTTTTT G ACTT ATTCTT CTC ACT GG ACTTT AAG ATT ACTTCCACAGCGAAAGTGCTGCCTCCCTTTTCTGCCCGCAGTGTTCTGCGTA CTTTAGATACTACTCAGTGCTGACATTTGATGGCAAAAGTTGCCTGCACTTA AATTTCTCTTTTTAATAGGGTGAACTAGAGTTGGAGTTTTTTTCTCTTTTTTCT CTTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTCCCT CCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCTCTCTCTCTTTTTCTTTCTTTCTTTCTTTC TTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTTTTTGACAAATCTCACAGOC TTTGAGAATTATAAAAGGTGACAGTTCACCTGAAAATCACAGGTCTGGTCTG TTT AA ATTGTTG AGA AAT ATCCGATT AA A AGTCTTGTGGCT GTGTCCT AAT A GGCTCTCTTTCAGGACGTTGTAGTCAATAGAGTGGCTGAACCATACTTGAGT TTATAAAGCTCAAAAACTGATGCACCCACTCTGCTATTATCGTGTTAGTAAG AGTTCAGCTGTATATCATTGTCTAGGTTTATCTTGTCCTACAGTGGGTATTCA AATATGGCCACCAGAGGATATGTGTAAATATAAGCACCTGTATTTGCCTGTT GTTGAGAACTGGAGGGAAAACAAAAAATGTCTGGCAACCCTTTGCCTTTTTA ACCGTAATTAATTGACAGTTTATTTAGAGATAAGAGTTTTCAAAAATCTCTT AACTGCCACAACCCACAGAGGGTCTTGTTTTGCCATCTTCAGTGGCTCACAG ATATGATCCAAGTTAACTTGAAAGAGATGAGCAGTACCCAGGAAATTGTCC TGCCTTTAACTCTGGCTGTCCTTAATTATGACTGTTTAATGCTGAATTTTCCA TCCGTCTAGTGTTTGAGGGTAAAGAAAAGCCTTTTTTAAATAAGTATTTCTG TAAAAC’GGCATCGGTGGGATCTTCTGTGTTGCTATCACGGGTGAAAGAGGG A AAC ATTTCTT ATTTTT ATT A AGC AG AGC ATT ATTT AC AG A A AGCC ATTGTT GAGAATTAGTTCCCACATCATATAAATATCCATTAACCATTCTAAATTGTAA GAGAACTCCAGTGTTGCTATGCACAAGGAACTCTCCTGGGGGCCTTTTTTTG CATAGCAATTAAAGGTATGCTATTTGTCAGTAGCCATTTTTTGCAGTGATTT AAAGACCAAAGTTGTTTTACAGCTGTGTTACCCTTAAAGGTTTTTTTTTTATG TATTAAATCAATTTATCACTGTTTGAAGCTTTGAATACCTGCAATCTTTGCCA AG AT ACTTTTTT ATTT A AA AA A AT A ACTGTGT A A ATATT ACCCTGT A ATATTA T AT AT ACTT AAT A A AAC ATTTT AAGCTA(sec. con núm de ident.: 5)
Isoforma 3 de aminoácidos de CD47 de ratón (XP_006521870.1) MWPLAAALLLGSCCCGSAOLLFSINVNSIEFTSCNETVVIPCIVRMVEAOSTEE M FVkVVkLNkSYlFlYDGNkNSTTTDQNFTSAklSVSDLlNGlASLkM DkRDA M VGNYTCEVTELSREGRTVlELRNRTAFNTDQGSACSYEEERGGCkLVSW FSPNEkILIViFPILAILLFW GKFGILTLKYKSSHTNKRIlLLLVAGLVLTVIVVVG AILL1PGEKPVKNASGLGL1V1STG1LILLQYNVFMTAFGMTSFTIA1LITQVLGYV LALVGLCLCIM ACEPVHGPLLISGLGIlALAELLGLVYM KFV^V0fl770/>/W C4F EEPLNEc(sec. con núm de ident.: 6)
Isoforma 4 de ARNm de CD47 de ratón (XM 006521808.1)
GCCT AC ACCGGG AG AGC AGGG AGG AGG AGTTGG ACT G AGGTTGGGCGGCTC CGAGGTCCAGGGCGAGCTTGGCCAGAGGGAGTAGAGAGCAGCGGGGCTGC GCAGGGACGCGTGCCGTGAGTTCCGGTGAGCGTGTGTGTCCCA1GCTCCCGT CTTTCAGGCCGGCCCAGGACACGAAGCCGGAAGAGAGCTGGCTGGAGGGAC GGGGGCCGTGAGCAGAGAGTGCAACCCGCGCAGCCCCGGGGACAGGCTGA TTCTTGGCGCTCTCCGCCGGAGCCTGCCCAGGGCTGGGTGTGAGGCTGGCGT CACGTCAACGAGCAGAGGCGGCCAGGCGGGGCGGAGTGCGCGTGCGCGGG GCGGCGAGCACGCGCGCGCGCGCACCCCCGGGCAGCCTGGGCGGCCGCTCC TGCCTGTCACTGCTGCGGCGCTGCTGGTCGGTCGTTTCCCTTGAAGGCAGCA GCGGAGGCGGCGGCTGCTCCAGACACCTGCGGCGGCGACCCCCCGGCGGCG CGGAGATGTGGCCCTTGGCGGCGGCGCTGTTGCTGGGCTCCTGCTGCT GCGG I'IC AGC TCAAC I’ACTG m AG IAACGTC AACTCCAIAGAG n C A C TTCATGCAATGAAACTGTGGTCATCCCTTGCATCGTCCGTAATGTGGAG GCGCAAAGCACCGAAGAAATGTTTGTGAAGTGGAAGTTGAACAAATCG TATATTTTCATCTATGATGGAAATAAAAATAGCACTACTACAGATCAAA ACTTTACCAGTGCAAAAATCTCAGTCTCAGACTTAATCAATGGCATTGC CTCTTTGAAAATGGATAAGCGCGATGCCATGGTGGGAAACTACACTTGC GAAGTGACAGAGTTATCCAGAGAAGGCAAAACAGTTATAGAGCTGAAA AACCGCACGGTTTCGTGGTTTTCTCCAAATGAAAAGATCCTCATTGTTA TTTTCCCAATTTTGGCTATACTCCTGTTCTGGGGAAAGTTTGGTATTTTA AC ACTCAAATATAAATC C AGC’C AT AC G AAT.AAG AG AAT C ATT C’ T GC’T GC TCGTTGCCGGGCTGGTGCTCACAGTCATCGTGGTTGTTGGAGCCATCCT TCTCATCCCAGGAGAAAAGCCCGTGAAGAATGCTTCTGGACTTGGCCTC ATTGTAATCTCTACGGGGATATTAATACTACTTCAGTACAATGTGTTTAT GACAGCTTTTGGAATGACCTCTTTCACCATTGCCATATTGATCACTCAA GTGCTGGGCTACGTCCTTGCTTTGGTCGGGCTGTGTCTCTGCATCATGG CATGTGAGCCAGIGCACGGCCCCC TITTGATTTCAGGTTTGGGGATCAT AGCTCTAGCAGAACTACTTGGATTAGTTTATATGAAGTTTGTCGCTTCC AACC AG AGG ACTATCC AACC TC CTAGG AAAGCTGTAGAGG A ACCCCTTA
a c g c a t t t a a a g a g t c a a a a g g a a t g a t g a a t g a c g a a t a g g t g a a g g g AAGTGACGGACTGTAACTTGGAAGTCAGAAATGGAAGAATACAGTTGTCTA AGCACCAGGTCTTCACGACTCACAGCTGGAAGGAACAGACAACAGTAACTG ACTTCC ATCC AGG AAAAC ATGTCAC AT AAAT G ATT ACT AAGTTTATATTC AA AGCAGCTGTACTTTACATAATAAAAAAAATATGATGTGCTGTGTAACCAATT GGAATCCCATTTTTCTATTGTTTCTACTCAACTAGGGGCAAACGTTTCAGGG GCAACTTCCAAGAATGATGCTTGTTAGATCCTAGAGTCTCTGAACACTGAGT TTAAATTGATTCCGAGTGAGACTCGCCAAGCACTAACCTGAGGGTTAGTTAC CCAGAGATACCTATGAAAAACAGTGGTATCCAGCAAGCCTTAGTAAACTCA GGTTGCCAGCAGCTTTGCCACTTCCGCTGCTAGCTGAATAACAAGACTGCCA CTTCTGGGTCATAGTGAT AGAGACTGAAGT AGAAAAACGAATGTGGTTGGG CAAATCCCGTGTGGCCCCTCTGTGTGCTATGATATTGATGGC'ACTGGTGTCT TCATTCTTGGGGGTTGCCATCATTCACACACACCCCTTTGACATACAGTGCA CCCCAGTTTTGAATACATTTTTTTTGCACCCTGTCCCGTTCTGCTACTTTGATT TGCGTTATGATATATATATATATATATAATACCTTTTCTCCTCTTTAAACATG GTCCTGTGACACAATAGTCAGTTGCAGAAAGGAGCCAGACTTATTCGCAAA GCACTGTGCTCAAACTCTTCAGAAAAAAAGGAAAAAAAAAAAAAGCTATAG TTGTAACATATGTATTCCAGACCTCTGGTTTAAAGGCAAAAGAAAAAAAAT CTACAGTGTTTCTTCTCATGTTTTCTGATCGGAGGCATGACAAAGCAAGACT GAAATCTGAACTGTGTCTCCTGCATGGCAACACGTGTCTCCGTCAGGCCCTC GCAAGGCCCGGGGAGGGGGTTCTACGCCTCTTGTCTCTTTGTTGCATGCTGA ACACTCATCGCCTTCCTACTGTATCCTGCCTCCTGCAGCCTCCCTCTTCCTCC TCCTCTTCCTCTTCCTCCTCTTCCTCCTCCTCCTCCTCTTCCTCCAAGTTTGAA AGGTC AAAC AAA ACT AC C AC ATTCCCT ACCCAGTT AG AAG A AAACC ACCGT CCT G AC AGTTGTG ATCGC ATGG AGT ACTTTT AG ATTATT AGC ACCTGTTTTT A CCTCGTTTGTGGGCGTGTTTGTATGTGCACATGTATGAAGTCGGCACATGCA CCTTCTGTATGGGCAGAGGCGTGGCATCTACAGAAGAGCAGATGCCAACTT TGTGCTTTT AGT GA AT AC ATT AAA AAA AAA AAACCAACGGTCCTT ATTGAGT GGAATTCTATTTGATGCAAATATTTGAGCTCTTTAAGACTTTAAAACTAGAT AATGTGCCAAGCTTTTAGGACTGCTCACCAGTGCCCTCTCiA AGAAACACCAG T ACTTTTTCCTGTTTGTGT AATA A AGGCAT ATTTGT ATTTGTGTTTGCATCAC TAATGGTTATTTCTTCTTAGTCCACTGAATGTTTCCATGTGCCTCTCGTATGC CAA ACTTTTTGTC ATCTTTC ATGTGGGGACCA AATGGTTTGTCTGTGGC AAA CCTAAACCTATOACCTGCTCAOGCCTCTCAOAAAACTGACCACAOTACCAA GATAGTACTTCGCAAAGAAAAGTAGGTTCCCTCCCTGGTTTTGTAGCTGTCG CCAATATTAGCGTAATTCCAAGGAGCTGAACGCCTTTATATAAATCTGATGG CACCTGATGCTTTTAGTTCTGAAAATATTTACACTCGGATCATGTTGTTGATG ACTTAAACAAAGTTTTGATGAAGAGAGCAAAAAAAAAGCAGGTGGATTTGG AAC AGTTTCAGGGTTTTTTTT GTTTTTT GTTTTTTGTTTTT GTTTTTTTTTTTTT ATTTTTGTTTTTCTGTTCTCTGIIAG AAAAG1CA GG IG1TCTCTG I'CAGGCTA TCTTTAT AGTCAATTTTTTTTACG AACTAAAGT AGT ACCTTTTAAT ATGT AGT CAACGCCCCTCTGCTCGGGGTTCAGTTTTGGGTCTTAACCAGCTGTCATGTTC TCTATGCTGCCTGCCAC TI GAGGCACTGAGTGCCCTAG ACAGTCCCATCGGT GGTAGCCAGGGAAACGAAAGACGAACTCAACTCTTGCTCCTAATAATCAAC TCTCTGTATGAAGGATGGCAGCATTAAGAGTCCTCCTGCCTGGGCATTATTG GGCCAGTTCACCCTCTTTAAATCAAACCCGCAGTGGCTCCCAGTTCTCGTCC CATCAGATTTAAATTGCTAACAGTATGGGGGGCACCACGCATCTGTTTTGTC CCACAATGCGCTTTTCTCTCCCAAATCCCGATTTCTGCTGTCATAGCCTCTAT TCAATTTTTATTTATTGTCTGCCCTCCACTTATACAATCGTAGAGAGCAATGC CATTTGTCACTTTCTGCAACAGTTTTTTGAGCCTTTATGGCTGAATCCCATTT TT CTT C'TCTTT C A A ACTGTTT GC'T CC ATT GC’T CC’TCCCGC ACGGCT GT C'CGT A CAGTCATCCCATCCATCTGGGGGCCTCTTTCATCTCTCACCCTTCCTGGTGCT TCGTGGATCTCTGCTTACCTCTGTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTGACTTATTCTT CTCACTGGACTTTAAGATTACTTCCACAGCGAAAGTGCTGCCTCCCTTTTCTG CCCGCAGTGTTCTGCGT ACTTT AG ATACT ACTCAGTGCT GAC ATTTGATGGC AAA í\GTTGCCT GC ACTTAAATTT CTCTTTTTA ATAGGGTG AACT AG AGTT GG AGTTTTTTTCTCTTTTTTCTCTTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT CTCTCTCTCTCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCTCTCTCTCT TTTT CTTT CTTTCTTTCTTTCTTT CTTTC TTTCTTTCTTT CTTT CTTT CTTTCTTTT TTTGACAAATCTCACAGGCTTTGAGAATTATAAAAGGTGACAGTTC'ACCTGA AAATCACAGGTCTGGTCTGTTTAAATTGTTGAGAAATATCCGATTAAAAGTC TTGTGGCTGTGTCCTAATAGGCTCTCTTTCAGGACGTTGTAGTCAATAGAGT GGCT G AACCAT ACTT G AGTTT AT AA AGC’T C AAAAACTG AT GC ACCC ACTCT G CTATTATCGTGTTAGTAAGAGTTCAGCTGTATATCATTGTCTAGGTTTATCTT GTCCTACAGTGGGTATTCAAATATGGCCACCAGAGGATATGTGTAA ATATA AGCACCTGTATTTGCCTGTTGTTGAGAACTGGAGGGAAAACAAAAAATGTC TGGCAACCCTTTGCCTTTTTAACCGTAATTAATTGACAGTTTATTTAGAGATA AGAGTTTTCAAAAATCTCTTAACTGCCACAACCCACAGAGGGTCTTGTTTTG CCATCTTCAGTGGCTCACAGATATGATCCAAGTTAACTTGAAAGAGATGAGC AGTACCC AGGA A ATTGTCCT GCCTTT AACTCTGGCTGTCCTTA ATT ATGACT GTTTAATGCTGAATTTTCCATCCGTCTAGTGTTTGAGGGTAAAGAAAAGCCT TTTTTAAATAAGTATTTCTGTAAAACGGCATCGGTGGGATCTTCTGTGTTGCT ATCACGGGTGAAAGAGGGAAACATTTCTTATTTTTATTAAGCAGAGCATTAT TTACAGAAAGCCATTGTTGAGAATTAGTTCCCACATCATATAAATATCCATT AACCATTCTAAATTGTAAGAGAACTCCAGTGTTGCTATGCACAAGGAACTCT CCTGGGGGCCTTTTTTTGCATAGCAATTAAAGGTATGCTATTTGTCAGTAGC CATTTTTTGCAGTGATTTAAAGACCAAAGTTGTTTTACAGCTGTGTTACCCTT AAAGGTTTTTTTTTTATGTATTAAATCAATTTATCACTGTTTGAAGCTTTGAA TACCTGCAATCTTTGCCAAGATACTTTTTTATTTAAAAAAATAACTGTGTAA ATATTACC'CTGT A ATATT ATATAT ACTT A ATA A A AC'ATTTT A AGC'TA (sec. con núm de ident.: 7)
Isoforma 4 de aminoácidos de CD47 de ratón (XP_006521871.1)
MWPLAAALLLGSCCCGSAOEEFSNVNSIEFTSCNETVVTPCIVR'NVEAOSTEE MFVKWKLNKSYIFIYDGNKNSTTTDQNFTSAKISVSDLINGIASLKMDKRDA MVGNYTCEVTELSREGKTV1ELKNRTVSWFSP.NEK1L1V1FPILA1LLFWGKFG ILTLKYK.SSHTNKRIILLLVAGLVLTVIVVVGAILLIPGEKPVKNASGLGLIVISTG ILILLQYNVFMTAFGMTSFTIAILITQVLGYVLALVGLCLCIMACEPVHGPLLISG LGII AL A EL LG L V YM K.FW ASNQR TIQPPRKA VEEPL NA FK ESKGMMNDE (sec. con núm de ident.: 8)
Isoforma 1 de ARNm de CD47 humano (XM 005247909.1)
AGTGGGAGCGCGCGTGCGCGCGGCCGTGCAGCCTGGGCAGTGGGTCCTGCC TGTGACGCGCGGCGGCGGTCGGTCCTGCCTGTAACGGCGGCGGCGGCTGCT GCTCCGGACACCTGCGGCGGCGGCGGCGACCCCGCGGCGGGCGCGGAGAT GTGGCCCCTGGTAGCGGCGCTGTTGCTGGGCTCGGCGTGCTGCGGATC
a g c .tc a g c t a c .ta t t t a a t a a a a c a a a a t c t g t a g a a t t c a c g t t t t g t a ATG AC AC TGTCGTC ATTC C ATGCTTTGTTAC TAATATGG AGGC AC A AAA CAC'TAC'TCíAACíTATAC'CíTAAACtTCKíAAATTTAAACtCíAACíACíATA’ITTAC' ACCTTTGATGGAGCTCTAAACAAGTCCACTGTCCCCACTGACTTTAGTA
CiTGCAAAAATTGAAGTC TCAC AATTAC TAAAAGGAGATGC C TC TTTGAA (iATti(iATAA(iA(iTCiAT(iC’T(iTCTC'ACACAC’A(iCiAAAC'TACAC'TTCiT(iAA CTAACAGAATTAACCAGAGAAGGTGAAACGATCATCGAGCTAAAATATC GTGTTGTTTC ATGGTTTTCTCCAAATGAAAAT ATTCTTATTGTT ATTTTC CC.AA TTTTTG C TA IAC TCCTG F IC TGGGGAC A G T T IGG 1ATTAAAACAC t t a a a t a t a g a t c c g g t g g t a t g g a t g a g a a a a c a a t t g c t t t a c t t g t TGCTGGACTAGTGATCACTGTCATTGTCATTGTTGGAGCCATTCTTTTC GTCCCAGGTGAATATTCATTAAAGAATGCTACTGGCCTTGGTTTAATTG TGACTTCTACAGGGATATTAATATTACTTCACTACTATGTGTTTAGTACA GCGATTGGATTAACCTCCTTCGTCATTGCCATATTGGTTATTCAGGTGA TA G C C T A T A T f ' f TC G C TG TG G TTG G AC 'TG AG TC TC TG T VTTGCGGCGTG TATACCAATGCATGGCCCTCTTCTGATTTCAGGTTTGAGTATCTTAGCT CTAGCACAATTACTTGGACTAGTTTATATGAAATTTGTGGAATAACTGAA GTGAAGTGATGGArTrCGATTTGGAGAGTAGTAAGAC'GTGAAAGGAATAC'A CTTGTGTTTAAGCACCATGGCC'TTGATGATTC'ACTGTTGGGGAGAAGAAAC'A AG AAAAGT AACTGGTT GTC ACCT AT G AG ACCCTT ACGTGATTGTT AGTT AAG TTTTTATTCAAAGCAGCTGTAATTTAGTTAATAAAATAATTATGATCTATGTT GTTTGCCCAATTGAGATCCAGTTTTTTGTTGTTATTTTTAATCAATTAGGGGC AATAGTAGAATGGACAATTTCCAAGAATGATGCCTTTCAGGTCCTAGGGCCT CTGGCCTCT AGGT A ACC AGTTT AAATT GGTT C AGGGTG AT AACT ACTT AGC A CTGCCCTC.GTGATTACCCAGAGATATCTATC.AAAACCAGTGGCTTCCATCAA ACCTTTGCCAACTCAGGTTCACAGCAGCTTTGGGCAGTTATGGCAGTATGGC ATTAGCTGAGAGGTGTCTGCCACTTCTGGGTCAATGGAATAATAAATTAAGT ACAGGCAGGAATTTGGTTGGGAGCATCTTGTATGATCTCCGTATGATGTGAT ATTGATüGAGATAGTGGTCCTCATTC ITüGGGGTIGCCATTCCCACATTC'CC CCTTCAACAAAC AGTGTAACACiGTCCTTC CCAGATTTAGGGTACTTTTATTG ATGGATATGTTTTCCTTTTATTCACATAACCCCTTGAAACCCTGTCTTGTCCT CCTGTTACTTGCTTCTGCTGTACAAGATGTAGCACCTTTTCTCCTCTTTGAAC ATGGTCTAGTGACACGGTAGCACCAGTTGCAGGAAGGAGCCAGACTTGTTC TCAGAGCACTGTGTTCACACTTTTCAGCAAAAATAGCTATGGTTGTAACATA TGTATTCCCTTCCTCTGATTTGAAGGCAAAAATCTACAGTGTTTCTTCACTTC TTTTCTGATCTGGGGCATGAAAAAAGCAAGATTGAAATTTGAACTATGAGTC TCCTGCATGGCAACAAAATGTGTGTCACCATCAGGCCAACAGGCCAGCCCTT GAATÜGGGATTTATTACTGTTGTATCTATÜTTGCATGATAAACATTCATCAC CTT CCTCCTGT AGT CCT GCC'TC'GT ACT CCCCTTCC C'C'T ATG ATT GAAAAGT AA ACAAAACCCACATTTC'CTATCCTGGTTAGAAGAAAATTAATGTTCTGACAGT TGTG ATCGCCTGG AGTACTTTT AGACTTTT AGC ATTCGTTTTTT ACCTGTTTG IGGAIG IG I G 11 IG I A IG I G C A I ACO IA I GAGA 1AGGCACA IGC A IC I IC 1G TATGGACAAAGGTGÜGGTACCTACAGGAÜAGCAAAGGTTAATTTTGTGCTT TT AGTA A A AAC ATTT A A ATAC A A AGTTCTTTATTGGGT GG A ATTAT ATTTG A TGCAAATATTTGATCACTTAAA.ACTrnA.AAACTTCTAGGTAATTTGCCACG CTTTTTGACTGCTCACCAATACCCTGTAAAAATACGTAATTCTTCCTGTTTGT GTAAT AAG ATATTCATATTTGT AGTTGC ATT AATAATAGTT ATTTCTT AGTCC ATC'AGATGTTCCCGTGTGCCTCTTTTATGC C'AAATTGATTGTCATATTTCATG
CCTCTCAGAAAACTGAGCATACTAGCAAGACAGCTCTTCTTGAAAAAAAAA ATAT GT AT AC AC A A AT AT AT ACGT AT ATCT AT ATAT ACGT ATGT AT AT ACAC ACA I G I A I A I I C11 I CC. TI GAT IG IG IAGC1G I CVAAAA 1 AA I AACA I A I A IA GAGGGAGCTGTATTCCTTTATACAAATCTGATGGCTCCTGCAGCACTTTTTC CTTCTGAAAATATTTACATTTTGCTAACCTAGTTTCiTTACTTTAAAAATCAGT TTTGAIGAAAGGAGGGAAAAGCAGATGGACTTGAAAAAGATCCAAGCTCCT ATT AG AiVAAGGT AT G AAAATCTTT AT AGT AAAATTTTTT AT AiVACT AAAGTT GTACCTTTTAATATGTAGTA.AACTCTCATTTATTTGGGGTTCGCTCTTGGATC TCATCCATCCATTGTGTTCTCTTTAATGCTGCCTGCCTTTTGAGGCATTCACT GCCCTAGACAATGCCACCAGAGATAGTGGGGGAAATGCCAGATGAAACCAA CTCTTGCTCTCACTAGTTGTCAGCTTC'TCTGGATAAGTGACCACAGAAGCAG GAGTCCTCCTGCTTGGGCATCATTGGGCCAGTTCCTTCTCTTTAAATCAGATT TGTAATGGCTCCCAAATTCCATCACATCACATTTAAATTGCAGACAGTGTTT TGCACATCATGTATCTGTTTTGTCCCATAATATGCTTTTTACTCCCTGATCCC AGTTTCTGCTGTTGACTCTTCCATTCAGTTTTATTTATTGTGTGTTCTCACAGT GACAC’CATTTGTCCTTTTCTGCAACAACCTTTCCAGCTACTTTTGCCAAATTC TATTTGTCTTCTCCTTCAAAACATTCTCCTTTGCAGTTCCTCTTCATCTGTGTA GCTGCTCTTTTGTCTCTTAACTTACCATTCCTATAGTACTTTATGCATCTCTGC TTAGTTCTATTAGTTTTTTGGCCTTGCTCTTCTCCTTGATTTTAAAATTCCTTC TAT AGCT ACi AGCTTTT CTTT CTTT C ATT CT CT CTT CCTGC AGTGTTTTGCAT AC ATCAGAAGd AGG l ACA I AAGT rAAA I GATrGAGAG I'TGGC I G I A I 1TAGA I TTATCACTTTTTAATAGGGTGAGCTTGAGAGTTTTCTTTCTTTCTGTTTTTTTT TTTT GTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT G ACT A ATTT C AC ATGCTCT AAAAACCTTCAAAGGTGATTATTTTTCTCCTGGAAAC'TCCAGGTCCATTCTG TTTAAATCCCTAAGAATGTCAGAATTAAAATAACAGGGCTATCCCGTAATTG GAAATATTTC'TTTTTTCAGGATGCTATAGTCAATTTAGTAAGTGACCACCAA ATTGTTATTTGCACTAACAAAGCTCAAAACACGATAAGTTTACTCCTCCATC TC AGTA AT A A A A ATT A AGCTGT A ATC AACCTTCT AGGTTTCTCTTGTCTT A A AATGGGTATTCAAAAATGGGGATCTGTGGTGTATGTATGGAAACACATACT CCTTAATTTACCTGTTGTTGGAAACTGGAGAAATGATTGTCGGGCAACCGTT T ATTTTTT ATT GT ATTTTATTT GGTT G AGGG ATTTTTTT AT A A AC AGTTTT ACT TGTGTCATATTTTAAAATTACTAACTGCCATCACCTGC’TGGGGTCCTTTGTTA GGTCATTTTCAGTGACTAATAGGGATAATCCAGGTAACTTTGAAGAGATGA GCAGTGAGTGACCAGGCAGTTTTTCTGC’CTTTAGCTTTGACAGTTCTTAATTA AGATCATTGAAGACCAGCTTTCTCATAAATTTCTCTTTTTGAAAAAAAGAAA GCATTTGTACTAAGCTCCTCTGTAAGACAACATCTTAAATCTTAAAAGTGTT GTTATCATGAC'TGGTGAGAGAAGAAAACATTTTGTTTTTATTAAATGGAGCA TTATTTACAAAAAGCCATTGTTGAGAATTAGATCCCACATCGTATAAATATC TATTAACCATTCTAAATAAAGAGAAC'TCCAGTGTTGCTATGTGCAAGATCCT CTCTTGGAGCTTTTTTGCATAGCAATTAAAGGTGTGCTATTTGTCAGTAGCC ATTTTnTGCAGTGATTTGAAGACCAAAGTTGTnTACAGCTGTGTTACCGTT AAAGGTTTTTTTTTTTATATGTATTAAATC'AATTTATCACTGTTTAAAGCTTT GAATATCTGCAATCTTTGCCAAGGTACTTTTTTATTTAAAAAAAAACATAAC TTTGTAAATATTACCC'TGTAATATTATATATACTTAATAAAACATTTTAAGCT A(sec. con núm de ident.: 9)
Isoforma 1 de aminoácidos de CD47 humano (XP 005247966.1)
MWPLVAALLLGSACCGSAO LL F» KTKSVEFTFCN DTVVi PC FVTNM EAQNT TEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDK SDAVSHTGNYTCEVTELTREGETI1ELKYRVVSWFSPNENILIVIFP1FAILLFW GQFGIKTLK.YRSGGMDEKTIALLVAGLVITV1V1VGAILFVPGEYSLKNATGLGLI VTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILV10VIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLI SGLSILALAOLLGLVYMKFVf
(sec. con núm de ident.: 10)
Isoforma 2 de ARNm de CD47 humano (NM_198793.2)
GGGGAGCAGGCGGGGGAGCGGGCGGGAAGCAGTGGGAGCGCGCGTGCGCG CGGCCGTGCAGCCTGGGCAGTGGGTCCTGCCTGTGACGCGCGGCGGCGGTC GGTCCTGCCTGTAACGGCGGCGGCGGCTGCTGCTCCAGACACCTGCGGCGG CGGCGGCGACCCCGCGGCGGGCGCGGAGATCTCGCCCCTCCTACCCCCC CTG TTG C TG G G C TC G G C G TG C TG C G GATCAGCTCAGCTACTATTTAATA AAACAAAA I C I G I AGAAI I CACG I I 11G I AA IGACAC I G I CC. rCA i rCC ATGCTTTGTTACTAATATGGAGGCACAAAACACTAC'I'GAAGTATACGTA AAGTGG AAATTTAAAG C. AAG ACATA TTTACAC CTTTC AT CGACCTC TAA AC AA(; ICC AC K . I C C X X AC K . A C [ I I A( , I A( . I ( .C AA A A AI I GA A t . l C IX A C A A I I A C I A A A A G G ACA IGCC I C i r i G A A G A r C G A l A A G A G T G A I G C l GTCTCACACACAGGAAAC'TACAC'TTGTGAAGTAACAGAAT IAACCAGAG AAC.Ct IXiAAACXiA 1 C A l'CXiAC.C IAAAAI A rCXrrC. r iXi TTTCATGGTTTTC TCCAAATGAAAATATTCTTATTGTTATTTTCCCAATTTTTGCTATACTCC TGTTCTGG G GACAGTTTGGTATTAA.AACACTTAAATATAGATCCGGTGG t a t g c ía t c ;a c ;a a a a c a a t t g c t t t a c t t g t t g c t g g a c t a g t c ; a t x a c t G IX A l I G I C A l I G r i GG \G C C \ l 1X1 I I I CG rCCC AGG I GAA rA I Í C’A IT AAAG AATGCT ACTGGCCTT GGTTT AATTGTGACTTCTAC AGGG AT ATT A ATATTACTTCACTACTATGTGTTTAGTACAGCGATTGGATTAACCTCCTT CGTCATTCCCATATTGGTTATTCAGGTGATAeiCXTATATCCTCGCTGTe: GTTGG A CTG A GTCTCTGTA TTGCG G CGTGTATACCAATGCATGGCCCTC TTCTGATTTCAGGTTTGAGTATCTTAGCTCTAGCACAATTACTTGGACTA GTTTATATG AAATTTGTGGCTICC'AATC AGAAGACTATAC AACCTCCTA GGAATAACTGAAGTGAAGTGATGGACTCCGATTTGGAGAGTAGTAAGACG TGAAAGGAATAC ACTTGTGTTTAAGCACC ATGGCCTTGATGATTCArTGTTG GGGAGAAGAAACAAGAAAAGTAACTGGTTGTCACCTATGAGACCCTTACGT G ATT GTT AGTT AAGTTTTT ATTC A AAGC AGCTGT AATTT AGTTA AT AAAAT A ATTATGATCTATGTTGTTTGCCCAATTGAGATCCAGTTTTTTGTTGTTATTTTT AATCAATTAGGGGCAATAGTAGAATGGACAATTTCX'AAGAATGATGCCTTT CAGGTCCTAGGGCCTCTGGCCTCTAGGTAACCAGTTTAAATTGGTTCAGGGT GATAACTACTTAGCACTGCCCTGGTGATTACCCAGAGATATCTATGAAAACC AGTGGCTTCX’ATCAAACCTTTGCCAACTCAGGTTCACAGCAGCTTTGGGCAG TTATGGC’AGTATGGCATTAGCTGAGAGGTGTCTGCCACTTCTGGGTCAATGG AAT AATAAATT AAGTACAGGC AGG AATTTGGTTGGG AGCATCTTGT ATG ATC TCCGTATGATGTGATATTGATGGAGATAGTGGTCCTCATTCTTGGGGGTTGC CATTCCCACATTCCCCCTTC.AACAAACAGTGTAACAGGTCCTTCCCAGATTT AGGGTACTTTTATTGATGGATATGTTTTCCTTTTATTCAC’ATAACCCCTTGAA ACCCTGTCTTGTCCTCCTGTTACTTGCTTCTGCTGTACAAGATGTAGCACCTT TTCTCCTCTTTGAACATGGTCTAGTGACACGGTAGCACCAGTTGCAGGAAGG AGCCAGACTTGTTCTCAGAGCACTGTGTTCACACTTTTCAGCAAAAATAGCT ATGGTTGTAACATATGTATTCCCTTCCTCTGATTTGAAGGCAAAAATCTACA GTGTTTCTTCACTTCTTTTCTGATCTGGGGCATGAAAAAAGCAAGATTGAAA TTTGAACTATGAGTCTCCTGCATGGCAACAAAATGTGTGTCACCATC’AGGCC AACAGGCCAGCCCTTGAATGGGGATTTATTACTGTTGTATCTATGTTGCATG ATAAACATTCATCACCTTCCTCCTGTAGTCCTGCCTCGTACTCCCCTTCCCCT ATGATTGAAAAGTAAACAAAACCCACATTTCCTATCCTGGTTAGAAGAAAA TTAATGTTCTGACAGTTGTGATCGCCTGGAGTACTTTTAGACTTTTAGCATTC GTTTTTT ACCTGTTTGTGGATGT GTGTTTGT ATGTGC AT ACGT AT GAG AT AGG CACATGCATCTTCTGTATGGACAAAGGTGGGGTACC’TACAGGAGAGCAAAG GTTAATTTTGTGCTTTTAGTAAAAACATTTAAATACAAAGTTCTTTATTGGGT GGAATTATATTTGATGCAAATATTTGATCACTTAAAACTTTTAAAACTTCTA GGTAATTTGCCACGCrTTTTGACTGCTCACCAATACCCTGTAAAAATACGTA ATTCTTCCTGTTTGTGT A ATA AG AT ATTC ATATTTGT AGTTGCATT AATAAT A GTT ATTTCTT AGTCC ATCAG ATGTT CCCGT GT GCCTC TTTT ATGCC AAATT G A TTGTCATATTTCATGTTGGGACCAAGTAGTTTGCCCATGGCAAACCTAAATT TATG ACCTGCTG AGGCCT CTC AG A A A ACT GAGC AT ACTAGCA AG AC AGCTC TTCTTGAAAAAAAAAATATGTATACACAAATATATACGTATATCTATATATA CGTATGTATATACACACATGTATATTCTTCCTTGATTGTGTAGCTGTCCAAAA TAATAACATATATAGAGGGAGCTGTATTCCTTTATACAAATCTGATGGCTCC TGCAGCACTTTTTCCTTCTGAAAATATTTACATTTTGCTAACCTAGTTTGTTA CTTTAAAAATCAGTTTTGATGAAAGGAGGGAAAAGCAGATGGACTTGAAAA AGATCCAAGCTCCTATTAGAAAAGGTATGAAAATCTTTATAGTAAAATTTTT TAT AAACT AA AGTTGT ACCTTTT A AT ATGT AGT AAACTCTC ATTT ATTTGGGG TTCGCTCTTGGATCTCATCCATCCATTGTGTTCTCTTTAATGCTGCCTGCCTTT TGAGGCATTCACTGCCCTAGACAATGCCACCAGAGATAGTGGGGGAAATGC CAGATGAAACCAACTCTTGCTCTCACTAGTTGTCAGCTTCTCTGGATAAGTG ACCACAGAAGCAGGAGTCCTCCTGCTTGGGCATCATTGGGCCAGTTCCTTCT CTTTAAATCAGATTTGTAATGGCTCCCAAATTCCATCACATCACATTTAAATT GCAGACAGTGTTTTGCACATCATGTATCTGTTTTGTCCCATAATATGCTTTTT ACTCCCTGATCCCAGTTTCTGCTGTTGACTCTTCCATTCAGTTTTATTTATTGT GTGTTCTCACAGTGACACCATTTGTCCTTTTCTGCAACAACCTTTCCAGCTAC TTTTGCCAAATTCTATTTGTCTTCTCCTTCAAAACATTCTCCTTTGCAGTTCCT
rTTCATCTGTGTAGCTGrTCTTTTGTCTCTTAArTTACCATTCCTATAGTACTT TATGCATCTCTGCTTAGTTCTATTAGTTTTTTGGCCTTGCTCTTCTCCTTGATT TTAAAATTCCTTCTATAGCTAGAGCTTTTCTTTCTTTCATTCTCTCTTCCTGCA GTGTTTTGCATACATCAGAAGCTAGGTACATAAGTTAAATGATTGAGAGTTG GCTGTATTTAGATTTATCACTTTTTAATAGGGTGAGCTTGAGAGTTTTCTTTC TTTCT GTTTTTTTTTTTT G TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG ACT A ATTTCACATGCTCTAAAAACCTTCAAAGGTGATTATTTTTCTCCTGGAAACTC CAGGTCC'ATTCTGTTTAAATCCCTAAGAATGICAGAATl AAAATAACAGGGC TATCCCGTAATTGGAAATATTTCTTTTTTCAGGATGCTATAGTCAATTTAGTA AGTGACCACCAAATTGTTATTTGCACTAACAAAGCTCAAAACACGATAAGTT TACTCCTCCATCTCAGTAATAAAAATTAAGCTGTAATCAACCTTCTAGGTTT CTCTTGTCTTAAAATGGGTATTCAAAAATGGGGATCTGTGGTGTATGTATGG AAACACATACTCCTTAATTTACCTGTTGTTGGAAACTGGAGAAATGATTGTC GGGC AACCGTTT ATTTTTT ATTGT ATTTT ATTTGGTTG AGGG ATTTTTTT AT A AACAGTTTTACTTGTGTCATATTTTAAAATTACTAACTGCCATCACCTGCTGG GGTCCTTTGTTAGGTC ATT TTCAGTG ACTA ATAGGGAT,AATCCAGGTAACTT TGAAGAGATGAGCAGTGAGTGACCAGGCAGTTTTTCTGCCTTTAGCTTTGAC AGTTCTTAATTAAGATCATTGAAGACCAGCTTTCTCATAAATTTCTCTTTTTG AAAAAAAGA.AAGCATTTGTACTAAGCTCCTCTGTAAGACAACATCTTAAAT CTTAA.AAGTGTTGTTATCATGACTGGTGAGAGAAGAAAACATTTTGTTTTTA TTAAATGGAGCATTATTTACAAAAAGCCATTGTTGAGAATTAGATCCCACAT CGT ATAAAT ATCT ATT AACC ATTCTAAATA AAG AGAACTCC AGTGTTGCT AT GTGCAAGATCCTCTCTTGGAGCTTTTTTGCATAGCAATTAAAGGTGTGCTAT TTGTC AGT AGC’C ATTTTTTT GC AGT G ATTT G AAG AC'CAAAGTTGTTTTAC AGC TGTGTT ACCGTT A AAGGTTTTTTTTTTT AT ATGT ATT AAATC AATTT AT CAC T GTTTAAAGCTTTGAATATCTGCAATCTTTGCCAAGGTACTTTTTTATTTAAAA A AAAAC AT AACTTT GT AA AT ATT ACCCTGT AAT ATTATATAT AC TT A AT AA A AC ATTTT AAGCT ATTTTGTTGGGCT ATTT CT ATT GC T GCT AC AGC AG ACC AC A AGCAC' ATTTCTG A AA AATTT AATTT ATTA ATGTATTTTT AAGTTGCTTAT ATT CTAGGTAACAATGTAAAGAATGATTTAAAATATTAATTATGAATTTTTTGAG TATAATACCCAATAAGCTTTTAATTAGAGCAGAGTTTTAATTAAAAGTTTTA AATCAGTC
(sec. con núm de ident.: 11)
Isoforma 2 de aminoácidos de CD47 humano (NP_942088.1)
MWPLVAALLLGSACCGSAOLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTN.VIEAONT
TEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAK1EVSQLLKGDASLKMDK
SDAVSIITGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFW
GQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLK.NATGLGLI
VTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIOVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLI
SGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRNMsec. con núm de ident.: 12)
Isoforma 3 de ARNm de CD47 humano (XM_005247908.1)
AGTGGGAGCGCGCGTGCGCGCGGCCGTGCAGCCTGGGCAGTGGGTCCTGCC
TGTGACGCGCGGCGGCGGTCGGTCCTGCCTGTAACGGCGGCGGCGGCTGCT
GCTCCGGACACCTGCGGCGGCGGCGGCGACCCCGCGGCGGGCGCGGAGAT
GTGGCCCCTGGTAGCGGCGCTGTTGCTGGGCTCGGCGTGCTGCGGATC
a g c t c a g c t a c t a t t t a a t a a a a c a a a a t c t g t a g a a t t c a c g t t t t g t a ATGACACTGTCGTCATTCCATGCTrrGTTACTAATATGGAGGCACAAAA
CACTACTGAAGTATACGTAAAGTGGAAATTTAAAGGAAGAGATATTTAC
a c c t t t g a t g g a g c t c t a a a c a a g t c c a c t g t c c c c a c t g a c t t t a g t a
GTGCAAAAATTGAAGTCTCACAATTACTAAAAGGAGATGCCTCTTTGAA
GATGGATAAGAGTGATGCTGTCTCACACACAGGAAACTACACTTGTGAA
GTAACAGAATTAACCAGAGAAGGTGAAACGATCATCGAGCTAAAATATC
GT GTTGTTTCAT GGTTTT CTCC AAATGAAAAT ATTCTT ATTGTTATTTTC
CCAATTTTTGCTATACTCCTGTTCTGGGGACAGTTTGGTATTAAAACAC
TTAAATATAGA'rCCGGTGGTATGGATGAGAAAACAATTGCTTTACTTGT
TGCTGGACTAGTGATCACTGTC’ATTGTCATTGTTGGAGCCATTCTTTTC
GTCCCAGGTGAATATTCATTAAAGAATGCTACTGGCCTTGGTTTAATTG
TGACTTCTACAGGGATATTAATATTACTTCACTACTATGTGTTTAGTACA
CCGATTGGATTAACCTCCTTCGTCATTGCCATATTGGTTATTCAGGTGA
t a g c c t a t a t c c t c g c ix; ix.(;nxi(;Adx;Ac;rc r c ix; i A r ix .cx.G C G iG
TATACCAATGCATGGCCCTCTTCTGATTTCAGGTTTGAGTATCTTAGCT
CTAGCACAATT ACTTGGACTAGTTT ATATGAAATTTGTGGCTTCCAATC
AGAAGACTATACAACCTCCTAGGAAAGCTGTAGAGGAACCCCTTAATGA
ATAACTGAAGTGAAGTGATGGACTCCGATTTGGAGAGTAGTAAGACGTGAA
AGGAATACACTTGTGTTTAAGCACCATGGC'CTTGATGATTCACTGTTGGGGA
GAAGAAACAAGAAAAGTAACTGGTTGTCACCTATGAGACCCTTACGTGATT
GTT AGTT A AGTTTTTATTC AAAGC AGCTGT AATTT AGTT AAT A A AAT AATT AT
GATCTATGTTGTTTGCCCAATTGAGATCCAGTTTTTTGTTGTTATTTTTAATC
AATTAGGGGCAATAGTAGAATGGACAATTTCCAAGAATGATGCCTTTCAGG
TCCTAGGGCCTCTGGCCTCTAGGTAACCAGTTTAAATTGGTTCAGGGTGATA
