RS64989B1 - Životinje koje nisu čovek a koje imaju humanizovani klaster diferencijacije 47 gena - Google Patents

Životinje koje nisu čovek a koje imaju humanizovani klaster diferencijacije 47 gena

Info

Publication number
RS64989B1
RS64989B1 RS20231251A RSP20231251A RS64989B1 RS 64989 B1 RS64989 B1 RS 64989B1 RS 20231251 A RS20231251 A RS 20231251A RS P20231251 A RSP20231251 A RS P20231251A RS 64989 B1 RS64989 B1 RS 64989B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
gene
rodent
polypeptide
leu
Prior art date
Application number
RS20231251A
Other languages
English (en)
Inventor
Cagan Gurer
Ella Ioffe
Alexander Mujica
Gavin Thurston
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54979926&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS64989(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS64989B1 publication Critical patent/RS64989B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/5055—Cells of the immune system involving macrophages
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Description

Opis pronalaska
UNAKRSNA REFERENCA NA POVEZANE PRIJAVE
Ova prijava polaže pravo na osnovu privremene SAD prijave patenta serijski br.
62/087,992, podnete 5. decembra 2014.
OBLAST PRONALASKA
Terapija raka može se podeliti u četiri glavne kategorije: hemo/radioterapija, hormonska terapija, cilljana terapija i imunoterapija. Intenzivan fokus medicinskog istraživanja i razvoja fokusiran je na ciljanu terapiju i napravljena su značajna poboljšanja, ali rak ostaje glavni izazov za pacijente i industriju zdravstvene zaštite širom sveta. Ovaj veliki izazov je delimično posledica sposobnosti ćelija raka da izbegnu nadzorne mehanizme urođenog i adaptivnog imunološkog sistema, što je delimično rezultat inhibicije fagocitnog klirensa. Trenutno, ne postoji in vivo sistem da bi se optimalno odredio terapeutski potencijal novih terapija protiv raka koje su dizajnirane da aktiviraju fagocitni klirens ćelija raka i određuju molekularne aspekte kako ćelije raka daju inhibitorne signale makrofagima i fagocitnim ćelijama. Takav sistem obezbeđuje izvor za analize fagocitoze i funkcije makrofaga in vivo, i identifikaciju novih terapija raka koje su usmerene na obezbeđivanje antitumorskog okruženja promovisanjem profagocitnih signala imunološkom sistemu.
KRATAK PRIKAZ
Predmetni pronalazak je zasnovan na spoznaji da je poželjno konstruisati ne-humane životinje (životinje koje nisu čovek) da bi se omogućili poboljšani sistemi za identifikaciju i razvoj novih terapeutika za rak. Predmetni pronalazak je, takođe, zasnovan na spoznaji da je poželjno konstruisati ne-humane životinja da bi se omogućilo poboljšano usađivanje humanih hematopoetskih matičnih ćelija. Dalje, predmetni pronalazak je, takođe, zasnovan na prepoznavanju da su ne-humane životinje koje imaju humanizovani CD47 gen i/ili na drugi način eksprimuju, sadrže ili proizvode humani ili humanizovani CD47 polipeptid poželjne, na primer, za upotrebu u identifikaciji i razvoju terapeutika protiv raka, koji prevazilaze sistemsku toksičnost povezanu sa blokadom CD47 i prevazilaze CD47 posredovanu inhibiciju fagocitoze tumorskih ćelija i obezbeđuju efikasniji in vivo sistem za usađivanje humanih hematopoetskih matičnih ćelija koji obezbeđuje povećanje homeostaze šireg broja tipova humanih ćelija. Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje ciljajući vektor nukleinske kiseline, koji sadrži
5’ homologni krak koji sadrži genomsku sekvencu uzvodno od egzona 2 mišjeg CD47 gena,
genomski fragment DNK koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena,
selekcionu kasetu leka i
3’ homologni krak koji sadrži genomsku sekvencu nizvodno od egzona 7
mišjeg CD47 gena,
pri čemu homologni krakovi 5’ i 3’ posreduju u integraciji genomskog fragmenta koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena u mišji CD47 lokus.
Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje glodara čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen,
pri čemu humanizovani CD47 gen kodira humanizovani CD47 polipeptid koji sadrži deo humanog CD47 polipeptida i unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara;
pri čemu deo humanog CD47 polipeptida obuhvata vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, i kodiran je egzonima 2-7 humanog CD47 gena;
pri čemu je unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara kodiran egzonima nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara;
pri čemu je humanizovani CD47 gen operativno vezan za CD47 promotor glodara; i pri čemu genom glodara dalje sadrži jedan ili više humanih ili humanizovanih gena odabranih od SIRPα, IL- 3, M-CSF, GM-CSF i TPO.
Glodar iz predmetnog pronalaska tako ima genom koji sadrži humanizovani CD47 gen koji sadrži genetski materijal dve različite vrste (čoveka i glodara). Humanizovani CD47 gen glodara kodira CD47 polipeptid koji sadrži humane delove i delove glodara, pri čemu su humani delovi i delovi glodara povezani zajedno i formiraju funkcionalni CD47 polipeptid.
Glodar iz predmetnog pronalaska može da sadrži humanizovani CD47 gen koji sadrži endogeni unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara kao što je gore definisano i deo humanog CD47 polipeptida kao što je gore definisano, pri čemu je humanizovani CD47 gen operativno vezan za endogeni CD47 promotor glodara.
Unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara sadrži egzone nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara. Humanizovani CD47 gen može opciono da sadrži egzon 1 CD47 gena glodara. Egzon 1 i egzoni nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara mogu biti najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80% , najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identični odgovarajućem egzonu 1 i egzonima nizvodno od egzona 7 gena CD47 miša koji se pojavljuje u tabeli 3. Egzon 1 i egzoni nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara mogu biti identični odgovarajućem egzonu 1 i egzonima nizvodno od egzona 7 gena CD47 miša koji se pojavljuje u tabeli 3.
Humani deo može da kodira amino-kiseline 16-292 humanog CD47 polipeptida. Humani deo može da kodira amino-kiseline 19-292 humanog CD47 polipeptida. Humani deo može da kodira amino-kiseline 19-141 humanog CD47 polipeptida. Humani deo može da kodira amino-kiseline 19-127 humanog CD47 polipeptida.
Egzoni 2-7 humanog CD47 gena mogu biti najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85% , najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identični odgovarajućim egzonima 2-7 humanog CD47 gena koji se pojavljuje u tabeli 3. Egzoni 2-7 humanog CD47 gena mogu biti identični odgovarajućim egzonima 2-7 humanog CD47 gena koji se pojavljuje u tabeli 3.
Glodar iz predmetnog pronalaska eksprimuje CD47 polipeptid koji sadrži vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida i unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara. CD47 polipeptid može biti preveden u ćeliju glodara sa signalnim peptidom glodara. Signalni peptid glodara može biti signalni peptid miša ili pacova.
CD47 polipeptid može biti eksprimovan iz endogenog CD47 gena glodara.
Unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara može da sadrži intracitoplazmatski rep koji ima sekvencu amino-kiseline koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75% , najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična intracitoplazmatskom repu CD47 polipeptida miša koji se pojavljuje u tabeli 3. Unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara može da sadrži intracitoplazmatski rep koji ima sekvencu amino-kiseline koja je identična intracitoplazmatskom repu mišjeg CD47 polipeptida koji se pojavljuje u tabeli 3.
Vanćelijski domen humanog CD47 polipeptida može da sadrži amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 19-141 humanog CD47 polipeptida. Vanćelijski domen humanog CD47 polipeptida može da sadrži amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 19-127 humanog CD47 polipeptida. Vanćelijski domen humanog CD47 polipeptida može da sadrži sekvencu aminokiseline koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80% , najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična odgovarajućoj sekvenci amino-kiseline vanćelijskog domena humanog CD47 polipeptida koji se pojavljuje u tabeli 3. Vanćelijski domen humanog CD47 polipeptida može da sadrži sekvencu amino-kiseline koja je identična odgovarajućoj sekvenci amino-kiseline vanćelijskog domena humanog CD47 polipeptida koji se pojavljuje u tabeli 3.
Ovde je, takođe, opisan CD47 polipeptid kodiran CD47 genom glodara kao što je ovde opisano. Kodirani CD47 polipeptid može da sadrži sekvencu amino-kiseline koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85 %, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identična SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ili SEQ ID NO: 20. Kodirani CD47 polipeptid može da sadrži sekvencu amino-kiselina koja je identična SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ili SEQ ID NO: 20.
Ovde je, takođe, opisan humanizovani CD47 gen koji sadrži egzone nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara koji su operativno povezani sa egzonima 2-7 humanog CD47 gena. Humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan obuhvata egzone glodara nizvodno od egzona 7 gena CD47 glodara koji kodiraju unutarćelijski deo polipeptida CD47 glodara i humane egzone 2-7 humanog CD47 gena koji kodiraju vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida. Humanizovani CD47 gen može dalje da sadrži egzone glodara koji kodiraju signalni peptid, u celini ili delimično.
Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje izolovanu ćeliju ili tkivo od glodara iz predmetnog pronalaska, pri čemu izolovana ćelija ili tkivo obuhvata humanizovani CD47 gen i jedan ili više humanih ili humanizovanih gena u genomu. Ćelija se može izabrati između dendritske ćelije, limfocita (npr. B ili T ćelije), makrofaga i monocita. Tkivo se može izabrati iz masnog tkiva, bešike, mozga, dojke, koštane srži, oka, srca, creva, bubrega, jetre, pluća, limfnih čvorova, mišića, pankreasa, plazme, seruma, kože, slezine, želuca, timusa, testisa, jajne ćelije i njihove kombinacije.
Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje izolovanu embrionalnu matičnu (ES) ćeliju glodara, čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen,
pri čemu humanizovani CD47 gen kodira humanizovani CD47 polipeptid koji sadrži deo humanog CD47 polipeptida i unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara;
pri čemu deo humanog CD47 polipeptida obuhvata vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, i kodiran je egzonima 2-7 humanog CD47 gena; pri čemu je unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara kodiran egzonima nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara;
pri čemu je humanizovani CD47 gen operativno vezan za CD47 promotor glodara; i pri čemu genom glodara dalje sadrži jedan ili više humanih ili humanizovanih gena izabranih iz SIRPα, IL- 3, M-CSF, GM-CSF i TPO.
Izolovana embrionalna matična ćelija glodara može biti embrionalna matična ćelija miša i može biti iz soja 129, soja C57BL/6 ili soja BALB/c. Izolovana embrionalna matična ćelija glodara može biti embrionalna matična ćelija miša i može biti iz mešavine 129 i C57BL/6 sojeva.
Ovde je, takođe, opisana upotreba izolovane embrionalne matične ćelije glodara kao što je ovde opisano za pravljenje glodara. Izolovana embrionalna matična ćelija glodara može biti embrionalna matična ćelija miša i može se koristiti za pravljenje miša koji sadrži CD47 gen kao što je ovde opisano. Embrionalna matična ćelija glodara može biti embrionalna matična ćelija pacova i može se koristiti za pravljenje pacova koji sadrži CD47 gen kao što je ovde opisano.
Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje embrion glodara koji sadrži embrionalne matične ćelije glodara iz predmetnog pronalaska. Embrion glodara može biti embrion miša. Embrion glodara može biti embrion pacova.
Ovde je, takođe, opisan postupak pravljenja glodara koji eksprimuje CD47 polipeptid iz endogenog CD47 gena, pri čemu polipeptid CD47 sadrži humanu sekvencu, a postupak obuhvata umetanje genomskog fragmenta u endogeni CD47 gen u embrionalnoj matičnoj ćeliji glodara, dati genomski fragment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira deo humanog CD47 polipeptida koji sadrži vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, kodiranog egzonima 2-7 humanog CD47 gena; dobijanje embrionalne matične ćelije glodara koja sadrži endogeni CD47 gen koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira deo humanog CD47 polipeptida; i stvaranje glodara korišćenjem embrionalne matične ćelije glodara koja sadrži datu nukleotidnu sekvencu koja kodira deo humanog CD47 polipeptida.
Humana sekvenca može da sadrži amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 19-141 (ili 19-292) humanog CD47 polipeptida. Humana sekvenca može da sadrži amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 19-127 humanog CD47 polipeptida.
Nukleotidna sekvenca obuhvata egzone 2-7 humanog CD47 gena. Nukleotidna sekvenca može da sadrži jedan ili više selekcionih markera. Nukleotidna sekvenca može da sadrži mesta rekombinacije specifične za mesto.
Postupak može dalje da obuhvata korak ubacivanja genomskog fragmenta u endogeni SIRPα gen embrionalne matične ćelije glodara, a dati genomski fragment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani SIRPα polipeptid u celini ili delimično (npr. kodira vanćelijski deo humanog SIRPα polipeptida). Genomski fragment može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani SIRPα polipeptid u celini ili delimično (npr. kodira vanćelijski deo humanog SIRPα polipeptida) se ubacuje u endogeni SIRPα gen embrionalne matične ćelije glodara pre ubacivanja u endogeni CD47 gen.
Ovde je, takođe, opisano uzgajanje glodara koji sadrži endogeni CD47 gen koji uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira deo humanog CD47 polipeptida koji sadrži najmanje vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, koji su kodirani egzonima 2-7 humanog CD47 gena, sa drugim glodarom, dati drugi glodar ima genom koji sadrži SIRPα gen koji kodira SIRPα polipeptid koji sadrži vanćelijski deo humanog SIRPα polipeptida (npr. amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 28-362 humanog SIRPα polipeptida) i unutarćelijski deo endogenog SIRPα polipeptida.
Ovde je, takođe, opisan postupak obezbeđivanja glodara čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen koji kodira vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, kodiranog egzonima 2-7 humanog CD47 gena, vezan za unutarćelijski deo endogenog CD47 polipeptida, a postupak obuhvata modifikaciju genoma glodara tako da on sadrži humanizovani CD47 gen koji kodira vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida koji su povezani sa unutarćelijskim delom endogenog CD47 polipeptida, čime se obezbeđuje dati glodar.
Modifikacija genoma glodara može se izvršiti u embrionalnoj matičnoj ćeliji glodara. Embrionalna matična ćelija glodara može biti embrionalna matična ćelija miša ili embrionalna matična ćelija pacova.
Postupak može dalje da obuhvata modifikaciju genoma glodara tako da sadrži SIRPα gen koji kodira vanćelijski deo humanog SIRPα polipeptida (npr. amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 28-362 humanog SIRPα polipeptida) koji je povezan sa unutarćelijskim delom endogenog SIRPα polipeptida. Modifikovanje genoma glodara tako da sadrži SIRPα gen koji kodira vanćelijski deo humanog SIRPα polipeptida (npr. amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 28-362 humanog SIRPα polipeptida) povezan sa unutarćelijskim delom endogenog SIRPα polipeptida se može izvesti pre modifikacije genoma glodara tako da on sadrži CD47 gen koji kodira vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida povezane sa unutarćelijskim delom endogenog CD47 polipeptida.
Ovde je, takođe, opisan uzgoj glodara čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen koji kodira vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, kodiranog egzonima 2-7 humanog CD47 gena, vezane za unutarćelijski deo endogenog CD47 polipeptida, sa drugim glodarom, a dati drugi glodar ima genom koji sadrži SIRPα gen koji kodira SIRPα polipeptid koji sadrži vanćelijski deo humanog SIRPα polipeptida (npr. aminokiseline koje odgovaraju ostacima 28-362 humanog SIRPα polipeptida) i unutarćelijski deo endogenog SIRPα polipeptida.
Ovde je, takođe, opisan glodar koji se može dobiti postupcima koje su ovde opisani. Ovde je, takođe, opisan postupak presađivanja humanih ćelija u glodara, postupak kojaiobuhvata korake obezbeđivanja glodara čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen koji kodira vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, kodirane egzonima 2-7 humanog CD47 gena, vezane za unutarćelijski deo endogenog CD47 polipeptida; i presađivanje jedne ili više humanih ćelija u date glodare. Postupak može dalje da obuhvata korak ispitivanja usadivanja jedne ili više humanih ćelija kod datog glodara. Korak testiranja može da obuhvata upoređivanje usađivanja jedne ili više humanih ćelija sa usađivanjem u jednog ili više glodara divljeg tipa ili kod jednog ili više glodara čiji genom ne sadrži CD47 gen koji kodira vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida vezanog za unutarćelijski deo endogenog CD47 polipeptida.
Humane ćelije mogu biti hematopoetske matične ćelije. Humane ćelije se mogu presaditi intravenozno. Humane ćelije se mogu presaditi intraperitonealno. Humane ćelije se mogu presaditi subkutano. Ovde je, takođe, opisan postupak procene terapeutske efikasnosti leka koji cilja humane ćelije, a postupak obuhvata obezbeđivanje glodara čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen koji kodira vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, kodiranog egzonima 2-7 humanog CD47 gena, vezane za unutarćelijski deo endogenog CD47 polipeptida; presađivanje jedne ili više humanih ćelija u date glodare; davanje kandidata za lek datom glodaru; i praćenje humanih ćelija kod glodara da bi se odredila terapijska efikasnost kandidata za lek.
Humane ćelije mogu biti ćelije raka, a kandidat za lek može biti kandidat za lek protiv raka. Kandidat za lek može biti antitelo.
Glodar može dalje da sadrži humane imune ćelije. Kandidat za lek može biti bispecifično antitelo koje vezuje humani CD47 i antigen na presađenim humanim ćelijama raka.
Ovde je, takođe, opisan postupak koji obuhvata obezbeđivanje jedne ili više ćelija čiji genom uključuje humanizovani CD47 gen koji kodira vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, kodiranog egzonima 2-7 humanog CD47 gena, vezane za unutarćelijski deo endogenog CD47 polipeptida; inkubiranje jedne ili više ćelija sa obeleženim supstratom; i merenje fagocitoze obeleženog supstrata od strane jedne ili više ćelija. Supstrat može biti fluorescentno obeležen. Supstrat može biti obeležen antitelom. Supstrat može biti jedno ili više crvenih krvnih zrnaca. Supstrat može biti jedna ili više bakterijskih ćelija. Supstrat može biti jedna ili više tumorskih ćelija.
Ovde je, takođe, opisan postupak koji obuhvata obezbeđivanje glodara čiji genom uključuje humanizovani CD47 gen koji kodira vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, kodiranog egzonima 2-7 humanog CD47 gena, vezane za unutarćelijski deo endogenog CD47 polipeptida; izlaganje glodara antigenu; i merenje fagocitoze antigena od strane jedne ili više ćelija glodara. Korak izlaganja može da obuhvata izlaganje glodara antigenu koji je fluorescentno obeležen. Korak izlaganja može da obuhvata izlaganje glodara jednoj ili više ćelija koje sadrže antigen. Korak izlaganja može da obuhvata izlaganje glodara jednoj ili više humanih ćelija koje sadrže antigen ili jednoj ili više bakterijskih ćelija koje sadrže antigen. Korak izlaganja može da obuhvata izlaganje glodara jednoj ili više ćelija koje su transformisane antigenom tako da se antigen eksprimuje na površini jedne ili više transformisanih ćelija. Korak izlaganja može da obuhvata izlaganje glodara jednoj ili više tumorskih ćelija koje sadrže antigen.
Ovde su, takođe, opisani postupci za identifikaciju ili validaciju leka ili vakcine, a postupak obuhvata korake isporuke leka ili vakcine glodaru čiji genom uključuje humanizovani CD47 gen koji kodira vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, kodirane egzonima 2-7 humanog CD47 gena, vezane za unutarćelijski deo endogenog CD47 polipeptida, i praćenja jednog ili više imunoloških odgovora na lek ili vakcinu, bezbednosnog profila leka ili vakcine, ili uticaja na bolest ili stanje. Praćenje bezbednosnog profila može uključivati utvrđivanje da li glodar ispoljava neželjeni efekat ili neželjenu reakciju kao rezultat davanja leka ili vakcine. Neželjeni efekat ili neželjena reakcija se mogu izabrati iz morbiditeta, mortaliteta, promene telesne težine, promene nivoa jednog ili više enzima (npr. jetre), promene težine jednog ili više organa, gubitka funkcije (npr. senzorne, motoričke, organske itd.), povećane osetljivosit na jednu ili više bolesti, promene u genomu glodara, povećanje ili smanjenje potrošnje hrane i komplikacije jedne ili više bolesti.
Ovde je, takođe, opisana upotreba glodara kako je ovde opisan u razvoju leka ili vakcine za upotrebu u medicini, kao što je upotreba kao lek.
Ovde je, takođe, opisana upotreba glodara kao što je ovde opisan u proizvodnji leka za lečenje raka ili neoplazme.
Ovde je, takođe, opisana upotreba glodara kao što je ovde opisan za procenu efikasnosti terapeutskog leka koji cilja na humane ćelije. Ovde opisanom glodaru mogu da se presade humane ćelije, a kandidat za lek koji cilja na date humane ćelije može da se da glodaru. Efikasnost leka se može utvrditi praćenjem humanih ćelija kod glodara nakon davanja leka.
Ovde je, takođe, opisan glodar ili ćelija kako je ovde opisana za upotrebu u razvoju i/ili identifikaciji leka (npr. antitela) za terapiju ili dijagnostikovanje.
Ovde je, takođe, opisan glodar ili ćelija kako je ovde opisana za upotrebu u razvoju i/ili identifikaciji leka (npr. antitela) za lečenje, prevenciju ili poboljšanje raka ili neoplazme.
Pronalazak, takođe, obezbeđuje postupak za procenu farmakokinetičkih svojstava leka koji cilja na humani CD47, a postupak obuhvata:
(i) davanje kandidata za lek koji cilja humani CD47 glodaru čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen,
pri čemu humanizovani CD47 gen kodira humanizovani CD47 polipeptid koji sadrži deo humanog CD47 polipeptida i unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara: pri čemu deo humanog CD47 polipeptida obuhvata vanćelijski domen i
transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, i kodiran je egzonima 2-7 humanog CD47 gena; pri čemu je unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara kodiran egzonima nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara; i
pri čemu je humanizovani CD47 gen operativno vezan za CD47 promotor glodara; i
(ii) izvođenje jednog ili više testova za procenu farmakokinetičkih svojstava kandidata za lek.
Ovde je, takođe, opisan postupak procene ciljne toksičnosti leka koji cilja na humani CD47, a postupak obuhvata korake davanja leka glodaru kao što je ovde opisan, i izvođenje testa za jedan ili više parametara povezanih sa vanciljnom toksičnosti leka.
Ovde je, takođe, opisan postupak procene vanciljne toksičnosti leka koji cilja na humani CD47, a postupak obuhvata korake davanja leka glodaru kao što je ovde opisano, i izvođenje testa za jedan ili više parametara povezanih sa vanciljnom toksičnosti leka.
Glodar kako je ovde opisan je glodar čiji genom uključuje humanizovani CD47 gen koji kodira vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida povezanog sa unutarćelijskim delom endogenog CD47 polipeptida; glodar može biti miš; glodar može biti pacov.
Lek koji cilja na humani CD47 može biti antagonist CD47. Antagonist CD47 može biti anti-CD47 antitelo. Lek koji cilja na humani CD47 može biti agonist CD47.
Humanizovani CD47 gen može da uključuje bilo koji humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan. Humani CD47 polipeptid može da uključi bilo koji humani CD47 polipeptid opisan ovde.
Ovde opisani glodar možda neće detektabilno eksprimovati endogenog CD47 polipeptida glodara pune dužine. Ovde opisani glodar možda neće detektabilno eksprimovati vanćelijskog dela endogenog CD47 polipeptida. Ovde opisani glodar možda neće detektovati ekspresiju vanćelijskog dela i endogenog CD47 polipeptida i endogenog SIRPα polipeptida.
Vanćelijski domen humanog CD47 polipeptida može da sadrži amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 19-141 humanog CD47 polipeptida kao što je ovde opisano.
N-terminalni imunoglobulinski V domen humanog CD47 polipeptida može da sadrži amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 19-127 humanog CD47 polipeptida kao što je ovde opisano.
Glodari, ćelije, tkiva, embrionalne matične ćelije i/ili embrioni predmetnog pronalaska mogu imati genom koji dalje sadrži SIRPα gen koji kodira SIRPα polipeptid koji sadrži vanćelijski deo humanog SIRPα polipeptida (npr. amino-kiseline koje odgovaraju ostacima peptida 28-362 humanog SIRPα polipeptida) i unutarćelijski deo endogenog SIRPα polipeptida.
Ovde opisani glodar može biti miš; ili pacov.
Kako se koriste u ovoj prijavi, termini „oko” i „približno” se koriste kao ekvivalenti. Bilo koji brojevi koji se koriste u ovoj prijavi sa ili bez oko/približno imaju za cilj da pokriju sve normalne fluktuacije koje proceni neko ko je prosečan stručnjak u tehnici.
Ostale karakteristike, ciljevi i prednosti opisani ovde su očigledni u detaljnom opisu koji sledi. Podrazumeva se, međutim, da je detaljan opis dat samo kao ilustracija, a ne kao ograničenje. Različite promene i modifikacije će postati očigledne stručnjacima u tehnici iz detaljnog opisa.
KRATAK OPIS CRTEŽA
Patentna ili prijavna datoteka sadrži najmanje jedan crtež izveden u boji. Kopije ovog patenta ili objave prijave patenta sa crtežom(ima) u boji će obezbediti Zavod na zahtev i plaćanje neophodne naknade.
Crteži uključeni ovde, koji se sastoje od sledećih slika, služe samo u svrhu ilustracije.
Slika 1 prikazuje dijagram, ne u razmeri, genomske organizacije gena nehumanog (npr. mišjeg) i humanog Klastera diferencijacije 47 (CD47). Egzoni su numerisani ispod svakog egzona.
Slika 2 prikazuje dijagram, ne u razmeri, primera postupka za humanizaciju nehumanog gena Klastera diferencijacije 47 (CD47).
Slika 3 prikazuje dijagram, ne u razmeri, genomske organizacije mišjeg i humanog Klastera diferencijacije 47 (CD47) gena. Navedene su lokacije proba korišćenih u testu opisanom u Primeru 1.
Slika 4 prikazuje primer histograma ekspresije CD47 u crvenim krvnim zrncima humanizovanih CD47 miševa detektovane anti-CD47 antitelima. Ab A, Ab B, Ab C, Ab D i Ab E: anti-CD47 antitela; hIgG4: humani IgG4 irelevantne specifičnosti sa modifikovanim Fc regionom koji ima smanjenu efektorsku funkciju; hIgG4: humano IgG4 antitelo irelevantne specifičnosti.
Slika 5 prikazuje primer hemaglutinacije crvenih krvnih zrnaca miša iz divljeg tipa (n=2) i humanizovanih CD47 (n=2) miševa anti-CD47 antitelima. WT: divlji tip; HuCD47: humanizovani CD47: Ab A, Ab B, Ab C, Ab D i Ab E: anti-CD47 antitela; hIgG4: humani IgG4 irelevantne specifičnosti sa modifikovanim Fc regionom koji ima smanjenu efektorsku funkciju; hIgG4: humano IgG4 antitelo irelevantne specifičnosti.
Slika 6 prikazuje primere farmakokinetičkih profila anti-CD47 antitela kod humanizovanih CD47 miševa predstavljene kao koncentracija antitela (u µg/mL, y-osa) tokom vremena (u danima, x-osa); Ab F, Ab G, Ab H i Ab I: anti-CD47 antitela; hIgG4s: humano IgG4 antitelo irelevantne specifičnosti sa modifikovanim Fc regionom koji ima smanjenu efektorsku funkciju.
Slika 7 prikazuje primere farmakokinetičkih profila anti-CD47 antitela kod humanizovanih CD47/SIRPα miševa (CD47<hu/hu>SIRPα<hu/hu>) predstavljene kao koncentracija antitela (u mcg/mL, y-osa) tokom vremena (u danima, x-osa). Ab J, Ab F, Ab GandAb I: anti-CD47 antitela; hIgG4s: humano IgG4 antitelo irelevantne specifičnosti sa modifikovanim Fc regionom koji ima smanjenu efektorsku funkciju.
Slika 8 prikazuje primere farmakokinetičkih profila anti-CD47 antitela kod humanizovanih CD47/SIRPα miševa (CD47<hu/hu>SIRPα<hu/hu>) predstavljene kao koncentracija antitela (u mcg/mL, y-osa) tokom vremena (u danima, x-osa). Ab J, Ab F: anti-CD47 antitela; Ab Fs: Ab F sa modifikovanim Fc regionom koji ima smanjenu efektorsku funkciju; Ab Fmono: monovalentna verzija Ab F; hIgG4s: humano IgG4 antitelo irelevantne specifičnosti sa modifikovanim Fc regionom koji ima smanjenu efektorsku funkciju.
Slika 9 prikazuje primere farmakokinetičkih profila anti-CD47 antitela kod miševa divljeg tipa predstavljenih kao koncentracija antitela (u mcg/mL, y-osa) tokom vremena (u danima, x-osa). Miševi koji su pokazivali odgovor mišjih anti-humanih antitela (MAHA) su isključeni. Ab J, Ab F, Ab I i Ab G: anti-CD47 antitela; hIgG4s: humano IgG4 antitelo irelevantne specifičnosti sa modifikovanim Fc regionom koji ima smanjenu efektorsku funkciju (zvezda: sve tačke nakon 15 dana su isključene iz grupe tretmana hIgG4s zbog MAHA); Ab J F(ab’)2: F(ab’)2fragment Ab J.
DEFINICIJE
Posebni postupci i eksperimentalni uslovi opisani ovde mogu da variraju. Takođe se podrazumeva da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisa određenih realizacija, i nije joj namera da bude ograničavajuća, pošto je obim predmetnog pronalaska definisan patentnim zahtevima.
Osim ako nije drugačije definisano, svi izrazi i fraze korišćene ovde uključuju značenja koja izrazi i fraze imaju u tehnici, osim ako je suprotno jasno naznačeno ili jasno očigledno iz konteksta u kome se izraz ili fraza koristi. Iako se bilo koji postupak i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, sada su opisani određeni postupci i materijali.
Izraz „približno”, kako se ovde primenjuje na jednu ili više vrednosti od interesa, odnosi se na vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. Izraz „Približno” ili „oko“ može se odnositi na raspon vrednosti koje spadaju u 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ili manje u bilo kom smeru (veće ili manje od) navedene referentne vrednosti osim ako nije drugačije navedeno ili na drugi način očigledno iz konteksta (osim kada bi taj broj premašio 100% moguće vrednosti).
Izraz „biološki aktivan”, kako se ovde koristi, odnosi se na karakteristiku bilo kog sredstva koje ima aktivnost u biološkom sistemu, in vitro ili in vivo (npr. u organizmu). Na primer, sredstvo koje, kada je prisutno u organizmu, ima biološki efekat u tom organizmu, smatra se biološki aktivnim. Kada je protein ili polipeptid biološki aktivan, deo tog proteina ili polipeptida koji deli najmanje jednu biološku aktivnost proteina ili polipeptida se obično može nazvati „biološki aktivnim“ delom.
Izraz „uporedivi”, kako se ovde koristi, odnosi se na dva ili više sredstva, entiteta, situacija, skupova uslova itd. koji možda nisu identični jedan drugom, ali koji su dovoljno slični da bi omogućili poređenje između njih tako da se zaključci mogu razumno izvući na osnovu uočene razlike ili sličnosti. Prosečni stručnjaci u tehnici će razumeti, u kontekstu, koji stepen identiteta je potreban u bilo kojoj datoj okolnosti da bi se dva ili više takvih sredstava, entiteta, situacija, skupova uslova, itd. smatrali uporedivim.
Izraz „konzervativna”, kako se ovde koristi za opisivanje konzervativne aminokiselinske supstitucije, odnosi se na supstituciju aminokiselinskog ostatka drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr. naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativne aminokiselinske supstitucije neće bitno promeniti funkcionalna svojstva proteina od interesa, na primer, sposobnost receptora da se veže za ligand. Primeri grupa amino-kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju: alifatske bočne lance kao npr. glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; alifatsko-hidroksilne bočne lance kao što su serin i treonin; bočne lance koji sadrže amid kao što su asparagin i glutamin; aromatične bočne lance kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; osnovne bočne lance lizin, arginin i histidin; kisele bočne lance kao što su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i bočne lance koji sadrže sumpor kao što su cistein i metionin. Konzervativne supstitucione grupe amino-kiselina uključuju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. Konzervativna aminokiselinska supstitucija može biti supstitucija bilo kog prirodnog ostatka u proteinu sa alaninom, kao što se koristi u, na primer, mutagenezi skeniranja alanina. Može se izvršiti konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u matrici log-verovatnoće PAM250 opisanoj u Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database. Science 256:1443-45. Supstitucija može biti umereno konzervativna supstitucija pri čemu supstitucija ima nenegativnu vrednost u matrici logaritamske verovatnoće PAM250.
Izraz „kontrola”, kako se ovde koristi, odnosi se na značenje koje „kontrola” ima u tehnici kao standard sa kojim se upoređuju rezultati. Obično, kontrole se koriste za povećanje integriteta u eksperimentima izolovanjem varijabli kako bi se doneo zaključak o takvim varijablama. Kontrola može biti reakcija ili test koji se izvodi istovremeno sa test reakcijom ili ispitivanjem da bi se obezbedio komparator. Kako se ovde koristi, „kontrola” može da se odnosi na „kontrolnu životinju”. „Kontrolna životinja” može da ima modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikaciju koja je drugačija nego što je ovde opisano, ili da je bez modifikacije (tj. životinja divljeg tipa). U jednom eksperimentu se primenjuje „test” (tj. varijabla koja se testira). U drugom eksperimentu, „kontrola”, varijabla koja se testira nije primenjena. Kontrola može biti istorijska kontrola (tj. testa ili ispitivanja koje je prethodno obavljeno, ili količina ili rezultat koji je prethodno poznat). Kontrola može da bude ili da sadrži odštampan ili na drugi način sačuvan zapis. ontrola može biti pozitivna kontrola ili negativna kontrola.
Izraz „disrupcija”, kako se ovde koristi, može se odnositi na rezultat događaja homologne rekombinacije sa molekulom DNK (npr. sa endogenom homolognom sekvencom kao što je gen ili genski lokus. Disrupcija može postići ili predstavljati umetanje, brisanje, supstituciju, zamenu, misens mutaciju, ili pomeranje okvira sekvence(i) DNK, ili bilo koja njihova kombinacija. Insercije mogu da uključuju umetanje celih gena ili fragmenata gena, npr. egzona, koji mogu biti drugačijeg porekla od endogene sekvence (npr. heterologna sekvenca). Disrupcija može povećati ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda (npr. proteina kodiranog genom). Disrupcija može smanjiti ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda. Disrupcija može da promeni sekvencu gena ili kodiranog genskog proizvoda (npr. kodirani protein). Disrupcija može da skrati ili fragmentira gen ili kodirani genski proizvod (npr. kodirani protein). Disrupcija može proširiti gen ili kodirani genski proizvod; u nekim takvim slučajevima, poremećaj može postići sklapanje fuzionog proteina. Disrupcija može da utiče na nivo, ali ne i na aktivnost gena ili genskog proizvoda. Disrupcija može uticati na aktivnost, ali ne i na nivo gena ili genskog proizvoda. Disrupcija možda nema značajan uticaj na nivo gena ili genskog proizvoda. Disrupcija možda nema značajan uticaj na aktivnost gena ili genskog proizvoda. Disrupcija možda nema značajan uticaj na nivo ili aktivnost gena ili genskog proizvoda.
Izrazi „određivanje”, „merenje”, „ocenjivanje”, „procenjivanje”, „ispitivanje” i „analiziranje” se ovde koriste naizmenično za upućivanje na bilo koji oblik merenja i uključuju određivanje da li je element prisutan ili ne. Ovi izrazi uključuju i kvantitativna i/ili kvalitativna određivanja. Testiranje može biti relativno ili apsolutno. „Ispitivanje na prisustvo“ može biti određivanje količine nečega prisutnog i/ili utvrđivanje da li je prisutno ili odsutno.
Fraza „endogeni lokus” ili „endogeni gen”, kako se ovde koristi, odnosi se na genetski lokus pronađen u roditeljskom ili referentnom organizmu pre uvođenja disrupcije, delecije, zamene, alternacije ili modifikacije kako je ovde opisano. Endogeni lokus može imati sekvencu koja se nalazi u prirodi. Endogeni lokus može biti lokus divljeg tipa. Referentni organizam može biti organizam divljeg tipa. Referentni organizam može biti konstruisani organizam. Referentni organizam može biti laboratorijski uzgojen organizam (bilo divlji tip ili konstruisan).
Fraza „endogeni promotor” odnosi se na promotor koji je prirodno povezan, na primer, u organizmu divljeg tipa, sa endogenim genom.
Izraz „heterologan”, kako se ovde koristi, odnosi se na sredstvo ili entitet iz drugog izvora. Na primer, kada se koristi u odnosu na polipeptid, gen ili genski proizvod ili je prisutan u određenoj ćeliji ili organizmu, izraz pojašnjava da je relevantni polipeptid, gen ili genski proizvod: 1) napravljen ljudskom rukom; 2) uveden u ćeliju ili organizam (ili njegov prekursor) ljudskom rukom (npr. genetskim inženjeringom); i/ili 3) nije prirodno proizveden od strane relevantne ćelije ili organizma ili nije prisutan u njoj (npr. relevantni tip ćelije ili tip organizma).
Ćelije prema pronalasku su ćelije glodara. Izraz „ćelija domaćin”, kako se ovde koristi, odnosi se na ćeliju u koju je uvedena heterologna (npr. egzogena) nukleinska kiselina ili protein. Stručnjaci nakon čitanja predmetnog pronalaska razumeće da se takvi izrazi ne odnose samo na ćeliju određenog subjekta, već se koristi da označe potomstvo takve ćelije. Pošto se određene modifikacije mogu desiti u narednim generacijama zbog mutacije ili uticaja okoline, takvo potomstvo možda neće biti identično roditeljskoj ćeliji, ali je i dalje uključeno u opseg izraza „ćelija domaćin” kako se ovde koristi. Ćelije domaćini kao što je ovde uopšteno opisano obuhvataju prokariotsku ili eukariotsku ćeliju. Uopšteno, ćelija domaćin je svaka ćelija koja je pogodna za primanje i/ili proizvodnju heterologne nukleinske kiseline ili proteina, bez obzira na kraljevstvo života u koje je ćelija svrstana. Primeri ćelija uključuju ćelije prokariota i eukariota (jednoćelijske ili višećelijske), ćelije bakterija (npr. sojevi E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., itd.), ćelije mikobakterija, ćelije gljivica, ćelije kvasca (npr. S. cerevisiae. S. pombe. P. pastoris, P. methanolica, itd.), biljne ćelije, ćelije insekata (npr. SF-9, SF-21, ćelije insekata zaražene bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), ćelije ne-humanih životinja, humane ćelije ili fuzije ćelija kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. Ćelija može biti ćelija čoveka, majmuna, čovekolikog majmuna, hrčka, pacova ili miša. Ćelija može biti eukariotska i može se izabrati iz sledećih ćelija: CHO (e.g.. CHO K1, DXB- 11 CHO, Veggie-CHO), COS (e.g.. COS-7), ćelije retine. Vero, CV1, bubrega (npr. HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK. BHK), HeLa. HepG2, WI38, MRC 5. Colo205. HB 8065. HL-60, (e.g.. BHK21), Jurkat. Daudi. A431 (epidermna), CV-1, U937, 3T3, L ćelije, C127 ćelije, SP2/0. NS-0, MMT 060562. Sertoli ćelije. RL 3A ćelije, HT1080 ćelije, ćelije mijeloma, ćelije tumora i ćelijske linije izvedene iz gore pomenute ćelije. Ćelija može da sadrži jedan ili više virusnih gena, npr. ćeliju retine koja eksprimuje virusni gen (npr. PER.C6™ ćelije). Ćelija domaćin može da bude ili obuhvata izolovanu ćeliju. Ćelija domaćin može biti deo tkiva. Ćelija domaćin može biti deo organizma.
Izraz „humanizovan”, se ovde koristi u skladu sa svojim značenjem koje se razume u tehnici da se odnosi na nukleinske kiseline ili proteine čije strukture (tj. sekvence nukleotida ili amino-kiselina) uključuju delove koji odgovaraju u suštini ili identično sa strukturama određenog gena ili proteina koji se nalaze u prirodi u ne-humanoj životinji, a takođe uključuju delove koji se razlikuju od onih koji se nalaze u relevantnom određenom nehumanom genu ili proteinu i umesto toga bliže korespondiraju sa uporedivim strukturama pronađenim u odgovarajućem humanom genu ili proteinu. „Humanizovan” gen koji je ovde opisan kodira polipeptid koji ima u suštini sekvencu amino-kiseline kao i humani polipeptid (npr. humani protein ili njegov deo - npr. njegov karakterističan deo). Da damo samo jedan primer, u slučaju membranskog receptora, a „humanizovan” gen može da kodira polipeptid koji ima vanćelijski deo koji ima sekvencu amino-kiseline kao onu kod humanog vanćelijskog dela, a preostalu sekvencu kao kod nehumanog polipeptida (npr. mišjeg). Humanizovani gen može da sadrži najmanje deo DNK sekvence humanog gena. Humanizovani gen može da sadrži celu DNK sekvencu humanog gena. Prema pronalasku, humanizovani CD47 gen kodira humanizovani CD47 polipeptid koji sadrži deo humanog CD47 polipeptida i unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara, pri čemu deo humanog CD47 polipeptida sadrži vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, i kodiran je egzonima 2-7 humanog CD47 gena, pri čemu je unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara kodiran egzonima nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara. Ovde opisani humanizovani protein obuhvata sekvencu koja ima deo koji se pojavljuje u humanom proteinu. Prema pronalasku, humanizovani CD47 polipeptid sadrži vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, koji su kodirani egzonima 2-7 humanog CD47 gena, i unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara, kodiran egzonima nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara.
Izraz „identitet”, kako se ovde koristi u vezi sa poređenjem sekvenci, odnosi se na identitet koji je određen brojnim različitim algoritamima poznatim u tehnici koji se mogu koristiti za merenje identiteta nukleotidne i/ili sekvence amino-kiseline. Identiteti kao što je ovde opisano mogu se odrediti korišćenjem ClustalW v.1.83 (sporog) poravnanja koje koristi vrednost otvorene praznine od 10.0, vrednost proširene praznine od 0.1 i korišćenjem Gonetove matrice sličnosti (MACVECTOR<TM>10.0.2, MacVector Inc., 2008).
Izraz „izolovan”, kako se ovde koristi, odnosi se na supstancu i/ili entitet koji je (1) odvojen od najmanje nekih komponenti sa kojima je bio povezan kada je prvobitno proizveden (bilo u prirodi i/ili u eksperimentalnom okruženju), i/ili (2) konstruisan, napravljen, pripremljen i/ili proizveden od strane ljudi. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu se odvojiti od oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili više od oko 99% ostalih komponenti sa kojima su prvobitno bili povezani. Izolovanih sredstava može biti oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99 %, ili više od oko 99% čistoće. Kako se ovde koristi, supstanca je „čista” ako je u suštini bez drugih komponenti. Kao što će razumeti stručnjaci u tehnici, supstanca se i dalje može smatrati da je „izolovana” ili čak „čista”, nakon što se kombinuje sa određenim drugim komponentama kao što su, na primer, jedan ili više nosača ili ekscipijenasa (npr. pufer, rastvarač, voda, itd.); u takvim slučajevima, procenat izolacije ili čistoće supstance se izračunava bez uključivanja takvih nosača ili ekscipijenasa. Da damo samo jedan primer, biološki polimer kao što je polipeptid ili polinukleotid koji se javlja u prirodi može se smatrati „izolovan” kada: a) na osnovu svog porekla ili izvora derivacije nije povezan sa nekim ili svim komponentama koje ga prate u njegovom izvornom stanju u prirodi; b) da je u suštini bez drugih polipeptida ili nukleinskih kiselina iste vrste iz vrste koja ga proizvodi u prirodi; ili c) je eksprimovan od ili je na drugi način u vezi sa komponentama iz ćelije ili drugog ekspresionog sistema koji nije od vrste koja ga proizvodi u prirodi. Tako, na primer, polipeptid koji se hemijski sintetiše ili se sintetiše u ćelijskom sistemu različitom od onog koji ga proizvodi u prirodi može se smatrati „izolovanim” polipeptidom. Alternativno ili dodatno, polipeptid koji je podvrgnut jednoj ili više tehnika prečišćavanja može se smatrati „izolovanim“ polipeptidom u meri u kojoj je odvojen od drugih komponenti: a) sa kojima je povezan u prirodi; i/ili b) sa kojima je bio povezan kada je prvobitno proizveden.
Fraza „ne-humana životinja”, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji kičmenjački organizam koji nije čovek. Ne-humana životinja može biti kolousta riba, košljoriba, rušljoriba (npr. ajkula ili raža), vodozemac, gmizavac, sisar ili ptica. Ne-humani sisar može biti primat, koza, ovca, svinja, pas, krava ili glodar. Ne-humana životinja predmetnog pronalaska je glodar, kao npr. pacov ili miš.
Fraza „nukleinske kiseline”, kako se ovde koristi, u svom najširem smislu, odnosi se na bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja je ili može biti ugrađena u oligonukleotidni lanac. „Nukleinska kiselina” može biti jedinjenje i/ili supstanca koja je ili može biti ugrađena u oligonukleotidni lanac preko fosfodiestarske veze. Kao što će biti jasno iz konteksta, „nukleinska kiselina” se može odnositi na pojedinačne ostatke nukleinske kiseline (npr. nukleotide i/ili nukleozide); „nukleinska kiselina” može se odnositi na oligonukleotidni lanac koji sadrži pojedinačne ostatke nukleinske kiseline. „Nukleinska kiselina” može da bude ili da sadrži RNK; „nukleinska kiselina” može da bude ili da sadrži DNK. „Nukleinska kiselina” može biti, sadržati ili se sastojati od jednog ili više ostataka prirodnih nukleinskih kiselina. „Nukleinska kiselina” može biti, sadržati ili se sastojati od jednog ili više analoga nukleinske kiseline. Analog nukleinske kiseline može se razlikovati od „nukleinske kiseline” u tome što ne koristi fosfodiestarsku kičmu. Na primer, „nukleinska kiselina” može biti, sadržavati ili se sastojati od jedne ili više „peptidne nukleinske kiseline”, koje su poznate u tehnici i imaju peptidne veze umesto fosfodiestarskih veza u kičmi. Alternativno ili dodatno, „nukleinska kiselina” može imati jednu ili više fosforotioatnih i/ili 5’-N-fosforamiditnih veza pre nego fosfodiestarske veze. „Nukleinska kiselina” može biti, sadržati ili se sastojati od jednog ili više prirodnih nukleozida (npr. adenozin, timidin, gvanozin, citidin, uridin, deoksiadenozin, deoksitimidin, deoksiguanozin i deoksicitidin). „Nukleinska kiselina” može biti, sadržati ili se sastojati od jednog ili više analoga nukleozida (npr. 2-aminoadenozin, 2-tiotimidin, inozin, pirolo-pirimidin, 3-metil adenozin, 5-metilcitidin, C-5 propinil-citidin, C-5 propinil-uridin, 2-aminoadenozin, C5-bromouridin, C5-fluoruridin, C5-joduridin, C5- propinil-uridin, C5-propinilcitidin, C5-metilcitidin, 2-aminoadenozin, 7-deazaadenozin, 7-deazagvanozin, 8-oksoadenozin, 8-oksogvanozin, O(6)-metilgvanin, 2-tiocitidin, metilovane baze, interkalirane baze i njihove kombinacije. „Nukleinska kiselina” može da sadrži jedan ili više modifikovanih šećera (npr. 2’-fluororibozu, ribozu, 2-dezoksiribozu, arabinozu, i heksozu) u poređenju sa onima u prirodnim nukleinskim kiselinama. „Nukleinska kiselina” može imati nukleotidnu sekvencu koja kodira funkcionalni genski proizvod kao što je RNK ili protein. „Nukleinska kiselina” može da uključuje jedan ili više introna. „Nukleinska kiselina” može se pripremiti jednom ili više izolacija iz prirodnog izvora, enzimskom sintezom polimerizacijom zasnovanom na komplementarnom šablonu (in vivo ili in vitro), reprodukcijom u rekombinantnoj ćeliji ili sistemu i hemijskom sintezom. „Nukleinska kiselina” može biti najmanje 3, 4, 5.6, 7.8, 9, 10, 15, 20.25.30.35, 40, 45, 50.55.60.65.70, 75.80.85, 90.
95.100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190.20.225.250, 275.300, 325, 350, 375, 400. 425, 450. 475. 500, 600, 700. 800. 900, 1000, 1500, 2000, 2500. 3000, 3500. 4000.
4500, 5000 ili više ostataka dugačka. „Nukleinska kiselina” može biti jednolančana; ili „Nukleinska kiselina” može biti dvolančana. „Nukleinska kiselina” može imati nukleotidnu sekvencu koja sadrži najmanje jedan element koji kodira, ili je komplement sekvence koja kodira, polipeptid. „Nukleinska kiselina” može imati enzimsku aktivnost.
Fraza „operativno povezane”, kako se ovde koristi, odnosi se na jukstapoziciju u kojoj su opisane komponente u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na predviđen način. Kontrolna sekvenca „operativno povezana” za kodirajuću sekvencu se vezuje na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama. „Operativno povezane” sekvence obuhvataju i sekvence kontrole ekspresije koje su u blizini gena od interesa i sekvence kontrole ekspresije koje deluju trans ili na daljinu kako bi kontrolisale gen od interesa. Izraz „sekvenca kontrole ekspresije”, kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotidne sekvence, koje su neophodne da bi se izvršila ekspresija i procesiranje kodirajućih sekvenci za koje su vezane. „Sekvence kontrole ekspresije” obuhvataju: odgovarajuću inicijaciju, terminaciju, sekvence promotora i pojačivača transkripcije; efikasne signale za obradu RNK kao što su splajsni signali i signali poliadenilacije; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku mRNK; sekvence koje poboljšavaju efikasnost translacije (tj. Kozak konsenzus sekvenca); sekvence koje poboljšavaju stabilnost proteina; i kada se želi, sekvence koje pojačavaju sekreciju proteina. Priroda takvih kontrolnih sekvenci se razlikuje u zavisnosti od organizma domaćina. Na primer, kod prokariota, takve kontrolne sekvence generalno obuhvataju promotor, ribozomsko vezujuće mesto i sekvencu za završetak transkripcije, dok kod eukariota, obično, takve kontrolne sekvence uključuju promotore i sekvencu za završetak transkripcije. Izraz „kontrolne sekvence” namerava da uključi komponente čije je prisustvo bitno za ekspresiju i procesiranje, a takođe može da uključi i dodatne komponente čije prisustvo je korisno, na primer, liderske sekvence i sekvence partnera fuzije.
Izraz „polipeptid”, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji polimerni lanac aminokiselina. Polipeptid može imati sekvencu amino-kiseline koja se javlja u prirodi. Polipeptid može imati sekvencu amino-kiseline koja se ne javlja u prirodi. Polipeptid može imati sekvencu amino-kiseline sekvenca koja sadrži delove koji se javljaju u prirodi odvojeno jedan od drugog (tj. od dva ili više različitih organizama, posebno humanih delova i delova glodara). Polipeptid može imati sekvencu amino-kiselina koja je projektovana tako da je dizajnirana i/ili proizvedeno delovanjem čoveka.
Izraz „rekombinantan”, kako se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi na polipeptide (npr. CD47 polipeptide kako je ovde opisano) koji su dizajnirani, kreirani, pripremljeni, eksprimovani, napravljeni ili izolovani rekombinantnim sredstvima, kao što su polipeptidi eksprimovani korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina, polipeptidi izolovani iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih polipeptida Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech.15:62-70: Azzazy H.. and Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem.35:425-445: Gavilondo J. V., and Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), antitela izolovana od životinje (npr. miša) koja su transgena za gene humanog imunoglobulina (videti, npr. Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res.20:6287-6295: Kellermann S-A., and Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597: Little M. et al. (2000) Immunology Today 21:364-370; Murphy, A.J.,et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.111 (14):5153-5158) ili polipeptida pripremljenih, eksprimovanih, kreiranih ili izolovanih na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje odabranih elemenata sekvence jednog sa drugim. Jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence može se naći u prirodi. Jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence može biti dizajniran in silico. Jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence može biti rezultat mutageneze (npr. in vivo or in vitro) poznatog elementa sekvence, npr. iz prirodnog ili sintetičkog izvora. Na primer, rekombinantni polipeptid se sastoji od sekvenci koje se nalaze u genomu izvornog organizma od interesa (npr. čoveka, miša, itd.). Rekombinantni polipeptid može imati sekvencu amino-kiselina koja je rezultat mutageneze (npr.., in vitro or in vivo, na primer kod ne-humane životinje), tako da su sekvence amino-kiselina rekombinantnih polipeptida su sekvence koje, iako potiču od sekvenci polipeptida i koje su povezane sa njima, možda prirodno ne postoje u genomu nehumane životinje in vivo.
Izraz „zamenska/zamena” se ovde koristi da se označi proces kroz koji „zamenjena” sekvenca nukleinske kiseline (npr. gen) pronađena u lokusu domaćina (npr. u genomu) je uklonjena sa tog lokusa, a druga, „zamenska” nukleinska kiselina se nalazi na njenom mestu. Zamenjena sekvenca nukleinske kiseline i zamenske sekvence nukleinske kiseline mogu biti uporedive jedna sa drugom po tome što su, na primer, homologne jedna drugoj i/ili sadrže odgovarajuće elemente (npr. elemente koji kodiraju proteine, regulatorne elemente, itd.). Zamenjena sekvenca nukleinske kiseline može da uključuje jedan ili više promotora, pojačivača, mesta splajsnih donora, mesta splajsnih primalaca, introna, egzona, neprevedenog regiona (UTR); zamenska sekvenca nukleinske kiseline može da uključuje jednu ili više kodirajućih sekvenci. Zamenska sekvenca nukleinske kiseline može biti homolog zamenjene sekvence nukleinske kiseline. Zamenska sekvenca nukleinske kiseline može biti ortolog zamenjene sekvence. Zamenskaa sekvenca nukleinske kiseline može da bude ili da sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, uključujući gde zamenska sekvenca nukleinske kiseline jeste ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline može biti ili obuhvata sekvencu glodara (npr. sekvencu miša ili pacova). Tako postavljena sekvenca nukleinske kiseline može da uključuje jednu ili više regulatornih sekvenci koje su deo izvorne sekvence nukleinske kiseline koja se koristi za dobijanje tako postavljene sekvence (npr. promotori, pojačivači, 5’- ili 3’-neprevedeni regioni, itd.). Na primer, zamena je supstitucija endogene sekvence sa heterolognom sekvencom koja rezultira proizvodnjom genskog proizvoda iz tako postavljene sekvence nukleinske kiseline (koja sadrži heterolognu sekvencu), ali ne i ekspresijom endogene sekvence; zamena je endogene genomske sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira protein koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom. Endogeni gen ili njegov fragment mogu biti zamenjeni odgovarajućim humanim genom ili njegovim fragmentom. Odgovarajući humani gen ili njegov fragment je humani gen ili fragment koji je ortolog, ili je u suštini sličan ili isti po strukturi i/ili funkciji, kao endogeni gen ili njegov fragment koji je zamenjen. Prema pronalasku, humanizovani CD47 se može formirati iz zamene genomskog fragmenta koji sadrži egzone 2-7 endogenog CD47 gena glodara na endogenom CD47 lokusu glodara, sa genomskim fragmentom koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena.
Fraza „klaster diferencijacije 47proteina” ili „CD47 protein”, kako se ovde koristi, odnosi se na politopni transmembranski protein koji pripada superfamiliji imunoglobulina i ima vanćelijski amino-terminalni imunoglobulinski V domen, pet transmembranskih domena i kratak karboksil-terminalni unutarćelijski rep. CD47 se eksprimuje na površini ćelije i uključen je u interakcije između proteina na površini membrane kao što su, na primer, integrini, SIRPα i trombospondin-1 (TSP-1). CD47 se eksprimuje u normalnim tkivima i pojačano reguliše kod mnogih humanih karcinoma. Pokazalo se da je CD47 uključen u nekoliko ćelijskih procesa kao što su, na primer, apoptoza, proliferacija, adhezija i migracija. Nekoliko alternativno spojenih CD47 izoforma je identifikovano između miša i čoveka. Kao ilustracija, nukleotidne i sekvence amino-kiselina mišjih i humanih CD47 gena su date u tabeli 3. Stručnjaci u tehnici nakon čitanja predmetnog pronalaska prepoznaće da jedan ili više endogenih CD47 gena u genomu (ili svi) mogu biti zamenjeni jednim ili više heterolognih CD47 gena (npr. polimorfne varijante, podtipovi ili mutanti, geni druge vrste, humanizovane forme, itd.).
„CD47-ekspresiona ćelija”, kako se ovde koristi, odnosi se na ćeliju koja eksprimuje CD47 transmembranski protein. Ćelija koja eksprimuje CD47 može da eksprimuje CD47 transmembranski protein na svojoj površini. CD47 protein može biti eksprimovan na površini ćelije u količini dovoljnoj da posreduje interakcije između ćelije preko CD47 transmembranskog proteina eksprimovanog na površini ćelije. Primeri ćelija koje eksprimuju CD47 uključuju neurone, imune ćelije, keratinocite i ćelije koje cirkulišu. Ćelije koje eksprimuju CD47 regulišu interakciju imunih ćelija i ćelija koje cirkulišu da regulišu različite ćelijske procese kao što su adhezija, proliferacija ćelija i/ili apoptoza, angiogeneza i inflamacija. Glodari predmetnog pronalaska mogu pokazati regulaciju različitih ćelijskih procesa (kao što je ovde opisano) preko humanizovanih CD47 proteina eksprimovanih na površini još jedne ili više ćelija glodara.
Izraz „referenca” se ovde koristi da opiše standardno ili kontrolno sredstvo, kohortu, pojedinca, populaciju, uzorak, sekvencu ili vrednost sa kojom se sredstvo, životinja, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost od interesa upoređuje. Referentno sredstvo, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost mogu biti testirani i/ili određeni u suštini istovremeno sa testiranjem ili određivanjem sredstva, kohorte, pojedinca, populacije, uzorka, sekvence ili vrednosti od interesa. Referentno sredstvo, kohorta, pojedinac , populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost može biti istorijska referenca, opciono realizovana u opipljivom mediju. Referenca se može odnositi na kontrolu. Kako se ovde koristi, „referenca” može da se odnosi na „referentnu životinju”. „Referentna životinja” može da ima modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikaciju koja je drugačija nego što je ovde opisano ili da je bez modifikacije (tj. životinja divljeg tipa). Tipično, kao što će razumeti stručnjaci u tehnici, referentno sredstvo, životinja, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost se određuje ili karakteriše pod uslovima uporedivim sa onima koji se koriste za određivanje ili karakterizaciju sredstva, životinje (npr. sisara), kohorte, pojedinca, populacije, uzorka, sekvence ili vrednosti od interesa.
Izraz „u suštini”, kako se ovde koristi, odnosi se na kvalitativno stanje ispoljavanja potpunog ili skoro potpunog obima ili stepena karakteristike ili svojstva od interesa. Stručnjak sa prosečnim veštinama u biološkoj tehnici će razumeti da biološki i hemijski fenomeni retko, ako ikada, idu do kraja i/ili nastavljaju do potpunosti ili postižu ili izbegavaju apsolutni rezultat. Izraz „u suštini” se stoga ovde koristi da obuhvati potencijalni nedostatak kompletnosti svojstven mnogim biološkim i hemijskim fenomenima.
Fraza „suštinska homologija”, kako se ovde koristi, odnosi se na poređenje između sekvenci amino-kiselina ili nukleinskih kiselina. Kao što će stručnjaci sa prosečnim iskustvom u tehnici razumeti, dve sekvence se generalno smatraju „u suštini homolognim” ako sadrže homologne ostatke na odgovarajućim pozicijama. Homologni ostaci mogu biti identični ostaci. Alternativno, homologni ostaci mogu biti neidentični ostaci sa odgovarajućim strukturnim i/ili funkcionalnim karakteristikama. Na primer, kao što je dobro poznato stručnjacima u tehnici, određene amino-kiseline se obično klasifikuju kao „hidrofobna” ili „hidrofilna” amino-kiselina, i/ili kao da imaju „polarne” ili „nepolarne” bočne lance. Supstitucija jedne amino-kiseline drugom istog tipa se često može smatrati „homolognom” supstitucijom. Tipične kategorizacije amino-kiselina su rezimirane u tabelama 1 i 2.
TABELA 1
Alanin Ala A<Nepolarn>Neutraln 1,8
Arginin Arg R Polarna Positivna -4,5
Asparagin Asn N Polarna Neutraln -3,5
Asparaginska Asp D Polarna Negativn -3,5
Cistein Cys C Nepolarn Neutraln 2,5
Glutaminska Glu E Polarna Negativn -3,5
Glutamin Gin Q Polarna Neutraln -3,5
Glicin Gly G Nepolarn Neutraln -0,4
Histidin His H Polarna Positivna -3,2
Izoleucin lie I Nepolarn Neutraln 4,5
Leucin Leu L Nepolarn Neutraln 3,8
Lizin Lys K Polarna Positivna -3,9
Metionin Met M Nepolarn Neutraln 1,9
Fenilalanin Phe F Nepolarn Neutraln 2,8
Prolin Pro P Nepolarn Neutraln -1,6
Serin Ser S Polarna Neutraln -0,8
Treonin Thr T Polarna Neutraln -0,7
Triptofan Trp W Nepolarn Neutraln -0,9
Tirozin Tyr Y Polarna Neutraln -1,3
Valin Val V Nepolarn Neutraln 4,2
TABELA 2
Dvojake amino-kiseline 3-slova 1-slovo Asparagin ili asparaginska kiselina Asx B
Glutamin ili glutaminska kiselina Glx Z
Leucin ili izoleucin Xie J Nespecifikovana ili nepoznata Xaa X
Kao što je dobro poznato u tehnici, sekvence amino-kiselina ili nukleinskih kiselina mogu se uporediti korišćenjem bilo kog od različitih algoritama, uključujući one dostupne u komercijalnim kompjuterskim programima kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, BLAST sa prazninama i PSI-BLAST za sekvence amino-kiseline. Primeri takvih programa su opisani u Altschul etal. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol..
215(3): 403-410; Altschul etal. (1997) Methods in Enzymology; Altschul et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402: Baxevanis et al. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; and Misener et al. (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. Vol. 132), Humana Press. Pored identifikacije homolognih sekvenci, gore pomenuti programi obično daju indikaciju stepena homologije. Dve sekvence se mogu smatrati u suštini homolognim ako je najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%.85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više njihovih odgovarajućih ostataka su homologni u relevantnom delu ostataka. Relevantni deo može biti kompletna sekvenca. Relevantni deo može biti najmanje 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili više ostataka. Relevantni deo može uključivati neprekidne ostatke duž kompletne sekvence. Relevantni deo može uključivati diskontinuirane ostatke duž kompletne sekvence. Relevantni deo može biti najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više ostataka.
Fraza „suštinski identitet”, kako se ovde koristi, odnosi se na poređenje između sekvenci amino-kiselina ili nukleinskih kiselina. Kao što će stručnjaci sa prosečnim iskustvom u tehnici razumeti, dve sekvence se generalno smatraju „u suštini identičnim” ako sadrže identične ostatke na odgovarajućim pozicijama. Kao što je dobro poznato u ovoj struci, sekvence amino-kiselina ili nukleinskih kiselina mogu se uporediti korišćenjem bilo kog od niza algoritama, uključujući one dostupne u komercijalnim kompjuterskim programima kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, BLAST sa prazninama i PSI-BLAST za sekvence amino-kiselina. Primeri takvih programa su opisani u Altschul et al. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul et al.. Methods in Enzymology; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-3402: Baxevanis et al. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; and Misener et al.. (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. Vol. 132), Humana Press. Pored identifikacije identičnih sekvenci, gore pomenuti programi obično daju indikaciju stepena identiteta. Dve sekvence se mogu smatrati u suštini identičnim ako najmanje 50%, 55%, 60%. 65%, 70%, 75%, 80%. 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%. 96%. 97%, 98%, 99% ili više njihovih odgovarajućih ostataka su identični na relevantnom delu ostataka. Relevantni deo može biti kompletna sekvenca. Relevantni deo može biti najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više ostataka.
Fraza „ciljajući vektor” ili „ciljajuća konstrukcija”, kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotidni molekul koji sadrži ciljajući region. Ciljajući region obuhvata sekvencu koja je identična ili u suštini identična sekvenci u ciljnoj ćeliji, tkivu ili životinji i obezbeđuje integraciju ciljajućeg konstrukta u položaj unutar genoma ćelije, tkiva ili životinje putem homologne rekombinacije. Ciljajući regioni koji ciljaju korišćenjem mesta za prepoznavanje rekombinaze specifičnih za lokaciju (npr. loxP ili Frt mesta) su takođe uključeni. Ciljajući konstrukt predmetnog pronalaska obuhvata 5’ homologni krak koji sadrži genomsku sekvencu uzvodno od egzona 2 mišjeg CD47 gena, 3’ homologni krak koji sadrži genomsku sekvencu nizvodno od egzona 7 mišjeg CD47 gena, genomski DNK fragment koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena i selekcionu kasetu leka, koji opciono dalje sadrži kontrolne i/ili regulatorne sekvence, i druge sekvence nukleinskih kiselina koje omogućavaju rekombinaciju posredovanu egzogenim dodavanjem proteina koji pomažu ili olakšavaju rekombinaciju koja uključuje takve sekvence. Drugi ciljajući konstrukti koji su ovde opisani obuhvataju gen od interesa u celini ili delimično, pri čemu je gen od interesa heterologni gen koji kodira protein, u celini ili delimično, koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom. Drugi ciljajući konstrukti koji su ovde opisani obuhvataju humanizovani gen od interesa, u celini ili delimično, pri čemu humanizovani gen od interesa kodira protein, u celini ili delimično, koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom.
Izraz ”varijanta”, kako se ovde koristi, odnosi se na entitet koji pokazuje značajan strukturni identitet sa referentnim entitetom, ali se strukturno razlikuje od referentnog entiteta u prisustvu ili nivou jednog ili više hemijskih delova u poređenju sa referentnim entitetom. „Varijanta” se, takođe, može funkcionalno razlikovati od svog referentnog entiteta. Generalno, da li se određeni entitet pravilno smatra „varijantom” referentnog entiteta zasniva se na njegovom stepenu strukturnog identiteta sa referentnim entitetom. Kao što će proceniti stručnjaci u tehnici, svaki biološki ili hemijski referentni entitet ima određene karakteristične strukturne elemente. „Varijanta”, po definiciji, poseban je hemijski entitet koji deli jedan ili više takvih karakterističnih strukturnih elemenata. Da damo samo nekoliko primera, mali molekul može imati karakterističan strukturni element jezgra (npr. jezgro makrociklusa) i/ili jedan ili više karakterističnih visećih delova, tako da je varijanta malog molekula ona koja deli osnovni strukturni element i karakteristični viseći deo, ali se razlikuje u drugim visećim delovima i/ili u vrstama prisutnih veza (jednostruka naspram dvostrukih, E naspram Z, itd..) unutar jezgra, a polipeptid može imati karakterističan element sekvence koji se sastoji od više aminokiselina koje imaju određene pozicije jedna u odnosu na drugu u linearnom ili trodimenzionalnom prostoru i/ili doprinose određenoj biološkoj funkciji, nukleinska kiselina može imati karakteristični element sekvence koji se sastoji od mnoštva nukleotidnih ostataka koji imaju određene pozicije u odnosu na druge u linearnom ili trodimenzionalnom prostoru. Na primer, „varijantni polipeptid” može da se razlikuje od referentnog polipeptida kao rezultat jedne ili više razlika u sekvenci amino-kiselina i/ili jedne ili više razlika u hemijskim delovima (npr. ugljeni hidrati, lipidi, itd.) kovalentno vezanim za polipeptidnu kičmu. „Varijantni polipeptid” može pokazati ukupni identitet sekvence sa referentnim polipeptidom koji iznosi najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%.94%, 95%, 96%, 97% ili 99%. Alternativno ili dodatno, „varijantni polipeptid” ne sme da deli najmanje jedan karakteristični element sekvence sa referentnim polipeptidom. Referentni polipeptid može imati jednu ili više bioloških aktivnosti. „Varijantni polipeptid” može da deli jednu ili više bioloških aktivnosti referentnog polipeptida. „Varijantnom polipeptidu” može da nedostaje jedna ili više bioloških aktivnosti referentnog polipeptida. „Varijantni polipeptid” može da pokaže smanjeni nivo jedne ili više bioloških aktivnosti u poređenju sa referentnim polipeptidom. Polipeptid od interesa može se smatrati „varijantom” roditeljskog ili referentnog polipeptida ako polipeptid od interesa ima sekvencu amino-kiselina koja je identična onoj od roditelja, ali za mali broj alternacija sekvence na određenim pozicijama. Tipično, manje od 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ostataka u varijanti je supstituisano u poređenju sa roditeljem. „Varijanta” može da ima 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 supstituisani ostatak u poređenju sa roditeljem. Često, „varijanta” ima veoma mali broj (npr. manje od 5, 4, 3, 2 ili 1) broj supstituisanih funkcionalnih ostataka (tj. ostataka koji učestvuju u određenoj biološkoj aktivnosti). Štaviše, „varijanta” obično nema više od 5, 4, 3, 2 ili 1 adicija ili delecija, i često nema adicija ili delecija, u poređenju sa roditeljem. Štaviše, bilo koja adicija ili delecija su obično manje od oko 25, oko 20, oko 19, oko 18, oko 17, oko 16, oko 15, oko 14, oko 13, oko 10, oko 9, oko 8, oko 7, oko 6, i obično su manje od oko 5, oko 4, oko 3 ili oko 2 ostatka. Roditeljski ili referentni polipeptid može biti onaj koji se nalazi u prirodi. Kao što će razumeti stručnjaci sa prosečnim iskustvom u tehnici, veći broj varijanti određenog polipeptida od interesa se obično može naći u prirodi, posebno kada je polipeptid od interesa polipeptid infektivnog sredstva.
Izraz „vektor”, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je povezan. Vektori mogu biti sposobni za ekstrahromozomsku replikaciju i/ili ekspresiju nukleinskih kiselina za koje su povezani u ćeliji domaćinu kao što je kao eukariotska i/ili prokariotska ćelija. Vektori sposobni da usmeravaju ekspresiju operativno povezanih gena se ovde nazivaju „ekspresioni vektori.” Izraz „divlji tip”, kako se ovde koristi, ima svoje podrazumevano značenje u tehnici koje se odnosi na entitet koji ima strukturu i/ili aktivnost kakva se nalazi u prirodi u „normalnom” (u suprotnosti sa mutantnim, bolesnim, izmenjenim, itd.) stanju ili kontekstu. Prosečan stručnjak u tehnici će podrazumevati da geni i polipeptidi divljeg tipa često postoje u više različitih oblika (npr. aleli).
DETALJAN OPIS ODREĐENIH REALIZACIJA
Predmetni pronalazak se odnosi, između ostalog, na poboljšane i/ili konstruisane glodare koji imaju humanizovani genetski materijal koji kodira klaster diferencijacije 47 (CD47) gena za određivanje terapeutske efikasnosti CD47 antagonista (npr. anti-CD47 antitela) za lečenje raka, i testove ugradnje transplantata, aktivacije i fagocitoze i transdukcije signala. Smatra se da takvi glodari obezbeđuju poboljšanje u određivanju terapeutske efikasnosti CD47 antagonista i njihovog potencijala za blokadu CD47. Takođe se smatra da takvi glodari obezbeđuju poboljšanje presađivanja humanih ćelija. Stoga je predmetni pronalazak posebno koristan za razvoj anti-CD47 terapija za lečenje različitih vrsta raka, kao i za održavanje humanih hematopoetskih ćelija kod glodara. Posebno, predmetni pronalazak se odnosi na humanizaciju mišjeg CD47 gena što rezultira ekspresijom humanizovanog CD47 proteina na površini ćelija glodara. Takvi humanizovani CD47 proteini imaju kapacitet da obezbede izvor humanih CD47<+>ćelija za određivanje efikasnosti anti-CD47 terapeutika za aktiviranje fagocitoze tumorskih ćelija. Dalje, takvi humanizovani CD47 proteini imaju kapacitet da prepoznaju usađene humane ćelije putem angažovanja drugih proteina na ćelijskoj površini i liganada prisutnih na površini presađenih humanih ćelija (npr. SIRPα). Glodari predmetnog pronalaska mogu biti sposobni da aktiviraju fagocitozu putem blokade CD47 signalizacije preko humanizovanog CD47 proteina eksprimovanog na površini ćelija glodara. Glodari predmetnog pronalaska mogu biti sposobni da prime transplantirane humane hematopoetske ćelije; takvi glodari se mogu razviti i/ili imati imuni sistem koji sadrži humane ćelije. Prema pronalasku, humanizovani CD47 proteini obuhvataju deo humanog CD47 polipeptida i unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara, pri čemu deo humanog CD47 polipeptida obuhvata vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, i kodiran je egzonima 2-7 humanog CD47 gena, i pri čemu je unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara kodiran egzonima nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara. Ovde opisan humanizovani CD47 protein ima sekvencu koja odgovara N-terminalnom imunoglobulinskom V domenu humanog CD47 proteina. Ovde opisani humanizovani CD47 proteini imaju sekvencu koja odgovara N-terminalnom delu humanog CD47 proteina koji obuhvata vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 proteina, pri čemu vanćelijski domen uključuje N-terminalni imunoglobulinski V domen humanog CD47 proteina i transmembranski domen obuhvata pet transmembranskih domena humanog CD47 proteina. Humanizovani CD47 protein koji je ovde opisan ima sekvencu koja odgovara intracitoplazmatskom repu CD47 proteina glodara (npr. mišjeg). Humanizovani CD47 proteini opisani ovde imaju sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 19-292 (ili 19-141 ili 19-127) humanog CD47 proteina. Glodari predmetnog pronalaska mogu da sadrže humanizovani endogeni CD47 gen prema pronalasku koji sadrži genetski materijal glodara i čoveka). Ovde opisan humanizovani CD47 gen sadrži egzone humanog CD47 gena koji kodiraju vanćelijski deo uključujući N-terminalni imunoglobulinski V domen humanog CD47 gena. Humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan obuhvata humane CD47 egzone 2-7, koji kodiraju N-terminalni deo humanog CD47 proteina koji obuhvata vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 proteina, pri čemu vanćelijski domen uključuje N-terminalni imunoglobulinski V domen humanog CD47 proteina i transmembranski domen obuhvata pet transmembranskih domena humanog CD47 proteina. Ovde opisani humanizovani CD47 gen obuhvata CD47 egzone glodara koji kodiraju signalni peptid, u celini ili delimično, i intracitoplazmatski rep CD47 proteina glodara. Ovde opisani humanizovani CD47 gen obuhvata CD47 egzon 1 i egzon(e) nizvodno od egzona 7 koji kodiraju intracitoplazmatski rep i 3’ UTR. U zavisnosti od izoforme, može postojati jedan ili više egzona nizvodno od egzona 7, pri čemu su stop kodon i 3’ UTR prisutni u poslednjem egzonu za sve izoforme. Na primer, izoforma 2 i mišjeg i humanog CD47 prikazana u tabeli 3 ima dva egzona nizvodno od egzona 7, označena kao egzon 8 i 9.
Različiti aspekti pronalaska su detaljno opisani u sledećim odeljcima. U ovoj prijavi, upotreba „ili” znači „i/ili” osim ako nije drugačije navedeno.
Klaster diferencijacije 47 (CD47) Gena
CD47, prvobitno nazvan protein povezan sa integrinom (IAP) zbog njegove uloge u transdukciji signala od integrina na imunim ćelijama, je transmembranski protein koji uključuje N-terminalni imunoglobulinski V (IgV) domen, pet transmembranskih domena i kratki C-terminalni intracitoplazmatski rep. Intracitoplazmatski rep se razlikuje po dužini prema četiri alternativno splajsovane izoforme koje su identifikovane. CD47 (ili IAP) je prvobitno opisan kao eksprimovan na svim tkivima (izoforma 2), neuronima (izoforma 4) i keratinocitima i makrofagima (izoforma 1; videti Reinhold et al. (1995) J. Cell Sci.108:3419-3425). Malo se zna o izoformi 3 uprkos tome što ovaj oblik ima drugi najduži intracitoplazmatski rep među četiri izoforme. Pored integrina, poznato je da CD47 interaguje sa nekoliko drugih proteina ćelijske površine kao što su, na primer, trombospondin i članovi porodice SIRP. Najvažnije, CD47 stupa u interakciju sa SIRPα i dovodi do dvosmerne signalizacije koja reguliše različite reakcije ćelije na ćeliju, kao što je, na primer, inhibicija fagocitoze i aktivacija T ćelija. Zaista, interakcija CD47-SIRPα je došla u fokus poslednjih godina zbog svoje uloge u obezbeđivanju tumorskih ćelija kapacitetom da izbegnu imunološki nadzor Vezivanje CD47 za SIRPα normalno obezbeđuje zaštitu normalnim ćelijama putem antifagocitnih signala („nemoj me jesti”). Međutim, otkriveno je da tumori takođe eksprimuju antifagocitne signale, uključujući CD47, da bi izbegli uništenje fagocitozom. Zanimljivo, poznato je da je CD47 pojačan u nekoliko hematoloških karcinoma i doprinosi rastu i širenju tumora (Chao et al. (2012) Curr Opin Immunol.24(2): 225-232).
Potpuni efekti ciljanja CD47 i CD47-SIRPα puta kao novog tretmana za rak su nepoznati, a neke moguće toksičnosti su istražene. Potrebno je temeljnije i detaljnije razumevanje CD47 signalizacije i puta CD47-SIRPα da bi se razvile bolje ciljane terapije za lečenje raka u budućnosti.
CD47 Sekvence
Primeri sekvenci CD47 za miša i čoveka su date u tabeli 3. Za sekvence mRNK, podebljani font označava sekvencu kodiranja, a uzastopni egzoni, gde je naznačeno, razdvojeni su naizmeničnim podvučenim tekstom. Za sekvence proteina miša i čoveka, signalni peptidi su podvučeni, vanćelijske sekvence su podebljane, a intracitoplazmatske sekvence su ispisane kurzivom. Za humanizovane proteinske sekvence, nehumane sekvence su označene regularnim fontom, humane sekvence su označene podebljanim fontom, a signalni peptidi su podvučeni. Kao što je prikazano, izoforme se razlikuju po broju egzona. Na primer, izoforme 1-4 humanog CD47 gena imaju ukupno 8, 9, 10 i 11 egzona, tim redosledom, sa egzonima 2-7 svake izoforme koji kodiraju vanćelijski domen i pet transmembranskih domena.
TABELA 3
Mišji CD47 mRNK izoforma 1 (XM_006521810.1) (nastavak)
(nastavak)
Mišji CD47 izoforma 1 amino-kiseline (XP_006521873.1)
Ĩnastavak) Ĩnastavak) (nastavak) (nastavak)
(nastavak)
Mišji CD47 izoforma 3 amino-kiseline (XP_006521870.1)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
Mišji CD47 izoforma 4 amino-kiseline (XP_006521871.1)
(nastavak)
(nastavak) (nastavak)
(nastavak)
Humani CD47 mRNK izoforma 2 amino-kiseline (NP_942088.1)
(nastavak) (nastavak)
(nastavak) (nastavak)
(nastavak)
Humani CD47 mRNK izoforma 4 amino-kiseline (NP_001768.1)
Humanizovani CD47 mRNK izoforma 1 amino-kiseline
(nastavak)
Humanizovani CD47 mRNK izoforma 3 amino-kiseline
Humanizovani CD47 mRNK izoforma 4 amino-kiseline
Humanizovani CD47 glodara
Ovde su opisani glodari koji eksprimuju humanizovane CD47 proteine na površini ćelija glodara koji su rezultat genetske modifikacije endogenog lokusa glodara koji kodira CD47 protein. Pogodni primeri opisani ovde uključuju, posebno, miševe.
Humanizovani CD47 gen sadrži genetski materijal heterologne vrste (ljudi), pri čemu humanizovani CD47 gen kodira CD47 protein koji sadrži kodirani deo genetskog materijala iz heterologne vrste. Ovde opisan humanizovani CD47 gen sadrži genomsku DNK heterologne vrste koja kodira vanćelijski deo CD47 proteina koji je eksprimovan na plazma membrani ćelije. Humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan obuhvata genomsku DNK čoveka koja kodira vanćelijski domen i transmembranske domene CD47 proteina koji je eksprimovan na plazma membrani ćelije. Prema pronalasku, humanizovani CD47 gen kodira humanizovani CD47 polipeptid koji sadrži deo humanog CD47 polipeptida i unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara, pri čemu deo humanog CD47 polipeptida obuhvata vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, i kodiran je egzonima 2-7 humanog CD47 gena, i pri čemu je unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara kodiran egzonima nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara. Glodari, embrioni, ćelije i ciljajući konstrukti za pravljenje glodara, embriona glodara i ćelija koje sadrže dati humanizovani CD47 gen su, takođe, obezbeđeni.
Endogeni CD47 gen može biti obrisan. Endogeni CD47 gen može biti izmenjen, pri čemu je deo endogenog CD47 gena zamenjen heterolognom sekvencom (Ceo ili u suštini ceo endogeni CD47 gen može biti zamenjen heterolognim genom (. Deo humanog CD47 gena može biti umetnut u endogeni CD47 gen glodara na endogenom CD47 lokusu da bi se formirao humanizovani CD47 gen prema pronalasku. Modifikacija ili humanizacija se može izvršiti u jednoj od dve kopije endogenog CD47 gena, što dovodi do glodara koji je heterozigotan u odnosu na humanizovani CD47 gen. Može se obezbediti glodar koji je homozigotan za humanizovani CD47 gen.
Ovde opisani glodar može da sadrži humanizovani CD47 gen prema pronalasku na endogenom CD47 lokusu glodara. Stoga se takvi glodari mogu opisati kao da imaju heterologni CD47 gen. Zamenjeni, umetnuti, modifikovani ili izmenjeni CD47 gen na endogenom CD47 lokusu može se otkriti korišćenjem različitih postupaka uključujući, na primer, PCR, Western blot, Southern blot, polimorfizam dužine restrikcionog fragmenta (RFLP) ili alel test povećanja ili gubitaka. Glodar može biti heterozigotan u odnosu na humanizovani CD47 gen. Glodar može biti homozigotan za humanizovani CD47 gen.
Humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan uključuje CD47 gen koji ima drugi, treći, četvrti, peti, šesti i sedmi humani egzon, od kojih svaki može imati sekvencu od najmanje 50% (npr 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%.85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu kao drugi, treći, četvrti, peti, šesti i sedmi egzon koji se pojavljuju u humanom CD47 genu iz tabele 3.
Humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan uključuje CD47 gen koji ima prvi egzon i egzon(e) nizvodno od egzona 7 (npr. osmi i deveti egzon izoforme 2), od kojih svaki može imati sekvencu od najmanje 50% (npr. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%. 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%.97%, 98%, 99% ili više) identičnu odgovarajućem egzonu koji se pojavljuje u mišjem CD47 genu iz tabele 3.
Humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan može da uključuje CD47 gen koji ima 5’ neprevedeni region i 3’ neprevedeni region od kojih svaki ima sekvencu od najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%.90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu 5’ neprevedenom regionu i 3’ neprevedenom regionu koji se pojavljuje u mišjem CD47 genu iz tabele 3.
Humanizovani CD47 gen koji je ovde opisan može da uključuje CD47 gen koji ima sekvencu kodiranja nukleotida (npr. cDNK sekvencu) najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu sekvenci kodiranja nukleotida koja se pojavljuje u sekvenci kodiranja humanog CD47 nukleotida iz tabele 3.
Humanizovani CD47 protein proizveden od glodara iz predmetnog pronalaska može imati humani vanćelijski deo koji ima sekvencu amino-kiselina koja je najmanje 50% (npr.., 50%, 55%.60%.65%, 70%, 75%, 80%.85%.90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%.99% ili više) identična vanćelijskom delu humanog CD47 proteina koji se pojavljuje u tabeli 3.
Humanizovani CD47 protein proizveden od glodara predmetnog pronalaska može imati vanćelijski deo koji ima sekvencu amino-kiseline koja je identična amino-kiselinskim ostacima 19-141 koji se pojavljuju u humanom CD47 proteinu iz tabele 3.
Humanizovani CD47 protein proizveden od glodara iz predmetnog pronalaska može imati N-terminalni imunoglobulinski V domen koji ima sekvencu amino-kiseline koja je najmanje 50% (npr. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična sa domenom N-terminalnog imunoglobulinskog V domena humanog CD47 proteina koji se pojavljuje u tabeli 3.
Humanizovani CD47 protein proizveden od glodara iz predmetnog pronalaska može imati N-terminalni imunoglobulinski V domen koji ima sekvencu amino-kiseline koja je identična amino-kiselinskim ostacima 19-127 koji se pojavljuju u humanom CD47 proteinu iz tabele 3.
Humanizovani CD47 protein proizveden od glodara iz predmetnog pronalaska može imati N-terminalni imunoglobulinski V domen i pet transmembranskih domena, od kojih svaki ima sekvencu koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%. 96%. 97%, 98%, 99% ili više) identična sa N-terminalnim imunoglobulinskim V domenom i pet transmembranskih domena humanog CD47 proteina koji se pojavljuje u tabeli 3.
Humanizovani CD47 protein proizveden od glodara predmetnog pronalaska može imati intracitoplazmatski rep koji ima sekvencu koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%.91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična sa intracitoplazmatskim repom mišjeg CD47 proteina koji se pojavljuje u tabeli 3.
Humanizovani CD47 protein proizveden od glodara predmetnog pronalaska može imati sekvencu amino-kiseline koja je najmanje 50% (npr.50%.55%, 60%.65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična ostacima amino-kiselina 16-292 koji se pojavljuju u humanom CD47 proteinu iz tabele 3.
Humanizovani CD47 protein proizveden od glodara predmetnog pronalaska može imati sekvencu amino-kiseline koja je najmanje 50% (npr.50%.55%, 60%.65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična ostacima amino-kiselina 19-292 koji se pojavljuju u humanom CD47 proteinu iz tabele 3.
Humanizovani CD47 protein proizveden od glodara predmetnog pronalaska može imati sekvencu amino-kiseline koja je identična amino-kiselinskim ostacima 19-292 (ili 16-292) koji se pojavljuju u humanom CD47 proteinu iz tabele 3.
Humanizovani CD47 protein proizveden od glodara predmetnog pronalaska može imati sekvencu amino-kiseline koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična sekvenci amino-kiselina humanizovanog CD47 proteina koja se pojavljuje u tabeli 3.
Humanizovani CD47 protein proizveden od glodara iz predmetnog pronalaska može imati sekvencu amino-kiseline koja je identična sekvenci amino-kiseline humanizovanog CD47 proteina koja se pojavljuje u tabeli 3.
Opisane su kompozicije i postupci za pravljenje glodara koji eksprimuju humanizovani CD47 protein, uključujući specifične polimorfne oblike, alelne varijante (npr. razlike u jednoj amino-kiselini) ili alternativno spojene izoforme, uključujući kompozicije i postupke za pravljenje glodara koji eksprimuju takve proteine od humanog promotora i humane regulatorne sekvence. Takođe su opisane kompozicije i postupci za pravljenje glodara koji eksprimuju takve proteine iz endogenog promotora i endogene regulatorne sekvence. Postupci uključuju umetanje genetskog materijala koji kodira deo humanog CD47 proteina koji sadrži najmanje vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 proteina na preciznoj lokaciji u genomu glodara koja odgovara endogenom CD47 genu, čime se stvara humanizovani CD47 gen koji eksprimuje humanizovani CD47 protein koji sadrži najmanje vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 proteina, i unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara. Postupci uključuju umetanje genomske DNK koja odgovara egzonima 2-7 humanog CD47 gena u endogeni CD47 gen glodara čime se stvara humanizovani gen koji kodira CD47 protein koji sadrži humani deo koji sadrži amino-kiseline kodirane umetnutim egzonima i koji sadrži najmanje vanćelijski domen i transmembranski domen humanog CD47 proteina.
Gde je prikladno, kodirajući region genetskog materijala ili polinukleotidne sekvence koja kodira deo humanog CD47 proteina koji sadrži najmanje vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 proteina može biti modifikovan tako da uključuje kodone koji su optimizovani za ekspresiju kod glodara (npr. vidi U.S. Patente br.
5,670,356 i 5,874,304). Kodonom optimizovane sekvence su sintetičke sekvence i poželjno kodiraju identični polipeptid (ili biološki aktivni fragment polipeptida pune dužine koji ima u suštini istu aktivnost kao polipeptid pune dužine) kodiran roditeljskim polinukleotidom koji nije optimizovan za kodon. Kodirajući region genetskog materijala koji kodira deo humanog CD47 proteina koji sadrži najmanje vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 proteina može da uključuje izmenjenu sekvencu za optimizaciju upotrebe kodona za određeni tip ćelije (ćeliju glodara). Na primer, kodoni genomske DNK koji odgovaraju egzonima 2-7 humanog CD47 gena koji se ubacuju u endogeni CD47 gen glodara mogu biti optimizovani za ekspresiju u ćeliji glodara. Takva sekvenca se može opisati kao kodon-optimizovana sekvenca.
Pristup humanizovanog CD47 gena koristi relativno minimalnu modifikaciju endogenog gena i rezultira prirodnom transdukcijom CD47 posredovanom signalom kod glodara, jer je genomska sekvenca CD47 sekvenci modifikovana u jednom fragmentu i stoga zadržava normalnu funkcionalnost uključivanjem neophodnih regulatornih sekvenci. Dakle, u takvim slučajevima, modifikacija CD47 gena ne utiče na druge okolne gene ili druge endogene gene koji deluju na CD47 (npr. trombospondin, SIRP, integrine, itd.). Dalje, modifikacija ne utiče na sklapanje funkcionalnog CD47 transmembranskog proteina na plazma membrani i održava normalne efektorske funkcije putem vezivanja i naknadne transdukcije signala kroz citoplazmatski deo proteina koji nije pod uticajem modifikacije.
Shematska ilustracija (ne u razmeri) genomske organizacije endogenog mišjeg CD47 gena i humanog CD47 gena je data na Slici 1. Primer postupka za humanizaciju endogenog mišjeg CD47 gena korišćenjem genomskog fragmenta koji sadrži egzone 2-7 gena humanog CD47 gena je dat na Slici 2. Kao što je prikazano, genomska DNK koja sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena je umetnuta u endogeni mišji CD47 genski lokus pomoću ciljajuće konstrukcije. Ova genomska DNK uključuje deo gena koji kodira vanćelijski deo i transmembranske domene (npr. amino-kiseline 16-292) humanog CD47 proteina odgovornog za vezivanje liganda.
Glodar (npr. miš) koji ima humanizovani CD47 gen na endogenom CD47 lokusu može se napraviti bilo kojim postupakom poznatim u tehnici. Na primer, može se napraviti vektor za ciljanje koji uvodi deo humanog CD47 gena sa selekcionom kasetom leka. Slika 2 prikazuje endogeni CD47 lokus mišjeg genoma koji sadrži inserciju egzona 2-7 humanog CD47 gena. Kao što je prikazano, ciljajući konstrukt sadrži 5’ homologni krak koji sadrži sekvencu uzvodno od egzona 2 endogenog mišjeg CD47 gena (-39 Kb), nakon čega sledi genomski DNK fragment koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena (-23,9 Kb ), selekciona kaseta leka (npr. gen otpornosti na neomicin sa obe strane loxP sekvence; ~5 Kb), i 3’ homologni krak koji sadrži sekvencu nizvodno od egzona 7 endogenog mišjeg CD47 gena (~99 Kb). Ciljajuća konstrukcija sadrži selekcionu kasetu leka koja se sama briše (npr. gen otpornosti na neomicin okružen loxP sekvencama; vidi U.S. Patenti br.
8,697,851, 8,518,392 i 8,354,389). Nakon homologne rekombinacije, egzoni 2-7 endogenog mišjeg CD47 gena su zamenjeni sekvencom sadržanom u ciljajućem vektoru (tj., egzoni 2-7 humanog CD47 gena). Humanizovani CD47 gen je stvoren što rezultira ćelijom ili nehumanom životinjom koja eksprimuje humanizovani CD47 protein koji sadrži amino-kiseline kodirane egzonima 2-7 humanog CD47 gena. Selekciona kaseta leka se uklanja na način koji zavisi od razvoja, to jest, potomstva izvedeno od miševa čije ćelije zametne linije koje sadrže humanizovani CD47 gen koji je gore opisan će odbaciti selektabilni marker iz diferenciranih ćelija tokom razvoja.
Glodari iz predmetnog pronalaska mogu biti pripremljeni kao što je gore opisano, ili korišćenjem postupak poznatih u tehnici, da sadrže dodatne humane ili humanizovane gene, često u zavisnosti od nameravane upotrebe glodara. Genetski materijal takvih dodatnih humanih ili humanizovanih gena može se uvesti kroz dalju promenu genoma ćelija (npr. embrionalne matične ćelije) koje imaju genetske modifikacije kao što je gore opisano ili kroz tehnike oplemenjivanja poznatih u tehnici sa drugim genetski modifikovanim sojevima po želji. Glodari predmetnog pronalaska su pripremljeni da dalje sadrže jedan ili više humanih ili humanizovanih gena izabranih iz SIRPα (CD172a), IL-3, M-CSF, GM-CSF i TPO. Glodari predmetnog pronalaska se mogu pripremiti uvođenjem ciljajućeg vektora, kao što je ovde opisano, u ćeliju iz modifikovanog soja. Da damo samo jedan primer, ciljajući vektor, kao što je gore opisano, može biti uveden u miša koji ima Rag2-deficijent i IL-2Ry-deficijent i uključuje četiri humana citokina (Rag2”IL2Rvc'</>'; M-CSF<Hu>; IL- 3/GM-CSF<Hu>; hSIRPα'9; TPO<Hu>). Glodari predmetnog pronalaska se mogu pripremiti tako da dalje sadrže humani ili humanizovani gen za signalnog regulatornog proteina-α (SIRPα). Glodari predmetnog pronalaska obuhvataju humanizovani CD47 gen, kako je ovde opisano, i genetski materijal heterologne vrste (ljudi), pri čemu genetski materijal kodira jedan ili više heterolognih proteina izabranih iz SIRPα (CD172a), IL-3, M-CSF, GM-CSF i TPO. Glodari predmetnog pronalaska mogu da sadrže humanizovani CD47 gen kako je ovde opisano i genetski materijal heterologne vrste (ljudi), pri čemu genetski materijal može da kodira heterologni (humani) SIRPα (CD172a) protein. Glodari predmetnog pronalaska mogu dalje da sadrže SIRPα gen koji sadrži endogeni deo i humani deo (npr. egzone 2-4 humanog SIRPα gena), pri čemu humani deo kodira vanćelijski domen SIRPα proteina (npr. amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 28-362 humanog SIRPα proteina) i endogeni deo kodira unutarćelijski domen endogenog SIRPα proteina; humani deo i endogeni deo mogu biti operativno povezani sa endogenim SIRPa promotorom.
Na primer, kao što je ovde opisano, glodari koji sadrže humanizovani CD47 gen mogu dalje da sadrže (npr. ukrštanjem ili višestrukim strategijama ciljanja gena) jednu ili više modifikacija kao što je opisano u PCT/US2010/051339, podnetom 4. oktobra 2010: PCT/US2013/058448, podnetom 6. septembra 2013: PCT/US2013/045788, podnetom 14. juna 2013: PCT/US2014/056910, podnetom 23. septembra 2014: PCT/US2014/060568, podnetom 15. oktobra 2014: PCT/US2012/025040, podnetom 14. februara 2014: PCT/US2012/062379, podnetom 29. oktobra 2012: PCT/US2014/064806, podnetom 10. novembra 2014; i PCT/US2014/064810, podnetom 10. novembra 2014. Kao što je ovde opisano, glodar koji sadrži humanizovani CD47 gen (tj., egzone 2-7 humanog CD47 gena koji su operativno povezani sa egzonom 1 i egzonom 8 (a samim tim i bilo kojim egzonima koji se nalaze nizvodno) endogenog CD47 gena glodara tako da humanizovani CD47 gen kodira CD47 polipeptid koji ima vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 proteina i unutarćelijski deo od CD47 proteina glodara) može se ukrstiti na glodara koji sadrži humanizovani SIRPα gen (npr. egzoni 2-4 humanog SIRPα gena operativno povezan sa egzonima 1 i 5-8 endogenog SIRPα gena glodara tako da humanizovani SIRPα gen kodira SIRPα polipeptid koji ima vanćelijski deo iz humanog SIRPα proteina (npr. amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 28-362) i unutarćelijski deo od SIRPα proteina glodara; vidi, npr. PCT/US2014/056910, podnet 23. septembra 2014).
Iako se ovde opširno raspravlja o realizacijama koje koriste humanizovani CD47 gen kod miša (tj. miša sa genom CD47 koji kodira CD47 protein koji uključuje humani deo i deo miša), opisani su i drugi glodari koji sadrže humanizovani CD47 gen. Takvi glodari mogu da sadrže humanizovani CD47 gen koji je operativno vezan za endogeni CD47 promotor. Takvi glodari mogu da eksprimuju humanizovani CD47 protein iz endogenog lokusa, pri čemu humanizovani CD47 protein sadrži aminokiselinske ostatke 16-292 (ili 19-141 ili 19-127) humanog CD47 proteina. Takvi glodari uključuju bilo koje od onih koji se mogu genetski modifikovati da eksprimuju CD47 protein kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti, uključujući, na primer, miša, pacova, itd. Na primer, za one glodare za koje pogodne genetski modifikovane ES ćelije nisu lako dostupne, drugi postupci se koriste za pravljenje glodara koji sadrži genetsku modifikaciju. Takvi postupci uključuju, na primer, modifikaciju genoma ne-ES ćelije (npr. fibroblasta ili indukovane pluripotentne ćelije) i korišćenje nuklearnog transfera somatskih ćelija (SCNT) za prenos genetski modifikovanog genoma u odgovarajuću ćeliju, na primer, enukleisani oocit, i gestaciju modifikovane ćelije (npr. modifikovane jajne ćelije) kod glodara pod pogodnim uslovima da bi se formirao embrion.
Postupci za modifikaciju genoma glodara uključuju, na primer, korišćenje cinkov prst nukleaza (ZFN) ili efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN) da bi se modifikovao genom da bi se uključio humanizovani CD47 gen.
Glodar iz predmetnog pronalaska može biti izabran iz miša, pacova i hrčka. Glodar iz predmetnog pronalaska može biti izabran iz natporodice Muroidea. Genetski modifikovani glodar iz predmetnog pronalaska može biti iz porodice izabrane između Calomyscidae (npr. hrčci slični mišu), Cricetidae (npr. hrčak, pacovi iz Novog sveta, voluharice). Muridae (pravi miševi i pacovi, skočimiševi, bodljikavi miševi, grivasti pacovi), Nesomyidae (penjački miševi, - Dendromus melanotis, stenoviti pacovi Chaetodipus intermedius, belorepi pacovi, malgaški pacovi - Hypogeomys antimena i miševi), Platacanthomyidae (npr. bodljikavi puhovi -Platacanthomys lasiurus) i Spalacidae (npr. krtice, bambusovi pacovi i zokori). Genetski modifikovani glodar iz predmetnog pronalaska može biti izabran iz pravog miša ili pacova (porodica Muridae), skočimiševa, bodljikavih miševa, grivastih pacova. Genetski modifikovani miš iz predmetnog pronalaska može biti iz porodice Muridae. U jednoj realizaciji, glodar iz predmetnog pronalaska je izabran između miša i pacova. U jednoj realizaciji, glodar iz predmetnog pronalaska je miš.
Glodar iz predmetnog pronalaska može biti miš soja C57BL izabran iz C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr i C57BL/Ola. Miš iz predmetnog pronalaska može biti soj 129 odabran iz grupe koju čine soj 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr.
129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2. 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae. 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (videte, npr. Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836: Auerbach, W. et al., 2000. Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030. 1032). Genetski modifikovani miš predmetnog pronalaska može biti mešavina prethodno pomenutog soja 129 i prethodno pomenutog soja C57BL/6. Miš predmetnog pronalaska može biti mešavina prethodno pomenutih 129 sojeva, ili mešavina prethodno navedenih BL/6 sojeva.
129 soj mešavine kako je ovde opisano može biti soj 129S6 (129/SvEvTac). Miš predmetnog pronalaska može biti BALB soj, npr. BALB/c soj. Miš predmetnog pronalaska može biti mešavina soja BALB i drugog prethodno pomenutog soja.
U jednoj realizaciji, glodar iz predmetnog pronalaska je pacov. Pacov iz predmetnog pronalaska može biti izabran iz pacova Wistar, soja LEA, soja Sprague Dawley, soja Fischer, F344, F6 i Dark Agouti. Soj pacova kako je ovde opisan može biti mešavina dva ili više sojeva izabranih iz grupe koju čine Wistar, LEA. Sprague Dawley, Fischer. F344. F6. i Dark Agouti.
Postupci koji koriste glodare koji imaju humanizovane CD47 gene
Prijavljeni su mutantni CD47 i transgene životinje koje nisu humane (npr. patuljaste svinje) i ćelije (Koshimizu H. et al. (2014) PLoS One, 9(2):e89584; Lavender, K.J. et al. (2014) J. Immunol. Methods, 407:127-134; Tena, A. et al. (2014) Am. J. Transplant.doi: 10.1111/ajt.
12918; Lavender K.J. et al. (2013) Blood, 122(25):4013-4020; Tena, A. et al. (2012) Transplantation 94(10S):776; Wang, C. et al. (2011) Cell Transplant.20(11 -12):1915-1920; Johansen, M.L. and Brown, E.J. (2007) J. Biol. Chem. 282:24219-24230; Wang, H. et al. (2007) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 104:13744-13749; Tulasne D. et al. (2001) Blood, 98(12):3346-52; Oldenborg. P.etal. (2000) Science 288:2051-2054; Verdrengh, M. etal. (1999) Microbes Infect.1(10):745-751; Chang, H.P. etal. (1999) Learn Mem. 6(5):448-457; Wang, X.Q. et al. (1999) J. Cell Biol. 147(2):389-400; Lindberg. F.P. et al. (1996) Science 274(5288):795-798). Takve životinje su korišćene u različitim testovima da bi se odredili, na primer, molekularni aspekti ekspresije, funkcije i regulacije CD47. Otkrivene su značajne razlike u vrstama. Zaista, negojazni miševi sa dijabetesom/teškim kombinovanim imunodeficijentnim (NOD/SCID) eksprimuju SIRPα protein koji je sposoban da stupi u interakciju sa humanim CD47 i, stoga, se intenzivno koristi za razvoj mišjih modela sa komponentama humanog imunog sistema (npr. vidi Takenaka, K. et al. (2007) Nat. Immunol.
8(120:1313-1323). Alel SIRPα prisutan kod ovih miševa nije reprezentativan za alel SIRPα prisutan u drugim sojevima miševa i, generalno, postoji mala unakrsna reakcija između CD47 i SIRPα između vrsta. Takođe, prijavljeno je da CD47 na ćelijama miša ima skoro potpunu pokretljivost, dok CD47 na humanim ćelijama pokazuje samo oko 30-40% (Bruce. L. et al. (2003) Blood 101:4180-4188; Mouro- Chanteloup, L. et al. (2000) VoxSanguinis 78:P030; Mouro-Chanteloup, L. et al. (2003) Blood 101:338-344). Dakle, NOD/SCID miševi nisu bez ograničenja. Na primer, iako višelinijski humani hematopoetski razvoj može biti podržan u nekim genetskim pozadinama (npr. BALB/c Rag2-</>-IL-2R-,'C-</>-), homeostaza drugih tipova ćelija ostaje neefikasna (npr. T i NK ćelije; vidi npr. Gimeno, R. etal. (2004) Blood 104:3886-3893; Traggiai. E. etal. (2004) Science 304:104-107; Legrand, N. et al. (2006) Blood 108:238-245). Dalje, poznato je da CD47 stupa u interakciju sa drugim proteinima ćelijske površine i obezbeđuje dvosmernu signalizaciju. Dakle, postojeći miševi predstavljaju neefikasne in vivo sisteme za razjašnjavanje funkcija zavisnih od CD47 u različitim biološkim procesima kao što su, na primer, presađivanje i fagocitoza. Dalje, postojeći miševi predstavljaju suboptimalne in vivo sisteme za razvoj CD47 ciljanih terapija.
Glodari predmetnog pronalaska obezbeđuju poboljšani in vivo sistem i izvor bioloških materijala (npr. ćelija) koji eksprimuju humani CD47 koji su korisni za razne testove. Glodari predmetnog pronalaska se mogu koristiti za razvoj terapeutika koji ciljaju na CD47 i/ili moduliraju CD47-SIRPα signalizaciju. Glodari predmetnog pronalaska se mogu koristiti za skrining i razvoj kandidata za terapiju (npr. antitela) koji vezuju humani CD47. Glodari predmetnog pronalaska mogu se koristiti za skrining i razvoj kandidata za terapiju (npr. antitela) koja blokiraju interakciju humanog CD47 sa humanim SIRPα. Glodari predmetnog pronalaska se mogu koristiti za određivanje profila vezivanja antagonista i/ili agonista humanizovanog CD47 na površini ćelije glodara kao što je ovde opisano. Glodari predmetnog pronalaska se mogu koristiti za određivanje jednog ili više epitopa jednog ili više kandidatskih terapeutskih antitela koja vezuju humani CD47.
Glodari predmetnog pronalaska se mogu koristiti za određivanje farmakokinetičkih profila anti-CD47 antitela. Jedan ili više glodara predmetnog pronalaska i jedan ili više kontrolnih ili referentnih glodara mogu biti izloženi jednom ili više kandidata terapeutskih anti-CD47 antitela u različitim dozama (npr. 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg , 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/mg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg , 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg ili 50 mg/kg ili više). Terapijska antitela kandidata mogu se dozirati na bilo koji željeni način primene (npr. supkutano, intravenozno, intramuskularno, intraperitonealno, itd.). Krv se može izolovati od glodara (humanizovanih i kontrolnih) u različitim vremenskim tačkama (npr.0 sati, 6 sati, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana , 10 dana, 11 dana ili do 30 ili više dana). Mogu se izvršiti različiti testovi da bi se odredili farmakokinetički profili primenjenih kandidatskih terapijskih antitela korišćenjem uzoraka dobijenih od glodara kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ukupni IgG, antiterapijski odgovor antitela, aglutinaciju, itd.
Glodari predmetnog pronalaska se mogu koristiti za merenje terapeutskog efekta blokiranja ili modulacije CD47 signalizacije i efekta na ekspresiju gena kao rezultat ćelijskih promena. Glodar iz predmetnog pronalaska ili ćelije izolovane od njih mogu biti izloženi terapeutskom kandidatu koji se vezuje za humanizovani CD47 protein (ili humani deo CD47 proteina) na površini ćelije glodara i, nakon naknadnog perioda od vreme, analiziran za efekte na CD47 zavisne procese, na primer, adheziju, angiogenezu, apoptozu, upalu, migraciju, fagocitozu, proliferaciju i klirens tumora (ili tumorskih ćelija).
Opisani su glodari predmetnog pronalaska koji eksprimuju humanizovani CD47 protein. Tako ćelije, ćelijske linije i ćelijske kulture mogu da se generišu da služe kao izvor humanizovanog CD47 za upotrebu u vezivnim i funkcionalnim testovima, npr. za ispitivanje vezivanja ili funkcije CD47 antagonista ili agonista, posebno kada je antagonist ili agonist specifičan za humanu SIRPα sekvencu ili epitop. CD47 epitopi vezani kandidatima za terapeutska antitela mogu se odrediti korišćenjem ćelija izolovanih od glodara predmetnog pronalaska.
Ćelije glodara iz predmetnog pronalaska mogu se izolovati i koristiti na ad hoc osnovi, ili se mogu održavati u kulturi tokom mnogih generacija. Ćelije glodara iz predmetnog pronalaska mogu biti učinjenje besmrtnim i održavane u kulturi neograničeno (npr. u serijskim kulturama).
Ćelije i/ili glodari predmetnog pronalaska mogu se koristiti u testu preživljavanja i/ili proliferacije (npr. korišćenjem B ili T ćelija) za skrining i razvoj kandidata za terapiju koja modulira humanu CD47 signalizaciju. Aktivacija ili gubitak
CD47 može igrati važnu ulogu u regulaciji ćelijske proliferacije, a indukcija apoptoze pomoću CD47 može biti rezultat aktivacije specifičnih epitopa vanćelijskog domena CD47, dakle kandidati za modulatore CD47 (npr. antagonisti ili agonisti) mogu se identifikovati, okarakterisati i razviti korišćenjem ćelija glodara iz predmetnog pronalaska. Ćelije i/ili glodari predmetnog pronalaska mogu da se koriste u testu(ovima) preživljavanja ili smrti da bi se odredio efekat na proliferaciju ili apoptozu specifične ćelije(a) (npr. ćelije raka) u prisustvu i odsustvu CD47.
Ćelije i/ili glodari predmetnog pronalaska mogu se koristiti u ksenotransplantaciji heterolognih (npr. humanih) ćelija da bi se odredile funkcije posredovane CD47 u fiziološkom (npr. imunološkom) odgovoru na transplantirane humane ćelije. Kandidati za terapiju koji vezuju ili blokiraju jednu ili više funkcija humanog CD47 mogu se okarakterisati kod glodara predmetnog pronalaska. Pogodna merenja uključuju različite testove ćelija, testove proliferacije, analizu imunoglobulina u serumu (npr. titar antitela), testove citotoksičnosti i karakterizaciju interakcija ligand-receptor (testovi imunoprecipitacije). Glodari predmetnog pronalaska se mogu koristiti za karakterizaciju CD47 posredovanih funkcija koje regulišu imuni odgovor na antigen. Antigen može biti povezan sa neoplazmom. Antigen može biti povezan sa autoimunom bolešću ili stanjem. Antigen može biti meta povezana sa bolešću ili stanjem kod jednog ili više humanih pacijenata kojima je potrebno lečenje.
Glodari predmetnog pronalaska mogu se koristiti u eksperimentima transplantacije ili usvajanja transfera da bi se odredio terapeutski potencijal jedinjenja ili bioloških sredstava za modulaciju CD47 zavisne regulacije novih limfocita i njihove imunološke funkcije. Glodari predmetnog pronalaska mogu biti transplantirani sa humanim B ćelijama.
Ćelije glodara predmetnog pronalaska mogu se koristiti u testu migracije ćelija ili širenja za skrining i razvoj kandidata za terapiju koja modulira humani CD47. Takvi procesi su neophodni za mnoge ćelijske procese uključujući zarastanje rana, diferencijaciju, proliferaciju i preživljavanje.
Ćelije glodara predmetnog pronalaska mogu se koristiti u testovima fagocitoze da bi se odredio terapeutski potencijal jedinjenja ili bioloških sredstava za modulaciju regulacije fagocitoze zavisne od CD47.
Ćelije glodara predmetnog pronalaska mogu se koristiti u testovima rasta (ili proliferacije) tumorskih ćelija da bi se odredio terapeutski potencijal jedinjenja ili bioloških sredstava za modulaciju regulacije zavisne od CD47 i/ili apoptoze tumorskih ćelija.
Inflamatorna bolest ili stanje može biti izazvano kod jednog ili više glodara predmetnog pronalaska da bi se obezbedio in vivo sistem za određivanje terapeutskog potencijala jedinjenja ili bioloških sredstava za modulaciju CD47 zavisne regulacije jedne ili više funkcija inflamatorne bolesti ili stanja. Inflamatorna bolest ili stanje može biti povezano sa neoplazmom.
Anti-angiogeno stanje može biti izazvano kod jednog ili više glodara predmetnog pronalaska da bi se obezbedio in vivo sistem za određivanje terapeutskog potencijala jedinjenja ili bioloških sredstava da modulišu CD47 zavisnu regulaciju jedne ili više funkcija antiangiogenog stanja. Primeri funkcija koje se mogu proceniti da bi se odredila terapijska efikasnost uključuju ekspresiju hemokina, odgovore stimulisane azotnim oksidom (NO) i oporavak krvotoka.
Glodari predmetnog pronalaska mogu da obezbede jedan in vivo sistem za analizu i ispitivanje leka ili vakcine. Kandidat za lek ili vakcinu može biti isporučen jednom ili više glodara predmetnog pronalaska, nakon čega sledi praćenje glodara da bi se odredio jedan ili više imunoloških odgovora na lek ili vakcinu, bezbednosni profil leka ili vakcine, ili uticaj na bolest ili stanje. Primeri postupaka koji se koriste za određivanje bezbednosnog profila uključuju merenja toksičnosti, optimalne koncentracije doze, efikasnosti leka ili vakcine i mogućih faktora rizika. Takvi lekovi ili vakcine se mogu poboljšati i/ili razviti kod takvih glodara.
Glodari predmetnog pronalaska obezbeđuju in vivo sistem za procenu farmakokinetičkih svojstava leka koji cilja na CD47. Lek koji cilja na humani CD47 može biti isporučen ili davan jednom ili više glodara predmetnog pronalaska, nakon čega sledi praćenje ili izvođenje jednog ili više testova na glodarima (ili ćelijama izolovanim od njih) da bi se odredio efekat leka na glodara. Farmakokinetička svojstva uključuju, ali nisu ograničena na, kako životinja prerađuje lek u različite metabolite (ili otkrivanje prisustva ili odsustva jednog ili više metabolita leka, uključujući toksične metabolite), poluvreme leka, nivoe leka u cirkulaciji nakon primene (npr. koncentracija leka u serumu), odgovor na lek (npr. antitela protiv leka), apsorpcija i distribucija leka, način primene, putevi izlučivanja i/ili klirensa leka. Farmakokinetičke i farmakodinamičke osobine lekova (npr. CD47 modulatora) mogu se pratiti tokom ili kroz upotrebu glodara iz predmetnog pronalaska.
Glodari predmetnog pronalaska obezbeđuju in vivo sistem za procenu toksičnosti leka koji cilja na CD47. Lek koji cilja na CD47 može da se isporuči ili da jednom ili više glodara iz predmetnog pronalaska, praćen praćenjem ili izvođenjem jednog ili više testova na glodarima (ili ćelijama izolovanim od njih) da bi se odredio ciljni toksični efekat leka na glodaru. Tipično, lekovi su namenjeni da modulišu jednu ili više funkcija svojih meta. Da damo samo jedan primer, CD47 modulator je namenjen da moduliše funkcije posredovane CD47 (npr. CD47 indukovana apoptoza) kroz interakciju na neki način sa molekulom CD47 na površini jedne ili više ćelija. Takav modulator može imati neželjeni efekat koji predstavlja preuveličavanje željenog(ih) farmakološkog(ih) dejstva(ava) modulatora. Takvi efekti se nazivaju efekti na meti (ciljni). Primeri efekata na meti uključuju previsoku dozu, hroničnu aktivaciju/inaktivaciju i ispravnu akciju u pogrešnom tkivu. Ciljni efekti leka koji cilja na CD47 identifikovani u ili kroz upotrebu glodara iz predmetnog pronalaska mogu da se koriste za određivanje prethodno nepoznate funkcije(a) CD47.
Glodari predmetnog pronalaska mogu da obezbede in vivo sistem za procenu vanciljne toksičnosti leka koji cilja na CD47. Lek koji cilja na CD47 može biti isporučen ili administriran jednom ili više glodara predmetnog pronalaska, praćen praćenjem ili izvođenjem jednog ili više testova na glodarima (ili ćelijama izolovanim od njih) da bi se odredio vanciljni toksični efekat leka na glodara. Vanciljni efekti mogu se javiti kada lek stupi u interakciju sa nenamernom metom (npr. unakrsna reaktivnost na zajednički epitop). Takve interakcije se mogu javiti u planiranom ili neplaniranom tkivu. Da damo samo jedan primer, izomeri kao u ogledalu (enantiomeri) leka mogu dovesti do toksičnih efekata van cilja. Dalje, lek može na neodgovarajući način da stupi u interakciju sa različitim podtipovima receptora i nenamerno ih aktivira. Primeri vanciljnih efekata uključuju netačnu aktivaciju/inhibiciju pogrešne mete bez obzira na tkivo u kome se nalazi netačna meta. Vanciljni efekti leka koji cilja na CD47 mogu se odrediti upoređivanjem efekata davanja leka glodarima iz predmetnog pronalaska sa jednim ili više referentnih glodara.
Izvođenje testova može da uključuje određivanje efekta na fenotip (npr. promena telesne težine) i/ili genotip ne-humane životinje čovek kojoj se lek daje. Izvođenje testova može da uključuje određivanje varijabilnosti od serije do serije za CD47 modulator (npr. antagonist ili agonist). Izvođenje testova može da uključuje određivanje razlika između efekata leka koji cilja na CD47 koji se daje glodaru iz predmetnog pronalaska i referentnom glodaru. Referentni glodari mogu imati modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikaciju koja je drugačija nego što je ovde opisano (npr. ona koja ima disrupciju, deleciju ili na neki drugi način nefunkcionalni CD47 gen) ili bez modifikacije (tj. glodar divljeg tipa).
Primeri parametara koji se mogu meriti kod glodara (ili u i/ili korišćenjem ćelija izolovanih od njih) za procenu farmakokinetičkih svojstava, toksičnosti na meti i/ili toksičnosti van cilja leka koji cilja na CD47 uključuju, ali nisu ograničeni na, aglutinaciju, autofagiju, deobu ćelija, ćelijsku smrt, hemolizu posredovanu komplementom, integritet DNK, titar specifičnih antitela, metabolizam leka, nizove ekspresije gena, nivoe hematokrita, hematuriju, metabolička aktivnost, mitohondrijsku aktivnost, oksidativni stres, fagocitozu, biosintezu proteina, degradaciju proteina, sekreciju proteina, odgovor na stres, koncentraciju leka u ciljnom tkivu, koncentraciju leka u neciljanom tkivu, aktivnost transkripcije i slično. Glodari predmetnog pronalaska se mogu koristiti za određivanje farmaceutski efikasne doze CD47 modulatora.
Glodari predmetnog pronalaska mogu da obezbede poboljšani in vivo sistem za razvoj i karakterizaciju terapeutskih kandidata za upotrebu u lečenju raka. Glodarima predmetnog pronalaska može se implantirati tumor, nakon čega sledi davanje jednog ili više kandidata za terapiju. Kandidati za terapiju mogu da uključuju multispecifično antitelo (npr.
bispecifično antitelo) ili koktel antitela; kandidati za terapiju mogu da uključuju kombinovanu terapiju kao što je, na primer, primena mono-specifičnih antitela doziranih uzastopno ili istovremeno. Tumoru se može dati dovoljno vremena da se uspostavi na jednoj ili više lokacija unutar glodara. Proliferacija tumorskih ćelija, rast, itd. mogu se meriti i pre i posle primene sa kandidatom(ima) za terapiju. Citotoksičnost kandidata za terapiju takođe se može meriti kod glodara po želji.
Glodari predmetnog pronalaska mogu da obezbede poboljšani in vivo sistem koji razjašnjava mehanizme humana ćelija-ćelija interakcije putem transfera usvajanja. Glodarima iz predmetnog pronalaska može se implantirati tumorski ksenograft, nakon čega bi usledila druga implantacija limfocita koji infiltriraju tumor koji bi se mogli implantirati u glodare putem adaptivnog transfera da bi se odredila efikasnost u eradikaciji solidnih tumora ili drugih maligniteta. Takvi eksperimenti se mogu uraditi sa humanim ćelijama zbog ekskluzivnog prisustva humanog CD47 bez konkurencije sa endogenim CD47 glodara. Alternativno, takvi eksperimenti mogu uključivati upotrebu mišjih ćelija iz NOD/SCID ili BRG (BALB/c Rag2’</>'IL-2R,'C’</>' ) pozadine. Dalje, terapije i farmaceutski proizvodi za upotrebu u ksenotransplantaciji mogu se poboljšati i/ili razviti kod takvih glodara.
Glodari predmetnog pronalaska mogu da obezbede poboljšani in vivo sistem za održavanje i razvoj humanih hematopoetskih matičnih ćelija putem presađivanja. Glodari predmetnog pronalaska mogu da obezbede poboljšani razvoj i održavanje humanih matičnih ćelija unutar glodara. Povećana populacija diferenciranih humanih B i T ćelija može se primetiti u krvi, koštanoj srži, slezini i timusu glodara. Optimalna homeostaza T i NK ćelija može se primetiti u ćelijama u krvi, koštanoj srži, slezini i timusu glodara. Glodari predmetnog pronalaska mogu pokazati povećanje nivoa ili količine crvenih krvnih zrnaca (RBC) u poređenju sa jednim ili više referentnih glodara.
Glodari predmetnog pronalaska se mogu koristiti za procenu efikasnosti terapeutskog leka koji cilja na humane ćelije. Glodaru predmetnog pronalaska mogu se transplantirati humane ćelije, a kandidat za lek koji cilja na takve humane ćelije se daje takvom glodaru. Terapeutska efikasnost leka se zatim utvrđuje praćenjem humanih ćelija kod glodara nakon primene leka. Lekovi koji se mogu testirati na glodarima uključuju jedinjenja malih molekula, tj. jedinjenja molekulske težine manje od 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD ili 800 daltona, i jedinjenja velikih molekula (kao što su proteini, npr. antitela), koji imaju namenjene terapeutske efekte za lečenje humanih bolesti i stanja ciljanjem (npr. vezivanjem i/ili delovanjem na) humane ćelije.
Lek može biti lek protiv raka, a humane ćelije mogu biti ćelije raka, koje mogu biti ćelije primarnog karcinoma ili ćelije ćelijskih linija ustanovljenih iz primarnog raka. U ovim slučajevima, glodaru iz predmetnog pronalaska se mogu transplantirati humane ćelije raka, a lek protiv raka može se dati glodaru. Efikasnost leka se može utvrditi procenom da li je rast ili metastaza humanih ćelija raka kod glodara inhibirana kao rezultat primene leka.
Lek protiv raka može biti molekul antitela, koji se vezuje za antigen na humanim ćelijama raka. Lek protiv raka može biti bispecifično antitelo koje se vezuje za antigen na humanim ćelijama raka, i za antigen na drugim humanim ćelijama, na primer, ćelijama humanog imunog sistema (ili „humanim imunim ćelijama”) kao npr. B ćelije i T ćelije.
Glodaru iz predmetnog pronalaska mogu da se usade humane imune ćelije ili ćelije koje se diferenciraju u humane imune ćelije. Takav glodar sa usađenim humanim imunim ćelijama se presađuje humanim ćelijama raka i daje mu lek protiv raka, kao što je bispecifično antitelo koje se vezuje za antigen na humanim ćelijama raka i za antigen na humanim imunim ćelijama (npr. T ćelijama). Terapeutska efikasnost bispecifičnog antitela može se proceniti na osnovu njegove sposobnosti da inhibira rast ili metastaze humanih ćelija raka kod glodara. Glodaru iz predmetnog pronalaska mogu da se usade humane CD34<+>hematopoetske progenitorne ćelije koje stvaraju humane imune ćelije (uključujući T ćelije, B ćelije, NK ćelije, između ostalih). Ćelije limfoma humanih B ćelija (npr. Raji ćelije) se transplantiraju u takvog glodara sa usađenim humanim imunim ćelijama, koji se zatim primenjuju sa bispecifičnim antitelom koje se vezuje za tumorski antigen (npr. antigen na normalnim B ćelijama i određenim B ćelijama maligniteta kao što je CD20) i na CD3 podjedinicu T ćelijskog receptora, da bi se testirala sposobnost bispecifičnog antitela da inhibira rast tumora kod glodara.
PRIMERI
Sledeći primeri su dati tako da opišu prosečnom stručnjaku u tehnici kako da napravi i koristi postupke i kompozicije pronalaska, i nemaju nameru da budu ograničavajući. Osim ako nije drugačije naznačeno, temperatura je naznačena u Celzijusima, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer 1. Humanizacija endogenog Klastera diferencijacije 47 (CD47) gena.
Ovaj primer ilustruje primere postupaka humanizacije endogenog gena koji kodira klaster diferencijacije 47 (CD47) kod glodara (npr. miša). Postupci opisani u ovom primeru mogu se koristiti za humanizaciju endogenog CD47 gena glodara korišćenjem bilo koje humane sekvence ili kombinacije humanih sekvenci (ili fragmenata sekvence) po želji. U ovom primeru, humani CD47 gen koji se pojavljuje u klonu bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) RP11-69A17 se koristi za humanizaciju endogenog CD47 gena miša.
Ciljajući vektor za humanizaciju genetskog materijala koji kodira vanćelijski N-terminalni IgV domen i pet transmembranskih domena endogenog CD47 gena je konstruisan korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (vidi, npr. U.S. Patent br.6,586,251 i Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.21 (6):652-659).
Ukratko, klon mišjeg bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) RP23-230L20 (Invitrogen) je modifikovan da izbriše sekvencu koja sadrži egzone 2-7 endogenog CD47 gena i ubaci egzone 2-7 humanog CD47 gena koristeći humani BAC klon RP11-69A17 (Invitrogen), koji kodira amino-kiseline 16-292 humanog CD47 polipeptida. Endogena DNK koja sadrži genomsku DNK koja odgovara egzonima 1, 8 i 9 izoforme 2, kao i 5’ i 3’ neprevedeni regioni (UTR) su zadržani. Analiza sekvence humane CD47 sekvence sadržane u BAC klonu RP11-69A17 potvrdila je sve CD47 egzone i splajsne signale. Analiza sekvence je otkrila da se sekvenca poklapa sa referentnim genomom i CD47 transkriptima NM_001777.3 i NM_198793.2. Genomska DNK koja odgovara egzonima 2-7 endogenog CD47 gena (-30,8 kb) zamenjena je u BAC klonu RP23-230L20 homolognom rekombinacijom u bakterijskim ćelijama da bi se ubacio DNK fragment koji sadrži -23,9 kb genomske humane DNK koji odgovara egzonima 2-7 humanog CD47 gena iz BAC klona RP11-69A17 i -4995 bp koji odgovara samobrišućoj neomicinskoj kaseti okruženoj mestima za prepoznavanje rekombinaze (loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-loxP; videti; U.S. Patente br.
8,697,851, 8,518,392 i 8,354,389). Kaseta neomicina koja se samobriše je dodata na kraj fragmenta humane DNK -23,9 kb koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena (Slika 2). Ciljajući vektor je sadržavao, od 5’ do 3’, 5’ homologni krak koji sadrži -39 kb mišje genomske DNK iz BAC klona RP23-230L20, -29,3 kb humane genomske DNK iz BAC klona RP11-69A17 (koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena), kasetu neomicina koja se sama briše okruženu loxP lokacijama i -98,8 kb mišje genomske DNK iz BAC klona RP23-230L20. Nakon homologne rekombinacije u bakterijskim ćelijama sa ciljajućim vektorom opisanim iznad, kreiran je modifikovani RP23-230L20 BAC klon koji je rezultirao humanizovanim CD47 genom koji je sadržao mišji 5’ UTR, mišji egzon 1, humani egzon 2-7, egzone miša 8-9 i mišji 3’UTR. Proteinske sekvence četiri projektovane alternativno splajsovane izoforme humanizovanog CD47 date su u tabeli 3 koje ukazuju na rezultujuće mišje i humane aminokiseline kodirane mišijom i ljudskom DNK, tim redosledom.
Gore opisani modifikovani BAC klon je korišćen za elektroporaciju F1H4 (50% 129/S6/SvEv/Tac, 50% C57BL/6NTac: Auerbach, W. et al. (2000) Biotechniques 29(5): 1024-8,1030, 1032) embrionalne matične ćelije miša (ES) za stvaranje modifikovanih ES ćelija koje sadrže endogeni CD47 gen koji je humanizovan iz egzona 2-7. Pozitivno ciljane ES ćelije koje sadrže humanizovani CD47 gen su identifikovane testom (Valencuela et al.. supra) koji je detektovao prisustvo humanih CD47 sekvenci (npr. egzona 2-7) i potvrdio gubitak i/ili zadržavanje mišjih CD47 sekvenci (npr. egzona 1, 8 i 9 i/ili egzona 2-7). Tabela 4 prikazuje prajmere i probe koje su korišćene za potvrdu humanizacije endogenog CD47 gena kao što je gore opisano (Slika 3). Nukleotidna sekvenca preko uzvodne tačke umetanja uključivala je sledeće, što ukazuje na endogenu mišju sekvencu uzvodno od tačke umetanja (sadržanu u zagradama ispod sa AsiSI restrikcijskim mestom ispisanim kurzivom) povezanu kontinualno sa humanom CD47 sekvencom prisutnom na mestu umetanja: (GCAGACATGATTACTTCAGAGCTTTCAAAG CTAGATACTGTACCTTGCAT ATTCCAACAC) GCGA TCGC ATTTTAAGAT TTTCCATCCT AGTGGAAAGA TATGATTTGA TTCATCCTAT TTACTTT- GTA TATTAAAGTA CAGTAGAACC TGCCACTTTT (SEQ ID NO: 33). Nukleotidna sekvenca preko nizvodne tačke umetanja na 5’ kraju samobrišuće neomicinske kasete uključivala je sledeće, što ukazuje na humanu genomsku sekvencu CD47 koja je u blizini sekvence kasete nizvodno od tačke umetanja (sadržana u zagradama ispod sa loxP sekvencom ispisanom kurzivom): GGATCCATTTTAAGTAATAG AATAGGATTT TTAATTGTTC CAGTGTT- TCT GTGATAGAGC TGTCCTGCAC AGACCTGTTT (CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG) (SEQ ID NO: 34). Nukleotidna sekvenca preko nizvodne tačke umetanja na 3’ kraju neomicinske kasete uključivala je sledeće, što ukazuje na sekvencu kasete koja se graniči sa genomskom sekvencom miša 3’ egzona 7 endogenog CD47 gena (sadržana u zagradama ispod sa lokxP sekvencom kurzivom): CATGTCTGGA ATAACTTCGTATAATGTATG CTATACGAAGTTAT- GCTAGT AACTATAACG GTCCTAAGGT AGCGACTAGC (ATTAGTATGG AAGGTCCGTC CACTGTCCAG GTTC-CTCTTG CGGAGCTCTT TGTCTCTCTG GACTCTGTAT ACACTGCTTG) (SEQ ID NO: 35). Nukleotidna sekvenca preko tačke umetanja nizvodno nakon brisanja kasete neomicina (preostalo 76 bp) uključivala je sledeće, što ukazuje na genomsku sekvencu čoveka i miša jukstapozicioniranu sa preostalom sekvencom kasete loxP sekvence (sadržana u zagradama ispod sa loxP sekvencom kurzivom): GGATCCATTTTAAGTAATAG AATAGGATTT TTAATTGTTC CAGTGTTTCT GTGATAGAGC TGTCCTGCAC AGACCTGTTT
(CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT GCTAGTAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG ACTAGC)ATT AGTATGGAAG GTC- CGTCCAC TGTCCAGGTT CCTCTTGCGG AGCTCTTTGT CTCTCTGGAC TCTGTATACA CTGCTTGCAT (SEQ ID NO: 36).
Pozitivni klonovi ES ćelija su zatim korišćeni za implantaciju ženki miševa pomoću VELOCIMOUSE® postupka (videti, npr. U.S. Pat. br. 7,294,754 i Poueymirou et al., F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, 2007, Nature Biotech.25(1):91-99) da bi se dobilo leglo mladunaca koje sadrži inserciju egzona 2-7 humanog CD47 gena u endogeni CD47 gen miša. Miševi koji nose humanizaciju egzona 2-7 endogenog CD47 gena ponovo su potvrđeni i identifikovani genotipizacijom DNK izolovane iz isečaka repa korišćenjem modifikacije testa alela (Valencuela et al.. supra) koji je otkrio prisustvo sekvenci humanog CD47 gena. Mladunci su genotipizovani i kohorte životinja heterozigotnih za humanizovani CD47 genski konstrukt su odabrane za karakterizaciju.
TABELA 4
Ime Prajmer Sekvenca (5’-3’)
Napred TGCAGAAGTCACTAGGAGGAAT (SEQIDNO:21) Proba TCAGTCAACTTCTTCTGGGTTGTTT (SEQIDNO:22) 7190mTU
CC
Reverzna GTGCCAGACTCACTTTCTATCCA (SEQIDNO:23) Napred TGCTGCCAATATACGGCTTCTG (SEQIDNO:24) Proba CAGCTCTCATAGCCAACTATGGTG (SEQIDNO:25) 7190mTD
CC
Reverzna TCAAGCAGAGCCTGGTTATCTG (SEQIDNO:26) Napred GTCGTCATTCCATGCTTTGTTAC (SEQIDNO:27) Proba TGGAGGCACAAAACACTACTGAAG (SEQIDNO:28) 7190hTU
TATACG
Reverzna GGACAGTGGACTTGTTTAGAGC (SEQIDNO:29) Napred GGCTTGGTGGCTGATTGTTCT (SEQIDNO:30) Proba AGCACCCAAACTGATATGCCTGTA (SEQIDNO:31) 7190hTD
TTTG
Reverzna TGGGAACTGGTGTTTCAAGTCTA (SEQIDNO:32)
Primer 2. Ekspresija humanizovanog CD47 polipeptida u crvenim krvnim zrncima miša.
Ovaj primer pokazuje da se glodari modifikovani da sadrže humanizovani CD47 gen prema Primeru 1 mogu koristiti za skrining CD47 modulatora (npr. anti-CD47 antitela) i određivanje različitih karakteristika kao što su, na primer, farmakokinetika i bezbednosni profili. U ovom primeru, nekoliko anti-CD47 antitela je testirano na mišjim crvenim krvnim zrncima (RBC) izolovanim od glodara napravljenih u skladu sa Primerom 1, a ti glodari eksprimuju humanizovani CD47 polipeptid kao što je ovde opisano.
Ukratko, 2 mL pune krvi humanizovanih CD47 miševa (n=2) je prebačeno u epruvetu od 15 mL i centrifugirano na 200xg tokom 10 minuta na 4°C. Plazma i pufasti sloj su aspirirani, a zatim je dodato 15 mL PBS i ćelije su lagano pomešane. Smeša je ponovo centrifugirana na 200xg pet minuta na 4°C. Supernatant je aspiriran i ćelije su isprane još dva puta. Peletirani eritrociti su resuspendovani do konačne zapremine u 10 mL PBS. Resuspendovani eritrociti su centrifugirani poslednji put na 200xg tokom 10 minuta na 4°C. Zapremina koncentrovanih eritrocita je procenjena na 0,5 mL i razblažena do koncentracije od 0,5% sa PBS (0,5 mL koncentrovanih eritrocita/100 mL PBS). Stvarna koncentracija eritrocita je određena pomoću Cellometer Auto T4 (1,5x10<7>/mL: Nexcelom Bioscience).
Osamdeset (80) µL 0,5% mišjih eritrocita je dodato u svako ležište ploče sa V-dnom sa 96 ležišta. Anti-CD47 antitela su dodata u svako ležište (20 µL na 33 nM). Ploča je lagano tapkana za mešanje i inkubirana na ledu 30 minuta. Ploča je zatim dva puta isprana puferom za bojenje (PBS sa 2% FBS). Sekundarna antitela Fab-488 (AffiniPure mišji anti-humani IgG, F(ab’)2specifičan za fragmente konjugovan sa Alexa Fluor 488, Jackson Immuno Research) su dodata u svako ležište u koncentraciji od 10 µg/mL. Ploča je ponovo inkubirana na ledu 30 minuta, nakon čega je jednom isprana puferom za bojenje. Ćelije u svakom ležištu su resuspendovane u 200 µL pufera za bojenje i filtrirane kroz filter ploču sa 96 ležišta. Ćelije u ploči su analizirane korišćenjem BD ACCURI™ C6 sistema (BD Biosciences). Primeri rezultata su prikazani na slici 4. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) iznad kontrole izotipa za svako testirano antitelo prikazan je u tabeli 5.
TABELA 5
Antitelo MFI Puta iznad izotipske
kontrole
Ab A, hlgG4s 28898 258
Ab B. hlgG4s 27545 246
Ab C. hlgG4s 24620 220
Ab D. hlgG1 29882 267
Ab E. hlgG4 33423 298
Kontrola, hlgG4s112-Kontrola, hlgG4 112 -hlgG4s: humani lgG4 sa modifikovanim Fc regionom koji ima smanjenu
efektorsku funkciju
Kao što je prikazano na slici 4, sva anti-CD47 antitela vezana su za eritrocite humanizovanih CD47 miševa. Uzeti zajedno, ovaj primer pokazuje da (1) glodari projektovani da sadrže humanizovani CD47 gen kao što je ovde opisano eksprimuju humanizovani CD47 polipeptid na površini ćelija (npr. RBC) glodara, i (2) takve ćelije su korisne za skrining CD47 modulatora (npr. CD47 antitela) i određivanje farmakokinetičkih profila takvih modulatora.
Primer 3. Hemaglutinacija crvenih krvnih zrnaca miša koja eksprimuju humanizovani CD47 polipeptid.
Ovaj primer dalje pokazuje da glodari modifikovani da sadrže humanizovani CD47 gen prema Primeru 1 mogu da se koriste u različitim testovima (npr. hemaglutinacioni test) za skrining CD47 modulatora (npr. anti-CD47 antitela) i određivanje različitih karakteristika kao što su npr. farmakokinetika i bezbednosni profili. U ovom primeru, nekoliko anti-CD47 antitela je pregledano na mišjim crvenim krvnim zrncima (RBC) koja eksprimuju humanizovani CD47 polipeptid kako je ovde opisano da bi se odredila koncentracija antitela koja promoviše hemaglutinaciju.
Ukratko, eritrociti iz divljeg tipa i humanizovanih CD47 miševa (n = 2) su pripremljeni kao što je opisano u Primeru 2. Dvadeset (20) µL anti-CD47 antitela (u 5-strukom serijskom razblaženju) je dodato u otvore 1-12 preko ploča sa V-dnom sa 96 ležišta, nakon čega je usledilo dodavanje 80 µL 0,5% mišjih eritrocita u sva ležišta ploče. Ploče su lagano tapkane da se mešaju i inkubirane na sobnoj temperaturi (24-27°C) 30 minuta. Krajnja tačka aglutinacije je primećena vizuelno (tj. eritrociti se talože na dno u negativnim uzorcima, dok se eritrociti aglutiniraju u pozitivnim uzorcima). Primeri rezultata su prikazani na Slici 5, sa okvirima koji ocrtavaju ležišta koja pokazuju hemaglutinaciju.
Kao što je prikazano na slici 5, samo lektin je izazvao aglutinaciju kod miševa divljeg tipa. Međutim, dva anti-CD47 antitela (Ab E i Ab C), pored lektina, izazvala su aglutinaciju u eritrocitima od dva humanizovana CD47 glodara napravljena prema Primeru 1. Koncentracija pri kojoj su ova dva antitela izazvala aglutinaciju počela je od 11 nM. Uzeto skupa, ovaj Primer pokazuje da glodari projektovani da sadrže humanizovani CD47 gen kao što je ovde opisano mogu da se koriste za procenu jednog ili više svojstava (npr. hemaglutinacije) CD47 modulatora (npr. CD47 antitela).
Primer 4. Farmakokinetički klirens CD47 modulatora kod humanizovanih CD47 glodara.
Ovaj primer ilustruje postupak procene farmakokinetičkog klirensa CD47 modulatora (npr. anti-CD47 antitela) kod glodara modifikovanih da sadrže humanizovani CD47 gen prema Primeru 1. U ovom primeru, divljim i humanizovanim CD47 glodarima (npr. miševima) su davana anti-CD47 antitela i nivoi antitela u serumu su određeni korišćenjem ELISA testa.
Ukratko, divljem tipu (n=5) ili miševima homozigotnim za humanizovani CD47 (n=5; kao što je gore opisano) davana su četiri anti-CD47 antitela (Ab F, Ab G, Ab Hand Ab I) i kontrolno antitelo izotipa IgG4s (IgG4s). Genetska pozadina miševa bila je 75% CD57BL/6 i 25% 129Sv. Svako antitelo je testirano na pet humanizovanih CD47 glodara. Sva antitela su davana supkutano u dozi od 50 mg/kg. Jednom je krv vađena jedan dan pre davanja antitela (dan 0). Krv nakon injekcije prikupljena je nakon 6 sati, 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 7 dana, 10 dana i 14 dana. Frakcije seruma iz krvi su odvojene i podvrgnute analizi ukupnih humanih antitela korišćenjem ELISA imuno testa.
Ukratko, poliklonsko antitelo kozjeg anti-humanog IgG (Jackson ImmunoResearch) je naneto na ploče sa 96 ležišta da bi se uhvatila testirana humana antitela u serumu, a zatim su antitela vezana za ploču otkrivena korišćenjem kozjeg anti-humanog IgG poliklonskog antitela konjugovanog sa peroksidazom hrena ] (Jackson ImmunoResearch) i TMB supstratom (BD Pharmingen). Uzorci seruma su bili u serijskim razblaženjima od šest doza i referentni standardi odgovarajućih antitela u serijskim razblaženjima od 12 doza. Koncentracije antitela leka u serumima su izračunate na osnovu referentne standardne krive generisane korišćenjem softvera Graphpad Prism. Primeri rezultata prikazani su na slici 6 i tabeli 6.
Podaci su pokazali da se antitela koja su davana divljim i humanizovanim miševima, kako je ovde opisano, dobro tolerišu. Uzeto skupa, ovaj Primer pokazuje da se ovde opisani glodari mogu koristiti za procenu jednog ili više farmakokinetičkih svojstava leka koji cilja na CD47 (npr. anti-CD47 antitelo) kao što su, na primer, nivoi leka u cirkulaciji. Štaviše, ovde opisani glodari mogu da se koriste za procenu toksičnosti leka koji cilja na CD47 određivanjem neželjenih efekata nakon primene.
TABELA 6
Koncentrac ja antitela u serumu (p.g/mL ± SEM)
Antitelo 6 sati Dan 1 Dan 2 Dan 3 Dan 4<Dan 7 Dan 10>Ab F 116,7±14,0 196,4±10,6 96,0±13,3 24,7±7,0 3,7±0,42 <0,35 <0,35 AbG 115,0±22,1 198,8±23,4 118,4±20,9 48,3±16,0 2,9±1,97 <0,35 <0,35 Ab H 64,5±3,85 108,0±5,13 32,0±6,08 1,0±0,2 0,4±0,03 0,06±0,03 0,05±0,02 Ab I 51,1 ±16,6 115,2±14,8 63,8±8,3 11,1±4,2 0,5±0,1 0,1±0,02 <0,35
lgG4s 458,2±34,4 702,5±32,3 616,6±27,0 567,1±39,5 488,9±45,0 357,0±51,1 307,6±61,1 Izotipska
kontrola
Primer 5. Farmakokinetički profili CD47 modulatora kod humanizovanih CD47/SIRPα glodara.
Ovaj primer ilustruje postupak procene farmakokinetičkog klirensa CD47 modulatora (npr. anti-CD47 antitela) kod glodara modifikovanih da sadrže humanizovane CD47 (prema Primeru 1) i SIRPα gene. Posebno, ovde opisani humanizovani CD47 glodari su modifikovani tako da dalje sadrže humanizovani SIRPα gen koji sadrži endogeni deo i humani deo, čiji humani deo kodira vanćelijski domen humanog SIRPα proteina (npr. amino-kiseline 28-362 humanog SIRPα proteina) i čiji endogeni deo kodira unutarćelijski domen endogenog SIRPα proteina (npr. amino-kiseline koje kodiraju transmembranske i unutarćelijske delove mišjeg SIRPα proteina) kao što je opisano u PCT/US14/56910, podnetom 23. septembra 2014.
Dvostruko humanizovani CD47/SIRPα miševi su napravljeni uzgojem humanizovanih SIRPα miševa sa humanizovanim CD47 miševima. U ovom primeru, dvostruko humanizovanim CD47/SIRPα glodarima (npr. miševima) su davana različita anti-CD47 antitela i određeni su njihovi odgovarajući farmakokinetički profili.
Ukratko, grupama divljeg tipa (n=5) i miševi homozigoti za humanizovane CD47 i SIRPα gene (CD47<hu/hu>- SIRPα.<hu/hu>; n=5 po grupi) su davana odabrana anti-CD47 antitela i kontrolno antitelo izotipa IgG4 (hIgG4s). Genetska pozadina miševa bila je 75% CD57BL/6 i 25% 129Sv. Sva antitela su davana u jednoj supkutanoj dozi od 50 mg/kg. Jednom je krv uzimana jedan dan pre davanja antitela (dan 0). Krv nakon injekcije uzimana je nakon 6 sati, 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 7 dana i 10 dana. Frakcije seruma iz krv su razdvojene i podvrgnute analizi ukupnih humanih antitela korišćenjem ELISA imuno testa (opisano gore). Pored toga, mereni su nivoi hematokrita za 6 sati, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 7 dana i 10 dana i po potrebi je urađen test urina (na 6 sati i kada je boja urina odstupila od žute) da bi se utvrdilo broj crvenih krvnih zrnaca. Primeri rezultata prikazani su na slikama 7-9.
Kao što je prikazano na slikama 7 i 8, sva anti-CD47 antitela su pokazala ciljno posredovani klirens kod CD47<hu/hu>- SIRPα<hu/hu>miševa i, posebno, mnogi su pokazali slične farmakokinetičke profile. Dalje, monovalentna verzija jednog anti-CD47 antitela (Ab F) pokazala je veću bioraspoloživost od njegovog bivalentnog ekvivalenta (Slika 8). Pronalazači su primetili slične farmakokinetičke profile za antitela među više eksperimenata sa humanizovanim CD47 i dvostruko humanizovanim životinjama (tj., CD47<hu/hu>SIRPα<hu/hu>miševima).
Ab J je imao manji efekat na nivoe hematokrita nego druga testirana anti-CD47 antitela (Ab F, Ab G, Ab I, itd.) i uporedive promene nivoa hematokrita u odnosu na kontrolu (hIgG4s) kod CD47<hu/hu>SIRPα.<hu/hu>miševa. Merenja hematokrita 2-4 dana pokazala su najveći pad od normalnog opsega (-38,5-45,1%), što je uključivalo grupe kojima su davani Abs F, G i I. Konkretno, monovalentni oblik Ab F je pokazao odloženo smanjenje hematokrita u poređenju sa drugim testiranim antitelima. Pronalazači su zaključili da se razlike u nivoima hematokrita među različitim grupama tretmana mogu pripisati razlici u epitopu koji prepoznaju različita antitela. Takođe, miševi kojima su dozirana odabrana anti-CD47 antitela pokazali su pozitivne testove urina na hem. nakon 6 sati. Na primer, grupe za tretman Ab J i Ab F su imale po jednog miša pozitivnog na hem. prvog dana, dok su sve ostale vremenske tačke bile negativne. Nije zabeležen značajan gubitak težine (>20%) ni u jednoj tretiranoj grupi.
Uzeto skupa, ovaj Primer pokazuje da glodari predmetnog pronalaska obezbeđuju in vivo sistem za procenu farmakokinetičkih svojstava i/ili profila jednog ili više lekova koji ciljaju na CD47 (npr. jedno ili više anti-CD47 antitela) kao što su, na primer, nivoi leka u cirkulaciji. Štaviše, glodari kako je ovde opisano konstruisani da dalje sadrže druge humanizovane gene (npr. humanizovani SIRPα) mogu se koristiti za procenu ciljanog klirensa jednog ili više lekova koji ciljaju CD47.
EKVIVALENTI
Pošto su na taj način opisali nekoliko aspekata najmanje jedne realizacije predmetnog pronalaska, stručnjaci iz ove oblasti tehnike treba da razumeju da će stručnjaci u tehnici lako doći do različitih izmena, modifikacija i poboljšanja. Takve izmene, modifikacije i poboljšanja su predviđeni da budu deo predmetnog pronalaska, i predviđeni su da budu unutar obima pronalaska. Shodno tome, prethodni opis i crtež su samo kao primer i pronalazak je definisan patentnim zahtevima koji slede.
Upotreba rednih izraza kao što su „prvi”, „drugi”, „treći” itd., u zahtevima za modifikaciju elementa patentnog zahteva sama po sebi ne znači nikakav prioritet, presedan ili redosled jednog elementa zahteva u odnosu na drugi ili vremenski redosled po kojem se radnje nekog postupka izvode, ali se koriste samo kao oznake za razlikovanje jednog elementa zahteva koji ima određeno ime od drugog elementa koji ima isto ime (ali za upotrebu rednog termina) da bi se razlikovali elementi zahteva.
Članove „a” i „an” (u engleskoj verziji) kako se ovde koriste u specifikaciji i patentnim zahtevima, osim ako nije jasno naznačeno suprotno, treba shvatiti da uključuju množinu reference. Tvrdnje ili opisi koji uključuju „ili” između jednog ili više članova grupe smatraju se ispunjenim ako je jedan, više od jednog ili su svi članovi grupe prisutni u, primenjeni u, ili na drugi način relevantni za dati proizvod ili proces, osim ako nije naznačeno suprotno ili na drugi način evidentno iz konteksta. Pronalazak uključuje aspekte u kojima je tačno jedan član grupe prisutan u, primenjen u, ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili proces. Pronalazak, takođe, uključuje aspekte u kojima je više od jednog ili su svi članovi grupe prisutni u, primenjeni u, ili na drugi način relevantni za dati proizvod ili proces. Štaviše, treba razumeti da pronalazak obuhvata sve varijacije, kombinacije i permutacije u kojima se jedno ili više ograničenja, elemenata, klauzula, opisnih termina, itd., iz jednog ili više navedenih patentnih zahteva uvodi u drugi zahtev u zavisnosti od iste osnovne zahteva (ili, ako je relevantno, bilo koji drugi zahtev) osim ako nije drugačije naznačeno ili osim ako bi prosečnom stručnjaku bilo očigledno da će se pojaviti kontradikcija ili nedoslednost. Kada su elementi predstavljeni kao liste, (npr. u Markush grupi ili sličnom formatu), treba razumeti da je svaka podgrupa elemenata takođe stavljena na uvid javnosti, i da se bilo koji element(i) može ukloniti iz grupe. Trebalo bi razumeti da, uopšteno govoreći, kada se pronalazak ili aspekti pronalaska pominju kao da sadrže određene elemente, karakteristike itd., određene realizacije pronalaska ili aspekti pronalaska se sastoje, ili se u suštini sastoje od, takvih elemenata, karakteristika, itd. Radi jednostavnosti ove realizacije nisu u svakom slučaju posebno izložene u toliko mnogo reči ovde. Takođe treba razumeti da bilo koji aspekt pronalaska može biti eksplicitno isključen iz patentnih zahteva, bez obzira da li je specifično isključenje navedeno u specifikaciji.
Stručnjaci će razumeti tipične standarde odstupanja ili greške koje se mogu pripisati vrednostima dobijenim u testovima ili drugim procesima opisanim ovde.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> NON-HUMAN ANIMALS HAVING A HUMANIZED CLUSTER OF DIFFERENTIATION 47 GENE
<130> 32584 (10108WO01)
<140>
<141>
<150> 62/087,992
<151> 2014-12-05
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5591
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
gcctacaccg ggagagcagg gaggaggagt tggactgagg ttgggcggct ccgaggtcca 60
gggcgagctt ggccagaggg agtagagagc agcggggctg cgcagggacg cgtgccgtga 120
gttccggtga gcgtgtgtgt cccatgctcc cgtctttcag gccggcccag gacacgaagc 180
cggaagagag ctggctggag ggacgggggc cgtgagcaga gagtgcaacc cgcgcagccc 240
cggggacagg ctgattcttg gcgctctccg ccggagcctg cccagggctg ggtgtgaggc 300 tggcgtcacg tcaacgagca gaggcggcca ggcggggcgg agtgcgcgtg cgcggggcgg 360 cgagcacgcg cgcgcgcgca cccccgggca gcctgggcgg ccgctcctgc ctgtcactgc 420 tgcggcgctg ctggtcggtc gtttcccttg aaggcagcag cggaggcggc ggctgctcca 480 gacacctgcg gcggcgaccc cccggcggcg cggagatgtg gcccttggcg gcggcgctgt 540 tgctgggctc ctgctgctgc ggttcagctc aactactgtt tagtaacgtc aactccatag 600 agttcacttc atgcaatgaa actgtggtca tcccttgcat cgtccgtaat gtggaggcgc 660 aaagcaccga agaaatgttt gtgaagtgga agttgaacaa atcgtatatt ttcatctatg 720 atggaaataa aaatagcact actacagatc aaaactttac cagtgcaaaa atctcagtct 780 cagacttaat caatggcatt gcctctttga aaatggataa gcgcgatgcc atggtgggaa 840 actacacttg cgaagtgaca gagttatcca gagaaggcaa aacagttata gagctgaaaa 900 accgcacggc cttcaacact gaccaaggat cagcctgttc ttacgaggag gagaaaggag 960 gttgcaaatt agtttcgtgg ttttctccaa atgaaaagat cctcattgtt attttcccaa 1020 ttttggctat actcctgttc tggggaaagt ttggtatttt aacactcaaa tataaatcca 1080 gccatacgaa taagagaatc attctgctgc tcgttgccgg gctggtgctc acagtcatcg 1140 tggttgttgg agccatcctt ctcatcccag gagaaaagcc cgtgaagaat gcttctggac 1200 ttggcctcat tgtaatctct acggggatat taatactact tcagtacaat gtgtttatga 1260 cagcttttgg aatgacctct ttcaccattg ccatattgat cactcaagtg ctgggctacg 1320 tccttgcttt ggtcgggctg tgtctctgca tcatggcatg tgagccagtg cacggccccc 1380 ttttgatttc aggtttgggg atcatagctc tagcagaact acttggatta gtttatatga 1440 agtttgtcga ataggtgaag ggaagtgacg gactgtaact tggaagtcag aaatggaaga 1500 atacagttgt ctaagcacca ggtcttcacg actcacagct ggaaggaaca gacaacagta 1560 actgacttcc atccaggaaa acatgtcaca taaatgatta ctaagtttat attcaaagca 1620 gctgtacttt acataataaa aaaaatatga tgtgctgtgt aaccaattgg aatcccattt 1680 ttctattgtt tctactcaac taggggcaaa cgtttcaggg gcaacttcca agaatgatgc 1740 ttgttagatc ctagagtctc tgaacactga gtttaaattg attccgagtg agactcgcca 1800 agcactaacc tgagggttag ttacccagag atacctatga aaaacagtgg tatccagcaa 1860 gccttagtaa actcaggttg ccagcagctt tgccacttcc gctgctagct gaataacaag 1920 actgccactt ctgggtcata gtgatagaga ctgaagtaga aaaacgaatg tggttgggca 1980 aatcccgtgt ggcccctctg tgtgctatga tattgatggc actggtgtct tcattcttgg 2040 gggttgccat cattcacaca cacccctttg acatacagtg caccccagtt ttgaatacat 2100 tttttttgca ccctgtcccg ttctgctact ttgatttgcg ttatgatata tatatatata 2160 tataatacct tttctcctct ttaaacatgg tcctgtgaca caatagtcag ttgcagaaag 2220 gagccagact tattcgcaaa gcactgtgct caaactcttc agaaaaaaag gaaaaaaaaa 2280 aaaagctata gttgtaacat atgtattcca gacctctggt ttaaaggcaa aagaaaaaaa 2340 atctacagtg tttcttctca tgttttctga tcggaggcat gacaaagcaa gactgaaatc 2400 tgaactgtgt ctcctgcatg gcaacacgtg tctccgtcag gccctcgcaa ggcccgggga 2460 gggggttcta cgcctcttgt ctctttgttg catgctgaac actcatcgcc ttcctactgt 2520 atcctgcctc ctgcagcctc cctcttcctc ctcctcttcc tcttcctcct cttcctcctc 2580 ctcctcctct tcctccaagt ttgaaaggtc aaacaaaact accacattcc ctacccagtt 2640 agaagaaaac caccgtcctg acagttgtga tcgcatggag tacttttaga ttattagcac 2700 ctgtttttac ctcgtttgtg ggcgtgtttg tatgtgcaca tgtatgaagt cggcacatgc 2760 accttctgta tgggcagagg cgtggcatct acagaagagc agatgccaac tttgtgcttt 2820 tagtgaatac attaaaaaaa aaaaaccaac ggtccttatt gagtggaatt ctatttgatg 2880 caaatatttg agctctttaa gactttaaaa ctagataatg tgccaagctt ttaggactgc 2940 tcaccagtgc cctctgaaga aacaccagta ctttttcctg tttgtgtaat aaaggcatat 3000 ttgtatttgt gtttgcatca ctaatggtta tttcttctta gtccactgaa tgtttccatg 3060 tgcctctcgt atgccaaact ttttgtcatc tttcatgtgg ggaccaaatg gtttgtctgt 3120 ggcaaaccta aacctatgac ctgctgaggc ctctcagaaa actgaccaca gtaccaagat 3180 agtacttcgc aaagaaaagt aggttccctc cctggttttg tagctgtcgc caatattagc 3240 gtaattccaa ggagctgaac gcctttatat aaatctgatg gcacctgatg cttttagttc 3300 tgaaaatatt tacactcgga tcatgttgtt gatgacttaa acaaagtttt gatgaagaga 3360 gcaaaaaaaa agcaggtgga tttggaacag tttcagggtt ttttttgttt tttgtttttt 3420 gtttttgttt tttttttttt atttttgttt ttctgttctc tgttagaaaa gtcaggtgtt 3480 ctctgtcagg ctatctttat agtcaatttt ttttacgaac taaagtagta ccttttaata 3540 tgtagtcaac gcccctctgc tcggggttca gttttgggtc ttaaccagct gtcatgttct 3600 ctatgctgcc tgccacttga ggcactgagt gccctagaca gtcccatcgg tggtagccag 3660 ggaaacgaaa gacgaactca actcttgctc ctaataatca actctctgta tgaaggatgg 3720 cagcattaag agtcctcctg cctgggcatt attgggccag ttcaccctct ttaaatcaaa 3780 cccgcagtgg ctcccagttc tcgtcccatc agatttaaat tgctaacagt atggggggca 3840 ccacgcatct gttttgtccc acaatgcgct tttctctccc aaatcccgat ttctgctgtc 3900 atagcctcta ttcaattttt atttattgtc tgccctccac ttatacaatc gtagagagca 3960 atgccatttg tcactttctg caacagtttt ttgagccttt atggctgaat cccatttttc 4020 ttctctttca aactgtttgc tccattgctc ctcccgcacg gctgtccgta cagtcatccc 4080 atccatctgg gggcctcttt catctctcac ccttcctggt gcttcgtgga tctctgctta 4140 cctctgtggg tttttttttt tttttttgac ttattcttct cactggactt taagattact 4200 tccacagcga aagtgctgcc tcccttttct gcccgcagtg ttctgcgtac tttagatact 4260 actcagtgct gacatttgat ggcaaaagtt gcctgcactt aaatttctct ttttaatagg 4320 gtgaactaga gttggagttt ttttctcttt tttctctttt ctctctctct ctctctctct 4380 ctctctctct ctctctctct ctccctccct ccctccctcc ctccctccct ccctctctct 4440 ctctttttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt 4500 ttttgacaaa tctcacaggc tttgagaatt ataaaaggtg acagttcacc tgaaaatcac 4560 aggtctggtc tgtttaaatt gttgagaaat atccgattaa aagtcttgtg gctgtgtcct 4620 aataggctct ctttcaggac gttgtagtca atagagtggc tgaaccatac ttgagtttat 4680 aaagctcaaa aactgatgca cccactctgc tattatcgtg ttagtaagag ttcagctgta 4740 tatcattgtc taggtttatc ttgtcctaca gtgggtattc aaatatggcc accagaggat 4800 atgtgtaaat ataagcacct gtatttgcct gttgttgaga actggaggga aaacaaaaaa 4860 tgtctggcaa ccctttgcct ttttaaccgt aattaattga cagtttattt agagataaga 4920 gttttcaaaa atctcttaac tgccacaacc cacagagggt cttgttttgc catcttcagt 4980 ggctcacaga tatgatccaa gttaacttga aagagatgag cagtacccag gaaattgtcc 5040 tgcctttaac tctggctgtc cttaattatg actgtttaat gctgaatttt ccatccgtct 5100 agtgtttgag ggtaaagaaa agcctttttt aaataagtat ttctgtaaaa cggcatcggt 5160 gggatcttct gtgttgctat cacgggtgaa agagggaaac atttcttatt tttattaagc 5220 agagcattat ttacagaaag ccattgttga gaattagttc ccacatcata taaatatcca 5280 ttaaccattc taaattgtaa gagaactcca gtgttgctat gcacaaggaa ctctcctggg 5340 ggcctttttt tgcatagcaa ttaaaggtat gctatttgtc agtagccatt ttttgcagtg 5400
1
atttaaagac caaagttgtt ttacagctgt gttaccctta aaggtttttt ttttatgtat 5460
taaatcaatt tatcactgtt tgaagctttg aatacctgca atctttgcca agatactttt 5520
ttatttaaaa aaataactgt gtaaatatta ccctgtaata ttatatatac ttaataaaac 5580
attttaagct a 5591
<210> 2
<211> 312
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly 1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser
20 25 30
Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala
35 40 45
Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr 50 55 60
Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn
65 70 75 80
2
Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala 85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys 100 105 110
Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys 115 120 125
Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser Tyr Glu 130 135 140
Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu 145 150 155 160
Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp 165 170 175
Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn 180 185 190
Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile 195 200 205
Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys 210 215 220
Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile 225 230 235 240
Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe 245 250 255
Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu 260 265 270
Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro 275 280 285
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly 290 295 300
Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Glu
305 310
<210> 3
<211> 5560
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 3
4 gcctacaccg ggagagcagg gaggaggagt tggactgagg ttgggcggct ccgaggtcca 60 gggcgagctt ggccagaggg agtagagagc agcggggctg cgcagggacg cgtgccgtga 120 gttccggtga gcgtgtgtgt cccatgctcc cgtctttcag gccggcccag gacacgaagc 180 cggaagagag ctggctggag ggacgggggc cgtgagcaga gagtgcaacc cgcgcagccc 240 cggggacagg ctgattcttg gcgctctccg ccggagcctg cccagggctg ggtgtgaggc 300 tggcgtcacg tcaacgagca gaggcggcca ggcggggcgg agtgcgcgtg cgcggggcgg 360 cgagcacgcg cgcgcgcgca cccccgggca gcctgggcgg ccgctcctgc ctgtcactgc 420 tgcggcgctg ctggtcggtc gtttcccttg aaggcagcag cggaggcggc ggctgctcca 480 gacacctgcg gcggcgaccc cccggcggcg cggagatgtg gcccttggcg gcggcgctgt 540 tgctgggctc ctgctgctgc ggttcagctc aactactgtt tagtaacgtc aactccatag 600 agttcacttc atgcaatgaa actgtggtca tcccttgcat cgtccgtaat gtggaggcgc 660 aaagcaccga agaaatgttt gtgaagtgga agttgaacaa atcgtatatt ttcatctatg 720 atggaaataa aaatagcact actacagatc aaaactttac cagtgcaaaa atctcagtct 780 cagacttaat caatggcatt gcctctttga aaatggataa gcgcgatgcc atggtgggaa 840 actacacttg cgaagtgaca gagttatcca gagaaggcaa aacagttata gagctgaaaa 900 accgcacggt ttcgtggttt tctccaaatg aaaagatcct cattgttatt ttcccaattt 960 tggctatact cctgttctgg ggaaagtttg gtattttaac actcaaatat aaatccagcc 1020 atacgaataa gagaatcatt ctgctgctcg ttgccgggct ggtgctcaca gtcatcgtgg 1080 ttgttggagc catccttctc atcccaggag aaaagcccgt gaagaatgct tctggacttg 1140 gcctcattgt aatctctacg gggatattaa tactacttca gtacaatgtg tttatgacag 1200 cttttggaat gacctctttc accattgcca tattgatcac tcaagtgctg ggctacgtcc 1260 ttgctttggt cgggctgtgt ctctgcatca tggcatgtga gccagtgcac ggcccccttt 1320 tgatttcagg tttggggatc atagctctag cagaactact tggattagtt tatatgaagt 1380 ttgtcgcttc caaccagagg actatccaac ctcctaggaa taggtgaagg gaagtgacgg 1440 actgtaactt ggaagtcaga aatggaagaa tacagttgtc taagcaccag gtcttcacga 1500 ctcacagctg gaaggaacag acaacagtaa ctgacttcca tccaggaaaa catgtcacat 1560 aaatgattac taagtttata ttcaaagcag ctgtacttta cataataaaa aaaatatgat 1620 gtgctgtgta accaattgga atcccatttt tctattgttt ctactcaact aggggcaaac 1680 gtttcagggg caacttccaa gaatgatgct tgttagatcc tagagtctct gaacactgag 1740 tttaaattga ttccgagtga gactcgccaa gcactaacct gagggttagt tacccagaga 1800 tacctatgaa aaacagtggt atccagcaag ccttagtaaa ctcaggttgc cagcagcttt 1860 gccacttccg ctgctagctg aataacaaga ctgccacttc tgggtcatag tgatagagac 1920 tgaagtagaa aaacgaatgt ggttgggcaa atcccgtgtg gcccctctgt gtgctatgat 1980 attgatggca ctggtgtctt cattcttggg ggttgccatc attcacacac acccctttga 2040 catacagtgc accccagttt tgaatacatt ttttttgcac cctgtcccgt tctgctactt 2100 tgatttgcgt tatgatatat atatatatat ataatacctt ttctcctctt taaacatggt 2160 cctgtgacac aatagtcagt tgcagaaagg agccagactt attcgcaaag cactgtgctc 2220 aaactcttca gaaaaaaagg aaaaaaaaaa aaagctatag ttgtaacata tgtattccag 2280 acctctggtt taaaggcaaa agaaaaaaaa tctacagtgt ttcttctcat gttttctgat 2340 cggaggcatg acaaagcaag actgaaatct gaactgtgtc tcctgcatgg caacacgtgt 2400 ctccgtcagg ccctcgcaag gcccggggag ggggttctac gcctcttgtc tctttgttgc 2460 atgctgaaca ctcatcgcct tcctactgta tcctgcctcc tgcagcctcc ctcttcctcc 2520 tcctcttcct cttcctcctc ttcctcctcc tcctcctctt cctccaagtt tgaaaggtca 2580 aacaaaacta ccacattccc tacccagtta gaagaaaacc accgtcctga cagttgtgat 2640 cgcatggagt acttttagat tattagcacc tgtttttacc tcgtttgtgg gcgtgtttgt 2700 atgtgcacat gtatgaagtc ggcacatgca ccttctgtat gggcagaggc gtggcatcta 2760 cagaagagca gatgccaact ttgtgctttt agtgaataca ttaaaaaaaa aaaaccaacg 2820 gtccttattg agtggaattc tatttgatgc aaatatttga gctctttaag actttaaaac 2880 tagataatgt gccaagcttt taggactgct caccagtgcc ctctgaagaa acaccagtac 2940 tttttcctgt ttgtgtaata aaggcatatt tgtatttgtg tttgcatcac taatggttat 3000 ttcttcttag tccactgaat gtttccatgt gcctctcgta tgccaaactt tttgtcatct 3060 ttcatgtggg gaccaaatgg tttgtctgtg gcaaacctaa acctatgacc tgctgaggcc 3120 tctcagaaaa ctgaccacag taccaagata gtacttcgca aagaaaagta ggttccctcc 3180 ctggttttgt agctgtcgcc aatattagcg taattccaag gagctgaacg cctttatata 3240 aatctgatgg cacctgatgc ttttagttct gaaaatattt acactcggat catgttgttg 3300 atgacttaaa caaagttttg atgaagagag caaaaaaaaa gcaggtggat ttggaacagt 3360 ttcagggttt tttttgtttt ttgttttttg tttttgtttt ttttttttta tttttgtttt 3420 tctgttctct gttagaaaag tcaggtgttc tctgtcaggc tatctttata gtcaattttt 3480 tttacgaact aaagtagtac cttttaatat gtagtcaacg cccctctgct cggggttcag 3540 ttttgggtct taaccagctg tcatgttctc tatgctgcct gccacttgag gcactgagtg 3600 ccctagacag tcccatcggt ggtagccagg gaaacgaaag acgaactcaa ctcttgctcc 3660 taataatcaa ctctctgtat gaaggatggc agcattaaga gtcctcctgc ctgggcatta 3720 ttgggccagt tcaccctctt taaatcaaac ccgcagtggc tcccagttct cgtcccatca 3780 gatttaaatt gctaacagta tggggggcac cacgcatctg ttttgtccca caatgcgctt 3840 ttctctccca aatcccgatt tctgctgtca tagcctctat tcaattttta tttattgtct 3900 gccctccact tatacaatcg tagagagcaa tgccatttgt cactttctgc aacagttttt 3960 tgagccttta tggctgaatc ccatttttct tctctttcaa actgtttgct ccattgctcc 4020 tcccgcacgg ctgtccgtac agtcatccca tccatctggg ggcctctttc atctctcacc 4080 cttcctggtg cttcgtggat ctctgcttac ctctgtgggt tttttttttt ttttttgact 4140 tattcttctc actggacttt aagattactt ccacagcgaa agtgctgcct cccttttctg 4200 cccgcagtgt tctgcgtact ttagatacta ctcagtgctg acatttgatg gcaaaagttg 4260 cctgcactta aatttctctt tttaataggg tgaactagag ttggagtttt tttctctttt 4320 ttctcttttc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tccctccctc 4380 cctccctccc tccctccctc cctctctctc tctttttctt tctttctttc tttctttctt 4440 tctttctttc tttctttctt tctttctttt tttgacaaat ctcacaggct ttgagaatta 4500 taaaaggtga cagttcacct gaaaatcaca ggtctggtct gtttaaattg ttgagaaata 4560 tccgattaaa agtcttgtgg ctgtgtccta ataggctctc tttcaggacg ttgtagtcaa 4620 tagagtggct gaaccatact tgagtttata aagctcaaaa actgatgcac ccactctgct 4680 attatcgtgt tagtaagagt tcagctgtat atcattgtct aggtttatct tgtcctacag 4740 tgggtattca aatatggcca ccagaggata tgtgtaaata taagcacctg tatttgcctg 4800 ttgttgagaa ctggagggaa aacaaaaaat gtctggcaac cctttgcctt tttaaccgta 4860 attaattgac agtttattta gagataagag ttttcaaaaa tctcttaact gccacaaccc 4920 acagagggtc ttgttttgcc atcttcagtg gctcacagat atgatccaag ttaacttgaa 4980 agagatgagc agtacccagg aaattgtcct gcctttaact ctggctgtcc ttaattatga 5040 ctgtttaatg ctgaattttc catccgtcta gtgtttgagg gtaaagaaaa gcctttttta 5100 aataagtatt tctgtaaaac ggcatcggtg ggatcttctg tgttgctatc acgggtgaaa 5160
gagggaaaca tttcttattt ttattaagca gagcattatt tacagaaagc cattgttgag 5220
aattagttcc cacatcatat aaatatccat taaccattct aaattgtaag agaactccag 5280
tgttgctatg cacaaggaac tctcctgggg gccttttttt gcatagcaat taaaggtatg 5340
ctatttgtca gtagccattt tttgcagtga tttaaagacc aaagttgttt tacagctgtg 5400
ttacccttaa aggttttttt tttatgtatt aaatcaattt atcactgttt gaagctttga 5460
atacctgcaa tctttgccaa gatacttttt tatttaaaaa aataactgtg taaatattac 5520
cctgtaatat tatatatact taataaaaca ttttaagcta 5560
<210> 4
<211> 303
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser
20 25 30
Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala
35 40 45
Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr 50 55 60
Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn 65 70 75 80
Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala 85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys 100 105 110
Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys 115 120 125
Asn Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val 130 135 140
Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile 145 150 155 160
Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn Lys Arg Ile Ile Leu 165 170 175
Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile Val Val Val Gly Ala
1
Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys Asn Ala Ser Gly Leu 195 200 205
Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Asn 210 215 220
Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe Thr Ile Ala Ile Leu 225 230 235 240
Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu 245 250 255
Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly 260 265 270
Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys 275 280 285
Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn Arg 290 295 300
<210> 5
<211> 5648
<212> DNA
2 <213> Mus musculus
<400> 5
gcctacaccg ggagagcagg gaggaggagt tggactgagg ttgggcggct ccgaggtcca 60
gggcgagctt ggccagaggg agtagagagc agcggggctg cgcagggacg cgtgccgtga 120
gttccggtga gcgtgtgtgt cccatgctcc cgtctttcag gccggcccag gacacgaagc 180
cggaagagag ctggctggag ggacgggggc cgtgagcaga gagtgcaacc cgcgcagccc 240
cggggacagg ctgattcttg gcgctctccg ccggagcctg cccagggctg ggtgtgaggc 300
tggcgtcacg tcaacgagca gaggcggcca ggcggggcgg agtgcgcgtg cgcggggcgg 360
cgagcacgcg cgcgcgcgca cccccgggca gcctgggcgg ccgctcctgc ctgtcactgc 420
tgcggcgctg ctggtcggtc gtttcccttg aaggcagcag cggaggcggc ggctgctcca 480
gacacctgcg gcggcgaccc cccggcggcg cggagatgtg gcccttggcg gcggcgctgt 540
tgctgggctc ctgctgctgc ggttcagctc aactactgtt tagtaacgtc aactccatag 600
agttcacttc atgcaatgaa actgtggtca tcccttgcat cgtccgtaat gtggaggcgc 660
aaagcaccga agaaatgttt gtgaagtgga agttgaacaa atcgtatatt ttcatctatg 720
atggaaataa aaatagcact actacagatc aaaactttac cagtgcaaaa atctcagtct 780
cagacttaat caatggcatt gcctctttga aaatggataa gcgcgatgcc atggtgggaa 840
actacacttg cgaagtgaca gagttatcca gagaaggcaa aacagttata gagctgaaaa 900
accgcacggc cttcaacact gaccaaggat cagcctgttc ttacgaggag gagaaaggag 960 gttgcaaatt agtttcgtgg ttttctccaa atgaaaagat cctcattgtt attttcccaa 1020 ttttggctat actcctgttc tggggaaagt ttggtatttt aacactcaaa tataaatcca 1080 gccatacgaa taagagaatc attctgctgc tcgttgccgg gctggtgctc acagtcatcg 1140 tggttgttgg agccatcctt ctcatcccag gagaaaagcc cgtgaagaat gcttctggac 1200 ttggcctcat tgtaatctct acggggatat taatactact tcagtacaat gtgtttatga 1260 cagcttttgg aatgacctct ttcaccattg ccatattgat cactcaagtg ctgggctacg 1320 tccttgcttt ggtcgggctg tgtctctgca tcatggcatg tgagccagtg cacggccccc 1380 ttttgatttc aggtttgggg atcatagctc tagcagaact acttggatta gtttatatga 1440 agtttgtcgc ttccaaccag aggactatcc aacctcctag gaaagctgta gaggaacccc 1500 ttaacgaata ggtgaaggga agtgacggac tgtaacttgg aagtcagaaa tggaagaata 1560 cagttgtcta agcaccaggt cttcacgact cacagctgga aggaacagac aacagtaact 1620 gacttccatc caggaaaaca tgtcacataa atgattacta agtttatatt caaagcagct 1680 gtactttaca taataaaaaa aatatgatgt gctgtgtaac caattggaat cccatttttc 1740 tattgtttct actcaactag gggcaaacgt ttcaggggca acttccaaga atgatgcttg 1800 ttagatccta gagtctctga acactgagtt taaattgatt ccgagtgaga ctcgccaagc 1860 actaacctga gggttagtta cccagagata cctatgaaaa acagtggtat ccagcaagcc 1920 ttagtaaact caggttgcca gcagctttgc cacttccgct gctagctgaa taacaagact 1980
4
gccacttctg ggtcatagtg atagagactg aagtagaaaa acgaatgtgg ttgggcaaat 2040 cccgtgtggc ccctctgtgt gctatgatat tgatggcact ggtgtcttca ttcttggggg 2100 ttgccatcat tcacacacac ccctttgaca tacagtgcac cccagttttg aatacatttt 2160 ttttgcaccc tgtcccgttc tgctactttg atttgcgtta tgatatatat atatatatat 2220 aatacctttt ctcctcttta aacatggtcc tgtgacacaa tagtcagttg cagaaaggag 2280 ccagacttat tcgcaaagca ctgtgctcaa actcttcaga aaaaaaggaa aaaaaaaaaa 2340 agctatagtt gtaacatatg tattccagac ctctggttta aaggcaaaag aaaaaaaatc 2400 tacagtgttt cttctcatgt tttctgatcg gaggcatgac aaagcaagac tgaaatctga 2460 actgtgtctc ctgcatggca acacgtgtct ccgtcaggcc ctcgcaaggc ccggggaggg 2520 ggttctacgc ctcttgtctc tttgttgcat gctgaacact catcgccttc ctactgtatc 2580 ctgcctcctg cagcctccct cttcctcctc ctcttcctct tcctcctctt cctcctcctc 2640 ctcctcttcc tccaagtttg aaaggtcaaa caaaactacc acattcccta cccagttaga 2700 agaaaaccac cgtcctgaca gttgtgatcg catggagtac ttttagatta ttagcacctg 2760 tttttacctc gtttgtgggc gtgtttgtat gtgcacatgt atgaagtcgg cacatgcacc 2820 ttctgtatgg gcagaggcgt ggcatctaca gaagagcaga tgccaacttt gtgcttttag 2880 tgaatacatt aaaaaaaaaa aaccaacggt ccttattgag tggaattcta tttgatgcaa 2940 atatttgagc tctttaagac tttaaaacta gataatgtgc caagctttta ggactgctca 3000 ccagtgccct ctgaagaaac accagtactt tttcctgttt gtgtaataaa ggcatatttg 3060 tatttgtgtt tgcatcacta atggttattt cttcttagtc cactgaatgt ttccatgtgc 3120 ctctcgtatg ccaaactttt tgtcatcttt catgtgggga ccaaatggtt tgtctgtggc 3180 aaacctaaac ctatgacctg ctgaggcctc tcagaaaact gaccacagta ccaagatagt 3240 acttcgcaaa gaaaagtagg ttccctccct ggttttgtag ctgtcgccaa tattagcgta 3300 attccaagga gctgaacgcc tttatataaa tctgatggca cctgatgctt ttagttctga 3360 aaatatttac actcggatca tgttgttgat gacttaaaca aagttttgat gaagagagca 3420 aaaaaaaagc aggtggattt ggaacagttt cagggttttt tttgtttttt gttttttgtt 3480 tttgtttttt tttttttatt tttgtttttc tgttctctgt tagaaaagtc aggtgttctc 3540 tgtcaggcta tctttatagt caattttttt tacgaactaa agtagtacct tttaatatgt 3600 agtcaacgcc cctctgctcg gggttcagtt ttgggtctta accagctgtc atgttctcta 3660 tgctgcctgc cacttgaggc actgagtgcc ctagacagtc ccatcggtgg tagccaggga 3720 aacgaaagac gaactcaact cttgctccta ataatcaact ctctgtatga aggatggcag 3780 cattaagagt cctcctgcct gggcattatt gggccagttc accctcttta aatcaaaccc 3840 gcagtggctc ccagttctcg tcccatcaga tttaaattgc taacagtatg gggggcacca 3900 cgcatctgtt ttgtcccaca atgcgctttt ctctcccaaa tcccgatttc tgctgtcata 3960 gcctctattc aatttttatt tattgtctgc cctccactta tacaatcgta gagagcaatg 4020 ccatttgtca ctttctgcaa cagttttttg agcctttatg gctgaatccc atttttcttc 4080 tctttcaaac tgtttgctcc attgctcctc ccgcacggct gtccgtacag tcatcccatc 4140 catctggggg cctctttcat ctctcaccct tcctggtgct tcgtggatct ctgcttacct 4200 ctgtgggttt tttttttttt ttttgactta ttcttctcac tggactttaa gattacttcc 4260 acagcgaaag tgctgcctcc cttttctgcc cgcagtgttc tgcgtacttt agatactact 4320 cagtgctgac atttgatggc aaaagttgcc tgcacttaaa tttctctttt taatagggtg 4380 aactagagtt ggagtttttt tctctttttt ctcttttctc tctctctctc tctctctctc 4440 tctctctctc tctctctctc cctccctccc tccctccctc cctccctccc tctctctctc 4500 tttttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttttt 4560 tgacaaatct cacaggcttt gagaattata aaaggtgaca gttcacctga aaatcacagg 4620 tctggtctgt ttaaattgtt gagaaatatc cgattaaaag tcttgtggct gtgtcctaat 4680 aggctctctt tcaggacgtt gtagtcaata gagtggctga accatacttg agtttataaa 4740 gctcaaaaac tgatgcaccc actctgctat tatcgtgtta gtaagagttc agctgtatat 4800 cattgtctag gtttatcttg tcctacagtg ggtattcaaa tatggccacc agaggatatg 4860 tgtaaatata agcacctgta tttgcctgtt gttgagaact ggagggaaaa caaaaaatgt 4920 ctggcaaccc tttgcctttt taaccgtaat taattgacag tttatttaga gataagagtt 4980 ttcaaaaatc tcttaactgc cacaacccac agagggtctt gttttgccat cttcagtggc 5040 tcacagatat gatccaagtt aacttgaaag agatgagcag tacccaggaa attgtcctgc 5100
ctttaactct ggctgtcctt aattatgact gtttaatgct gaattttcca tccgtctagt 5160
gtttgagggt aaagaaaagc cttttttaaa taagtatttc tgtaaaacgg catcggtggg 5220
atcttctgtg ttgctatcac gggtgaaaga gggaaacatt tcttattttt attaagcaga 5280
gcattattta cagaaagcca ttgttgagaa ttagttccca catcatataa atatccatta 5340
accattctaa attgtaagag aactccagtg ttgctatgca caaggaactc tcctgggggc 5400
ctttttttgc atagcaatta aaggtatgct atttgtcagt agccattttt tgcagtgatt 5460
taaagaccaa agttgtttta cagctgtgtt acccttaaag gttttttttt tatgtattaa 5520
atcaatttat cactgtttga agctttgaat acctgcaatc tttgccaaga tactttttta 5580
tttaaaaaaa taactgtgta aatattaccc tgtaatatta tatatactta ataaaacatt 5640
ttaagcta 5648
<210> 6
<211> 331
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser 20 25 30
Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala 35 40 45
Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr 50 55 60
Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn 65 70 75 80
Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala 85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys 100 105 110
Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys 115 120 125
Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser Tyr Glu 130 135 140
Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu 145 150 155 160
Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp 165 170 175
Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn 180 185 190
Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile 195 200 205
Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys 210 215 220
Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile 225 230 235 240
Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe 245 250 255
Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu 260 265 270
Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro 275 280 285
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly 290 295 300
Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro
305 310 315 320
Pro Arg Lys Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Glu
325 330
<210> 7
<211> 5618
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 7
gcctacaccg ggagagcagg gaggaggagt tggactgagg ttgggcggct ccgaggtcca 60
gggcgagctt ggccagaggg agtagagagc agcggggctg cgcagggacg cgtgccgtga 120
gttccggtga gcgtgtgtgt cccatgctcc cgtctttcag gccggcccag gacacgaagc 180
cggaagagag ctggctggag ggacgggggc cgtgagcaga gagtgcaacc cgcgcagccc 240
cggggacagg ctgattcttg gcgctctccg ccggagcctg cccagggctg ggtgtgaggc 300
tggcgtcacg tcaacgagca gaggcggcca ggcggggcgg agtgcgcgtg cgcggggcgg 360
cgagcacgcg cgcgcgcgca cccccgggca gcctgggcgg ccgctcctgc ctgtcactgc 420
tgcggcgctg ctggtcggtc gtttcccttg aaggcagcag cggaggcggc ggctgctcca 480
1
gacacctgcg gcggcgaccc cccggcggcg cggagatgtg gcccttggcg gcggcgctgt 540 tgctgggctc ctgctgctgc ggttcagctc aactactgtt tagtaacgtc aactccatag 600 agttcacttc atgcaatgaa actgtggtca tcccttgcat cgtccgtaat gtggaggcgc 660 aaagcaccga agaaatgttt gtgaagtgga agttgaacaa atcgtatatt ttcatctatg 720 atggaaataa aaatagcact actacagatc aaaactttac cagtgcaaaa atctcagtct 780 cagacttaat caatggcatt gcctctttga aaatggataa gcgcgatgcc atggtgggaa 840 actacacttg cgaagtgaca gagttatcca gagaaggcaa aacagttata gagctgaaaa 900 accgcacggt ttcgtggttt tctccaaatg aaaagatcct cattgttatt ttcccaattt 960 tggctatact cctgttctgg ggaaagtttg gtattttaac actcaaatat aaatccagcc 1020 atacgaataa gagaatcatt ctgctgctcg ttgccgggct ggtgctcaca gtcatcgtgg 1080 ttgttggagc catccttctc atcccaggag aaaagcccgt gaagaatgct tctggacttg 1140 gcctcattgt aatctctacg gggatattaa tactacttca gtacaatgtg tttatgacag 1200 cttttggaat gacctctttc accattgcca tattgatcac tcaagtgctg ggctacgtcc 1260 ttgctttggt cgggctgtgt ctctgcatca tggcatgtga gccagtgcac ggcccccttt 1320 tgatttcagg tttggggatc atagctctag cagaactact tggattagtt tatatgaagt 1380 ttgtcgcttc caaccagagg actatccaac ctcctaggaa agctgtagag gaacccctta 1440 acgcatttaa agagtcaaaa ggaatgatga atgacgaata ggtgaaggga agtgacggac 1500
2
tgtaacttgg aagtcagaaa tggaagaata cagttgtcta agcaccaggt cttcacgact 1560 cacagctgga aggaacagac aacagtaact gacttccatc caggaaaaca tgtcacataa 1620 atgattacta agtttatatt caaagcagct gtactttaca taataaaaaa aatatgatgt 1680 gctgtgtaac caattggaat cccatttttc tattgtttct actcaactag gggcaaacgt 1740 ttcaggggca acttccaaga atgatgcttg ttagatccta gagtctctga acactgagtt 1800 taaattgatt ccgagtgaga ctcgccaagc actaacctga gggttagtta cccagagata 1860 cctatgaaaa acagtggtat ccagcaagcc ttagtaaact caggttgcca gcagctttgc 1920 cacttccgct gctagctgaa taacaagact gccacttctg ggtcatagtg atagagactg 1980 aagtagaaaa acgaatgtgg ttgggcaaat cccgtgtggc ccctctgtgt gctatgatat 2040 tgatggcact ggtgtcttca ttcttggggg ttgccatcat tcacacacac ccctttgaca 2100 tacagtgcac cccagttttg aatacatttt ttttgcaccc tgtcccgttc tgctactttg 2160 atttgcgtta tgatatatat atatatatat aatacctttt ctcctcttta aacatggtcc 2220 tgtgacacaa tagtcagttg cagaaaggag ccagacttat tcgcaaagca ctgtgctcaa 2280 actcttcaga aaaaaaggaa aaaaaaaaaa agctatagtt gtaacatatg tattccagac 2340 ctctggttta aaggcaaaag aaaaaaaatc tacagtgttt cttctcatgt tttctgatcg 2400 gaggcatgac aaagcaagac tgaaatctga actgtgtctc ctgcatggca acacgtgtct 2460 ccgtcaggcc ctcgcaaggc ccggggaggg ggttctacgc ctcttgtctc tttgttgcat 2520 gctgaacact catcgccttc ctactgtatc ctgcctcctg cagcctccct cttcctcctc 2580 ctcttcctct tcctcctctt cctcctcctc ctcctcttcc tccaagtttg aaaggtcaaa 2640 caaaactacc acattcccta cccagttaga agaaaaccac cgtcctgaca gttgtgatcg 2700 catggagtac ttttagatta ttagcacctg tttttacctc gtttgtgggc gtgtttgtat 2760 gtgcacatgt atgaagtcgg cacatgcacc ttctgtatgg gcagaggcgt ggcatctaca 2820 gaagagcaga tgccaacttt gtgcttttag tgaatacatt aaaaaaaaaa aaccaacggt 2880 ccttattgag tggaattcta tttgatgcaa atatttgagc tctttaagac tttaaaacta 2940 gataatgtgc caagctttta ggactgctca ccagtgccct ctgaagaaac accagtactt 3000 tttcctgttt gtgtaataaa ggcatatttg tatttgtgtt tgcatcacta atggttattt 3060 cttcttagtc cactgaatgt ttccatgtgc ctctcgtatg ccaaactttt tgtcatcttt 3120 catgtgggga ccaaatggtt tgtctgtggc aaacctaaac ctatgacctg ctgaggcctc 3180 tcagaaaact gaccacagta ccaagatagt acttcgcaaa gaaaagtagg ttccctccct 3240 ggttttgtag ctgtcgccaa tattagcgta attccaagga gctgaacgcc tttatataaa 3300 tctgatggca cctgatgctt ttagttctga aaatatttac actcggatca tgttgttgat 3360 gacttaaaca aagttttgat gaagagagca aaaaaaaagc aggtggattt ggaacagttt 3420 cagggttttt tttgtttttt gttttttgtt tttgtttttt tttttttatt tttgtttttc 3480 tgttctctgt tagaaaagtc aggtgttctc tgtcaggcta tctttatagt caattttttt 3540
4
tacgaactaa agtagtacct tttaatatgt agtcaacgcc cctctgctcg gggttcagtt 3600 ttgggtctta accagctgtc atgttctcta tgctgcctgc cacttgaggc actgagtgcc 3660 ctagacagtc ccatcggtgg tagccaggga aacgaaagac gaactcaact cttgctccta 3720 ataatcaact ctctgtatga aggatggcag cattaagagt cctcctgcct gggcattatt 3780 gggccagttc accctcttta aatcaaaccc gcagtggctc ccagttctcg tcccatcaga 3840 tttaaattgc taacagtatg gggggcacca cgcatctgtt ttgtcccaca atgcgctttt 3900 ctctcccaaa tcccgatttc tgctgtcata gcctctattc aatttttatt tattgtctgc 3960 cctccactta tacaatcgta gagagcaatg ccatttgtca ctttctgcaa cagttttttg 4020 agcctttatg gctgaatccc atttttcttc tctttcaaac tgtttgctcc attgctcctc 4080 ccgcacggct gtccgtacag tcatcccatc catctggggg cctctttcat ctctcaccct 4140 tcctggtgct tcgtggatct ctgcttacct ctgtgggttt tttttttttt ttttgactta 4200 ttcttctcac tggactttaa gattacttcc acagcgaaag tgctgcctcc cttttctgcc 4260 cgcagtgttc tgcgtacttt agatactact cagtgctgac atttgatggc aaaagttgcc 4320 tgcacttaaa tttctctttt taatagggtg aactagagtt ggagtttttt tctctttttt 4380 ctcttttctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc cctccctccc 4440 tccctccctc cctccctccc tctctctctc tttttctttc tttctttctt tctttctttc 4500 tttctttctt tctttctttc tttctttttt tgacaaatct cacaggcttt gagaattata 4560 aaaggtgaca gttcacctga aaatcacagg tctggtctgt ttaaattgtt gagaaatatc 4620 cgattaaaag tcttgtggct gtgtcctaat aggctctctt tcaggacgtt gtagtcaata 4680 gagtggctga accatacttg agtttataaa gctcaaaaac tgatgcaccc actctgctat 4740 tatcgtgtta gtaagagttc agctgtatat cattgtctag gtttatcttg tcctacagtg 4800 ggtattcaaa tatggccacc agaggatatg tgtaaatata agcacctgta tttgcctgtt 4860 gttgagaact ggagggaaaa caaaaaatgt ctggcaaccc tttgcctttt taaccgtaat 4920 taattgacag tttatttaga gataagagtt ttcaaaaatc tcttaactgc cacaacccac 4980 agagggtctt gttttgccat cttcagtggc tcacagatat gatccaagtt aacttgaaag 5040 agatgagcag tacccaggaa attgtcctgc ctttaactct ggctgtcctt aattatgact 5100 gtttaatgct gaattttcca tccgtctagt gtttgagggt aaagaaaagc cttttttaaa 5160 taagtatttc tgtaaaacgg catcggtggg atcttctgtg ttgctatcac gggtgaaaga 5220 gggaaacatt tcttattttt attaagcaga gcattattta cagaaagcca ttgttgagaa 5280 ttagttccca catcatataa atatccatta accattctaa attgtaagag aactccagtg 5340 ttgctatgca caaggaactc tcctgggggc ctttttttgc atagcaatta aaggtatgct 5400 atttgtcagt agccattttt tgcagtgatt taaagaccaa agttgtttta cagctgtgtt 5460 acccttaaag gttttttttt tatgtattaa atcaatttat cactgtttga agctttgaat 5520 acctgcaatc tttgccaaga tactttttta tttaaaaaaa taactgtgta aatattaccc 5580 tgtaatatta tatatactta ataaaacatt ttaagcta 5618
<210> 8
<211> 321
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly 1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser 20 25 30
Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala 35 40 45
Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr 50 55 60
Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn 65 70 75 80
Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala 85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys 115 120 125
Asn Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val 130 135 140
Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile 145 150 155 160
Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn Lys Arg Ile Ile Leu 165 170 175
Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile Val Val Val Gly Ala 180 185 190
Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys Asn Ala Ser Gly Leu 195 200 205
Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Asn 210 215 220
Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe Thr Ile Ala Ile Leu 225 230 235 240
Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu
245 250 255
Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly
260 265 270
Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys
275 280 285
Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys Ala Val
290 295 300
Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met Asn Asp 305 310 315 320
Glu
<210> 9
<211> 5021
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
agtgggagcg cgcgtgcgcg cggccgtgca gcctgggcag tgggtcctgc ctgtgacgcg 60
cggcggcggt cggtcctgcc tgtaacggcg gcggcggctg ctgctccgga cacctgcggc 120 ggcggcggcg accccgcggc gggcgcggag atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg 180 ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc 240 acgttttgta atgacactgt cgtcattcca tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac 300 actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt aaaggaagag atatttacac ctttgatgga 360 gctctaaaca agtccactgt ccccactgac tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa 420 ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg gataagagtg atgctgtctc acacacagga 480 aactacactt gtgaagtaac agaattaacc agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa 540 tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt 600 tttgctatac tcctgttctg gggacagttt ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt 660 ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc 720 attgttggag ccattctttt cgtcccaggt gaatattcat taaagaatgc tactggcctt 780 ggtttaattg tgacttctac agggatatta atattacttc actactatgt gtttagtaca 840 gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc atattggtta ttcaggtgat agcctatatc 900 ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt 960 ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa 1020 tttgtggaat aactgaagtg aagtgatgga ctccgatttg gagagtagta agacgtgaaa 1080 ggaatacact tgtgtttaag caccatggcc ttgatgattc actgttgggg agaagaaaca 1140
1
agaaaagtaa ctggttgtca cctatgagac ccttacgtga ttgttagtta agtttttatt 1200 caaagcagct gtaatttagt taataaaata attatgatct atgttgtttg cccaattgag 1260 atccagtttt ttgttgttat ttttaatcaa ttaggggcaa tagtagaatg gacaatttcc 1320 aagaatgatg cctttcaggt cctagggcct ctggcctcta ggtaaccagt ttaaattggt 1380 tcagggtgat aactacttag cactgccctg gtgattaccc agagatatct atgaaaacca 1440 gtggcttcca tcaaaccttt gccaactcag gttcacagca gctttgggca gttatggcag 1500 tatggcatta gctgagaggt gtctgccact tctgggtcaa tggaataata aattaagtac 1560 aggcaggaat ttggttggga gcatcttgta tgatctccgt atgatgtgat attgatggag 1620 atagtggtcc tcattcttgg gggttgccat tcccacattc ccccttcaac aaacagtgta 1680 acaggtcctt cccagattta gggtactttt attgatggat atgttttcct tttattcaca 1740 taaccccttg aaaccctgtc ttgtcctcct gttacttgct tctgctgtac aagatgtagc 1800 accttttctc ctctttgaac atggtctagt gacacggtag caccagttgc aggaaggagc 1860 cagacttgtt ctcagagcac tgtgttcaca cttttcagca aaaatagcta tggttgtaac 1920 atatgtattc ccttcctctg atttgaaggc aaaaatctac agtgtttctt cacttctttt 1980 ctgatctggg gcatgaaaaa agcaagattg aaatttgaac tatgagtctc ctgcatggca 2040 acaaaatgtg tgtcaccatc aggccaacag gccagccctt gaatggggat ttattactgt 2100 tgtatctatg ttgcatgata aacattcatc accttcctcc tgtagtcctg cctcgtactc 2160
1 1
cccttcccct atgattgaaa agtaaacaaa acccacattt cctatcctgg ttagaagaaa 2220 attaatgttc tgacagttgt gatcgcctgg agtactttta gacttttagc attcgttttt 2280 tacctgtttg tggatgtgtg tttgtatgtg catacgtatg agataggcac atgcatcttc 2340 tgtatggaca aaggtggggt acctacagga gagcaaaggt taattttgtg cttttagtaa 2400 aaacatttaa atacaaagtt ctttattggg tggaattata tttgatgcaa atatttgatc 2460 acttaaaact tttaaaactt ctaggtaatt tgccacgctt tttgactgct caccaatacc 2520 ctgtaaaaat acgtaattct tcctgtttgt gtaataagat attcatattt gtagttgcat 2580 taataatagt tatttcttag tccatcagat gttcccgtgt gcctctttta tgccaaattg 2640 attgtcatat ttcatgttgg gaccaagtag tttgcccatg gcaaacctaa atttatgacc 2700 tgctgaggcc tctcagaaaa ctgagcatac tagcaagaca gctcttcttg aaaaaaaaaa 2760 tatgtataca caaatatata cgtatatcta tatatacgta tgtatataca cacatgtata 2820 ttcttccttg attgtgtagc tgtccaaaat aataacatat atagagggag ctgtattcct 2880 ttatacaaat ctgatggctc ctgcagcact ttttccttct gaaaatattt acattttgct 2940 aacctagttt gttactttaa aaatcagttt tgatgaaagg agggaaaagc agatggactt 3000 gaaaaagatc caagctccta ttagaaaagg tatgaaaatc tttatagtaa aattttttat 3060 aaactaaagt tgtacctttt aatatgtagt aaactctcat ttatttgggg ttcgctcttg 3120 gatctcatcc atccattgtg ttctctttaa tgctgcctgc cttttgaggc attcactgcc 3180
1 2
ctagacaatg ccaccagaga tagtggggga aatgccagat gaaaccaact cttgctctca 3240 ctagttgtca gcttctctgg ataagtgacc acagaagcag gagtcctcct gcttgggcat 3300 cattgggcca gttccttctc tttaaatcag atttgtaatg gctcccaaat tccatcacat 3360 cacatttaaa ttgcagacag tgttttgcac atcatgtatc tgttttgtcc cataatatgc 3420 tttttactcc ctgatcccag tttctgctgt tgactcttcc attcagtttt atttattgtg 3480 tgttctcaca gtgacaccat ttgtcctttt ctgcaacaac ctttccagct acttttgcca 3540 aattctattt gtcttctcct tcaaaacatt ctcctttgca gttcctcttc atctgtgtag 3600 ctgctctttt gtctcttaac ttaccattcc tatagtactt tatgcatctc tgcttagttc 3660 tattagtttt ttggccttgc tcttctcctt gattttaaaa ttccttctat agctagagct 3720 tttctttctt tcattctctc ttcctgcagt gttttgcata catcagaagc taggtacata 3780 agttaaatga ttgagagttg gctgtattta gatttatcac tttttaatag ggtgagcttg 3840 agagttttct ttctttctgt tttttttttt tgtttttttt tttttttttt tttttttttt 3900 ttttgactaa tttcacatgc tctaaaaacc ttcaaaggtg attatttttc tcctggaaac 3960 tccaggtcca ttctgtttaa atccctaaga atgtcagaat taaaataaca gggctatccc 4020 gtaattggaa atatttcttt tttcaggatg ctatagtcaa tttagtaagt gaccaccaaa 4080 ttgttatttg cactaacaaa gctcaaaaca cgataagttt actcctccat ctcagtaata 4140 aaaattaagc tgtaatcaac cttctaggtt tctcttgtct taaaatgggt attcaaaaat 4200
1
ggggatctgt ggtgtatgta tggaaacaca tactccttaa tttacctgtt gttggaaact 4260
ggagaaatga ttgtcgggca accgtttatt ttttattgta ttttatttgg ttgagggatt 4320
tttttataaa cagttttact tgtgtcatat tttaaaatta ctaactgcca tcacctgctg 4380
gggtcctttg ttaggtcatt ttcagtgact aatagggata atccaggtaa ctttgaagag 4440
atgagcagtg agtgaccagg cagtttttct gcctttagct ttgacagttc ttaattaaga 4500
tcattgaaga ccagctttct cataaatttc tctttttgaa aaaaagaaag catttgtact 4560
aagctcctct gtaagacaac atcttaaatc ttaaaagtgt tgttatcatg actggtgaga 4620
gaagaaaaca ttttgttttt attaaatgga gcattattta caaaaagcca ttgttgagaa 4680
ttagatccca catcgtataa atatctatta accattctaa ataaagagaa ctccagtgtt 4740
gctatgtgca agatcctctc ttggagcttt tttgcatagc aattaaaggt gtgctatttg 4800
tcagtagcca tttttttgca gtgatttgaa gaccaaagtt gttttacagc tgtgttaccg 4860
ttaaaggttt ttttttttat atgtattaaa tcaatttatc actgtttaaa gctttgaata 4920
tctgcaatct ttgccaaggt acttttttat ttaaaaaaaa acataacttt gtaaatatta 4980
ccctgtaata ttatatatac ttaataaaac attttaagct a 5021
<210> 10
<211> 293
<212> PRT
<213> Homo sapiens
1 4
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly 1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125
1
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270
1
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285
Met Lys Phe Val Glu
290
<210> 11
<211> 5288
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
ggggagcagg cgggggagcg ggcgggaagc agtgggagcg cgcgtgcgcg cggccgtgca 60
gcctgggcag tgggtcctgc ctgtgacgcg cggcggcggt cggtcctgcc tgtaacggcg 120
gcggcggctg ctgctccaga cacctgcggc ggcggcggcg accccgcggc gggcgcggag 180
atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 240
ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 300
tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 360
aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 420
tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 480
gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 540
1
agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 600 gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 660 ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 720 gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 780 gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 840 atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 900 atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 960 gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 1020 gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa 1080 cctcctagga ataactgaag tgaagtgatg gactccgatt tggagagtag taagacgtga 1140 aaggaataca cttgtgttta agcaccatgg ccttgatgat tcactgttgg ggagaagaaa 1200 caagaaaagt aactggttgt cacctatgag acccttacgt gattgttagt taagttttta 1260 ttcaaagcag ctgtaattta gttaataaaa taattatgat ctatgttgtt tgcccaattg 1320 agatccagtt ttttgttgtt atttttaatc aattaggggc aatagtagaa tggacaattt 1380 ccaagaatga tgcctttcag gtcctagggc ctctggcctc taggtaacca gtttaaattg 1440 gttcagggtg ataactactt agcactgccc tggtgattac ccagagatat ctatgaaaac 1500 cagtggcttc catcaaacct ttgccaactc aggttcacag cagctttggg cagttatggc 1560
1
agtatggcat tagctgagag gtgtctgcca cttctgggtc aatggaataa taaattaagt 1620 acaggcagga atttggttgg gagcatcttg tatgatctcc gtatgatgtg atattgatgg 1680 agatagtggt cctcattctt gggggttgcc attcccacat tcccccttca acaaacagtg 1740 taacaggtcc ttcccagatt tagggtactt ttattgatgg atatgttttc cttttattca 1800 cataacccct tgaaaccctg tcttgtcctc ctgttacttg cttctgctgt acaagatgta 1860 gcaccttttc tcctctttga acatggtcta gtgacacggt agcaccagtt gcaggaagga 1920 gccagacttg ttctcagagc actgtgttca cacttttcag caaaaatagc tatggttgta 1980 acatatgtat tcccttcctc tgatttgaag gcaaaaatct acagtgtttc ttcacttctt 2040 ttctgatctg gggcatgaaa aaagcaagat tgaaatttga actatgagtc tcctgcatgg 2100 caacaaaatg tgtgtcacca tcaggccaac aggccagccc ttgaatgggg atttattact 2160 gttgtatcta tgttgcatga taaacattca tcaccttcct cctgtagtcc tgcctcgtac 2220 tccccttccc ctatgattga aaagtaaaca aaacccacat ttcctatcct ggttagaaga 2280 aaattaatgt tctgacagtt gtgatcgcct ggagtacttt tagactttta gcattcgttt 2340 tttacctgtt tgtggatgtg tgtttgtatg tgcatacgta tgagataggc acatgcatct 2400 tctgtatgga caaaggtggg gtacctacag gagagcaaag gttaattttg tgcttttagt 2460 aaaaacattt aaatacaaag ttctttattg ggtggaatta tatttgatgc aaatatttga 2520 tcacttaaaa cttttaaaac ttctaggtaa tttgccacgc tttttgactg ctcaccaata 2580
1
ccctgtaaaa atacgtaatt cttcctgttt gtgtaataag atattcatat ttgtagttgc 2640 attaataata gttatttctt agtccatcag atgttcccgt gtgcctcttt tatgccaaat 2700 tgattgtcat atttcatgtt gggaccaagt agtttgccca tggcaaacct aaatttatga 2760 cctgctgagg cctctcagaa aactgagcat actagcaaga cagctcttct tgaaaaaaaa 2820 aatatgtata cacaaatata tacgtatatc tatatatacg tatgtatata cacacatgta 2880 tattcttcct tgattgtgta gctgtccaaa ataataacat atatagaggg agctgtattc 2940 ctttatacaa atctgatggc tcctgcagca ctttttcctt ctgaaaatat ttacattttg 3000 ctaacctagt ttgttacttt aaaaatcagt tttgatgaaa ggagggaaaa gcagatggac 3060 ttgaaaaaga tccaagctcc tattagaaaa ggtatgaaaa tctttatagt aaaatttttt 3120 ataaactaaa gttgtacctt ttaatatgta gtaaactctc atttatttgg ggttcgctct 3180 tggatctcat ccatccattg tgttctcttt aatgctgcct gccttttgag gcattcactg 3240 ccctagacaa tgccaccaga gatagtgggg gaaatgccag atgaaaccaa ctcttgctct 3300 cactagttgt cagcttctct ggataagtga ccacagaagc aggagtcctc ctgcttgggc 3360 atcattgggc cagttccttc tctttaaatc agatttgtaa tggctcccaa attccatcac 3420 atcacattta aattgcagac agtgttttgc acatcatgta tctgttttgt cccataatat 3480 gctttttact ccctgatccc agtttctgct gttgactctt ccattcagtt ttatttattg 3540 tgtgttctca cagtgacacc atttgtcctt ttctgcaaca acctttccag ctacttttgc 3600
11
caaattctat ttgtcttctc cttcaaaaca ttctcctttg cagttcctct tcatctgtgt 3660 agctgctctt ttgtctctta acttaccatt cctatagtac tttatgcatc tctgcttagt 3720 tctattagtt ttttggcctt gctcttctcc ttgattttaa aattccttct atagctagag 3780 cttttctttc tttcattctc tcttcctgca gtgttttgca tacatcagaa gctaggtaca 3840 taagttaaat gattgagagt tggctgtatt tagatttatc actttttaat agggtgagct 3900 tgagagtttt ctttctttct gttttttttt tttgtttttt tttttttttt tttttttttt 3960 ttttttgact aatttcacat gctctaaaaa ccttcaaagg tgattatttt tctcctggaa 4020 actccaggtc cattctgttt aaatccctaa gaatgtcaga attaaaataa cagggctatc 4080 ccgtaattgg aaatatttct tttttcagga tgctatagtc aatttagtaa gtgaccacca 4140 aattgttatt tgcactaaca aagctcaaaa cacgataagt ttactcctcc atctcagtaa 4200 taaaaattaa gctgtaatca accttctagg tttctcttgt cttaaaatgg gtattcaaaa 4260 atggggatct gtggtgtatg tatggaaaca catactcctt aatttacctg ttgttggaaa 4320 ctggagaaat gattgtcggg caaccgttta ttttttattg tattttattt ggttgaggga 4380 tttttttata aacagtttta cttgtgtcat attttaaaat tactaactgc catcacctgc 4440 tggggtcctt tgttaggtca ttttcagtga ctaataggga taatccaggt aactttgaag 4500 agatgagcag tgagtgacca ggcagttttt ctgcctttag ctttgacagt tcttaattaa 4560 gatcattgaa gaccagcttt ctcataaatt tctctttttg aaaaaaagaa agcatttgta 4620 ctaagctcct ctgtaagaca acatcttaaa tcttaaaagt gttgttatca tgactggtga 4680
gagaagaaaa cattttgttt ttattaaatg gagcattatt tacaaaaagc cattgttgag 4740
aattagatcc cacatcgtat aaatatctat taaccattct aaataaagag aactccagtg 4800
ttgctatgtg caagatcctc tcttggagct tttttgcata gcaattaaag gtgtgctatt 4860
tgtcagtagc catttttttg cagtgatttg aagaccaaag ttgttttaca gctgtgttac 4920
cgttaaaggt tttttttttt atatgtatta aatcaattta tcactgttta aagctttgaa 4980
tatctgcaat ctttgccaag gtactttttt atttaaaaaa aaacataact ttgtaaatat 5040
taccctgtaa tattatatat acttaataaa acattttaag ctattttgtt gggctatttc 5100
tattgctgct acagcagacc acaagcacat ttctgaaaaa tttaatttat taatgtattt 5160
ttaagttgct tatattctag gtaacaatgt aaagaatgat ttaaaatatt aattatgaat 5220
tttttgagta taatacccaa taagctttta attagagcag agttttaatt aaaagtttta 5280
aatcagtc 5288
<210> 12
<211> 305
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
11
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn
290 295 300
Asn
305
<210> 13
<211> 5078
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
agtgggagcg cgcgtgcgcg cggccgtgca gcctgggcag tgggtcctgc ctgtgacgcg 60
cggcggcggt cggtcctgcc tgtaacggcg gcggcggctg ctgctccgga cacctgcggc 120
ggcggcggcg accccgcggc gggcgcggag atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg 180
ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc 240
acgttttgta atgacactgt cgtcattcca tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac 300
actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt aaaggaagag atatttacac ctttgatgga 360
gctctaaaca agtccactgt ccccactgac tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa 420
ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg gataagagtg atgctgtctc acacacagga 480
aactacactt gtgaagtaac agaattaacc agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa 540
tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt 600
11
tttgctatac tcctgttctg gggacagttt ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt 660 ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc 720 attgttggag ccattctttt cgtcccaggt gaatattcat taaagaatgc tactggcctt 780 ggtttaattg tgacttctac agggatatta atattacttc actactatgt gtttagtaca 840 gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc atattggtta ttcaggtgat agcctatatc 900 ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt 960 ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa 1020 tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa cctcctagga aagctgtaga ggaacccctt 1080 aatgaataac tgaagtgaag tgatggactc cgatttggag agtagtaaga cgtgaaagga 1140 atacacttgt gtttaagcac catggccttg atgattcact gttggggaga agaaacaaga 1200 aaagtaactg gttgtcacct atgagaccct tacgtgattg ttagttaagt ttttattcaa 1260 agcagctgta atttagttaa taaaataatt atgatctatg ttgtttgccc aattgagatc 1320 cagttttttg ttgttatttt taatcaatta ggggcaatag tagaatggac aatttccaag 1380 aatgatgcct ttcaggtcct agggcctctg gcctctaggt aaccagttta aattggttca 1440 gggtgataac tacttagcac tgccctggtg attacccaga gatatctatg aaaaccagtg 1500 gcttccatca aacctttgcc aactcaggtt cacagcagct ttgggcagtt atggcagtat 1560 ggcattagct gagaggtgtc tgccacttct gggtcaatgg aataataaat taagtacagg 1620
11
caggaatttg gttgggagca tcttgtatga tctccgtatg atgtgatatt gatggagata 1680 gtggtcctca ttcttggggg ttgccattcc cacattcccc cttcaacaaa cagtgtaaca 1740 ggtccttccc agatttaggg tacttttatt gatggatatg ttttcctttt attcacataa 1800 ccccttgaaa ccctgtcttg tcctcctgtt acttgcttct gctgtacaag atgtagcacc 1860 ttttctcctc tttgaacatg gtctagtgac acggtagcac cagttgcagg aaggagccag 1920 acttgttctc agagcactgt gttcacactt ttcagcaaaa atagctatgg ttgtaacata 1980 tgtattccct tcctctgatt tgaaggcaaa aatctacagt gtttcttcac ttcttttctg 2040 atctggggca tgaaaaaagc aagattgaaa tttgaactat gagtctcctg catggcaaca 2100 aaatgtgtgt caccatcagg ccaacaggcc agcccttgaa tggggattta ttactgttgt 2160 atctatgttg catgataaac attcatcacc ttcctcctgt agtcctgcct cgtactcccc 2220 ttcccctatg attgaaaagt aaacaaaacc cacatttcct atcctggtta gaagaaaatt 2280 aatgttctga cagttgtgat cgcctggagt acttttagac ttttagcatt cgttttttac 2340 ctgtttgtgg atgtgtgttt gtatgtgcat acgtatgaga taggcacatg catcttctgt 2400 atggacaaag gtggggtacc tacaggagag caaaggttaa ttttgtgctt ttagtaaaaa 2460 catttaaata caaagttctt tattgggtgg aattatattt gatgcaaata tttgatcact 2520 taaaactttt aaaacttcta ggtaatttgc cacgcttttt gactgctcac caataccctg 2580 taaaaatacg taattcttcc tgtttgtgta ataagatatt catatttgta gttgcattaa 2640
11
taatagttat ttcttagtcc atcagatgtt cccgtgtgcc tcttttatgc caaattgatt 2700 gtcatatttc atgttgggac caagtagttt gcccatggca aacctaaatt tatgacctgc 2760 tgaggcctct cagaaaactg agcatactag caagacagct cttcttgaaa aaaaaaatat 2820 gtatacacaa atatatacgt atatctatat atacgtatgt atatacacac atgtatattc 2880 ttccttgatt gtgtagctgt ccaaaataat aacatatata gagggagctg tattccttta 2940 tacaaatctg atggctcctg cagcactttt tccttctgaa aatatttaca ttttgctaac 3000 ctagtttgtt actttaaaaa tcagttttga tgaaaggagg gaaaagcaga tggacttgaa 3060 aaagatccaa gctcctatta gaaaaggtat gaaaatcttt atagtaaaat tttttataaa 3120 ctaaagttgt accttttaat atgtagtaaa ctctcattta tttggggttc gctcttggat 3180 ctcatccatc cattgtgttc tctttaatgc tgcctgcctt ttgaggcatt cactgcccta 3240 gacaatgcca ccagagatag tgggggaaat gccagatgaa accaactctt gctctcacta 3300 gttgtcagct tctctggata agtgaccaca gaagcaggag tcctcctgct tgggcatcat 3360 tgggccagtt ccttctcttt aaatcagatt tgtaatggct cccaaattcc atcacatcac 3420 atttaaattg cagacagtgt tttgcacatc atgtatctgt tttgtcccat aatatgcttt 3480 ttactccctg atcccagttt ctgctgttga ctcttccatt cagttttatt tattgtgtgt 3540 tctcacagtg acaccatttg tccttttctg caacaacctt tccagctact tttgccaaat 3600 tctatttgtc ttctccttca aaacattctc ctttgcagtt cctcttcatc tgtgtagctg 3660
11
ctcttttgtc tcttaactta ccattcctat agtactttat gcatctctgc ttagttctat 3720 tagttttttg gccttgctct tctccttgat tttaaaattc cttctatagc tagagctttt 3780 ctttctttca ttctctcttc ctgcagtgtt ttgcatacat cagaagctag gtacataagt 3840 taaatgattg agagttggct gtatttagat ttatcacttt ttaatagggt gagcttgaga 3900 gttttctttc tttctgtttt ttttttttgt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960 tgactaattt cacatgctct aaaaaccttc aaaggtgatt atttttctcc tggaaactcc 4020 aggtccattc tgtttaaatc cctaagaatg tcagaattaa aataacaggg ctatcccgta 4080 attggaaata tttctttttt caggatgcta tagtcaattt agtaagtgac caccaaattg 4140 ttatttgcac taacaaagct caaaacacga taagtttact cctccatctc agtaataaaa 4200 attaagctgt aatcaacctt ctaggtttct cttgtcttaa aatgggtatt caaaaatggg 4260 gatctgtggt gtatgtatgg aaacacatac tccttaattt acctgttgtt ggaaactgga 4320 gaaatgattg tcgggcaacc gtttattttt tattgtattt tatttggttg agggattttt 4380 ttataaacag ttttacttgt gtcatatttt aaaattacta actgccatca cctgctgggg 4440 tcctttgtta ggtcattttc agtgactaat agggataatc caggtaactt tgaagagatg 4500 agcagtgagt gaccaggcag tttttctgcc tttagctttg acagttctta attaagatca 4560 ttgaagacca gctttctcat aaatttctct ttttgaaaaa aagaaagcat ttgtactaag 4620 ctcctctgta agacaacatc ttaaatctta aaagtgttgt tatcatgact ggtgagagaa 4680
11
gaaaacattt tgtttttatt aaatggagca ttatttacaa aaagccattg ttgagaatta 4740
gatcccacat cgtataaata tctattaacc attctaaata aagagaactc cagtgttgct 4800
atgtgcaaga tcctctcttg gagctttttt gcatagcaat taaaggtgtg ctatttgtca 4860
gtagccattt ttttgcagtg atttgaagac caaagttgtt ttacagctgt gttaccgtta 4920
aaggtttttt tttttatatg tattaaatca atttatcact gtttaaagct ttgaatatct 4980
gcaatctttg ccaaggtact tttttattta aaaaaaaaca taactttgta aatattaccc 5040
tgtaatatta tatatactta ataaaacatt ttaagcta 5078
<210> 14
<211> 312
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
12
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys 290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Glu
305 310
<211> 5346
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
ggggagcagg cgggggagcg ggcgggaagc agtgggagcg cgcgtgcgcg cggccgtgca 60
gcctgggcag tgggtcctgc ctgtgacgcg cggcggcggt cggtcctgcc tgtaacggcg 120
gcggcggctg ctgctccaga cacctgcggc ggcggcggcg accccgcggc gggcgcggag 180
atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 240
ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 300
tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 360
aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 420
tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 480
gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 540
agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 600
gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 660
ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 720
gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 780
gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 840
12
atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 900 atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 960 gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 1020 gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa 1080 cctcctagga aagctgtaga ggaacccctt aatgcattca aagaatcaaa aggaatgatg 1140 aatgatgaat aactgaagtg aagtgatgga ctccgatttg gagagtagta agacgtgaaa 1200 ggaatacact tgtgtttaag caccatggcc ttgatgattc actgttgggg agaagaaaca 1260 agaaaagtaa ctggttgtca cctatgagac ccttacgtga ttgttagtta agtttttatt 1320 caaagcagct gtaatttagt taataaaata attatgatct atgttgtttg cccaattgag 1380 atccagtttt ttgttgttat ttttaatcaa ttaggggcaa tagtagaatg gacaatttcc 1440 aagaatgatg cctttcaggt cctagggcct ctggcctcta ggtaaccagt ttaaattggt 1500 tcagggtgat aactacttag cactgccctg gtgattaccc agagatatct atgaaaacca 1560 gtggcttcca tcaaaccttt gccaactcag gttcacagca gctttgggca gttatggcag 1620 tatggcatta gctgagaggt gtctgccact tctgggtcaa tggaataata aattaagtac 1680 aggcaggaat ttggttggga gcatcttgta tgatctccgt atgatgtgat attgatggag 1740 atagtggtcc tcattcttgg gggttgccat tcccacattc ccccttcaac aaacagtgta 1800 acaggtcctt cccagattta gggtactttt attgatggat atgttttcct tttattcaca 1860 taaccccttg aaaccctgtc ttgtcctcct gttacttgct tctgctgtac aagatgtagc 1920 accttttctc ctctttgaac atggtctagt gacacggtag caccagttgc aggaaggagc 1980 cagacttgtt ctcagagcac tgtgttcaca cttttcagca aaaatagcta tggttgtaac 2040 atatgtattc ccttcctctg atttgaaggc aaaaatctac agtgtttctt cacttctttt 2100 ctgatctggg gcatgaaaaa agcaagattg aaatttgaac tatgagtctc ctgcatggca 2160 acaaaatgtg tgtcaccatc aggccaacag gccagccctt gaatggggat ttattactgt 2220 tgtatctatg ttgcatgata aacattcatc accttcctcc tgtagtcctg cctcgtactc 2280 cccttcccct atgattgaaa agtaaacaaa acccacattt cctatcctgg ttagaagaaa 2340 attaatgttc tgacagttgt gatcgcctgg agtactttta gacttttagc attcgttttt 2400 tacctgtttg tggatgtgtg tttgtatgtg catacgtatg agataggcac atgcatcttc 2460 tgtatggaca aaggtggggt acctacagga gagcaaaggt taattttgtg cttttagtaa 2520 aaacatttaa atacaaagtt ctttattggg tggaattata tttgatgcaa atatttgatc 2580 acttaaaact tttaaaactt ctaggtaatt tgccacgctt tttgactgct caccaatacc 2640 ctgtaaaaat acgtaattct tcctgtttgt gtaataagat attcatattt gtagttgcat 2700 taataatagt tatttcttag tccatcagat gttcccgtgt gcctctttta tgccaaattg 2760 attgtcatat ttcatgttgg gaccaagtag tttgcccatg gcaaacctaa atttatgacc 2820 tgctgaggcc tctcagaaaa ctgagcatac tagcaagaca gctcttcttg aaaaaaaaaa 2880
12
tatgtataca caaatatata cgtatatcta tatatacgta tgtatataca cacatgtata 2940 ttcttccttg attgtgtagc tgtccaaaat aataacatat atagagggag ctgtattcct 3000 ttatacaaat ctgatggctc ctgcagcact ttttccttct gaaaatattt acattttgct 3060 aacctagttt gttactttaa aaatcagttt tgatgaaagg agggaaaagc agatggactt 3120 gaaaaagatc caagctccta ttagaaaagg tatgaaaatc tttatagtaa aattttttat 3180 aaactaaagt tgtacctttt aatatgtagt aaactctcat ttatttgggg ttcgctcttg 3240 gatctcatcc atccattgtg ttctctttaa tgctgcctgc cttttgaggc attcactgcc 3300 ctagacaatg ccaccagaga tagtggggga aatgccagat gaaaccaact cttgctctca 3360 ctagttgtca gcttctctgg ataagtgacc acagaagcag gagtcctcct gcttgggcat 3420 cattgggcca gttccttctc tttaaatcag atttgtaatg gctcccaaat tccatcacat 3480 cacatttaaa ttgcagacag tgttttgcac atcatgtatc tgttttgtcc cataatatgc 3540 tttttactcc ctgatcccag tttctgctgt tgactcttcc attcagtttt atttattgtg 3600 tgttctcaca gtgacaccat ttgtcctttt ctgcaacaac ctttccagct acttttgcca 3660 aattctattt gtcttctcct tcaaaacatt ctcctttgca gttcctcttc atctgtgtag 3720 ctgctctttt gtctcttaac ttaccattcc tatagtactt tatgcatctc tgcttagttc 3780 tattagtttt ttggccttgc tcttctcctt gattttaaaa ttccttctat agctagagct 3840 tttctttctt tcattctctc ttcctgcagt gttttgcata catcagaagc taggtacata 3900
12
agttaaatga ttgagagttg gctgtattta gatttatcac tttttaatag ggtgagcttg 3960 agagttttct ttctttctgt tttttttttt tgtttttttt tttttttttt tttttttttt 4020 ttttgactaa tttcacatgc tctaaaaacc ttcaaaggtg attatttttc tcctggaaac 4080 tccaggtcca ttctgtttaa atccctaaga atgtcagaat taaaataaca gggctatccc 4140 gtaattggaa atatttcttt tttcaggatg ctatagtcaa tttagtaagt gaccaccaaa 4200 ttgttatttg cactaacaaa gctcaaaaca cgataagttt actcctccat ctcagtaata 4260 aaaattaagc tgtaatcaac cttctaggtt tctcttgtct taaaatgggt attcaaaaat 4320 ggggatctgt ggtgtatgta tggaaacaca tactccttaa tttacctgtt gttggaaact 4380 ggagaaatga ttgtcgggca accgtttatt ttttattgta ttttatttgg ttgagggatt 4440 tttttataaa cagttttact tgtgtcatat tttaaaatta ctaactgcca tcacctgctg 4500 gggtcctttg ttaggtcatt ttcagtgact aatagggata atccaggtaa ctttgaagag 4560 atgagcagtg agtgaccagg cagtttttct gcctttagct ttgacagttc ttaattaaga 4620 tcattgaaga ccagctttct cataaatttc tctttttgaa aaaaagaaag catttgtact 4680 aagctcctct gtaagacaac atcttaaatc ttaaaagtgt tgttatcatg actggtgaga 4740 gaagaaaaca ttttgttttt attaaatgga gcattattta caaaaagcca ttgttgagaa 4800 ttagatccca catcgtataa atatctatta accattctaa ataaagagaa ctccagtgtt 4860 gctatgtgca agatcctctc ttggagcttt tttgcatagc aattaaaggt gtgctatttg 4920
12
tcagtagcca tttttttgca gtgatttgaa gaccaaagtt gttttacagc tgtgttaccg 4980
ttaaaggttt ttttttttat atgtattaaa tcaatttatc actgtttaaa gctttgaata 5040
tctgcaatct ttgccaaggt acttttttat ttaaaaaaaa acataacttt gtaaatatta 5100
ccctgtaata ttatatatac ttaataaaac attttaagct attttgttgg gctatttcta 5160
ttgctgctac agcagaccac aagcacattt ctgaaaaatt taatttatta atgtattttt 5220
aagttgctta tattctaggt aacaatgtaa agaatgattt aaaatattaa ttatgaattt 5280
tttgagtata atacccaata agcttttaat tagagcagag ttttaattaa aagttttaaa 5340
tcagtc 5346
<210> 16
<211> 323
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly 1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
12
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
12
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys 290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met 305 310 315 320
1
Asn Asp Glu
<210> 17
<211> 293
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 17
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly 1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80
1 1 Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205
1 2 Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285
Met Lys Phe Val Glu
290
<210> 18
<211> 305
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
1
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly 1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
1 4 Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270
1
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn 290 295 300
Arg
305
<210> 19
<211> 312
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 19
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly 1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45
1
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175
1
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys 290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Glu
305 310
1
<211> 323
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 20
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly 1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
1
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220
14
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys 290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met 305 310 315 320
Asn Asp Glu
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 21
tgcagaagtc actaggagga at 22
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 22
tcagtcaact tcttctgggt tgtttcc 27
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 23
gtgccagact cactttctat cca 23
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 24
tgctgccaat atacggcttc tg 22
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 25
cagctctcat agccaactat ggtgcc 26
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
14 <213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 26
tcaagcagag cctggttatc tg 22
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 27
gtcgtcattc catgctttgt tac 23
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
tggaggcaca aaacactact gaagtatacg 30
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 29
ggacagtgga cttgtttaga gc 22
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 30
ggcttggtgg ctgattgttc t 21
<210> 31
14 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 31
agcacccaaa ctgatatgcc tgtatttg 28
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 32
tgggaactgg tgtttcaagt cta 23
<210> 33
<211> 158
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
14 <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 33
gcagacatga ttacttcaga gctttcaaag ctagatactg taccttgcat attccaacac 60
gcgatcgcat tttaagattt tccatcctag tggaaagata tgatttgatt catcctattt 120
actttgtata ttaaagtaca gtagaacctg ccactttt 158
<210> 34
<211> 160
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 34
ggatccattt taagtaatag aataggattt ttaattgttc cagtgtttct gtgatagagc 60
tgtcctgcac agacctgttt ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
atgcatggcc tccgcgccgg gttttggcgc ctcccgcggg 160
<210> 35
<211> 160
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
14
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 35
catgtctgga ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagt aactataacg 60
gtcctaaggt agcgactagc attagtatgg aaggtccgtc cactgtccag gttcctcttg 120
cggagctctt tgtctctctg gactctgtat acactgcttg 160
<210> 36
<211> 239
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 36
ggatccattt taagtaatag aataggattt ttaattgttc cagtgtttct gtgatagagc 60
tgtcctgcac agacctgttt ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
gctagtaact ataacggtcc taaggtagcg actagcatta gtatggaagg tccgtccact 180
gtccaggttc ctcttgcgga gctctttgtc tctctggact ctgtatacac tgcttgcat 239
14

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Ciljajući vektor nukleinske kiseline, koji sadrži
5’ homologni krak koji sadrži genomsku sekvencu uzvodno od egzona 2 mišjeg CD47 gena,
genomski fragment DNK koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena, selekcionu kasetu leka, i
3’ homologni krak koji sadrži genomsku sekvencu nizvodno od egzona 7 mišjeg CD47 gena,
pri čemu homologni krakovi 5’ i 3’ posreduju u integraciji genomskog fragmenta koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena u mišji CD47 lokus.
2. Ciljajući vektor nukleinske kiseline prema zahtevu 1, pri čemu genomski fragment koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena kodira polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiseline koja ima najmanje 98% identiteta sa sekvencom amino-kiselina kako je navedeno u aminokiselinama 16-292 od SEQ ID NO: 10.
3. Ciljajući vektor nukleinske kiseline prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je selekciona kaseta leka samobrišuća selekciona kaseta leka.
4. Glodar čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen,
pri čemu humanizovani CD47 gen kodira humanizovani CD47 polipeptid koji sadrži deo humanog CD47 polipeptida i unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara;
pri čemu deo humanog CD47 polipeptida sadrži vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, i kodiran je egzonima 2-7 humanog CD47 gena;
pri čemu je unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara kodiran egzonima nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara;
pri čemu je humanizovani CD47 gen operativno vezan za CD47 promotor glodara; i
pri čemu genom glodara dalje sadrži jedan ili više humanih ili humanizovanih gena izabranih iz SIRPα, IL-3, M-CSF, GM-CSF i TPO.
5. Glodar prema zahtevu 4, pri čemu se humanizovani CD47 gen formira od zamene genomskog fragmenta koji sadrži egzone 2-7 endogenog CD47 gena glodara na endogenom CD47 lokusu glodara, sa genomskim fragmentom koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena.
6. Glodar prema zahtevu 4 ili 5, pri čemu genomski fragment koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena kodira polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiseline koja ima najmanje 98% identiteta sa sekvencom amino-kiselina kako je navedeno u amino-kiselinama 16-292, SEQ ID NO: 10.
7. Glodar prema bilo kom od zahteva 4-6, pri čemu je glodar miš ili pacov.
8. Izolovana ćelija ili tkivo glodara prema bilo kom od zahteva 4-7, pri čemu izolovana ćelija ili tkivo obuhvata humanizovani CD47 gen i jedan ili više humanih ili humanizovanih gena u genomu.
9. Izolovana embrionalna matična ćelija (ES) glodara čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen,
pri čemu humanizovani CD47 gen kodira humanizovani CD47 polipeptid koji sadrži deo humanog CD47 polipeptida i unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara;
pri čemu deo humanog CD47 polipeptida obuhvata vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, i kodiran je egzonima 2-7 humanog CD47 gena;
pri čemu je unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara kodiran egzonima nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara;
pri čemu je humanizovani CD47 gen operativno vezan za CD47 promotor glodara; i
pri čemu genom ES ćelije glodara dalje sadrži jedan ili više humanih ili humanizovanih gena izabranih iz SIRPα, IL-3, M-CSF, GM-CSF i TPO.
10. ES ćelija glodara prema zahtevu 9, koja je mišja ES ćelija ili ES ćelija pacova.
11. Embrion glodara koji sadrži ES ćeliju glodara prema zahtevu 9 ili 10.
12. Postupak procene farmakokinetičkih svojstava leka koji cilja humani CD47, a postupak obuhvata:
(i) davanje kandidata za lek koji cilja humani CD47 glodaru čiji genom sadrži humanizovani CD47 gen,
pri čemu humanizovani CD47 gen kodira humanizovani CD47 polipeptid koji sadrži deo humanog CD47 polipeptida i unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara;
pri čemu deo humanog CD47 polipeptida sadrži vanćelijski domen i transmembranske domene humanog CD47 polipeptida, i kodiran je egzonima 2-7 humanog CD47 gena;
pri čemu je unutarćelijski deo CD47 polipeptida glodara kodiran egzonima nizvodno od egzona 7 CD47 gena glodara; i
pri čemu je humanizovani CD47 gen operativno vezan za CD47 promotor glodara; i
(ii) izvođenje jednog ili više testova za procenu farmakokinetičkih svojstava kandidata za lek.
13. Postupak prema zahtevu 12, pri čemu:
(a) genomski fragment koji sadrži egzone 2-7 humanog CD47 gena kodira polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiseline koja ima najmanje 98% identiteta sa sekvencom aminokiselina kako je navedeno u amino-kiselinama 16-292 SEQ ID NO: 10 ; i/ili
(b) genom glodara dalje sadrži jedan ili više humanih ili humanizovanih gena izabranih iz SIRPα, IL-3, M-CSF, GM-CSF i TPO.
14. Postupak prema zahtevu 12 ili 13, pri čemu je kandidat za lek antitelo usmereno na humani CD47.
15. Postupak prema zahtevu 12 ili 13, pri čemu je glodar pacov ili miš.
RS20231251A 2014-12-05 2015-11-25 Životinje koje nisu čovek a koje imaju humanizovani klaster diferencijacije 47 gena RS64989B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462087992P 2014-12-05 2014-12-05
EP20215046.2A EP3850946B1 (en) 2014-12-05 2015-11-25 Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64989B1 true RS64989B1 (sr) 2024-01-31

Family

ID=54979926

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210547A RS61774B1 (sr) 2014-12-05 2015-11-25 Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen klastera diferencijacije 47
RS20231251A RS64989B1 (sr) 2014-12-05 2015-11-25 Životinje koje nisu čovek a koje imaju humanizovani klaster diferencijacije 47 gena
RS20190370A RS58536B1 (sr) 2014-12-05 2015-11-25 Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen klastera diferencijacije 47

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210547A RS61774B1 (sr) 2014-12-05 2015-11-25 Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen klastera diferencijacije 47

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190370A RS58536B1 (sr) 2014-12-05 2015-11-25 Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen klastera diferencijacije 47

Country Status (29)

Country Link
US (5) US20160345549A1 (sr)
EP (4) EP3466255B1 (sr)
JP (2) JP6730277B2 (sr)
KR (3) KR102617691B1 (sr)
CN (2) CN107205368B (sr)
AR (1) AR102888A1 (sr)
AU (2) AU2015355328B2 (sr)
BR (1) BR112017010490A2 (sr)
CA (1) CA2967834C (sr)
CY (2) CY1121547T1 (sr)
DK (3) DK3086637T3 (sr)
ES (3) ES2870462T3 (sr)
FI (1) FI3850946T3 (sr)
HR (3) HRP20190634T1 (sr)
HU (3) HUE054661T2 (sr)
IL (2) IL286403B2 (sr)
LT (3) LT3086637T (sr)
MX (1) MX2017007293A (sr)
NZ (2) NZ731471A (sr)
PL (3) PL3850946T3 (sr)
PT (3) PT3466255T (sr)
RS (3) RS61774B1 (sr)
RU (1) RU2728412C2 (sr)
SG (2) SG10202103050YA (sr)
SI (3) SI3466255T1 (sr)
SM (3) SMT201900178T1 (sr)
TR (1) TR201903891T4 (sr)
TW (1) TWI681053B (sr)
WO (1) WO2016089692A1 (sr)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102617691B1 (ko) 2014-12-05 2023-12-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 분화 클러스터 47 유전자를 가진 비인간 동물
NZ731954A (en) 2014-12-09 2024-11-29 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 274 gene
WO2016154299A1 (en) * 2015-03-24 2016-09-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Genetic modification of pigs for xenotransplantation
RU2725737C2 (ru) 2015-05-29 2020-07-03 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Животные, отличные от человека, с нарушением в локусе c9orf72
AU2016358101B2 (en) 2015-11-20 2022-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized Lymphocyte-activation gene 3
CN108779159B (zh) 2016-02-04 2022-12-30 瑞泽恩制药公司 具有经改造的angptl8基因的非人动物
JP6980674B2 (ja) 2016-02-29 2021-12-15 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. ヒト化ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有する齧歯類
EP4056031A1 (en) * 2016-08-11 2022-09-14 The Jackson Laboratory Methods and compositions relating to improved human red blood cell survival in genetically modified immunodeficient non-human animals
WO2018041121A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric ctla-4
CN107815468B (zh) 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
WO2018041119A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric ox40
CN107815465B (zh) * 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CA3038548A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a hexanucleotide repeat expansion in a c9orf72 locus
CN108467873B (zh) 2017-03-17 2020-03-13 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 一种cd132基因缺失的免疫缺陷动物模型的制备方法及应用
WO2018177441A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Beijing Biocytogen Co., Ltd GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα
CN108588126B (zh) * 2017-03-31 2020-04-10 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
US20210161971A1 (en) * 2017-06-12 2021-06-03 Sinai Health System Allograft tolerance without the need for systemic immune suppression
JP7262440B2 (ja) 2017-08-02 2023-04-21 フェインズ セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｃｄ４７抗体及びその使用
IL274740B2 (en) * 2017-11-30 2024-06-01 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized trkb locus
JP7328243B2 (ja) * 2018-03-26 2023-08-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類
HRP20240999T1 (hr) 2018-07-16 2024-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavački modeli bolesti ditra i njihova upotreba
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
US11690362B2 (en) 2018-12-20 2023-07-04 Regeneran Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
CN114164177A (zh) * 2019-01-17 2022-03-11 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化转基因动物
CN112430621B (zh) * 2019-08-09 2022-09-27 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il2ra基因人源化的非人动物的构建方法及应用
WO2021043290A1 (en) * 2019-09-06 2021-03-11 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric tnfr2
WO2021136537A1 (en) * 2019-12-31 2021-07-08 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. GENETICALLY MODIFIED IMMUNODEFICIENT NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα/CD47
CN112080522A (zh) * 2020-09-15 2020-12-15 广东药康生物科技有限公司 一种cd47人源化小鼠模型的构建方法
CN112725379B (zh) * 2021-01-27 2024-08-13 上海南方模式生物科技股份有限公司 人源化cd40基因改造动物模型的构建方法及应用
WO2023046061A1 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric trop2
WO2024020057A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified animal model and its use to model the human immune system
WO2025171307A1 (en) 2024-02-08 2025-08-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US8101719B2 (en) * 2003-11-11 2012-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized anti-CD47 antibody
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
US20070113297A1 (en) * 2005-09-13 2007-05-17 Yongguang Yang Methods and compositions for inhibition of immune responses
SG174053A1 (en) * 2006-09-01 2011-09-29 Therapeutic Human Polyclonals Inc Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals
WO2009039244A2 (en) * 2007-09-18 2009-03-26 Genizon Biosciences Inc. Genemap of the human genes associated with crohn's disease
CN101668387A (zh) 2008-09-02 2010-03-10 鸿富锦精密工业（深圳）有限公司 印刷电路板
CN102281758B (zh) * 2009-01-16 2014-12-10 公益财团法人实验动物中央研究所 移植了人肝细胞的小鼠
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
WO2011020014A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Promoter-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette
US8758750B2 (en) * 2009-09-15 2014-06-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synergistic anti-CD47 therapy for hematologic cancers
CA3040377C (en) 2009-10-06 2025-12-30 Yale University Genetically modified mice and engraftment comprising the knock-in of a human thrombopoietin (tpo) gene
ES3040596T3 (en) 2011-02-15 2025-11-03 Regeneron Pharma Humanized m-csf mice and uses thereof
US20140242095A1 (en) * 2011-10-19 2014-08-28 University Health Network Antibodies and antibody fragments targeting sirp-alpha and their use in treating hematologic cancers
MY186903A (en) 2011-10-28 2021-08-26 Regeneron Pharma Humanized il-6 and il-6 receptor
RS56656B1 (sr) 2011-10-28 2018-03-30 Regeneron Pharma Miševi sa genetski modifikovanim glavnim kompleksom gena tkivne podudarnosti
RS56330B1 (sr) 2011-10-28 2017-12-29 Regeneron Pharma Genetski modifikovani miševi sa ekspresijom himernih molekula klase ii glavnog kompleksa histokompatibilnosti (mhc)
EP2644027A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-02 Institut Pasteur Transgenic immunodefficient mouse expressing human SIRPalpha.
US8962913B2 (en) 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
KR102287541B1 (ko) 2012-09-07 2021-08-10 예일 유니버시티 유전적으로 변형된 비-인간 동물 및 이것들의 사용 방법
EP4389764B1 (en) 2012-11-05 2026-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified rodents and methods of use thereof
HK1216647A1 (zh) * 2012-12-12 2016-11-25 Vasculox Inc. 治疗性cd47抗体
KR20240147707A (ko) 2013-02-20 2024-10-08 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 사람화된 ｔ-세포 보조-수용체를 발현하는 마우스
CN110192541B (zh) 2013-02-22 2022-02-18 瑞泽恩制药公司 表达人源化主要组织相容性复合物的小鼠
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
DK3175706T3 (en) 2013-09-23 2019-03-04 Regeneron Pharma Non-human animals with a humanized signal regulatory protein gene
SMT201900177T1 (it) 2013-10-15 2019-05-10 Regeneron Pharma Animali con il-15 umanizzata
SG10201811701YA (en) 2013-11-19 2019-01-30 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized a proliferation-inducing ligand gene
CN105792646B (zh) 2013-11-19 2018-03-02 瑞泽恩制药公司 具有人源化的b细胞活化因子基因的非人动物
ES2794942T3 (es) 2014-04-08 2020-11-19 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen receptores Fc-gamma humanizados
NO2785538T3 (sr) 2014-05-07 2018-08-04
KR20250096864A (ko) 2014-05-19 2025-06-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간 epo를 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물
HUE048677T2 (hu) 2014-06-19 2020-07-28 Regeneron Pharma Humanizált programozott sejthalál 1 génnel rendelkezõ nem-humán állatok
KR20240055876A (ko) 2014-11-24 2024-04-29 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 cd3 복합체를 발현하는 비인간 동물
KR102617691B1 (ko) 2014-12-05 2023-12-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 분화 클러스터 47 유전자를 가진 비인간 동물

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20190634T1 (hr) 2019-08-09
KR102313073B1 (ko) 2021-10-18
US10015953B2 (en) 2018-07-10
KR20210127773A (ko) 2021-10-22
DK3850946T3 (da) 2024-01-08
CN112342197A (zh) 2021-02-09
SI3086637T1 (sl) 2019-04-30
PL3086637T3 (pl) 2019-09-30
SG10202103050YA (en) 2021-05-28
LT3086637T (lt) 2019-04-10
DK3466255T3 (da) 2021-05-03
EP4296278A3 (en) 2024-03-27
RU2017123357A (ru) 2019-01-09
EP3466255B1 (en) 2021-02-17
NZ731471A (en) 2021-12-24
PL3466255T3 (pl) 2021-08-09
AR102888A1 (es) 2017-03-29
TWI681053B (zh) 2020-01-01
RU2017123357A3 (sr) 2019-06-03
CN107205368B (zh) 2020-11-17
KR102508175B1 (ko) 2023-03-09
ES2870462T3 (es) 2021-10-27
SMT202300482T1 (it) 2024-01-10
HUE064960T2 (hu) 2024-04-28
SI3850946T1 (sl) 2024-02-29
CY1124089T1 (el) 2022-05-27
IL286403A (en) 2021-10-31
SMT202100281T1 (it) 2021-07-12
JP6730277B2 (ja) 2020-07-29
HRP20210662T1 (hr) 2021-05-28
CY1121547T1 (el) 2020-05-29
US12389889B2 (en) 2025-08-19
DK3086637T3 (en) 2019-04-08
EP4296278A2 (en) 2023-12-27
RU2728412C2 (ru) 2020-07-29
ES2716735T3 (es) 2019-06-14
PT3466255T (pt) 2021-05-10
IL252019A0 (en) 2017-06-29
AU2015355328B2 (en) 2022-03-10
CN112342197B (zh) 2025-02-18
US20240138384A1 (en) 2024-05-02
FI3850946T3 (fi) 2023-12-28
KR102617691B1 (ko) 2023-12-27
MX2017007293A (es) 2018-03-12
TR201903891T4 (tr) 2019-04-22
HRP20231707T1 (hr) 2024-03-15
LT3850946T (lt) 2024-01-10
LT3466255T (lt) 2021-05-25
AU2022203787A1 (en) 2022-06-23
KR20170098800A (ko) 2017-08-30
IL286403B1 (en) 2023-06-01
WO2016089692A1 (en) 2016-06-09
HK1225912A1 (en) 2017-09-22
SG11201703463WA (en) 2017-05-30
KR20230038599A (ko) 2023-03-20
TW201629210A (zh) 2016-08-16
AU2015355328A1 (en) 2017-05-18
IL252019B (en) 2021-10-31
JP7089554B2 (ja) 2022-06-22
NZ769992A (en) 2024-11-29
EP3466255A1 (en) 2019-04-10
JP2018500012A (ja) 2018-01-11
IL286403B2 (en) 2023-10-01
US10939673B2 (en) 2021-03-09
SI3466255T1 (sl) 2021-07-30
AU2022203787B2 (en) 2025-01-30
ES2969389T3 (es) 2024-05-17
HUE054661T2 (hu) 2021-09-28
EP3086637A1 (en) 2016-11-02
CN107205368A (zh) 2017-09-26
US20160345549A1 (en) 2016-12-01
PL3850946T3 (pl) 2024-03-11
PT3086637T (pt) 2019-03-26
EP3850946A1 (en) 2021-07-21
DK3850946T5 (da) 2024-08-19
PT3850946T (pt) 2024-01-02
BR112017010490A2 (pt) 2018-04-03
US20160157470A1 (en) 2016-06-09
CA2967834C (en) 2024-01-16
CA2967834A1 (en) 2016-06-09
RS58536B1 (sr) 2019-04-30
HUE043132T2 (hu) 2019-07-29
RS61774B1 (sr) 2021-05-31
US11910788B2 (en) 2024-02-27
US20180249689A1 (en) 2018-09-06
EP3086637B1 (en) 2019-01-02
JP2020168016A (ja) 2020-10-15
EP3850946B1 (en) 2023-09-27
SMT201900178T1 (it) 2019-05-10
US20210161112A1 (en) 2021-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022203787B2 (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
RS64573B1 (sr) Ne-humana životinja sa humanizovanim signalno-regulatornim proteinskim genom
RU2827833C1 (ru) Животные, отличные от человека, имеющие гуманизированный ген кластера дифференцировки 47
HK40096160A (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK40054102B (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK40054102A (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK40007070A (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK40007070B (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
HK1225912B (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene