ES2870462T3 - Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado - Google Patents

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Abstract

Un roedor cuyo genoma comprende un gen de CD47 humanizado, en donde el gen de CD47 humanizado codifica un polipéptido CD47 humanizado que comprende una porción de un polipéptido CD47 humano, y una porción intracelular de un polipéptido CD47 de roedor; en donde la porción del polipéptido CD47 humano comprende el dominio extracelular y los dominios transmembrana del polipéptido CD47 humano, y está codificada por los exones 2-7 de un gen de CD47 humano; en donde la porción intracelular del polipéptido CD47 de roedor está codificada por los exones aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 de roedor; y en donde el gen de CD47 humanizado está unido operativamente a un promotor de CD47 de roedor.

Description

DESCRIPCIÓN
Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado
Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos núm. de serie 62/087,992, presentada el 5 de diciembre de 2014.
Listado de secuencias
Un listado de secuencias en el archivo de texto ASCII, llamado 32584_10108W001_SequenceListing.txt de 96,0 KB y creado el 23 de noviembre de 2015, se envió a la Oficina de Marcas y Patentes de los Estados Unidos a través de EFS-Web.
Antecedentes
La terapia contra el cáncer puede dividirse en cuatro categorías principales: quimioterapia/radioterapia, terapia hormonal, terapia dirigida e inmunoterapia. Un enfoque profundo de la investigación y desarrollo médicos se ha centrado en la terapia dirigida y se han realizado avances significativos, no obstante, el cáncer es aún un desafío importante para los pacientes y la industria de atención sanitaria en todo el mundo. Este desafío importante se debe, en parte, a la capacidad de las células cancerosas de evadir los mecanismos de control de los sistemas inmunitario innato y el adaptativo, lo que es, parcialmente, el resultado de la inhibición del aclaramiento fagocítico. Actualmente, no existe ningún sistema in vivo para determinar de manera óptima el potencial terapéutico de las nuevas terapias contra el cáncer diseñadas para activar el aclaramiento fagocítico de las células cancerosas y determinar los aspectos moleculares de cómo las células cancerosas proporcionan señales inhibidoras a los macrófagos y las células fagocíticas. Tal sistema proporciona una fuente para ensayos de fagocitosis y funciones de macrófagos in vivo, y la identificación de nuevas terapias contra el cáncer que tienen como objetivo proporcionar un entorno antitumoral mediante la promoción de señales profagocíticas al sistema inmunitario.
El documento W02007/033221 se refiere a métodos y composiciones para la inhibición de respuestas inmunitarias. El documento WO2013/063556 se refiere a un receptor de IL-6 e IL-6 humanizado.
Resumen
La presente descripción se basa en el reconocimiento de que es conveniente modificar genéticamente animales no humanos que permitan sistemas mejorados para la identificación y el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos contra el cáncer. La presente invención además se basa en el reconocimiento de que es conveniente modificar genéticamente animales no humanos para permitir un injerto mejorado de células madre hematopoyéticas humanas. Además, la presente invención también se basa en el reconocimiento de que los animales no humanos que tienen un gen de CD47 humanizado y/o que expresan, contienen o producen un polipéptido CD47 humano o humanizado son convenientes, por ejemplo, para su uso en la identificación y desarrollo de agentes terapéuticos contra el cáncer que superen la toxicidad sistémica asociada con el bloqueo de CD47 y superen la inhibición de la fagocitosis de células tumorales mediada por CD47, y proporcionen un sistema in vivo más eficaz para el injerto de células madre hematopoyéticas humanas que proporcione un aumento en la homeostasis de un número más amplio de tipos de células humanas.
La invención proporciona un roedor cuyo genoma comprende un gen de CD47 humanizado,
en donde el gen de CD47 humanizado codifica un polipéptido CD47 humanizado que comprende una porción de un polipéptido CD47 humano, y una porción intracelular de un polipéptido CD47 de roedor;
en donde la porción del polipéptido CD47 humano comprende el dominio extracelular y los dominios transmembrana del polipéptido CD47 humano, y está codificada por los exones 2-7 de un gen de CD47 humano;
en donde la porción intracelular del polipéptido CD47 de roedor está codificada por los exones aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 de roedor; y en donde el gen de CD47 humanizado está operativamente unido a un promotor de CD47 de roedor.
La invención proporciona además una célula o tejido aislados de roedor cuyo genoma comprende un gen de CD47 humanizada, en donde el gen de CD47 humanizado en donde el gen de CD47 humanizado codifica un polipéptido CD47 humanizado que comprende una porción de un polipéptido CD47 humano y una porción intracelular de un polipéptido CD47 de roedor
en donde la porción del polipéptido CD47 humano comprende el dominio extracelular y los dominios transmembrana del polipéptido CD47 humano, y está codificada por los exones 2-7 de un gen de CD47 humano;
en donde la porción intracelular del polipéptido CD47 de roedor está codificada por los exones aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 de roedor; y
en donde el gen de CD47 humanizado está unido operativamente a un promotor de CD47 de roedor.
La invención proporciona además un embrión de roedor generado a partir de una célula madre embrionaria de la invención.
La invención proporciona adicionalmente un método para proporcionar un roedor, el método que comprende modificar el genoma de un roedor para que comprenda un gen de CD47 humanizada,
en donde el gen de CD47 humanizado codifica un polipéptido CD47 humanizado que comprende una porción de un polipéptido CD47 humano, y una porción intracelular de un polipéptido CD47 de roedor;
en donde la porción del polipéptido CD47 humano comprende el dominio extracelular y los dominios transmembrana del polipéptido CD47 humano, y está codificada por los exones 2-7 de un gen de CD47 humano;
en donde la porción intracelular del polipéptido CD47 de roedor está codificada por los exones aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 de roedor; y
en donde el gen de CD47 humanizado está unido operativamente a un promotor de CD47 de roedor.
La invención proporciona además un método para evaluar el injerto de células humanas, en donde dicho método comprende evaluar el injerto de células humanas en un roedor de la invención, en donde opcionalmente las células humanas son células madre hematopoyéticas.
La invención proporciona además un método para evaluar la eficacia terapéutica de un fármaco dirigido a células humanas, el método que comprende: administrar un candidato a fármaco a un roedor de la invención en el que se han trasplantado una o más células humanas; y controlar las células humanas en el roedor para determinar la eficacia terapéutica del candidato a fármaco.
La invención proporciona además un método para evaluar si un candidato a modulador de una proteína CD47 humana induce la aglutinación de glóbulos rojos, dicho método que comprende incubar glóbulos rojos aislados de un roedor de la invención en presencia del candidato a modulador; y
evaluar si el candidato a modulador induce la aglutinación de los glóbulos rojos.
Se describe en la presente un animal no humano que tiene un genoma que comprende un gen de CD47 que incluye material genético de dos especies diferentes (por ejemplo, un ser humano y uno no humano). El gen de CD47 de animales no humanos como se describe en la presente codifica un polipéptido CD47 que contiene porciones humanas y no humanas, en donde las porciones humanas y no humanas se unen entre sí y forman un polipéptido CD47 funcional.
Se describe en la presente un animal no humano que puede comprender un gen de CD47 que comprende una porción endógena y una porción humana, en donde las porciones endógena y humana se unen operativamente a un promotor endógeno.
Una porción endógena puede comprender el exón 1 y los exones aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 endógeno. El exón 1 y los exones aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 endógeno pueden ser al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idénticos al exón 1 correspondiente y los exones aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 de ratón que aparece en la Tabla 3. El exón 1 y los exones aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 endógeno pueden ser idénticos al exón 1 correspondiente y los exones aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 de ratón que aparece en la Tabla 3.
En algunas modalidades, una porción humana codifica los aminoácidos 16-292 de un polipéptido CD47 humano. En algunas modalidades, una porción humana codifica los aminoácidos 19-292 de un polipéptido CD47 humano. En algunas modalidades, una porción humana codifica los aminoácidos 19-141 de un polipéptido CD47 humano. En algunas modalidades, una porción humana codifica los aminoácidos 19-127 de un polipéptido CD47 humano. En algunas modalidades, una porción humana comprende los exones 2-7 de un gen de CD47 humano.
Los exones 2-7 de un gen de CD47 humano pueden ser al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idénticos a los exones 2-7 correspondientes de un gen de CD47 humano que aparece en la Tabla 3. Los exones 2-7 de un gen de CD47 humano pueden ser idénticos a los exones 2-7 correspondientes de un gen de CD47 humano que aparece en la Tabla 3.
Un animal no humano descrito en la presente puede expresar un polipéptido CD47 que comprende una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano y una porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno. Un polipéptido CD47 puede comprender una porción transmembrana de un polipéptido CD47 humano. Un polipéptido CD47 puede comprender una porción transmembrana de un polipéptido CD47 no humano. Un polipéptido CD47 puede traducirse en una célula de un animal no humano con un péptido señal no humano. Un péptido señal no humano puede ser un péptido señal de roedor (por ejemplo, un ratón o una rata).
Un polipéptido CD47 descrito en la presente puede expresarse a partir de un gen de CD47 no humano endógeno.
Una porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno puede comprender una cola intracitoplasmática que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idéntica a una cola intracitoplasmática de un polipéptido CD47 de ratón que aparece en la Tabla 3. Una porción intracelular del polipéptido CD47 endógeno puede comprender una cola intracitoplasmática que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una cola intracitoplasmática de un polipéptido CD47 de ratón que aparece en la Tabla 3.
En algunas modalidades, una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano comprende aminoácidos correspondientes a los residuos 19-141 de un polipéptido CD47 humano. En algunas modalidades, una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano comprende aminoácidos correspondientes a los residuos 19-127 de un polipéptido CD47 humano. La porción extracelular de un polipéptido CD47 humano puede comprender una secuencia de aminoácidos que sea al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente de una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano que aparece en la Tabla 3. Una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano puede comprender una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente de una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano que aparece en la Tabla 3.
Se describe en la presente un polipéptido CD47 codificado por el gen de CD47 de un animal no humano como se describe en la presente. Un polipéptido CD47 codificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idéntico a la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. Un polipéptido CD47 codificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
Un gen de CD47 humanizada que comprende uno o más exones de un gen de CD47 no humano unido operativamente a uno o más exones de un gen de CD47 humano. Un gen de CD47 humanizada descrito en la presente puede comprender exones no humanos que codifican una porción intracelular de un polipéptido CD47 y exones humanos que codifican una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano. Un gen de CD47 humanizada puede comprender además exones humanos que codifican una porción transmembrana de un polipéptido CD47 humano. Un gen de CD47 humanizada descrito en la presente puede comprender exones no humanos que codifican un péptido señal, en su totalidad o en parte, y una porción intracelular de un polipéptido CD47, y exones humanos que codifican una porción extracelular y, opcionalmente, una porción transmembrana de un polipéptido CD47.
En la presente se describe además una célula o tejido aislados a partir de un animal no humano como se describe en la presente. La célula o tejido aislados comprenden un gen de CD47 como se describe en la presente. Una célula puede seleccionarse de una célula dendrítica, un linfocito (por ejemplo, una célula B o T), un macrófago y un monocito. Un tejido puede seleccionarse de tejido adiposo, vejiga, cerebro, mama, médula ósea, ojo, corazón, intestino, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, músculo, páncreas, plasma, suero, piel, bazo, estómago, timo, testículo, ovario, y sus combinaciones.
En la presente descripción se describe además una célula madre embrionaria no humana cuyo genoma comprende un gen de CD47 como se describe en la presente. Una célula madre embrionaria no humana puede ser una célula madre embrionaria de ratón y es de una cepa 129, una cepa C57BL/6 o una cepa BALB/c. Una célula madre embrionaria no humana es una célula madre embrionaria de ratón y es de una mezcla de las cepas 129 y C57BL/6.
En la presente descripción se describe además el uso de una célula madre embrionaria no humana como se describe en la presente para producir un animal no humano. Una célula madre embrionaria no humana puede ser una célula madre embrionaria de ratón y puede usarse para producir un ratón que comprende un gen de CD47 como se describe en la presente. Una célula madre embrionaria no humana puede ser una célula madre embrionaria de rata y puede usarse para producir una rata que comprende un gen de c D47 como se describe en la presente.
En la presente descripción se describe además un embrión no humano que comprende, se produce, se obtiene, o se genera a partir de una célula madre embrionaria no humana que comprende un gen de CD47 como se describe en la presente. Un embrión no humano puede ser un embrión de roedor. Un embrión de roedor puede ser un embrión de ratón. Un embrión de roedor puede ser un embrión de rata.
En la presente descripción se describe además un método para producir un animal no humano que expresa un polipéptido CD47 a partir de un gen de CD47 endógeno, en donde el polipéptido CD47 comprende una secuencia humana, el método comprende insertar un fragmento genómico en un gen de CD47 endógeno en un gen no humano célula madre embrionaria, dicho fragmento genómico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido CD47 humano en su totalidad o en parte; obtener una célula madre embrionaria no humana que comprende un gen de CD47 endógeno que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido CD47 humano en su totalidad o en parte; y crear un animal no humano mediante el uso de la célula madre embrionaria no humana que comprende dicha secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido CD47 humano en su totalidad o en parte.
En algunas modalidades, una secuencia humana comprende los aminoácidos 19-141, (o 19-292) de un polipéptido CD47 humano. En algunas modalidades, una secuencia humana comprende los aminoácidos correspondientes a los residuos 19-127 de un polipéptido CD47 humano.
Una secuencia de nucleótidos puede comprender los exones 2-7 de un gen de CD47 humano. Una secuencia de nucleótidos puede comprender uno o más marcadores de selección. Una secuencia de nucleótidos puede comprender uno o más sitios de recombinación sitio específica.
El método puede comprender además una etapa de insertar un fragmento genómico en un gen SIRPa endógeno de una célula madre embrionaria no humana, dicho fragmento genómico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido SIRPa humano en su totalidad o en parte (por ejemplo, codifica una porción extracelular de un polipéptido SIRPa humano). Un fragmento genómico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido SIRPa humano en su totalidad o en parte (por ejemplo, codifica una porción extracelular de un polipéptido SIRPa humano) se inserta en un gen SIRPa endógeno de la célula madre embrionaria no humana antes de una inserción en un gen de CD47 endógeno.
El método puede comprender además criar un animal no humano que comprende un gen de CD47 endógeno que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido c D47 humano, en su totalidad o en parte, con un segundo animal no humano, dicho segundo animal no humano que tiene un genoma que comprende un gen SIRPa que codifica un polipéptido SIRPa que comprende una porción extracelular de un polipéptido SIRPa humano (por ejemplo, aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362 de un polipéptido SIRPa humano) y una porción intracelular de un polipéptido SIRPa endógeno.
En la presente descripción se describe además un método para proporcionar un animal no humano cuyo genoma comprende un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano unido a una porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno, el método que comprene modificar el genoma de un animal no humano que comprenda de ese modo un gen de CD47 que codifica la porción extracelular de un polipéptido CD47 humano unido a la porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno, lo que proporciona así dicho animal no humano. Un gen de CD47 puede codificar un polipéptido CD47 que comprende una porción extracelular y una porción transmembrana de un polipéptido CD47 humano unido a una porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno no humano. Un gen de CD47 puede codificar un polipéptido CD47 que comprende una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano unido a una porción transmembrana y una porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno no humano.
La modificación del genoma de un animal no humano puede realizarse en una célula madre embrionaria no humana. La célula madre embrionaria no humana puede ser una célula madre embrionaria de roedor, una célula madre embrionaria de ratón; o una célula madre embrionaria de rata.
El método puede comprender además modificar el genoma del animal no humano para que comprenda un gen SIRPa que codifica la porción extracelular de un polipéptido SIRPa humano (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362 de un polipéptido SIRPa humano) unido a la porción intracelular de un polipéptido SIRPa endógeno. La modificación del genoma del animal no humano para que comprenda un gen SIRPa que codifica la porción extracelular de un polipéptido SIRPa humano (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362 de un polipéptido SIRPa humano) unido a la porción intracelular de un polipéptido SIRPa endógeno puede realizarse antes de modificar el genoma del animal no humano para que comprenda un gen de CD47 que codifica la porción extracelular y, opcionalmente, una porción transmembrana de un polipéptido CD47 humano unido a la porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno.
El método puede comprender además criar un animal no humano, cuyo genoma comprende un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano unido a una porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno, con un segundo animal no humano, dicho segundo animal no humano que tiene un genoma que comprende un gen SIRPa que codifica un polipéptido SIRPa que comprende una porción extracelular de un polipéptido SIRPa humano (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362 de un polipéptido SIRPa humano) y una porción intracelular de un polipéptido SIRPa endógeno.
En la presente descripción se describe además un animal no humano que puede obtenerse por los métodos según se describen en la presente descripción.
En la presente descripción se describe además un método para injertar células humanas en un animal no humano, el método que comprende las etapas de proporcionar un animal no humano cuyo genoma comprende un gen de CD47 que codifica la porción extracelular de un polipéptido CD47 humano, unido a la porción intracelular un polipéptido CD47 endógeno; y trasplantar una o más células humanas en dicho animal no humano. El método puede comprender además una etapa de ensayo del injerto de una o más células humanas en dicho animal no humano. Una etapa de ensayo puede comprender comparar el injerto de una o más células humanas con el injerto en uno o más animales no humanos de tipo silvestre, o en uno o más animales no humanos cuyo genoma no comprende un gen de CD47 que codifica la porción extracelular de un polipéptido CD47 humano unido a la porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno.
Las células humanas pueden ser células madre hematopoyéticas. Las células humanas pueden trasplantarse por vía intravenosa. Las células humanas pueden trasplantarse por vía intraperitoneal. Las células humanas pueden trasplantarse por vía subcutánea.
En la presente descripción se describe además un método para evaluar la eficacia terapéutica de un fármaco dirigido a células humanas, el método que comprende proporcionar un animal no humano cuyo genoma comprende un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano unido a una porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno; trasplantar una o más células humanas en dicho animal no humano; administrar un candidato a fármaco a dicho animal no humano; y controlar las células humanas en el animal no humano para determinar la eficacia terapéutica del candidato a fármaco.
Las células humanas pueden ser células cancerosas y el candidato a fármaco puede ser un candidato a fármaco contra el cáncer. Un candidato a fármaco puede ser un anticuerpo.
Un animal no humano puede comprender además células inmunitarias humanas. Un candidato a fármaco puede ser un anticuerpo biespecífico que se une al CD47 humano y un antígeno en células cancerosas humanas trasplantadas.
En la presente descripción se describe además un método que comprende proporcionar una o más células cuyo genoma incluye un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano unido a una porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno; incubar una o más células con un sustrato marcado; y medir la fagocitosis del sustrato marcado por una o más células. El sustrato puede marcarse con fluorescencia. El sustrato puede marcarse con un anticuerpo. El sustrato puede ser uno o más glóbulos rojos. El sustrato puede ser una o más células bacterianas. El sustrato puede ser una o más células tumorales.
En la presente descripción se describe además un método que comprende proporcionar un animal no humano cuyo genoma incluye un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano unido a una porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno; exponer al animal no humano a un antígeno; y medir la fagocitosis del antígeno por una o más células del animal no humano. La etapa de exposición puede comprender exponer al animal no humano a un antígeno que está marcado con fluorescencia. La etapa de exposición puede comprender exponer al animal no humano a una o más células que comprenden el antígeno. La etapa de exposición puede comprender exponer al animal no humano a una o más células humanas que comprenden el antígeno o a una o más células bacterianas que comprenden el antígeno. La etapa de exposición puede comprender exponer al animal no humano a una o más células que se han transformado con el antígeno de modo que el antígeno se exprese en la superficie de una o más células transformadas. La etapa de exposición puede comprender exponer al animal no humano a una o más células tumorales que comprenden el antígeno.
En la presente descripción se describen además métodos para la identificación o validación de un fármaco o vacuna, el método que comprende las etapas de suministrar un fármaco o vacuna a un animal no humano cuyo genoma incluye un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano unida a una porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno, y controlar una o más de las respuestas inmunitarias al fármaco o vacuna, el perfil de seguridad del fármaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afección. La monitorización del perfil de seguridad incluye determinar si el animal no humano exhibe un efecto secundario o una reacción adversa como resultado del suministro del fármaco o vacuna. Un efecto secundario o una reacción adversa pueden seleccionarse de morbilidad, mortalidad, alteración del peso corporal, alteración del nivel de una o más enzimas (por ejemplo, hepáticas), alteración en el peso de uno o más órganos, pérdida de función (por ejemplo, sensorial, motora, de órganos, etcétera), aumento de la susceptibilidad a una o más enfermedades, alteraciones al genoma del animal no humano, aumento o disminución del consumo de alimentos y complicaciones de una o más enfermedades.
En la presente descripción se describe además el uso de un animal no humano como se describe en la presente en el desarrollo de un fármaco o vacuna para su uso en medicina, tal como su uso como un medicamento.
En la presente se describe además el uso de un animal no humano como se describe en la presente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer o una neoplasia.
En la presente descripción se describe además el uso de un animal no humano como se describe en la presente para evaluar la eficacia de un fármaco terapéutico dirigido a células humanas. Un animal no humano descrito en la presente puede trasplantarse con células humanas, y un candidato a fármaco dirigido a dichas células humanas se puede administrar al animal. La eficacia terapéutica del fármaco puede determinarse mediante la monitorización de las células humanas en el animal no humano después de la administración del fármaco.
En la presente se describe además una célula o animal no humano como se describe en la presente para su uso en el desarrollo y/o identificación de un fármaco (por ejemplo, un anticuerpo) para terapia o diagnóstico.
En la presente se describe además una célula o animal no humano como se describe en la presente, para su uso en el desarrollo y/o identificación de un fármaco (por ejemplo, un anticuerpo) para el tratamiento, prevención o mejora del cáncer o una neoplasia.
En la presente se describe además un método para evaluar la farmacocinética de un fármaco dirigido a CD47 humano, el método que comprende las etapas de administrar el fármaco a un animal no humano como se describe en la presente, y realizar un ensayo para determinar una o más propiedades farmacocinéticas del fármaco dirigido a CD47 humano.
En la presente se describe además un método para evaluar la toxicidad en el objetivo de un fármaco dirigido a CD47 humano, el método comprende las etapas de administrar el fármaco a un animal no humano como se describe en la presente, y realizar un ensayo para uno o más parámetros asociados con toxicidad en el objetivo de un fármaco.
En la presente se describe además un método para evaluar la toxicidad por unión fuera de la diana de un fármaco dirigido a CD47 humano, el método comprende las etapas de administrar el fármaco a un animal no humano como se describe en la presente, y realizar un ensayo para uno o más parámetros asociados con la toxicidad de un fármaco fuera del objetivo.
Un animal no humano como se describe en la presente puede ser un roedor cuyo genoma incluye un gen de CD47 que codifica una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano unido a una porción intracelular de un polipéptido CD47 endógeno; un roedor puede ser un ratón; un roedor puede ser una rata.
Un fármaco dirigido a CD47 humano puede ser un antagonista de CD47. Un antagonista de CD47 puede ser un anticuerpo anti-CD47. Un fármaco dirigido a CD47 humano puede ser un agonista de CD47.
Un gen de CD47 descrito en la presente puede incluir un gen de CD47 como se describe en la presente. Un polipéptido CD47 descrito en la presente puede incluir un polipéptido CD47 como se describe en la presente.
Un animal no humano descrito en la presente no expresa de manera detectable un polipéptido CD47 no humano endógeno de longitud completa. Un animal no humano descrito en la presente no expresa de manera detectable una porción extracelular de un polipéptido CD47 endógeno. Un animal no humano descrito en la presente puede no expresar de forma detectable una porción extracelular tanto de un polipéptido CD47 endógeno como de un polipéptido SIRPa endógeno.
En diversas modalidades, una porción extracelular de un polipéptido CD47 humano comprende aminoácidos correspondientes a los residuos 19-141 de un polipéptido CD47 humano como se describe en la presente.
Un dominio V N-terminal de la inmunoglobulina de un polipéptido CD47 humano puede comprender aminoácidos correspondientes a los residuos 19-127 de un polipéptido c D47 humano como se describe en la presente.
Los animales, células, tejidos, células madre embrionarias y/o embriones no humanos descritos en la presente, pueden tener un genoma que además comprenda un gen SIRPa que codifica un polipéptido SIRPa que comprende una porción extracelular de un polipéptido SIRPa humano (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362 de un polipéptido SIRPa humano) y una porción intracelular de un polipéptido SIRPa endógeno.
Un animal no humano descrito en la presente puede ser un roedor; un ratón; o una rata.
Como se usa en esta solicitud, los términos “alrededor de” y “aproximadamente” se usan como equivalentes. Cualquier número usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente pretende abarcar cualquiera de las fluctuaciones normales apreciadas por un experto en la técnica en cuestión.
Otras características, objetos y ventajas descritas en la presente son evidentes en la descripción detallada que sigue. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, si bien indica determinadas modalidades descritas en la presente, se proporciona solamente a modo de ilustración, no de limitación. Diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.
Breve descripción de las figuras
El expediente de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado en color. La Oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujo(s) a color, previa solicitud y pago de la tasa necesaria.
Los Dibujos incluidos en la presente descripción, que se componen de las siguientes Figuras, son solamente con propósitos de ilustración y no de limitación.
La Figura 1 muestra un diagrama, que no está a escala, de la organización genómica de los genes no humanos del grupo de diferenciación 47 (CD47) (por ejemplo, de ratón) y de humano. Los exones se numeran debajo de cada exón.
La Figura 2 muestra un diagrama, que no está a escala, de un método ilustrativo para la humanización de un gen no humano del grupo de diferenciación 47 (CD47).
La Figura 3 muestra un diagrama, que no está a escala, de la organización genómica de los genes de ratón y de humano del grupo de diferenciación 47 (CD47). Se indican las ubicaciones de las sondas usadas en un ensayo descrito en el Ejemplo 1.
La Figura 4 muestra un histograma ilustrativo de la expresión de CD47 en glóbulos rojos de ratones CD47 humanizados detectados por anticuerpos anti-CD47. Ab A, Ab B, Ab C, Ab D y Ab E: anticuerpos anti-CD47; hIgG4s: IgG4 humana de especificidad irrelevante con región Fc modificada que tiene una función efectora reducida; hIgG4: anticuerpo IgG4 humano de especificidad irrelevante.
La Figura 5 muestra una hemaglutinación ilustrativa de glóbulos rojos de ratón de ratón a partir del CD47 de tipo silvestre (n=2) y humanizado (n=2) mediante anticuerpos anti-CD47. WT: tipo silvestre; HuCD47: CD47 humanizado; Ab A, Ab B, Ab C, Ab D y Ab E: anticuerpos anti-CD47; hIgG4s: IgG4 humana de especificidad irrelevante con región Fc modificada que tiene una función efectora reducida; hIgG4: anticuerpo IgG4 humano de especificidad irrelevante.
La Figura 6 muestra perfiles farmacocinéticos ilustrativos de anticuerpos anti-CD47 en ratones CD47 humanizados representados como concentración de anticuerpos (en pg/mL, eje y) a lo largo del tiempo (en días, eje x); Ab F, Ab G, Ab H y Ab I anticuerpos anti-CD47; hIgG4s: anticuerpo IgG4 humano de especificidad irrelevante con región Fc modificada que tiene una función efectora reducida.
La Figura 7 muestra perfiles farmacocinéticos ilustrativos de anticuerpos anti-CD47 en ratones CD47/SIRPa humanizados (CD47hu/hu SIRPahu/hu) representados como concentración de anticuerpos (en mcg/mL, eje y) a lo largo del tiempo (en días, eje x). Ab J, Ab F, Ab GandAb I: anticuerpos anti-CD47; hIgG4s: anticuerpo IgG4 humano de especificidad irrelevante con región Fc modificada que tiene una función efectora reducida.
La Figura 8 muestra perfiles farmacocinéticos ilustrativos de anticuerpos anti-CD47 en ratones CD47/SIRPa humanizados (CD47hu/hu SIRPahu/hu) representados como concentración de anticuerpos (en mcg/mL, eje y) a lo largo del tiempo (en días, eje x). Ab J, Ab F: anticuerpos anti-CD47; Ab Fs: Ab F con región Fc modificada que tiene una función efectora reducida; Ab Fmono: versión monovalente de Ab F; hIgG4s: anticuerpo IgG4 humano de especificidad irrelevante con región Fc modificada que tiene una función efectora reducida.
La Figura 9 muestra perfiles farmacocinéticos ilustrativos de anticuerpos anti-CD47 en ratones de tipo silvestre representados como concentración de anticuerpo (en mcg/ml, eje y) a lo largo del tiempo (en días, eje x). Se excluyeron los ratones que demostraron una respuesta de anticuerpos de ratón antihumanos (MAHA). Ab J, Ab F, Ab I y Ab G: anticuerpos anti-CD47; hIgG4s: anticuerpo IgG4 humano de especificidad irrelevante con región Fc modificada que tiene una función efectora reducida (estrella: todos los puntos después de 15 días se excluyeron del grupo de tratamiento con hIgG4s debido a MAHA); Ab J F(ab')2: F(ab')2 fragmento de Ab J.
DEFINICIONES
Esta invención no se limita a los métodos y condiciones experimentales particulares descritos en la presente, ya que tales métodos y condiciones pueden variar. Además, debe entenderse que la terminología que se usa en la presente descripción es solamente para el propósito de describir modalidades particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos y frases usados en la presente descripción incluyen los significados que se atribuyen a los términos y frases en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o resulte claramente evidente por el contexto en el cual se usa el término o frase. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, a continuación se describirán métodos y materiales particulares.
El término “aproximadamente”, como se aplica en la presente descripción a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. El término “aproximadamente’’ o “alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que caen dentro de 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia indicado a menos que se indique de cualquier otra manera o resulte evidente de cualquier otra manera a partir del contexto (excepto cuando tal número exceda el 100 % de un valor posible).
El término “biológicamente activo", como se usa en la presente descripción, se refiere a una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, in vitro o in vivo (por ejemplo, en un organismo). Por ejemplo, un agente que, cuando está presente en un organismo, tiene un efecto biológico dentro de ese organismo, se considera biológicamente activo. En casos particulares, cuando una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se refiere típicamente como una porción “biológicamente activa”.
El término “comparable”, como se usa en la presente descripción, se refiere a dos o más agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etcétera, que pueden no ser idénticos entre sí pero que son suficientemente similares para permitir la comparación entre ellos, de manera que puedan extraerse conclusiones razonablemente en base a las diferencias o las similitudes observadas. Los expertos en la técnica comprenderán, en contexto, el grado de identidad necesario en cualquier circunstancia determinada para dos o más de tales agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etcétera, para considerarse comparables.
El término "conservadora", como se usa en la presente descripción para describir una sustitución conservativa de aminoácidos, se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservadora de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de un receptor de unirse a un ligando. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen: cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; cadenas laterales hidroxialifáticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina, y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina, e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. Una sustitución conservadora de aminoácidos puede ser una sustitución de cualquier residuo nativo en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, la mutagénesis por barrido de alanina. Puede producise una sustitución conservadora que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 descrita en Gonnet y otros (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. La sustitución puede ser una sustitución moderadamente conservadora en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
El término “control”, como se usa en la presente descripción, incluye el significado que se entiende en la técnica de un “control” que es un estándar contra el cual se comparan los resultados. Típicamente, los controles se usan para aumentar la integridad en los experimentos mediante el aislamiento de variables para llegar a una conclusión sobre tales variables. Un control puede ser una reacción o un ensayo que se realiza de manera simultánea con una reacción o un ensayo de prueba para proporcionar un comparador. Como se usa en la presente descripción, un “control’ puede referirse a un “animal de control’. Un “animal de control’ puede tener una modificación como se describe en la presente, una modificación que es diferente a como se describe en la presente, o puede no tener modificaciones (es decir, un animal de tipo silvestre). En un experimento, se aplica la"prueba" (es decir, la variable que se analiza). En el segundo experimento, el"control," no se aplica la variable que se analiza. Un control es un control histórico (es decir, de una prueba o un ensayo realizados anteriormente, o una cantidad o resultado que se conoce previamente). Un control puede ser o comprende un registro impreso o guardado de cualquier otra manera. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.
El término"interrupción" como se usa en la presente descripción, puede referirse al resultado de un evento de recombinación homóloga con una molécula de ADN (por ejemplo, con una secuencia homóloga endógena tal como un gen o locus génico. Una interrupción puede lograr o representar una inserción, una deleción, una sustitución, un reemplazo, una mutación con pérdida de sentido, o un desplazamiento del marco de una(s) secuencia(s) de ADN, o cualquier combinación de estas. Las inserciones pueden incluir la inserción de genes completos o fragmentos de genes, por ejemplo, exones, que pueden ser de un origen distinto al de la secuencia endógena (por ejemplo, una secuencia heteróloga). Una interrupción puede aumentar la expresión y/o actividad de un gen o producto génico (por ejemplo, de una proteína codificada por un gen). Una interrupción puede disminuir la expresión y/o actividad de un gen o producto génico. Una interrupción puede alterar la secuencia de un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). Una interrupción puede truncar o fragmentar un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). Una interrupción puede extender un gen o un producto génico codificado; en algunos de tales casos, una interrupción puede lograr el ensamblaje de una proteína de fusión. Una interrupción puede afectar el nivel pero no la actividad de un gen o producto génico.
Una interrupción puede afectar la actividad pero no el nivel de un gen o producto génico. Una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel de un gen o producto génico. Una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre la actividad de un gen o producto génico. Una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel o la actividad de un gen o producto génico.
Los términos “determinar’, “medir’, “evaluar’, ‘‘valorar’, “ensayar’ y “analizar’ se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a cualquier forma de medición e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones cuantitativas y/o cualitativas. El ensayo puede ser relativo o absoluto. “Ensayar para determinar la presencia de" puede ser determinar la cantidad de algo presente y/o determinar si está presente o ausente.
La frase "locus endógeno" o "gen endógeno", como se usa en la presente descripción, se refiere a un locus genético que se encuentra en un organismo parental o de referencia antes de la introducción de una interrupción, deleción, reemplazo, alteración o modificación como se describe en la presente. El locus endógeno puede tener una secuencia que se encuentra en la naturaleza. El locus endógeno puede ser un locus de tipo silvestre. El organismo de referencia puede ser un organismo de tipo silvestre. El organismo de referencia puede ser un organismo modificado genéticamente. El organismo de referencia es un organismo criado en un laboratorio (ya sea de tipo silvestre o modificado genéticamente).
La frase "promotor endógeno" se refiere a un promotor que se asocia naturalmente, por ejemplo, en un organismo de tipo silvestre, con un gen endógeno.
El término "heterólogo", como se usa en la presente descripción, se refiere a un agente o entidad de una fuente diferente. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a un polipéptido, gen, o producto génico o presente en una célula u organismo particular, el término aclara que el polipéptido, gen, o producto génico relevante: 1 ) se modificó genéticamente por la acción del hombre; 2 ) se introdujo en la célula u organismo (o un precursor de este) por la acción del hombre (por ejemplo, por medio de ingeniería genética); y/o 3) no se produce o no está presente naturalmente en la célula u organismo relevante (por ejemplo, el tipo de célula o el tipo de organismo relevante).
El término "célula huésped', como se usa en la presente descripción, se refiere auna célula en la cual se ha introducido un ácido nucleico o una proteína heterólogos (por ejemplo, exógenos). Después de leer esta descripción los expertos entenderán que tales términos no se refieren solamente a la célula particular en cuestión, sino que se usan, además, para referirse a la progenie de tal una célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones posteriores ya sea debido a una mutación o a influencias del ambiente, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero aun así se incluye dentro del alcance del término “célula huésped ' como se usa en la presente descripción. Una célula huésped puede ser o comprende, una célula procariota o eucariota. En general, una célula huésped es cualquier célula que sea adecuada para recibir y/o producir un ácido nucleico o una proteína heterólogos, independientemente del reino de la vida al que pertenece la célula. Las células ilustrativas incluyen las de organismos procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etcétera), células de micobacterias, células fúngicas, células de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etcétera), células vegetales, células de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insectos infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etcétera), células de animales no humanos, células humanas, o fusiones de células tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. La célula es una célula humana, de mono, simio, hámster, rata o ratón. La célula puede ser eucariota y puede seleccionarse de las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de retina, Vero, CV1, renal (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. La célula puede comprender uno o más genes virales, por ejemplo, una célula de la retina que expresa un gen viral (por ejemplo, una célula PER.C6™). Una célula huésped puede ser o comprender una célula aislada. Una célula huésped puede ser parte de un tejido, una célula huésped es parte de un organismo.
El término "humanizado", se usa en la presente descripción de acuerdo con su significado entendido en la técnica para referirse a ácidos nucleicos o proteínas cuyas estructuras (es decir, secuencias de nucleótidos o aminoácidos) incluyen porciones que corresponden sustancialmente o idénticamente a estructuras de un gen o proteína particular que se encuentran en la naturaleza en un animal no humano, e incluyen, además, porciones que se diferencian de la encontrada en el gen o proteína no humanos particulares en cuestión y en lugar de eso corresponden de manera más cercana a estructuras comparables que se encuentran en un gen o proteína humanos correspondientes. Un gen “humanizado” es uno que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la de un polipéptido humano (por ejemplo, una proteína humana o porción de esta - por ejemplo, una porción característica de esta). Para proporcionar un ejemplo, en el caso de un receptor de membrana, un gen “humanizado” puede codificar un polipéptido que tiene una porción extracelular que tiene una secuencia de aminoácidos igual a la de una porción extracelular humana y la secuencia restante es igual a la de un polipéptido no humano (por ejemplo, de ratón). Un gen humanizado puede comprender al menos una porción de una secuencia de ADN de un gen humano. Un gen humanizado puede comprender una secuencia de ADN completa de un gen humano. Una proteína humanizada puede comprender una secuencia que tiene una porción que aparece en una proteína humana. Una proteína humanizada puede comprender una secuencia completa de una proteína humana y se expresa a partir de un locus endógeno de un animal no humano que corresponde al homólogo o al ortólogo del gen humano.
El término "identidad', como se usa en la presente descripción en relación con una comparación de secuencias, se refiere a la identidad determinada mediante una serie de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos. Las identidades como se describen en la presente descripción, se determinan mediante el uso de un alineamiento ClustalW v. 1.83 (lento) que emplea una penalización por apertura de interrupción de 10 ,0, una penalización por extensión de interrupción de 0,1 , y el uso de una matriz de similitud de Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).
El término "aislado", como se usa en la presente descripción, se refiere a una sustancia y/o entidad que (1) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2 ) se ha diseñado, producido, preparado y/o fabricado por acción del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente de 10 %, aproximadamente de 20 %, aproximadamente de 30 %, aproximadamente de 40 %, aproximadamente de 50 %, aproximadamente de 60 %, aproximadamente de 70 %, aproximadamente de 80 %, aproximadamente de 90 %, aproximadamente de 91 %, aproximadamente de 92 %, aproximadamente de 93 %, aproximadamente de 94 %, aproximadamente de 95 %, aproximadamente de 96 %, aproximadamente de 97 %, aproximadamente de 98 %, aproximadamente de 99 % o más de aproximadamente de 99 % de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. Los agentes aislados son aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o más de aproximadamente 99 % puros. Como se usa en la presente descripción, una sustancia es “pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Como entenderán los expertos en la técnica, una sustancia aún puede considerarse “aislada" o incluso “pura”, después de combinarse con otros componentes determinados tales como, por ejemplo, uno o más portadores o excipientes (por ejemplo, tampón, disolvente, agua, etcétera); en tales casos, el porcentaje de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir tales portadores o excipientes. Para proporcionar un ejemplo, un polímero biológico tal como un polipéptido o un polinucleótido que se produce en la naturaleza se considera “aislado" cuando: a) en virtud de su origen o fuente de obtención no se asocia con algunos o todos los componentes que lo acompañan en su estado nativo en la naturaleza; b) está sustancialmente libre de otros polipéptidos o ácidos nucleicos de la misma especie que la especie que lo produce en la naturaleza; o c) se expresa por, o se encuentra de cualquier otra manera en asociación con componentes de una célula u otro sistema de expresión que no es de la especie que lo produce en la naturaleza. Por lo tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente del que lo produce en la naturaleza se considera un polipéptido "aislado". Alternativamente o adicionalmente, un polipéptido que se ha sometido a una o más técnicas de purificación puede considerarse un polipéptido “aislado" en la medida que se ha separado de otros componentes: a) con los que se asocia en la naturaleza; y/o b) con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente.
La frase “animal no humano", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier organismo vertebrado que no es un ser humano. Un animal no humano es un ciclóstomo, un pez óseo, un pez cartilaginoso (por ejemplo, un tiburón o una raya), un anfibio, un reptil, un mamífero, o un ave.
Un mamífero no humano es un primate, una cabra, una oveja, un cerdo, un perro, una vaca o un roedor. Un animal no humano es un roedor tal como una rata o un ratón.
La frase "ácido nucleico", como se usa en la presente descripción, en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que es una cadena oligonucleotídica o que puede incorporarse a esta. Un “ácido nucleico" puede ser un compuesto y/o sustancia que es, o que puede incorporarse en una cadena oligonucleotídica por medio de un enlace fosfodiéster. Como estará claro a partir del contexto, “ácido nucleico” puede referirse a residuos de ácidos nucleicos individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos); “ácido nucleico” puede referirse a una cadena oligonucleotídica que comprende residuos de ácidos nucleicos individuales. Un "ácido nucleico" puede ser o comprender ARN; un "ácido nucleico" puede ser o comprender ADN. Un “ácido nucleico" puede ser, comprender, o consistir en uno o más residuos de ácidos nucleicos naturales. Un “ácido nucleico” puede ser, comprender, o consistir en uno o más análogos de ácidos nucleicos. Un análogo de ácido nucleico se diferencia de un “ácido nucleico" en que no utiliza una cadena principal con enlaces fosfodiéster. Por ejemplo, un “ácido nucleico” puede ser, comprender, o consistir en uno o más “ácidos nucleicos peptídicos”, que se conocen en la técnica y tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la cadena principal. Alternativamente o adicionalmente, un “ácido nucleico" tiene uno o más enlaces fosforotioato y/o 5'-N-fosforamidita en lugar de enlaces fosfodiéster. Un “ácido nucleico” puede ser, comprender, o consistir en uno o más nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina). Un “ácido nucleico” puede ser, comprender, o consistir en uno o más análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilcitidina, C-5 propiniluridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, c5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, 0(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas y combinaciones de estos). Un “ácido nucleico" puede comprender uno o más azúcares modificados (por ejemplo, 2 '-fluororribosa, ribosa, 2 '-desoxirribosa, arabinosa, y hexosa) en comparación con los que se encuentran en los ácidos nucleicos naturales. Un “ácido nucleico’’ puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico funcional tal como un ARN o una proteína. Un"ácido nucleico" puede incluir uno o más intrones. Un “ácido nucleico” puede prepararse mediante uno o más de aislamiento a partir de una fuente natural, síntesis enzimática por polimerización basada en un molde complementario (in vivo o in vitro), reproducción en una célula o sistema recombinante, y síntesis química. Un “ácido nucleico" puede ser de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o más residuos de largo. Un "ácido nucleico" puede ser monocatenario; o un "ácido nucleico’’ puede ser bicatenario. Un “ácido nucleico’’ puede tener una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un elemento que codifica, o es el complemento de una secuencia que codifica, un polipéptido. Un "ácido nucleico" puede tener actividad enzimática.
La frase "unidos operativamente", como se usa en la presente descripción, se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante está ligada de manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "unidas operativamente" incluyen tanto las secuencias de control de la expresión contiguas al gen de interés como las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de la expresión", como se usa en la presente descripción, se refiere a secuencias de polinucleótidos, que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de las secuencias codificantes a las que se ligan. Las “secuencias de control de la expresión’’ incluyen: secuencias adecuadas de iniciación, de terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción; señales eficientes de procesamiento del ARN tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que aumentan la eficiencia de la traducción (es decir, la secuencia consenso Kozak); secuencias que aumentan la estabilidad de las proteínas; y cuando sea conveniente, secuencias que aumentan la secreción de proteínas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere según el organismo huésped. Por ejemplo, en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión al ribosoma, y secuencias de terminación de la transcripción, mientras que en eucariotas, típicamente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción. El término “secuencias de control” está destinado a incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir, además, componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes y secuencias de parejas de fusión.
El término "polipéptido", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Un polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos que se encuentra en la naturaleza. Un polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene porciones que se encuentran en la naturaleza separadas entre sí (es decir, a partir de dos o más organismos diferentes, por ejemplo, porciones humanas y no humanas). Un polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos que está modificada genéticamente en el hecho de que se diseña y/o produce mediante la acción del hombre.
El término "recombinante", como se usa en la presente descripción, se propone para referirse a polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos CD47 como se describen en la presente descripción) que se diseñan, se modifican genéticamente, se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como polipéptidos que se expresan con el uso de un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, polipéptidos aislados a partir de una biblioteca combinatoria, de polipéptidos humanos recombinantes (Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., y Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., and Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulinas humanas (ver por ejemplo, Taylor, L. D., y otros (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., y Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. y otros (2000) Immunology Today 21:364-370; Murphy, A.J.,y otros (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111(14):5153-5158) o polipéptidos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por cualquier otro medio que involucre el corte y empalme entre elementos de secuencia seleccionados. Uno o más de tales elementos de secuencias seleccionados pueden encontrarse en la naturaleza. Uno o más de tales elementos de secuencias seleccionados pueden diseñarse in silico. Uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados Pueden resultar de la mutagénesis (por ejemplo, in vivo o in vitro) de un elemento de secuencia conocido, por ejemplo, a partir de una fuente natural o sintética. Por ejemplo, un polipéptido recombinante puede estar compuesto de secuencias que se encuentran en el genoma de un organismo fuente de interés (por ejemplo, ser humano, ratón, etcétera). Un polipéptido recombinante puede tener una secuencia de aminoácidos que resultó de la mutagénesis (por ejemplo, in vitro o in vivo, por ejemplo, en un animal no humano), de manera que las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos recombinantes son secuencias que, si bien se originan de secuencias de polipéptidos y se relacionan con estas, pueden no existir naturalmente dentro del genoma de un animal no humano in vivo.
El término "reemplazo" se usa en la presente descripción para referirse a un proceso a través del cual una secuencia de ácido nucleico “reemplazada” (por ejemplo, un gen) que se encuentra en un locus huésped (por ejemplo, en un genoma) se elimina de ese locus, y un ácido nucleico “reemplazado" diferente, se sitúa en su lugar. La secuencia de ácido nucleico reemplazada y las secuencias de ácidos nucleicos de reemplazo son comparables entre sí porque, por ejemplo, son homólogas entre sí y/o contienen elementos correspondientes (por ejemplo, elementos que codifican proteínas, elementos reguladores, etcétera). Una secuencia de ácido nucleico reemplazada puede incluir uno o más de un promotor, un potenciador, un sitio donante de corte y empalme, un sitio receptor de corte y empalme, un intrón, un exón, una región no traducida (UTR); una secuencia de ácido nucleico de reemplazo puede incluir una o más secuencias codificantes. Una secuencia de ácido nucleico de reemplazo puede ser un homólogo de la secuencia de ácido nucleico reemplazada. Una secuencia de ácido nucleico de reemplazo puede ser un ortólogo de la secuencia reemplazada. Una secuencia de ácido nucleico de reemplazo puede ser o comprender, una secuencia de ácido nucleico humana. En algunos casos, que incluyen cuando la secuencia de ácido nucleico de reemplazo es, o comprende, una secuencia de ácido nucleico humana, la secuencia de ácido nucleico reemplazada puede ser o comprender, una secuencia de roedor (por ejemplo, una secuencia de ratón o de rata). La secuencia de ácido nucleico así colocada puede incluir una o más secuencias reguladoras que son parte de la secuencia de ácido nucleico fuente usada para obtener la secuencia así colocada (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones 5' o 3' no traducidas, etcétera). Por ejemplo, en varias modalidades, el reemplazo es una sustitución de una secuencia endógena con una secuencia heteróloga que resulta en la producción de un producto génico a partir de la secuencia de ácido nucleico así colocada (que comprende la secuencia heteróloga), pero no la expresión de la secuencia endógena; el reemplazo es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene una función similar a la de una proteína codificada por la secuencia endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica una proteína CD47, y el fragmento de ADN codifica una o más proteínas CD47 humanas). Un gen endógeno o un fragmento de este se reemplaza con un gen humano correspondiente o un fragmento de este. Un gen humano correspondiente o un fragmento de este es un gen humano o un fragmento que es un ortólogo de, o es sustancialmente similar o igual en estructura y/o función, al gen endógeno o fragmento de este que se reemplaza.
La frase "grupo de diferenciación de la proteína 47" o "proteína CD47", como se usa en la presente descripción, se refiere a una proteína transmembrana de múltiples pases que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas y tiene un dominio V extracelular amino terminal de inmunoglobulina, cinco dominios transmembrana y una cola corta intracelular carboxilo terminal. El CD47 se expresa en la superficie celular y está implicado en interacciones entre proteínas de la superficie de la membrana tal como, por ejemplo, integrinas, SIRPa y trombospondina-1 (TSP-1). El CD47 se expresa en tejidos normales y se regula positivamente en muchos cánceres humanos. Se ha demostrado que CD47 está implicado en varios procesos celulares tales como, por ejemplo, apoptosis, proliferación, adhesión y migración. Se han identificado alternativamente varias isoformas de CD47 de corte y empalme entre el ratón y el hombre. A modo de ilustración, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los genes CD47 de ratón y humano se proporcionan en la Table 3. Después de la lectura de esta descripción los expertos reconocerán que uno o más genes CD47 endógenos en un genoma (o todos) pueden reemplazarse con uno o más genes CD47 heterólogos (por ejemplo, variantes polimórficas, subtipos o mutantes, genes de otras especies, formas humanizadas, etcétera).
Una "célula que expresa CD47', como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa una proteína transmembrana CD47. Una célula que expresa CD47 puede expresar una proteína transmembrana CD47 en su superficie. Una proteína CD47 puede expresarse en la superficie de la célula en una cantidad suficiente para mediar las interacciones célula con célula a través de la proteína transmembrana CD47 expresada en la superficie de la célula. Las células ilustrativas que expresan CD47 incluyen neuronas, células inmunitarias, queratinocitos y células circulantes. Las células que expresan CD47 regulan la interacción de las células inmunitarias y las células circulantes para regular diversos procesos celulares tales como la adhesión, la proliferación celular y/o apoptosis, la angiogénesis y la inflamación. Los animales no humanos descritos en la presente invención pueden demostrar la regulación de diversos procesos celulares (como se describe en la presente) por medio de proteínas CD47 humanizadas expresadas en la superficie de una o más células del animal no humano.
El término “referencia’’ se usa en la presente descripción para describir un estándar o agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de control contra el cual se compara un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. Un agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia puede probarse y/o se determinarse sustancialmente de manera simultánea con la prueba o determinación del agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. Un agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia puede ser una referencia histórica, materializada opcionalmente en un medio tangible. Una referencia puede referirse a un control. Como se usa en la presente descripción, una “referencia’’ puede referirse a un “animal de referencia’’. Un “animal de referencia’’ puede tener una modificación como se describe en la presente, una modificación que es diferente a como se describe en la presente o puede no tener modificaciones (es decir, un animal de tipo silvestre). Típicamente, como entenderán los expertos en la técnica, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se determina o caracteriza en condiciones comparables a las utilizadas para determinar o caracterizar el agente, animal (por ejemplo, un mamífero), cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés.
El término “sustancialmente", como se usa en la presente descripción, se refiera a la condición cualitativa de exhibir una medida o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos raramente, o nunca, llegan a completarse y/o se completan o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término “sustancialmente" se usa en la presente descripción para capturar la carencia potencial de totalidad inherente en muchos fenómenos biológicos y químicos.
La frase “homología sustancia r , como se usa en la presente descripción, se refiere a una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la técnica, generalmente dos secuencias se consideran “sustancialmente homologas" si contienen residuos homólogos en posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos con características estructurales y/o funcionales adecuadamente similares. Por ejemplo, como bien conocen los expertos en la técnica, determinados aminoácidos se clasifican, típicamente, como aminoácidos “hidrofóbicos" o “hidrofílicos", y/o porque tienen cadenas laterales “polares" o “no polares". La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo puede considerarse frecuentemente una sustitución “homologa”. Las clasificaciones de aminoácidos típicas se resumen en la Tabla 1 y 2.
TABLA 1
Alanina Ala A No polar Neutro 1,8
Arginina Arg R Polar Positivo -4,5
Asparagina Asn N Polar Neutro -3,5
Ácido aspártico Asp D Polar Negativo -3,5
Cisteína Cys C No polar Neutro 2,5
Ácido glutámico Glu E Polar Negativo -3,5
Glutamina Gln Q Polar Neutro -3,5
Glicina Gly G No polar Neutro -0,4
Histidina His H Polar Positivo -3,2
Isoleucina Ile I No polar Neutro 4,5
Leucina Leu L No polar Neutro 3,8
Lisina Lys K Polar Positivo -3,9
Metionina Met M No polar Neutro 1,9
Fenilalanina Phe F No polar Neutro 2,8
Prolina Pro P No polar Neutro - 1,6
Serina Ser S Polar Neutro -0,8
Treonina Thr T Polar Neutro -0,7
Triptófano Trp W No polar Neutro -0,9
Tirosina Tyr Y Polar Neutro -1,3
Valina Val V No polar Neutro 4,2
Figure imgf000014_0001
Aminoácidos ambiguos De 3 De 1
Letras Letra
Asparagina o ácido aspártico Asx B
(Continuación)
Glutamina o ácido glutámico Glx Z
Leucina o Isoleucina XI e J
Aminoácido no especificado o Xaa X
desconocido
Como se conoce bien en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos pueden compararse con el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST con huecos y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ilustrativos se describen en Altschul y otros (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul y otros. (1997) Methods in Enzymology; Altschul y otros,"Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis y otros (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; y Misener y otros (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Además de identificar las secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. Dos secuencias pueden considerarse que son sustancialmente homólogas si al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son homólogos en un tramo relevante de residuos. El tramo relevante puede ser una secuencia completa. El tramo relavante es de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o más residuos. El tramo relevante puede incluir residuos contiguos a lo largo de una secuencia completa. El tramo relevante puede incluir residuos discontinuos a lo largo de una secuencia completa. El tramo relevante puede ser de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más residuos.
La frase “identidad sustancial’, como se usa en la presente descripción, se refiere a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la técnica, generalmente dos secuencias se consideran “sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos en posiciones correspondientes. Como se conoce bien en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse con el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para las secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST con huecos, y PSI-BLAST para las secuencias de aminoácidos. Tales programas ilustrativos se describen en Altschul y otros (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul y otros, Methods in Enzymology; Altschul y otros (1997) Nucleic Acids Res.
25:3389-3402;
Baxevanis y otros (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; y Misener y otros, (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. Dos secuencias pueden considerarse sustancialmente idénticas si al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son idénticos en un segmento relevante de residuos. El tramo relevante puede ser una secuencia completa. El tramo relevante puede ser de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más residuos.
La frase "vector de transformación" o "constructo de transformación’’, como se usa en la presente descripción, se refiere a una molécula de polinucleótido que comprende una región de orientación. Una región de transformación comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia en una célula, tejido o animal diana y proporciona la integración del constructo de transformación en una posición dentro del genoma de la célula, tejido o animal por medio de la recombinación homóloga. Se incluyen, además, las regiones de transformación que se dirigen hacia el objetivo con el uso de sitios de reconocimiento de recombinasas sitio específicas (por ejemplo, sitios loxP o Frt). Un constructo de transformación descrito en la presente comprende, además, una secuencia de ácido nucleico o gen de interés particular, un marcador de selección, secuencias de control o reguladoras, y otras secuencias de ácidos nucleicos que permiten la recombinación mediada por la adición exógena de proteínas que ayudan o facilitan la recombinación que involucra tales secuencias. Un constructo de transformación descrito en la presente comprende, además, un gen de interés en su totalidad o en parte, en donde el gen de interés es un gen heterólogo que codifica una proteína, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de una proteína codificada por una secuencia endógena. Un constructo de transformación descrito en la presente comprende, además, un gen humanizado de interés, en su totalidad o en parte, en donde el gen humanizado de interés codifica una proteína, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de una proteína codificada por la secuencia endógena.
El término “variante", como se usa en la presente descripción, se refiere a una entidad que muestra una identidad estructural significativa con una entidad de referencia, pero se diferencia estructuralmente de la entidad de referencia en la presencia o nivel de una o más porciones químicas en comparación con la entidad de referencia. Una “variante” puede diferir, además, funcionalmente de su entidad de referencia. En general, el hecho de que una entidad particular se considere adecuadamente como una “variante” de una entidad de referencia se basa en su grado de identidad estructural con la entidad de referencia. Como apreciarán los expertos en la técnica, cualquier entidad de referencia biológica o química tiene determinados elementos estructurales característicos. Una “variante", por definición, es una entidad química definida que comparte uno o más de tales elementos estructurales característicos. Para proporcionar algunos ejemplos, una molécula pequeña puede tener un elemento estructural central característico (por ejemplo, un macrociclo central) y/o una o más porciones colgantes características de manera que una variante de la molécula pequeña es una que comparte el elemento estructural central y las porciones colgantes características pero se diferencia en otras porciones colgantes y/o en los tipos de enlaces presentes (simples vs. dobles, E vs. Z, etcétera) dentro del núcleo central, un polipéptido puede tener un elemento de secuencia característico que comprende una pluralidad de aminoácidos que tienen posiciones designadas relacionadas entre sí en el espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen a una función biológica particular, un ácido nucleico puede tener un elemento de secuencia característico que comprende una pluralidad de residuos de nucleótidos que tienen posiciones designadas con respecto a otras en el espacio lineal o tridimensional. Por ejemplo, una “variante de polipéptido’’ puede diferenciarse de un polipéptido de referencia como resultado de una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos y/o una o más diferencias en las porciones químicas (por ejemplo, carbohidratos, lípidos, etcétera) unidas covalentemente a la cadena principal del polipéptido. En algunos aspectos, una “variante de polipéptido’’ muestra una identidad de secuencia general con un polipéptido de referencia que es al menos de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, o 99 %. Alternativamente o adicionalmente, una “variante de polipéptido’’ no comparte al menos un elemento de secuencia característico con un polipéptido de referencia. El polipéptido de referencia puede tener una o más actividades biológicas. Una “variante de polipéptido’’ puede compartir una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. Una “variante de polipéptido" puede carecer de una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. Una “variante de polipéptido’’ puede mostrar un nivel reducido de una o más actividades biológicas en comparación con el polipéptido de referencia. Un polipéptido de interés puede considerarse una “variante” de un polipéptido original o de referencia si el polipéptido de interés tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la del original excepto por un pequeño número de alteraciones de la secuencia en posiciones particulares. Típicamente, menos de 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % de los residuos en la variante están sustituidos en comparación con la parental. Una “variante” tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuo sustituido en comparación con un original. Frecuentemente, una “variante” tiene un número muy pequeño (por ejemplo, menos de 5, 4, 3, 2 o 1) de residuos funcionales sustituidos (es decir, residuos que participan en una actividad biológica particular). Además, típicamente, una “variante” no tiene más de 5, 4, 3, 2, o 1 adiciones o deleciones, y frecuentemente no tiene adiciones o deleciones, en comparación con el original. Además, cualquiera de las adiciones o deleciones son típicamente menores que aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 19, aproximadamente 18, aproximadamente 17, aproximadamente 16, aproximadamente 15, aproximadamente 14, aproximadamente 13, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, y comúnmente son menores que aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3 o aproximadamente 2 residuos. El polipéptido parental o de referencia es uno que se encuentra en la naturaleza. Como entenderán los expertos en la técnica, una pluralidad de variantes de un polipéptido de interés particular puede encontrarse comúnmente en la naturaleza, particularmente cuando el polipéptido de interés es un polipéptido agente infeccioso.
El término “vector”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se asocia. Los vectores pueden ser capaces de replicarse de manera extracromosómica y/o expresar los ácidos nucleicos a los que se encuentran unidos en una célula huésped tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se refieren en la presente descripción como “vectores de expresión.”
El término “de tipo silvestre", como se usa en la presente descripción, tiene su significado entendido en la técnica que se refiere a una entidad que tiene una estructura y/o actividad como la que se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto “normal" (a diferencia de mutante, enfermo, alterado, etcétera). Los expertos en la técnica apreciarán que los genes y polipéptidos de tipo silvestre existen frecuentemente en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).
Descripción detallada de determinadas modalidades
en la presente descripción se describen, entre otras cosas, animales no humanos mejorados y/o modificados genéticamente que tienen material genético humanizado que codifica un complejo de diferenciación del gen 47 (CD47) para determinar la eficacia terapéutica de los antagonistas de CD47 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD47) para el tratamiento del cáncer. y ensayos de injerto de trasplantes, activación y fagocitosis y transducción de señales. Se contempla que tales animales no humanos proporcionen una mejora en la determinación de la eficacia terapéutica de antagonistas de CD47 y su potencial para el bloqueo de CD47. Se contempla además que tales animales no humanos proporcionen una mejora en el injerto de trasplante de células humanas. Por lo tanto, la presente descripción es particularmente útil para el desarrollo de terapias anti-CD47 para el tratamiento de diversos cánceres, así como también, para el mantenimiento de células hematopoyéticas humanas en animales no humanos. Particularmente, la presente descripción abarca la humanización de un gen de CD47 de murino que resulta en la expresión de una proteína CD47 humanizada en la superficie de células del animal no humano. Tales proteínas CD47 humanizadas tienen la capacidad de proporcionar una fuente de células humanas CD47+ para determinar la eficacia de terapias anti-CD47 para activar la fagocitosis de células tumorales. Además, tales proteínas CD47 humanizadas tienen la capacidad de reconocer células humanas injertadas mediante el acoplamiento de otras proteínas de la superficie celular y ligandos presentes en la superficie de las células humanas injertadas (por ejemplo, SIRPa). Los animales no humanos descritos en la presente pueden ser capaces de activar la fagocitosis mediante el bloqueo de la señalización de CD47 a través de la proteína CD47 humanizada expresada en la superficie de las células del animal no humano. Los animales no humanos descritos en la presente pueden ser capaces de recibir células hematopoyéticas humanas trasplantadas; tales mamíferos no humanos pueden desarrollar y/o tener un sistema inmunitario que comprende células humanas. Las proteínas CD47 humanizadas pueden tener una secuencia correspondiente al dominio V N-terminal de la inmunoglobulina de una proteína CD47 humana. Las proteínas CD47 humanizadas pueden tener una secuencia correspondiente a una porción N-terminal de una proteína CD47 humana que comprende una porción extracelular y una porción transmembrana de una proteína CD47 humana, en donde la porción extracelular incluye el dominio V N-terminal de la inmunoglobulina de la proteína CD47 humana y la porción transmembrana incluye los cinco dominios transmembrana de la proteína CD47 humana. Las proteínas CD47 humanizadas pueden tener una secuencia correspondiente a la cola intracitoplasmática de una proteína CD47 no humana (por ejemplo, de murino). Las proteínas CD47 humanizadas pueden tener una secuencia correspondiente a los residuos de aminoácidos 19­ 292 (o 19-141, o 19-127) de una proteína CD47 humana. Los animales no humanos descritos en la presente pueden comprender un gen de CD47 endógeno que contiene material genético del animal no humano y una especie heteróloga (por ejemplo, un ser humano). Los animales no humanos descritos en la presente pueden comprender un gen de CD47 humanizada, en donde el gen de CD47 humanizada comprende exones de un gen de CD47 humano que codifica una porción extracelular que incluye dominio V N-terminal de la inmunoglobulina de un gen de CD47 humano. El gen de CD47 humanizada puede comprender exones de CD47 humano, por ejemplo, los exones 2-7, que codifican una porción N-terminal de una proteína CD47 humana que comprende una porción extracelular y una porción transmembrana de una proteína CD47 humana, en donde la porción extracelular incluye el dominio V N-terminal de la inmunoglobulina de la proteína CD47 humana y la porción transmembrana incluye los cinco dominios transmembrana de la proteína CD47 humana. El gen de CD47 humanizado puede comprender exones de CD47 no humanos que codifican el péptido señal, en su totalidad o en parte, y la cola intracitoplasmática de una proteína CD47 no humana. El gen de CD47 humanizado puede comprender el exón 1 de CD47 no humano y el (los) exón (es) cadena abajo del exón 7 que codifican la cola intracitoplasmática y la UTR3'. En dependencia de las isoformas, puede haber uno o más exones cadena abajo del exón 7, con el codón de parada y la u TR3' que está presente en el último exón para todas las isoformas. Por ejemplo, la isoforma 2 de CD47 de ratón y humano que se muestra en la Tabla 3 tiene dos exones cadena abajo del exón 7, designados como exón 8 y 9.
Diversos aspectos de la invención se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no significa que limite la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de “o” significa “y/o” a menos que se indique de cualquier otra manera.
Gen del grupo de diferenciación 47 (CD47)
CD47, originalmente llamada proteína asociada a integrina (IAP) por su función en la transducción de señales de integrinas en células inmunitarias, es una proteína transmembrana que incluye un dominio V N-terminal de la inmunoglobulina (IgV), cinco dominios transmembrana y una cola intracitoplasmática C-terminal corta. La cola intracitoplasmática difiere en longitud de acuerdo con cuatro isoformas de corte y empalme alternativamente que se han identificado. Inicialmente se describió que CD47 (o IAP) se expresaba en todos los tejidos (isoforma 2), neuronas (isoforma 4) y queratinocitos y macrófagos (isoforma 1; ver Reinhold y otros (1995) J. Cell Sci. 108: 3419-3425). Se sabe poco sobre la isoforma 3 a pesar de que esta forma tiene la segunda cola intracitoplasmática más larga entre las cuatro isoformas. Adicionalmente a las integrinas, se sabe que CD47 interactúa con varias otras proteínas de la superficie celular como, por ejemplo, trombospondina y miembros de la familia SIRP. Más notablemente, CD47 interactúa con SIRPa y conduce a una señalización bidireccional que regula una variedad de respuestas de célula con célula tal como, por ejemplo, la inhibición de la fagocitosis y la activación de células T. De hecho, la interacción CD47-SIRPa se ha convertido en un centro de atención en los últimos años por su función de proporcionar a las células tumorales la capacidad de evadir la vigilancia inmunitaria. La unión de CD47 a SIRPa normalmente proporciona protección a través de señales antifagocíticas ("no me comas") para las células normales. Sin embargo, se ha descubierto que los tumores expresan además señales antifagocíticas, que incluyen CD47, para evadir la destrucción por fagocitosis. Curiosamente, se sabe que CD47 se regula positivamente en varios cánceres hematológicos y contribuye tanto al crecimiento como a la diseminación de los tumores (Chao y otros (2012) Curr Opin Immunol.24(2/.
225-232).
Se desconocen los efectos completos de orientarse a CD47 y la vía CD47-SIRPa como un nuevo tratamiento para el cáncer y se han explorado algunas posibles toxicidades. Se necesita una comprensión más rigurosa y detallada de las funciones mediadas por CD47 y de la ruta de CD47-SIRPa para desarrollar terapias mejor orientadas para el tratamiento futuro del cáncer.
Secuencias CD47
En la Tabla 3 se exponen ejemplos de secuencias ilustrativas de CD47 para ratón y ser humano. Para las secuencias de ARNm, la letra en negrita indica la secuencia codificante y los exones consecutivos, cuando se indican, se encuentran separados por texto alternante subrayado. Para las secuencias de proteínas humanas y de ratón, los péptidos señal están subrayados, las secuencias extracelulares están en negrita y las secuencias intracitoplasmáticas están en cursiva. Para las secuencias de proteínas humanizadas, las secuencias no humanas se indican en fuente regular, las secuencias humanas se indican en negrita y los péptidos señal están subrayados. Como se muestra, las isoformas difieren en el número de exones. Por ejemplo, las isoformas 1-4 del gen de CD47 humano tienen un total de 8, 9, 10 y 11 exones, respectivamente, con los exones 2-7 de cada isoforma que codifican el dominio extracelular y los cinco dominios transmembrana.
TABLA 3
ARNm de CD47 de ratón isoforma 1 (XM_006521810.1)
GCCTACACCGGGAGAGCAGGGAGGAGGAGTTGGACTGAGGTTGGGCGGCTC
CG AGGTCC AGGGCG AGCTTGGCC AG AGGGAGTAG AG AGC AGCGGGGCTGC
GC AGGG ACGCGTGCCGTG AGTTCCGGTGAGCGTGTGTGTCCC ATGCTCCCGT
CTTTC AGGCCGGCCCAGGACACGAAGCCGGAAGAGAGCTGGCTGGAGGGAC
GGGGGCCGTGAGCAGAGAGTGC AACCCGCGC AGC( CCGGGGAC AGGCTGA
TTCTT GGC GCTCTCCGCCGG AGCCTGCCC AGGGCTGGGTGTGAGGCTGGCGT
C ACGTC A ACG AGC AGAGGCGGCC AGGCGGGGCGG AGTGCGCGTGCGCGGG
GCGGCGAGC ACGCGCGC'GCGCGC ACCCCCGGGC AGCCIGGGC GGCCGCTCC
TGCCTGTCACTGCTGCGGCGCTGCTGGTCGGTCGTTTCTCTTGAAGGCAGCA
GCGGAGGCGGCGGCTGCTCC AGACACCTGCGGCGGCGACCCCCCGGCGGCG
CGGAGATGTGGCOCTTGGCGGC (.<.< GCTGTIGC I GCG CTCCTG CTG CT
GCGGTTCAGCTCAACTACTGTITAGTAACGTCAACTC'CATAGAG ITCA C t t c a t g c a a t g a a a c t c t g c t c a t c c c t t g c a t c g t c c g t a a t c t g c a g ( .( GCAAAGC ACC GAAGA \ M í . I ITG 1 GA AG I GGAAGTTGAACAAA ICC» TATATTTTCATCTATGATGCAAATAAAAATAGCACTACTACAí ; m í \ \ \ ACTTTACC A C I ( .( \AAAATCTCAGTCTCAGACTTAATCAATGGCATTGí CTCTTTGAAAATGGAT.XAGCGCGATGCCATGGTGGGAAACTACACTTGC GAAGTGACAGAGTTATC í \G KG W í . í . í KA \ \( AGTTATAGAGCTGAAA AACCGCACGGCCTTCAACACTGACCAAGCrATCAGOCTGTTCTTACGAGG AGGAGAAAGGAGGTTGCAAATTAGTTTCGTGGTTTTCTCCAAATGAAAA GATCCTCATTGTTATTTTCCCAATTTTGGCTATACTCCTGTTCTGGGGAA AGTTTGGTATTTTAAC ACTCA AATATAAATCC AGCCATACG AATAAG AG AA r e ATI CTGC TGC I C C n c c C GGGC IG G IG C TC ACAG1CATCCTGG n GTTGGAGCCATCCTTCTCATCCCAGG AGAAAAGCCCGTGAAGAATGCTT CTGGACTTGCiC C TCATTGIAATC TCT ACGGGG ATATTAATACTACTTCA í . I \CA A TGTGTTTATGACA GCTnTGGAA TGACCTCTTTCA CCA Tl GCC ATATTGATCACTCAAGTGCTGGGCTACGTCCTTGCTTTGGTCGGGCTGT GTCTCTGCATCATGGCATGTGAGCCAGTGCACGGCCCCCTTTTGATTTC AGGTTTGGGGATCA I AGCTCTAGCAGAACTAC1TOGAI I AGITTATATG AAGTTTGTCGAATAGGTí. A ACiC ¡GA AGTC JACCX < AC 1X71 AM T T ( iGAAGTCA GAAATGGAAGAATACAGTTGTCTAAGCACCAGGTCTTCACGACTCACAGCT GG A AGGAACAG ACA ACAGTA ACTG ACTTCC ATCC AGGAAAAC ATGTCAC AT AAATGATT ACTAAGTTTAT ATTCAAAGCAGCTGTACTTT ACAT AATAAAAAA AA1ATGATGTGCTGTGTAACCAATTGGAATCCCATI rTTCTAl ig i ITCTACI C AACT AGGGGC AAACGTTTC AGGGGCA ACTTCC AAG A ATGATGC'ÍTGTT AG A TXX I AG \GI( l( IGA \< Al I ( , AGTTTAAATTC i \ I IX ( < i ACIX» U i \< ! ( ( , ( ( AAGC ACT A ACCTG AGGGTT AGTT ACCC AGAGAT ACCT AT GAAA A AC AGTGG T ATCC AGC A AGCCTTAGT AAACTC AGGTTGCCAGC AGCTTTGCC ACTTCCGC TGCTAGCTGAATAACAAGACTGCCACTTCTGGGTCA rAGTGA t a g a g a c t g AAGTAGAAAAACGAATGTGGTTGGGCAAATCCCGTGTGGCCCCTCTGTGTG CTATGATATTGATGGCACTGGTGTCTTC ATTCTTGGGGGTTGCCATCATTCAC AC AC ACCCCTTTGAC AT AC AGTGC ACCCC \GTTTTG AATAC A T m T T T T G C A CCCTGTCCCGTTCTGCTACTTTGATTTGCGTTATGATATATATAT ATATATAT AATACCTTTTCTCCTCTTTAAACATGGTCCTGTGACACAATAGTCAGTTGCA GAAAGGAGCCAGACriAT 1C GC AA AGC ACTGTGCTC A A AC TC TT C AG A A A A AA AGGAAAAA AA A A A AAAGCTATAGTTGT AAC AT ATGTATTCC AGACCTCT GGTTTAAAGGCA.AA AG AAAAA AAATCT AC AGTGTTTCTTCTC ATGTTTTC TG ATCGG AGGC ATG AC.AAAGCAAG ACTG AAATCTG.AACTGTG TCTCCTGC A IG GCAACACGTGTCTCCGTCAGGCCCTCGCAAGGCCCGGCiGAGGGGGTTCTAC GCCTCTTGTCTCi 1 J G I 1GCATGC rGAACACTCATCGOCTTCCl A< rGTATCX IGCCTCCTGCAGCCTCCCTCTTCCTCCTCCTCTTCCTCTTCCTCCTCTTCCTCC
rC'CTCCTCCTCTTCCTCCAAGTT I GAAAGGTC AA ACAAAACI ACCAC'A I’TCC CTACCCAGTTAGAAGAAAACCACCGTCCTGACAGTTGTGATCGCATGGAGT ACTTTTAGATTATTAGCACCTGTmTACCTCGTTTGTGGGCGTGTTTGTATG TGC AC A TGT ATG A AGTCGGCAC ATGC ACCTTCTGT ATGGGC AG AGGCGTGC.
CATCTACAGAAGAGi AGA7GCCAAC1ITGTGCTTTTAGTGAA1ACA1! AAAA AA AA AAAACCA ACGGTCC TTA ITGAG1GGAA rrCTA T T IGATGC A AA I A r iT GAGCTCTTTAAGACTTTAAAACTAGAT AATGTGCCA AGCTTTTAGGACTGCT C ACC AGTGCCCTCTGAAGAAAC ACC AGTACTTTTTCCTGTTTGTGTAATAAA GGCATATTTGTATTTGTGTTTGCATCACTA ATGGTTATTTCTTCTT AGTCCAC TGAATG riTCCATGTGCCTCTCG TATGCCA AAC n T IT G T C A T C r r r C ATGTG GGGACCAAATGG m GTCTGTGGC AAACCTAA ACCTA1GACCTGCTGAGGCC TCTC AGAA AACTGACCAC AGT ACCA AGAT AGT ACTTCGC A A AGA A A AGT AG GTTCCCTCCCTGGTTTTGT AGCTGTCGCC AAT ATT AGCGT AATTCC AAGGAG CTGAACGCCTTTATATAAATCTGATGGCACCTGATGCTTTTAGTTCTGAAAA T ATTTAC ACTCGG AT C ATGTT GTTGATGACTTAA AC A A AGTTTTGATG A AGA GAGC AAAAAAA A \(.( \ GG TGG A TTTGG A A C AGTTT C AGGGTTTTTTTT GTTT TTT GTTTTTTGTTTTT GTTTTTTTTTTTTT ATTTTT GTTTTTCTGTTCTCTGTT AG AAAAGTCAGGTGTTCTCTGTCAGGCTATCTTTATAGTCAATTTTTTTTACGAA CTAAAGTAGTACCTTTTAATATGTAGTCAACGCCCCTCTGCTCGGGGTTCAG TTTTGGGTCTTAACCAGCTGTCATGTTCTCTATGCTGCCTGCCACTTGAGGCA CTGAGTGCCCTAGAC AGTCCC ATCGGI GGTAGCCAGGGAAACGAAAGACGA ACTCAACTCTTGCTCCTAATAATCAACTCTCTGTATGAAGGATGGCAGCATT AAGAGTCCTCCTGCCTGGGC'ATI ATTGGGCC'AG TTCACCCTCTTTA A ATC A A ACCCGCAGTGGCTCCCAGTTCTCGTCCCATCAGATTTAAATTGCTAACAGTA TG G G G G G C A C CA C G C A TC TG TTTTG TCC C A CA A TG C G C Tm C TC TC CC A A A TCCCGATTTCTGCTGTCATAGCCTCTATTCAATTTTTATTTATTGTCTGCCCTC C ACTTATAC AATCGTAGAGAGCAATGCCATTTGTCACTTTCTGC A ACAGTTT TTTGAGCCTTTA TGGCTGA ATCC'C ATTTTICTTC TCTTTC A A AC TGTTTGCTCC ATTGCTCCTCCCGCACGGCTGTCCGTAC AG ICATCCC ATCCATCTGGGGGCC TCTTTCATCTCTCACCCTTCCTGGTGCTTCGTGGATCTCTGCTTACCTCTGTG GGTTTTTTTTTTTTTTTTTGACTTATTCTTCTCACTGGACTTTAAGATTACTTC CACAGCGAAAGTGCTGCCTCCCTTTTCTGCCCGCAGTGTTCTGCGTACTTTA GATACTACTCAGTGCTGACATTTGATGGCAAAAGTTGCC’TGCACTTAAATTT CTCTTTTTAATAGGGTGAACTAGAGTTGGAGTTTTTTTCTCTTTTTTCTCTTTT C T C T C K T C K TCTCTCTCTC I C T( TCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTCÍ'C K C CTC CCTCCCTCCCTCCCTCCCTCTCTCTCTCTTTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCT TTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTTTTTGACAAATCTCACAGGCTTTGA GAATTATAAAAGGTGACAGTTCACCTGAAAATCACAGGTCTGGTCTGTTTAA ATTGTTGAGAAATATCCGATTAAAAGTCTTGTGGCTGTGTCCTAATAGGCTC TCTTTCAGGACGTTGTAGTCAATAGAGTGGCTGAACCATACTTGAGTTTATA AAGCTCAAAAACTGATGCACCCACTCTGCTATTATCGTGTTAGTAAGAGTTC AGCTGT AT ATC ATTGTCT AGGTTT ATCTTGTCCT AC AGTGGGT ATTC A A AT AT GGCCACCAGAGGATATGTGTAAATATAAGCACCTGTATTTGCCTGTTGTTGA GAACTGCiAGGC.AAAACAAAAAATGTCTGCiCAACCCTlTGCCTTTTTAACCGT AATTAATTGACAGTTTATTTAGAGATAAGAGTTTTCAAAAATCTCTTAACTG CCACAACCCACAGAGGGTCTTGTTTTGCCATCTTCAGTGGCTCACAGATATG ATCC A AGTT AACTTGAAAGAGATGAGC AGT ACCC AGGAAATTGTCCTGCCTT TAACTCTGGCTGTCCTTAATTATGACTGTTTA^MGCTGAATTTTCCATCCGTC TAGTGTrrGAGGGTAAAGAAAAGCCTTTTTTAAATAAGTATTTCTGTAAAAC G G CA IC G G IGGGATCTTCTGTGTTGCIATCACGGGTGAAAGAGGGAAACAT TTCTT ATTTTT ATT AAGC AGAGCATT ATTTAC AGAA AGCCATTGTTGAGAATT AGTTCCCACATCA TATAAATATCCATTAACCATTCTAAATTGTAAGAGAACT CCAGTGTTGCTATGCACAAGGAACTCTCCTGGGGGCCTTTTTTTGCATAGCA ATTAAAGGTATGCTATTTGTCAGTAGCCATTTTTTGCAGTGATTTAAAGA( < AAAGTTGTTTTACAGCTGTGTTACCCTTAAAGGTTTTTTTTTTATGTATTAAA TCAATTTATCACTGTTTGAAGCTTTGAATACCTGCAATCTTTGCCAAGATACT TTTTTA TTT AA AAAAATAACTGT G T A AATATT ACC C T GTAAT A TT AT ATAT AC
TTAATAAAACATTTTAAGCTA (SEQ ID NO I )
zu
Aminoácidos de CD47 de ratón isoforma 1 (XP_006521873.1)
MWPLAAALLl GSCCCGSAO lX rS N V N S IE U st N ETYM Pf IVR\VEAQSTEH
MFVKYN KLN KSYIFIYD G N KN STTTD Q N FTSA KISV SD IJN G IA SLKM D KRD A
M VGN VTCFVTELSREGKTVIELKN RTAFN TD Q CSA CSYEEEKG G CKLVSN V
FSPNEKQ l Y i m i MI LFWGKFGD ll KYKSSHTNKRIILLLVAGLVI IV IW V O
AILLIPGEKPVKNASGLGUVISTGILILLQYNVFMTAFGMTSFTIAILITQVLGYV
LALVCH TI ri\IA ( F.PVHGPLLISGLGIIALAFI I (.I VYMKFV£(SEQ ID NO 2)
ARNm de CD47 de ratón Isoforma 2 (XM_006521811.1)
GOCTACM X C.GGAGA(JCA<>(><¡ M . ( . AGGAGTTGGACTGAGGTTGí .<,< i .< JCTC CGAGG TCCAGGGCGAGC1 rGGCCAGAGGGAG’l AGAGAGCAGCGGGGC1GC
GC AGGGACGCGTGCCGTG AGTTCCGGTG AGCGTGTGTGTCCC ATGCTCCCGT
CTTTCAGGCCGGCCCAGGACACGAAGCCGGAAGAGAGCTGGCTGGAGGGAC
GGGGGCCGTGAGCAGAG AGIGCAACCCGCGCAGCCCCGGGGAC AGGCTGA
TTCTTGGCGCTCTCCGCCGGACKTTGCCCAGGGCTGGGTGTC.AGGCTGGCGT
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Aminoácidos de CD47 de ratón isoforma 2 (XP 006521874.1)
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ARNm de CD47 de ratón isoforma 3 (XM_006521807.1)
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ARNm de CD47 de ratón isoforma 4 (XM_006521808.1)
GCCT AC ACCGGGAGAGC AGGGAGG AGGAGTTGGACTG AGGTTGGGCGGCTC
CGAGGTCCAGGGCGAGCTTGGCCAGAGGGAGTAGAGAGCAGCGGGGCTGC
GCAGGGACGCGTGCCGTGAGTTCCGGTGAGCGTGTGTGTCCCATGCTCCCGT
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ATATTACCCTGTAATATTATATATACTTAATAAAACATTTTA AGCTA (SF.Q ID
NO 7)
Aminoácidos de CD47 de ratón isoforma 4 (XP 006521871.1)
MWPI.AAAL.IT-GSCCCGSAO LLFSN VN SIFFTSCN ETV VIPC 1VRNVEAOSTFE
M F V k W k l NkSN IFIV DGN kN STTTD QN FTSAKISVSD LIN GIASLkM D KRDA
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ILTLKYKSSHTNKRIllLLLVAGLVLTVIYYYGAILLIPGI KPYKNASGl G U \ ISTG I! II UJYNVFMTAFGMTSFnAEJTQVLGYVLAJ VGIC U 3 MACEPVHOPLUSG LG IIALAF-LLGLYYMKFV.4SN(JRHQH'RKA I 1JÜ>UiAFKESKl,MMNl )J ( SEQ ID NO 8)
ARNm de CD47 humana isoforma 1 (XM 005247909.1)
AGTGGG AGCGCGCGTGCGCGCGGCCGTGC AGCC! GGGC AGTGGG TCCTGCC
TG TG A C GC GC GGCGGCGG TC C»G TC C T GC C T GT A ACGGC GGC GGC GGCT GC T
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Aminoácidos CD47 humana isoforma 1 (XP_005247966.1)
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(SF-OIRNO I0)
ARNm de CD47 humana isoforma 2 (NM_198793.2)
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C G G C C G T G C A G C C IG G G C A G T G G G T C C T G C C T G T G A C G C G C G G C G G C G G T C
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G ATTGTT AGTT AAGTTTTTATTC AAAGC AGCTGT AATTTAGTT AAT AAAATA
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AATC AATTAGGGGCAATAGTAGAATGGACAATTTCT AAGAATGATGCTTTT
CAGGTCCTAGGGCTTCTGGCCTCTAGGTAACCAGTTTAAATTGGTTCAGGGT
G ATA ACTACTT AGC ACTGCCCTGGTG ATTACCC AG AG AT ATCT ATG A A A ACC
AGTGGCTTCCATCAAACCTTTGCCAACTCAGGTTCACAGCAGCTTTGGGCAG
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K ( GTATGATGTGATATTGATGGAGATAGTGGTCCTCATTC I rGGGGGTTGC
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( . I rATTTCTTAGTCCA FC AG ATGTTCCCGTGTGCCTCTTTTATGí CAAATTGA TTGTCATATTTCATGTTGGGACCAAGTAGTTTGCCCATGGCAAACCTAAATT ÍATGACCTGCTGAGGCCTCTCAGAAAACTGAGCATACTAGCAAGACAGCTC TTCTTGAAAAAAAAAATATGTATACAC AAATATATACGTATATCTATATATA CGT AT GT AT AT ACAC AC ATGT ATATTCTTCCTTG ATTGTGT AGCTGTCC AAAA TAATAACATATATAGAGGGAGCTGTATTCCTTTATACAAATCTGATGGCTCC TGC \GCACTTTTTCCTTC T( i A A A AT ATTT AC ATTTTCiCTA ACCTAGTTTGTTA CT r ! AA A A ATC A G T m G AIG AA AGG AGGG A A A AGC AG ATGG A C H G A A A A AGATCCAAGCTCCTATTAGA AA AGGT ATGAAAATCTTTATAGTA AAATTTTT TAT AAACT AAAGTTGT ACCTTITAAT ATGTAGTAAACTCTCATTTATTTGGGG
1TCGC1CTTGGATCTCATCCATCCATTGTG n C T C T n AATGCTGCCTGCC IT I TGAGGCATTC ACTGCCCTAGAC A ATGCC ACC AGAGAT AGTGGGGGAAATGC CAGATGAAACCAACTCTTGCTCTCACTAGTTGTCAGCTTCTCTGGATAAGTG ACC ACAGA AGC AGG AGTCCTCCTGCTTGGGC ATC ATTGGGCCAGTTCCTTCT CTTTAAATCAGATTTGTAATGOCTCCCAAATK ( \ l < ACATCACATTTAAAT1 GCAGACAGTGT11 TGCM ATCATG1 A T C T d l l K .K ( CATAATATGCT11 l i \( K < ( rGATCCCAGTTTC FGCTGTTGACT< rTCCATTCAGTTTTATTTATTGl GTGTTCTC AC AGTGACACC ATTTGTCC TTTTCTGC AAC A ACCTTTCCAGCT AC TTTTÍK ( A \A T T ( I A I IT (iT ( T H T( ( I I( W A A ( A 'IT( T (C T IK K AGTTCCT CTTCATCTGTGT AGCTGCTCTTTTGTCTCTT AACTTACCATTCCT ATAGT ACTT TATGC ATCTCTGCTTAGTTCTATT AGTTTTTTGGCCTTGCTCTTCTCCTTGATT TTAAAATTCCTTCTATAGCTAGAGCTTTTCTTTCnTCATTCTCTCTTCCTGC A GTGTTTTGC A T ACA FC AGA AGCT AGGT AC ATA AGTTA A ATGATTG AGAGTTG GCTGTATTTAGATTTATCACTTTTTAATAGGGTGAGCTTGAGAGTTTTCTTTC TTrCTGTTTTTTTTTTTTGTTTrTTTTTTTTTTTI'I'n'TrTTTTTTTTTITGACT A ATTTC AC ATGCTCT A A A A ACCTTCA A AGGTG ATT ATTTTTCTCCTGG A A ACTC C AGGTCC ATTCTGTTT AAATCCCT AAG AATGTC AGAATT A AAATAAC AGGGC T ATCCCGIA A FTGGAAAT ATTTCTTTTTTC AGGATGCTATAGTC AATTTAGT A AGTG ACC ACC A A ATTGTTATTTGC ACT A AC A A AGCTC A A A AC ACG ATA AGTT T ACTCCTCC ATCTC AGTAATAAAAATTAAGCTGTAATC AACCTTCTAGGTTT CTCTTGTCTT AA.AATGGGT ATTC AA AAATGGGG ATCTGTGGTGTATGT ATGG AAACACATACTCCTTAATTTACCTGTTGTTGGAAACTGGAGAAATGATTGTC GGGCAACC Ci rT T A T T T n TATTGTATTTTATTTGGT FG KGGGATTTTTTTAl \ AAC AGTTTT AC Tl’GT GTC A TATTTT AA AATT AC T A ACTGCC ATC ACCTGCTGG GGTCCTTTGTT AGGTCATTTTCAGTGACTA AT AGGGATAATCCAGGT A ACTT TGAAGAGATGAGCAGTGAGTG \( C \(K .( A(.TTTTT( TÍK'CTTTACK TTTC.AC AGTTCTTAATTAAGATCATTGAAGACCAGCTTTCTCATAAATrTCTCTTTTTG W W W \ ( . \ \ \( .( \TTTGT ACTA AGCTCCTCK.I \AGAC A AC \ K TI AAAT e n AA A AG K iTTGTTA rCATGACTGGTGAGAGA A( |AAAA( A11T1G TTTTTA TTAAATGGAGCATTATTTACAAAAAGCCATTGTTGAGAATTAGATCCCACAT CGTATAAATATCTATTAACCATTCTAAATAAAGAGAACTCCAGTGTTGCTAT GTGCAAGATC('T( T( TTCKiACK'TTTTTTCiCATAGCAATTAAAGGTGTGCTAT TTGTCAGT AGCC ATTTTTTTGC AGTGATTTGA AG ACC A A AGTTGTTTT AC AGC l'GTGlTACTO 1TAAAOGI H 1*1 TTTHTATATGTAITAAATCAAITTATCACI
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TATAATACCCAATAAGCTTTTAATTAGAGCAGAGTrTTAATTAAAAGTTTrA AATCAGTC
(SEQ ID NO Mi
Aminoácidos CD47 humana isoforma 2 (NP 942088.1)
MWP1 Y \ A l LLGSACCGSAO LLFN K1 Ks\ I FTFrNDTVVlPCFVTNMEAQNT
TEVYVKAVKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAK1EVSQLLKGDASLKMDK
SDAVSHTGNYTCEYTEETREGF.TIIFLKYRVVSWFSPNENILIATFPIFAILLFW
(rOK.lKTLKYRSC.C.MDl KITALLVAGI. VI I YIVIVGAILFYPGl YSl KN A IGLGLI
VTSTGIL1LLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVTQVIAYILAVVGLSLCIAAC1PMIIGPLLI
SGLSILAI.AOI-LGL\'Y\1KFV,-I.V.V(^A'7/(3/7’/?.VAf(SEO ID NO 12)
ARNm de CD47 humana isoforma 3 (XM 005247908.1)
AGTGGGAGCGCGCGTGCGí GCGGCí GTGCAGCCTt >< .(K AGTGGGTCCTGí <
IGTGACGCGCGGCGGCGG 1CGGTCCTGCCTGTAACGGCGGCGGCGGCTGC ¡
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GATCTATGTTGTTTGCCCAATTGAGATCCAGT TTTTTGTTGTT ATTTTTAATC
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\(.« ,( A i K M Ar( ( ( I \(. \1 \ \ I < r( ( \< 1 U.Atr A ¡ AGlGC.Gt.Ci A \ \ U»(. C A GATGAAACCAACTC'ITGCTCTCACTAG nGTCAGCTTCTCTGGATAAGIGAC C AC AG A AGC AGG AGTCCTCCTGCTTGGGC ATC ATTGGGCC AGTTCCTTCTCT TTAAAT C AG ATTTGT AATGCiCTCCC AAATTCC AT C AC ATC AC ATTT.AAATT G CAGACAGTGTUTGCACATCATGTATCTGTTTTGTCCCATAATATGCTTTTTA CTCCC’TGArCCCAGTTTCTGCrGTTGACTCTrCC’A TTCAGITTTATTTA1TGTG K tTt c k ac AcnciAc A c c A n rcnc c n rrcrcK AAC A A C crn c ’CA .cTAC T
TTC ATCTGTGT AGCTGCTCTTTTCiTCTCTT A ACTT ACC ATTCCT AT AGT ACTTI ATGC ATC TC TCX TTAGTTCTATTACiTTTTTTCKX C TTCK TC’TTCTCT TTCiATTT TA AA ATTCCTTCTATAGCTAGAGCTTTTCTTTCTTTC ATTCTCTCTTCCTGCAG TGTTTTGCATACATCAGAAGCTAGGTACATAAGTTAAATGATTGAGAGTTGG CTGT ATTT AGATTTATC ACTTTTT AAT AGGGTGAGCTTGAGAGTTTTCTTTCT TTCTGTTTTTTTTTTTTCrnTTTTTTTTTTTrTTTTTrTTTTTTTTTTTTG AC I A A i t t c a c a i g c re i a a a a a c c i t c a a a g g i g a n Ai r m c i c c t g ü a a a c i c c
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AC ICC 1C C M C TC AGIA AI A A A VA T I AAGCIG1AATC AACC I I C Í A G G H I C
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T AAAAGTGTTGTTATC ATG ACTGGTGAGAGAAG A AA AC ATTTT GTTTTT ATT
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Figure imgf000035_0001
Aminoácidos CD47 humana isoforma 3 (XP 005247965.1)
MWPI VAAI t I C.s -\< ( GS VOl.Lt-'INKTKSVEFTKC M>TA VIPC F\ I NMK
11 AA VK W K K K G R D IYTFD CA LM vS I VPT DFSS AKIF VSQ LLK G D A SL
SD A V SH TG N YTC EV TELTR EG ETIIELkYR V V SW FSPN EN lLlV lFPlFA I
GQFG1KTLKYRSGGMDCKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNAT
VTSTGII.nXHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVTAYILAVVGLSLCIAACIPM
SGLSILAI.A01.LGIAA \IKFV/IAAC>A7/C^VV^I7->.7,/A'A(SEQ ID NO 14)
Figure imgf000035_0002
ARNm de CD47 humana isoforma 4 (NM 001777.3)
G G G G AGC A G G C G G G G G A G C G G G C G G G A A G C A G IG G G A G C G C G C G IG C G C G
C G G C CG T G C A G C C T G G G C A G T G G G T CC T G C C T G T G A C G C G C G G C G G C G G T C
G G T C C T G C C T G T A A C G G C G G C G G C G G C T G C T G C T C C A G A C A C C T G C G G C G G
C G G C G G C G A C C C C G C G G C G G G C G C G G A G A IG 1 G G C C C C T G G T A C C G G C G
C T G I T G C T G G G C T C G G C G T G C ’TGC G G A IC A G C IC AC.CI A C I A I I I A A I A
A A \C A \ A A IC IC. I A G A A ITC AC C, I I I I G I \ A IC. AC AC IGTC G IX V I ICC
A I GC I I I G I I AC I A A I A I GC; AC;GC AC A A A AC AC I AC IG A A G I A l AC G I A
A A G T G G A V M T P A A A G G A A G A G A T A I T I AC A C C 'P T P G A IG G A G C T C T A A
A C A A G TCC VC TC.TCC C CAC TG A C T T T A GT A G T G C A A A A A T T G A A G T C T C
A C A A T T U T A A A A G G A G A T G C C I C I 1 1 G VXC.ATGGA I A AC .A G T G A 1 G C T
( ¿ IC IC AC AC AC AC;c;AAAC I AC AC r i G I C l A A C i I AAC A G A A I I \ AC C AG AG A AC;C; I C. A\ AC C1A I C M C G AGC I A A A A I V I CG I G IT G IT T C ATGG n r rC
T C C A A A T G.AAAATA T T C T T A T T C T T A T T T T C C C A A T T T T T G C T A T A C T C C
T G T T C T G G G G AC A G T T T G C T A T T A A A AC AC IT A A A T A I AG A TC'CG G FGG
T A T G G A T G AGA AA ACA A T T G C T T T . A C T T G T T G C T G G A C P A G T G A PC.AC’T
c; k a i r e n e a i t c ; h g c ; ag c c a i re í i i t c c; rc c c a g c ; tc ; a a t a i t c a t i \ \ \(. \A I(.< l \(TGGCClTGGTTTAATTGTGACTTCTACAGCiGATATTA A I A T T A C T IC A( I \( I A I ( . IG T T I AG I \( A (.< G A I IG G Ar I AA< C I C C I T CCTCA I IGCC'A T \ I IC C T TA TTC A C C T C A I \CCC TATATCC T C C C IC T C G TTC G A C TG A G T C T C TC T A T TG C G G C G TC TA TA C C A A TC C A TG C C C C TC TTC TG A TTTC A G G TTTG A G TA TC TTA G C TCTA G C A CA A TTA C TTG G A C TA G T T T ATATG A A A TTTG TG G CTTCCAA'I CACA AC ACTA TACA ACCTCCTA GGA AA GCTGTA GA GGA ACCCCTTAA TGC \TT( A A \G V \TCAA \ \GGAAT (.A l’GA \ IGA l'C; \ Ai \ AC IGA AGTGAAGTGATGGACTCCGATTTGGAGAGT AGTAAGACGTGAAAGGAATACACTTGTGTTTAAGCACCATGGCCTTGATGA I I C ACTGTT GGGG AG A AG AA AC AAG AAAAGTA AC TO G I IGTC ACCTATGAG ACCCTT ACGTG ATTGTT AGTT A AGTTTTT ATTC AA AGC AGC TGTA ATTT AGTT A ATA A A A T A A TT ATO ATCTATÜTI tiü T G C C C A A TT G A G ATCC AGTTTTT IG T IGTTA IT r n A A TC A A n AGGGGC AATAGTAGAATGGAC A A r r rC C A AGAAT GATGCCTTTCAGGTCCTAGGGCCTCTGGCCTCTAGGTAACCAGTTTAAATTG GTTCAGGGTGATAACTACTTAGCACTGCCCTGGTGATTACCCAGAGATATCT ATGAAAACCAGTGGCTTeCATC AAACC m GCCAACTCAGGTTCACAGCAGC TTTGGGCAGTTATGGCAGTATGGCATTAGCTGAGAGGTGTCTGCCACTTCTG GGTCAAT GG.AAT A AT A A ATT AAGT AC AGGC AGG AATTTGGTTGGG AGCATC rTGTATGATCTCCGTATGATGTGATATTGATGGAGATAGTGGTCCTC ATTCTT GGGGGTTGCCATTCC( \( \ I TCCCCCTTCAACA A \( \GTGTA \( U » T ( C TT a CAGAT1 1 KGOGl VCTTI rATTGATGGAl ATGT1 rTCCTTI l \! TCACAI \\ CCCCTTG.AAACCCTGTCTrGTCCTCCrGTTACTTGCTrCTGCTGTACAAGATG TAGCACCTTTTCTCCTCTTTGAAC ATGGTCTAGTGACACCiGTAGC ACC AGTT GCAGGAAGGAGCCAGACTTGTTCTCAGAGCACTGTGTTCACACTTTTCAGCA
\ \ \ \ I AGCT ATGGTTGTA AC A rATOTA I I ( CCTTCCTCTGATTTGAAGGC A A \AATC I \( \<iTGTTTCTTCACTTCTTTTCTGATCTGGGGCA rGAAAAA A(iCA \GATTGA \ATTTGAACTA IGAG IC ICC IGCA1XSGC \ \< \ AAA TG TG K«I < \( C ATC ACiGCC A AC AGGCCAGCCCTTGAATGGGG ATTT ATI ACTGTTGT ATCTA TGTTGCATGATAAACATTCATCACCTTCCTCCTGTAGTCCTGCCTCGTACTCC CCTTCCCCTATGAiTGAAAAGTAAACAAAACCCACATITCCTATCCTGGiTA GAAGAAAATTAATGTTCTGAC AGTTGTGATCGCCTGGAGTACTTTTAGACTT TTAGCATTCGTTTTTTACC'TGTTTGTGÍj ATGTGTGTTTGTATGTGCATACGTA 1G AGATAGGCAC ATGCATC T I C TG i ATGGACAAAGGTGGGGTACCT AC AGG AG AGC A A AGGTTA ATTTTGTGCTTTT AGT A A A A AC ATTT AA AT AC AAAGTTC TTTATTGGGTGGAATTATATTTGATGCAAATATTTÜ \ rCACTTAAAACTTTTA A A AC T I CIAGGT AATTTGCCACGCTTTITGACTGCTCACCAAI ACCCI GI A A AAATACGTAATTCTTCCTGTTTGTGTAATAAGATATTCATATTTGTAGTTCiCA TTA ATAA I AGTTATTTCII AGTC( ATCAGATd rCOCGTGTGC CTCTTTTATO CCAAATTGATTGTCATATTTCATGTTGGGACCAAGTAGTTTGCCCATGGCAA ACC TA AATTT ATGACCTGCTGAGGCCTCTCAGAA AACTGAGCAT ACT AGC AA
( .AC \(.CT('TTCTTCiAAAAA.AA.\AATATGTATA( AC AAATATATACGTATATC rATATATACGTATGTATATACACACATGTATATTCTTCCTTGATTGTGTAGCT GTCCA W A T A AI A A( \I A T \ I AG A GGGAGC I <. I \ ITCCTTTA I \< AAATCTG \ T G G c ra Kr( m a \( i r m a m i o a \a a t a t t t a c a t t t í g c i \a c c t a GTTTGTTACTTTAAAAATCAGTTT TGATGAAAGGAGGGAAAAGCAGATGGA CTTGA A A A AG ATCCA AGCTCCTATT AGA A A AGGTATG A A A ATCTTTATAGT A AAATTTTTTATAAACTAAAGTTGTACCTTTTAATATGTAGTAAACT('TC ATTT ATTTGGGGTTCGCTCTTGGATCTCATCCATCC ATTGTGTTCTCTTTAATGCTG CCTGCCTTTTGAGGCA ITCACTGCCCTAGACAATGCCACCAGAGAT a g t g g g
GGAAATGCCAGATGAAACCAACTCTTGCTCTCACTAGTTGTCAGCTTCTCTG
GATA AGTGACC ACAGA AGCAGGAGTCCTCCTGCTTGGGCATCATTGGGCC A
GTTCCTTCTCTTTAAATCAGATTTGTAATGGCICCCAAATrCCATCACATCAC
ATTT AAATTGCAGAC AGTGTTTTGCACATC ATGTATCTGTTTTGTCCCATAAT
ATGCTTTTTACTCCCTGATCCCAGTTTCTGCTC.TTGACTCT'TCrATTCAGTTTT ATTTATTGTGTGTTCTCACAGIG AC ACCATTTGTCC I I I fO G C A A C \A( C1 I
I CC AGCT ACTTTTGCC A A ATTCTA TTTGTCTTCTCCTTC A A A AC ATTCTCCTTT
GC AGTT CCTCTT C ATCTGT GTAGCTGCTCTTTTGT CT CTT AACTTAC C ATTCCT
ATAGTACTTTATGCATCTCTGCTTAGTTCTATTAGTTTTTTGGCCTTGCTCTTC
TCCTTGATTTTAAAATTCCTTCTATAGCTAGAGCTTTTCTTTCTTTCATTCTCT
CTTCCTGCAGTGTTTTGCATAC ATC AGAAGCTAGGTACAT AAGTTAAATGAT
TG AG AG IT GGCTGTATTTAGAT IT A TC AC11 I ITAATAOGGTGAGC ITGAGA
GTTTTCTTTCTTTCTGTTTTTTTTTTTTGTTT I TT'TTTTTl I I I I I I I ITTTTT I I I
TTTTGACTAATTTCACATGCTCTAAA.AACCTTCAAAGGTGATTATTTTTCTCC
TGG A A ACTCC AGGTCC ATI CTGT r r A AATCCCT A AG A A1GTC AG AA r r AA A A
T A ACAGGGCT ATCCCGT AATTGG AA AT ATTTCTTTTTTC AGGATGCT ATAGT
< AA i l l A GI AAGTG AC C A< CAAATTGTTATTTGCACTAACAAAGCTCAAAAC
ACGAT A AGTTT ACTCCTCC ATCTCAGT AAT AAAA ATT A AGCTGT AATC AACC
TTCTAGGTTTCTCTTGTCTTAAAATGGCiT ATTCAAAAATGGGGATCTGTGGT C. I \ I ( T1 A IGG AAACA( A I AC K ( 11 AATTTACCTGl IG I rCK'iAAAC I'CiGAG \
A ATGATTGTCGGGC A ACC G 1TT ATTT I I I A I I GI A T IT T ATI TGGTTGAGGGA
TTTTTTTAT \ V \( AGTTTTACTTGTGI ( \ 1 \TTTTAAAATTACTAACTGCC K I
C ACCTGC'TGGGGTCCTTT(iTT AGGTC ATTTTC AGTG ACT AATAGGG ATA ATC
CAGGTAACTTTGAAGAGATGAGCAGTGAGTGACCAGGCAGTTTTTCTGCCTT
T AGCTTTG AC AGTTCTT A ATT A AG ATC ATTGA AGACC AGCTTTCTC AT A A AT
TTCTCTTTTTGA AAAA AAGAAAGCATTTGTACTAAGCTCCTCTGTAAGACAA
C ATCTT A A ATCTT A A A AGTGTTGTT ATC ATGACTGGTG AG AG AAG A A A AC AT
TTTGTTTTTATTAAATGGAGC ATT ATTT ACAAAAAGCCATTGTTGAGAATTA
GATCCCACATCGTATAAATATCTATTAACCATTCTAAATAAAGAGAACTCCA
G G TG TG C TA TTTG TC A G TA G C C A III111 IGCAGTGATTTGAAGACCAAAGT
TGTTTIACAGCTGTGTTACCGTTAAAGGTTI IT T rT T T I ATATGTATTAAATC
A ATTT ATCACTGTTTAAAGCTTTGAATATCTGCAATCTTTGCCAAGGTACTTT
TTTA1TTAAAAAAAAACATAACTTTGTAAATATTACCCTGTAATATTATATAT
ACTTAATAAA AC ATTTrAAGCT ATTTTGTTGGGCT ATTTCT ATTGCTGCTAC A
(.( AGACC ACAAGCACATTTCTGAAAAATTTAATTTATTAATGTATTTTTAAG
TTGCTT AT ATTCT AGGTAAC AATGT AAAGAATGATTTA AAATATT AATT ATG
AATTm TGAGTATAATACCCAATAAGCTTTTAATTAGAGCAGAGTTTTAATT
AAA AGTTTT A A ATC AGTC( SEQ ID NO 15)
Figure imgf000037_0001
Aminoácidos CD47 humana isoform a4 (NP 001768.1)
MWPI \ AM I I GSACCCiSAOl.l.KNKTkSN KHTCNDTVA f f i FVTNMEAQNT T E VY V KW K FKG RDIYTFDGALNKSTVPIWSSAlQÉVSQUJfiGDASLKMDK SDAVSH'KAN 'KTATELTREGETHSUC1 RWSWVSnCENO IVD PIFAD I FW GQFGIKTLKYRSGGMDFKT1AI.EVAGLVITVIVIVGAI1.FVPGEYSI.KNATGIXj ! i
VTSTGILILLHYYW STAIGLTSFVIAILVTOVUYILAVVGLSLCIAACIPM HGPLL!
SG I .S IL \ I A01 L G L V Y \ 1KI V.-IS X O K / I O r i ‘RKA I / / / V S A I K I SK( i \ f \ fS f >/• < SEQ ID NÜ. 16)
Aminoácidos de CD47 humanizada isoforma 1
MWPI A AAl t.l (tS( ('< GSAOI.I.FN K T K SVKFTFC NDI V VI PC FYTN VIKAQNT TEVYVKW KFKG RD IYTFIíG A LN kST Y 'P T D FSSA klE V SQ L L K G D A SL kM D k M> \\ MI IGNY IC F Vl Fl I RFGI I I I FFkY R W S W F S P N E N IU V IF P IF A III i YYGQ FGIkTLKYRSGGM D F.kTIAl I \ AGI VITVIVIY G A IFFV PG EYSI.kN A T
G FG LIV TSTG ILILLH Y Y VFSTAIGLTSFVIAILVIQ VIAYILA VVG LSIX'IA ACI
PMHGPLLISGLSILALAQLLGLVTMKFV7i(SEQ ID NO I7)
Aminoácidos de CD47 humanizada isoforma 2
VIVVPI AAAl.t-I.CiSCTC GSAO l.L FN kT kSV FFTFC NDTVVIPC FYTNV1FAONT TEY Y V k W kFkG R D IY T FD G A L N k ST Y P T D F SSA k IF Y SQ L L k G D A SL k M D k SD A V SlIT G N Y T C E V T E L T R E C E T U E L kY R W SW FSP N E N IL lV IFP lF A IL L F W G Q F G Ik T l.k Y RSGGM DFkTIAl.l.VAGIA'ITVIY IVG Vil I \ PGFY SLkN AT
GLGLIVTSTCÍILILLHY Y VFSTAIGLTSFY IAILMQVIAY ILAVY G L S L Í IAAC I
P .M H (iP LU SG LSII.A LA ytJA ;F\ YMKF\vl.SA(_W//(7/J/ m M S E O ID NO I8)
Aminoácidos de CD47 humanizada isoforma 3
MVVPI A \ AI l I GS( ( ( GSAO U .F N k T k S V F F T F C N i m VIPC FV I NYIFAONT TF\ Y V k\V K FK G R D IY TFI)G A I.\kSTV PTI>l S S V k lF V S y i I k ( .l)A S F K M I)k SDAVSHTGNY TC FY T F L T R E G E T IIE L k Y R W SW FSPN EN ILIV IFP1FA ILLF YV G Q FG IkTLkY R SG G M D EkT I A LLVA GLVITVIV IV C A ILFV P G EY SL kN A T
G L G U V T S T G II.IIJ.H Y Y \ FST A IC I.T SFV IA IIA IQVI VY II.AY VG FSI.CIA A CI
PM liG P1.1.1 SG LSI LA LA Q LLC LVY M KV \ASKyRJIQ PPRKA I T.KPI.NK (SEO ID NO 19)
Aminoácidos de CD47 humanizada isoforma 4
NIVVPI A A Al.I.I.GSCTC’GSAO IJ .F N k T k S V F F T F C NDTVVIPC FYTN VIF.AONT TE\ YV k W k F k G R D IY T F D G A L N k S T Y PTDI SS Y k IE V S Q L L k G D A S E k M D k SDAVSUTGNY I CFV I F L T R E G E T U E L kY R W S W I SPNEN1LIVIFPIFAILLF W G O F G Ik T l.k Y R SG G M D FkTIA I.I .Y AGI.MTY IMY GAII.FY PGFY SFkN A T GLÍiLIY TSTG ILILLH Y Y V FSTA IG LTSIA LVILMQWAY ILAY \ GLSLC IAAC I PMHGP1X1SGLSIKALAQ1XGLVYMICFV ISNQRI^ PPRKAVEEPLÍfÁFKESKG UKf.VDi: (SEO ID NO 20)
Animales no humanos con CD47 humanizada
Se proporcionan animales no humanos que expresan proteínas CD47 humanizadas en la superficie de células de los animales no humanos como resultado de una modificación genética de un locus endógeno del animal no humano que codifica una proteína CD47. Los ejemplos adecuados descritos en la presente incluyen roedores, particularmente, ratones.
Un gen de CD47 humanizado puede comprender material genético de una especie heteróloga (por ejemplo, seres humanos), en donde el gen de CD47 humanizado codifica una proteína CD47 que comprende la porción codificada del material genético de la especie heteróloga. Un gen de CD47 humanizado descrito en la presente comprende ADN genómico de una especie heteróloga que codifica la porción extracelular de una proteína CD47 que se expresa en la membrana plasmática de una célula. Un gen de CD47 humanizado descrito en la presente comprende ADN genómico de una especie heteróloga que codifica la porción extracelular y la porción transmembrana de una proteína CD47 que se expresa en la membrana plasmática de una célula. Se proporcionan, además, animales no humanos, embriones, células y constructos de transformación para producir animales no humanos, embriones no humanos, y células que contienen dicho gen de CD47 humanizado.
El gen de CD47 endógeno puede estar delecionado. Un gen de CD47 endógeno puede alterarse, en donde una porción del gen de CD47 endógeno se reemplaza con una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia de CD47 humana, en su totalidad o en parte). La totalidad o sustancialmente la totalidad de un gen de CD47 endógeno puede reemplazarse con un gen heterólogo (por ejemplo, un gen de CD47 humano). Una porción de un gen de CD47 heterólogo puede insertarse en un gen de CD47 no humano endógeno en un locus CD47 endógeno. El gen heterólogo puede ser un gen humano. La modificación o humanización puede realizarse a una de las dos copias del gen de CD47 endógeno, lo que da lugar a un animal no humano que es heterocigoto con respecto al gen de CD47 humanizado. Se proporciona un animal no humano que es homocigoto para un gen de CD47 humanizado.
Un animal no humano descrito en la presente puede contener un gen de CD47 humano, en su totalidad o en parte, en un locus CD47 no humano endógeno. Por tanto, tales animales no humanos pueden describirse como que tienen un gen de CD47 heterólogo. El gen de CD47 reemplazado, insertado, modificado o alterado en el locus CD47 endógeno, puede detectarse con el uso de una variedad de métodos que incluyen, por ejemplo, PCR, transferencia de Western, transferencia de Southern, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), o un ensayo de ganancia o pérdida de alelos. El animal no humano es heterocigoto con respecto al gen de CD47 humanizado. El animal no humano puede ser homocigoto para el gen de CD47 humanizado.
Un gen de CD47 humanizado descrito en la presenteincluye un gen de CD47 que tiene un segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto y séptimo exón, cada uno de los cuales puede tener una secuencia de al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntico a un segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto y séptimo exón que aparecen en un gen de CD47 humano de la Tabla 3.
Un gen de CD47 humanizado descrito en la presente puede incluir un gen de CD47 que tiene un primer exón y un exón(ones) cadena abajo del exón 7 (por ejemplo, exones octavo y noveno de la isoforma 2), cada uno con una secuencia de al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un exón respectivo que aparece en un gen de CD47 de ratón de la Tabla 3.
Un gen de CD47 humanizado descrito en la presente puede incluir un gen de CD47 que tiene una región 5' no traducida y una región 3' no traducida cada una de las cuales tiene una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una región 5' no traducida y una región 3' no traducida que aparecen en un gen de CD47 de ratón de la Tabla 3.
Un gen de CD47 humanizado descrito en la presentepuede incluir un gen de CD47 que tiene una secuencia codificante de nucleótidos (por ejemplo, una secuencia de ADNc) tiene una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia codificante de nucleótidos que aparece en una una secuencia codificante de nucleótidos CD47 humana de la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrita en la presente tiene una porción extracelular que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una porción extracelular de una proteína CD47 humana que aparece en la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente tiene una porción extracelular que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a los residuos de aminoácidos 19-141 que aparece en una proteína CD47 humana de la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente tiene un dominio V N-terminal de la inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un dominio V N-terminal de la inmunoglobulina de una proteína CD47 humana que aparece en la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrita en la presente puede tener un dominio V N-terminal de la inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a los residuos de aminoácidos 19-127 que aparecen en una proteína CD47 humana de la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente tiene un dominio V N-terminal de la inmunoglobulina y cinco dominos transmembrana cada uno que tiene una secuencia que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un dominio V N-terminal de la inmunoglobulina y cinco dominios transmembrana de una proteína CD47 humana que aparece en la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente tiene una cola intracitoplasmática que tiene una secuencia que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una cola intracitoplasmática de una proteína CD47 de ratón que aparece en la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 16-292 que aparecen en una proteína CD47 humana de la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 19-292 que aparecen en una proteína CD47 humana de la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a los residuos de aminoácidos 19-292 (o 16-292) que aparecen en una proteína CD47 humana de la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia de aminoácidos de una proteína CD47 humanizada que aparece en la Tabla 3.
Una proteína CD47 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos de una proteína CD47 humanizada que aparece en la Tabla 3.
Se proporcionan composiciones y métodos para producir animales no humanos que expresan una proteína CD47 humanizada, que incluye formas polimórficas específicas, variantes alélicas (por ejemplo, diferencias en un solo aminoácido) o alternativamente isoformas de corte y empalme, que incluyen composiciones y métodos para producir animales no humanos que expresan tales proteínas a partir de un promotor humano y una secuencia reguladora humana. Se proporcionan, además, composiciones y métodos para producir animales no humanos que expresan tales proteínas a partir de un promotor endógeno y una secuencia reguladora endógena. Los métodos incluyen insertar el material genético que codifica una proteína CD47 humana en su totalidad o en parte en un sitio preciso en el genoma de un animal no humano que corresponde a un gen de CD47 endógeno para de esta manera crear un gen de CD47 humanizado que expresa una proteína CD47 que es humana en su totalidad o en parte. Los métodos pueden incluir insertar ADN genómico correspondiente a exones 2-7 de un gen de CD47 humano en un gen de CD47 endógeno del animal no humano para de esta manera crear un gen humanizado que codifica una proteína CD47 que contiene una porción humana que contiene aminoácidos codificados por los exones insertados.
Cuando sea adecuado, la región codificante del material genético o secuencia(s) de polinucleótido(s) que codifica(n) una proteína CD47 humana en su totalidad o en parte pueden modificarse de manera que incluyan codones optimizados para la expresión en el animal no humano (por ejemplo, ver las patentes de los Estados Unidos núms.
5,670,356 y 5,874,304). Las secuencias con optimización de codones son secuencias sintéticas, y, preferentemente, codifican el polipéptido idéntico (o un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de longitud completa que tiene sustancialmente la misma actividad que el polipéptido de longitud completa) codificado por el polinucleótido original sin optimización de codones. La región codificante del material genético que codifica una proteína CD47 humana, en su totalidad o en parte, puede incluir una secuencia alterada para optimizar el uso de codones en un tipo de célula particular (por ejemplo, una célula de roedor). Por ejemplo, los codones del ADN genómico correspondiente a los exones 2-7 de un gen de CD47 humano a insertar en un gen de CD47 endógeno de un animal no humano (por ejemplo, un roedor) pueden optimizarse para su expresión en una célula del animal no humano. Una secuencia de este tipo puede describirse como una secuencia con codones optimizados.
Un enfoque del gen de CD47 humanizado emplea una modificación relativamente mínima del gen endógeno y resulta en la transducción natural de las señales mediadas por CD47 en el animal no humano, debido a que la secuencia genómica de las secuencias CD47 están modificadas en un solo fragmento y por lo tanto conservan su funcionalidad normal mediante la inclusión de las secuencias reguladoras necesarias. Por lo tanto, en tales casos, la modificación del gen de CD47 no afecta otros genes circundantes u otros genes endógenos que interactúan con CD47 (por ejemplo, trombospondina, SIRP, integrinas, etcétera). Además, la modificación no afecta el ensamblaje de una proteína transmembrana CD47 funcional en la membrana celular y mantiene sus funciones efectoras normales por medio de la unión y posterior transducción de señales a través de la porción citoplasmática de la proteína que no se afecta por la modificación.
Una ilustración esquemática (que no está a escala) de la organización genómica de un gen de CD47 endógeno de murino y un gen de CD47 humano se proporciona en la Figura 1. Un método ilustrativo para la humanización de un gen de CD47 endógeno de murino con el uso de un fragmento genómico que contiene los exones 2-7 de un gen de CD47 humano se proporciona en la Figura 2. Como se ilustra, el ADN genómico que contiene los exones 2-7 de un gen de CD47 humano se inserta en el locus del gen de CD47 endógeno de murino mediante un constructo de transformación. Este ADN genómico incluye la porción del gen que codifica la porción extracelular y los dominios transmembrana (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 16-292) de una proteína CD47 humana responsable de la unión al ligando.
Un animal no humano (por ejemplo, un ratón) que tiene un gen de CD47 humanizado en el locus de CD47 endógeno puede producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede producirse un vector de transformación que introduce un gen de CD47 humano en su totalidad o en parte con un gen marcador de selección. La Figura 2 ilustra un locus deCD47 endógeno de un genoma de ratón que comprende una inserción de los exones 2­ 7 de un gen de CD47 humano. Como se ilustra, el constructo de transformación contiene un brazo de homología 5' que contiene la secuencia corriente arriba del exón 2 de un gen de CD47 endógeno de murino (~39 Kb), seguido de un fragmento de ADN genómico que contiene exones 2-7 de un gen de CD47 humano (~23,9 Kb), un casete de selección con fármaco (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina flanqueado en ambos lados por secuencias loxP; ~5 Kb) y un brazo de homología 3' que contiene una aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 endógeno de murino (~99 Kb). El constructo de transformación contiene un casete de selección con fármaco autoeliminable (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina flanqueado por secuencias loxP; ver las patentes de los Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392 and 8,354,389). Tras la recombinación homóloga, los exones 2-7 de un gen de CD47 endógeno de murino se reemplazan por la secuencia contenida en el vector de transformación (es decir, los exones 2-7 de un gen de CD47 humano). Se crea un gen de CD47 humanizado lo que resulta en una célula o animal no humano que expresa la proteína CD47 humanizada que contiene los aminoácidos codificados por los exones 2-7 de un gen de CD47 humano. El casete de selección con fármaco se elimina de una manera dependiente del desarrollo, es decir, la progenie derivada de los ratones cuyas células de la línea germinal contienen el gen de CD47 humanizado descrito anteriormente liberarán el marcador de selección de las células diferenciadas durante el desarrollo.
Los animales no humanos descritos en la presente pueden prepararse como se describió anteriormente, o mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, para comprender genes humanos o humanizados adicionales, a menudo en dependencia del uso pretendido del animal no humano. El material genético de tales genes humanos o humanizados adicionales puede introducirse mediante la alteración adicional del genoma de las células (por ejemplo, células madre embrionarias) que tienen las modificaciones genéticas descritas anteriormente o mediante técnicas de reproducción conocidas en la técnica con otras cepas modificadas genéticamente, según se desee. Los animales no humanos descritos en la presente pueden prepararse para comprender además uno o más genes humanos o humanizados seleccionados de SIRPa (CD172a), IL-3, M-CSF, GM-CSF y TPO. Los animales no humanos descritos en la presente pueden prepararse mediante introducción de un vector de transformación, como se describe en la presente, en una célula de una cepa modificada. Para dar solo un ejemplo, un vector de transformación, como se describió anteriormente, puede introducirse en un ratón que sea deficiente en Rag2 y deficiente en IL-2Ry e incluya cuatro citocinas humanas (Rag2'/'IL2RYC/'; M-CSFHu; IL-3/GM- CSFHu; hSIRPatg; TPOHu). Los animales no humanos descritos en la presente pueden prepararse para comprender además un gen humano o humanizado de la proteína alfa reguladora de señales (SIRPa). Los animales no humanos descritos en la presente pueden comprender un gen de CD47 humanizado, como se describe en la presente, y material genético de una especie heteróloga (por ejemplo, humanos), en donde el material genético codifica, en su totalidad o en parte, una o más proteínas heterólogas seleccionadas de SIRPa (CD172a), IL-3, M-CSF, GM-CSF y TPO. Los animales no humanos descritos en la presente pueden comprender un gen de CD47 humanizado como se describe en la presente y material genético de una especie heteróloga (por ejemplo, humanos), en donde el material genético codifica, en su totalidad o en parte, una proteína SIRPa heteróloga (por ejemplo, humana) (CD 172a) . Los animales no humanos descritos en la presente pueden comprender además un gen SIRPa que comprende una porción endógena y una porción humana (por ejemplo, exones 2-4 de un gen SIRPa humano), en donde la parte humana codifica el dominio extracelular de una proteína SIRPa (por ejemplo aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362 de una proteína SIRPa humana) y la porción endógena codifica el dominio intracelular de una proteína SIRPa endógena; la porción humana y la porción endógena pueden unirse operativamente a un promotor SIRPa endógeno.
Por ejemplo, como se describe en la presente, los animales no humanos que comprenden un gen de CD47 humanizado pueden comprender, además, (por ejemplo, por medio de cruzamiento o estrategias de transformación de múltiples genes) una o más modificaciones como se describe en los documentos PCT/US2010/051339, presentado el 4 de octubre de 2010; PCT/US2013/058448, presentado 6 de septiembre de 2013;
PCT/US2013/045788, presentado el 14 de junio de 2013; PCT/US2014/056910, presentado el 23 de septiembre de 2014; PCT/US2014/060568, presentado el 15 de octubre de 2014; el PCT/US2012/025040, presentado el 14 de febrero de 2014; PCT/US2012/062379, presentado el 29 de octubre de 2012;
PCT/US2014/064806, presentado el 10 de noviembre de 2014; y PCT/US2014/064810, presentado el 10 de noviembre de 2014. Un roedor que comprende un gen de CD47 humanizado (es decir, los exones 2-7 de un gen de CD47 humano unido operativamente al exón 1 y al exón 8 (y por lo tanto a cualquiera de los exones aguas abajo) de un gen de CD47 endógeno de roedor de modo que el gen de CD47 humanizado codifique un polipéptido CD47 que tiene una porción extracelular de una proteína CD47 humana y una porción intracelular de una proteína CD47 de roedor) puede cruzarse con un roedor que comprende un gen SIRPa humanizado (por ejemplo, exones 2-4 de un gen SIRPa humano unido operativamente a los exones 1 y 5-8 de un gen SIRPa endógeno de roedor de modo que el gen SIRPa humanizado codifique un polipéptido SIRPa que tiene una porción extracelular de una proteína SIRPa humana (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 28-362) y una porción intracelular de una proteína SIRPa de roedor; ver, por ejemplo, documento PCT/US2014/056910, presentado el 23 de septiembre de 2014).
Aunque las modalidades que emplean un gen de CD47 humanizado en un ratón (es decir, un ratón con un gen de CD47 que codifica una proteína CD47 que incluye una porción humana y una porción de ratón) se analizan exhaustivamente en la presente descripción, se proporcionan, además, otros animales no humanos que comprenden un gen de CD47 humanizado. Tales animales no humanos comprenden un gen de CD47 humanizado unido operativamente a un promotor de CD47 endógeno. Tales animales no humanos pueden expresar una proteína CD47 humanizada a partir de un locus endógeno, en donde la proteína CD47 humanizada comprende los residuos de aminoácidos 16-292 (o 19-141 o 19-127) de una proteína CD47 humana. Tales animales no humanos incluyen cualquiera de los que pueden modificarse genéticamente para expresar una proteína CD47 como se describe en la presente, que incluyen, por ejemplo, mamíferos, por ejemplo, ratón, rata, conejo, cerdo, bovino (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, hurón, primate (por ejemplo, tití, mono rhesus), etcétera. Por ejemplo, para los animales no humanos donde las células ES genéticamente modificables adecuadas no están fácilmente disponibles, pueden emplearse otros métodos para producir un animal no humano que comprende la modificación genética. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la modificación de un genoma de células que no son ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y el empleo de transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) para transferir el genoma modificado genéticamente a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito enucleado, y la gestación de la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un animal no humano en condiciones adecuadas para formar un embrión.
Los métodos para la modificación del genoma de un animal no humano (por ejemplo, el genoma de un cerdo, vaca, roedor, pollo, etcétera) incluyen, por ejemplo, el empleo de una nucleasa con dedos de zinc (ZFN) o una nucleasa efectora tipo activadora de la transcripción (TALEN) para modificar un genoma que incluya un gen de CD47 humanizado.
Un animal no humano descrito en la presente puede ser un mamífero. Un animal no humano descrito en la presente, es un mamífero pequeño, por ejemplo, de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. Un animal modificado genéticamente descrito en la presente es un roedor. Un roedor descrito en la presente se selecciona de un ratón, una rata y un hámster. Un roedor descrito en la presente se selecciona de la superfamilia Muroidea. Un animal modificado genéticamente descrito en la presente es de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hámster similar a ratón), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, ratones campestres), Muridae (ratones y ratas verdaderos, jerbos, ratones espinosos, ratas crestadas), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de roca, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirones espinosos), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas de bambú, y zokor). Un roedor modificado genéticamente descrito en la presente se selecciona de un ratón o rata verdaderos (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso, y una rata crestada. Un ratón modificado genéticamente descrito en la presente es un miembro de la familia Muridae. Un animal no humano descrito en la presente es un roedor. Un roedor descrito en la presente puede seleccionarse entre un ratón y una rata. Un animal no humano descrito en la presente puede ser un ratón.
Un animal no humano descrito en la presente, puede ser un roedor que es un ratón de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, y C57BL/01a. Un ratón descrito en la presente puede ser de una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129Sl/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, por ejemplo, Festing y otros, 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. y otros, 2000, Biotechniques 29(5): 1024- 1028, 1030, 1032). Un ratón modificado genéticamente como se describe en la presente puede ser una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. Un ratón descrito en la presente, puede ser una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. Una cepa 129 de la mezcla como se describe en la presente puede ser una cepa 129S6 (129/SvEvTac). Un ratón descrito en la presente es una cepa BALB, por ejemplo, la cepa BALB/c. Un ratón descrito en la presente puede ser una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente.
Un animal no humano descrito en la presente puede ser una rata. Una rata descrita en la presente se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F6 y Dark Agouti. Una cepa de rata como se describe en la presente, puede ser una mezcla de dos o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 y Dark Agouti.
Métodos que emplean animales no humanos que tienen genes CD47 humanizados
Se han informado animales no humanos y células mutantes y transgénicos CD47 (por ejemplo, cerdos miniatura) (Koshimizu H. y otros (2014) PLoS One, 9(2):e89584; Lavender, K.J. y otros (2014) J. Immunol. Methods, 407:127-134; Tena, A. y otros (2014) Am. J. Transplant, doi: 10.1111/ajt. 12918; Lavender K.J. y otros (2013) Blood, 12(225):4013-4020; Tena, A. y otros (2012) Transplantation 94(10S):776; Wang, C. y otros (2011) Cell Transplant.
20(11-12): 1915-1920; Johansen, M.L. and Brown, E.J. (2007) J. Biol. Chem. 282:24219-24230; Wang, H. y otros (2007) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 104:13744-13749; Tulasne D. y otros (2001) Blood, 98(12):3346-52; Oldenborg,
P.y otros (2000) Science 288:2051-2054; Verdrengh, M. y otros (1999) Microbes Infect. 1(10):745-751; Chang, H.P. y otros (1999) Learn Mem. 6(5):448-457; Wang, X.Q. y otros (1999) J. Cell Biol. 147(2):389-400; Lindberg, F.P. y otros (1996) Science 274(5288):795-798). Tales animales se han empleado en una variedad de ensayos para determinar, por ejemplo, los aspectos moleculares de la expresión, función y regulación de CD47. Se han descubierto diferencias considerables entre especies. De hecho, los ratones inmunodeficientes combinados graves/diabéticos no obesos (NOD/SCID) expresan una proteína SIRPa que es capaz de interactuar con CD47 humano y, por lo tanto, se han usado ampliamente para el desarrollo de modelos de ratón con componentes del sistema inmunitario humano (por ejemplo, ver Takenaka, K. y otros (2007) Nat. Immunol. 8(120:1313-1323). El alelo SIRPa presente en estos ratones no es representativo del alelo SIRPa presente en otras cepas de ratón y, generalmente, hay poca reacción cruzada entre CD47 y SIRPa entre especies. Además, se ha informado que CD47 en células de ratón tiene una movilidad casi completa, mientras que CD47 en células humanas demuestra solo aproximadamente 30-40 % (Bruce, L. y otros (2003) Blood 101:4180-4188; Mouro-Chanteloup, L. y otros (2000) VoxSanguinis 78:P030; Mouro-Chanteloup, L. y otros (2003) Blood 101:338-344). Por tanto, los ratones NOD/SCID no están exentos de limitaciones. Por ejemplo, aunque el desarrollo hematopoyético humano de múltiples linajes puede apoyarse en algunos fondos genéticos (por ejemplo, BALB^ Rag2'/' IL-2Ryc/'), la homeostasis de otros tipos de células sigue siendo ineficaz (por ejemplo, células T y NK; ver por ejemplo, Gimeno, R. y otros (2004) Blood 104:3886-3893; Traggiai, E. y otros. (2004) Science 304:104-107; Legrand, N. y otros (2006) Blood 108:238-245). Adicionalmente, se sabe además que CD47 interactúa con otras proteínas de la superficie celular y proporciona señalización bidireccional. Por lo tanto, los ratones existentes representan un sistema in vivo ineficaz para elucidar las funciones dependientes de CD47 en diversos procesos biológicos como, por ejemplo, el injerto y la fagocitosis. Además, los ratones existentes representan un sistema in vivo subóptimo para el desarrollo de terapias orientadas a CD47.
Los animales no humanos descritos en la presente proporcionan un sistema in vivo mejorado y una fuente de materiales biológicos (por ejemplo, células) que expresan CD47 humana, los cuales son útiles para una variedad de ensayos. Los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse para desarrollar agentes terapéuticos que se orienten a CD47 y/o modulen la señalización de CD47-SIRPa. Los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse para seleccionar y desarrollar candidatos a agentes terapéuticos (por ejemplo, anticuerpos) que se unan a la proteína CD47 humana. Los animales no humanos descritos en la presente, pueden usarse para seleccionar y desarrollar candidatos a agentes terapéuticos (por ejemplo, anticuerpos) que bloqueen la interacción de CD47 humana con SIRPa humana. Los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse para determinar el perfil de unión de antagonistas y/o agonistas de un CD47 humanizado en la superficie de una célula de un animal no humano como se describe en la presente. Los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse para determinar el epítopo o epítopos de uno o más candidatos a anticuerpos terapéuticos que se unan a CD47 humana.
Los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse para determinar los perfiles farmacocinéticos de los anticuerpos anti-CD47. Uno o más animales no humanos descritos en la presente y uno o más animales no humanos de control o de referencia cada uno se exponen a uno o más candidatos a anticuerpos terapéuticos anti-CD47 a diversas dosis (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, o 50 mg/kg o más). Los candidatos a anticuerpos terapéuticos pueden dosificarse mediante cualquier vía de administración deseada (por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, etc.). La sangre se aísla de los animales no humanos (humanizados y control) en diversos puntos de tiempo (por ejemplo, 0 h, 6 h, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, o hasta 30 o más días). Diversos ensayos pueden realizarse para determinar los perfiles farmacocinéticos de los candidatos a anticuerpos terapéuticos administrados mediante el uso de muestras obtenidas a partir de animales no humanos como se describen en la presente descripción, que incluyen, pero no se limitan a, IgG total, respuesta contra el anticuerpo terapéutico, aglutinación, etcétera.
Los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse para medir el efecto terapéutico del bloqueo o la modulación de la señalización de CD47 y el efecto sobre la expresión génica como un resultado de los cambios celulares. Un animal no humano descrito en la presente o células aisladas del mismo pueden exponerse a un candidato a agente terapéutico que se una a una proteína CD47 humanizada (o una porción de una proteína CD47 humana) en la superficie de una célula del animal no humano y, después un período de tiempo posterior, analizarse para determinar los efectos sobre los procesos dependientes de CD47, por ejemplo, adhesión, angiogénesis, apoptosis, inflamación, migración, fagocitosis, proliferación y eliminación de tumores (o células tumorales).
Los animales no humanos descritos en la presente pueden expresar la proteína CD47 humanizada, por tanto pueden generarse células, líneas celulares, y cultivos celulares que sirven como fuente de proteína CD47 humanizada para su uso en ensayos funcionales y de unión, por ejemplo, para evaluar la unión o función de un antagonista o agonista de CD47, particularmente cuando el antagonista o agonista es específico para una secuencia o epítopo de la proteína SIRPa humana. Los epítopos CD47 que se unen por candidatos a anticuerpos terapéuticos pueden determinarse mediante el uso de células aisladas de animales no humanos descritos en la presente.
Las células de los animales no humanos descritos en la presente pueden aislarse y usarse sobre una base ad hoc, o pueden mantenerse en cultivo por muchas generaciones. Las células de un animal no humano descritas en la presente pueden inmortalizarse y mantenerse en cultivo indefinidamente (por ejemplo, en cultivos en serie).
Las células y/o los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse en un ensayo de supervivencia y/o proliferación (por ejemplo, que emplean células T o B) para seleccionar y desarrollar candidatos a agentes terapéuticos que modulan la señalización de CD47 humana. La activación o pérdida de CD47 puede desempeñar una función importante en la regulación de la proliferación celular, y la inducción de apotosis mediante CD47 puede resultar de la activación de epitopos específicos del dominio extracelular de CD47, por tanto los candidatos a moduladores de CD47 (por ejemplo, antagonistas o agonistas), pueden identificarse, caracterizarse y desarrollarse con el uso de células de animales no humanos descritos en la presente y/o un animal no humano como se describe en la presente. Las células y/o los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse en ensayo(s) de supervivencia o muerte para determinar el efecto sobre la proliferación o la apoptosis de una(s) célula(s) específica(s) (por ejemplo, células cancerosas) en presencia y ausencia de CD47.
Las células y/o los animales no humanos descritos en la presente se usan en el xenotrasplante de células heterólogas (por ejemplo, humanas) para determinar las funciones mediadas por CD47 en la respuesta fisiológica (por ejemplo, inmunitaria) a las células humanas trasplantadas. Los candidatos a agentes terapéuticos que unen, o bloquean una o más funciones de, CD47 humana pueden caracterizarse en un animal no humano, descrito en la presente. Las mediciones adecuadas incluyen diversos ensayos celulares, ensayos de proliferación, análisis de inmunoglobulinas séricas (por ejemplo, titulación de anticuerpos), ensayos de citotoxicidad, y caracterización de las interacciones entre ligando y receptor (ensayos de inmunoprecipitación). Los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse para caracterizar las funciones mediadas por CD47 en la regulación de una respuesta inmunitaria a un antígeno. El antígeno puede estar asociado con una neoplasia. El antígeno puede estar asociado con una enfermedad o afección autoinmunitaria. El antígeno puede ser una diana asociada con una enfermedad o afección que padecen uno o más pacientes humanos que necesitan tratamiento.
Los animales no humanos descritos en la presente, pueden usarse en experimentos de trasplante o transferencia adoptiva para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de CD47 de linfocitos nuevos y su función inmunitaria. Los animales no humanos descritos en la presente pueden trasplantarse con células B humanas.
Las células de los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse en un ensayo de migración y distribución de células para seleccionar y desarrollar candidatos a agentes terapéuticos que modulen la CD47 humana. Tales procesos son necesarios para muchos procesos celulares, que incluyen la cicatrización, diferenciación, proliferación y supervivencia de heridas.
Las células de animales no humanos descritas en la presente pueden usarse en ensayos de fagocitosis para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación de la fagocitosis dependiente de CD47.
Las células de los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse en ensayos de crecimiento (o proliferación) de células tumorales para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación y/o la apoptosis de células tumorales, dependiente de CD47.
Una enfermedad o afección inflamatoria puede inducirse en uno o más animales no humanos descritos en la presente para proporcionar un sistema in vivo para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de CD47 de una o más funciones de la enfermedad o afección inflamatoria. La enfermedad o afección inflamatoria puede estar asociada con una neoplasia.
Puede inducirse una afección anti-angiogénica en uno o más animales no humanos descritos en la presente para proporcionar un sistema in vivo para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de CD47 de una o más funciones de la condición anti-angiogénica. Las funciones ilustrativas que pueden evaluarse para determinar la eficacia terapéutica incluyen la expresión de quimiocinas, respuestas estimuladas por óxido nítrico (NO) y recuperación del flujo sanguíneo.
Los animales no humanos descritos en la presente pueden proporcionar un sistema in vivo para el análisis y prueba de un fármaco o vacuna. Un candidato a fármaco o vacuna puede suministrarse a uno o más animales no humanos descritos en la presente, seguido del control de los animales no humanos para determinar una o más respuestas inmunitarias frente al fármaco o vacuna, el perfil de seguridad del fármaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afección. Los métodos ilustrativos usados para determinar el perfil de seguridad incluyen mediciones de toxicidad, concentración de dosis óptima, eficacia del fármaco o vacuna, y posibles factores de riesgo. Tales fármacos o vacunas pueden mejorarse y/o desarrollarse en tales animales no humanos.
Los animales no humanos descritos en la presente pueden proporcionar un sistema in vivo para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a CD47 humana. Un fármaco dirigido a CD47 humana puede suministrarse o administrarse a uno o más animales no humanos descritos en la presente, seguido del control de los animales no humanos (o células aisladas a partir de estos), o la realización de uno o más ensayos en estos, para determinar el efecto del fármaco sobre el animal no humano. Las propiedades farmacocinéticas incluyen, pero no se limitan a, la manera en que un animal procesa el fármaco hacia diversos metabolitos (o detección de la presencia o ausencia de uno o más metabolitos del fármaco, que incluyen, metabolitos tóxicos), tiempo de vida media del fármaco, niveles circulantes del fármaco después de su administración (por ejemplo, concentración sérica del fármaco), respuesta contra el fármaco (por ejemplo, anticuerpos contra el fármaco), absorción y distribución del fármaco, vía de administración, vías de excreción y/o eliminación del fármaco. Las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los fármacos (por ejemplo, moduladores de CD47) se controlan en o a través del uso de los animales no humanos descritos en la presente.
Los animales no humanos de la presente invención proporcionan un sistema in vivo para evaluar la toxicidad por unión a la diana de un fármaco dirigido a CD47 humano. Un fármaco dirigido a CD47 humano puede suministrarse o administrarse a uno o más animales no humanos descritos en la presente, seguido del control de los animales no humanos (o células aisladas a partir de estos), o la realización de uno o más ensayos en estos, para determinar el efecto tóxico por unión a la diana del fármaco en el animal no humano. Típicamente, los fármacos se destinan a modular una o más funciones de sus dianas. Para proporcionar un ejemplo, un modulador de CD47 se destina a modular funciones mediadas por CD47 (por ejemplo, transducción de señales de CD47) a través de su interacción de alguna manera con la molécula CD47 en la superficie de una o más células. Un modulador de este tipo puede tener un efecto adverso que es una exageración de la(s) acción(es) farmacológica(s) deseada(s) del modulador. Tales efectos se denominan efectos por unión a la diana. Los efectos por unión a la diana ilustrativos incluyen una dosis demasiado elevada, activación/inactivación crónica, y acción correcta en un tejido incorrecto. Los efectos por unión a la diana de un fármaco dirigido a CD47 identificados en los animales no humanos descritos en la presente, o a través del uso de estos, se usan para determinar una(s) función(es) de CD47 previamente desconocida(s).
Los animales no humanos descritos en la presente proporcionan un sistema in vivo para evaluar la toxicidad por unión fuera de la diana de un fármaco dirigido a CD47 humano. Un fármaco dirigido a CD47 humano puede suministrarse o administrarse a uno o más animales no humanos descritos en la presente, seguido del control de los animales no humanos (o células aisladas a partir de estos), o la realización de uno o más ensayos en estos, para determinar el efecto tóxico por unión fuera de la diana del fármaco en el animal no humano. Los efectos por unión fuera de la diana pueden producirse cuando un fármaco interactúa con una diana no prevista (por ejemplo, reactividad cruzada a un epítopo común). Tales interacciones pueden producirse en un tejido previsto o no previsto. Para proporcionar un ejemplo, los isómeros especulares (enantiómeros) de un fármaco pueden conducir a efectos tóxicos por unión fuera de la diana. Además, un fármaco puede interactuar de manera inadecuada con diferentes subtipos de receptores y activarlos de manera no intencional. Los efectos por unión fuera de la diana ilustrativos incluyen la activación/inhibición incorrecta de una diana incorrecta independientemente del tejido en el que se encuentra la diana incorrecta. Los efectos por unión fuera de la diana de un fármaco dirigido a c D47 humano se determinan mediante la comparación de los efectos de la administración del fármaco a los animales no humanos descritos en la presente con uno o más animales no humanos de referencia.
La realización de un ensayo puede incluir la determinación del efecto sobre el fenotipo (por ejemplo cambio en el peso corporal) y/o el genotipo del animal no humano al que se administra el fármaco. La realización de un ensayo puede incluir la determinación de la variabilidad lote a lote de un modulador de CD47 (por ejemplo, un antagonista o un agonista). La realización de un ensayo puede incluir la determinación de las diferencias entre los efectos de un fármaco dirigido a CD47 administrado a un animal no humano descrito en la presente y a un animal no humano de referencia. Los animales no humanos de referencia pueden tener una modificación como se describe en la presente, una modificación que es diferente a como se describe en la presente (por ejemplo, una que tiene una interrupción, deleción o un gen de CD47 no funcional de cualquier otra manera) o puede no tener modificaciones (es decir, un animal no humano de tipo silvestre).
Los parámetros ilustrativos que pueden medirse en animales no humanos (o en células aisladas a partir de ellos y/o con el uso de éstas) para evaluar las propiedades farmacocinéticas, la toxicidad por unión a la diana, y/o la toxicidad por unión fuera de la diana de un fármaco dirigido a la proteína CD47 humana incluyen, pero sin limitarse a, aglutinación, autofagia, división celular, muerte celular, hemólisis mediada por complemento, integridad del ADN, título de anticuerpos específicos para el fármaco, metabolismo del fármaco, arreglos de expresión génica, actividad metabólica, actividad mitocondrial, estrés oxidativo, fagocitosis, biosíntesis de proteínas, degradación de proteínas, secreción de proteínas, respuesta al estrés, concentración del fármaco en el tejido diana, concentración del fármaco en tejido que no es diana, actividad transcripcional y similares. Los animales no humanos como se describen en la presente se pueden usar para determinar una dosis con eficacia farmacéutica de un modulador de CD47.
Los animales no humanos descritos en la presente proporcionan un sistema in vivo mejorado para el desarrollo y caracterización de candidatos a agentes terapéuticos para su uso en cáncer. Los animales no humanos descritos en la presente pueden implantarse con un tumor, seguido de la administración de uno o más candidatos a agentes terapéuticos. Los candidatos a agentes terapéuticos pueden incluir un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) o un cóctel de anticuerpos; los candidatos a agentes terapéuticos pueden incluir una terapia de combinación tal como, por ejemplo, la administración de anticuerpos monoespecíficos dosificados de manera secuencial o simultánea. El tumor puede dejarse durante el tiempo suficiente para su establecimiento en uno o más sitios dentro del animal no humano. La proliferación, crecimiento, supervivencia, etcétera de las células tumorales puede medirse antes y después de la administración con el(los) candidato(s) a agente(s) terapéutico(s). La citotoxicidad de los candidatos a agentes terapéuticos puede medirse, además, en el animal no humano según sea conveniente.
Los animales no humanos descritos en la presente pueden proporcionar sistema in vivo mejorado que aclara los mecanismos de interacción humana célula con célula mediante la transferencia adoptiva. Los animales no humanos descritos en la presente pueden implantarse con un xenoinjerto tumoral, seguido de una segunda implantación de linfocitos infiltrantes de tumor que podrían implantarse mediante transferencia adoptiva para determinar la eficacia en la erradicación de tumores sólidos u otras neoplasias malignas. Tales experimentos pueden realizarse con células humanas debido a la presencia exclusiva de CD47 humano sin competencia con CD47 endógeno del animal no humano. Alternativamente, tales experimentos pueden incluir el uso de células de ratón de un fondo NOD/SCID o BRG (BALB/c Rag2-/- IL- 2Ryc-/-). Además, las terapias y productos farmacéuticos para su uso en xenotrasplantes pueden mejorarse y/o desarrollarse en tales animales no humanos.
Los animales no humanos descritos en la presente pueden proporcionar un sistema in vivo mejorado de mantenimiento y desarrollo de células madre hematopoyéticas humanas mediante injerto. Los animales no humanos descritos en la presente pueden proporcionar un mejor desarrollo y mantenimiento de las células madre humanas dentro del animal no humano. Pueden observarse poblaciones aumentadas de células B y T humanas diferenciadas en la sangre, la médula ósea, el bazo y el timo del animal no humano. Puede observarse una homeostasis óptima de las células T y NK en las células de la sangre, la médula ósea, el bazo y el timo del animal no humano. Los animales no humanos descritos en la presente pueden demostrar un aumento en el nivel o la cantidad de glóbulos rojos (RBC) en comparación con uno o más animales no humanos de referencia.
Los animales no humanos descritos en la presente pueden emplearse para evaluar la eficacia de un fármaco terapéutico dirigido a células humanas. Un animal no humano descrito en la presente puede trasplantarse con células humanas, y un candidato a fármaco dirigido a tales células humanas se administra a dicho animal no humano. Después se determina la eficacia terapéutica del fármaco mediante el control de las células humanas en el animal no humano después de la administración del fármaco. Los fármacos que pueden evaluarse en los animales no humanos incluyen compuestos de molécula pequeña, es decir, compuestos de pesos moleculares menores que 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD u 800 Dalton, y compuestos moleculares grandes (tales como proteínas, por ejemplo, anticuerpos), que tienen efectos terapéuticos previstos para el tratamiento de enfermedades y afecciones humanas al dirigirse a células humanas (por ejemplo, unión a ellas y/o acción sobre ellas).
El fármaco es un fármaco contra el cáncer y las células humanas son células cancerosas que pueden ser células de un cáncer primario o células de líneas celulares establecidas a partir de un cáncer primario. En estos casos, un animal no humano descrito en la presente puede trasplantarse con células cancerosas humanas, y se le suministra un fármaco contra el cáncer al animal no humano. La eficacia del fármaco puede determinarse al evaluar si el crecimiento o la metástasis de las células cancerosas humanas en el animal no humano se inhibe como resultado de la administración del fármaco.
El fármaco contra el cáncer es una molécula de anticuerpo, que se une a un antígeno en células cancerosas humanas. El fármaco contra el cáncer es un anticuerpo biespecífico que se une a un antígeno en células cancerosas humanas, y a un antígeno en otras células humanas, por ejemplo, células del sistema inmunitario humano (o"células inmunitarias humanas") tales como células B y células T.
Un animal no humano descrito en la presente puede injertarse con células inmunitarias humanas o células que se diferencian en células inmunitarias humanas. Tal animal no humano con células inmunitarias humanas injertadas se trasplanta con células cancerosas humanas y se le administra un fármaco contra el cáncer, como un anticuerpo biespecífico que se une a un antígeno en células cancerosas humanas y a un antígeno en células inmunitarias humanas. (por ejemplo, células T). La eficacia terapéutica del anticuerpo biespecífico puede evaluarse en base a su capacidad para inhibir el crecimiento o la metástasis de las células cancerosas humanas en el animal no humano. El animal no humano descrito en la presente puede injertarse con células progenitoras hematopoyéticas humanas CD34+ que dan lugar a células inmunitarias humanas (que incluyen células T, células B, células n K, entre otras). Las células de linfoma de células B humanas (por ejemplo, las células Raji) se trasplantan a dicho animal no humano con células inmunitarias humanas injertadas, que después se administran con un anticuerpo biespecífico que se une al antígeno tumoral (por ejemplo, un antígeno en células B normales y ciertas neoplasias malignas de células B tales como CD20) y a la subunidad CD3 del receptor de células T, para probar la capacidad del anticuerpo biespecífico para inhibir el crecimiento tumoral en el animal no humano.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la técnica cómo hacer y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. A menos que se indique de cualquier otra manera, la temperatura se indica en Celsius, y la presión es la atmosférica o cercana a la atmosférica.
Ejemplo 1. Humanización de un gen endógeno del grupo de diferenciación 47 (CD47).
Este ejemplo ejemplifica métodos ilustrativos para la humanización de un gen endógeno que codifica el grupo de diferenciación 47 (CD47) en un mamífero humano tal como un roedor (por ejemplo, un ratón). Los métodos descritos en este ejemplo pueden emplearse para humanizar un gen de CD47 endógeno de un animal no humano con el uso de cualquier secuencia, o combinación de secuencias humanas (o fragmentos de secuencias) según convenga. En este ejemplo, se emplea un gen de CD47 humano que aparece en el clon RP11- 69A17 del cromosoma artificial bacteriano (BAC) para humanizar un gen de CD47 endógeno de un ratón.
Se construyó un vector de transformación para la humanización del material genético que codifica un dominio N-terminal extracelular de IgV y cinco dominios transmembrana de un gen de CD47 endógeno mediante el uso de la tecnología VELOCIGENE® (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 6,586,251 y Valenzuela y otros (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.
21(6):652-659).
Brevemente, se modificó el clon RP23-230L20 del cromosoma artificial bacteriano (BAC) de ratón (Invitrogen) para eliminar la secuencia que contiene los exones 2-7 de un gen CD47 endógeno e insertar los exones 2-7 de un gen CD47 humano utilizando el clon RP11-69A17 de BAC humano (Invitrogen), que codifica los aminoácidos 16-292 de un polipéptido CD47 humano. Se retuvo el ADN endógeno que contenía el ADN genómico correspondiente a los exones 1, 8 y 9 de la isoforma 2, así como también las regiones no traducidas (UTR) 5' y 3'. El análisis de secuencia de la secuencia de CD47 humano contenida en el clon RP11-69A17 de BAC confirmó todos los exones de CD47 y las señales de corte y empalme. El análisis de secuencia reveló que la secuencia coincidía con el genoma de referencia y los transcritos de c D47 NM_001777.3 y NM_198793.2. El A d N genómico correspondiente a los exones 2-7 de un gen de CD47 endógeno (-30,8 kb) se reemplazó en el clon RP23-230L20 de BAC mediante recombinación homóloga en células bacterianas para insertar un fragmento de ADN que contenía -23,9 kb de ADN genómico humano correspondiente a los exones 2-7 de un gen de CD47 humano del clon RP1 1-69A17 y -4995 pb de BAC correspondiente a un casete de neomicina de autodelección flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa (/oxP-hUbl-em7-Neo-pA-mPrml-Crei-/oxP; ver las patentes de Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392 and 8,354,389). El casete de neomicina de autodeleción se añadió al final del fragmento de ADN humano de -23,9 kb que contienía los exones 2-7 del gen de CD47 humano (Figura 2). El vector de transformación resultante contenía, de 5' a 3', un brazo de homología en 5' que contienía -39 kb de ADN genómico de ratón del clon RP23-230N20 de BAC, -29,3 kb de ADN genómico humano del clon RP11-69A17 de BAC (que contenía los exones 2-7 de un gen de CD47 humano), un casete de neomicina de autodeleción flanqueado por sitios loxP, y -98,8 kb de ADN genómico de ratón del clon RP23-230L20 de BAC. Después de la recombinación homóloga en células bacterianas con el vector de transformación descrito anteriormente, se creó un clon RP23-230L20 BAC modificado que resultó en un gen de CD47 humanizado que contenía una 5' UTR de ratón, un exón 1 de ratón, exones humanos 2-7, exones de ratón 8-9 y una 3' UTR de ratón. Las secuencias de proteínas de cuatro isoformas proyectadas alternativamente con corte y empalme de CD47 humanizado se proporcionan en la Tabla 3 que indican los aminoácidos de ratón y humanos resultantes codificados por el ADN de ratón y humano, respectivamente.
El clon BAC modificado descrito anteriormente se usó para electroporar células madre embrionarias (ES) de ratón F1H4 (50 % 129/S6/SvEv/Tac, 50 % C57BL/6NTac; Auerbach, W. y otros (2000) Biotechniques 29 (5): 1024-8, 1030, 1032) para crear células ES modificadas que comprenden un gen de CD47 endógeno que se humaniza a partir de los exones 2-7. Las células ES transformadas positivamente que contenían un gen de CD47 humanizado se identificaron mediante un ensayo (Valenzuela y otros, supra) que detectó la presencia de las secuencias de CD47 humano (por ejemplo, los exones 2-7) y confirmó la deleción y/o retención de las secuencias de CD47 de ratón (por ejemplo, exones 1, 8 y 9 y/o los exones 2-7). La Tabla 4 expone los cebadores y sondas que se usaron para confirmar la humanización de un gen de CD47 endógeno como se describió anteriormente (Figura 3). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción aguas arriba incluyó lo siguiente, que indica la secuencia endógena de ratón aguas arriba del punto de inserción (contenida dentro del paréntesis más abajo con un sitio de restricción AsiSI en cursiva) unido de manera contigua a la secuencia de CD47 humano presente en el punto de inserción: (GCAGACATGA TTACTTCAGA GCTTTCAAAG CTAGATACTG TACCTTGCAT ATTCCAACAC) GCGATCGC ATTTTAAGAT TTTCCATCCT AGTGGAAAGA TATGATTTGA TTCATCCTAT TTACTTTGTA T ATT A A AGT A CAGTAGAACC TGCCACTTTT (SEQ ID NO: 33). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción aguas abajo en el extremo 5' del casete de neomicina de autodeleción incluyó lo siguiente, que indica la secuencia genómica de CD47 humano contigua a la secuencia del casete aguas abajo del punto de inserción (contenida dentro del paréntesis de abajo con la secuencia loxP en cursiva): GGATCCATTT TAAGTAATAG AATAGGATTT TTAATTGTTC CAGTGTTTCT GTGATAGAGC TGTCCTGCAC AGACCTGTTT (CTCGAG4 TAA CTTCGTATAA TGTATGCTATACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG) (SEQ ID NO: 34). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción aguas abajo en el extremo 3' del casete de neomicina incluyó lo siguiente, que indica la secuencia del casete contigua a la secuencia genómica de ratón 3' del exón 7 de un gen de CD47 endógeno (contenida dentro del paréntesis inferior con la secuencia loxP en cursiva): CATGTCTGGA ATAACTTCGTATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGT AACTATAACG GTCCTAAGGT AGCGACTAGC (ATTAGTATGG AAGGTCCGTC CACTGTCCAG GTTCCTCTTG CGGAGCTCTT TGTCTCTCTG GACTCTGTAT ACACTGCTTG) (SEQ ID NO: 35). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción aguas abajo después de la deleción del casete de neomicina (76 pb restantes) incluyó lo siguiente, que indica la secuencia genómica humana y de ratón yuxtapuestas con la secuencia de loxP restante del casete (contenida dentro de los paréntesis siguientes con la secuencia de loxP en cursiva): GGATCCATTT T A AGT A AT AG AATAGGATTT TTAATTGTTC CAGTGTTTCT GTGATAGAGC TGTCCTGCAC AGACCTGTTT (CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTATGCTAGTAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG ACTAGC)ATT AGT AT GG A AG GTCCGTCCAC TGTCCAGGTT CCTCTTGCGG AGCTCTTTGT CTCTCTGGAC TCTGTATACA CTGCTTGCAT (SEQ ID NO: 36).
Los clones de células ES positivos se utilizaron entonces para implantar ratones hembra mediante el uso del método VELOCIMOUSE® (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 7,294,754 y Poueymirou y otros, F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, 2007, Nature Biotech. 25(l):91 -99) para generar una camada de crías que contiene una inserción de los exones 2-7 de un gen de CD47 humano en un gen de CD47 endógeno de un ratón. Los ratones que portaban la humanización de los exones 2-7 de un gen de CD47 endógeno se confirmaron e identificaron de nuevo mediante el genotipado del ADN aislado de los recortes de la cola mediante el uso de una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela y otros, supra) que detectó la presencia de las secuencias del gen de CD47 humano. Las crías se genotipifican y las cohortes de animales heterocigotos para el constructo del gen de CD47 humanizado se seleccionan para su caracterización.
___________TABLA 4________________
Nombre Cebador Secuencia (5'-3')
Directo TGC AGA AGTC ACTAGGAGGAAT (SEQ ID NO:21)
7190mTU Sonda TC AGI C A ACTTCTTCTGGGTTGTTT (SEQ ID NO:22)
CC_______________________________
Inverso
Figure imgf000048_0001
(SEQ ID NO:23)
Directo TGCTCCCAATATACGGCTTCTG | (SEQ ID NO:24)
C AGCTCT CAT AGCCA ACTATGGTG
7190mTD Sonda (SEQ ID NO:25)
CC______________________________
Inverso TCAAÜCAGAGCCTGGTTATCTG | (SEQ ID NO:26)
Directo GTCGTCATTCCAT GCTTT GTT AC | (SEQ ID NO:27)
TGGAGGCACAAAACACT ACTGAAG
7190hTU Sonda (SEQ ID NO:28)
TATACG__________________________
Inverso (SEQ ID NO:29)
Directo
Figure imgf000048_0002
(SEQ ID NO:30)
AGCACCCAAAC t g a t a t g c c t g t A
7190hTD Sonda (SEQ ID NO:31)
T 1TG __________________________________
Inverso
Figure imgf000048_0003
(SEQ ID NO:32)
Ejemplo 2. Expresión del polipéptido CD47 humanizado por glóbulos rojos de ratón.
Este Ejemplo demuestra que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados para contener un gen de CD47 humanizado de acuerdo con el Ejemplo 1 se puede usar para seleccionar moduladores de CD47 (por ejemplo, anticuerpos anti-CD47) y determinar varias características tales como, por ejemplo, los perfiles farmacocinéticos y de seguridad. En este Ejemplo, se seleccionan varios anticuerpos anti-CD47 en glóbulos rojos de ratón (RBC) aislados de roedores preparados de acuerdo con el Ejemplo 1, roedores que expresan un polipéptido CD47 humanizado como se describe en la presente.
Brevemente, se transfirieron 2 mL de sangre completa de ratones CD47 humanizados (n=2) a un tubo de 15 mL y se centrifugaron a 200xg durante 10 minutos a 4 °C. Se aspiraron el plasma y la capa leucocitaria y después se añadieron 15 mL de PBS y las células se mezclaron suavemente. La mezcla se centrifugó de nuevo a 200xg durante cinco minutos a 4 °C. Se aspiró el sobrenadante y las células se lavaron dos veces más. Los glóbulos rojos sedimentados se resuspendieron hasta un volumen final en 10 mL de PBS. Los glóbulos rojos resuspendidos se centrifugaron por última vez a 200xg durante 10 minutos a 4 °C. El volumen de glóbulos rojos empaquetados se estimó en 0,5 mL y se diluyó a una concentración de 0,5 % con PBS (0,5 mL de glóbulos rojos empaquetados/100 mL de PBS). La concentración real de RBC se determinó con un Cellometer Auto T4 (1,5x107/ mL; Nexcelom Bioscience).
Se añadieron ochenta (80) pL de RBC de ratón al 0,5 % a cada pocilio de una placa de fondo en V de 96 pocilios. Se añadieron anticuerpos anti-CD47 en cada pocillo (20 pL a 33 nM). La placa se golpeó suavemente para mezclar y se incubó en hielo durante 30 minutos. Después, la placa se lavó dos veces con tampón de tinción (PBS con FBS al 2 %). El anticuerpo secundario Fab-488 (anti-IgG humana de ratón AffiniPure conjugado con Alexa Fluor 488, fragmento específico F(ab')2, Jackson Immuno Research) se añadió a cada pocillo a una concentración de 10 pg/mL. La placa se incubó de nuevo en hielo durante 30 minutos, seguido de un lavado una vez con tampón de tinción. Las células de cada pocillo se resuspendieron en 200 pL de tampón de tinción y se filtraron a través de una placa de filtro de 96 pocillos. Las células de la placa se analizaron mediante el uso del sistema BD ACCURI™ C6 (BD Biosciences). Los resultados ilustrativos se muestran en la Figura 4. La intensidad de fluorescencia media (MFI) por encima del control de isotipo para cada anticuerpo probado se muestra en la Tabla 5.
TABLA 5
Anticuerpo MFI Veces por encima del control de
isotipo
Ab A, hIgG4s 28898 258
Ab B, hIgG4s 27545 246
Ab C, hIgG4s 24620 220
Ab D, hlgGI 29882 267
Ab E, hIgG4 33423 298
Control, hIgG4s 112 -
Control, hIgG4 112 -
hIgG4s: IgG4 humana con región Fc modificada que tiene una función efectora reducida
Como se muestra en la Figura 4, todos los anticuerpos anti-CD47 se unieron a los RBC de ratones CD47 humanizados. Tomado en conjunto, este ejemplo demuestra que (1) los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados genéticamente para contener un gen de CD47 humanizado como se describe en la presente, expresan un polipéptido CD47 humanizado en la superficie de las células (por ejemplo, de los RBC) del animal no humano y (2) tales células son útiles para seleccionar moduladores de c D47 (por ejemplo, anticuerpos CD47) y determinar los perfiles farmacocinéticos de tales moduladores.
Ejemplo 3. Hemaglutinación de glóbulos rojos de ratón que expresan polipéptido CD47 humanizado.
Este Ejemplo demuestra además que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados para contener un gen de CD47 humanizado de acuerdo con el Ejemplo 1, pueden usarse en diversos ensayos (por ejemplo, el ensayo de hemaglutinación) para seleccionar moduladores de CD47 (por ejemplo, enticuerpos anti-CD47) y determinar diversas características tal como, por ejemplo, los perfiles farmacocinético y de seguridad. En este ejemplo, se seleccionan varios anticuerpos anti-CD47 en glóbulos rojos de ratón (RBC) que expresan un polipéptido CD47 humanizado como se describe en la presente, para determinar la concentración de anticuerpos que promueve la hemaglutinación.
Brevemente, se prepararon glóbulos rojos de ratones CD47 de tipo silvestre y humanizados (n=2) como se describió en el Ejemplo 2. Se añadieron veinte (20) pL de anticuerpo anti-CD47 (a una dilución en serie de 5 veces) en los pocillos 1-12 a través de una placa con fondo en V de 96 pocillos, seguido de la adición de 80 pL de glóbulos rojos de ratón al 0,5 % a todos los pocillos de la placa. Las placas se golpearon suavemente para mezclar y se incubaron a temperatura ambiente (24-27 °C) durante 30 minutos. El punto final de aglutinación se observó visualmente (es decir, los RBC se depositan en el fondo en las muestras negativas, mientras que los RBC se aglutinan en las muestras positivas). Los resultados ilustrativos se muestran en la Figura 5, con recuadros para delinear los pocillos que muestran hemaglutinación.
Como se muestra en la Figura 5, solo la lectina causó aglutinación en ratones de tipo silvestre. Sin embargo, dos anticuerpos anti-CD47 (Ab E y Ab C) además de la lectina indujeron la aglutinación en los RBC de dos roedores CD47 humanizados preparados de acuerdo con el Ejemplo 1. La concentración a la que estos dos anticuerpos indujeron la aglutinación comenzó a partir de 11 nM. Tomado en conjunto, este Ejemplo demuestra que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados genéticamente para contener un gen de CD47 humanizado como se describe en la presente, pueden usarse para evaluar una o más propiedades (por ejemplo, hemaglutinación) de moduladores de CD47 (por ejemplo, anticuerpos CD47).
Ejemplo 4. Aclaramiento farmacocinético de moduladores de CD47 en roedores CD47 humanizados.
Este Ejemplo ilustra un método para evaluar el aclaramiento farmacocinético de moduladores de CD47 (por ejemplo, anticuerpos anti-CD47) en animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados para contener un gen de CD47 humanizado de acuerdo con el Ejemplo 1. En este Ejemplo, se administraron anticuerpos anti-CD47 a roedores CD47 de tipo silvestre y humanizados (por ejemplo, ratones) y se determinaron los niveles séricos de anticuerpos mediante el uso de un ensayo ELISA.
Brevemente, a los ratones de tipo silvestre (n=5) o a los homocigotos para CD47 humanizado (n=5; como se describió anteriormente) se les administraron cuatro anticuerpos anti-CD47 (Ab F, Ab G,Ab Hand Ab I) y un anticuerpo de control de isotipo IgG4s (IgG4s). Los fondos genéticos de los ratones fueron 75 % CD57BL/6 y 25 % 129Sv. Cada anticuerpo se probó en cinco roedores CD47 humanizados. Todos los anticuerpos se administraron por vía subcutánea a una dosis de 50 mg/kg. Se recogió un sangrado previo un día antes de la administración del anticuerpo (día 0). Las hemorragias posteriores a la inyección se recogieron a las 6 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 7 días, 10 días y 14 días. Las fracciones de suero de las hemorragias se separaron y se sometieron a análisis de anticuerpos humanos totales mediante el uso de un inmunoensayo ELISA.
Brevemente, se recubrió un anticuerpo policlonal IgG antihumano de cabra (Jackson ImmunoResearch) sobre placas de 96 pocillos para capturar los anticuerpos humanos probados en los sueros, y después se detectaron los anticuerpos unidos a la placa mediante eluso de un anticuerpo policlonal IgG antihumano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch) y sustrato TMB (BD Pharmingen). Las muestras de suero estaban en diluciones seriadas de seis dosis y estándares de referencia de los respectivos anticuerpos en diluciones seriadas de 12 dosis. Las concentraciones de anticuerpos del fármaco en el suero se calcularon en base a la curva estándar de referencia generada mediante eñ uso del software Graphpad Prism. Los resultados ilustrativos se muestran en la Figura 6 y la Tabla 6.
Los datos demostraron que los anticuerpos administrados a ratones de tipo silvestre y humanizados como se describe en la presente, fueron bien tolerados. Tomado en conjunto, este Ejemplo demuestra que los animales no humanos descritos en la presente, pueden usarse para evaluar una o más propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a CD47 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD47) tal como, por ejemplo, niveles de fármaco circulantes. Además, los animales no humanos descritos en la presente, pueden usarse para evaluar la toxicidad de un fármaco que se dirige a CD47 mediante la determinación de los efectos adversos después de la administración.
______________________________________________TABLA 6______________________________________________
Concentraciones de anticuerpos en suero (pg/mL ± SEM)
Anticuerpo 6 horas Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 7 Día 10
AbF 116,7±14,0 196,4±10,6 96,0±13,3 24,7±7,0 3,7±0,42 <0,35 <0,35
AbG 115,0±22,1 198,8±23,4 118,4±20,9 48,3±16,0 2,9±1,97 <0,35 <0,35
AbH 64,5±3,85 108,0±5,13 32,0±6,08 1,0±0,2 0,4±0,03 0,06±0,03 0,05±0,02
Abl IgG4s 51,1±16,6 115,2±14,8 63,8±8,3 11,1±4,2 0,5±0,1 0,1±0,02 <0,35
Control de 458,2±34,4 702,5±32,3 616,6±27,0 567,1±39,5 488,9±45,0 357,0±51,1 307,6±61,1 isotipo
Ejemplo 5. Perfiles farmacocinéticos de moduladores de CD47 en roedores CD47/SIRPa humanizados.
Este Ejemplo ilustra un método para evaluar el aclaramiento farmacocinético de moduladores de CD47 (por ejemplo, anticuerpos anti-CD47) en animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados para contener genes de CD47 (de acuerdo con el Ejemplo 1) y SIRPa humanizados. En particular, los roedores con CD47 humanizado descritos en la presente, se modificaron para contener además un gen SIRPa humanizado que contiene una parte endógena y una parte humana, cuya parte humana codifica el dominio extracelular de una proteína SIRPa humana (por ejemplo, los aminoácidos 28-362 de una proteína SIRPa humana) y cuya porción endógena codifica un dominio intracelular de una proteína SIRPa endógena (por ejemplo, los aminoácidos que codifican porciones transmembrana e intracelular de una proteína SIRPa de murino) como se describe en el documento PCT/US14/56910, presentada el 23 de septiembre de 2014. Se prepararon ratones CD47/SIRPa doble humanizados por cruzamiento de ratones SIRPa humanizado con ratones CD47 humanizado. En este Ejemplo, a roedores CD47/SIRPa doble humanizados (por ejemplo, ratones) se les administraron diversos anticuerpos anti-CD47 y se determinaron sus correspondientes perfiles farmacocinéticos.
Brevemente, grupos de tipo silvestre (n=5) y ratones homocigotos para genes CD47 y SIRPa humanizados (CD47hu/huSIRPa hu/hu; n=5 por grupo) se administraron anticuerpos anti-CD47 seleccionados y un anticuerpo de control de isotipo IgG4 (hIgG4s). Los fondos genéticos de los ratones fueron 75 % CD57BL/6 y 25 % 129Sv. Todos los anticuerpos se administraron en una única dosis subcutánea de 50 mg/kg. Se recogió un sangrado previo un día antes de la administración del anticuerpo (día 0). Las hemorragias posteriores a la inyección se recogieron a las 6 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 7 días y 10 días. Las fracciones de suero de las hemorragias se separaron y se sometieron a análisis de anticuerpos humanos totales mediante el uso de un inmunoensayo ELISA (descrito anteriormente). Además, se midieron los niveles de hematocrito a las 6 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 7 días y 10 días y se realizó una prueba de orina según fue necesario (a las 6 horas y cuando el color de la orina se desvió del color amarillo) para determinar recuentos de glóbulos rojos. Los resultados ilustrativos se muestran en la Figura 7-9.
Como se muestra en las Figuras 7 y 8, todos los anticuerpos anti-CD47 demostraron un aclaramiento mediado por la diana en ratones CD47hu/huSIRPahu/hu y, en particular, muchos demostraron perfiles farmacocinéticos similares. Además, una versión monovalente de un anticuerpo anti-CD47 (Ab F) demostró una mayor biodisponibilidad que su equivalente bivalente (Figura 8). Los inventores observaron perfiles farmacocinéticos similares para los anticuerpos entre múltiples experimentos con CD47 humanizado y animales doble humanizados (es decir, ratones CD47hu/huSIRPahu/llu).
Ab J tuvo un efecto menor sobre los niveles de hematocrito que otros anticuerpos anti-CD47 probados (Ab F, Ab G, Ab I, etc.) y cambios comparables en los niveles de hematocrito para controlar (hIgG4s) en ratones CD47hu/huSIRPahu/llu. Las mediciones del hematocrito en los días 2-4 mostraron la mayor caída desde el intervalo normal (-38,5-45,1 %), que incluyó grupos a los que se les administró Abs F, G e I. En particular, una forma monovalente de Ab F demostró un efecto retardado en la disminución del hematocrito. en comparación con otros anticuerpos probados. Los inventores razonaron que las diferencias en los niveles de hematocrito entre los diversos grupos de tratamiento podrían atribuirse a una diferencia en el epítopo reconocido por los diversos anticuerpos. Además, los ratones dosificados con anticuerpos anti-CD47 seleccionados mostraron pruebas positivas con tira reactiva de orina para hemo a las 6 horas. Por ejemplo, los grupos de tratamiento Ab J y Ab F tuvieron cada uno un ratón positivo para hemo el día 1, mientras que todos los demás puntos de tiempo fueron negativos. No se observó pérdida de peso significativa (>20 %) en cualquier grupo de tratamiento.
Tomado en conjunto, este Ejemplo demuestra que los animales no humanos descritos en la presente, proporcionan un sistema in vivo para evaluar las propiedades farmacocinéticas y/o perfiles de uno o más fármacos dirigidos a CD47 (por ejemplo, uno o más anticuerpos anti-CD47) como, por ejemplo, niveles de fármaco circulantes. Además, los animales no humanos como se describen en la presente descripción modificados genéticamente para contener además otros genes humanizados (por ejemplo, SIRPa humanizado) pueden usarse para evaluar el aclaramiento mediado por la diana de uno o más fármacos que se dirigen a CD47.
EQUIVALENTES
Por tanto al haber descrito varios aspectos de al menos una modalidad de esta invención, los expertos en la técnica deberán apreciar que a los expertos en la técnica se les ocurrirán fácilmente varias alteraciones, modificaciones y mejoras. Se pretende que tales alteraciones, modificaciones y mejoras sean parte de esta descripción y que estén dentro del alcance de la invención. Por consiguiente, la descripción y los dibujos anteriores son solo a modo de ejemplo y la invención se describe en detalle en las reivindicaciones que siguen.
El uso de términos ordinales tales como"primero","segundo","tercero", etcétera, en las reivindicaciones para modificar un elemento de reivindicación no connota por sí mismo ninguna prioridad, precedencia u orden de un elemento de reivindicación sobre otro o el orden temporal en el que se realizan los actos de un método, sino que se usan simplemente como etiquetas para distinguir un elemento de reivindicación que tiene un nombre determinado de otro elemento que tiene el mismo nombre (excepto por el uso del término ordinal) para distinguir los elementos de reivindicación.
Debe entenderse que los artículos"un" y"una" como se usan en la presente descripción y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, incluyen los referentes plurales. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen"o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en o son relevantes de cualquier otra manera para un producto o proceso dado, a menos que se indique lo contrario o sea evidente de cualquier otra manera por el contexto. La invención incluye modalidades en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en o es relevante de cualquier otra manera para un producto o proceso dado. La invención también incluye modalidades en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean en o son relevantes de cualquier otra manera para un producto o proceso dado. Además, debe entenderse que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Un roedor cuyo genoma comprende un gen de CD47 humanizado,
    en donde el gen de CD47 humanizado codifica un polipéptido CD47 humanizado que comprende una porción de un polipéptido CD47 humano, y una porción intracelular de un polipéptido CD47 de roedor;
    en donde la porción del polipéptido CD47 humano comprende el dominio extracelular y los dominios transmembrana del polipéptido CD47 humano, y está codificada por los exones 2-7 de un gen de CD47 humano;
    en donde la porción intracelular del polipéptido CD47 de roedor está codificada por los exones aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 de roedor; y
    en donde el gen de CD47 humanizado está unido operativamente a un promotor de CD47 de roedor.
  2. 2. El roedor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen de CD47 humanizado se forma a partir de una sustitución de un fragmento genómico que comprende los exones 2-7 de un gen de CD47 de roedor endógeno en un locus de CD47 endógeno de roedor, con un fragmento genómico que comprende los exones 2-7 del gen de CD47 humano.
  3. 3. El roedor de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el roedor comprende además un gen de SIRPa que codifica un polipéptido SIRPa que comprende el dominio extracelular de un polipéptido SIRPa humano y el dominio intracelular de un polipéptido SIRPa endógeno de roedor, en donde el polipéptido SIRPa interactúa con CD47, y opcionalmente el gen de SIRPa comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de un gen de SIRPa endógeno de roedor y los exones 2-4 de un gen de SIRPa humano.
  4. 4. El roedor de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el roedor es una rata o un ratón.
  5. 5. Una célula o tejido de roedor aislado cuyo genoma comprende un gen de CD47 humanizado,
    en donde el gen de CD47 humanizado codifica un polipéptido CD47 humanizado que comprende una porción de un polipéptido CD47 humano, y una porción intracelular de un polipéptido CD47 de roedor;
    en donde la porción del polipéptido CD47 humano comprende el dominio extracelular y los dominios transmembrana del polipéptido CD47 humano, y está codificada por los exones 2-7 de un gen de CD47 humano;
    en donde la porción intracelular del polipéptido CD47 de roedor está codificada por los exones aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 de roedor; y
    en donde el gen de CD47 humanizado está unido operativamente a un promotor de CD47 de roedor.
  6. 6. La célula de roedor de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha célula es una célula madre embrionaria de roedor y, opcionalmente, la célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón o rata.
  7. 7. Un embrión de roedor generado a partir de la célula madre embrionaria de acuerdo con la reivindicación 6.
  8. 8. Un método para proporcionar un roedor, el método que comprende modificar el genoma de un roedor para que comprenda un gen de CD47 humanizado,
    en donde el gen de CD47 humanizado codifica un polipéptido CD47 humanizado que comprende una porción de un polipéptido CD47 humano, y una porción intracelular de un polipéptido CD47 de roedor;
    en donde la porción del polipéptido CD47 humano comprende el dominio extracelular y los dominios transmembrana del polipéptido CD47 humano, y está codificada por los exones 2-7 de un gen de CD47 humano;
    en donde la porción intracelular del polipéptido CD47 de roedor está codificada por los exones aguas abajo del exón 7 de un gen de CD47 de roedor; y
    en donde el gen de CD47 humanizado está unido operativamente a un promotor de CD47 de roedor.
  9. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el roedor es un ratón o rata.
  10. 10. Un método para evaluar el injerto de células humanas, en donde dicho método comprende evaluar el injerto de células humanas en un roedor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde opcionalmente las células humanas son células madre hematopoyéticas.
  11. 11. Un método para evaluar la eficacia terapéutica de un fármaco dirigido a células humanas, el método que comprende:
    administrar un candidato a fármaco a un roedor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en el que se han trasplantado una o más células humanas; y
    controlar las células humanas en el roedor para determinar la eficacia terapéutica del candidato a fármaco.
  12. 12. Un método para evaluar si un candidato a modulador de una proteína CD47 humana induce la aglutinación de glóbulos rojos, dicho método que comprende
    incubar glóbulos rojos aislados de un roedor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en presencia del candidato a modulador; y
    evaluar si el candidato a modulador induce la aglutinación de los glóbulos rojos.
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