ACTACTTAGCACTGCCCTGGTGATTACCCAGAGATATCTATGAAAACCAGTG GCTT C C AT C AAACC TTT GCCAACT C AGGTT C AC AGC AGCTTT GGGCAG TT AT GGCAGTATGGCATTAGCTGAGAGGTGTCTGCCACTTCTGGGTCAATGGAATA ATAAATTAAGTACAGGCAGGAATTTGGTTGGGAGCATCTTGTATGATCTCCG TATGATGTGATATTGATGGAGATAGTGGTCCTCATTCTTGGGGGTTGCCATT CCCACATTCCCCCTTCAACAAACAGTGTAACAGGTCCTTCCCAGATTTAGGG TACTTTTATTGATGGATATGTTTTCCTTTTATTCACATAACCCCTTGAAACCC TGTCTTGTCCTCCTGTTACTTGCTTCTGCTGTACAAGATGTAGCACCTTTTCT CCTCTTTGAACATGGTCTAGTGACACGGTAGCACCAGTTGCAGGAAGGAGC CAGACTTGTTCTCAGAGCACTGTGTTCACACTTTTCAGCAAAAATAGCTATG GTTGTAACATATGTATTCCCTTCCTCTGATTTGAAGGCAAAAATCTACAGTG TTTCTTCACTTCTTTTCTGATCTGGGGCATGAAAAAAGCAAGATTGAAATTT GAACTATGAGTCTCCTGCATGGCAACAAAATGTGTGTCACCATCAGGCCAA CAGGCCAGCCCTTGAATGGGGATTTATTACTGTTGTATCTATGTTGCATGAT AAACATTCATCACCTTCCTCCTGTAGTCCTGCCTCGTACTCCCCTTCCCCTAT GATTGAAAAGTAAACAAAACCCACATTTCCTATCCTGGTTAGAAGAAAATT AATGTTCTGACAGTTGTGATCGCCTGGAGTACTTTTAGACTTTTAGCATTCGT TTTTT ACCTGTTT GT GG ATGTGT GTTTGT AT GTGC AT ACGT ATG AG AT AGGC A CATGCATCTTCTGTATGGACAAAGGTGGGGTACCTACAGGAGAGCAAAGGT TAATTTTGTGCTTTTAGTAAAAACATTTAAATACAAAGTTCTTTATTGGGTGG AATTATATTTGATGCAAATATTTGATCACTTAAAACTTTTAAAACTTCTAGGT
a a t t t g c c a c g c t t t t t g a c t g c t c a c c a a l A rcc iG rAAAAATAC G i a a r r CTTCCTGTTTGTGT A AT A AG AT ATTC AT ATTTGT AGTTGCATTA AT A AT AGTT ATTTCTTAGTCCATCAGATGTTCCCGTGTGCCTCTTTTATGCCAAATTGATTG TCATATTTCATGTTGGGACCAAGTAGTTTGCCCATGGCAAACCTAAATTTAT GACCTGCTGAGGCCTCTCAGAAAACTGAGCATACTAGCAAGACAGCTCTTCT TGAAAAAAAAAATATGTATACACAAATATATACGTATATCTATATATACGTA TGTATATAC'AC AC'ATGTATATTrTTrrTTGATTGTGTAGC'TGTCCAAAATAAT AACATATATAGAGGGAGCTGTATTCCTTTATACAAATCTGATGGCTCCTGCA GCACTTTTTCCTTCTGAAAATATTTACATTTTGCTAACCTAGTTTGTTACTTT AAAAATCAGTTTTGATGAAAGGAGGGAAAAGCAGATGGACTTGAAAAAGA ICCAAGCICCI AI I AGAAAAGG I A1GAAAA IC H 1AI AG I AAAA1 I 1 I I 1A I AAACTAAAGTTGTACCTTTTAATATGTAGTAAACTCTCATTTATTTGGGGTTC GCTCTTGGATCTCATC'CATCCATTGTGTTCTCTTTAATGrTGCCTGCCTTTTG AGGCATTCACTGCCCTAGACAATGCCACCAGAGATAGTGGGGGAAATGCCA GATGAAACCAACTCTTGCTCTCACTAGTTGTCAGCTTCTCTGGATAAGTGAC CACAGAAGCAGGAGTCCTCCTGCTTGGGCATCATTGGGCCAGTTCCTTCTCT TTAAATCAGATTTGTAATGGCTCCCAAATTCCATCACATCACATTTAAAFTG CAG AC AGTGTTTTGC AC ATCATGT ATCTGTTTT GTCCCATAAT ATGCTTTTT A CTCCCTGATCCCAGTTTCTGCTGTTGACTCTTCCATTCAGTTTTATTTATTGTG TGTTCTCACAGTGACACCATTTGTCCTTTTCTGCAACAACCTTTCCAGCTACT TTTGCCAAATTCTATTTGTCTTCTCCTTCAAAACATTCTCCTTTGCAGTTCCTC TTCATCTGTGTAGCTGCTCTTTTGTCTCTTAACTTACCATTCCTATAGTACm ATGCATCTCTGCTTAGTTCTATTAGTTTTTTGGCCTTGCTCTTCTCCTTGATTT TAAAATTCCTTCTATAGCTAGAGCTTTTCTTTCTTTCATTCTCTCTTCCTGCAG TGTTTTGC AT ACATCAG A AGCT AGGT ACATA AGTTA A ATG ATTGAG AGTTGG CTGTATTTAGATTTATCACTTTTTAATAGGGTGAGCTTGAGAGTTTTCTTTCT TT CT GTTTTTTTTTTTT GTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT G ACT A A TTTCACATGCTCT.AAAAACCTTCAAAGGTGATTATTTTTCTCCTGGAAACTCC AGGTCCATTCTGTTTAAATCCCTAAGAATGTCAGAATTAAAATAACAGGGCT ATCCCGTAATTGGAAATATTTCTTTTTTCAGGATGCTATAGTCAATTTAGTAA GTGACCACCAAATTGTTATTTGCACTAACAAAGCTCAAAACACGATAAGTTT ACTCCTCCATCTCAGTAATAAAAATTAAGCTGTAATCAACCTTCTAGGTTTC TCTTGTCTTAAAATGGGTATTCAAAAATGGGGATCTGTGGTGTATGTATGGA AACACATACTCCTTAATTTACCTGTTGTTGGAAACTGGAGAAATGATTGTCG GGCA ACCGTTT ATTTTTT ATT GT ATTTTATTTGGTTG AGGGATTTTTTT AT A A ACAGTTTTAC’TTGTGTCATATTTTAAAATTACTAACTGC’CATCAC’CTGC'TGGG GTCCn i G r I AGG 1CA l i r 1CAG I GAC1AA 1AGGGA rAATC'CAGG l'AAC i r 1 GAAGAGATGAGCAGTGAGTGACCAGGCAGTTTTTCTGCCTTTAGCTTTGACA GTTCTTAATTAAGATCATTGAAGACCAGCTTTCTCATAAATTTCTCTTTTTGA AAAAAAGAAAGCATTTGTACTAAGCTCCTC'TGTAAGACAAC ATCTTAAATCT TAAAAGTGTTGTTATCATGACTGGTGAGAGAAGAAAACATTTTGTTTTTATT AAATGGAGCATTATTTACAAAAAGCCA ITGTI GAGA ATI AGATGCCACATCG TATAAATATCTATTAACCATTCTAAATAAAGAGAACTCCAGTGTTGCTATGT GCAAGATCCTCTCTTGGAGCTTTTTTGCATAGCAATTAAAGGTGTGCTATTT GTCAGTAGCCATTTTTTTGCAGTGATTTGAAGACCAAAGTTGTTTTACAGCT GTGTTACCGTTAAAGGTTTTTTTTTTTATATGTATTAAATCAATTTATCACTG TTT AAAGCTTTGA AT AT CTGCA ATCTTTGGCAAGGT ACTTTTTT ATTT A AA AA A A AAC AT A ACTTTGT AAAT ATT ACCCTGT A AT ATT ATAT AT ACTT A AT A A A A CATTTTAAGCTA(sec. con núm de ident.: 13)
Isoforma 3 de aminoácidos de CD47 humano (XP_005247965.1)
MW'PLVAALLLGSACCGSAOLLFNKTK.SVEPTFCMDTVViPCFVTWlEAONT TEVYVKWKFKGRDIVTFDGALMKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDK SDAVSHTGNYTCEVTELTREGET1IELKYRWSWFSPNENILIV1FPIFAILLFW GQFG1KTLK.YRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGA1LFVPGEYSLK.NATGLGLI VTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIA1LVIQV1AYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLI SG LSIL A L AQLLG LV Y MK.F V/ISAQKTIQPPRKA VEEPLNE(sec. con núm de ident.: 14)
Isoforma 4 de ARNm de CD47 humano (NM_001777.3)
GGGGAGCAGGCGGGGGAGCGGGCGGGAAGCAGTGGGAGCGCGCGTGCGCG CGGCCGTGCAGCCTGGGCAGTGGGTCCTGCCTGTGACGCGCGGCGGCGGTC GGTCCTGCCTGTAACGGCGGCGGCGGCTGCTGCTCCAGACACCTGCGGCGG CGGCGGCGACCCCGCGGCGGGCGCGGAGATGTGGCCCCTGGTAGCGGCG CTGTTGCTGGGCTCGGCGTGCTGCGGATCAGCTCAGCTACTATTTAATA AAACAAAATCTGTAGAATTC’ACGTTTTGTAATGACACTGTCGTCATTCC A T G ( 'I' I T Í i l'TAC T A A r . \T ( i ( iA C i( iC ~ A ( A A A A t \ ( ' l 'A( I'(iA A (i F A T A t (i 'l 'A AAGTGGAAATTTAAAGGAAGAGATATTTACACCTTTGATGGAGCTCTAA ACAAGTCCACTGTC'CCCACTGACTTTAGTAGTGCAAAAATTGAAGTCTC ACAATTAC’TAAAAGGAGATCiCCTC' TTTGAAGATGGATAAGAGTGATGCT GTCTCACAC'AC AGGAAAC'TACACTTGTGAAGTAACAGAATTAACCAGAG AAGGT(;AAAC:GATCATC(;AC;CTAAAATATCGTC;TTGrrTTCATGGTTTTC TCC AA ATG AAAATATTCTT ATTGTT ATTTTCCC A ATTTTTGCT AT ACTCC TGTrCTCGGGACAGTTTGGTATTAAAACACTTAAATATAGATCCGGTGG TATGGATGAGAAAACAATTGCTTTACTTGTTGCTGGACTAGTGATC AC'T GTCATTGTCATTGTTGGAGC'CATTCTTTTCGTCC’CAGGTGAATATTCATT ATATTACTTCACTACTATGTGTTTAGTACAGCGATTGGATTAACCTCCTT CGTCATTGCCATATTGGTTATTCAGGTGATAGCCTATATCCTCGCTGTG GTTGGACTGAGTCTCTGTATTGCGGCGTGTATACCAATGCATGGCCCTC TTCTGATTTCAGGTTTGAGTATCTTAGCTCTAGCACAATTACTTGGACTA GTTTATATGAAATTTGTGGCTTCCAATCAGAAGACTATACAACCTCCTA GGAAAGCTGTAGAGGAACCCCTTAATGC ATTC AAAGAATC AAAAGGAAT GATGAATGATGAATAACTGAAGTGAAGTGATGGACTCCGATTTGGAGAGT AGTAAGACGTGAAAGGAATACACTTGTGTTTAAGCACCATGGCCTTGATGA TTCACTGTTGGGGAGAAGAAACAAGAAAAGTAACTGGTTGTCACCTATGAG ACCCTT ACGTG ATT GTT AGTT A AGTTTTT ATTC A A AGCAGCT GT A ATTT AGTT AATAAAATAATTATGATCTATGTTGTTTGCCCAATTGAGATCCAGTTTTTTGT TGTTATTTTTAATC'AATTAGGGGCAATAGTAGAATGGACAATTTCCAAGAAT GATGCCTTTCAGGTCCTAGGGCCTCTGGCCTCTAGGTAACCAGTTTAAATTG GTTCAGGGTGATAACTACTTAGCACTGCCCTGGTGATTACCCAGAGATATCT ATGAAAACCAGTGGCTTCCATCAAACCTTTGCCAACTCAGGTTCACAGCAGC TTTGGGC AGTT ATGGC AGT ATGGCATTAGCTGAGAGGTGTCTGCCACTTCTG GGTC A ATGGA ATAAT AAATT AAGT ACAGGC AGGAATTTGGTT GGG AGC ATC TTGTATGATCTCCGTATGATGTGATATTGATGGAGATAGTGGTCCTCATTCTT GGGGGTTGCC ATT CCC AC ATT CCCCCTTC A AC A A ACA GTGT A AC AGGTCCTT CCC AG A ITTAGGGTAC TITTA ITG ATGGATATGT r n C C ’TT TI AITCAC AT A A CCCCTTGAAACCCTGTCTTGTCCTCCTGTTACTTGCTTCTGCTGTACAAGATG TAGCACCTTTTCTCCTCTTTGAACATGGTCTAGTGACACGGTAGCACCAGTT GCAGGAAGGAGCCAGACTTGTTCTCAGAGCACTGTGTTCACACTTTTCAGCA AAAATAGCTATGGTTGTAACATATGTATTCCCTTCCTCTGATTTGAAGGCAA AAATCTACAGTGTTTCTTCACTTCTTTTCTGATCTGGGGCATGAAAAAAGCA AGATTGAAATTTGAACTATGAGTCTCCTGCATGGCAACAAAATGTGTGTCAC CATCAGGCCAACAGGCCAGCCCTTGAATGGGGATTTATTACTGTTGTATCTA TGTTGCATGATAAACATTCATCACCTTCCTCCTGTAGTCCTGCCTCGTACTCC CCTTCCCCT ATGATTGA A A AGT A A ACA A A ACCC ACATTTCCT ATCCTGC.TT A GAAGAAAATTAATGTTCTGACAGTTGTGATCÜCCTGGAGTACTTTTAGACTT TTAGCATTCGTTTTTTACCTGTTTGTGGATGTGTGTTTGTATGTGCATACGTA TGAGATAGGCACATGCATCTTCTGTATGGACAAAGGTGGGGTACCTACAGG AGAGCAAAGGTTAATTTTGTGCTTTTAGTAAAAACATTTAAATACAAAGTTC TTTATTGGGTGGAATTATATTTGATGCAAATATTTGATCACTTAAAACTTTTA AAACTTCTAGGT AATTT GCC ACGCTTTTTG ACT GCT C ACC AAT ACCCTGTAA AAATACGTAATTCTTCCTGTTTGTGTAATAAGATATTCATATTTGTAGTTGCA TTAATAATAGTTATTTCTTAGTCCATCAGATGTTCCCGTGTGCCTCTTTTATG CCAAATTGATTGTCATATTTCATGTTGGGACCAAGTAGTTTGCCCATGGCAA ACCTAAATTTATGACCTGCTGAGGCCTCTCAGAAAACTGAGCATACTAGCAA GACAGCTCTTCTTGAAAAAAAAAATATGTATACACAAATATATACGTATATC TATATATACGTATGTATATACACACATGTATATTCTTCCTTGATTGTGTAGCT GTCCAAAATAATAACATATATAGAGGGAGCTGTATTCCTTTATACAAATCTG
A i G GCI CCT GC AGCACITTTT CCIT C 1G AAAAI A IT TACA r r n GC I AACC1A GTTTGTTACTTTAAAAATCAGTTTTGATGAAAGGAGGGAAAAGCAGATGGA CTTGAAA.AAGATCCAAGCTCCTATTAGAAAAGGTATGAAAATCTTTATAGTA AAATTTTTT AT AAACT AAAGTT GT ACCTTTTAAT ATGT AGT AAACTCTCATTT ATTTGGGGTT CGCTCTT GG ATCTC AT CC ATCC ATTGTGTT CTCTTT.A ATGCT G CCTGCCTTTTGAGGCATTCACTGCCCTAGACAATGCCACCAGAGATAGTGGG GGAAATGCCAGATGAAACCAACTCTTGCTCTCACTAGTTGTCAGCTTCTCTG G AT AAGTG ACCACAG AAGC AGG AGTCCTCCT GCTT GGGC ATC ATT GGGCC A GTTCCTTCTCTTTAAATCAGATTTGTAATGGCTCCCAAATTCCATCACATCAC ATTTAAATTGCAGACAGTGTTTTGCACATCATGTATCTGTTTTGTCCCATAAT ATGCTTTTTACTCCCTGATCCCAGTTTCTGCTGTTGACTCTTCCATTCAGTTTT ATTTATTGTGTGTTCTCACAGTGACACCATTTGTCCTTTTCTGCAACAACCTT TCCAGCTACTTTTGCCAAATTCTATTTGTCTTCTCCTTCAAAACATTCTCCTTT GCAGTTCCTCTTCATCTGTGTAGCTGCTCTTTTGTCTCTTAACTTACCATTCCT AT AGT ACTTT AT GC AT CT CTGC'TT AGTT C’T ATT AGTTTTTT GGCCTT GCT CTT C TCCTTGATTTTAAAATTCCTTCTATAGCTAGAGCTTTTCTTTCTTTCATTCTCT CTTCCTGCAGTGTTTTGCATACATCAGAAGCTAGGTACATAAGTTAAATGAT TGAGAGTTGGCTGTATTTAGATTTATCACTTTTTAATAGGGTGAGCTTGAGA GTTTTCTTTCTTTCTGTTTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTGACTAATTTCACATGCTCTAAAAACCTTCAAAGGTGATTATTTTTCTCC TGGA A ACTCCAGGTCC ATTCTGTTT AAATCCCT A AGAATGTC AG AATTA A A A TA AC AGGGCT ATCCCGT A ATTGGA A AT ATTTCTTTTTT C AGGATGCTAT AGT CAATTTAGTAAGTGACCACCAAATTGTTATTTGCACTAACAAAGCTCAAAAC ACG AT AAGTTT ACTCCTCC ATCTCAGT AATAA AAATT AAGCTGT AATC AACC TTCTAGGTTTCTCTTGTCTTAAAATGGGTATTCAAAAATGGGGATCTGTGGT GTATGTATGGAAACACATACTCCTTAATTTACCTGTTGTTGGAAACTGGAGA A ATG ATTGTCGGGC A ACCGTTT ATTTTTT ATTGT ATTTT ATTTGGTTGAGGGA TTTTTTT AT A A AC AGTTTT ACTTGTGTCAT ATTTT A A A ATT ACT AACTGCC AT CACCTGCTGGGGTCCTTTGTTAGGTCATTTTCAGTGACTAATAGGGATAATC CAGGTAACTTTGAAGAGATGAGCAGTGAGTGACCAGGCAGTTTTTCTGCCTT TAGCTTTGACAGTTCTTAATTAAGATCATTGAAGACCAGCTTTCTCATAAAT TTCTCTTTTTGAAAAAAAGAAAGCATTTGTACTAAGCTCCTCTGTAAGACAA CATCTTAAATCTTAAAAGTGTTGTTATCATGACTGGTGAGAGAAGAAAACAT TTTGTTTTT ATT AAAT GG AGC ATT ATTT AC AAAAAGC C ATTGTT G AG AATT A G ATCCC AC ATCGTAT A A AT ATCT ATT A ACC ATTCT A A AT A A AG AG A ACTCC A GTGTTGCTATGTGCAAGATCCTCTCTTGGAGCTTTTTTGCATAGCAATTAAA GGTGTGCTATTTGTCAGTAGCCATTTTTTTGCAGTGATTTGAAGACCAAAGT TGTTTTACAGCTGTGTTACCGTTAAAGGTTTTTTTTTTTATATGTATTAAATC AATTTATCACTGTTTAAAGCTTTGAATATCTGCAATCTTTGCCAAGGTACTTT TTTATTTAAAAAAAAACATAACTTTGTAAATATTACCCTGTAATATTATATAT ACTTAATAAAAC ATTTT AAGCTATTTTGTTGGGCTATTTCTATTGCTGCTAC’A GCAGACCAC AAGC AC ATTT CTG AAAAATTT AATTT ATT AAT GT ATTTTT AAG TTGCTTATATTCTAGGTAACAATGTAAAGAATGATTTAAAATATTAATTATG AATTTTTTGAGTATAATACCCAATAAGCTTTTAATTAGAGCAGAGTTTTAATT AAAAGTTTTAAATC AGTC(sec. con núm de ident.: 15)
Isoforma 4 de aminoácidos de CD47 humano (NP_001768.1)
MWPLVAALLLGSACCGSAOLLFMKTKSVEFTFCNDTVYiPCFVTNMEAONT TEVYVKWKFKGRD1VTFDGALNKSTV PTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDK SDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRWSWFSPNENILIVIFPIFAILLFW GQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLI VTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIA1LVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLI s g l s il a l a q l l g l v y m k fv a sn q k t/qpprka veeplna fk esk g m m n d e (sec. con núm de ident.: 16)
Isoforma 1 de aminoácidos de CD47 humanizado
M W PLM ALLLG SC C C G SAQ LLF N K T K S V E E T F C N D T W IP C F V T N M E A Q N T
TE V Y V K W K FK G R D IYTFD G ALN KSTV PTD FS SA KIE VSQ LLKG D A SLK M D K
SD AVSH TG N YTC EV TELTR EG ETH ELKYR W SW FS PN EN 1LIV IFP IFA ILLF
W G Q F G IK T LK Y R S G G M D E K T IA LLV A G LV IT V IV IV G A ILF V P G E Y S LK N A T
G LG LIV T S T G IL ILLH Y Y V F S T A IG LT S F V IA ILV IQ V 1A Y ILA V V G LS LC IA A C I
P M H G P LLIS G LS ILA LA Q LLG LV Y M K FV £(sec. con núm de ident: 17)
Isoforma 2 de aminoácidos de CD47 humanizado
MWPLAAALLLGSC.'CCGSAQ LLFN KTKS VEFTFCN D TVVI PC FVTN M EAQ N T
TE V Y V K W K FK G R D IYTFD G ALN KSTV PTD FS SA KIE VSQ LLKG D A SLK M D K
SD A VSN TG N Y TC E V TE LTR E G E TIIE LK Y R V V S W FS P N E M LIV IFP IFA ILLF
W G Q F G IK T LK Y R S G G M D E K T IA LLV A G LV IT V IV IV G A ILF V P G E Y S LK N A T
G L G L IV T S T G IL ILLH Y Y V F S T A IG E T S F V IA ILV IQ V T A Y ILA V V G LS LC IA A C I
PM H G PLLISG LS IL A L A Q L L G LV Y M KFV 4 SNQR TIQPPRNR
(sec. con núm de ident.: 18)
Isoforma 3 de aminoácidos de CD47 humanizado
MWPLAAALLLGSCCCGSAQ LLFN KTK SVE FTFC N D TV VI PC FVTN M EAQ N T
TE V Y V K W K FK G R D IYTFD G ALN KSTV PTD FS SA KIE VSQ LLKG D A SLK M D K
SDAVSHTG NYTCEVTELTREG ETI1ELKYRVVSW FSPNEN1LIVIFP1FAILLF
W G Q FG 1KTLK YR SG G M D EK TIALLV AG LYTTVIV1VG A ILFV PG E YSLKN A T
G LG L IV T S T G IL ILLH Y Y V FS T A 1G LT S FV IA 1LV IQ V IA Y ILA V V G LS LC IA A C I
PM H G P L L ISGLSIL A L A Q L L GL V Y M K F VASNQR TI0PPRJC4 VEEPLNE
(sec. con núm de ident.: 19)
Isoforma 4 de aminoácidos de CD47 humanizado
MWPLAAALLLGSCCCGSAO LLFN KTK SVE FTFC N D TV VI PC FVTN M EAQ N T
TEY VVKYVKFKG RD1YTFDCALNKSTVPTDFSSAK1EVSQ LLKCDASLKM DK
SD A VSH TC N YTC EVTELTR EG ETM ELKYR VVSW FSPN EN ILIV IFP IFA ILLF
W G Q F G IK T LK Y R S G G M D E K T IA LLV A G LV IT V rv rV G A ILF V P G E Y S LK N A T
G L G L IV T S T G IL IL L H Y Y V F S T A IG L T S F V IA IL V IQ V IA Y IL A W G L S L C IA A C I
PM HG PLLISG L SI L A L AQ L LG LV Y M K F V T SNQR TUQPPRKA VEEPLNAFKESKG
MMNDE (sec. con núm de ident.: 20)
Animales no humanos con CD47 humanizado
Se proporcionan animales no humanos que expresan proteínas CD47 humanizadas en la superficie de las células de los animales no humanos como resultado de una modificación genética de un locus endógeno del animal no humano que codifica una proteína CD47. Los ejemplos adecuados descritos en la presente descripción incluyen roedores, particularmente, ratones.
Un gen de CD47 humanizado, puede comprender material genético de una especie heteróloga (por ejemplo, seres humanos), en donde el gen de CD47 humanizado codifica una proteína CD47 que comprende la porción codificada del material genético de la especie heteróloga. Un gen de CD47 humanizado descrito en el presente documento puede comprender ADN genómico de una especie heteróloga que codifica la porción extracelular de una proteína CD47 que se expresa en la membrana plasmática de una célula. Un gen de CD47 humanizado descrito en el presente documento puede comprender ADN genómico de una especie heteróloga que codifica la porción extracelular y la porción transmembrana de una proteína CD47 que se expresa en la membrana plasmática de una célula. Se proporcionan, además, animales no humanos, embriones, células y construcciones de transformación para producir animales no humanos, embriones no humanos, y células que contienen dicho gen de CD47 humanizado.
Puede eliminarse un gen endógeno de CD47. Puede alterarse un gen de CD47 endógeno, en donde una porción del gen de CD47 endógeno se reemplaza con una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia de CD47 humana, en su totalidad o en parte). La totalidad o sustancialmente la totalidad de un gen de CD47 endógeno se reemplaza con un gen heterólogo (por ejemplo, un gen de CD47 humano). Una porción de un gen de CD47 heterólogo puede insertarse en un gen de CD47 endógeno no humano en un locus de c D47 endógeno. El gen heterólogo puede ser un gen humano. La modificación o humanización puede realizarse a una de las dos copias del gen de CD47 endógeno, lo que da lugar a un animal no humano que es heterocigoto con respecto al gen de CD47 humanizado. Se puede proporcionar un animal no humano que sea homocigoto para un gen CD47 humanizado
Un animal no humano como se describe en la presente puede contener un gen CD47 humano, en su totalidad o en parte, en un locus CD47 endógeno no humano. Así, tales animales no humanos pueden describirse como que tienen un gen de CD47 heterólogo. El gen de CD47 reemplazado, insertado, modificado o alterado en el locus de CD47 endógeno puede detectarse con el uso de una variedad de métodos que incluyen, por ejemplo, PCR, transferencia Western, transferencia Southern, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), o un ensayo de ganancia o pérdida de alelos. El animal no humano puede ser heterocigoto con respecto al gen de CD47 humanizado El animal no humano puede ser homocigoto para el gen de CD47 humanizado.
Un gen de CD47 humanizado descrito en la presente incluye un gen de CD47 que tiene un segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto y séptimo exón, cada uno de los cuales puede tener una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto y séptimo exón que aparece en un gen de CD47 humano de la Tabla 3.
Un gen de CD47 humanizado de acuerdo con la presente invención incluye un gen de CD47 que tiene un iniciador exón y exón(es) corriente abajo del exón 7 (por ejemplo, los exones octavo y noveno de la isoforma 2) donde cada uno tiene una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un exón respectivo que aparece en un gen de CD47 de ratón de la Tabla 3.
Un gen de CD47 humanizado de conformidad con la presente invención incluye un gen de CD47 que tiene una región 5' no traducida y una región 3' no traducida cada una de las cuales tiene una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una región 5' no traducida y una región 3' no traducida que aparecen en un gen de CD47 de ratón de la Tabla 3.
Un gen de CD47 humanizado de conformidad con la presente invención incluye un gen de CD47 que tiene una secuencia de nucleótidos codificante (por ejemplo, una secuencia de ADNc) al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia de nucleótidos codificante que aparece en una secuencia de nucleótidos codificante de CD47 humano de la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en el presente documento puede tener una porción extracelular con una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una porción extracelular de una proteína CD47 humana que aparece en la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente tiene una porción extracelular que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a los residuos de aminoácidos 19-141 que aparecen en una proteína CD47 humana de la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano de la presente invención tiene un dominio V inmunoglobulínico N-terminal que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un dominio V inmunoglobulínico N-terminal de una proteína CD47 humana que aparece en la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente tiene un dominio V inmunoglobulínico N-terminal que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a los residuos de aminoácidos 19-127 que aparecen en una proteína CD47 humana de la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción puede tener un dominio V inmunoglobulínico N-terminal y cinco dominios transmembranas cada uno con una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un dominio V inmunoglobulínico N-terminal y cinco dominios transmembranas de una proteína CD47 humana que aparece en la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano de la presente invención tiene una cola intracitoplasmática que tiene una secuencia que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una cola intracitoplasmática de una proteína CD47 de ratón que aparece en la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en el presente documento puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 16­ 292 que aparecen en una proteína CD47 humana de la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en el presente documento puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 19­ 292 que aparecen en una proteína CD47 humana de la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a los residuos de aminoácidos 19-292 (o 16-292) que aparecen en una proteína CD47 humana de la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en el presente documento puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia de aminoácidos de una proteína CD47 humanizada que aparece en la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción puede tener una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos de una proteína CD47 humanizada que aparece en la Tabla 3.
Se proporcionan composiciones y métodos para producir animales no humanos que expresan una proteína CD47 humanizada, que incluye formas polimórficas específicas, variantes alélicas (por ejemplo, diferencias en un solo aminoácido) o isoformas de corte y empalme alternativo, que incluyen composiciones y métodos para producir animales no humanos que expresan tales proteínas a partir de un promotor humano y una secuencia reguladora humana. Se pueden proporcionar además composiciones y métodos para producir animales no humanos que expresan tales proteínas a partir de un promotor endógeno y una secuencia reguladora endógena. Los métodos incluyen insertar el material genético que codifica una proteína CD47 humana en su totalidad o en parte en una ubicación precisa en el genoma de un animal no humano que corresponde a un gen de CD47 endógeno para crear de esta manera un gen de CD47 humanizado que expresa una proteína CD47 que es humana en su totalidad o en parte. Los métodos pueden incluir insertar ADN genómico correspondiente a los exones 2 - 7 de un gen de CD47 humano en un gen de CD47 endógeno del animal no humano para crear de esta manera un gen humanizado que codifica una proteína CD47 que contiene una porción humana que contiene los aminoácidos codificados por los exones insertados.
Cuando sea adecuado, la región codificante del material genético o secuencia(s) de polinucleótido(s) que codifica(n) una proteína CD47 humana en su totalidad o en parte puede modificarse de manera que incluya codones optimizados para la expresión en el animal no humano (por ejemplo, ver las patentes de los Estados Unidos núms. 5,670,356 y 5,874,304). Las secuencias con optimización de codones son secuencias sintéticas, y, preferentemente, codifican el polipéptido idéntico (o un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de longitud completa que tiene sustancialmente la misma actividad que el polipéptido de longitud completa) codificado por el polinucleótido original sin optimización de codones. La región codificante del material genético que codifica una proteína CD47 humana, en su totalidad o en parte, puede incluir una secuencia alterada para optimizar el uso de codones en un tipo de célula particular (por ejemplo, una célula de roedor). Por ejemplo, los codones del ADN genómico correspondiente a los exones 2-7 de un gen de CD47 humano a insertar en un gen de CD47 endógeno de un animal no humano (por ejemplo, un roedor) pueden optimizarse para su expresión en una célula del animal no humano. Una secuencia de este tipo puede describirse como una secuencia con optimización de codones.
Un enfoque del gen de CD47 humanizado emplea una modificación relativamente mínima del gen endógeno y da como resultado la transducción natural de las señales mediadas por CD47 en el animal no humano, debido a que la secuencia genómica de las secuencias de CD47 se modifican en un solo fragmento y por lo tanto conservan su funcionalidad normal mediante la inclusión de las secuencias reguladoras necesarias. Así, en tales casos, la modificación del gen de CD47 no afecta otros genes circundantes u otros genes endógenos que interactúan con CD47 (por ejemplo, trombospondina, SIRP, integrinas, etcétera). Además, la modificación no afecta el ensamblaje de una proteína de transmembrana CD47 funcional en la membrana celular y mantiene sus funciones efectoras normales por medio de la unión y posterior transducción de señales a través de la porción citoplasmática de la proteína que no se afecta por la modificación.
Una ilustración esquemática (que no está a escala) de la organización genómica de un gen de CD47 murino endógeno y un gen de CD47 humano se proporciona en la Figura 1. Un método ilustrativo para la humanización de un gen de CD47 murino endógeno con el uso de un fragmento genómico que contiene los exones 2-7 de un gen de CD47 humano se proporciona en la Figura 2. Como se ilustra, el ADN genómico que contiene los exones 2 - 7 de un gen de CD47 humano se inserta en un locus de un gen de CD47 endógeno murino mediante una construcción de transformación. Este ADN genómico incluye la porción del gen que codifica una porción extracelular los dominios de transmembrana (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 16 - 292) de una proteína CD47 humana responsable de la unión a ligandos.
Un animal no humano (por ejemplo, un ratón) que tiene un gen de CD47 humanizado en el locus de CD47 endógeno puede producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede producirse un vector de transformación que introduce un gen de CD47 humano en su totalidad o en parte con un gen marcador de selección. La Figura 2 ilustra un locus de CD47 endógeno de un genoma de ratón que comprende una inserción de los exones 2 - 7 de un gen de CD47 humano. Como se ilustra, la construcción de transformación contiene un brazo de homología en 5' que contiene una secuencia corriente arriba del exón 2 de un gen de CD47 endógeno murino (~39 Kb), seguido por un fragmento de ADN genómico que contiene los exones 2 - 7 de un gen de CD47 humano (~23,9 Kb), un casete de selección por fármacos (por ejemplo, un gen de resistencia a la neomicina flanqueado en ambos extremos por secuencias loxP, ~5 Kb), y un brazo de homología en 3' que contiene una secuencia corriente abajo del exón 7 de un gen de CD47 endógeno murino (~99 Kb). El constructo de transformación contiene un casete de selección con fármaco autoeliminable (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina flanqueado por secuencias loxP; ver las patentes de los Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392 and 8,354,389). Después de la recombinación homóloga, los exones 2 - 7 de un gen de CD47 endógeno murino se reemplazan por la secuencia contenida en el vector de transformación (es decir, los exones 2 - 7 de un gen de CD47 humano). Se crea un gen de CD47 humanizado que da como resultado una célula o animal no humano que expresa una proteína CD47 humanizada que contiene los aminoácidos codificados por los exones 2 - 7 de un gen de CD47 humano. El casete de selección por fármacos se elimina de una manera dependiente del desarrollo, es decir, la progenie derivada de los ratones cuyas células de la línea germinal contienen el gen de CD47 humanizado descrito anteriormente liberarán el marcador de selección de las células diferenciadas durante el desarrollo.
Los animales no humanos como se describen en la presente pueden prepararse como se describió anteriormente, o mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, para comprender genes humanos o humanizados adicionales, lo que depende frecuentemente del uso deseado del animal no humano. El material genético de tales genes humanos o humanizados adicionales puede introducirse a través de la alteración adicional del genoma de las células (por ejemplo, células madre embrionarias) que tienen las modificaciones genéticas como se describió anteriormente o a través de técnicas de cruzamiento conocidas en la técnica con otras cepas modificadas genéticamente según convenga. Los animales no humanos descritos en la presente pueden prepararse de modo que comprendan además uno o más genes humanos o humanizados seleccionados de SIRPa (cDl72a), IL-3, M-CSf , GM-CSF y TPO. Los animales no humanos, como se describe en la presente, pueden prepararse mediante la introducción de un vector de transformación, como se describe en la presente, en una célula de una cepa modificada. Solo para dar un ejemplo, un vector de transformación, como se describió anteriormente, puede introducirse en un ratón que es deficiente de Rag2 y deficiente de IL-2Ry e incluye cuatro citocinas humanas (Rag2'/'IL2RYC/'; M-CSFHu; IL-3/GM-CSFHu; hSIRPatg; TPOHu). Los animales no humanos descritos en la presente descripción pueden prepararse para comprender además un gen de proteína alfa (SIRPa) reguladora de la señal humana o humanizada (SIRPa). Los animales no humanos como se describe en la presente pueden comprender un gen CD47 humanizado como se describe en la presente y material genético de una especie heteróloga (por ejemplo, seres humanos), en donde el material genético codifica, en su totalidad o en parte, una o más proteínas heterólogas seleccionadas de SIRPa (CD172a), IL-3, M-CSF, GM-CSF y TPO. Los animales no humanos descritos en la presente descripción pueden comprender un gen CD47 humanizado como se describe en la presente descripción y material genético de una especie heteróloga (por ejemplo, humanos), en donde el material genético codifica, en su totalidad o en parte, una proteína SIRPa heteróloga (por ejemplo, humana). Los animales no humanos de la presente invención comprenden además un gen de SIRPa que comprende una porción endógena y una porción humana (por ejemplo, los exones 2-4 de un gen de SIRPa humano), en donde la porción humana codifica el dominio extracelular de una proteína SIRPa (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362 de una proteína SIRPa humana) y la porción endógena codifica el dominio intracelular de una proteína SIRPa endógena; la porción humana y la porción endógena se unen operativamente a un promotor de SIRPa endógeno.
Por ejemplo, como se describe en la presente, los animales no humanos que comprenden un gen de CD47 humanizado pueden comprender además (por ejemplo, por medio de estrategias de entrecruzamiento o de transformación de múltiples genes) una o más modificaciones como se describe en los documentos núms. PCT/US2010/051339, presentado el 4 de octubre de 2010; PCT/US2013/058448, presentado el 6 de septiembre de 2013; PCT/US2013/045788, presentado el 14 de junio de 2013; PCT/US2014/056910, presentado el 23 de septiembre de 2014; PCT/US2014/060568, presentado el 15 de octubre de 2014; PCT/US2012/025040, presentado el 14 de febrero de 2014; PCT/US2012/062379, presentado el 29 de octubre de 2012; PCT/US2014/064806, presentado el 10 de noviembre de 2014; y PCT/US2014/064810, presentado el 10 de noviembre de 2014. Un roedor que comprende un gen de CD47 humanizado (es decir, los exones 2-7 de un gen de CD47 humano unido operativamente al exón 1 y al exón 8 (y por lo tanto cualquiera de los exones corriente abajo) de un gen de CD47 endógeno de roedor de manera que el gen de CD47 humanizado codifica un polipéptido de CD47 que tiene una porción extracelular de una proteína CD47 humana y una porción intracelular de una proteína CD47 de roedor) puede cruzarse con un roedor que comprende un gen de SIRPa humanizado (por ejemplo, los exones 2-4 de un gen de SIRPa humano unido operativamente a los exones 1 y 5-8 de un gen de SIRPa endógeno de roedor de manera que el gen de SIRPa humanizado codifica un polipéptido de SIRPa que tiene una porción extracelular de una proteína SIRPa humana (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362) y una porción intracelular de una proteína SIRPa de roedor; ver, por ejemplo, el documento núm. PCT/US2014/056910, presentado el 23 de septiembre de 2014).
Aunque las modalidades que emplean un gen de CD47 humanizado en un ratón (es decir, un ratón con un gen de CD47 que codifica una proteína CD47 que incluye una porción humana y una porción de ratón) se analizan exhaustivamente en la presente descripción, se describen, además, otros animales no humanos que comprenden un gen de CD47 humanizado. Tales animales no humanos pueden comprender un gen de CD47 humanizado unido operativamente a un promotor endógeno de SIRPa. Tales animales no humanos expresan una proteína CD47 humanizada a partir de un locus endógeno, en donde la proteína CD47 humanizada comprende los residuos de aminoácidos 16-292 (o 19-141 o 19-127) de una proteína CD47 humana. Tales animales no humanos incluyen cualquiera de los que pueden modificarse genéticamente para expresar una proteína CD47 como se describe en la presente, que incluyen, por ejemplo, mamíferos, por ejemplo, ratón, rata, conejo, cerdo, bovino (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, hurón, primate (por ejemplo, tití, mono Rhesus), etcétera. Por ejemplo, para los animales no humanos donde las células ES genéticamente modificables adecuadas no están fácilmente disponibles, pueden emplearse otros métodos para producir un animal no humano que comprende la modificación genética. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la modificación de un genoma de células que no son ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y el empleo de transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) para transferir el genoma modificado genéticamente a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito enucleado, y la gestación de la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un animal no humano en condiciones adecuadas para formar un embrión.
Los métodos para modificar el genoma de un animal no humano (por ejemplo, un genoma de cerdo, vaca, roedor, pollo, etcétera) incluyen, por ejemplo, emplear una nucleasa de dedos de zinc (ZFN) o una nucleasa efectora tipo activador de la transcripción (TALEN) para modificar un genoma de manera que incluya un gen de CD47 humanizado.
Un animal no humano descrito en el presente documento puede ser un mamífero. Un animal no humano descrito en el presente documento puede ser un mamífero pequeño, por ejemplo, de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. Un animal modificado genéticamente descrito en el presente documento puede ser un roedor. Un roedor descrito en la presente descripción puede seleccionarse de un ratón, una rata, y un hámster. Un roedor como se describe en la presente puede seleccionarse de la superfamilia Muroidea. Un animal modificado genéticamente descrito en el presente documento puede ser de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres similares a ratón), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, ratones campestres), Muridae (ratones y ratas verdaderos, jerbos, ratones espinosos, ratas crestadas), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de roca, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirones espinosos), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas de bambú, y zokor). Un roedor modificado genéticamente descrito en el presente documento puede seleccionarse de un ratón o una rata verdaderos (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso, y una rata crestada. Un ratón modificado genéticamente como se describe en la presente puede ser un miembro de la familia Muridae. Un animal no humano como se describe en la presente puede ser un roedor. Un roedor descrito en el presente documento puede seleccionarse de un ratón y una rata. Un animal no humano como se describe en la presente puede ser un ratón.
Un animal no humano como se describe en la presente puede ser un roedor que es un ratón de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, y C57BL/Ola. Un ratón como se describe en la presente puede ser de una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, por ejemplo, Festing y otros, 1999, Mammalian genoma 10:836; Auerbach W. y otros, 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032). Un ratón modificado genéticamente como se describe en la presente puede ser una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. Un ratón como se describe en la presente puede ser una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. Una cepa 129 de la mezcla como se describe en la presente puede ser una cepa 129S6 (129/SvEvTac). Un ratón como se describe en la presente puede ser una cepa BALB, por ejemplo, la cepa BALB/c. Un ratón descrito en la presente descripción puede ser una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente.
Un animal no humano como se describe en la presente descripción puede ser una rata, una rata descrita en la presente descripción se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F6, y Dark Agouti. Una cepa de rata como se describe en la presente puede ser una mezcla de dos o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6, y Dark Agouti.
Métodos que emplean animales no humanos que tienen genes de CD47 humanizados
Se ha informado de células y animales no humanos mutantes y transgénicos para CD47 (por ejemplo, minicerdos) (Koshimizu H. y otros (2014) PLoS One, 9(2):e89584; Lavender, K.J. y otros (2014) J. Immunol. Methods, 407:127134; Tena, A. y otros (2014) Am. J. Transplant.doi: 10.1111/ajt.12918; Lavender K.J. y otros (2013) Blood, 122(25):4013-4020; Tena, A. y otros (2012) Transplantation 94(10S):776; Wang, C. y otros (2011) Cell Transplant.
20(11-12):1915-1920; Johansen, M.L. y Brown, E.J. (2007) J. Biol. Chem. 282:24219-24230; Wang, H. y otros (2007) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 104:13744-13749; Tulasne D. y otros (2001) Blood, 98(12):3346-52; Oldenborg, P.y otros (2000) Science 288:2051-2054; Verdrengh, M. y otros (1999) Microbes Infect. 1(10):745-751; Chang, H.P. y otros (1999) Learn Mem. 6(5):448-457; Wang, X.Q. y otros (1999) J. Cell Biol. 147(2):389-400; Lindberg, F.P. y otros (1996) Science 274(5288):795-798). Tales animales se han empleado en una variedad de ensayos para determinar, por ejemplo, los aspectos moleculares de la expresión, función y regulación de CD47. Se han descubierto diferencias considerables entre especies. De hecho, ratones diabéticos no obesos/con inmunodeficiencia combinada severa (NOD/SCID) expresan una proteína SIRP que es capaz de interactuar con el CD47 humano y, por lo tanto, se han usado ampliamente para el desarrollo de modelos en ratones con componentes del sistema inmunitario humano (por ejemplo, ver Takenaka, K. y otros (2007) Nat. Immunol. 8(120:1313-1323). El alelo de SIRPa presente en estos ratones no es representativo del alelo de SIRPa presente en otras cepas de ratón y, en general, existe poca reacción cruzada entre c D47 y SIRPa entre especies. Además, se ha informado que el CD47 en células de ratón tiene una movilidad casi completa, mientras que el CD47 en células humanas solo demuestra aproximadamente un 30-40 % (Bruce, L. y otros (2003) Blood 101:4180-4188; Mouro-Chanteloup, L. y otros (2000) VoxSanguinis 78:P030; Mouro-Chanteloup, L. y otros (2003) Blood 101:338-344). Así, los ratones NOD/SCID tienen limitaciones. Por ejemplo, aunque el desarrollo hematopoyético humano de múltiples linajes puede soportarse en algunos fondos genéticos (por ejemplo, BALB/c Rag2'/_IL-2Rc-/-), la homeostasis de otros tipos celulares permanece ineficiente (por ejemplo, células T y NK; ver por ejemplo, Gimeno, R. y otros (2004) Blood 104:3886-3893; Traggiai, E. y otros (2004) Science 304:104-107; Legrand, N. y otros (2006) Blood 108:238-245). Además, se conoce además que CD47 interactúa con otras proteínas de la superficie celular y proporcionan una señalización bidireccional. Así, los ratones existentes representan un sistema in vivo ineficiente para el esclarecimiento de funciones dependientes de CD47 en diversos procesos biológicos tales como, por ejemplo, injerto y fagocitosis. Además, los ratones existentes representan un sistema in vivo subóptimo para el desarrollo de terapias dirigidas a CD47.
Los animales no humanos descritos en el presente documento proporcionan un sistema in vivo mejorado y una fuente de materiales biológicos (por ejemplo, células) que expresan CD47 humano, los cuales son útiles para una variedad de ensayos. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse para desarrollar agentes terapéuticos que se dirijan a CD47 y/o modulen la señalización CD47-SIRPa. Los animales no humanos como se describe en la presente pueden usarse para seleccionar y desarrollar productos terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos) que se unen a CD47 humana. Los animales no humanos descritos en la presente descripción pueden usarse para seleccionar y desarrollar terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos) que bloquean la interacción del CD47 humano con SIRPa humana. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse para determinar el perfil de unión de antagonistas y/o agonistas al CD47 humanizado en la superficie de una célula de un animal no humano como se describe en el presente documento. Los animales no humanos de la presente invención se usan para determinar el epítopo o epítopos de uno o más anticuerpos terapéuticos candidatos que se unen al CD47 humano.
Los animales no humanos como se describe en la presente se usan para determinar los perfiles de farmacocinética de los anticuerpos anti-CD47. Uno o más animales no humanos como se describen en la presente y uno o más animales no humanos de control o de referencia cada uno se exponen a uno o más anticuerpos terapéuticos candidatos anti-CD47 a diversas dosis (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0, 2 mg/kg, 0, 3 mg/kg, 0, 4 mg/kg, 0, 5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, o 50 mg/kg o más). Los anticuerpos terapéuticos candidatos pueden dosificarse por medio de cualquier vía de administración deseada (por ejemplo, por vía subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, etcétera). La sangre se aísla de los animales no humanos (humanizados y control) en diversos puntos de tiempo (por ejemplo, 0 h, 6 h, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, o hasta 30 o más días). Diversos ensayos pueden realizarse para determinar los perfiles farmacocinéticos de los anticuerpos terapéuticos candidatos administrados mediante el uso de muestras obtenidas a partir de animales no humanos como se describen en la presente descripción, que incluyen, pero no se limitan a, IgG total, respuesta contra el anticuerpo terapéutico, aglutinación, etcétera.
Los animales no humanos descritos en la presente descripción pueden usarse para medir el efecto terapéutico de bloquear o modular la señalización de CD47 y el efecto sobre la expresión génica como un resultado de cambios celulares. Un animal no humano de la presente invención o células aisladas a partir de ellos se exponen a un producto terapéutico candidato que se une a una proteína CD47 humanizada (o una porción humana de una proteína CD47) en la superficie de una célula del animal no humano y, después de un período de tiempo posterior, se analizan para determinar los efectos sobre los procesos dependientes de CD47, por ejemplo, adhesión, angiogénesis, apoptosis, inflamación, migración, fagocitosis, proliferación y eliminación de tumores (o células tumorales).
Los animales no humanos de la presente invención expresan una proteína CD47 humanizada, por tanto pueden generarse células, líneas celulares, y cultivos celulares para servir como una fuente de CD47 humanizado para usar en ensayos funcionales y de unión, por ejemplo, ensayar la unión o función de un antagonista o agonista de CD47, particularmente donde el antagonista o agonista es específico para una secuencia o epítopo de SIRPa humano. Los epítopos CD47 que se unen por anticuerpos candidatos terapéuticos pueden determinarse mediante el uso de células aisladas de animales no humanos como se describe en la presente.
Las células de los animales no humanos descritos en el presente documento pueden aislarse y usarse sobre una base ad hoc, o pueden mantenerse en cultivo por muchas generaciones. Las células de un animal no humano descrito en el presente documento pueden inmortalizarse y mantenerse en cultivo indefinidamente (por ejemplo, en cultivos en serie).
Las células y/o los animales no humanos como se describe en la presente pueden usarse en un ensayo de supervivencia y/o proliferación (por ejemplo, con el empleo de células B o T) para seleccionar y desarrollar productos terapéuticos candidatos que modulan la señalización de CD47 humano. La activación o pérdida de CD47 pueden desempeñar un papel importante en la regulación de la proliferación celular, y la inducción de la apoptosis por CD47 puede ser el resultado de la activación de epítopos específicos del dominio extracelular de CD47, por lo tanto, los moduladores de CD47 candidatos (por ejemplo, antagonistas o agonistas) pueden identificarse, caracterizarse y desarrollarse con el uso de células de animales no humanos de la presente invención y/o un animal no humano como se describe en la presente. Las células y/o los animales no humanos como se describe en la presente se usan en ensayo(s) de supervivencia o muerte para determinar el efecto sobre la proliferación o la apoptosis de una(s) célula(s) específica(s) (por ejemplo, células cancerosas) en presencia y ausencia de CD47.
Las células y/o animales no humanos de la presente invención se usan en el xenotrasplante de células heterólogas (por ejemplo, humanas) para determinar las funciones mediadas por CD47 en la respuesta fisiológica (por ejemplo, inmunitaria) a las células humanas trasplantadas. Los productos terapéuticos candidatos que se unen, o bloquean una o más funciones de, CD47 humana pueden caracterizarse en un animal no humano como se describe en la presente. Las mediciones adecuadas incluyen diversos ensayos celulares, ensayos de proliferación, análisis de inmunoglobulinas séricas (por ejemplo, titulación de anticuerpos), ensayos de citotoxicidad, y caracterización de las interacciones entre ligando y receptor (ensayos de inmunoprecipitación). Los animales no humanos como se describe en la presente pueden usarse para caracterizar las funciones mediadas por CD47 que regulan una respuesta inmunitaria a un antígeno. El antígeno puede asociarse con una neoplasia. El antígeno puede asociarse con una enfermedad o afección autoinmunitaria. El antígeno puede ser una diana asociada con una enfermedad o afección que padecen uno o más pacientes humanos que necesitan tratamiento.
Los animales no humanos como se describe en la presente pueden usarse en experimentos de trasplante o transferencia adoptiva para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de CD47 de linfocitos nuevos y su función inmunológica. Los animales no humanos como se describe en la presente pueden trasplantarse con células B humanas.
Las células de animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse en un ensayo de dispersión o migración celular para tamizar y desarrollar agentes terapéuticos candidatos que modulen el CD47 humano. Tales procesos son necesarios para muchos procesos celulares que incluyen la cicatrización de heridas, la diferenciación, la proliferación y la supervivencia.
Las células de animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse en ensayos de fagocitosis para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos que modulen la regulación de la fagocitosis dependiente de CD47.
Las células de los animales no humanos descritas en la presente descripción pueden usarse en ensayos de crecimiento de células tumorales para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación y/o apoptosis de las células tumorales dependiente de CD47.
Una enfermedad o afección inflamatoria puede inducirse en uno o más animales no humanos de la presente invención para proporcionar un sistema in vivo para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de CD47 de una o más funciones de la enfermedad o afección inflamatoria. La enfermedad o afección inflamatoria puede estar asociada con una neoplasia.
Una afección antiangiogénica puede inducirse en uno o más animales no humanos descritos en la presente descripción para proporcionar un sistema in vivo para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de CD47 de una o más funciones de la afección antiangiogénica. Las funciones ilustrativas que pueden evaluarse para determinar la eficacia terapéutica incluyen expresión de quimiocinas, respuestas estimuladas por el óxido nítrico (NO) y recuperación del flujo sanguíneo.
Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden proporcionar un sistema in vivo para el análisis y prueba de un fármaco o vacuna. Un fármaco o vacuna candidato puede suministrarse a uno o más animales no humanos descritos en el presente documento, seguido del control de los animales no humanos para determinar una o más respuestas inmunitarias frente al fármaco o vacuna, el perfil de seguridad del fármaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afección. Los métodos ilustrativos usados para determinar el perfil de seguridad incluyen mediciones de toxicidad, concentración de dosis óptima, eficacia del fármaco o vacuna, y posibles factores de riesgo. Tales fármacos o vacunas pueden mejorarse y/o desarrollarse en tales animales no humanos.
Los animales no humanos como se describen en la presente pueden proporcionar un sistema in vivo para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a CD47. Un fármaco dirigido a CD47 puede suministrarse o administrarse a uno o más animales no humanos como se describen en la presente descripción, seguido del control de los animales no humanos (o células aisladas a partir de estos), o la realización de uno o más ensayos en éstos, para determinar el efecto del fármaco sobre el animal no humano. Las propiedades farmacocinéticas incluyen, pero no se limitan a, la manera en que un animal procesa el fármaco hacia diversos metabolitos (o detección de la presencia o ausencia de uno o más metabolitos del fármaco, que incluyen, metabolitos tóxicos), tiempo de vida media del fármaco, niveles circulantes del fármaco después de su administración (por ejemplo, concentración sérica del fármaco), respuesta contra el fármaco (por ejemplo, anticuerpos contra el fármaco), absorción y distribución del fármaco, vía de administración, vías de excreción y/o eliminación del fármaco. Las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los fármacos (por ejemplo, moduladores de CD47) se controlan en los animales no humanos o a través del uso de estos como se describen en la presente.
Los animales no humanos de la presente invención proporcionan un sistema in vivo para evaluar la toxicidad por acción en el objetivo de un fármaco dirigido a CD47. Un fármaco dirigido a CD47 puede suministrarse o administrarse a uno o más animales no humanos como se describen en la presente descripción, seguido del control de los animales no humanos (o células aisladas a partir de estos), o la realización de uno o más ensayos en éstos, para determinar el efecto de la toxicidad por acción en el objetivo del fármaco sobre el animal no humano. Típicamente, los fármacos se destinan a modular una o más funciones de sus objetivos. Solo para dar un ejemplo, un modulador de CD47 está destinado a modular las funciones mediadas por CD47 (por ejemplo, apoptosis inducida por CD47) a través de la interacción de alguna manera con la molécula de CD47 en la superficie de una o más células. Un modulador de este tipo puede tener un efecto adverso que es una exageración de la(s) acción(es) farmacológica(s) deseada(s) del modulador. Tales efectos se denominan efectos por acción sobre el objetivo. Los efectos por unión al objetivo ilustrativos incluyen una dosis demasiado elevada, activación/inactivación crónica, y acción correcta en un tejido incorrecto. Los efectos por acción sobre el objetivo de un fármaco dirigido a CD47, identificados en los animales no humanos de la presente invención, o a través del uso de estos, se usan para determinar una o más funciones de CD47 previamente desconocidas.
Los animales no humanos de la presente invención proporcionan un sistema in vivo para evaluar la toxicidad fuera del objetivo de un fármaco dirigido a CD47. Un fármaco dirigido a CD47 puede suministrarse o administrarse a uno o más animales no humanos como se describen en la presente descripción, seguido del control de los animales no humanos (o células aisladas a partir de estos), o la realización de uno o más ensayos en éstos, para determinar el efecto de la toxicidad fuera del objetivo del fármaco sobre el animal no humano. Los efectos por acción fuera del objetivo pueden producirse cuando un fármaco interactúa con un objetivo no previsto (por ejemplo, reactividad cruzada a un epítopo común). Tales interacciones pueden producirse en un tejido previsto o no previsto. Para proporcionar un ejemplo, los isómeros especulares (enantiómeros) de un fármaco pueden conducir a efectos tóxicos por acción fuera del objetivo. Además, un fármaco puede interactuar de manera inadecuada con diferentes subtipos de receptores y activarlos de manera no intencional. Los efectos por acción fuera del objetivo ilustrativos incluyen la activación/inhibición incorrecta de un objetivo incorrecto independientemente del tejido en el que se encuentra el objetivo incorrecto. Los efectos por acción fuera del objetivo de un fármaco dirigido a CD47 se determinan mediante la comparación de los efectos de la administración del fármaco a los animales no humanos de la presente invención con uno o más animales no humanos de referencia.
La realización de un ensayo incluye determinar el efecto sobre el fenotipo (por ejemplo, cambio del peso corporal) y/o el genotipo del animal no humano al que se administra el fármaco. La realización de un ensayo incluye determinar la variabilidad lote a lote de un modulador de CD47 (por ejemplo, un antagonista o un agonista). La realización de un ensayo incluye determinar las diferencias entre los efectos de un fármaco dirigido a CD47 administrado a un animal no humano como se describe en la presente descripción y a un animal no humano de referencia. Los animales no humanos de referencia pueden tener una modificación como se describe en la presente, una modificación que es diferente a como se describe en la presente (por ejemplo, una que tiene una interrupción, deleción o un gen de CD47 no funcional de cualquier otra manera) o puede no tener modificaciones (es decir, un animal no humano de tipo silvestre).
Los parámetros ilustrativos que pueden medirse en los animales no humanos (o en células aisladas a partir de ellos y/o con el uso de éstas) para evaluar las propiedades farmacocinéticas, la toxicidad por acción en el objetivo, y/o la toxicidad por acción fuera del objetivo de un fármaco dirigido a CD47 incluyen, pero no se limitan a, aglutinación, autofagia, división celular, muerte celular, hemólisis mediada por complemento, integridad del ADN, título de anticuerpos específicos para el fármaco, metabolismo del fármaco, arreglos de expresión génica, niveles de hematocrito, hematuria, actividad metabólica, actividad mitocondrial, estrés oxidativo, fagocitosis, biosíntesis de proteínas, degradación de proteínas, secreción de proteínas, respuesta al estrés, concentración del fármaco en el tejido objetivo, concentración del fármaco en tejido que no es objetivo, actividad transcripcional y similares. Los animales no humanos como se describen en la presente se usan para determinar una dosis con eficacia farmacéutica de un modulador de CD47.
Los animales no humanos como se describen en la presente proporcionan un sistema in vivo mejorado para el desarrollo y caracterización de productos terapéuticos candidatos para usar en cáncer. Los animales no humanos como se describe en la presente pueden implantarse con un tumor, seguido de la administración de uno o más productos terapéuticos candidatos. Los productos terapéuticos candidatos pueden incluir un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) o un cóctel de anticuerpos; los productos terapéuticos candidatos incluyen una terapia de combinación tal como, por ejemplo, la administración de anticuerpos monoespecíficos dosificados de manera secuencial o simultánea. El tumor puede dejarse durante el tiempo suficiente para su establecimiento en uno o más sitios dentro del animal no humano. La proliferación, crecimiento, etcétera, de células tumorales puede medirse antes y después de la administración con el o los productos terapéuticos candidatos. La citotoxicidad de los productos terapéuticos candidatos puede medirse además en el animal no humano según convenga.
Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden proporcionar un sistema in vivo mejorado para elucidar los mecanismos de la interacción de célula a célula humana a través de transferencia adoptiva. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden implantarse con un xenoinjerto de tumor, seguido de un segundo implante de linfocitos infiltrantes de tumores que pueden implantarse en los animales no humanos mediante transferencia adoptiva para determinar la eficacia en la erradicación de tumores sólidos u otras enfermedades malignas. Tales experimentos pueden realizarse con células humanas debido a la presencia exclusiva de CD47 humano sin competencia con CD47 endógeno del animal no humano. Alternativamente, tales experimentos pueden incluir el uso de células de ratón de un fondo NOD/SCID o BRG (BALB/c Rag2-/-IL-2RYc-/-). Además, las terapias y los agentes farmacéuticos para usar en el xenotrasplante pueden mejorarse y/o desarrollarse en tales animales no humanos.
Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden proporcionar un sistema in vivo mejorado para el mantenimiento y desarrollo de células madre hematopoyéticas humanas a través del injerto. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden proporcionar un mejor desarrollo y mantenimiento de las células madre humanas dentro del animal no humano. Puede observarse un aumento de las poblaciones de células B y T humanas diferenciadas en la sangre, la médula ósea, el bazo y el timo del animal no humano. Se observa una homeostasis óptima de las células T y NK en las células en sangre, médula ósea, bazo y timo del animal no humano. Los animales no humanos de la presente invención demuestran un aumento en el nivel o cantidad de glóbulos rojos (RBC) en comparación con uno o más animales no humanos de referencia.
Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden emplearse para evaluar la eficacia de un fármaco terapéutico dirigido a células humanas. Un animal no humano descrito en el presente documento puede recibir un trasplante de células humanas, y un candidato a fármaco dirigido a dichas células humanas se administra a dicho animal no humano. Después se determina la eficacia terapéutica del fármaco mediante el control de las células humanas en el animal no humano después de la administración del fármaco. Los fármacos que pueden someterse a prueba en los animales no humanos incluyen compuestos moleculares pequeños, es decir, compuestos de pesos moleculares menores que 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD, u 800 Dalton, y compuestos moleculares grandes (tales como proteínas, por ejemplo, anticuerpos), que tienen efectos terapéuticos previstos para el tratamiento de enfermedades y afecciones humanas al dirigirse a células humanas (por ejemplo, unión a ellas y/o acción sobre ellas).
El fármaco es un fármaco anticancerígeno, y las células humanas pueden ser células cancerosas, que pueden ser células de un cáncer primario o células de líneas celulares establecidas a partir de un cáncer primario. En estos casos, un animal no humano descrito en el presente documento recibe un trasplante de células cancerosas humanas, y se le suministra un fármaco anticancerígeno al animal no humano. La eficacia del fármaco puede determinarse al evaluar si el crecimiento o la metástasis de las células cancerosas humanas en el animal no humano se inhibe como resultado de la administración del fármaco.
El fármaco anticancerígeno puede ser una molécula de anticuerpo, que se une a un antígeno en las células cancerosas humanas. El fármaco anticancerígeno puede ser un anticuerpo biespecífico que se une a un antígeno en las células cancerosas humanas, y a un antígeno en otras células humanas, por ejemplo, células del sistema inmunitario humano (o "células inmunitarias humanas") tales como células B y células T.
Un animal no humano descrito en el presente documento puede recibir un injerto de células inmunitarias humanas o células que se diferencian en células inmunitarias humanas. Dicho animal no humano con las células inmunitarias humanas injertadas recibe un trasplante de células cancerosas humanas, y una administración de un fármaco anticancerígeno, tal como un anticuerpo biespecífico que se une a un antígeno en las células cancerosas humanas y a un antígeno en las células inmunitarias humanas (por ejemplo, células T). La eficacia terapéutica del anticuerpo biespecífico puede evaluarse en base a su capacidad para inhibir el crecimiento o las metástasis de las células cancerosas humanas en el animal no humano. El animal no humano descrito en el presente documento puede recibir un injerto de células progenitoras hematopoyéticas humanas CD34+ que producen células inmunitarias humanas (que incluyen células T, células B, células n K, entre otras). Las células de linfoma de células B humanas (por ejemplo, células Raji) se trasplantan a dicho animal no humano con células inmunitarias humanas injertadas, el cual se administra después con un anticuerpo biespecífico que se une a un antígeno tumoral (por ejemplo, un antígeno en las células B normales y determinados tumores malignos de células B, tal como CD20) y a la subunidad CD3 del receptor de células T, para probar la capacidad del anticuerpo biespecífico para inhibir el crecimiento del tumor en el animal no humano.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la técnica cómo producir y usar los métodos y composiciones de la invención, y no están destinados a limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. A menos que se indique de cualquier otra manera, la temperatura se indica en Celsius, y la presión es la atmosférica o cercana a ella.
Ejemplo 1. Humanización de un gen del grupo de diferenciación 47 (CD47) endógeno.
Este ejemplo muestra métodos ilustrativos para la humanización de un gen endógeno que codifica al grupo de diferenciación 47 (CD47) en un mamífero no humano tal como un roedor (por ejemplo, un ratón). Los métodos descritos en este ejemplo pueden emplearse para humanizar un gen de CD47 endógeno de un animal no humano con el uso de cualquier secuencia humana, o combinación de secuencias humanas (o fragmentos de secuencias) según convenga. En este ejemplo, un gen de CD47 humano que aparece en el clon del cromosoma artificial bacteriano (BAC) RP11-69A17 se emplea para humanizar un gen de c D47 endógeno de un ratón.
Un vector de transformación para la humanización del material genético que codifica un dominio V Ig N-terminal extracelular y cinco dominios de transmembrana de un gen de CD47 endógeno se construyó mediante el uso de tecnología VELOCIGENE (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 6,586,251 y Valenzuela y otros (2003) High-throughput engineering of the ratón genoma coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.
21(6):652-659).
En resumen, el clon del cromosoma artificial bacteriano (BAC) de ratón RP23-230L20 (Invitrogen) se modificó para eliminar la secuencia que contiene los exones 2-7 de un gen de CD47 endógeno e insertar los exones 2-7 de un gen de CD47 humano mediante el uso del clon de BAC humano RP11-69A17 (Invitrogen), el cual codifica los aminoácidos 16-292 de un polipéptido de CD47 humano. Se retuvo el ADN endógeno que contiene ADN genómico correspondiente a los exones 1, 8 y 9 de la isoforma 2 así como las regiones no traducidas en 5' y 3' (UTR). El análisis de secuencias de la secuencia de CD47 humana contenida en el clon de BAC RP11-69A17 confirmó todos los exones de CD47 y las señales de corte y empalme. El análisis de secuencia reveló que la secuencia coincidía con el genoma de referencia y los transcritos de c D47 NM_001777.3 y NM_198793.2. El Ad N genómico correspondiente a los exones 2-7 de un gen de CD47 endógeno (~30, 8 kb) se reemplazó en el clon de BAC RP23-230L20 mediante recombinación homóloga en células bacterianas para insertar un fragmento de ADN que contiene ~23,9 kb de ADN genómico humano correspondiente a los exones 2-7 de un gen de CD47 humano a partir de un clon de BAC RP11-69A17 y ~4995 pb correspondientes a un casete de neomicina autoeliminable flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasas (loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-loxP; ver las patentes de los Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392 y 8,354,389). El casete de neomicina autoeliminable se añadió al extremo del fragmento de ADN humano de ~23,9 kb que contiene los exones 2-7 del gen de CD47 humano (Figura 2). El vector de transformación contenía, de 5' a 3', un brazo de homología en 5' que contiene ~39 kb de ADN genómico de ratón del clon de BAC RP23-230L20, ~29,3 kb de ADN genómico humano del clon de BAC RP11-69A17 (que contiene los exones 2-7 de un gen de CD47 humano), un casete de neomicina autoeliminable flanqueado por sitios loxP, ~98,8 kb de ADN genómico de ratón del clon de BAC RP23-230L20. Después de la recombinación homóloga en las células bacterianas con el vector de transformación descrito anteriormente, se creó un clon de BAC RP23-230L20 modificado que resultó en un gen de CD47 humanizado que contenía una UTR 5' de ratón, un exón 1 de ratón, los exones humanos 2-7, los exones de ratón 8-9 y una UTR 3' de ratón. Las secuencias de proteínas de cuatro isoformas proyectadas de corte y empalme alternativos de CD47 humanizado se proporcionan en la Tabla 3 que indica los aminoácidos de ratón y humanos resultantes, codificados por el ADN de ratón y humano, respectivamente.
El clon de BAC modificado descrito anteriormente se utilizó para la electroporación de F1H4 (50 % 129/S6/SvEv/Tac, 50 % C57BL/6NTac; Auerbach, W. y otros (2000) Biotechniques 29(5):1024-8, 1030, 1032) células madre embrionarias (ES) de ratón para crear células ES modificadas que comprenden un gen de CD47 endógeno que se humaniza a partir de los exones 2-7. Las células ES transformadas positivamente que contienen un gen de CD47 humanizado se identificaron mediante un ensayo (Valenzuela y otros, más arriba) que detectó la presencia de las secuencias de CD47 humano (por ejemplo, los exones 2-7) y confirmó la pérdida y/o retención de las secuencias de CD47 de ratón (por ejemplo, los exones 1, 8 y 9 y/o los exones 2-7). La Tabla 4 expone los cebadores y sondas que se usaron para confirmar la humanización de un gen de CD47 endógeno como se describió anteriormente (Figura 3). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente arriba incluyó lo siguiente, que indica la secuencia endógena de ratón corriente arriba del punto de inserción (contenida dentro de los paréntesis más abajo con un sitio de restricción AsiSI en letras cursivas) unida de manera contigua a una secuencia de CD47 humana presente en el punto de inserción: (GCAGACATGA TTACTTCAGA GCTTTCAAAG CTAGATACTG TACCTTGCAT ATTCCAACAC) GCGATCGC ATTTTAAGAT TTTCCATCCT AGTGGAAAGA TATGATTTGA TTCATCCTAT TTACTTTGTA TATTAAAGTA CAGTAGAACC TGCCACTTTT (sec. con núm de ident.: 33). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente abajo en el extremo 5' del casete de resistencia a neomicina autoeliminable incluyó lo siguiente, que indica una secuencia genómica de CD47 humana contigua con la secuencia del casete corriente abajo del punto de inserción (contenida dentro de los paréntesis más abajo con la secuencia loxP en letras cursivas): GGATCCATTT TAAGTAATAG AATAGGATTT TTAATTGTTC CAGTGTTTCT GTGATAGAGC TGTCCTGCAC AGACCTGTTT (CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG) (sec. con núm. de ident.: 34). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente abajo en el extremo 3' del casete de resistencia a neomicina incluyó lo siguiente, que indica la secuencia del casete contigua con la secuencia genómica de ratón en 3' del exón 7 de un gen endógeno de CD47 (contenida dentro de los paréntesis más abajo con la secuencia loxP en letras cursivas): CATGTCTGGA ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGT AACTATAACG GTCCTAAGGT AGCGACTAGC
(ATTAGTATGG AAGGTCCGTC CACTGTCCAG GTTCCTCTTG CGGAGCTCTT TGTCTCTCTG GACTCTGTAT ACACTGCTTG) (sec. con núm de ident.: 35). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente abajo después de la deleción del casete de resistencia a neomicina (76 pb restantes) incluyó lo siguiente, que indica la yuxtaposición de las secuencias genómicas de ratón y humana con la secuencia loxP restante de la secuencia del casete (contenida dentro de los paréntesis más abajo con la secuencia loxP en letras cursivas): GGATCCATTT TAAGTAATAG AATAGGATTT TTAATTGTTC CAGTGTTTCT GTGATAGAGC TGTCCTGCAC AGACCTGTTT
(CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT GCTAGTAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG ACTAGC)ATT AGTATGGAAG GTCCGTCCAC TGTCCAGGTT CCTCTTGCGG AGCTCTTTGT CTCTCTGGAC TCTGTATACA CTGCTTGCAT (sec. con núm de ident.: 36).
Los clones positivos de células ES se usaron después para implantar ratones hembras mediante el uso del método VELOCIMOUSE® (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 7,294,754 y Poueymirou y otros, F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gen-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) para generar una camada de crías que contienen una inserción de los exones 2-7 de un gen de CD47 humano en un gen de CD47 endógeno de un ratón. Los ratones que tienen la humanización de los exones 2-7 de un gen de CD47 endógeno se volvieron a confirmar e identificar mediante la genotipificación del ADN aislado a partir de fragmentos de la cola con el uso de una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela y otros, más arriba) que detectó la presencia de las secuencias del gen de CD47 humano. Las crías se genotipifican y las cohortes de animales heterocigotos para la construcción génica del CD47 humanizado se seleccionan para su caracterización.
TABLA 4
Nombre Iniciador Secuencia (5’-3’)
Directo T GCAGAAGTCACT AGGAGGAAT (sec. con núm. de ident.:21) Sonda (sec. con núm. de ident.:22)
TCAGTCAACTTCTTCTGGGTTGTTT
7190mTU
CC
Inverso GT GCCAGACT CACTTTCT AT CCA (sec. con núm. de ident.:23) Directo TGCTG CCAAT ATACGGCTTCTG (sec. con núm. de ident.:24) Sonda (sec. con núm. de ident.:25)
C A GCT CT C AT A GCC A A CT AT GGTG
7190mTD
CC
Inverso T CAAGCAGAGCCTGGTTATCTG (sec. con núm. de ident.:26) Directo GTCGT CATT CCAT GCTTT GTT AC (sec. con núm. de ident.:27) Sonda (sec. con núm. de ident.:28)
TGGA GG CA CA A A A CA CTA CTGA A G
7190hTU
TATACG
Inverso GGACAGT G GACTTGTTTAGAGC (sec. con núm. de ident.:29) Directo GGCTT GGT GGCTGATTGTT CT sec. con núm. de ident.:30 Sonda (Sec. con núm. de ident.:31)
AGCACCCAAACTGATATGCCTGTA
7190hTD
TTTG
Inverso TGGGAACTGGTGTTTCAAGTCTA (Sec. con núm. de ident.:32)
Ejemplo 2. Expresión de un polipéptido de CD47 humanizado por los glóbulos rojos de ratón.
Este Ejemplo demuestra que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados de manera que contengan un gen de CD47 humanizado de conformidad con el Ejemplo 1 pueden usarse para el tamizaje de moduladores de CD47 (por ejemplo, anticuerpos anti-CD47) y la determinación de diversas características tales como, por ejemplo, farmacocinética y perfiles de seguridad. En este Ejemplo, se realiza un tamizaje de varios anticuerpos anti-CD47 en glóbulos rojos de ratón (RBC) aislados a partir de roedores obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 1, dichos roedores expresan un polipéptido de CD47 humanizado como se describe en la presente.
En resumen, se transfirieron 2 mL de sangre completa de ratones con CD47 humanizado (n=2) a un tubo de 15 mL y centrifugaron a 200xg durante 10 minutos a 4 °C. El plasma y la capa leucocitaria se aspiraron y después se añadió 15 mL de PBS y las células se mezclaron suavemente. La mezcla se centrifugó de nuevo a 200xg durante cinco minutos a 4 °C. El sobrenadante se aspiró y las células se lavaron dos veces adicionales. Los RBC sedimentados se resuspendieron hasta un volumen final en 10 ml de PBS. Los RBC resuspendidos se centrifugaron por última vez a 200xg durante 10 minutos a 4 °C. El volumen de los RBC empaquetados se estimó en 0,5 mL y se diluyó hasta una concentración de 0,5 % con PBS (0,5 ml de RBC empaquetados/100 ml de PBS). La concentración real de RBC se determinó con un contador de células Cellometer Auto t 4 (1,5 x 107/ml; Nexcelom Bioscience).
Ochenta (80) pl de 0, 5 % de RBC de ratón se añadieron a cada pocillo de una placa de fondo en V de 96 pocillos. Los anticuerpos anti-CD47 se añadieron en cada pocillo (20 pl a 33 nM). La placa se golpeó suavemente para mezclar y se incubó en hielo durante 30 minutos. La placa se lavó después dos veces con tampón de tinción (PBS con 2 % de FBS). El anticuerpo secundario Fab-488 (anticuerpo de ratón anti-IgG humana AffiniPure conjugado con Alexa Fluor 488, específico del fragmento F(ab')2, Jackson Immuno Research) se añadió a cada pocillo en una concentración de 10 pg/ml. La placa se incubó de nuevo en hielo durante 30 minutos, seguido de un lavado una vez con tampón de tinción. Las células en cada pocillo se resuspendieron en 200 pL de tampón de tinción y se filtraron a través de una placa con filtro de 96 pocillos. Las células en la placa se analizaron mediante el uso del sistema ACCURI™ C6 de BD (BD Biosciences). Los resultados ilustrativos se muestran en la Figura 4. La media de la intensidad de fluorescencia (MFI) por encima del control de isotipo para cada anticuerpo de prueba se muestra en la Tabla 5.
TABLA 5
Anticuerpo MFI Veces por encima del control de isotipo
Ac A, hIgG4s 28898 258
Ac B, hIgG4s 27545 246
Ac C, hIgG4s 24620 220
Ac D, hIgG1 29882 267
Ac E, hIgG4 33423 298
Control, hIgG4s 112 -Control, hIgG4 112 - hIgG4s: IgG4 humana con región Fc modificada que tiene reducción de la función efectora
Como se muestra en la Figura 4, todos los anticuerpos anti-CD47 se unieron a los RBC de ratones con CD47 humanizado. En conjunto, este Ejemplo demuestra que (1) los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados genéticamente para contener un gen de CD47 humanizado como se describe en la presente expresan un polipéptido de CD47 humanizado en la superficie de las células (por ejemplo, RBC) del animal no humano, y (2) tales células son útiles para el tamizaje de moduladores de CD47 (por ejemplo, anticuerpos para CD47) y determinar los perfiles farmacocinéticos de tales moduladores.
Ejemplo 3. Hemaglutinación de glóbulos rojos de ratón que expresan un polipéptido de CD47 humanizado.
Este Ejemplo demuestra adicionalmente que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados para contener un gen de CD47 humanizado de acuerdo con el Ejemplo 1 pueden usarse en diversos ensayos (por ejemplo, ensayo de hemaglutinación) para el tamizaje de moduladores de CD47 (por ejemplo, anticuerpos anti-CD47) y para determinar diversas características tales como, por ejemplo, farmacocinética y perfiles de seguridad. En este Ejemplo, se realiza un tamizaje de varios anticuerpos anti-CD47 en glóbulos rojos de ratón (RBC) que expresan un polipéptido de CD47 humanizado como se describe en la presente para determinar la concentración de anticuerpos que promueve la hemaglutinación.
En resumen, los RBC de ratones de tipo silvestre y con CD47 humanizado (n = 2) se prepararon como se describió en el Ejemplo 2. Veinte (20) pl de anticuerpo anti-CD47 (en una dilución en serie de 5 veces) se añadieron a los pocillos 1-12 en una placa de fondo en V de 96 pocillos seguido de la adición de 80 pl de 0, 5 % de RBC de ratón a todos los pocillos de la placa. Las placas se golpearon suavemente para mezclar y se incubaron a temperatura ambiente (24-27°C) durante 30 minutos. El criterio de valoración de aglutinación se observó visualmente (es decir, los RBC se depositan en el fondo en las muestras negativas, mientras que en las muestras positivas los RBC se aglutinan). Los resultados ilustrativos se muestran en la Figura 5, con los cuadros para delinear los pocillos que muestran hemaglutinación.
Como se muestra en La Figura 5, solo la lectina provocó aglutinación en ratones de tipo silvestre. Sin embargo, dos anticuerpos anti-CD47 (Ac E y Ac C) además de la lectina indujeron aglutinación en los RBC de dos roedores con CD47 humanizado obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 1. La concentración a la que estos dos anticuerpos indujeron aglutinación comenzó desde los 11 nM. En conjunto, este Ejemplo demuestra que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados genéticamente para contener un gen de CD47 humanizado como se describe en la presente pueden usarse para evaluar una o más propiedades (por ejemplo, hemaglutinación) de moduladores de CD47 (por ejemplo, anticuerpos para CD47).
Ejemplo 4. Eliminación farmacocinética de moduladores de CD47 en roedores con CD47 humanizado.
Este Ejemplo ilustra un método para evaluar la eliminación farmacocinética de moduladores de CD47 (por ejemplo, anticuerpos anti-CD47) en animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados para contener un gen de c D47 humanizado de acuerdo con el Ejemplo 1. En este Ejemplo, los roedores de tipo silvestre y con CD47 humanizado (por ejemplo, ratones) se administraron con anticuerpos anti-CD47 y los niveles de anticuerpos en suero se determinaron mediante el uso de un ensayo ELISA.
En resumen, los ratones de tipo silvestre (n=5) u homocigotos para CD47 humanizado (n=5; como se describió anteriormente) se administraron con cuatro anticuerpos anti-CD47 (Ac F, Ac G, Ac H y Ac I) y un anticuerpo control de isotipo IgG4s (IgG4s). El fondo genético de los ratones fue 75 % CD57BL/6 y 25 % 129Sv. Cada anticuerpo se analizó en cinco roedores con CD47 humanizado. Todos los anticuerpos se administraron por vía subcutánea a una dosis de 50 mg/kg. Una extracción de sangre previa se recolectó un día antes de la administración de anticuerpos (día 0). Las extracciones posteriores a la inyección se recolectaron a las 6 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 7 días, 10 días y 14 días. Las fracciones séricas de las extracciones de sangre se separaron y se sometieron a análisis de anticuerpos humanos totales mediante el uso de un inmunoensayo ELISA.
En resumen, las placas de 96 pocillos se recubrieron con un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch) para capturar los anticuerpos humanos analizados en los sueros, y después los anticuerpos unidos a la placa se detectaron mediante el uso de un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch) y el sustrato TMB (BD Pharmingen). Las muestras de suero se prepararon en diluciones en serie de seis dosis y los estándares de referencia de los anticuerpos respectivos se prepararon en diluciones en serie de 12 dosis. Las concentraciones de los anticuerpos como fármacos en los sueros se calcularon en base a la curva patrón de referencia generada mediante el uso del programa informático Graphpad Prism. Los resultados ilustrativos se muestran en la Figura 6 y la Tabla 6.
Los datos demostraron que los anticuerpos administrados a los ratones de tipo silvestre y humanizados como se describe en la presente se toleraron bien. En conjunto, este Ejemplo demuestra que los animales no humanos de la presente invención pueden usarse para evaluar una o más propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a CD47 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD47) tales como, por ejemplo, los niveles del fármaco circulante. Además, los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse para evaluar la toxicidad de un fármaco dirigido a CD47 mediante la determinación de los efectos adversos después de la administración.
TABLA 6
Concentraciones de anticuerpos en suero (pg/ml ± SEM)
Anticuerpo 6 horas Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Día 7 Dia 10 AbF 116,7±14,0 196,4±10,6 96,0±13,3 24,7±7,0 3,7±0,42 <0,35 <0,35 AbG 115,0±22,1 198,8±23,4 118,4+20,9 48,3±16,0 2,9±1,97 <0,35 <0,35 Ab H 64,5±3,85 108,0±5,13 32,0±6,08 1,0±0,2 0,4±0,03 0,06±0,03 0,05±0,02 Abl 51,1±16,6 115,2±14,8 63,8±8,3 11,1±4,2 0,5±0,1 0,1 ±0,02 <0,35 Control de Isotipo lgG4s 458,2±34,4 702,5±32,3 616,6±27,0 567,1 ±39,5 488,9±45,0 357,0±51,1 307,6±61,1
Ejemplo 5. Perfiles de farmacocinética de moduladores de CD47 en roedores con CD47/SIRPa humanizados.
Este Ejemplo ilustra un método para evaluar la eliminación farmacocinética de moduladores de CD47 (por ejemplo, anticuerpos anti-CD47) en animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados para contener genes de c D47 (de acuerdo con el Ejemplo 1) y SIRPa humanizados. En particular, los roedores con CD47 humanizado descritos en la presente se modificaron para contener además un gen de SIRPa humanizado que contiene una porción endógena y una porción humana, dicha porción humana codifica el dominio extracelular de una proteína SIRPa humana (por ejemplo, los aminoácidos 28-362 de una proteína SIRPa humana) y dicha porción endógena codifica un dominio intracelular de una proteína SIRPa endógena (por ejemplo, los aminoácidos que codifican las porciones transmembrana e intracelular de una proteína SIRPa murina) como se describe en el documento núm. PCT/US14/56910, presentado el 23 de septiembre de 2014. Los ratones CD47/SIRPa doblemente humanizados se obtuvieron al cruzar ratones con SIRPa humanizado con ratones con CD47 humanizado. En este Ejemplo, los roedores CD47/SIRPa doblemente humanizados (por ejemplo, ratones) se administraron con diversos anticuerpos anti-CD47 y se determinaron sus correspondientes perfiles farmacocinéticos.
En resumen, los grupos de ratones de tipo silvestre (n=5) y homocigotos para los genes humanizados de CD47 y SIRPa (CD47hu/huSlRPahu/hu; n=5 por grupo) se administraron con anticuerpos anti-CD47 seleccionados y un anticuerpo control de isotipo IgG4 (hIgG4s). El fondo genético de los ratones fue 75 % CD57BL/6 y 25 % 129Sv. Todos los anticuerpos se administraron en una única dosis subcutánea de 50 mg/kg. Una extracción de sangre previa se recolectó un día antes de la administración de anticuerpos (día 0). Las extracciones de sangre posteriores a la inyección se recolectaron a las 6 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 7 días y 10 días. Las fracciones séricas de las muestras de sangre se separaron y se sometieron a análisis de anticuerpos humanos totales mediante el uso de un inmunoensayo ELISA (descrito anteriormente). Adicionalmente, se midieron los niveles de hematocrito a las 6 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 7 días y 10 días y se realizó una prueba de orina en caso de ser necesario (a las 6 horas y cuando el color de la orina se desvió del color amarillo) para determinar los conteos de glóbulos rojos. Los resultados ilustrativos se muestran en las Figuras 7-9.
Como se muestra en las Figuras 7 y 8, todos los anticuerpos anti-CD47 demostraron eliminación mediada por el objetivo en ratones CD47hu/huSIRPahu/hu y, en particular, varios demostraron perfiles farmacocinéticos similares. Además, una versión monovalente de un anticuerpo anti-CD47 (Ac F) demostró mayor biodisponibilidad que su equivalente bivalente (Figura 8). Los inventores observaron perfiles farmacocinéticos similares para los anticuerpos entre múltiples experimentos con animales con CD47 humanizado y doblemente humanizados (es decir, ratones CD47hu/huSIRPahu/hu).
El Ac J tuvo menos efecto sobre los niveles de hematocrito que otros anticuerpos anti-CD47 analizados (Ac F, Ac G, Ac I, etc.) y cambios comparables en los niveles de hematocrito con respecto al control (hIgG4s) en ratones CD47hu/huSIRPahu/hu. Las mediciones del hematocrito en los días 2-4 mostraron la mayor caída a partir de un intervalo normal (~38,5-45,1 %), lo cual incluyó a los grupos administrados con los Ac F, G e I. En particular, una forma monovalente del Ac F demostró un efecto de disminución retardada en el hematocrito en comparación con otros anticuerpos analizados. Los inventores razonaron que las diferencias en los niveles de hematocrito entre los diversos grupos de tratamiento podrían atribuirse a una diferencia en el epítopo reconocido por los diversos anticuerpos. Además, los ratones dosificados con anticuerpos anti-CD47 seleccionados demostraron pruebas positivas de la varilla de orina para el hemo a las 6 horas. Por ejemplo, cada uno de los grupos de tratamiento con Ac J y Ac F tuvo un ratón positivo para el hemo en el día 1, mientras que en todos los otros puntos de tiempo fueron negativos. No se observó una pérdida significativa del peso (>20 %) en ningún grupo de tratamiento.
En conjunto, este Ejemplo demuestra que los animales no humanos de la presente invención proporcionan un sistema in vivo para evaluar las propiedades farmacocinéticas y/o los perfiles de uno o más fármacos dirigidos a CD47 (por ejemplo, uno o más anticuerpos anti-CD47) tales como, por ejemplo, niveles del fármaco circulante. Además, los animales no humanos como se describen en la presente, modificados genéticamente para contener además otros genes humanizados (por ejemplo, SIRPa humanizado) pueden usarse para evaluar la eliminación mediada por el objetivo de uno o más fármacos dirigidos a CD47.
Equivalentes
Habiendo descrito así diversos aspectos de al menos una modalidad de esta invención, los expertos en la técnica apreciarán que pueden idear fácilmente diversas alteraciones, modificaciones, y mejoras. Tales alteraciones, modificaciones, y mejoras están destinadas a ser parte de esta descripción y están destinadas a estar dentro del alcance de la invención. En consecuencia, la descripción y figuras anteriores son solo a manera de ejemplo y la invención se describe en detalle en las reivindicaciones que siguen.
El uso de términos ordinales tales como "primero", "segundo", "tercero", etcétera, en las reivindicaciones para modificar un elemento de reivindicación no connota por sí mismo una prioridad, precedencia, u orden de un elemento de reivindicación sobre otro o el orden temporal en el que se realizaron los actos de un método, sino que se usan simplemente como marcadores para distinguir un elemento de reivindicación con un nombre determinado de otro elemento con el mismo nombre (excepto por el uso del término ordinal) para distinguir los elementos de reivindicación.
Debe entenderse que los artículos "un" y "una" como se usan en la presente descripción y en las reivindicaciones incluyen los referentes plurales, a menos que se indique claramente lo contrario. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechos si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean, o son relevantes de cualquier otra manera en un determinado producto o proceso a menos que se indique lo contrario o sea evidente de cualquier otra manera a partir del contexto. La invención incluye modalidades en las que exactamente un miembro del grupo está presente, se emplea, o es relevante de cualquier otra manera en un determinado producto o proceso. La invención incluye, además, modalidades en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean, o son relevantes de cualquier otra manera en un determinado producto o proceso. Además, debe entenderse que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etcétera, de una o más de las reivindicaciones enumeradas se introducen en otra reivindicación dependiente de la misma reivindicación base (o, según sea relevante, cualquier otra reivindicación) a menos que se indique de cualquier otra manera o a menos que sea evidente para un experto en la técnica que surja una contradicción o inconsistencia. Cuando los elementos se presentan como listas, (por ejemplo, en un grupo Markush o formato similar) debe entenderse que cada subgrupo de los elementos también se describe, y cualquier elemento(s) puede eliminarse del grupo. Debe entenderse que, en general, cuando la invención, o aspectos de la invención, se denomina(n) como que comprenden elementos, características particulares, etcétera, determinadas modalidades de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente en, tales elementos, características, etcétera. Con fines de simplicidad esas modalidades no se han expuesto específicamente de manera detallada en todos los casos en la presente. Debe entenderse, además, que ninguna modalidad o aspecto de la invención puede excluirse explícitamente de las reivindicaciones, independientemente de si la exclusión específica se menciona en la especificación.
Los expertos en la técnica apreciarán estándares de desviación o error típicos atribuibles a valores obtenidos en ensayos u otros procesos descritos en la presente.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un roedor cuyo genoma comprende un gen de CD47 humanizado, en donde el gen de CD47 humanizado comprende el exón 1 de un gen de CD47 endógeno de roedor, los exones 2-7 de un gen de CD47 humano, y los exones corriente abajo del exón 7 del gen de CD47 endógeno de roedor, en donde el gen de CD47 humanizado se une operativamente a un promotor de CD47 endógeno de roedor.
2. El roedor de la reivindicación 1, en donde el roedor comprende además un gen de SIRPa que codifica un polipéptido de SIRPa que comprende el dominio extracelular de un polipéptido de SIRPa humano y el dominio intracelular de un polipéptido de SIRPa endógeno de roedor, en donde el polipéptido de SIRPa interactúa con CD47 y opcionalmente el gen de SIRPa comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de un gen de SIRPa endógeno de roedor y los exones 2-4 de un gen de SIRPa humano.
3. El roedor de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el roedor es un ratón o una rata.
4. Una célula o tejido aislado de roedor cuyo genoma comprende un gen de CD47 humanizado, en donde el gen de CD47 humanizado comprende el exón 1 de un gen de CD47 endógeno de roedor, los exones 2-7 de un gen de CD47 humano, y los exones corriente abajo del exón 7 del gen de CD47 endógeno de roedor, en donde el gen de CD47 humanizado se une operativamente a un promotor de CD47 endógeno de roedor, y opcionalmente la célula o tejido de roedor es célula de ratón o tejido de ratón, o una célula de rata o tejido de rata.
5. La célula de roedor de la reivindicación 4, en donde dicha célula es una la célula madre embrionaria de roedor, y opcionalmente la célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón o de rata.
6. Un embrión de roedor generado a partir de la célula madre embrionaria de conformidad con la reivindicación 5.
7. Un método para proporcionar un roedor cuyo genoma comprende un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido de CD47 humano unido a una porción intracelular de un polipéptido de CD47 endógeno, el método que comprende modificar el genoma de un roedor de manera que comprenda un gen de CD47 humanizado, en donde el gen de CD47 humanizado comprende el exón 1 de un gen de CD47 endógeno de roedor, los exones 2-7 de un gen de CD47 humano, y los exones corriente abajo del exón 7 del gen de CD47 endógeno de roedor, en donde el gen de CD47 humanizado se une operativamente a un promotor de CD47 endógeno de roedor, que proporciona así dicho roedor.
8. Un método de obtener un roedor que expresa un polipéptido de CD47 a partir de un locus de CD47 endógeno, en donde el polipéptido de CD47 comprende una secuencia humana, el método que comprende:
(a) insertar un fragmento genómico en un locus de CD47 endógeno de roedor en una célula madre embrionaria de roedor, dicho fragmento genómico que comprende los exones 2-7 de un gen de CD47 humano, de esta manera forma el gen de CD47 humanizado en el locus de CD47 endógeno de roedor; (b) obtener una célula madre embrionaria de roedor que comprende el gen de CD47 humanizado de (a); y (c) crear un roedor mediante el uso de la célula madre embrionaria de roedor de (b).
9. El método de conformidad con la reivindicación 7 u 8, en donde el roedor es un ratón o una rata.
10. Un método para evaluar el injerto de células humanas, en donde dicho método comprende evaluar el injerto de células humanas en un roedor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde opcionalmente las células humanas son células madre hematopoyéticas.
11. Un método para evaluar la eficacia terapéutica de un fármaco que se dirige a células humanas, el método comprende:
administrar un candidato a fármaco a un roedor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el cual se han trasplantado una o más células humanas; y
controlar las células humanas en el ratón para determinar la eficacia terapéutica del candidato a fármaco.
12. Un método para evaluar si el modulador candidato de una proteína CD47 humana induce aglutinación de los glóbulos rojos, dicho método que comprende
incubar los glóbulos rojos aislados de un roedor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en presencia del modulador candidato; y
evaluar si el modulador candidato induce la aglutinación de los glóbulos rojos.
ES15813960T 2014-12-05 2015-11-25 Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado Active ES2716735T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462087992P 2014-12-05 2014-12-05
PCT/US2015/062614 WO2016089692A1 (en) 2014-12-05 2015-11-25 Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2716735T3 true ES2716735T3 (es) 2019-06-14

Family

ID=54979926

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18207075T Active ES2870462T3 (es) 2014-12-05 2015-11-25 Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado
ES20215046T Active ES2969389T3 (es) 2014-12-05 2015-11-25 Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado
ES15813960T Active ES2716735T3 (es) 2014-12-05 2015-11-25 Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18207075T Active ES2870462T3 (es) 2014-12-05 2015-11-25 Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado
ES20215046T Active ES2969389T3 (es) 2014-12-05 2015-11-25 Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado

Country Status (29)

Country Link
US (5) US20160345549A1 (es)
EP (4) EP3466255B1 (es)
JP (2) JP6730277B2 (es)
KR (3) KR102617691B1 (es)
CN (2) CN107205368B (es)
AR (1) AR102888A1 (es)
AU (2) AU2015355328B2 (es)
BR (1) BR112017010490A2 (es)
CA (1) CA2967834C (es)
CY (2) CY1121547T1 (es)
DK (3) DK3086637T3 (es)
ES (3) ES2870462T3 (es)
FI (1) FI3850946T3 (es)
HR (3) HRP20190634T1 (es)
HU (3) HUE054661T2 (es)
IL (2) IL286403B2 (es)
LT (3) LT3086637T (es)
MX (1) MX2017007293A (es)
NZ (2) NZ731471A (es)
PL (3) PL3850946T3 (es)
PT (3) PT3466255T (es)
RS (3) RS61774B1 (es)
RU (1) RU2728412C2 (es)
SG (2) SG10202103050YA (es)
SI (3) SI3466255T1 (es)
SM (3) SMT201900178T1 (es)
TR (1) TR201903891T4 (es)
TW (1) TWI681053B (es)
WO (1) WO2016089692A1 (es)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102617691B1 (ko) 2014-12-05 2023-12-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 분화 클러스터 47 유전자를 가진 비인간 동물
NZ731954A (en) 2014-12-09 2024-11-29 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 274 gene
WO2016154299A1 (en) * 2015-03-24 2016-09-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Genetic modification of pigs for xenotransplantation
RU2725737C2 (ru) 2015-05-29 2020-07-03 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Животные, отличные от человека, с нарушением в локусе c9orf72
AU2016358101B2 (en) 2015-11-20 2022-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized Lymphocyte-activation gene 3
CN108779159B (zh) 2016-02-04 2022-12-30 瑞泽恩制药公司 具有经改造的angptl8基因的非人动物
JP6980674B2 (ja) 2016-02-29 2021-12-15 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. ヒト化ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有する齧歯類
EP4056031A1 (en) * 2016-08-11 2022-09-14 The Jackson Laboratory Methods and compositions relating to improved human red blood cell survival in genetically modified immunodeficient non-human animals
WO2018041121A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric ctla-4
CN107815468B (zh) 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
WO2018041119A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric ox40
CN107815465B (zh) * 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CA3038548A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a hexanucleotide repeat expansion in a c9orf72 locus
CN108467873B (zh) 2017-03-17 2020-03-13 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 一种cd132基因缺失的免疫缺陷动物模型的制备方法及应用
WO2018177441A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Beijing Biocytogen Co., Ltd GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα
CN108588126B (zh) * 2017-03-31 2020-04-10 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
US20210161971A1 (en) * 2017-06-12 2021-06-03 Sinai Health System Allograft tolerance without the need for systemic immune suppression
JP7262440B2 (ja) 2017-08-02 2023-04-21 フェインズ セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｃｄ４７抗体及びその使用
IL274740B2 (en) * 2017-11-30 2024-06-01 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized trkb locus
JP7328243B2 (ja) * 2018-03-26 2023-08-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類
HRP20240999T1 (hr) 2018-07-16 2024-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavački modeli bolesti ditra i njihova upotreba
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
US11690362B2 (en) 2018-12-20 2023-07-04 Regeneran Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
CN114164177A (zh) * 2019-01-17 2022-03-11 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化转基因动物
CN112430621B (zh) * 2019-08-09 2022-09-27 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il2ra基因人源化的非人动物的构建方法及应用
WO2021043290A1 (en) * 2019-09-06 2021-03-11 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric tnfr2
WO2021136537A1 (en) * 2019-12-31 2021-07-08 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. GENETICALLY MODIFIED IMMUNODEFICIENT NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα/CD47
CN112080522A (zh) * 2020-09-15 2020-12-15 广东药康生物科技有限公司 一种cd47人源化小鼠模型的构建方法
CN112725379B (zh) * 2021-01-27 2024-08-13 上海南方模式生物科技股份有限公司 人源化cd40基因改造动物模型的构建方法及应用
WO2023046061A1 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric trop2
WO2024020057A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified animal model and its use to model the human immune system
WO2025171307A1 (en) 2024-02-08 2025-08-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US8101719B2 (en) * 2003-11-11 2012-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized anti-CD47 antibody
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
US20070113297A1 (en) * 2005-09-13 2007-05-17 Yongguang Yang Methods and compositions for inhibition of immune responses
SG174053A1 (en) * 2006-09-01 2011-09-29 Therapeutic Human Polyclonals Inc Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals
WO2009039244A2 (en) * 2007-09-18 2009-03-26 Genizon Biosciences Inc. Genemap of the human genes associated with crohn's disease
CN101668387A (zh) 2008-09-02 2010-03-10 鸿富锦精密工业（深圳）有限公司 印刷电路板
CN102281758B (zh) * 2009-01-16 2014-12-10 公益财团法人实验动物中央研究所 移植了人肝细胞的小鼠
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
WO2011020014A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Promoter-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette
US8758750B2 (en) * 2009-09-15 2014-06-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synergistic anti-CD47 therapy for hematologic cancers
CA3040377C (en) 2009-10-06 2025-12-30 Yale University Genetically modified mice and engraftment comprising the knock-in of a human thrombopoietin (tpo) gene
ES3040596T3 (en) 2011-02-15 2025-11-03 Regeneron Pharma Humanized m-csf mice and uses thereof
US20140242095A1 (en) * 2011-10-19 2014-08-28 University Health Network Antibodies and antibody fragments targeting sirp-alpha and their use in treating hematologic cancers
MY186903A (en) 2011-10-28 2021-08-26 Regeneron Pharma Humanized il-6 and il-6 receptor
RS56656B1 (sr) 2011-10-28 2018-03-30 Regeneron Pharma Miševi sa genetski modifikovanim glavnim kompleksom gena tkivne podudarnosti
RS56330B1 (sr) 2011-10-28 2017-12-29 Regeneron Pharma Genetski modifikovani miševi sa ekspresijom himernih molekula klase ii glavnog kompleksa histokompatibilnosti (mhc)
EP2644027A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-02 Institut Pasteur Transgenic immunodefficient mouse expressing human SIRPalpha.
US8962913B2 (en) 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
KR102287541B1 (ko) 2012-09-07 2021-08-10 예일 유니버시티 유전적으로 변형된 비-인간 동물 및 이것들의 사용 방법
EP4389764B1 (en) 2012-11-05 2026-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified rodents and methods of use thereof
HK1216647A1 (zh) * 2012-12-12 2016-11-25 Vasculox Inc. 治疗性cd47抗体
KR20240147707A (ko) 2013-02-20 2024-10-08 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 사람화된 ｔ-세포 보조-수용체를 발현하는 마우스
CN110192541B (zh) 2013-02-22 2022-02-18 瑞泽恩制药公司 表达人源化主要组织相容性复合物的小鼠
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
DK3175706T3 (en) 2013-09-23 2019-03-04 Regeneron Pharma Non-human animals with a humanized signal regulatory protein gene
SMT201900177T1 (it) 2013-10-15 2019-05-10 Regeneron Pharma Animali con il-15 umanizzata
SG10201811701YA (en) 2013-11-19 2019-01-30 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized a proliferation-inducing ligand gene
CN105792646B (zh) 2013-11-19 2018-03-02 瑞泽恩制药公司 具有人源化的b细胞活化因子基因的非人动物
ES2794942T3 (es) 2014-04-08 2020-11-19 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen receptores Fc-gamma humanizados
NO2785538T3 (es) 2014-05-07 2018-08-04
KR20250096864A (ko) 2014-05-19 2025-06-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간 epo를 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물
HUE048677T2 (hu) 2014-06-19 2020-07-28 Regeneron Pharma Humanizált programozott sejthalál 1 génnel rendelkezõ nem-humán állatok
KR20240055876A (ko) 2014-11-24 2024-04-29 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 cd3 복합체를 발현하는 비인간 동물
KR102617691B1 (ko) 2014-12-05 2023-12-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 분화 클러스터 47 유전자를 가진 비인간 동물

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20190634T1 (hr) 2019-08-09
KR102313073B1 (ko) 2021-10-18
US10015953B2 (en) 2018-07-10
KR20210127773A (ko) 2021-10-22
DK3850946T3 (da) 2024-01-08
CN112342197A (zh) 2021-02-09
SI3086637T1 (sl) 2019-04-30
PL3086637T3 (pl) 2019-09-30
SG10202103050YA (en) 2021-05-28
LT3086637T (lt) 2019-04-10
DK3466255T3 (da) 2021-05-03
EP4296278A3 (en) 2024-03-27
RU2017123357A (ru) 2019-01-09
EP3466255B1 (en) 2021-02-17
NZ731471A (en) 2021-12-24
PL3466255T3 (pl) 2021-08-09
AR102888A1 (es) 2017-03-29
TWI681053B (zh) 2020-01-01
RU2017123357A3 (es) 2019-06-03
CN107205368B (zh) 2020-11-17
KR102508175B1 (ko) 2023-03-09
ES2870462T3 (es) 2021-10-27
SMT202300482T1 (it) 2024-01-10
HUE064960T2 (hu) 2024-04-28
SI3850946T1 (sl) 2024-02-29
CY1124089T1 (el) 2022-05-27
IL286403A (en) 2021-10-31
SMT202100281T1 (it) 2021-07-12
JP6730277B2 (ja) 2020-07-29
HRP20210662T1 (hr) 2021-05-28
CY1121547T1 (el) 2020-05-29
US12389889B2 (en) 2025-08-19
DK3086637T3 (en) 2019-04-08
EP4296278A2 (en) 2023-12-27
RU2728412C2 (ru) 2020-07-29
PT3466255T (pt) 2021-05-10
IL252019A0 (en) 2017-06-29
AU2015355328B2 (en) 2022-03-10
CN112342197B (zh) 2025-02-18
US20240138384A1 (en) 2024-05-02
FI3850946T3 (fi) 2023-12-28
KR102617691B1 (ko) 2023-12-27
MX2017007293A (es) 2018-03-12
TR201903891T4 (tr) 2019-04-22
HRP20231707T1 (hr) 2024-03-15
LT3850946T (lt) 2024-01-10
LT3466255T (lt) 2021-05-25
AU2022203787A1 (en) 2022-06-23
KR20170098800A (ko) 2017-08-30
IL286403B1 (en) 2023-06-01
WO2016089692A1 (en) 2016-06-09
HK1225912A1 (en) 2017-09-22
SG11201703463WA (en) 2017-05-30
KR20230038599A (ko) 2023-03-20
TW201629210A (zh) 2016-08-16
AU2015355328A1 (en) 2017-05-18
IL252019B (en) 2021-10-31
JP7089554B2 (ja) 2022-06-22
NZ769992A (en) 2024-11-29
EP3466255A1 (en) 2019-04-10
JP2018500012A (ja) 2018-01-11
IL286403B2 (en) 2023-10-01
US10939673B2 (en) 2021-03-09
SI3466255T1 (sl) 2021-07-30
AU2022203787B2 (en) 2025-01-30
ES2969389T3 (es) 2024-05-17
HUE054661T2 (hu) 2021-09-28
EP3086637A1 (en) 2016-11-02
CN107205368A (zh) 2017-09-26
US20160345549A1 (en) 2016-12-01
PL3850946T3 (pl) 2024-03-11
PT3086637T (pt) 2019-03-26
EP3850946A1 (en) 2021-07-21
DK3850946T5 (da) 2024-08-19
PT3850946T (pt) 2024-01-02
BR112017010490A2 (pt) 2018-04-03
RS64989B1 (sr) 2024-01-31
US20160157470A1 (en) 2016-06-09
CA2967834C (en) 2024-01-16
CA2967834A1 (en) 2016-06-09
RS58536B1 (sr) 2019-04-30
HUE043132T2 (hu) 2019-07-29
RS61774B1 (sr) 2021-05-31
US11910788B2 (en) 2024-02-27
US20180249689A1 (en) 2018-09-06
EP3086637B1 (en) 2019-01-02
JP2020168016A (ja) 2020-10-15
EP3850946B1 (en) 2023-09-27
SMT201900178T1 (it) 2019-05-10
US20210161112A1 (en) 2021-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2716735T3 (es) Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado
ES2624614T3 (es) Animales no humanos que tienen un gen humanizado de una proteína reguladora de señales
ES2982515T3 (es) Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 274 humanizado
CN106604635A (zh) 具有人源化程序性细胞死亡1基因的非人动物
HK40054102B (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK40007070B (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK40007070A (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK40096160A (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK40054102A (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK1225912B (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene