KR20210004994A - 치료제를 시험하기 위한 인간화된 설치류 - Google Patents
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- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
Abstract
본 명세서에는 유전자 변형된 설치류에서 인간 Fc를 포함하는 치료제를 생체내에서 시험(예를 들어, 유전자 변형된 설치류에서 이러한 치료제의 약동학적 및/또는 약력학적 특성을 시험)하는 것에 관련된 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서 유전자 변형된 설치류는 인간 Fc를 포함하는 항체(예를 들어, 인간 IgG1 Fc, 인간 IgG4 Fc)를 발현한다. 일부 실시형태에서, 설치류는 완전 인간 항체(즉, 인간 중쇄 및 인간 경(γ 또는 κ)쇄를 갖는 항체)를 발현한다. 특정 실시형태에서 유전자 변형된 설치류는 인간 세포외 도메인을 갖는 1종 이상의 Fc 수용체(예를 들어, 신생아 Fc 수용체(FcRn), β-2-마이크로글로불린 폴리펩타이드(β2M), Fcε 수용체 1α(FcεR1α), Fc γ 수용체 1 알파(FcγR1a), Fc 감마 수용체 2a(FcγR2a), Fc 감마 수용체 2b(FcγR2b), Fc 감마 수용체 3a(FcγR3a), Fc 감마 수용체 3b(FcγR3b), Fc 감마 수용체 2c(FcγR2c))를 포함한다. 이러한 수용체의 막관통 도메인 및 세포질 도메인은 인간 또는 비-인간(예를 들어, 설치류)일 수 있다.
Description
관련 출원
본 출원은 미국 가특허 제62/648,197호(출원일: 2018년 3월 26일) 및 미국 가특허 제62/689,628호(출원일: 2018년 6월 25일)에 대한 우선권 이익을 주장하며, 이들 기초출원 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 이의 전문은 본 명세서에서 참조에 의해서 포함된다. 2019년 3월 20일자로 생성된 상기 ASCII 카피는 파일명이 RPB-01925_(28744-01925)_SL.txt이고, 크기가 12,008바이트이다.
치료제의 안전성, 효능 및 약동학적 특성은 통상적으로 이러한 약물이 인간에게 투여되기 이전에 동물 모델에서 시험된다. 이러한 전임상 연구에서 더 큰 동물, 예컨대, 비-인간 영장류의 사용은 고비용이고, 적합한 질환 모델은 보통 입수 가능하지 않은데, 이것이 약물 효능을 시험하는 데 있어서 이러한 동물의 유용성을 제한한다.
작은 크기 및 널리 특징규명된 생리학으로 인해, 설치류는 치료제의 전임상 시험을 위한 동물 모델로 오랫동안 사용되어 왔다. 또한, 설치류는 널리 확립된 기술을 사용한 유전적 변형이 매우 용이하기 때문에, 더 큰 포유동물에서는 사용할 수 없는 설치류에서 사용할 수 있는 질환 모델이 다수 존재한다. 그러나, 복합 치료제, 예컨대, 항체 및 Fc 융합 단백질은 종종 설치류에서 인간과 다르게 거동한다. 예를 들어, 이러한 치료제는 종종 인간에게 투여될 때와 비교하여 설치류에게 투여될 때 매우 상이한 약동학적 특성을 나타내는데, 이것은 인간에서 복합 치료제의 안전성, 효능 및 최적 용량의 예측인자로서 설치류 모델의 유용성을 제한한다. 이것은 차례로 전임상 시험에서 그러한 동물 모델의 유용성을 감소시킨다.
따라서, 인간 환자에서 이러한 치료제의 특성을 보다 예측할 수 있는 결과를 생성하는 설치류에서 복합 치료제의 정확한 전임상 시험을 가능하게 하는 새로운 동물 모델 및 방법에 대한 상당한 요구가 존재한다.
본 명세서에는 유전자 변형된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)에서 인간 Fc를 포함하는 치료제를 생체내에서 시험(예를 들어, 이러한 치료제 및 투여 요법의 약동학적 및/또는 약력학적 특성을 시험)하는 것에 관련된 방법 및 조성물이 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에는 인간 항체 및/또는 인간 Fc 융합 단백질의 투여가 감소된 항-인간 Fc 면역 반응(예를 들어, 마우스에서 마우스 항-인간 항체 또는 MAHA 반응)을 유도하는 유전자 변형된 설치류가 제공된다. 일부 실시형태에서 유전자 변형된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)는 인간 Fc를 포함하는 항체(예를 들어, 인간 IgG1 Fc, 인간 IgG4 Fc)를 발현한다. 일부 실시형태에서, 설치류는 완전 인간 항체(즉, 인간 중쇄 및 인간 경(γ 또는 κ)쇄를 갖는 항체)를 발현한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 인간 환자의 Fc 수용체가 이러한 Fc 융합 단백질 또는 항체와 어떻게 상호작용할 것인지를 반영하는 방식으로 Fc 융합 단백질 또는 항체와 상호작용하는 1종 이상의 인간화된 또는 부분적으로-인간화된 Fc 수용체를 발현하는 설치류가 제공된다. 따라서, 특정 실시형태에서 유전자 변형된 설치류는 인간 세포외 도메인을 갖는 1종 이상의 Fc 수용체(예를 들어, 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor: FcRn), β-2-마이크로글로불린 폴리펩타이드(β-2-microglobulin polypeptide)(β2M), Fcε 수용체 1α(FcεR1α), Fc γ 수용체 1 알파(FcγR1a), Fc 감마 수용체 2a(FcγR2a), Fc 감마 수용체 2b(FcγR2b), Fc 감마 수용체 3a(FcγR3a), Fc 감마 수용체 3b(FcγR3b), Fc 감마 수용체 2c(FcγR2c))를 포함한다. 이러한 수용체의 막관통 도메인 및 세포질 도메인은 인간 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예컨대, 래트 또는 마우스)일 수 있다.
특정 양상에서 본 명세서에는 게놈 내에 유전자 변형된 면역글로불린 중쇄(IgH) 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 및 설치류 ES 세포가 제공된다. 특정 실시형태에서 IgH 유전자좌는 (i) 하나 이상의 VH 유전자 분절, 하나 이상의 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 JH 유전자 분절(예를 들어, 래트 또는 마우스 VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절)을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, 인간 또는 설치류 IgG 막관통 도메인 및 인간 또는 설치류 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 하나 이상의 CH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 CH 유전자 분절 모두는 인간이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서 유전자좌는 내인성 설치류 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서, 설치류의 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 인간 CH에 의해서 암호화된 Fc에 매칭된 아이소타입인 인간 항체 및 Fc 융합 단백질은 이러한 설치류에게 투여될 때 감소된 면역 반응을 도출한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 인간 IgG1 항체는 인간 가변 도메인 및 인간 IgG1 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG2 항체는 인간 가변 도메인 및 인간 IgG2 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG3 항체는 인간 가변 도메인 및 인간 IgG3 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG4 항체는 인간 가변 도메인 및 인간 IgG4 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다. 일부 실시형태에서, κ 경쇄를 갖는 인간 항체는 인간 κ 경쇄를 갖는 항체를 발현하는, 예를 들어, 인간 κ 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하거나, 또는 인간 κ 가변 도메인 및 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다. 일부 실시형태에서, λ 경쇄를 갖는 인간 항체는 인간 λ 경쇄를 갖는 항체를 발현하는, 예를 들어, 인간 λ 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하거나, 또는 인간 λ 가변 도메인 및 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다. 특정 실시형태에서 본 명세서에는 이러한 설치류를 사용하여 인간 항체 및 Fc-융합 단백질을 시험하기 위한 동물 모델 및 방법이 제공된다.
특정 양상에서 본 명세서에는 게놈 내에 유전자 변형된 면역글로불린 카파(Igκ)쇄 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 제공된다. 일부 실시형태에서 Igκ 유전자좌는, (1) 하나 이상의 인간 Vκ 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 Jκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ쇄 가변 영역; 및 (2) 인간 Cκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 설치류가 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 및 Cκ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 불변 도메인을 포함하는 항체를 생산하도록 면역글로불린 κ쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서 유전자좌는 내인성 설치류 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서 인간 κ쇄를 포함하는 인간 항체는 이러한 설치류에게 투여될 때 면역 반응을 도출한다. 특정 실시형태에서 본 명세서에는 이러한 설치류를 사용하여 인간 항체를 시험하기 위한 동물 모델 및 방법이 제공된다.
특정 양상에서 본 명세서에는 게놈 내에 유전자 변형된 면역글로불린 람다(Igλ)쇄 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 제공된다. 특정 실시형태에서 Igλ 유전자좌는 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절, 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절 및 하나 이상의 Cλ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 Jλ 유전자 분절 및 Cλ 유전자 분절은 하나 이상의 Jλ-Cλ 클러스터로서 배열된다. 일부 실시형태에서, 인간 Jλ 유전자 분절 및 Cλ 유전자 분절은 인간 Jλ 유전자 분절이 하나 이상의 Cλ 유전자 분절의 상류에 집합적으로 위치되도록 배열된다. 일부 실시형태에서, 인간 Jλ 유전자 분절 및 Cλ 유전자 분절은 인간 Jλ 유전자 분절 및 Cλ 유전자 분절 중 일부가 하나 이상의 Jλ-Cλ 클러스터로서 배열되지만, 나머지 Jλ 유전자 분절은 하나 이상의 Cλ 유전자 분절의 상류에 집합적으로 위치되도록 배열된다. 일부 실시형태에서, 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절은 설치류가 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 및 Cλ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 불변 도메인을 포함하는 항체를 생산하도록 인간 Cλ 유전자 분절에 작동 가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서 유전자좌는 내인성 설치류 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서 인간 λ쇄를 포함하는 인간 항체는 이러한 설치류에게 투여될 때 면역 반응을 도출한다. 특정 실시형태에서 본 명세서에는 이러한 설치류를 사용하여 인간 항체를 시험하기 위한 동물 모델 및 방법이 제공된다.
특정 양상에서 본 명세서에는 게놈 내에 유전자 변형된 신생아 Fc 수용체(FcRn) 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 제공된다. 특정 실시형태에서 FcRn 유전자좌는 인간 세포외 도메인, 설치류 또는 인간 막관통 도메인 및 설치류 또는 인간 세포질 도메인을 포함하는 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서 유전자좌는 내인성 설치류 FcRn 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서 설치류는 이의 게놈 내에 인간 β-2-마이크로글로불린(β2M) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 β-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자좌를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서 인간 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 본 명세서에는 이러한 설치류를 사용하여 인간 항체 및 Fc 융합 단백질을 시험하기 위한 동물 모델 및 방법이 제공된다.
특정 양상에서 본 명세서에는 게놈 내에 인간 세포외 도메인, 설치류 또는 인간 막관통 도메인 및 설치류 또는 인간 세포질 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형된 Fc 엡실론 수용체 1 알파(FcεR1α) 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 제공된다. 일부 실시형태에서 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 본 명세서에는 이러한 설치류를 사용하여 인간 항체 및 Fc 융합 단백질을 시험하기 위한 동물 모델 및 방법이 제공된다.
특정 양상에서 본 명세서에는 게놈 내에 인간 세포외 도메인, 설치류 또는 인간 막관통 도메인 및 설치류 또는 인간 세포질 도메인을 포함하는 FcγR1a α-쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형된 Fc 감마 수용체 1a(FcγR1a) α-쇄 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 제공된다. 일부 실시형태에서 FcγR1a α-쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcγR1a α-쇄 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 설치류는 기능성 FcR γ-쇄를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서 기능성 FcR γ-쇄는 설치류 FcR γ-쇄(예를 들어, 유전자 변형된 설치류에 내인성인 FcR γ-쇄)이다. 특정 실시형태에서 본 명세서에는 이러한 설치류를 사용하여 인간 항체 및 Fc 융합 단백질을 시험하기 위한 동물 모델 및 방법이 제공된다.
특정 양상에서 본 명세서에는 게놈 내에 인간 FcγR2a α-쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형된 Fc 감마 수용체 2a α-쇄(FcγR2a) 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 제공된다. 일부 실시형태에서 FcγR2a α-쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR α-쇄 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 본 명세서에는 이러한 설치류를 사용하여 인간 항체 및 Fc 융합 단백질을 시험하기 위한 동물 모델 및 방법이 제공된다.
특정 양상에서 본 명세서에는 게놈 내에 인간 FcγR2b α-쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형된 Fc 감마 수용체 2b(FcγR2b) α-쇄 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 제공된다. 일부 실시형태에서 FcγR2b α-쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR α-쇄 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 본 명세서에는 이러한 설치류를 사용하여 인간 항체 및 Fc 융합 단백질을 시험하기 위한 동물 모델 및 방법이 제공된다.
특정 양상에서 본 명세서에는 게놈 내에 인간 FcγR3a α-쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형된 Fc 감마 수용체 3a(FcγR3a) α-쇄 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 제공된다. 일부 실시형태에서 FcγR3a α-쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR α-쇄 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 설치류는 기능성 FcR γ-쇄를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서 기능성 FcR γ-쇄는 설치류 FcR γ-쇄(예를 들어, 유전자 변형된 설치류에 내인성인 FcR γ-쇄)이다. 특정 실시형태에서 본 명세서에는 이러한 설치류를 사용하여 인간 항체 및 Fc 융합 단백질을 시험하기 위한 동물 모델 및 방법이 제공된다.
특정 양상에서 본 명세서에는 게놈 내에 인간 FcγR3b α-쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형된 Fc 감마 수용체 3b(FcγR3b) α-쇄 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 제공된다. 일부 실시형태에서 FcγR3b α-쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR α-쇄 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 본 명세서에는 이러한 설치류를 사용하여 인간 항체 및 Fc 융합 단백질을 시험하기 위한 동물 모델 및 방법이 제공된다.
특정 양상에서 본 명세서에는 게놈 내에 인간 FcγR2c α-쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형된 Fc 감마 수용체 2c(FcγR2c) α-쇄 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 제공된다. 일부 실시형태에서 FcγR2c α-쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR α-쇄 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 본 명세서에는 이러한 설치류를 사용하여 인간 항체 및 Fc 융합 단백질을 시험하기 위한 동물 모델 및 방법이 제공된다.
특정 양상에서 본 명세서에는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 유전자좌의 조합물을 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 IgH 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igκ 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igλ 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcRn 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 β2M 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcεR1α 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR1a 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR2a 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR2b 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR2c 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR3a 유전자좌, 및/또는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR3b 유전자좌로부터 선택된 하나 이상의 유전자 변형된 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 IgH 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igκ 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 IgH 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igλ 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 IgH 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igκ 및/또는 Igλ 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcRn 유전자좌 및 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 β2M 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 IgH 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcRn 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 β2M 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcεR1α 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR1a 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR2a 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR2b 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR2c 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR3a 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR3b 유전자좌를 포함한다.
특정 실시형태에서 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)에게 치료용 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 인간 Fc 도메인(예를 들어, 인간 항체 또는 Fc 융합 단백질)을 포함하는 치료용 단백질을 시험하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서 방법은 투여된 치료용 단백질의 하나 이상의 약동학적 특성을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서 하나 이상의 약동학적 파라미터는 혈장 농도 대 시간 하의 면적(area under the plasma concentration versus time: AUC), 생체내 회수율(in vivo recovery: IVR), 청소율(clearance rate: CL), 평균 체류 시간(mean residence time: MRT), 작용제 반감기(t½) 및 정상 상태에서의 분포 용적(volume of distribution: Vss)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 방법은 투여된 치료용 단백질의 치료 효능(예를 들어, 동물 모델에서 하나 이상의 질환 증상을 감소시키거나 제거하는 투여된 치료용 단백질의 용량의 능력)을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 투여된 치료용 단백질의 안전성(예를 들어, 동물 모델에서 투여된 치료용 단백질의 용량이 하나 이상의 부작용을 생성시키는 정도)을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 설치류에서 치료용 단백질이 하나 이상의 Fc 수용체 매개된 반응(예를 들어, 치료용 단백질이 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 유도하는 정도)을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서 방법은 치료용 단백질의 투여가 설치류에서 항-인간 Fc 면역 반응을 유도하는 정도를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서 방법은 치료용 단백질의 투여 요법의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서 본 명세서에는 인간 Fc 도메인(예를 들어, 인간 항체 또는 Fc 융합 단백질)을 포함하는 치료용 단백질을 시험하기 위한 동물 모델이 제공된다. 일부 실시형태에서 동물 모델은 치료용 단백질을 본 명세서에 제공된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서 동물 모델은 투여된 치료용 단백질의 하나 이상의 약동학적 특성을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서 하나 이상의 약동학적 파라미터는 혈장 농도 대 시간 하의 면적(AUC), 생체내 회수율(IVR), 청소율(CL), 평균 체류 시간(MRT), 작용제 반감기(t½) 및 정상 상태에서의 분포 용적(Vss)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 동물 모델은 투여된 치료용 단백질의 치료 효능(예를 들어, 동물 모델에서 하나 이상의 질환 증상을 감소시키거나 제거하는 투여된 치료용 단백질의 용량의 능력)을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 동물 모델은 투여된 치료용 단백질의 안전성(예를 들어, 동물 모델에서 투여된 치료용 단백질의 용량이 하나 이상의 부작용을 생성시키는 정도)을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 동물 모델은 설치류에서 치료용 단백질이 하나 이상의 Fc 수용체 매개된 반응(예를 들어, 치료용 단백질이 항체-의존적 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC)을 유도하는 정도)을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서 동물 모델은 치료용 단백질의 투여가 설치류에서 항-인간 Fc 면역 반응을 유도하는 정도를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서 동물 모델은 치료용 단백질의 투여 요법의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서 투여된 치료제는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여될 때 감소된 면역 반응을 도출한다. 일부 실시형태에서 투여된 인간 항체 또는 Fc 융합 단백질은 본 명세서에 제공된 설치류의 유전자 변형된 IgH 유전자좌에서 인간 CH에 의해서 암호화된 Fc 도메인의 아이소타입 및/또는 알로타입과 매칭되는 아이소타입 및/또는 알로타입을 갖는다. 일부 실시형태에서, 설치류의 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 인간 CH에 의해서 암호화된 Fc에 매칭된 아이소타입인 인간 항체 및 Fc 융합 단백질은 이러한 설치류에게 투여될 때 감소된 면역 반응을 도출한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 인간 IgG1 항체는 인간 가변 도메인 및 인간 IgG1 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG2 항체는 인간 가변 도메인 및 인간 IgG2 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG3 항체는 인간 가변 도메인 및 인간 IgG3 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG4 항체는 인간 가변 도메인 및 인간 IgG4 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다. 일부 실시형태에서, κ 경쇄를 갖는 인간 항체는 인간 κ 경쇄를 갖는 항체를 발현하는, 예를 들어, 인간 κ 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하거나, 또는 인간 κ 가변 도메인 및 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다. 일부 실시형태에서, λ 경쇄를 갖는 인간 항체는 인간 λ 경쇄를 갖는 항체를 발현하는, 예를 들어, 인간 λ 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하거나, 또는 인간 λ 가변 도메인 및 불변 도메인을 갖는 항체를 발현하는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다. 일부 실시형태에서 작용제는 인간 IgG1 항체이고, 설치류는 인간 IgG1 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 작용제는 인간 IgG4 항체이고, 설치류는 인간 IgG4 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 Igκ 경쇄를 갖는 인간 항체이고, 설치류는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igκ 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 Igλ 경쇄를 갖는 인간 항체이고, 설치류는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igλ 유전자좌를 포함한다.
특정 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 유전자좌 중 하나 이상을 포함하는 설치류 세포(예를 들어, ES 세포, 면역 세포, 내피 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 호산구, 비만 세포 및 호염기)가 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류 세포(예를 들어, 설치류 ES 세포)는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 IgH 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igκ 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류 세포(예를 들어, 설치류 ES 세포)는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 IgH 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igλ 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류 세포(예를 들어, 설치류 ES 세포)는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 IgH 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igκ 및/또는 Igλ 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcRn 유전자좌 및 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 β2M 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류 세포(예를 들어, 설치류 ES 세포)는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 IgH 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcRn 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 β2M 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcεR1α 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR1a 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR2a 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR2b 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR2c 유전자좌, 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR3a 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 FcγR3b 유전자좌를 포함한다.
일부 실시형태에서 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 및 설치류 ES 세포(예를 들어, 래트 또는 마우스 ES 세포)를 제조하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서 방법은 게놈이 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 유전자좌 중 하나 이상을 포함하도록 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 또는 설치류 ES 세포(예를 들어, 래트 또는 마우스 ES 세포)의 게놈을 유전자 변형시키는 단계를 포함한다.
도 1a는 본 명세서에 제공된 특정 예시적인 실시형태에 따른 예시적인 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 도시된 바와 같이, 예시적인 마우스 중쇄 유전자좌 1은 5'에서 3' 순서로, 인간 가변 영역(인간 VH, 인간 DH 및 인간 JH 유전자 분절을 포함함, 단순화를 위해서, 인간 VH 유전자 분절은 도시되지 않고; 단지 적은 수의 유전자 분절이 개략적으로 표현되며 - 가능한 존재하는 V, D 및 J 유전자 분절의 완전 레퍼토리의 경우 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[imgt.org, Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001), 및 Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001)] 참고), 마우스 인트론성 인핸서, 마우스 Cμ 유전자 분절, 마우스 Cδ 유전자 분절, 마우스 Cγ3 유전자 분절, 마우스 Cγ1 유전자 분절, 마우스 Cγ2b 유전자 분절, 인간 IgG1 세포외 도메인 및 마우스 IgG2a 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 암호화하는 혼성 CH 유전자 분절, 마우스 Cε 유전자 분절, 마우스 Cα 유전자 분절 및 마우스 3' 조절 영역(3' regulatory region)을 포함한다. 도시된 바와 같이, 예시적인 마우스 중쇄 유전자좌 2는 5'에서 3' 순서로, 인간 가변 영역(인간 VH, 인간 DH 및 인간 JH 유전자 분절을 포함함, 단순화를 위해서, 인간 VH 유전자 분절은 도시되지 않고; 단지 적은 수의 유전자 분절이 개략적으로 표현되며 - 가능한 존재하는 V, D 및 J 유전자 분절의 완전 레퍼토리의 경우 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[imgt.org, Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001), 및 Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001)] 참고), 마우스 인트론성 인핸서, 마우스 Cμ 유전자 분절, 마우스 Cδ 유전자 분절, 마우스 Cγ3 유전자 분절, 마우스 Cγ1 유전자 분절, 마우스 Cγ2b 유전자 분절, 인간 Cγ1 유전자 분절(IgG1 세포외 및 막관통/세포질 암호화 서열 둘 다는 인간임), 마우스 Cε 유전자 분절, 마우스 Cα 유전자 분절 및 마우스 3' 조절 영역을 포함한다. 도시된 바와 같이, 예시적인 마우스 중쇄 유전자좌 3은 5'에서 3' 순서로, 인간 가변 영역(인간 VH, 인간 DH 및 인간 JH 유전자 분절을 포함함, 단순화를 위해서, 인간 VH 유전자 분절은 도시되지 않고; 단지 적은 수의 유전자 분절이 개략적으로 표현되며 - 가능한 존재하는 V, D 및 J 유전자 분절의 완전 레퍼토리의 경우 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[imgt.org, Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001), 및 Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001)] 참고), 마우스 인트론성 인핸서, 마우스 Cμ 유전자 분절, 마우스 Cδ 유전자 분절, 마우스 Cγ3 유전자 분절, 인간 IgG4 세포외 도메인 및 마우스 IgG1 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 암호화하는 혼성 CH 유전자 분절, 마우스 Cγ2b 유전자 분절, 마우스 Cγ2a 유전자 분절, 마우스 Cε 유전자 분절, 마우스 Cα 유전자 분절 및 마우스 3' 조절 영역을 포함한다. 도시된 바와 같이, 예시적인 마우스 중쇄 유전자좌 4는 5'에서 3' 순서로, 인간 가변 영역(인간 VH, 인간 DH 및 인간 JH 유전자 분절을 포함함, 단순화를 위해서, 인간 VH 유전자 분절은 도시되지 않고; 단지 적은 수의 유전자 분절이 개략적으로 표현되며 - 가능한 존재하는 V, D 및 J 유전자 분절의 완전 레퍼토리의 경우 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[imgt.org, Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001), 및 Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001)] 참고), 마우스 인트론성 인핸서, 마우스 Cμ 유전자 분절, 마우스 Cδ 유전자 분절, 마우스 Cγ3 유전자 분절, 인간 Cγ4 유전자 분절(IgG4 세포외 도메인 및 막관통/세포질 도메인 암호화 서열은 둘 다 인간임), 마우스 Cγ2b 유전자 분절, 마우스 Cγ2a 유전자 분절, 마우스 Cε 유전자 분절, 마우스 Cα 유전자 분절 및 마우스 3' 조절 영역을 포함한다. 도시된 바와 같이, 예시적인 마우스 중쇄 유전자좌 5는 5'에서 3' 순서로, 인간 가변 영역(인간 VH, 인간 DH 및 인간 JH 유전자 분절을 포함함, 단순화를 위해서, 인간 VH 유전자 분절은 도시되지 않고; 단지 적은 수의 유전자 분절이 개략적으로 표현되며 - 가능한 존재하는 V, D 및 J 유전자 분절의 완전 레퍼토리의 경우 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[imgt.org, Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001), 및 Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001)] 참고), 인간 인트론성 인핸서, 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ3 유전자 분절, 인간 Cγ1 유전자 분절 및 마우스 3' 조절 영역을 포함한다. 도시된 바와 같이, 예시적인 마우스 중쇄 유전자좌 6은 5'에서 3' 순서로, 인간 가변 영역(인간 VH, 인간 DH 및 인간 JH 유전자 분절을 포함함, 단순화를 위해서, 인간 VH 유전자 분절은 도시되지 않고; 단지 적은 수의 유전자 분절이 개략적으로 표현되며 - 가능한 존재하는 V, D 및 J 유전자 분절의 완전 레퍼토리의 경우 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[imgt.org, Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001), 및 Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001)] 참고), 인간 인트론성 인핸서, 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ3 유전자 분절, 인간 Cγ1 유전자 분절, 인간 Cγ2 유전자 분절, 인간 Cγ4 유전자 분절 및 마우스 3' 조절 영역을 포함한다. 도시된 바와 같이, 예시적인 마우스 중쇄 유전자좌 7은 5'에서 3' 순서로, 마우스 가변 영역(마우스 VH, 마우스 DH 및 마우스 JH 유전자 분절을 포함함, 단순화를 위해서, 마우스 VH 유전자 분절은 도시되지 않고; 단지 적은 수의 유전자 분절이 개략적으로 표현되며 - 가능한 존재하는 V, D 및 J 유전자 분절의 레퍼토리의 경우 imgt.org 참고), 마우스 인트론성 인핸서, 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ3 유전자 분절, 인간 Cγ1 유전자 분절 및 마우스 3' 조절 영역을 포함한다. 도시된 바와 같이, 예시적인 마우스 중쇄 유전자좌 8은 5'에서 3' 순서로, 마우스 가변 영역(마우스 VH, 마우스 DH 및 마우스 JH 유전자 분절을 포함함, 단순화를 위해서, 마우스 VH 유전자 분절은 도시되지 않고; 단지 적은 수의 유전자 분절이 개략적으로 표현되며 - 가능한 존재하는 V, D 및 J 유전자 분절의 레퍼토리의 경우 imgt.org 참고), 마우스 인트론성 인핸서, 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ3 유전자 분절, 인간 Cγ1 유전자 분절, 인간 Cγ2 유전자 분절, 인간 Cγ4 유전자 분절 및 마우스 3' 조절 영역을 포함한다. 도시되지 않았지만, 이들 실시형태에서 유전자좌는 기능성 마우스 Adam6 유전자(예를 들어, Adam 6a 및/또는 Adam6b)를 포함한다. 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, lox 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 1b는 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 도 1a에 도시된 예시적인 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌 5를 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 단순화를 위해서, 인간 VH 유전자 분절 및 마우스 Adam6 유전자는 모든 개략적인 다이어그램에 도시하지 않는다. 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, lox 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 1c는 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 도 1a에 도시된 예시적인 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌 6을 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 단순화를 위해서, 인간 VH 유전자 분절 및 마우스 Adam6 유전자는 모든 개략적인 다이어그램에 도시하지 않는다. 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, lox 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 1d는 실시예 1.2에 기재된 바와 같이 도 1a에 도시된 예시적인 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌 7을 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 단순화를 위해서, 마우스 VH 유전자 분절은 모든 개략적인 다이어그램에 도시하지 않는다. 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, lox 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 1e는 실시예 1.2에 기재된 바와 같이 도 1a에 도시된 예시적인 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌 8을 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 단순화를 위해서, 마우스 VH 유전자 분절은 모든 개략적인 다이어그램에 도시하지 않는다. 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, lox 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 2a는 본 명세서에 제공된 특정 예시적인 실시형태에 따른 예시적인 변형된 면역글로불린 경쇄 유전자좌의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 상부의 예시적인 개략도는 인간 가변 영역, 마우스 인트론성 인핸서, 인간 Cκ 불변 영역 유전자 분절 및 마우스 3' 인핸서를 포함하는 Igκ 유전자좌를 도시한다. 하부의 예시적인 개략도는 Vλ 유전자 분절, 인간 Jλ-Cλ 탠덤 쌍, 인간 Jλ7 및 마우스 Cλ1 유전자 분절, 인간 인핸서 1, 2 및 3, 및 마우스 3' 인핸서를 포함하는 Igλ 유전자좌를 도시한다. 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, loxp 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 2b는 실시예 1.3에 기재된 바와 같이 도 2a에 도시된 예시적인 변형된 면역글로불린 카파 유전자좌를 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, loxp 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 3a는 hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1 마우스(유전자좌 5), VELOCIMMUNE® 마우스의 혈청 및 정상 인간 혈청에 존재하는 마우스 IgG, 마우스 IgM, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3의 수준을 도시한 도면.
도 3b는 hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1 마우스(유전자좌 5) 및 VELOCIMMUNE® 마우스에서 대립유전자 활용 및 대립유전자 제외의 존재를 나타내기 위한 hIgM 대 mIgM 및 hIgD 대 mIgD에 대한 FACS 플롯을 도시한 도면.
도 3c는 제시된 마우스의 혈청에 존재하는 마우스 IgG, 마우스 IgM, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG4의 수준을 도시한 도면.
도 3d는 인간 IgG4 항체의 주사 후에 제시된 마우스에서 제0일 및 제34일에 인간 항체에 대한 마우스의 농도를 나타낸 도면.
도 3e는 주사 후 최초 34일 동안 제시된 마우스에서 인간 IgG4 항체의 농도를 나타낸 도면.
도 4는 실시예 3에 기재된 바와 같은 예시적인 변형된 FcRn 유전자좌를 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, loxp 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 5는 실시예 3에 기재된 바와 같은 예시적인 변형된 FcRn 유전자좌 및 β2M 유전자좌를 포함하는 마우스를 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, loxp 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 6은 야생형 마우스와 비교한, 예시적인 변형된 FcRn 및 β2M 유전자좌를 포함하는 마우스에 의한 인간 항체의 항체 청소율(항체 농도로 제시됨)을 도시한 도면.
도 7은 실시예 4에 기재된 바와 같은 예시적인 변형된 FcγR1α(도면에 FCGR1로서 도시됨), FcγRIIIa, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIb, FcγRIIIb 및 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스의 생성을 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 8a는 인간 고 친화성 FcγR 및 인간 저 친화성 FcγR 및 인간 중쇄 불변 영역을 보유하는 마우스에서 마우스 IgD 대 마우스 IgM, 인간 IgD 대 인간 IgM의 활용을 도시한 FACS 플롯을 나타낸 도면.
도 8b는 야생형 마우스와 비교한, 인간 고 친화성 FcγR 및 인간 저 친화성 FcγR 및 인간 중쇄 불변 영역을 보유하는 마우스의 비장에 존재하는 T 세포(mCD3 양성) 및 B 세포(mCD19 양성)의 수 또는 백분율을 도시한 도면.
도 8c는 정상 인간 혈청과 비교한, 인간 고 친화성 FcγR 및 인간 저 친화성 FcγR 및 인간 중쇄 불변 영역을 보유하는 마우스에서 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3의 혈청 농도를 도시한 도면.
도 9는 실시예 5에 기재된 바와 같은 예시적인 변형된 FcεR1α 유전자좌를 포함하는 마우스를 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, loxp 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
좌측 패널 상의 도 10은 인간화된 FcεR1α가 본 명세서에 개시된 인간화된 FcεR1α 유전자좌를 포함하는 예시적인 마우스에서 호염기의 표면 상에 발현된다는 것을 나타내는 FACS 플롯을 도시한 도면. 우측 패널에서, 이러한 도면은 야생형 마우스와 비교한, 본 명세서에 개시된 인간화된 FcεR1α 유전자좌를 포함하는 마우스의 비장에 존재하는 마우스 또는 인간 FcεR1α+ 호염기의 백분율을 도시한다.
도 11은 본 명세서에 제공된 예시적인 인간화된 FcεR1α 유전자좌가 기능성이라는 것을 나타낸 도면. 마우스를 음성 대조군으로서 인간 알레르겐-특이적 IgEs 또는 IgG으로의 피부내 귀 주입에 의해서 감작시켰다. 1일 후, 마우스를 에반스 블루 염료에 희석된 알레르겐으로 IV로 시험감염시켰다. 귀에서 에반스 블루 염료 혈관외유출을 비만 세포 탈과립화의 판독치로서 측정하였다. 인간 IgE는 마우스 FcεR1에 결합하지 않기 때문에, 인간화된 FcεR1α 유전자좌를 포함하는 마우스에서의 반응은 기능성 FcεR1α가 생산되지 않았다는 것을 나타낸다.
도 12는 본 명세서에 제공된 예시적인 인간화된 FcεR1α 유전자좌가 기능성이라는 것을 나타낸 도면. 마우스를 인간 알레르겐-특이적 IgE의 IV 주사로 감작시켰다. 1일 후, 마우스를 알레르겐의 IV 주사로 시험감염시키고, 주사 후 4시간에 걸쳐서 온도 변화를 모니터링하였다. 온도 하강은 전신 과민증의 판독치이다.
도 13은 실시예 6에 기재된 바와 같은 예시적인 인간화된 FcRn, β2M, FcεR1α, FcγR1α(도면에 FCGR1로서 도시됨), FcγRIIIa, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIb, FcγRIIIb 및 중쇄 불변 영역 유전자좌 및 중쇄 가변 영역 유전자좌를 포함하는 마우스의 생성을 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 간략화를 위해서, 유전자좌 F 및 F'에서 단지 적은 수의 유전자 분절이 개략적으로 표현되며 - 가능한 존재하는 V, D 및 J 유전자 분절의 완전 레퍼토리의 경우 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[imgt.org, Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001), 및 Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001)]을 참고하기 바란다. 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 1b는 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 도 1a에 도시된 예시적인 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌 5를 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 단순화를 위해서, 인간 VH 유전자 분절 및 마우스 Adam6 유전자는 모든 개략적인 다이어그램에 도시하지 않는다. 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, lox 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 1c는 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 도 1a에 도시된 예시적인 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌 6을 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 단순화를 위해서, 인간 VH 유전자 분절 및 마우스 Adam6 유전자는 모든 개략적인 다이어그램에 도시하지 않는다. 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, lox 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 1d는 실시예 1.2에 기재된 바와 같이 도 1a에 도시된 예시적인 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌 7을 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 단순화를 위해서, 마우스 VH 유전자 분절은 모든 개략적인 다이어그램에 도시하지 않는다. 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, lox 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 1e는 실시예 1.2에 기재된 바와 같이 도 1a에 도시된 예시적인 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌 8을 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 단순화를 위해서, 마우스 VH 유전자 분절은 모든 개략적인 다이어그램에 도시하지 않는다. 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, lox 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 2a는 본 명세서에 제공된 특정 예시적인 실시형태에 따른 예시적인 변형된 면역글로불린 경쇄 유전자좌의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 상부의 예시적인 개략도는 인간 가변 영역, 마우스 인트론성 인핸서, 인간 Cκ 불변 영역 유전자 분절 및 마우스 3' 인핸서를 포함하는 Igκ 유전자좌를 도시한다. 하부의 예시적인 개략도는 Vλ 유전자 분절, 인간 Jλ-Cλ 탠덤 쌍, 인간 Jλ7 및 마우스 Cλ1 유전자 분절, 인간 인핸서 1, 2 및 3, 및 마우스 3' 인핸서를 포함하는 Igλ 유전자좌를 도시한다. 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, loxp 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 2b는 실시예 1.3에 기재된 바와 같이 도 2a에 도시된 예시적인 변형된 면역글로불린 카파 유전자좌를 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, loxp 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 3a는 hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1 마우스(유전자좌 5), VELOCIMMUNE® 마우스의 혈청 및 정상 인간 혈청에 존재하는 마우스 IgG, 마우스 IgM, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3의 수준을 도시한 도면.
도 3b는 hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1 마우스(유전자좌 5) 및 VELOCIMMUNE® 마우스에서 대립유전자 활용 및 대립유전자 제외의 존재를 나타내기 위한 hIgM 대 mIgM 및 hIgD 대 mIgD에 대한 FACS 플롯을 도시한 도면.
도 3c는 제시된 마우스의 혈청에 존재하는 마우스 IgG, 마우스 IgM, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG4의 수준을 도시한 도면.
도 3d는 인간 IgG4 항체의 주사 후에 제시된 마우스에서 제0일 및 제34일에 인간 항체에 대한 마우스의 농도를 나타낸 도면.
도 3e는 주사 후 최초 34일 동안 제시된 마우스에서 인간 IgG4 항체의 농도를 나타낸 도면.
도 4는 실시예 3에 기재된 바와 같은 예시적인 변형된 FcRn 유전자좌를 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, loxp 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 5는 실시예 3에 기재된 바와 같은 예시적인 변형된 FcRn 유전자좌 및 β2M 유전자좌를 포함하는 마우스를 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, loxp 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 6은 야생형 마우스와 비교한, 예시적인 변형된 FcRn 및 β2M 유전자좌를 포함하는 마우스에 의한 인간 항체의 항체 청소율(항체 농도로 제시됨)을 도시한 도면.
도 7은 실시예 4에 기재된 바와 같은 예시적인 변형된 FcγR1α(도면에 FCGR1로서 도시됨), FcγRIIIa, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIb, FcγRIIIb 및 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스의 생성을 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
도 8a는 인간 고 친화성 FcγR 및 인간 저 친화성 FcγR 및 인간 중쇄 불변 영역을 보유하는 마우스에서 마우스 IgD 대 마우스 IgM, 인간 IgD 대 인간 IgM의 활용을 도시한 FACS 플롯을 나타낸 도면.
도 8b는 야생형 마우스와 비교한, 인간 고 친화성 FcγR 및 인간 저 친화성 FcγR 및 인간 중쇄 불변 영역을 보유하는 마우스의 비장에 존재하는 T 세포(mCD3 양성) 및 B 세포(mCD19 양성)의 수 또는 백분율을 도시한 도면.
도 8c는 정상 인간 혈청과 비교한, 인간 고 친화성 FcγR 및 인간 저 친화성 FcγR 및 인간 중쇄 불변 영역을 보유하는 마우스에서 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3의 혈청 농도를 도시한 도면.
도 9는 실시예 5에 기재된 바와 같은 예시적인 변형된 FcεR1α 유전자좌를 포함하는 마우스를 생성하기 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 달리 제시되지 않는 한(예를 들어, loxp 부위 등), 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
좌측 패널 상의 도 10은 인간화된 FcεR1α가 본 명세서에 개시된 인간화된 FcεR1α 유전자좌를 포함하는 예시적인 마우스에서 호염기의 표면 상에 발현된다는 것을 나타내는 FACS 플롯을 도시한 도면. 우측 패널에서, 이러한 도면은 야생형 마우스와 비교한, 본 명세서에 개시된 인간화된 FcεR1α 유전자좌를 포함하는 마우스의 비장에 존재하는 마우스 또는 인간 FcεR1α+ 호염기의 백분율을 도시한다.
도 11은 본 명세서에 제공된 예시적인 인간화된 FcεR1α 유전자좌가 기능성이라는 것을 나타낸 도면. 마우스를 음성 대조군으로서 인간 알레르겐-특이적 IgEs 또는 IgG으로의 피부내 귀 주입에 의해서 감작시켰다. 1일 후, 마우스를 에반스 블루 염료에 희석된 알레르겐으로 IV로 시험감염시켰다. 귀에서 에반스 블루 염료 혈관외유출을 비만 세포 탈과립화의 판독치로서 측정하였다. 인간 IgE는 마우스 FcεR1에 결합하지 않기 때문에, 인간화된 FcεR1α 유전자좌를 포함하는 마우스에서의 반응은 기능성 FcεR1α가 생산되지 않았다는 것을 나타낸다.
도 12는 본 명세서에 제공된 예시적인 인간화된 FcεR1α 유전자좌가 기능성이라는 것을 나타낸 도면. 마우스를 인간 알레르겐-특이적 IgE의 IV 주사로 감작시켰다. 1일 후, 마우스를 알레르겐의 IV 주사로 시험감염시키고, 주사 후 4시간에 걸쳐서 온도 변화를 모니터링하였다. 온도 하강은 전신 과민증의 판독치이다.
도 13은 실시예 6에 기재된 바와 같은 예시적인 인간화된 FcRn, β2M, FcεR1α, FcγR1α(도면에 FCGR1로서 도시됨), FcγRIIIa, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIb, FcγRIIIb 및 중쇄 불변 영역 유전자좌 및 중쇄 가변 영역 유전자좌를 포함하는 마우스의 생성을 위한 예시적인 방법의 개략적인 요약을 도시한 도면(축적대로는 아님). 간략화를 위해서, 유전자좌 F 및 F'에서 단지 적은 수의 유전자 분절이 개략적으로 표현되며 - 가능한 존재하는 V, D 및 J 유전자 분절의 완전 레퍼토리의 경우 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[imgt.org, Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001), 및 Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001)]을 참고하기 바란다. 빈 형상 및 이중선은 인간 서열을 나타내고, 채워진 형상 및 단일선은 마우스 서열을 나타낸다.
일반
본 명세서에는 유전자 변형된 설치류에서 인간 Fc를 포함하는 치료제를 생체내에서 시험(예를 들어, 유전자 변형된 설치류에서 이러한 치료제의 약동학적 및/또는 약력학적 특성 및 투여 요법을 시험)하는 것에 관련된 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서 유전자 변형된 설치류는 인간 Fc(예를 들어, 인간 IgG1 Fc, 인간 IgG2 Fc, 인간 IgG3 Fc, 인간 IgG4 Fc) 또는 인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 설치류는 완전 인간 항체(즉, 인간 중쇄 및 인간 경(γ 또는 κ)쇄를 갖는 항체)를 발현한다. 특정 실시형태에서 유전자 변형된 설치류는 인간 세포외 도메인을 갖는 1종 이상의 Fc 수용체(예를 들어, 신생아 Fc 수용체(FcRn), β-2-마이크로글로불린 폴리펩타이드(β2M), Fcε 수용체 1α(FcεR1α), Fc γ 수용체 1 알파(FcγR1a), Fc 감마 수용체 2a(FcγR2a), Fc 감마 수용체 2b(FcγR2b), Fc 감마 수용체 3a(FcγR3a), Fc 감마 수용체 3b(FcγR3b), Fc 감마 수용체 2c(FcγR2c))를 포함한다. 이러한 수용체의 막관통 도메인 및 세포질 도메인은 인간 또는 비-인간(예를 들어, 설치류)일 수 있다.
인간 Fc를 포함하는 치료제, 예컨대, 치료용 인간 항체 및 인간 Fc 융합 단백질은 인간에게 투여되기 전에 전형적으로 비-인간 종에서 시험된다. 이러한 작용제는 종종 비-인간 영장류 또는 다른 비교적 큰 포유동물에서 시험되기 때문에, 이러한 시험은 고비용이고, 약물 개발자에게 상당한 재정적인 부담을 준다. 더욱이, 비-인간 영장류 및 다른 비교적 큰 포유동물은 종종 유전자 변형이 쉽지 않고, 이것이 이러한 유기체에서 사용 가능한 질환 모델을 제한한다.
이에 반해서, 설치류 종(예를 들어, 래트 및 마우스)은 작은 크기, 양호하고 특징규명된 생리학 및 유전자 변형의 용이성으로 인해서 치료용 항체 및 Fc 융합 단백질을 시험하기 위한 편리한 동물 모델이다. 불행하게도, 인간 Fc 영역은 인간에게 투여될 때에 비해서 선행 기술 설치류에게 투여될 때 종종 매우 상이한 약동학적 특성 및 약력학적 특성을 나타낸다. 예를 들어, 인간 Fc 영역을 갖는 치료제가 종래의 설치류에게 투여되는 경우, Fc 영역 내의 인간 서열은 종종 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 면역계에 의해서 외부 물질로서 식별된다. 그 결과, 설치류는 투여되는 치료제에 대해서 면역 반응(마우스 항-인간 반응 또는 MAHA로서 공지됨)을 가질 수 있고, 이것이 투여되는 작용제의 약동학적 특성 및 약력학적 특성에 영향을 미친다. 더욱이, 치료제의 인간 Fc 영역은 환자에서 인간 Fc 수용체와 상호작용하는 것보다 설치류에서 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Fc 수용체와 상이하게 상호작용할 수 있는데, 이것이 또한 약동학적 특성 및 약력학적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 종래의 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 모델은 종종 인간 Fc를 포함하는 치료에 대한 인간 치료 반응의 불량한 예측인자이다. 따라서, 인간 면역글로불린 유전자좌 영역(예를 들어, 도 1 및 도 2에서의 유전자좌)을 갖는 마우스는 MAHA 반응을 감소시키거나 제거하는데 도움이 된다.
약물에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 갖는 것은 연구 및 진단 목적에 매우 유용하다. 마우스 가변부 및 인간 불변부(예를 들어, 도 1a에서의 마우스 유전자좌 8)를 갖는 마우스의 생성은 약물이 인간 단클론성 항체인 경우 항-약물 항체를 생성시키기 위한 개선된 방법을 제공한다. 마우스에게 인간 항체를 주사함으로써 생성된 임의의 MAHA 반응은 항체의 가변 영역에 지향될 것이다. 이것은 항체의 불변 영역에 대한 배경 반응을 제거하고, 약물 특이적 항체를 생성하는 것을 보다 효율적으로 만든다.
본 명세서에는 치료 용도를 위한 인간 항체 및 Fc 융합 단백질을 개발, 스크리닝 및 시험하기 위한 생체내 시스템이 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에는 인간 Fc를 포함하는 치료제의 투여 후에 감소된 설치류-항-인간 면역 반응을 갖는 유전자 변형된 설치류가 제공된다. 본 명세서에서 입증된 바와 같이, 이것은 투여된 항체 또는 Fc 융합 단백질에 존재하는 Fc와 매칭되는 인간 Fc를 발현하도록 유전자 변형된 설치류의 사용을 통해서 달성될 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어, 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 분절의 상응하는 부분을 암호화하는 서열 대신에, 전체적으로 또는 부분적으로(예를 들어, IgG CH1-H-CH2-CH3) 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열의 삽입을 통해서 제조될 수 있다. 이러한 동물은 인간 Fc를 "자가"로 인식하여, 투여된 인간 Fc-함유 치료제에 대한 면역 반응을 발달시킬 가능성이 적다.
또한, 일부 실시형태에서 본 명세서에는 인간 환자에 의해서 발현되는 Fc 수용체와 유사하게 인간 Fc와 상호작용할 수 있는 Fc 수용체를 발현하는 유전자 변형된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)가 제공된다. 예를 들어, 특정 실시형태에서 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 설치류는 적어도 인간 세포외 도메인(예를 들어, 막관통 도메인 및 세포질 도메인은 인간 또는 설치류일 수 있음)을 갖는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 마우스는 인간 또는 부분적으로 인간 FcRn, 인간 또는 부분적으로 인간 β2M, 인간 또는 부분적으로 인간 FcεR1α, 인간 또는 부분적으로 인간 FcγR1a, 인간 또는 부분적으로 인간 FcγR2a, 인간 또는 부분적으로 인간 FcγR2b, 인간 또는 부분적으로 인간 FcγR3a, 인간 또는 부분적으로 인간 FcγR3b, 및/또는 인간 또는 부분적으로 인간 FcγR2c를 발현한다. 따라서 이러한 마우스는 완전 비-인간 Fc 수용체를 갖는 설치류에 비해서 인간 환자의 인간 Fc 반응을 보다 정확하게 모방할 수 있다.
따라서, 본 명세서에 제공된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)는 항원에 대한 특이성 및/또는 친화성뿐만 아니라 면역계의 내부 환경 내의 효과기 기능의 평가를 통해서 선택된 항체의 관련된 전체 생물학적 기능에 기초하여 치료용 인간 항체 및 Fc 융합 단백질을 개발, 선택 및 시험하기 위한 신규한 생체내 시스템을 제공한다. 이러한 방식에서, 별도로 평가되는 개별 성분에만 기초하여 예측되기 보다는 관련 생물학적 반응(예를 들어, 세포 반응)을 갖는 전체 분자 수준에서 평가되는 치료 가능성에 기초하여 인간 치료 후보물질이 개발 및 선택될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 설치류는 구체적으로 생체내에서 임상 인간 치료 항체 기능의 예측에 보다 적합한 시스템을 제공한다.
정의
단수 표현은 단수 표현의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하도록 본 명세서에서 사용된다. 예의 방식으로, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
용어 "아미노산"은 아미노 작용기 및 산 작용기 둘 다를 포함하고, 자연 발생 아미노산의 중합체에 포함될 수 있는 자연 또는 합성이든 모든 분자를 포괄하도록 의도된다. 예시적인 아미노산은 자연 발생 아미노산; 이의 유사체, 유도체 및 동류물(congener); 변이체 측쇄를 갖는 아미노산 유사체; 및 이들 중 임의의 것의 모든 입체이성질체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 무손상 항체 및 이의 항원 결합 단편 둘 다를 지칭할 수 있다. 무손상 항체는 다이설파이드 결합에 의해서 서로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 프레임워크 영역(FR)이라고 지칭되는 고도로 보존된 영역이 산재된 상보성 결정 영역(CDR)이라고 지칭되는 초가변성의 도메인으로 추가로 나뉠 수 있다. 각각의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 아미노-말단에서부터 카복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다.
용어 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 항체의 "항원 결합 단편" 및 "항원-결합 부분"은 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 용어 항체의 "항원-결합 단편"에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, 다이설파이드 연결된 Fv, Fd, 단일-쇄 항체, 단리된 CDRH3 및 무손상 항체의 가변 도메인의 적어도 일부를 보유하는 다른 항체 단편을 포함한다. 이들 항체 단편은 종래의 재조합 및/또는 효소 기술을 사용하여 획득될 수 있고, 무손상 항체와 동일한 방식으로 항원 결합에 대해서 스크리닝될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "혈장 농도 대 시간 곡선 하 면적" 또는 "AUC"는 투여 후 치료제의 제거 속도 및 제거 정도를 지칭한다. 일부 실시형태에서 AUC는 명시된 시간 기간, 예컨대, 12, 18, 24, 36, 48 또는 72시간 기간에 걸쳐서 또는 곡선의 기울기에 기초한 외삽법을 사용하여 무한대 동안 결정된다. 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, AUC는 무한대 동안 결정된다(AUCINF). AUC는 또한 단위 용량 기준으로 계산될 수 있다. 다른 PK 파라미터 중 다수에서와 같이, AUC의 결정은 단일 동물 또는 평균값이 계산되는 동물의 집단에서 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "청소율" 또는 "CL"은 약물을 제거하는 신체의 능력의 측정치를 지칭하며, 시간에 따른 약물의 청소된 혈장 부피로서 표현된다.
구 "로부터 유래된"은 재배열된 가변 영역 및/또는 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 분절"로부터 유래된" 재배열된 가변 영역 유전자과 관련하여 사용되는 경우 가변 도메인을 발현하는 유전자를 형성하도록 재배열된 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 분절의 세트로 복귀된 재배열된 가변 영역 유전자를 추적하는 능력을 지칭한다(적용 가능한 경우, 스플라이스 차이 및 체세포 돌연변이를 설명). 예를 들어, 체세포 돌연변이를 겪은 재배열된 가변 영역 유전자는 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 분절로부터 여전이 유래된다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자좌가 범용 경쇄 또는 중쇄 유전자좌로 대체되는 경우, 용어 "로부터 유래된"은, 그 서열이 체세포 돌연변이를 겪을 수 있더라도 상기 재배열된 유전자좌에 대한 서열의 기원을 추적하는 능력을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 구 "내인성 유전자" 또는 "내인성 유전자 분절"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 분열, 결실, 대체, 변경 또는 변형의 도입 이전의 모체 또는 참조 유기체에서 발견되는 유전자 또는 유전자 분절을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 참조 유기체는 야생형 유기체이다. 일부 실시형태에서, 참조 유기체는 조작된 유기체이다. 일부 실시형태에서, 참조 유기체는 실험실에서 자란 유기체(야생형이든 조작되든)이다.
용어 "생체내 회수율" 또는 "IVR"은 관찰된 피크 활성에서 사전투여 수준을 차감하고, 이어서 용량으로 나눈 증분 회수율(K-값)을 지칭한다. IVR은 또한 백분율에 기초하여 계산될 수 있다. 평균 IVR은 동물 집단에서 결정될 수 있거나, 개별 IVR은 단일 동물에서 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자좌"는 관련 유전 요소(예를 들어, 유전자, 유전자 분절, 조절 요소)의 세트를 함유하는 염색체 상의 위치를 지칭한다. 예를 들어, 재배열되지 않은 면역글로불린 유전자좌는 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절, 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 유전자 및 V(D)J 재조합 및 면역글로불린 발현을 지시하는 연관된 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 스위치 요소 등)를 포함할 수 있다. 유전자좌는 내인성이거나 비-내인성일 수 있다. 용어 "내인성 유전자좌"는 특정 유전자 요소가 자연에서 발견되는 염색체 상의 위치를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자좌는 자연에서 발견되는 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자좌는 야생형 유전자좌이다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자좌는 조작된 유전자좌이다. 예를 들어, 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 야생형 마우스에서 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절 및 불변 영역 유전자를 포함하는 마우스 염색체 12 상의 위치를 지칭하고, 내인성 마우스 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 야생형 마우스에서 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 불변 영역 유전자를 포함하는 마우스 염색체 16 상의 위치를 지칭하는 반면, 내인성 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌는 야생형 마우스에서 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 불변 영역 유전자를 포함하는 마우스 염색체 6 상의 위치를 지칭한다.
재배열되지 않은 가변 영역 유전자 분절은, 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 분절이 항원 결합 단백질의 폴리펩타이드쇄로서 불변 영역 유전자와 함께 발현되는 재배열된 가변 영역 유전자를 형성하도록 재배열될 수 있는 경우 인접한 불변 영역 유전자에 "작동 가능하게 연결된"다고 할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", 및 "핵산"은 상호 교환 가능하게 사용된다. 이것은 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이의 유사체의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 암호 또는 비암호 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예컨대, 표지 성분과의 접합에 의해서 추가로 변형될 수 있다. 본 명세서에는 제공된 모든 핵산 서열에서, U 뉴클레오타이드는 T 뉴클레오타이드와 상호 교환 가능성이다.
용어 "재배열되지 않은"은, V 유전자 분절 및 J 유전자 분절(중쇄 가변 영역의 경우, D 유전자 분절이 마찬가지임)이 별개로 유지되지만, 연결되어 V(D)J 레퍼토리의 단일 V, (D), J를 포함하는 재배열된 V(D)J 유전자("가변 영역 유전자")를 형성할 수 있는 면역글로불린 가변 영역 유전자좌 또는 가변 영역 유전자 분절의 상태를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "정상 상태에서의 분포 용적" 또는 "Vss"는 약물이 분포하는 명백한 공간(부피)를 지칭한다. 보다 특별하게는, Vss는 동물의 신체에서의 약물의 양을 정상 상태에서의 혈장 농도로 나눈 값을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CH 유전자 분절"(예를 들어, Cγ1 유전자 분절, Cγ2a 유전자 분절, Cγ2c 유전자 분절, Cμ 유전자 분절, Cγ2b 유전자 분절, Cγ3 유전자 분절, Cδ 유전자 분절, Cε 유전자 분절, Cα 유전자 분절 등)은 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA 서열의 분절을 지칭하고, CH 유전자(예를 들어, Cγ 유전자, Cγ2a 유전자, Cγ2c 유전자, Cγ3 유전자, Cγ2b 유전자, Cμ 유전자, Cδ 유전자, Cε 유전자, Cα 유전자 등)와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 예를 들어, Cγ1 유전자 분절 또는 Cγ1 유전자는 IgG1 불변 영역을 암호화하는 DNA 서열의 분절을 지칭한다. 용어 "CH 유전자 분절 유전자좌"는 CH 유전자 분절 또는 CH 유전자가 자연에서 발견되는 염색체 상의 위치를 지칭한다.
유전자 변형된 유전자좌
특정 양상에서 본 명세서에는 유전자 변형된 설치류에서 인간 Fc를 포함하는 치료제를 생체내 시험(예를 들어, 유전자 변형된 설치류에서 이러한 치료제의 약동학적 및/또는 약력학적 특성을 시험)하는 데 유용한 유전자 변형된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)가 제공된다. 일부 실시형태에서 유전자 변형된 설치류는 인간 Fc를 포함하는 항체 중쇄(예를 들어, 인간 IgG1 Fc, 인간 IgG4 Fc)를 암호화하는 유전자 변형된 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서, 설치류는 완전 또는 부분적 인간 경쇄를 암호화하는(예를 들어, γ 경쇄 또는 κ 경쇄)를 암호화하는 유전자 변형된 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 유전자 변형된 설치류는 인간 세포외 도메인을 갖는 Fc 수용체(예를 들어, 신생아 Fc 수용체(FcRn) α-쇄, β-2-마이크로글로불린 폴리펩타이드(β2M), Fcε 수용체 1α(FcεR1α) α-쇄, Fc γ 수용체 1 알파(FcγR1a) α-쇄, Fc 감마 수용체 2a(FcγR2a) α-쇄, Fc 감마 수용체 2b(FcγR2b) α-쇄, Fc 감마 수용체 3a(FcγR3a) α-쇄, Fc 감마 수용체 3b(FcγR3b) α-쇄, Fc 감마 수용체 2c(FcγR2c) α-쇄)를 암호화하는 하나 이상의 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 유전자좌에 의해서 암호화된 막관통 및 세포질 도메인은 인간 또는 비-인간(예를 들어, 설치류)일 수 있다.
인간화된 면역글로불린 중쇄 유전자좌
특정 양상에서, 본 명세서에는 유전자 변형된 면역글로불린(Ig) 중쇄 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)가 제공된다. 이러한 유전자좌는 일반적으로 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. 가변 영역은 Ig 중쇄 가변 영역 유전자 분절(예를 들어, 적어도 VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절)을 포함한다. 불변 영역 유전자좌는 하나 이상의 Ig 중쇄 불변 영역 유전자 분절(CH)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서 가변 영역은 재배열되지 않은 가변 영역일 것이고, 재배열되지 않은 Ig 가변 영역 유전자 분절을 함유할 것이다. 일부 실시형태에서, 가변 영역은 재배열된 가변 영역일 것이고, 따라서 재배열된 가변 영역 유전자를 함유할 것이다. 특정 실시형태에서, Ig 가변 영역 유전자 분절은 인간 가변 영역 유전자 분절이다. 특정 실시형태에서, Ig 가변 영역 유전자 분절은 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 가변 영역 유전자 분절(예를 들어, 래트 또는 마우스 가변 영역 유전자 분절)이다. 따라서, 특정 실시형태에서, Ig 중쇄 가변 영역 유전자좌는 인간 Ig 가변 영역 유전자 분절을 함유할 것이다. 인간 가변 영역 유전자 분절을 포함하는 예시적인 가변 영역 유전자좌는 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, 이러한 유전자좌는 미국 특허 제5,770,429호, 제5,814,318호, 제6,114,598호, 제6,998,514호, 제8,232,449호, 제8,502,018호 및 제8,697,940호(이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨), 및 미국 특허 공개 제2008/0098490호, 제2012/0167237호, 제2013/0145484호, 제2013/0326647호, 제2014/013275호 및 제2014/093908호(이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨)에 기재되어 있다.
특정 실시형태에서, Ig 중쇄 가변 영역 유전자좌는 재배열되지 않은 인간 Ig 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 함유한다. 일부 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 Ig 가변 영역 유전자 분절은 하나 이상의 인간 VH 분절, 하나 이상의 인간 DH 분절 및 하나 이상의 인간 JH 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 Ig 가변 영역 유전자 분절은 적어도 3개의 VH 유전자 분절, 적어도 18개의 VH 유전자 분절, 적어도 20개의 VH 유전자 분절, 적어도 30개의 VH 유전자 분절, 적어도 40개의 VH 유전자 분절, 적어도 50개의 VH 유전자 분절, 적어도 60개의 VH 유전자 분절, 적어도 70개의 VH 유전자 분절, 또는 적어도 80개의 VH 유전자 분절을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 IgH 유전자좌(또는 대립유전자)는 자연에 존재하는 인간 IgH 유전자좌의 인간 VH3-74와 인간 VH6-1 유전자 분절(이들 포함) 사이에서 발견되는 기능성 인간 VH 유전자 분절 중 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 IgH 유전자좌(또는 대립유전자)는 적어도 인간 VH 유전자 분절 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 및 VH6-1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 비-인간 동물은 단일 다형성 인간 VH 유전자 분절, 복수의 DH 유전자 분절 및 복수의 JH 유전자 분절(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 공개 제2013/0096287호에 기재된 바와 같음)을 특징으로 하는 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 갖는다. 일부 실시형태에서 VH 유전자 분절은 VH1-2 또는 VH1-69이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 비-인간 동물은 재배열된 중쇄 가변 영역(범용 중쇄 가변 영역 또는 공통 중쇄 암호화 서열, 예를 들어, 미국 특허 공개 제20140245468호 및 미국 특허 제9,204,624호 및 제9,930,871호에 기재된 바와 같음(이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함됨))을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 비-인간 동물은 면역글로불린 중쇄 유전자좌(예를 들어, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제9,516,868호)에서 중쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄, 예를 들어, κ, 유전자 분절을 포함한다.
추가의 다른 실시형태에서, 비-인간 유기체는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 이러한 비-인간 유기체에서 생성된 항체에 pH-의존적 결합 특성을 도입하도록 설계된 히스티딘 코돈의 삽입 및/또는 대체를 포함하는 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태 중 일부에서, 히스티딘 코돈은 CDR3을 암호화하는 핵산 서열에 삽입 및/또는 대체된다. 다양한 이러한 중쇄 면역글로불린 유전자좌는 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제9,301,510호, 제9,334,334호, 미국 특허 출원 공개 제2013/0247236호 제20140013456호에 제공되어 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 IgH 유전자좌(또는 대립유전자)는 5, 10, 15, 20, 25개 또는 그 초과(예를 들어, 26, 27개 등) 인간 DH 유전자 분절을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 IgH 유전자좌(또는 대립유전자)는 자연에 존재하는 인간 IgH 유전자좌의 인간 DH1-1과 인간 DH7-27 유전자 분절(이들 포함) 사이에서 발견되는 기능성 인간 DH 유전자 분절의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 IgH 유전자좌(또는 대립유전자)는 적어도 인간 DH 유전자 분절 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26 및 DH7-27을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 Ig 유전자 분절은 인간 DH 유전자 분절의 전부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 IgH 유전자좌(또는 대립유전자)는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 초과의 기능성 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 IgH 유전자좌(또는 대립유전자)는 자연에 존재하는 인간 IgH 유전자좌의 인간 JH1과 인간 JH6 유전자 분절(이들 포함) 사이에서 발견되는 기능성 인간 JH 유전자 분절 중 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 IgH 유전자좌(또는 대립유전자)는 적어도 인간 JH 유전자 분절 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 및 JH6을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 Ig 유전자 분절은 인간 JH 유전자 분절의 전부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 IgH 유전자좌는 내인성 Adam6 유전자를 함유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 IgH 유전자좌는 동일한 종의 야생형 비-인간 동물의 생식세포계열 게놈에서 발견되는 동일한 생식세포계열 게놈 위치에 내인성 Adam6 유전자(또는 Adam6-암호화 서열)을 함유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 IgH 유전자좌는 인간 Adam6 위유전자(pseudogene)를 함유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 IgH 유전자좌는 하나 이상의 비-인간(예를 들어, 설치류) Adam6 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열의 삽입을 포함한다. 상기 삽입은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 외부에(예를 들어, 5'의 가장 VH 유전자 분절의 상류), 조작된 IgH 유전자좌 내에 또는 비-인간 동물의 생식세포계열 게놈 내의 어딘가에(예를 들어, 무작위로 도입된 비-인간 Adam6-암호화 서열), 세포 또는 조직에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 기능성 내인성 설치류 Adam6 유전자가 결여되어 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 중쇄 유전자좌를 포함하는 설치류의 생식세포계열 게놈은 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편이 (예를 들어, 웅성생식계의 세포, 예를 들어, 고환 세포에서) 발현된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 동일한 염색체 상에 포함된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 포함된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 제1 인간 VH 유전자 분절과 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 인간 VH 유전자 분절은 VH1-2이고, 제2 인간 VH 유전자 분절은 VH6-1이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 은 인간 Adam6 위유전자 대신에 존재한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 은 인간 Adam6 위유전자를 대체한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 존재한다.
Ig 중쇄 유전자 분절을 포함하는 예시적인 Ig 가변 영역은 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52] 및 보충 정보에 제공되어 있다. 이러한 마우스는 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 Ig 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함하는 Ig 중쇄 가변 유전자 유전자좌는 또한 인간 Ig 중쇄 가변 영역 유전자간(intergenic) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 가변 유전자 유전자좌는 비-인간(예를 들어, 설치류, 래트, 마우스) Ig 중쇄 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgH 유전자좌는 비-인간 조절 요소(예를 들어, 비-인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예를 들어, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다. 일부 실시형태에서, IgH 유전자좌는 IgM 인핸서(Eμ)를 포함한다. 일부 실시형태에서, IgM 인핸서는 비-인간 Eμ(예를 들어, 설치류 Eμ, 예컨대, 마우스 또는 래트 Eμ)이다.
일부 실시형태에서, Ig 중쇄 가변 영역은 Ig 중쇄 가변 영역 유전자(범용 중쇄 가변 영역)를 포함하는 재배열된 가변 영역이다. 일부 실시형태에서, 재배열된 Ig 중쇄 가변 영역 유전자는 인간 재배열된 Ig 중쇄 가변 영역 유전자이다. 예시적인 재배열된 Ig 중쇄 가변 영역은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 공개 제2014/0245468호에 제공된다.
특정 실시형태에서, 면역글로불린 불변 영역은 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG 막관통 도메인은 설치류 IgG 막관통 도메인(예를 들어, 마우스 또는 래트 막관통 도메인)이다. 특정 실시형태에서, 막관통 도메인은 인간 IgG 막관통 도메인이다. 일부 실시형태에서, IgG 세포질 도메인은 설치류 IgG 세포질 도메인(예를 들어, 마우스 또는 래트 세포질 도메인)이다. 일부 실시형태에서, IgG 세포질 도메인은 인간 IgG 세포질 도메인이다. 일부 실시형태에서, IgG 연결 영역은 설치류 IgG 연결 영역(예를 들어, 마우스 또는 래트 연결 도메인)이다. 특정 실시형태에서, IgG 연결 영역은 인간 IgG 연결 영역이다.
특정 실시형태에서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG1 도메인이다. 일부 실시형태에서, 이러한 IgG1 도메인은 IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 및 IGHG1*05로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
특정 실시형태에서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG2 도메인이다. 일부 실시형태에서, 이러한 IgG2 도메인은 IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 및 IGHG2*06로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
특정 실시형태에서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 이러한 IgG3 도메인은 IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 및 IGHG3*19로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
특정 실시형태에서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG4 도메인이다. 일부 실시형태에서, 이러한 IgG4 도메인은 IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 및 IGHG4*04로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, CH 유전자 분절은 FcR에 대한 효과기 기능 및/또는 친화도가 참조 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 비해서 향상되거나 감소된 것을 특징으로 하는 변이체 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열(즉, 적절한 참조 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 비해서 하나 이상의 첨가, 결실 및/또는 치환을 포함하는 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열)을 암호화한다.
일부 실시형태에서, CH 유전자 분절은 활성화 및/또는 저해성 수용체에 대한 변경된 친화도를 특징으로 하는 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 암호화한다. 일부 실시형태에서, CH 유전자 분절은 예를 들어, 중성 pH와 비교할 때 산성 pH에서 FcRn 수용체에 대한 향상된 또는 감소된 결합을 특징으로 하는 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 암호화한다. 일부 실시형태에서, CH 유전자 분절은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 암호화하거나, 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 전체적으로 또는 부분적으로 암호화한다. 예시적인 아미노산 변형은 297번 위치(예를 들어, N297A), 250번 위치(예를 들어, 250E 또는 250Q), 252번 위치(예를 들어, 252L, 252Y, 252F, 252W 또는 252T), 254번 위치(예를 들어, 254S 또는 254T), 256번 위치(예를 들어, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D 또는 256T), 307번 위치(예를 들어, 307P 또는 307A), 308번 위치(예를 들어, 308F 또는 308V), 428번 위치(예를 들어, 428L 또는 428F), 433번 위치(예를 들어, 433H, 433Lm, 433R, 433S, 433P, 433Q 또는 433K), 434번 위치(예를 들어, 434A, 434W, 434H, 434F 또는 434Y) 및 이들의 조합에서의 치환을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, CH 유전자 분절은 250Q 및 248L(예를 들어, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E(예를 들어, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예를 들어, M428L 및 N434S); 257I 및 311I(예를 들어, P257I 및 Q311I); 257I 및 434H(예를 들어, P257I 및 N434H); 376V 및 434H(예를 들어, D376V 및 N434H); 307A, 380A 및 434A(예를 들어, T307A, E380A 및 N434A); 및 433K 및 434F(예를 들어, H433K 및 N434F)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 변형의 하나 이상의 쌍 또는 군을 갖는 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 암호화한다.
일부 실시형태에서, CH 유전자 분절은 하나 초과의 인간 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래된(또는 이것에서 나타나는) 분절 또는 부분을 포함하는 키메라 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 암호화한다. 예를 들어, 이러한 키메라 CH 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자로부터 유래된 CH3 도메인과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자로부터 유래된 CH2 도메인을 포함할 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 키메라 CH 영역은 키메라 힌지 영역을 추가로 포함한다. 예를 들어, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "하부 힌지" 서열(EU 넘버링에 따라서 228번 위치에서부터 236번 위치까지의 아미노산 잔기)과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "상부 힌지" 아미노산 서열(EU 넘버링에 따라서 216번 위치에서부터 227번 위치까지의 아미노산 잔기)을 포함할 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 키메라 힌지 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 상부 힌지로부터 유래된 아미노산 잔기 및 인간 IgG2 히부 힌지로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다.
특정 실시형태에서, 변형된 CH 유전자 분절은 내인성 CH 유전자 분절 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서, 변형된 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ1 유전자 분절 유전자좌, 내인성 Cγ2a 유전자 분절 유전자좌, 내인성 Cγ2b 유전자 분절 유전자좌, 내인성 Cγ2c 유전자 분절 유전자좌 또는 내인성 Cγ3 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 구조는 설치류 중에서 달라질 수 있다. 예를 들어, 노르웨이 래트(Norwegian rat)는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 Cγ3 유전자 분절을 갖지 않는 반면, 마우스 균주는 일반적으로 이러한 유전자 분절을 갖는다. 동일한 종에 경우에도, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 구조는 균주마다 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 마우스 균주는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 Cγ2a 유전자 분절을 갖는 반면, 다른 마우스 균주(예를 들어, Igh1-b 대립유전자를 갖는 마우스 균주)는 대신에 Cγ2c 유전자 분절을 갖고, 일부 마우스 균주는 Cγ2a 및 Cγ2c 유전자 분절 둘 다를 가질 수 있다. 본 명세서에서 도면, 실시예 및/또는 설명에 개시된 설치류 Cγ1, Cγ2a, Cγ2b 및 Cγ3 유전자 분절은 따라서 예시적인 설치류 CH 유전자 분절이고, 당업자는 특정 불변 영역 유전자 구조가 설치류 균주마다 달라질 것이라는 것을 인지할 것이다. 따라서, 예를 들어, 당업자는 본 개시내용이 임의의 개시된 설치류 Cγ2a 유전자 분절 대신에 또는 그것에 더하여 설치류 Cγ2c 유전자 분절을 포함하는 설치류를 고려한다는 것을 인지할 것이다.
일부 실시형태에서, 변형된 CH 유전자 분절은 인간 Cγ1 유전자 분절(또는 IgG1 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 인간 Cγ1 유전자 분절의 적어도 일부)이고, 이것은 내인성 Cγ2a 유전자 분절 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서, IgG1 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 인간 Cγ1 유전자 분절의 일부는 IgG2a 막관통 및/또는 세포질 도메인을 암호화하는 내인성 설치류 Cγ2a 유전자 분절의 일부에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 변형된 CH 유전자 분절은 인간 Cγ1 유전자 분절(또는 IgG1 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 인간 Cγ1 유전자 분절의 적어도 일부)이고, 이것은 내인성 Cγ2c 유전자 분절 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서, IgG1 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 인간 Cγ1 유전자 분절의 일부는 IgG2c 막관통 및/또는 세포질 도메인을 암호화하는 내인성 설치류 Cγ2c 유전자 분절의 일부에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 변형된 CH 유전자 분절은 인간 Cγ4 유전자 분절(또는 IgG4 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 인간 Cγ4 유전자 분절의 적어도 일부)이고, 이것은 내인성 Cγ1 유전자 분절 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서, IgG4 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 인간 Cγ4 유전자 분절의 일부는 IgG1 막관통 및/또는 세포질 도메인을 암호화하는 내인성 설치류 Cγ1 유전자 분절의 일부에 작동 가능하게 연결된다.
특정 실시형태에서, 변형된 CH 유전자 분절은 내인성 CH 유전자 분절의 전부 또는 일부를 대체한다. 특정 실시형태에서, 변형된 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ1 유전자 분절, 내인성 Cγ2a 유전자 분절, 내인성 Cγ2b 유전자 분절, 내인성 Cγ2c 유전자 분절, 또는 내인성 Cγ3 유전자 분절의 전부 또는 일부를 대체한다.
일부 실시형태에서, 변형된 CH 유전자 분절은 인간 Cγ1 유전자 분절(또는 IgG1 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 인간 Cγ1 유전자 분절의 적어도 일부)이고, 이것은 내인성 Cγ2a 유전자 분절 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다. 일부 실시형태에서, IgG1 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 인간 Cγ1 유전자 분절의 일부가 IgG2a 막관통 및/또는 세포질 도메인을 암호화하는 내인성 설치류 Cγ2a 유전자 분절의 일부에 작동 가능하게 연결되도록 IgG1 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 인간 Cγ1 유전자 분절의 일부는 IgG2a 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 내인성 설치류 Cγ2a 유전자 분절의 일부를 대체한다.
일부 실시형태에서, 변형된 CH 유전자 분절은 인간 Cγ4 유전자 분절(또는 IgG4 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 인간 Cγ4 유전자 분절의 적어도 일부)이고, 이것은 내인성 Cγ1 유전자 분절 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다. 일부 실시형태에서, IgG4 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 인간 Cγ4 유전자 분절의 일부가 IgG1 막관통 및/또는 세포질 도메인을 암호화하는 내인성 설치류 Cγ1 유전자 분절의 일부에 작동 가능하게 연결되도록 IgG4 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 인간 Cγ4 유전자 분절의 일부는 IgG1 불변 도메인의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화하는 내인성 설치류 Cγ1 유전자 분절의 일부를 대체한다.
특정 실시형태에서 Ig 중쇄 불변 영역은 하나 이상의 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) CH 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역은 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cμ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역은 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cδ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역은 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ1 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역은 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2a 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역은 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2b 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역은 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2c 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역은 설치류(예를 들어, 마우스) Cγ3 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역은 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cε 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역은 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cε 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 설치류 불변 영역 유전자 분절은 내인성 불변 영역 유전자 분절이다. 일부 실시형태에서, 상기에 기재된 변형된 CH 유전자 분절은 Ig 중쇄 불변 영역 내의 유일한 변형된 CH 유전자 분절이다.
일부 실시형태에서, 상기에 기재된 변형된 CH 유전자 분절은 Ig 중쇄 불변 영역 내의 복수의 변형된 CH 유전자 분절 중 하나(예를 들어, Ig 중쇄 불변 영역에서 부분적으로 또는 완전히 인간화된 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 변형된 유전자 분절 중 하나)이다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 불변 영역은 인간 또는 부분적으로 인간 Cμ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 불변 영역은 인간 또는 부분적으로 인간 Cδ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 불변 영역은 인간 또는 부분적으로 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 불변 영역은 인간 또는 부분적으로 인간 Cγ2 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 불변 영역은 인간 또는 부분적으로 인간 Cγ3 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 불변 영역은 인간 또는 부분적으로 인간 Cγ4 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 불변 영역은 인간 또는 부분적으로 인간 Cε 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 불변 영역은 인간 또는 부분적으로 인간 Cα 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ1 유전자 분절 및 인간 Cγ3 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절 및 인간 Cγ4 유전자 분절을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, IgH 유전자좌는 인간 또는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 조절 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조절 요소는 내인성 조절 요소이다. 특정 실시형태에서, IgH 유전자좌는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 또는 인간 인트론성 인핸서(Ei)를 포함한다. 일부 실시형태에서, IgH 유전자좌는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 또는 인간 3' 조절 영역(3' RR)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다. 특정 실시형태에서, 변형된 IgH 유전자좌는 내인성 유전자좌의 외부에 위치된 트랜스젠 상에 위치된다. 일부 실시형태에서, 내인성 IgH 유전자좌는 (예를 들어, 내인성 Ig 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부의 결실, 재배치 및/또는 반전을 통해서) 불활성화된다.
따라서, 일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 불변 영역(또는 이의 일부)은 결실되지 않는다(즉, 무손상이다). 일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 하나 이상의 CH 유전자 분절은 변형되거나, 파괴되거나, 결실되거나 또는 다른 것 중에서 비-인간 면역글로불린 중쇄 IgG 불변 영역 유전자의 막관통 및 세포질 암호화 서열(들)(예를 들어, M1 및/또는 M2 암호화 서열)에 작동 가능하게 연결된 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG CH1-H-CH2-CH3 폴리펩타이드를 암호화하는 서열) 및 일부 실시형태에서, IgE 불변 영역 유전자의 막관통 및 세포질 암호화 서열(들)에 작동 가능하게 연결된 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열(예를 들어, 인간 IgE CH1-CH2-CH3-CH4 폴리펩타이드를 암호화하는 서열)로 대체된다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 이종 면역글로불린 중쇄 불변 영역으로 대체된다. 일부 실시형태에서, 이종 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 하나 이상의 IgG 불변 영역 유전자의 막관통 및 세포질 암호화 서열(예를 들어, M1 및 M2 엑손)에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 이종 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 IgE 불변 영역 유전자의 막관통 및 세포질 암호화 서열(예를 들어, M1 및 M2 엑손)에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 이종 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 IgA 불변 영역 유전자의 막관통 및 세포질 암호화 서열(예를 들어, M 엑손[들])에 작동 가능하게 연결된다. 일부 특정 실시형태에서, 하나 이상의 CH 유전자 분절(예를 들어, Cμ, Cδ 등)은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 불변 영역 유전자의 막관통 및 세포질 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역에서 결실되거나 대체된다. 일부 실시형태에서, 이종 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열이다. 일부 실시형태에서, 변경되거나, 파괴되거나, 결실되거나, 하나 이상의 이종 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열로 대체되거나 조작되는 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 뮤린 면역글로불린 중쇄 불변 영역이다. 일부 실시형태에서, 이종 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 상기 IgG 불변 영역 유전자의 2개의 카피 중 IgG 불변 영역 유전자(예를 들어, Cγ1, Cγ2a, Cγ2b, Cγ2c 또는 Cγ3)의 하나의 카피(즉, 대립유전자) 내에 삽입되어, 이종 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 대해서 이형접합성인 비-인간 동물을 생성시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 이종 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 대해서 동형접합성인 비-인간 동물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 동일하거나 상이한 IgG 서브클래스의 비-인간 막관통 및 세포질 도메인 암호화 서열(예를 들어, 비-인간 IgG M1-M2)에 작동 가능하게 연결된 인간 세포외 도메인 암호화 서열(예를 들어, 인간 IgG CH1-H-CH2-CH3)을 각각 포함하는 CH 유전자 분절을 암호화하는 하나 이상의 IgG를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 본 명세서에 기재된 바와 같은 CH 유전자 분절을 암호화하는 하나 이상의 조작된 IgG를 포함하고, 야생형(예를 들어, 비변형된 비-인간 예컨대, 래트 또는 마우스) Cμ 불변 영역 유전자를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 본 명세서에 기재된 바와 같은 CH 유전자 분절을 암호화하는 하나 이상의 조작된 IgG를 포함하고, 야생형(예를 들어, 비변형된 비-인간 예컨대, 래트 또는 마우스) Cμ 및 Cδ 불변 영역 유전자를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 CH 유전자 분절을 암호화하는 조작된 IgG는 Cγ1, Cγ2a, Cγ2b, Cγ2c 또는 Cγ3으로부터 선택된 IgG 서브클래스의 CH 유전자 분절을 암호화하는 조작된 IgG이다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2a 유전자 분절의 M1 및 M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ2a 유전자 분절을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2a 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ2a 유전자 분절을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2c 유전자 분절의 M1 및 M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ2c 유전자 분절을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2c 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ2c 유전자 분절을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) C γ1 유전자 분절의 M1 및 M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 C γ1 유전자 분절을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ1 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ1 유전자 분절을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2a 유전자 분절의 M1 및 M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ2a 유전자 분절, 및 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ1 유전자 분절의 M1 및 M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ1 유전자 분절을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2a 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ2a 유전자 분절, 및 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ1 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ1 유전자 분절을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2c 유전자 분절의 M1 및 M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ2c 유전자 분절, 및 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ1 유전자 분절의 M1 및 M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ1 유전자 분절을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2c 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ2c 유전자 분절, 및 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, 비-인간(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ1 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 조작된 Cγ1 유전자 분절을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 예를 들어, 전체적으로 또는 부분적으로 결실을 통해서, 전체적으로 또는 부분적으로 변경을 통해서, 전체적으로 또는 부분적으로 파괴를 통해서, 전체적으로 또는 부분적으로 그 자체가 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 IgG CH1-H-CH2-CH3 또는 인간 IgG CH1-H-CH2-CH3-M1-M2(예를 들어, IgG2b 및/또는 IgG3)를 암호화하는 서열을 함유하지 않는 IgD, IgE, IgA 및 IgG를 암호화하는 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 유전자로의 대체를 통해서, 인간 IgG CH1-H-CH2-CH3 또는 인간 IgG CH1-H-CH2-CH3-M1-M2(예를 들어, IgG1 및/또는 IgG2a)를 암호화하는 서열을 포함하는 하나 이상의 IgG 불변 영역을 제외한 불변 영역 유전자(즉, 아이소타입)가 비기능성이 되도록 하는 것을 포함하는 하나 이상의 추가 변형을 포함한다. 조작된 비-인간 배아, 세포 및 이러한 비-인간 동물, 배아 및 세포를 제조하기 위한 표적화 벡터가 또한 제공된다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 야생형(예를 들어, 비변형된 비-인간 예컨대, 래트 또는 마우스) Cμ 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 상기 Cγ1 유전자 분절의 M1-M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ1 유전자 분절, 및 Cδ, Cγ2a, Cγ2c, Cγ2b, Cγ3, Cε 및 Cα 유전자 분절의 결실을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 야생형(예를 들어, 비변형된 비-인간 예컨대, 래트 또는 마우스) Cμ 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, 상기 Cγ1 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ1 유전자 분절, 및 Cδ, Cγ2a, Cγ2c, Cγ2b, Cγ3, Cε 및 Cα 유전자 분절의 결실을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 야생형(예를 들어, 비변형된 비-인간 예컨대, 래트 또는 마우스) Cμ 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 상기 Cγ2a 유전자 분절의 M1-M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ2a 유전자 분절, 및 Cδ, Cγ1, Cγ2b, Cγ2c, Cγ3, Cε 및 Cα 유전자 분절의 결실을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 야생형(예를 들어, 비변형된 비-인간 예컨대, 래트 또는 마우스) Cμ 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, 상기 Cγ2a 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ2a 유전자 분절, 및 Cδ, Cγ1, Cγ2b, Cγ2c, Cγ3, Cε 및 Cα 유전자 분절의 결실을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 야생형(예를 들어, 비변형된 비-인간 예컨대, 래트 또는 마우스) Cμ 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 상기 Cγ2c 유전자 분절의 M1-M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ2c 유전자 분절, 및 Cδ, Cγ1, Cγ2a, Cγ2b, Cγ3, Cε 및 Cα 유전자 분절의 결실을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 야생형(예를 들어, 비변형된 비-인간 예컨대, 래트 또는 마우스) Cμ 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, Cγ2c 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ2c 유전자 분절, 및 Cδ, Cγ1, Cγ2b, Cγ2c, Cγ3, Cε 및 Cα 유전자 분절의 결실을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역을, 그 자체가 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 IgG CH1-H-CH2-CH3 또는 인간 IgG CH1-H-CH2-CH3-M1-M2(예를 들어, IgG2b 및/또는 IgG3)를 암호화하는 서열을 함유하지 않는 IgD, IgE, IgA 및 IgG에 대한 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 유전자 내로 삽입함으로써, 인간 IgG CH1-H-CH2-CH3 또는 인간 IgG CH1-H-CH2-CH3-M1-M2(예를 들어, IgG1 및/또는 IgG2a)를 암호화하는 서열을 포함하는 하나 이상의 IgG 불변 영역을 제외한 불변 영역 유전자(즉, 아이소타입)가 변경, 변형, 대체, 조작되도록 조작하는 것을 포함하는 하나 이상의 추가 변형을 포함한다.
조작된 비-인간 배아, 세포 및 본 명세서에 기재된 조작된 불변 영역을 갖는 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물, 배아 및 세포를 제조하기 위한 표적화 벡터가 또한 제공된다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 야생형 Cμ 유전자 분절, 야생형 Cδ 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG3 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, Cγ3 유전자 분절의 M1-M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ3 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, Cγ1 유전자 분절의 M1-M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ1 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG2 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, Cγ2b 유전자 분절의 M1-M2에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ2b 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, Cγ2a 유전자 분절의 M1-M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ2a 유전자 분절(및/또는 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, Cγ2c 유전자 분절의 M1-M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ2c 유전자 분절), CH1-CH2-CH3-CH4 엑손 대신에 인간 IgE CH1-CH2-CH3-CH4를 암호화하고 Cε 유전자 분절의 M1-M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cε 유전자 분절, 및 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgA1 또는 IgA2 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, Cα 유전자 분절의 M 엑손(들)에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cα 유전자 분절을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 야생형 Cμ 유전자 분절, 야생형 Cδ 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG3 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, Cγ3 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ3 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, Cγ1 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ1 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG2 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, Cγ2b 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ2b 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, Cγ2a 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ2a 유전자 분절(및/또는 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하고, Cγ2c 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cγ2c 유전자 분절), CH1-CH2-CH3-CH4 엑손 대신에 인간 IgE CH1-CH2-CH3-CH4를 암호화하고 Cε 유전자 분절의 M1-M2 엑손에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cε 유전자 분절, 및 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgA1 또는 IgA2 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, Cα 유전자 분절의 M 엑손(들)에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 Cα 유전자 분절을 포함한다.
다양한 실시형태에서 본 명세서에는 도 1에 도시된 유전자 조작된 중쇄 면역글로불린 유전자좌, 뿐만 아니라 이러한 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스), ES 및 다른 세포 및 조직이 제공된다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서에는 인간 중쇄 가변 유전자 분절(인간 중쇄 V, D, 및 J 유전자 분절), 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Ei 인핸서, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cμ, Cδ, Cγ3, Cγ1, Cγ2b 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2a 유전자 분절의 M1-M2 엑손(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 래트 또는 마우스의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 엑손에 작동 가능하게 연결된 인간 IgG1의 세포외 도메인을 암호화하는 엑손, IgG2a)에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 키메라 Cγ2a 유전자 분절(및/또는 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2c 유전자 분절의 M1-M2 엑손(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 래트 또는 마우스의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 엑손에 작동 가능하게 연결된 인간 IgG1의 세포외 도메인을 암호화하는 엑손, IgG2c)에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 키메라 Cγ2c 유전자 분절), 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cε 및 Cα 유전자 분절, 및 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 인핸서를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 조절 영역을 포함하는 유전자 조작된 중쇄 면역글로불린 유전자좌가 제공된다. 예시적인 유전자 변형된 중쇄 유전자좌는 마우스 유전자좌 1로서 도 1에 제공된다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 유전자좌는 본 명세서 및 각각의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호에 기재된 바와 같은 기능성 Adam6 유전자를 포함한다. 유전자 변형된 비-인간 동물, ES 세포 및 다른 세포, 이러한 유전자 조작된 유전자좌를 포함하는 조직이 또한 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에는 인간 중쇄 가변 유전자 분절(인간 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절), 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Ei 인핸서, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cμ, Cδ, Cγ3, Cγ1, Cγ2b 유전자 분절, IgG1 세포외 및 막관통/세포질 암호화 서열 둘 다가 인간이도록 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하는 서열을 포함하는 인간 Cγ1 유전자 분절, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cε 및 Cα 유전자 분절, 및 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 인핸서를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 조절 영역을 포함하는 유전자 조작된 중쇄 면역글로불린 유전자좌가 제공된다. 예시적인 유전자 변형된 중쇄 유전자좌는 마우스 유전자좌 2로서 도 1에 제공된다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 유전자좌는 본 명세서 및 각각의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호에 기재된 바와 같은 기능성 Adam6 유전자를 포함한다. 유전자 변형된 비-인간 동물, ES 세포 및 다른 세포, 이러한 유전자 조작된 유전자좌를 포함하는 조직이 또한 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에는 인간 중쇄 가변 유전자 분절(인간 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절), 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Ei 인핸서, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cμ, Cδ, Cγ3 유전자 분절, CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하고, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ1 유전자 분절의 M1-M2 엑손(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 래트 또는 마우스의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 엑손에 작동 가능하게 연결된 인간 IgG4의 세포외 도메인을 암호화하는 엑손, IgG1)에 작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 키메라 Cγ1 유전자 분절, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2b, Cγ2a(및/또는 Cγ2c), Cε, Cα 유전자 분절, 및 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 인핸서를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 조절 영역을 포함하는 유전자 조작된 중쇄 면역글로불린 유전자좌가 제공된다. 예시적인 유전자 변형된 중쇄 유전자좌는 마우스 유전자좌 3으로서 도 1에 제공된다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 유전자좌는 본 명세서 및 각각의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호에 기재된 바와 같은 기능성 Adam6 유전자를 포함한다. 유전자 변형된 비-인간 동물, ES 세포 및 다른 세포, 이러한 유전자 조작된 유전자좌를 포함하는 조직이 또한 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에는 인간 중쇄 가변 유전자 분절(인간 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절), 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Ei 인핸서, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cμ, Cδ, Cγ3 유전자 분절, IgG4 세포외 및 막관통/세포질 암호화 서열 둘 다가 인간이도록 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2를 암호화하는 서열을 포함하는 인간 Cγ4 유전자 분절, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cγ2b, Cγ2a(및/또는 Cγ2c) 유전자 분절, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Cε 및 Cα 유전자 분절, 및 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 인핸서를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 조절 영역을 포함하는 유전자 조작된 중쇄 면역글로불린 유전자좌가 제공된다. 예시적인 유전자 변형된 중쇄 유전자좌는 마우스 유전자좌 4로서 도 1에 제공된다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 유전자좌는 본 명세서 및 각각의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호에 기재된 바와 같은 기능성 Adam6 유전자를 포함한다. 유전자 변형된 비-인간 동물, ES 세포 및 다른 세포, 이러한 유전자 조작된 유전자좌를 포함하는 조직이 또한 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에는 인간 중쇄 가변 유전자 분절(인간 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절), 인간 Ei 인핸서, 인간 Cμ, Cδ, Cγ3, 및 Cγ1 유전자 분절, 및 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 인핸서를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 조절 영역을 포함하는 유전자 조작된 중쇄 면역글로불린 유전자좌가 제공된다. 예시적인 유전자 변형된 중쇄 유전자좌는 마우스 유전자좌 5로서 도 1에 제공된다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 유전자좌는 본 명세서 및 각각의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호에 기재된 바와 같은 기능성 Adam6 유전자를 포함한다. 유전자 변형된 비-인간 동물, ES 세포 및 다른 세포, 이러한 유전자 조작된 유전자좌를 포함하는 조직이 또한 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에는 인간 중쇄 가변 유전자 분절(인간 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절), 인간 Ei 인핸서, 인간 Cμ, Cδ, Cγ3, Cγ1, Cγ2 및 Cγ4 유전자 분절, 및 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 인핸서를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 조절 영역을 포함하는 유전자 조작된 중쇄 면역글로불린 유전자좌가 제공된다. 예시적인 유전자 변형된 중쇄 유전자좌는 마우스 유전자좌 6으로서 도 1에 제공된다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 유전자좌는 본 명세서 및 각각의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호에 기재된 바와 같은 기능성 Adam6 유전자를 포함한다. 유전자 변형된 비-인간 동물, ES 세포 및 다른 세포, 이러한 유전자 조작된 유전자좌를 포함하는 조직이 또한 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 중쇄 가변 유전자 분절(설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절), 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Ei 인핸서, 인간 Cμ, Cδ, Cγ3, 및 Cγ1 유전자 분절, 및 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 인핸서를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 조절 영역을 포함하는 유전자 조작된 중쇄 면역글로불린 유전자좌가 제공된다. 예시적인 유전자 변형된 중쇄 유전자좌는 마우스 유전자좌 7로서 도 1에 제공된다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 유전자좌는 기능성 Adam6 유전자를 포함한다. 유전자 변형된 비-인간 동물, ES 세포 및 다른 세포, 이러한 유전자 조작된 유전자좌를 포함하는 조직이 또한 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 중쇄 가변 유전자 분절(설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절), 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Ei 인핸서, 인간 Cμ, Cδ, Cγ3, Cγ1, Cγ2 및 Cγ4 유전자 분절, 및 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 인핸서를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' 조절 영역을 포함하는 유전자 조작된 중쇄 면역글로불린 유전자좌가 제공된다. 예시적인 유전자 변형된 중쇄 유전자좌는 마우스 유전자좌 8로서 도 1에 제공된다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 유전자좌는 기능성 Adam6 유전자를 포함한다. 유전자 변형된 비-인간 동물, ES 세포 및 다른 세포, 이러한 유전자 조작된 유전자좌를 포함하는 조직이 또한 제공된다.
또한 본 명세서에는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 제조 방법은 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3 뉴클레오타이드 서열이 Cγ2a 유전자 분절의 M1 및 M2 엑손에 작동 가능하게 연결되도록 Cγ2a 유전자 분절의 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 폴리펩타이드를 암호화하는 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약 1.6kb의 DNA를 삽입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 제조 방법은 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 뉴클레오타이드 서열이 Cγ2a 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결되도록 Cγ2a 유전자 분절의 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 폴리펩타이드를 암호화하는 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약 6.8kb의 DNA를 삽입하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 제조 방법은 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3 뉴클레오타이드 서열이 Cγ2c 유전자 분절의 M1 및 M2 엑손에 작동 가능하게 연결되도록 Cγ2c 유전자 분절의 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 폴리펩타이드를 암호화하는 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약 1.6kb의 DNA를 삽입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 제조 방법은 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 뉴클레오타이드 서열이 Cγ2c 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결되도록 Cγ2c 유전자 분절의 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 폴리펩타이드를 암호화하는 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약 6.8kb의 DNA를 삽입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 제조 방법은 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3 뉴클레오타이드 서열이 Cγ1 유전자 분절의 M1 및 M2 엑손에 작동 가능하게 연결되도록 Cγ1 유전자 분절의 CH1-H-CH2-CH3 엑손 대신에 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 폴리펩타이드를 암호화하는 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약 1.5kb의 DNA를 삽입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 제조 방법은 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 뉴클레오타이드 서열이 Cγ1 유전자 분절의 스위치 영역에 작동 가능하게 연결되도록 Cγ1 유전자 분절의 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 엑손 대신에 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 폴리펩타이드를 암호화하는 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약 5.8kb의 DNA를 삽입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 제조 방법은 인간 Cμ, Cδ, Cγ3, Cγ1 서열을 포함하는 약 130kb의 DNA를 삽입하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 방법은 인간 Cγ2 및 Cγ4 서열을 포함하는 추가의 약 43kb의 DNA를 삽입하는 단계를 추가로 포함한다.
상기에 기재된 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 다양한 제조 방법에서, DNA를 내인성 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 중쇄 가변 유전자 분절을 포함하는 내인성 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 면역글로불린 중쇄 유전자좌, 또는 인간 중쇄 가변 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 도입할 수 있다. DNA는 상동성 재조합 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 다른 방법을 통해서 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)는 본 명세서에 기재된 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다. 특정 실시형태에서, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)는 본 명세서에 기재된 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
인간화된 면역글로불린 카파 유전자좌
특정 양상에서, 본 명세서에는 유전자 변형된 Igκ쇄 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)가 제공된다. 이러한 유전자좌는 κ 가변 영역 및 κ 불변 영역을 포함한다. κ 가변 영역은 Igκ쇄 가변 영역 유전자 분절(즉, 적어도 Vκ 유전자 분절 및 Jκ 유전자 분절)을 포함한다. 불변 영역은 Igκ쇄 불변 영역(Cκ) 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 κ쇄 가변 영역, 예컨대, 인간 Igκ 가변 영역은 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 및 Cκ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 불변 도메인을 포함하는 항체를 생산하도록 면역글로불린 κ쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서 Igκ 가변 영역은 재배열되지 않은 Igκ 가변 영역일 것이고, 따라서 재배열되지 않은 Igκ 가변 영역 유전자 분절을 함유할 것이다. 일부 실시형태에서, Igκ 가변 영역은 재배열된 Igκ 가변 영역일 것이고, 따라서 재배열된 Igκ 가변 영역 유전자를 함유할 것이다. 특정 실시형태에서, Igκ 가변 영역 유전자 분절은 인간 Igκ 가변 영역 유전자 분절이다. 특정 실시형태에서, Igκ 가변 영역 유전자 분절은 설치류 Igκ 가변 영역 유전자 분절(예를 들어, 래트 또는 마우스 가변 영역 유전자 분절)이다. 일부 실시형태에서, Igκ 불변 영역 유전자좌는 부분적으로 또는 완전히 인간인 Igκ 불변 영역 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 Igκ쇄 유전자좌는 내인성 Igκ쇄 유전자좌에 위치된다.
특정 실시형태에서, Igκ 가변 영역은 재배열되지 않은 인간 Igκ 가변 영역 유전자 분절을 함유한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 자연에서 나타나는 인간 Igκ 경쇄 유전자좌의 원위 가변 클러스터(또는 원위 아암 또는 원위 복제)에서 나타나는 적어도 인간 Vκ 유전자 분절을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 자연에서 나타나는 인간 Igκ 경쇄 유전자좌의 근위 가변 클러스터(또는 근위 아암 또는 근위 복제)에서 나타나는 적어도 인간 Vκ 유전자 분절을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 자연에서 나타나는 인간 Igκ 경쇄 유전자좌의 원위 및 근위 가변 클러스터에서 나타나는 인간 Vκ 유전자 분절을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 자연에서 나타나는 인간 Igκ 경쇄 유전자좌의 인간 Vκ 2-40(또는 Vκ 3D-7)과 인간 Vκ 4-1 유전자 분절(이들 포함) 사이에서 발견되는 기능성 인간 Vκ 유전자 분절의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 복수의 인간 Vκ 분절 및 하나 이상의 인간 Jκ 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 4개의 기능성 Vκ 분절 및 모든 인간 Jκ 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 16개의 기능성 Vκ 분절 및 모든 인간 Jκ 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 인간 Vκ 분절 모두 및 인간 Jκ 분절 모두를 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 그 초과(예를 들어, 36, 37, 38, 39, 40 등)의 인간 Vκ 유전자 분절을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 인간 Vκ 유전자 분절 Vκ 3D-7, Vκ 1D-8, Vκ 1D-43, Vκ 3D-11, Vκ 1D-12, Vκ 1D-13, Vκ 3D-15, Vκ 1D-16, Vκ 1D-17, Vκ 3D-20, Vκ 6D-21, Vκ 2D-26, Vκ 2D-28, Vκ 2D-29, Vκ 2D-30, Vκ 1D-33, Vκ 1D-39, Vκ 2D-40, Vκ 2-40, Vκ 1-39, Vκ 1-33, Vκ 2-30, Vκ 2-28, Vκ 1-27, Vκ 2-24, Vκ 6-21, Vκ 3-20, Vκ 1-17, Vκ 1-16, Vκ 3-15, Vκ 1-12, Vκ 3-11, Vκ 1-9, Vκ 1-8, Vκ 1-6, Vκ 1-5, Vκ 5-2 및 Vκ 4-1을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 적어도 인간 Vκ 유전자 분절 Vκ 3D-7, Vκ 1D-8, Vκ 1D-43, Vκ 3D-11, Vκ 1D-12, Vκ 1D-13, Vκ 3D-15, Vκ 1D-16, Vκ 1D-17, Vκ 3D-20, Vκ 6D-21, Vκ 2D-26, Vκ 2D-28, Vκ 2D-29, Vκ 2D-30, Vκ 1D-33, Vκ 1D-39 및 Vκ 2D-40을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 적어도 인간 Vκ 유전자 분절 Vκ 2-40, Vκ 1-39, Vκ 1-33, Vκ 2-30, Vκ 2-28, Vκ 1-27, Vκ 2-24, Vκ 6-21, Vκ 3-20, Vκ 1-17, Vκ 1-16, Vκ 3-15, Vκ 1-12, Vκ 3-11, Vκ 1-9, Vκ 1-8, Vκ 1-6, Vκ 1-5, Vκ 5-2 및 Vκ 4-1을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 비-인간 동물은 2개 이하의 인간 VL 유전자 분절 및 복수의 JL 유전자 분절(예를 들어, 이중 경쇄 마우스, 또는 DLC, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 공개 제2013/0198880호에 기재된 바와 같음)을 특징으로 하는 제한된 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 갖는다. 일부 실시형태에서 VL 유전자 분절은 Vκ 유전자 분절이다. 일부 실시형태에서 VL 유전자 분절은 Vλ 유전자 분절이다. 일부 실시형태에서 Vκ 유전자 분절은 Vκ 3-20 및 Vκ 1-39이다.
일부 실시형태에서, 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과의 기능성 인간 Jκ 유전자 분절을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 자연에서 나타나는 인간 Igκ 경쇄 유전자좌의 인간 Jκ1과 인간 Jκ5 유전자 분절(이들 포함) 사이에서 발견되는 기능성 인간 Jκ 유전자 분절의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 적어도 인간 Jκ 유전자 분절 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5를 포함한다.
추가의 다른 실시형태에서, 비-인간 유기체는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 이러한 비-인간 유기체에서 생성된 항체에 pH-의존적 결합 특성을 도입하도록 설계된 히스티딘 코돈의 삽입 및/또는 대체를 포함하는 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태 중 일부에서, 히스티딘 코돈은 CDR3을 암호화하는 핵산 서열에 삽입 및/또는 대체된다. 다양한 이러한 경쇄 면역글로불린 유전자좌는 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제9,301,510호, 제9,334,334호, 미국 특허 출원 공개 제2013/0247236호 제20140013456호에 제공되어 있다.
Igκ 유전자 분절을 포함하는 예시적인 가변 영역은 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52] 및 보충 정보에 제공되어 있다. 일부 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 인간 Jκ 분절의 전부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 Igκ 가변 영역 유전자 분절을 함유하는 Igκ 가변 유전자 유전자좌는 또한 인간 Igκ 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Igκ 가변 유전자 유전자좌는 비-인간(예를 들어, 설치류, 래트, 마우스) Igκ 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Igκ 유전자 유전자좌는 비-인간 조절 요소(예를 들어, 비-인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예를 들어, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다.
일부 실시형태에서, Igκ 가변 영역 유전자좌는 Igκ 가변 영역 유전자(범용 경쇄 가변 영역)를 포함하는 재배열된 가변 영역 유전자좌이다. 일부 실시형태에서, 재배열된 Igκ 가변 영역 유전자는 인간 재배열된 Igκ 가변 영역 유전자이다. 범용 경쇄 가변 영역의 사용은 이중특이적 항체의 생성을 용이하게 한다. 예시적인 재배열된 Ig 경쇄 가변 영역은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 공개 제2013/0185821호에 제공된다.
일부 실시형태에서, Igκ쇄 유전자좌는 인간 또는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 조절 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조절 요소는 내인성 조절 요소이다. 특정 실시형태에서, Igκ쇄 유전자좌는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 또는 인간 인트론성 κ 인핸서(Eκi)를 포함한다. 일부 실시형태에서, IgH 유전자좌는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 또는 인간 3' κ 인핸서(Eκ3')를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다. 특정 실시형태에서, 변형된 Igκ쇄 유전자좌는 내인성 유전자좌의 외부에 위치된 트랜스젠 상에 위치된다. 일부 실시형태에서, 내인성 Igκ쇄 유전자좌는 (예를 들어, 내인성 Igκ쇄 유전자좌의 전부 또는 일부의 결실, 재배치 및/또는 반전을 통해서) 불활성화된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 제조 방법은 인간 Igκ 불변 뉴클레오타이드 서열이 Igκ 불변 영역 유전자의 인핸서 및/또는 조절 영역에 작동 가능하게 연결되도록, Igκ 불변 영역 유전자의 Igκ 불변 엑손 대신에 면역글로불린 κ 경쇄 불변 도메인 폴리펩타이드를 암호화하는 인간 Igκ 불변 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약 0.5kb의 DNA를 삽입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)는 본 명세서에 기재된 변형된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다. 특정 실시형태에서, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)는 본 명세서에 기재된 변형된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
인간화된 면역글로불린 람다 유전자좌
특정 양상에서, 본 명세서에는 유전자 변형된 Igλ쇄 유전자좌를 포함하는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)가 제공된다. 이러한 유전자좌는 Igλ쇄 가변 영역 유전자 분절(즉, 적어도 Vλ 유전자 분절 및 Jλ 유전자 분절)을 포함한다. 변형된 λ 유전자좌는 적어도 하나의 Igλ쇄 불변 영역(Cλ) 유전자 분절을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, Vλ 유전자 분절 및 Jλ 유전자 분절, 예컨대, 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절은 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 및 Cλ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 불변 도메인을 포함하는 항체를 생산하도록 Cλ에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서 Vλ 유전자 분절 및 Jλ 유전자 분절은 재배열되지 않은 Vλ 및 Jλ 유전자 분절일 것이다. 일부 실시형태에서, Vλ 유전자 분절 및 Jλ 유전자 분절은 재배열된 Vλ 및 Jλ 유전자 분절일 것이고, 따라서 재배열된 가변 영역 유전자의 형태로 존재할 것이다. 특정 실시형태에서, Igλ 가변 영역 유전자 분절은 인간 가변 영역 유전자 분절이다. 특정 실시형태에서, Igλ 가변 영역 유전자 분절은 설치류 가변 영역 유전자 분절(예를 들어, 래트 또는 마우스 가변 영역 유전자 분절)이다. 일부 실시형태에서, Igλ 불변 영역 유전자좌는 부분적으로 또는 완전히 인간인 λ 불변 영역 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 Igλ쇄 유전자좌는 내인성 Igλ쇄 유전자좌에 위치된다. Igλ 유전자 분절을 포함하는 예시적인 가변 영역은 예를 들어, 미국 특허 공개 제2012/0073004호 및 제2002/0088016호 및 미국 특허 출원 제15/803,513호(출원일: 2017년 11월 3일; US2018/0125043로서 공개)(이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨)에 제공되어 있다.
일부 실시형태에서, 재배열되지 않은 인간 Igκ 가변 영역 유전자 분절을 함유하는 Igλ 가변 유전자 유전자좌는 또한 인간 Igλ 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Igλ 가변 유전자 유전자좌는 비-인간(예를 들어, 설치류, 래트, 마우스) Igλ 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Igλ 유전자 유전자좌는 비-인간 조절 요소(예를 들어, 비-인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예를 들어, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다.
인간 Igλ 경쇄 유전자좌는, 일부 실시형태에서, 인간 Igλ 경쇄 유전자좌로부터의 유전 물질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 Igλ 경쇄 유전자좌는 적어도 하나의 인간 Vλ 유전자 분절, 적어도 하나의 인간 Jλ 유전자 분절, 적어도 하나의 인간 Cλ 유전자 분절, 및 상기 적어도 하나의 인간 Vλ 유전자 분절과 상기 적어도 하나의 인간 Jλ 유전자 분절의 재배열(예를 들어, 재조합 신호 서열[들])을 촉진시켜 인간 Vλ 도메인을 암호화하는 기능성 재배열된 인간 Vλ-Jλ 서열을 형성하는 데 필요한 하나 이상의 서열을 포함한다. 다수의 실시형태에서, 인간 Igλ 경쇄 서열은 복수의 인간 Vλ 유전자 분절 및 상기 인간 Vλ 유전자 분절과 적어도 하나의 인간 Jλ 유전자 분절의 재배열을 촉진시키는 데 필요한 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 Igλ 경쇄 서열은 인간 Igλ 경쇄 유전자좌(예를 들어, 박테리아 인공 염색체로부터 단리되고/되거나 클로닝됨)의 게놈 서열이고, 생식세포계열 구성 내에 복수의 인간 Vλ 유전자 분절을 함유한다. 일부 실시형태에서, 인간 Igλ 경쇄 서열은 생식세포계열 구성 내에 인간 Vλ, Jλ 및 Cλ 서열을 포함한다(즉, 상기 인간 Vλ, Jλ 및 Cλ 서열은 인간 세포에서 Igλ 경쇄 유전자좌에서 나타나고, 즉, Jλ 및 Cλ 서열은 Jλ Cλ 클러스터로서 나타나기 때문). 일부 실시형태에서, 인간 Igλ 경쇄 서열은 전체적으로 또는 부분적으로 Igλ 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는데, Igλ 경쇄 폴리펩타이드는 면역글로불린, 특히 인간 B 세포에 의해서 발현되는 면역글로불린에서 나타난다. 상응하는 비-인간 Igλ 경쇄 서열(예를 들어, 내인성 설치류 Igλ 경쇄 유전자좌) 대신에 상기 인간 Igλ 경쇄 서열을 함유하는 비-인간 동물, 배아, 세포 및 비-인간 동물, 비-인간 배아, 및 세포를 제조하기 위한 표적화 작제물이 또한 제공된다.
일부 실시형태에서, 인간 Igλ 경쇄 서열은 비-인간 동물의 생식세포계열 게놈 내에 상응하는 비-인간 Igλ 경쇄 서열 대신에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 인간 Igλ 경쇄 서열은 비-인간 Igλ 경쇄 서열(예를 들어, 비-인간 Igλ 경쇄 불변 영역 서열)의 상류에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 인간 Igλ 경쇄 서열은 상기 인간 Igλ 경쇄 서열이 비-인간 Igλ 경쇄 서열과 병치되도록 하나 이상의 비-인간 Igλ 경쇄 서열의 중간에 삽입된다.
특정 실시형태에서, Igλ쇄 유전자좌는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 20, 30 또는 40개의 기능성 Vλ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자좌는 인간 Vλ 유전자 분절 Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자좌는 Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-14, Vλ3-16, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25 및 Vλ3-27을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자좌는 Vλ3-27, Vλ1-36, Vλ5-37, Vλ5-39, Vλ1-40, Vλ7-43, Vλ1-44, Vλ5-45, Vλ7-46, Vλ1-47, Vλ9-49, Vλ1-51 및 Vλ5-52를 포함한다. 특정 실시형태에서, 유전자좌는 Vλ10-54, Vλ6-57, Vλ4-60, Vλ8-61 및 Vλ4-69를 포함한다. 일부 실시형태에서, Igλ쇄 유전자좌는 하나 이상의 인간 Jλ-Cλ 쌍을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, Igλ쇄 유전자좌는 인간 Vλ 유전자 분절의 하류에 인간 Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6 및/또는 Jλ7-Cλ7을 포함한다. 일부 실시형태에서, Igλ쇄 유전자좌는 도 2a에 도시된 바와 같이, 인간 Vλ 유전자 분절의 하류에 인간 Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6, 인간 Jλ7 및 마우스 Cλ1을 포함한다.
일부 실시형태에서, Igλ 유전자좌는 Igλ 가변 영역 유전자(범용 경쇄 가변 영역)를 포함하는 재배열된 유전자좌이다. 일부 실시형태에서, 재배열된 Igλ 가변 영역 유전자는 인간 재배열된 Igλ 가변 영역 유전자이다. 범용 경쇄 가변 영역의 사용은 적어도 하나의 항원-결합 도메인이 결합된 이중특이적 항체의 생성을 용이하게 한다. 예시적인 재배열된 Ig 경쇄 가변 영역은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 공개 제2013/0185821호에 제공된다.
일부 실시형태에서, Igλ쇄 유전자좌는 인간 또는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 조절 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조절 요소는 내인성 조절 요소이다. 특정 실시형태에서, Igλ쇄 유전자좌는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) λ 인핸서 2.4를 포함한다. 일부 실시형태에서, Igλ쇄 유전자좌는 인간 또는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 3' λ 인핸서를 포함한다. 일부 실시형태에서, Igλ쇄 유전자좌는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) λ 인핸서 3.1을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다. 특정 실시형태에서, 변형된 Igλ쇄 유전자좌는 내인성 유전자좌의 외부에 위치된 트랜스젠 상에 위치된다. 일부 실시형태에서, 내인성 Igλ쇄 유전자좌는 (예를 들어, 내인성 Igλ쇄 유전자좌의 전부 또는 일부의 결실, 재배치 및/또는 반전을 통해서) 불활성화된다.
일부 실시형태에서, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)는 변형된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다. 특정 실시형태에서, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)는 변형된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
일부 실시형태에서, 비-인간 유기체는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 경쇄 가변 유전자 분절의 제한된 레퍼토리를 포함하는 경쇄 면역글로불린 유전자좌(예를 들어, 2개의 경쇄 가변 유전자 분절을 포함하는 이중 경쇄 가변 영역)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 경쇄 유전자 분절의 제한된 레퍼토리 내의 경쇄 가변 유전자 분절은 인간 경쇄 유전자 분절이다. 예시적인 이중 Ig 경쇄 가변 영역은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 공개 제2013/0198880호에 제공된다. 일부 실시형태에서, 이중 경쇄 가변 영역을 포함하는 비-인간 유기체를 사용하여 이중특이적 항체를 생산한다.
인간화된 CD79a 및 CD79b 유전자좌
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)는 인간 또는 인간화된 B-세포 항원 수용체 복합체-회합된 단백질 알파쇄(CD79a 또는 Igα) 및/또는 B-세포 항원 수용체 복합체-회합된 단백질 베타쇄(CD79b 또는 Igβ) 유전자좌를 포함한다. 인간 또는 인간화된 CD79a 및 CD79b 유전자를 함유하는 설치류는 B 세포의 표면 상에서 이종이량체로서 인간 또는 인간화된 CD79a 및 CD79b 폴리펩타이드를 발현하며, 이것은 비공유 방식으로 막-발현된 면역글로불린과 회합하여 B 세포 수용체(BCR)를 형성한다. BCR은 항원과 회합되고, 항원과의 결속 후 신호 전달 및 내재화에서 기능한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 설치류는 인간 또는 인간화된 CD79a 및 CD79b 유전자를 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 설치류는 설치류 CD79a 부분 및 인간 CD79a 부분을 포함하는 CD79a 유전자, 및 설치류 CD79b 부분 및 인간 CD79b 부분을 포함하는 CD79b 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 인간 CD79a 부분은 인간 CD79a 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 실질적으로 전부(예를 들어, 인간 CD79a 폴리펩타이드의 잔기 33-143에 상응하는 아미노산)를 암호화하고 및 인간 CD79b 부분은 인간 CD79b 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 실질적으로 전부(예를 들어, 인간 CD79b 폴리펩타이드의 잔기 29-159에 상응하는 아미노산)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 설치류 CD79a 및 CD79b 부분은 각각 내인성 CD79a 및 CD79b 폴리펩타이드의 적어도 세포내 도메인을 각각 암호화하고; 일부 특정 실시형태에서 각각 내인성 CD79a 및 CD79b 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 각각 암호화한다. 일부 실시형태에서, 인간 부분 및 내인성 부분은 각각 내인성 CD79a 또는 CD79b 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 설치류는 설치류 CD79a 부분 및 인간 CD79a 부분을 포함하는 키메라 CD79a 유전자를 추가로 포함하며, 여기서 인간 CD79a 부분은 인간 CD79a 폴리펩타이드의 잔기 33-116에 상응하는 아미노산을 포함하는 서열을 암호화하고, 일 실시형태에서 그것은 인간 CD79a 폴리펩타이드의 아미노산 33-119를 포함하는 서열을 암호화하고, 일 실시형태에서 그것은 인간 CD79a 폴리펩타이드의 아미노산 33-143을 포함하는 서열을 암호화하고, 일 실시형태에서, 그것은 인간 CD79a 폴리펩타이드의 아미노산 33-165를 포함하는 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 키메라 CD79a 폴리펩타이드는 인간 Ig C2-유사 도메인을 포함하고; 일부 실시형태에서, 키메라 CD79a 폴리펩타이드는 또한 인간 줄기 영역을 포함하고; 일부 실시형태에서, 키메라 CD79a 폴리펩타이드는 또한 인간 막관통 도메인을 포함하고; 일부 실시형태에서, 키메라 CD79a 폴리펩타이드는 설치류(예를 들어, 마우스) 세포질 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 설치류는 본 명세서에 기재된 인간 영역 부분 및 인간 또는 설치류(예를 들어, 마우스) CD79a 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 키메라 CD79a 유전자를 포함하며; 일 실시형태에서, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열은 마우스 CD79a의 아미노산 1-28을 암호화하는 마우스 CD79a 서열이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 설치류는 설치류 CD79b 부분 및 인간 CD79b 부분을 포함하는 키메라 CD79b 유전자를 추가로 포함하며, 여기서 인간 CD79b 부분은 인간 CD79b 폴리펩타이드의 잔기 29-135에 상응하는 아미노산을 포함하는 서열을 암호화하고, 일 실시형태에서 그것은 인간 CD79b 폴리펩타이드의 아미노산 29-159를 포함하는 서열을 암호화하고, 일 실시형태에서 그것은 인간 CD79b 폴리펩타이드의 아미노산 29-184를 포함하는 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 키메라 CD79b 폴리펩타이드는 인간 Ig V유사 도메인을 포함하고; 일부 실시형태에서, 키메라 CD79b 폴리펩타이드는 또한 인간 줄기 영역을 포함하고; 일부 실시형태에서, 키메라 CD79b 폴리펩타이드는 또한 인간 막관통 도메인을 포함하고; 일부 실시형태에서, 키메라 CD79b 폴리펩타이드는 설치류(예를 들어, 마우스) 세포질 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 설치류는 본 명세서에 기재된 인간 영역 부분 및 인간 또는 설치류(예를 들어, 마우스) CD79b 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 키메라 CD79b 유전자를 포함하며; 일 실시형태에서, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열은 마우스 CD79b의 아미노산 1-25를 암호화하는 마우스 CD79b 서열이다.
젠뱅크 수탁 번호 NP_001774.1, NM_001783.3, NP_067612.1 및 NM_021601.3, 및 유니프로트 ID P11912는 목적하는 인간 부분이 획득될 수 있는 인간 CD79A 유전자 및 인간 CD79A 폴리펩타이드의 대표적인 공급원 서열을 제공한다. 젠뱅크 수탁 번호 NP_000617.1, NM_000626.2, NP_001035022.1, NM_001039933.1, NP_067613.1 및 NM_021602.2, 및 유니프로트 ID P40259는 목적하는 인간 부분이 획득될 수 있는 인간 CD79B 유전자 및 인간 CD79B 폴리펩타이드의 대표적인 공급원 서열을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)는 미국 특허 출원 공개 제2011-0093963 A1호 및 제2009-0053210 A1호; 국제 특허 출원 공개 제WO 2008/027986호; 및 유럽 특허 제2 064 325 B1호(이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨)에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 CD79A 및 CD79B 유전자를 추가로 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 설치류는 내인성 CD79a 부분 및 인간 CD79a 부분을 포함하는 인간화된 CD79a 유전자, 및 내인성 CD79b 부분 및 인간 CD79b 부분을 포함하는 인간화된 CD79b 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 인간 CD79a 부분은 인간 CD79a 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 실질적으로 전부(예를 들어, 인간 CD79a 폴리펩타이드의 잔기 33-143에 상응하는 아미노산)를 암호화하고 및 인간 CD79b 부분은 인간 CD79b 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 실질적으로 전부(예를 들어, 인간 CD79b 폴리펩타이드의 잔기 29-159에 상응하는 아미노산)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 설치류는 내인성 CD79a 부분 및 인간 CD79a 부분을 포함하는 인간화된 CD79a 유전자, 및 내인성 CD79b 부분 및 인간 CD79b 부분을 포함하는 인간화된 CD79b 유전자를 포함하고, 여기서 인간 CD79a 부분은 아미노산 33-116(예를 들어, 인간 CD79a 폴리펩타이드의 아미노산 33-119를 포함하는 서열, 아미노산 33-143을 포함하는 서열, 또는 아미노산 33-165을 포함하는 서열)을 포함하는 서열을 암호화하고, 인간 CD79b 부분은 아미노산 29-135(예를 들어, 인간 CD79a 폴리펩타이드의 아미노산 29-159를 포함하는 서열, 또는 아미노산 29-184를 포함하는 서열)를 포함하는 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 내인성 CD79a 및 CD79b 부분은 각각 내인성 CD79a 및 CD79b 폴리펩타이드의 적어도 세포내 도메인을 각각 암호화하고; 일부 특정 실시형태에서 각각 내인성 CD79a 및 CD79b 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 각각 암호화한다.
인간화된 신생아 Fc 수용체 유전자좌
일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)는 이의 게놈 내에 인간화된 또는 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn) 유전자좌를 발현 및/또는 포함한다. 브람벨(Brambell) 수용체라고도 공지된 FcRn은 내피 세포에 의해서 발현되고, 베타-2-마이크로글로불린(β2M)과 회합하고, IgG 항체의 Fc 도메인 및 혈청 알부민 둘 다에 결합하는 단백질이다. FcRn은 IgG 및 혈청 알부민의 반감기를 연장시킨다. 구체적으로, pH 의존적인 방식으로 IgG 및 혈청 알부민에 결합함으로써, FcRn은 내피 세포에 의한 리소좀 분해로부터 이들 혈청 단백질을 구제함으로써, 이러한 단백질의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, FcRn 유전자좌는 인간 세포외 도메인, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 막관통 도메인 및 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 세포질 도메인을 포함하는 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcRn 유전자좌는 인간 세포외 도메인, 인간(예를 들어, 마우스 또는 래트) 막관통 도메인 및 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 세포질 도메인을 포함하는 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcRn 유전자좌는 인간 세포외 도메인, 인간(예를 들어, 마우스 또는 래트) 막관통 도메인 및 인간(예를 들어, 마우스 또는 래트) 세포질 도메인을 포함하는 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 내인성 FcRn 유전자좌에서 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 이러한 유전자좌를 포함하는 설치류가 인간 세포외 도메인 및 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 막관통 및 세포질 도메인을 갖는 FcRn을 발현하도록 인간 FcRn의 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열로 대체된다. 일부 실시형태에서, 설치류는 설치류 FcRn을 발현하지 않거나, 기능성 설치류 FcRn을 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, FcRn 유전자 유전자좌는 비-인간 조절 요소(예를 들어, 비-인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예를 들어, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다.
특정 실시형태에서, 마우스 FcRn 유전자의 알파 1, 알파 2 및 알파 3 도메인(제1의 3개의 암호 엑손인 엑손 3, 4 및 5)을 암호화하는 마우스 엑손은 인간 FcRn 유전자의 알파 1, 알파 2 및 알파 3 도메인(엑손 3, 4 및 5)을 암호화하는 인간 엑손으로 대체된다(도 4 참조). 일부 실시형태에서, FcRn 유전자는 마우스 엑손 1(비-암호 엑손), 마우스 엑손 2(신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 포함) 및 인간 엑손 3-6, 마우스 엑손 6 및 7(막관통 도메인 및 세포질 도메인을 암호화함)을 포함한다. 일부 실시형태에서 유전자좌에 의해서 암호화된 인간화된 FcRn의 아미노산 서열은 서열번호 16이다.
젠뱅크 수탁 번호 NC_000019.10(49512279-49526428), NM_001136019.1 및 NP_001129491.1은 목적하는 인간 부분이 획득될 수 있는 인간 FcRn 유전자, cDNA 및 폴리펩타이드의 대표적인 공급원 서열을 제공한다. 젠뱅크 수탁 번호 NC_000073.6(45092992-45103846), NM_010189.1 및 NP_034319.1은 목적하는 마우스 부분이 획득될 수 있고/있거나 표적화 벡터 상동성 아암의 설계에 사용될 수 있는 마우스 FcRn 유전자, cDNA 및 폴리펩타이드의 대표적인 공급원 서열을 제공한다.
일부 실시형태에서, 설치류는 유전자 변형된 FcRn 유전자좌에 대해서 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 설치류는 유전자 변형된 FcRn 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
인간화된 β-2-마이크로글로불린
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 변형된 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 및 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간화된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자좌를 발현 및/또는 포함한다. β2M는 막관통 영역이 결여되고, FcRn 및 MHC 클래스 I 분자와 회합하는 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, β2M 유전자좌는 인간 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서 인간 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다. 일부 실시형태에서, 설치류는 설치류 β2M을 발현하지 않거나, 기능성 설치류 β2M 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, β2M 유전자 유전자좌는 비-인간 조절 요소(예를 들어, 비-인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예를 들어, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다.
인간화된 β2M 폴리펩타이드, 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자좌 및 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 발현하는 비-인간 동물은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 공개 제2013/0111617호 및 제2013/0185819호에 기재되어 있다. 따라서, 미국 특허 공개 제 2013/0111617호 및 제2013/0185819호에 기재된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 비-인간 동물(예를 들어, 마우스)은 인간화된 β2M 유전자를 포함하고, 여기서 유전자는 인간 β2M 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함하고, 일부 실시형태에서, 인간화된 β2M 유전자는 비-인간(예를 들어, 마우스) β2M 유전자의 엑손 1을 포함한다. 인간화된 β2M 유전자좌는 도 5에 개략적으로 도시되어 있다. 일부 실시형태에서, 설치류는 유전자 변형된 β2M 유전자좌에 대해서 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 설치류는 유전자 변형된 β2M 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
인간화된 Fc 엡실론 수용체 1 알파
일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)는 이의 게놈 내에 인간화된 또는 인간 Fc 엡실론 수용체 1 알파(FcεR1α)를 발현 및/또는 포함한다. FcεR1α는 FcεR1β 및 FcεR1γ와 회합하여 표피 랑게르한스 세포, 호산구, 비만 세포 및 호염기 상에서 발현되는 IgE에 대한 고-친화도 수용체인 FcεR1을 형성한다. FcεR1의 IgE 결합 부위는 FcεR1α 소단위에서 발견된다.
일부 실시형태에서, FcεR1α 유전자좌는 인간 세포외 도메인, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 막관통 도메인 및 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 세포질 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcεR1α 유전자좌는 인간 세포외 도메인, 인간 막관통 도메인 및 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 세포질 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcεR1α 유전자좌는 인간 세포외 도메인, 인간 막관통 도메인 및 인간 세포질 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 조작된 FcεR1α 유전자좌의 예시적인 실시형태는 도 9에 도시되어 있다.
일부 실시형태에서 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 내인성 FcεR1α 유전자좌에서 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 이러한 유전자좌를 포함하는 설치류가 인간 세포외 도메인 및 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 막관통 및 세포질 도메인을 갖는 FcεR1α을 발현하도록 인간 FcεR1α의 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열로 대체된다. 일부 실시형태에서 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드, 인간 막관통 도메인, 및 인간 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자좌에 위치된다. 일부 실시형태에서 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드, 인간 막관통 도메인, 및 인간 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다. 일부 실시형태에서, 설치류는 설치류 FcεR1α를 발현하지 않거나, 기능성 설치류 FcεR1α를 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, FcεR1α 유전자 유전자좌는 비-인간 조절 요소(예를 들어, 비-인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예를 들어, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다.
특정 실시형태에서, 마우스 FcεRIα의 마우스 암호 엑손 1, 암호 엑손 2, 암호 엑손 3, 암호 엑손 4, 및 암호 엑손 5의 부분은 인간 FcεRIα 유전자의 인간 암호 엑손 1, 암호 엑손 2, 암호 엑손 3, 암호 엑손 4 및 암호 엑손 5의 부분으로 대체된다. 일부 실시형태에서, FcεRIα 유전자는 키메라 마우스/인간 엑손 1(마우스 프로모터 및 5' UTR을 포함함), 정지 코돈을 통해서 인간 암호 엑손 2-5, 인간 3'UTR 및 폴리A, 그 다음 마우스 3'UTR 및 폴리A를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 유전자 엑손 1(부분) 및 2는 신호 펩타이드를 암호화하고, 엑손 3 및 4는 IgE와 상호작용하는 것으로 여겨지는 FcεRIα의 2개의 Ig-유사 도메인을 암호화하고, 엑손 5는 단백질의 세포질 및 막관통 도메인을 암호화한다(도 9 참조).
젠뱅크 수탁 번호 NC_000001.11 (159283888-159308224), NM_002001.3 및 NP_001992.1은 목적하는 인간 부분이 획득될 수 있는 인간 FcεR1α 유전자, cDNA 및 폴리펩타이드의 대표적인 공급원 서열을 제공한다. 젠뱅크 수탁 번호 NC_000067.6(173221269-173227232), NM_010184.1 및 NP_034314.1은 목적하는 마우스 부분이 획득될 수 있고/있거나 표적화 벡터 상동성 아암의 설계에 사용될 수 있는 마우스 FcεR1α 유전자, cDNA 및 폴리펩타이드의 대표적인 공급원 서열을 제공한다.
일부 실시형태에서, 설치류는 유전자 변형된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 설치류는 유전자 변형된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
인간화된 Fc 감마 수용체 1a
일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)는 이의 게놈 내에 인간화된 또는 인간 Fc 감마 수용체 1a(FcγR1a, 종종 도면에서 FcγR1로 표시됨) 유전자좌를 포함 및/또는 발현한다. FcγR1a는 IgG의 Fc 부분에 결합하여 숙주 세포의 활성화를 야기하는 단핵구 상에서 발현되는 고 친화성 FcγR 단백질이다.
일부 실시형태에서, FcγR1a 유전자좌는 인간 세포외 도메인, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 막관통 도메인 및 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 세포질 도메인을 포함하는 FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcγR1a 유전자좌는 인간 세포외 도메인, 인간(예를 들어, 마우스 또는 래트) 막관통 도메인 및 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 세포질 도메인을 포함하는 FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcγR1a 유전자좌는 인간 세포외 도메인, 인간(예를 들어, 마우스 또는 래트) 막관통 도메인 및 인간(예를 들어, 마우스 또는 래트) 세포질 도메인을 포함하는 FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcγR1a 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcγR1a 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 내인성 FcγR1a 유전자좌에서 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 이러한 유전자좌를 포함하는 설치류가 인간 세포외 도메인 및 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 막관통 및 세포질 도메인을 갖는 FcγR1a을 발현하도록 인간 FcεR1α의 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열로 대체된다. 일부 실시형태에서, 설치류는 설치류 FcγR1a를 발현하지 않거나, 기능성 설치류 FcγR1a를 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, FcγR1a 유전자 유전자좌는 비-인간 조절 요소(예를 들어, 비-인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예를 들어, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다.
인간화된 FcγR1a 폴리펩타이드, 인간화된 FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자좌 및 인간화된 FcγR1a 폴리펩타이드를 발현하는 비-인간 동물은 각각의 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제9,474,255호 및 미국 특허 공개 제2017/0086432호에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 설치류는 유전자 변형된 FcγR1a 유전자좌에 대해서 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 설치류는 유전자 변형된 FcγR1a 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
인간화된 저 친화성 Fc 감마 수용체
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 변형된 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 및 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 저 친화성 Fc 감마 수용체(FcγR) 폴리펩타이드(예를 들어, 인간 FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 또는 FcγRIIIb 폴리펩타이드)를 암호화하는 유전자좌를 발현 및/또는 포함한다.
일부 실시형태에서, 저 친화성 FcγR 유전자좌는 인간 FcγRIIa 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서 인간 FcγRIIa 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 FcγRIIa 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다. 구체적인 실시형태에서, 인간 FcγRIIa 유전자는 다형성을 포함하고, 여기서 다형성은 131His 저 반응자 다형성 및 131Arg 저 반응자 다형성으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에서, FcγRIIa 다형성은 131His 저 반응자 다형성이다. 일부 실시형태에서, 설치류는 설치류 저 친화성 FcγR 폴리펩타이드를 발현하지 않는다(예를 들어, 설치류 FcγRIIb, FcγRIV 및/또는 FcγRIII 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, 기능성 설치류 FcγRIIb, FcγRIV 및/또는 FcγRIII 폴리펩타이드를 발현하지 않는다). 일부 실시형태에서, FcγRIIa 유전자 유전자좌는 비-인간 조절 요소(예를 들어, 비-인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예를 들어, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다.
일부 실시형태에서, 저 친화성 FcγR 유전자좌는 인간 FcγRIIb 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서 인간 FcγRIIb 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 FcγRIIb 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다. 구체적인 실시형태에서, 인간 FcγRIIb 유전자는 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 치환은 187Ile 또는 187Thr 치환으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 설치류는 설치류 저 친화성 FcγR 폴리펩타이드를 발현하지 않는다(예를 들어, 설치류 FcγRIIb, FcγRIV 및/또는 FcγRIII 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, 기능성 설치류 FcγRIIb, FcγRIV 및/또는 FcγRIII 폴리펩타이드를 발현하지 않는다). 일부 실시형태에서, FcγRIIb 유전자 유전자좌는 비-인간 조절 요소(예를 들어, 비-인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예를 들어, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다.
일부 실시형태에서, 저 친화성 FcγR 유전자좌는 인간 FcγRIIc 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서 인간 FcγRIIc 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 FcγRIIc 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다. 일 실시형태에서, FcγRIIc 유전자는 특정 대립유전자 변이체이고, 여기서 대립유전자 변이체는 57Stop 변이체 및 57Q 변이체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 설치류는 설치류 저 친화성 FcγR 폴리펩타이드를 발현하지 않는다(예를 들어, 설치류 FcγRIIB, FcγRIV 및/또는 FcγRIII 폴리펩타이드를 발현하지 않는다). 일부 실시형태에서, FcγRIIc 유전자 유전자좌는 비-인간 조절 요소(예를 들어, 비-인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예를 들어, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다.
일부 실시형태에서, 저 친화성 FcγR 유전자좌는 인간 FcγRIIIa 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서 인간 FcγRIIIa 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 FcγRIIIa 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다. 일부 실시형태에서, 설치류는 설치류 저 친화성 FcγR 폴리펩타이드를 발현하지 않는다(예를 들어, 설치류 FcγRIIb, FcγRIV 및/또는 FcγRIII 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, 기능성 설치류 FcγRIIb, FcγRIV 및/또는 FcγRIII 폴리펩타이드를 발현하지 않는다). 일 실시형태에서, FcγRIIIa 유전자는 특정 대립유전자 변이체이고, 여기서 대립유전자 변이체는 176Val 변이체 및 176Phe 변이체로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에서, FcγRIIIa 대립유전자 변이체는 176Val 변이체이다. 일부 실시형태에서, FcγRIIIa 유전자 유전자좌는 비-인간 조절 요소(예를 들어, 비-인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예를 들어, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다.
일부 실시형태에서, 저 친화성 FcγR 유전자좌는 인간 FcγRIIIb 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서 인간 FcγRIIIb 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서 FcγRIIIb 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다. 구체적인 실시형태에서, FcγRIIIb 유전자는 특정 대립유전자 변이체이고, 여기서 대립유전자 변이체는 NA1 변이체 및 NA2 변이체로부터 선택된다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, FcγRIIIb 대립유전자 변이체는 NA2 변이체이다. 일부 실시형태에서, 설치류는 설치류 저 친화성 FcγR 폴리펩타이드를 발현하지 않는다(예를 들어, 설치류 FcγRIIb, FcγRIV 및/또는 FcγRIII 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, 기능성 설치류 FcγRIIb, FcγRIV 및/또는 FcγRIII 폴리펩타이드를 발현하지 않는다). 일부 실시형태에서, FcγRIIIb 유전자 유전자좌는 비-인간 조절 요소(예를 들어, 비-인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예를 들어, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)는 미국 특허 제9,221,894호, 제9,056,130호, 제9,089,599호, 제8,658,154호, 제8,883,496호 또는 제8,658,853에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 저 친화성 FcγR 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)는 적어도 2개의 저 친화성 인간 FcγR 유전자 및 내인성 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Fc γ-쇄 유전자를 포함하며, 여기서 저 친화성 인간 FcγR 유전자는 인간 FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)는 인간 FcγRIIa 및 FcγRIIIb, 내인성 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Fc γ-쇄 유전자를 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)는 FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIb, FcγRIIc 및 FcγRIIId 유전자, 및 내인성 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) Fc γ-쇄 유전자를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 하나 이상의 인간 FcγR을 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)는 내인성 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) FcγRIIB, FcγRIV 및 FcγRIII 유전자(즉, 내인성 설치류 FcγRIIb, FcγRIV 및 FcγRIII α-쇄 암호화 서열)에서 동형접합성 파괴를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 저 친화성 FcγR을 포함하는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)는 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 폴리펩타이드(예를 들어, 내인성 저 친화성 FcγR α-쇄 폴리펩타이드)를 검출 가능하게 발현하지 않는다.
일부 실시형태에서, 설치류는 유전자 변형된 저 친화성 FcγR 유전자좌에 대해서 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 설치류는 유전자 변형된 저 친화성 FcγR 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
유전자 변형된 비-인간 동물 및 ES 세포
특정 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 인간화된 유전자좌 중 하나 이상을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대, 래트 또는 마우스)뿐만 아니라 이러한 비-인간 동물의 제조에 유용한 유전자 변형된 비-인간 동물 ES 세포가 제공된다.
특정 양상에서, 본 명세서에는 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 기재된 조작된 유전자좌 중 하나 이상을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물 및 비-인간 동물 ES 세포가 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 IgH 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포는 본 명세서에 제공된 Igκ 및/또는 Igλ 유전자좌를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 CD79a 및/또는 CD79b 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 FcRn 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 β2M 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 FcεR1α 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 FcγR1a 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 FcγR2a 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 FcγR2b 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 FcγR3a 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 FcγR3b 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 FcγR2c 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포는 본 명세서에 제공된 유전자좌, 예를 들어, 유전자 조작된 유전자좌 중 하나 이상에 대해서 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포는 본 명세서에 제공된 유전자좌, 예를 들어, 유전자 조작된 유전자좌 중 하나 이상에 대해서 동형접합성이다.
일부 실시형태에서, 비-인간 동물은 임의의 비-인간 동물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-인간 동물은 척추동물이다. 일부 실시형태에서, 비-인간 동물은 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소(예를 들어, 젖소, 황소, 들소), 사슴, 양, 염소, 라마, 닭, 고양이, 개, 페릿, 영장류(예를 들어, 마모셋(marmoset), 레서스 원숭이(rhesus monkey))로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 적합한 유전자 변형 가능한 ES 세포가 쉽게 입수 가능하지 않은 비-인간 동물의 경우, 다른 방법을 사용하여 본 명세서에 기재된 유전자 변형을 포함하는 비-인간 동물을 제조할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 비-ES 세포 게놈(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도 만능 세포(induced pluripotent cell))을 변형시키는 단계 및 핵 전달을 사용하여 변형된 게놈을 적합한 세포, 예컨대, 난모세포에 전달하는 단계 및 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)를 배아를 형성하기에 적합한 조건 하에서 비-인간 동물에서 착상시키는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에는 유전자 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)가 제공된다. 이러한 유전자 조작된 유전자좌의 예시적인 실시형태는 도 1에 개략적으로 도시되어 있고, 본 명세서에 상세하게 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 비-인간 동물은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식세포계열 게놈) 내에 Adam6 유전자를 포함하는데, 이것은 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화한다(각각 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호 참조). 일부 실시형태에서, ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편은 Adam6 유전자로부터 발현된다. 일부 실시형태에서, Adam6 유전자는 Adam6 유전자를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 마우스의 또 다른 균주로부터 획득된 래트 Adam6 유전자 또는 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 마우스)로부터 유래되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 비-인간 동물은 전위성(ectopic) Adam6 유전자를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "전위성" Adam6 유전자는 Adam6 유전자가 야생형 비-인간 동물에서 나타나는 것과 상이한 컨텍스트에 존재하는 Adam6 유전자를 지칭한다. 예를 들어, Adam6 유전자는 상이한 염색체 상에 위치될 수 있거나, 상이한 유전자좌에 위치될 수 있거나, 상이한 서열에 인접하게 위치될 수 있다. 예시적인 전위성 Adam6 유전자는 인간 면역글로불린 서열(예를 들어, 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절) 내에 위치된 마우스 Adam6 유전자이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 비-인간 동물은 삽입되거나 통합된 Adam6 유전자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 비-인간 동물은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식세포계열 게놈) 내에 하나 이상의 비-인간 Adam6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열의 삽입을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 비-인간 동물은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식세포계열 게놈) 내에 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 비-인간 동물은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식세포계열 게놈) 내에 마우스 Adam6a 유전자 및/또는 마우스 Adam6b 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 비-인간 동물은 마우스 ADAM6a, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편 및/또는 마우스 ADAM6b, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 동일한 염색체에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절과 가깝도록 하는 위치에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절과 인접하도록 하는 위치에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절 사이에 위치되도록 하는 위치에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 제1 인간 VH 유전자 분절과 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시형태에서, 제1 인간 VH 유전자 분절은 인간 VH1-2이고, 제2 인간 VH 유전자 분절은 인간 VH6-1이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 은 인간 Adam6 위유전자 대신에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 삽입된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 비-인간 동물은 ADAM6 활성을 회복시키거나 향상시키는 Adam6 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, Adam6 유전자는 ADAM6 활성을 기능성, 내인성 Adam6 유전자를 포함하는 대등한 비-인간 동물의 수준까지 회복시킨다. 일부 실시형태에서, Adam6 유전자는 ADAM6 활성을 기능성 Adam6 유전자를 포함하지 않는 대등한 비-인간 동물의 ADAM6 활성의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배까지 향상시킨다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 비-인간 동물은 수컷 비-인간 동물에서 생식력을 회복시키거나 향상시키는 Adam6 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, Adam6 유전자는 수컷 비-인간 동물에서 생식력을 기능성, 내인성 Adam6 유전자를 포함하는 대등한 비-인간 동물의 수준까지 회복시킨다. 일부 실시형태에서, Adam6 유전자는 수컷 비-인간 동물의 짝짓기에 의해서 생산된 새끼의 수가 기능성 Adam6 유전자를 포함하지 않는 대등한 수컷 비-인간 동물의 대등한 짝짓기로부터 생산된 새끼의 수의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%이도록 수컷 비-인간 동물에서 생식력을 회복시킨다. 일부 실시형태에서, Adam6 유전자는 수컷 비-인간 동물의 짝짓기에 의해서 생산된 새끼의 수가 기능성 Adam6 유전자를 포함하지 않는 대등한 수컷 비-인간 동물의 대등한 짝짓기로부터 생산된 새끼의 수의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배를 포함하도록 수컷 비-인간 동물에서 생식력을 향상시킨다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 적어도 하나의 내인성 비-인간 Adam6 유전자가 결여되어 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 내인성 비-인간 Adam6 유전자의 결여는 내인성 비-인간 Adam6 유전자가 결여된 수컷 마우스에서 ADAM6 활성 및/또는 생식력을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌 적어도 하나의 내인성 비-인간 Adam6 유전자의 파괴를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 내인성 비-인간 Adam6 유전자의 파괴는 내인성 비-인간 Adam6 유전자가 결여된 수컷 마우스에서 ADAM6 활성 및/또는 생식력을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 비-인간 동물은 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 비-인간 동물은 예를 들어, 슈퍼패밀리 뛰는쥐상과(Dipodoidea) 또는 쥐상과(Muroidea)의 작은 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 특정 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트 또는 햄스터이다. 일부 실시형태에서, 설치류는 슈퍼패밀리 쥐상과로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 비-인간 동물은 칼로미스쿠스과(Calomyscidae) 예를 들어, 마우스-유사(mouse-like hamster)), 비단털쥐과(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, 뉴월드(New World) 래트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae)(예를 들어, 트루(true) 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐(gerbil), 가시쥐(spiny mice), 크레스티드 래트(crested rat)), 붉은숲쥐과(Nesomyidae)(예를 들어, 클라이밍(climbing) 마우스, 락(rock) 마우스, 흰꼬리쥐(white-tailed rat), 마다카스카르 래트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae)(예를 들어, 가시겨울잠쥐(spiny dormouse)) 및 장님쥐과(Spalacidae)(예를 들어, 뒤쥐(mole rat), 대나무쥐 및 조커(zokor))로부터 선택되는 과에서 유래된다. 일부 실시형태에서, 설치류는 트루 마우스 및 래트(쥐과), 게르빌루스쥐, 가시쥐 및 크레스티드 래트로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 마우스는 쥐과의 구성원에서 유래된다. 일부 실시형태에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 일부 실시형태에서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 비-인간 동물은 마우스이다.
일부 실시형태에서, 비-인간 동물은 C57BL 균주의 마우스이다. 일부 실시형태에서, C57BL 균주는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 비-인간 동물은 129 균주의 마우스이다. 일부 실시형태에서, 129 균주는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 균주로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 마우스는 129 균주와 C57BL 균주의 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 마우스는 129 균주의 혼합물 및/또는 C57BL/6 균주의 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 혼합물의 129 균주는 129S6(129/SvEvTac) 균주이다. 일부 실시형태에서, 마우스는 BALB 균주(예를 들어, BALB/c)이다. 일부 실시형태에서, 마우스는 BALB 균주와 또 다른 균주(예를 들어, C57BL 균주 및/또는 129 균주)의 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 비-인간 동물은 상기에 언급된 균주의 임의의 조합물로부터 유래된 마우스일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 비-인간 동물은 래트이다. 일부 실시형태에서, 래트는 위스타(Wistar) 래트, LEA 균주, 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 균주, 피셔(Fischer) 균주, F344, F6, 및 다크 아구티(Dark Agouti)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 래트 균주는 위스타, LEA, 스프라그 돌리, 피셔, F344, F6 및 다크 아구티로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 균주의 혼합물이다.
특정 실시형태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 게놈 및/또는 생식세포계열 내에 본 명세서에 제공된 다수의 유전자좌, 예컨대, 본 명세서에 제공된 다수의 유전자 조작된 유전자좌를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 IgH 유전자좌 및 본 명세서에는 제공된 Igκ 및/또는 Igλ 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에는 제공된 IgH 유전자좌, 본 명세서에 제공된 Igκ 및/또는 Igλ 유전자좌 및 선택적으로 본 명세서에 제공된 CD79a 및/또는 CD79b 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 IgH 유전자좌, 본 명세서에 제공된 Igκ 및/또는 Igλ 유전자좌, 본 명세서에 제공된 FcRn 유전자좌및 본 명세서에 제공된 β2M 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 비-인간 동물 또는 ES 세포는 이의 생식세포계열 및/또는 게놈 내에 본 명세서에 제공된 IgH 유전자좌, 본 명세서에 제공된 Igκ 및/또는 Igλ 유전자좌, 본 명세서에 제공된 FcRn 유전자좌, 본 명세서에 제공된 β2M 유전자좌, 본 명세서에 제공된 FcεR1α 유전자좌, 본 명세서에 제공된 FcγR1a 유전자좌, 본 명세서에 제공된 FcγR2a 유전자좌, 본 명세서에 제공된 FcγR2b 유전자좌, 본 명세서에 제공된 FcγR3a 유전자좌, 본 명세서에 제공된 FcγR3b 유전자좌, 및/또는 본 명세서에 제공된 FcγR2c 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
특정 양상에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 본 명세서에 제공된 인간화된 유전자좌에 의해서 암호화된 인간화된 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 비-인간 동물은 인간화된 Ig 중쇄 폴리펩타이드를 발현한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 인간화된 Igκ 폴리펩타이드 및/또는 인간화된 Igλ 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 실시형태에서 비-인간 동물은 인간화된 CD79a 폴리펩타이드 및/또는 인간화된 CD79b 폴리펩타이드를 발현한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 인간화된 FcRn 폴리펩타이드를 발현한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 발현한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 인간화된 FcεR1α 폴리펩타이드를 발현한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 인간화된 FcγR1a 폴리펩타이드를 발현한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물 또는 ES 세포 비-인간 동물은 인간화된 FcγR2a 폴리펩타이드를 발현한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 인간화된 FcγR2b 유전자좌 폴리펩타이드를 발현한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 인간화된 FcγR3a 폴리펩타이드를 발현한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 인간화된 FcγR3b 폴리펩타이드를 발현한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 인간화된 FcγR2c 폴리펩타이드를 발현한다.
유전자 변형된 비-인간 동물 및 ES 세포는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 유전자 변형된 비-인간 동물 ES 세포는 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 생성될 수 있는데, 이 기술은 미국 특허 제6,586,251호, 제6,596,541호, 제7,105,348호, 및 문헌[Valenzuela et al. (2003) "High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis" Nat. Biotech. 21(6): 652-659](이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨)에 기재되어 있다. 변형은 또한 게놈 표적화 뉴클레아제 시스템, 예컨대, CRISPR/Cas 시스템, 전사 활성화기-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 시스템 또는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형은 예를 들어, 각각 참조에 의해 포함된 미국 특허 출원 제14/314,866호, 제14/515,503호, 제14/747,461호 및 제14/731,914호에 기재된 CRISPR/Cas를 사용하여 제조된다. 이러한 유전자 변형된 비-인간 동물 및 ES 세포의 예시적인 제조 방법은 또한 본 명세서에 실시예 1 및 3 내지 5에 제공된다.
그 다음 본 명세서에 기재된 ES 세포를 사용하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 비-인간 동물을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 마우스 비-인간 동물 ES 세포를 사용하여 미국 특허 제7,294,754호 및 문헌[Poueymirou et al., Nature Biotech 25:91-99 (2007)](이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨)에 기재된 바와 같은 VELOCIMOUSE® 방법을 사용하여 유전자 변형된 마우스를 생성시킬 수 있다. 생성된 마우스는 동형접합성으로 번식될 수 있다.
인간 Fc-함유 치료제의 시험 방법
특정 양상에서 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 설치류(예를 들어, 본 명세서에 제공된 마우스 또는 래트)에게 치료용 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 인간 Fc 도메인(예를 들어, 인간 항체 또는 Fc 융합 단백질)을 포함하는 치료용 단백질을 시험하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에는 이러한 방법을 수행하기 위한 동물 모델이 제공된다.
일부 실시형태에서 투여된 인간 항체 또는 Fc 융합 단백질은 본 명세서에 제공된 설치류의 유전자 변형된 IgH 유전자좌에서 인간 CH에 의해서 암호화된 Fc 도메인의 아이소타입 및/또는 알로타입과 매칭되는 아이소타입 및/또는 알로타입을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgG1 항체이고, 설치류는 인간 IgG1 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgG4 항체이고, 설치류는 인간 IgG4 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgG1 항체이고, 설치류는 인간 IgG1 CH1, 힌지, CH2, CH3, M1 및 M2 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgG2 항체이고, 설치류는 인간 IgG2 CH1, 힌지, CH2, CH3, M1 및 M2 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgG3 항체이고, 설치류는 인간 IgG3 CH1, 힌지, CH2, CH3, M1 및 M2 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgG4 항체이고, 설치류는 인간 IgG4 CH1, 힌지, CH2, CH3, M1 및 M2 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgM 항체이고, 설치류는 인간 IgM CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgD 항체이고, 설치류는 인간 IgD CH1, H1, H2, CH2, CH3, M1 및 M2 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 Igκ 경쇄를 갖는 인간 항체이고, 설치류는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igκ 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 Igλ 경쇄를 갖는 인간 항체이고, 설치류는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igλ 유전자좌를 포함한다.
일부 실시형태에서 방법은 투여된 치료용 단백질의 하나 이상의 약동학적 특성을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서 투여된 인간 항체 또는 융합 단백질의 약동학적 특성을 결정하는 데 사용되는 동물 모델은 본 명세서에 제공된 변형된 IgH 유전자좌를 포함하는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 설치류이다. 특정 실시형태에서 투여된 인간 항체 또는 융합 단백질의 약동학적 특성을 결정하는 데 사용되는 동물 모델은 본 명세서에 제공된 변형된 IgH 유전자좌 및 본 명세서에 제공된 변형된 Igκ 유전자좌 및/또는 변형된 Igλ 유전자좌를 포함하는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 설치류이다. 일부 실시형태에서 투여된 인간 항체 또는 Fc 융합 단백질은 유전자 변형된 IgH 유전자좌에서 인간화된 CH에 의해서 암호화된 불변 도메인의 아이소타입 및/또는 알로타입과 매칭되는 아이소타입 및/또는 알로타입을 갖는다. 일부 실시형태에서 설치류는 본 명세서에 제공된 변형된 FcRn 유전자좌를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서 설치류는 본 명세서에 제공된 변형된 β2M을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서 하나 이상의 약동학적 파라미터는 혈장 농도 대 시간 하의 면적(AUC), 생체내 회수율(IVR), 청소율(CL), 평균 체류 시간(MRT), 작용제 반감기(t½) 및 정상 상태에서의 분포 용적(Vss)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일반적으로, 투여된 치료제의 약동학적 특성은 치료제의 선택된 용량(예를 들어, 0.1㎎/㎏, 0.2㎎/㎏, 0.3㎎/㎏, 0.4㎎/㎏, 0.5㎎/㎏, 1㎎/㎏, 2㎎/㎏, 3㎎/㎏, 4㎎/㎏, 5㎎/㎏, 7.5㎎/㎏, 10㎎/㎏, 15㎎/㎏, 20㎎/㎏, 25㎎/㎏, 30㎎/㎏, 40㎎/㎏ 또는 50㎎/㎏ 또는 그 초과)을 투여하고, 그 다음 치료제의 혈장 농도가 일정 시간(예를 들어, 0시간, 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 또는 최대 30일 또는 그 초과의 일수)에 걸쳐 어떻게 변하는지를 결정함으로써 결정된다.
일부 실시형태에서, 방법은 투여된 치료용 단백질의 치료 효능(예를 들어, 동물 모델에서 하나 이상의 질환 증상을 감소시키거나 제거하는 투여된 치료용 단백질의 용량의 능력)을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서 동물 모델은 암 모델이고, 질환 증상은 예를 들어, 종양 크기, 종양 전이 및/또는 동물 생존을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서 동물 모델은 자가면역 또는 염증 모델이고, 질환 증상은 예를 들어, 사이토카인 발현 수준, 면역 세포의 증식 수준, 조직 손상 수준 및/또는 동물 생존 수준을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 동물 모델은 감염 질환 모델이고, 질환 증상은 예를 들어, 감염제의 수준, 조직 손상 수준 및/또는 동물 생존 수준을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 투여된 치료용 단백질의 안전성 및 투여량(예를 들어, 동물 모델에서 투여된 치료용 단백질의 용량이 하나 이상의 부작용을 생성시키는 정도)을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 부작용은 알레르기 반응, 탈모증, 과민증, 빈혈, 식욕 부진, 균형 감퇴, 출혈, 혈전, 호흡 곤란, 기관지염, 멍, 백혈구 수치 감소, 적혈구 수치 감소, 혈소판 수치 감소, 심장독성, 결막염, 변비, 기침, 탈수, 설사, 전해질 불균형, 불임, 발열, 탈모, 심부전, 감염, 주사 부위 반응, 철분 결핍, 신부전, 백혈구 감소증, 간 기능 장애, 폐렴, 빠른 심장 박동, 직장 출혈, 발작, 체중 감소 및 체중 증가를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 특정 실시형태에서 본 명세서에는 수동 피부 과민증(passive cutaneous anaphylaxis: PCA) 및/또는 수동 전신 과민증(PSA) 모델을 사용하여 치료에 의해서 유도되는 알레르기 반응을 측정하는 방법을 제공된다.
특정 실시형태에서, 방법은 설치류에서 치료용 단백질이 하나 이상의 Fc 수용체 매개된 반응을 유도하는 정도(예를 들어, 치료용 단백질이 항체-의존적 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC)을 유도하는 정도)를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서 본 명세서에는 인간 항체의 인간 Fc 영역을 포함하는 치료제를 스크리닝하는 방법이 제공되며, 이 방법은, (a) 인간 항체의 Fc 영역을 포함하는 치료제를 본 명세서에 제공된 설치류에 투여하는 단계로서, 치료제는 설치류에서 표적 세포에 결합하는, 상기 투여하는 단계; (b) 표적 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포의 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 측정하는 단계 및 (c) 단계 (b)에서 ADCC의 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 증가된 표적 세포 사멸은 치료제가 ADCC를 매개하는 증가된 능력을 갖는다는 것을 나타낸다.
일부 실시형태에서 방법은 치료용 단백질의 투여가 설치류에서 항-인간 Fc 면역 반응을 유도하는 정도를 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서 투여된 치료제는 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여될 때 감소된 면역 반응을 도출한다. 일부 실시형태에서 투여된 인간 항체 또는 Fc 융합 단백질은 본 명세서에 제공된 설치류의 유전자 변형된 IgH 유전자좌에서 인간 CH에 의해서 암호화된 Fc 도메인의 아이소타입 및/또는 알로타입과 매칭되는 아이소타입 및/또는 알로타입을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgG1 항체이고, 설치류는 인간 IgG1 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgG4 항체이고, 설치류는 인간 IgG4 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgG1 항체이고, 설치류는 인간 IgG1 CH1, 힌지, CH2, CH3, M1 및 M2 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgG2 항체이고, 설치류는 인간 IgG2 CH1, 힌지, CH2, CH3, M1 및 M2 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgG3 항체이고, 설치류는 인간 IgG3 CH1, 힌지, CH2, CH3, M1 및 M2 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgG4 항체이고, 설치류는 인간 IgG4 CH1, 힌지, CH2, CH3, M1 및 M2 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgM 항체이고, 설치류는 인간 IgM CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 인간 IgD 항체이고, 설치류는 인간 IgD CH1, H1, H2, CH2, CH3, M1 및 M2 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 IgH 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 Igκ 경쇄를 갖는 인간 항체이고, 설치류는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igκ 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서 치료제는 Igλ 경쇄를 갖는 인간 항체이고, 설치류는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 Igλ 유전자좌를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 인간 Fc를 포함하는 치료용 항체의 시험을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험되는 항체는 인간 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 도메인을 포함한다. 인간 중쇄 불변 도메인의 서열은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 및 www.imgt.org에서 입수 가능한 IMGT 데이터베이스 참조).
일부 실시형태에서, 시험되는 항체는 변형된 Fc 도메인(예를 들어, Fc와 Fc 수용체 사이의 상호작용을 변경시키는 돌연변이)을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 235, 236, 237, 239, 265, 267, 268, 269, 270, 298, 326, 327, 330, 332, 350, 351, 366, 392, 394, 405 및/또는 407번 위치(EU 넘버링 시스템 사용)에서 Fc 도메인에 대한 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형은 L235A, G236E, G237F, S239E, S239D, D265E, D265S, S267E, S267D, S267G, H268E, H268D, E269L, D270N, D270E, S298A, K326A, K326D, A327H, A327V, A327L, A330I, A330S, I332E, T350V, L351Y, T366L, K392M, K392L, T394W, F405A 및/또는 Y407V(EU 넘버링 시스템 사용)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항체는 이의 Fc 도메인에 대한 다중 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중 변형은 D270N/K326D, S239E/S298A/K326A/A327H, L235A/S239E/D265E/A327H, G236E/G237F/S239E, G237F/S239E/D265E, G327F/S239E/H268D, G236E/D270N/A327V/I332E, G237F/S239E/A327H, G237F/A327L/A330I, S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/D265S/H268D/I332E, S239E/D265S/I332E, S239E/S267E/H268D, S239E/A327L/A330I, D265E/S267D/A330S, S267G/H268E/D270E, H268D/E269L/S298A/K326A/A327H, H268D//K326A/A327H로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 Fc 변형 및 Fc 변형의 조합은 미국 특허 제5,624,821호, 제5,648,260호, 제6,528,624호, 제6,737,056호, 제7,122,637호, 제7,183,387호, 제7,297,775호, 제7,317,091호, 제7,332,581호, 제7,632,497호, 제7,662,925호, 제7,695,936호, 제8,093,359호, 제8,216,805호, 제8,218,805호, 제8,388,955호 및 제8,937,158호 및 미국 특허 공개 제2005/0054832호, 제2006/0222653호, 제2006/0275282호, 제2006/0275283호, 제2007/0190063호, 제2008/0154025호, 제2009/0042291호, 제2013/0108623호 및 제2013/0089541(이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨)에 제공되어 있다.
일부 실시형태에서, 시험되는 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체의 2개의 항원 결합 도메인은 구별되는 중쇄 가변 도메인을 갖지만, 동일한 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, 중쇄의 Fc 도메인은 중쇄 이종이량체 형성을 용이하게 하고/하거나 중쇄 동종이량체 형성을 저해하도록 하는 변형을 포함한다. 이러한 변형은 예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호, 제5,807,706호, 제5,821,333호, 제7,642,228호 및 제8,679,785호 및 미국 특허 공개 제2013/0195849호(이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨)에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 본 방법에서 시험되는 항체는 인간 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 λ 경쇄 가변 도메인이다. 일부 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 κ 경쇄 가변 도메인이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 경쇄 불변 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, 경쇄 불변 도메인은 λ 경쇄 불변 도메인이다. 일부 실시형태에서, 경쇄 불변 도메인은 κ 경쇄 불변 도메인이다. 인간 경쇄 불변 도메인의 서열은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 및 www.imgt.org에서 입수 가능한 IMGT 데이터베이스 참조).
특정 실시형태에서, 치료제는 약제학적 조성물, 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된, 인간 항체 또는 Fc 융합 단백질을 함유하는 약제학적 조성물의 일부로서 본 명세서에 제공된 설치류에게 투여된다.
본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 하기를 위해서 개작된 것을 비롯한, 고체 또는 액체 형태의 투여를 위해서 특별하게 제형화될 수 있다: (1) 경구 투여, 예를 들어 드렌치(drench)(수성 용액 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 정제(예를 들어, 협측, 설하, 및 전신 흡수를 표적으로 한 것), 볼러스(boluse), 분말, 과립, 혀에 대한 적용을 위한 페이스트; 또는 (2) 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액 또는 서방형 제형과 같은 피하, 근육 내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여.
비경구 투여에 적합한 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 당, 알코올, 산화방지제, 완충액, 정균제, 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질 또는 현탁화제 또는 증점제를 함유할 수 있는, 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 멸균 등장성 수용액 또는 비수용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀션, 또는 사용하기 직전에 멸균 주사액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합하여 인간 항체 또는 Fc 융합 단백질을 포함한다.
본 명세서에 제공된 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물유, 예를 들어, 올리브유 및 주사 가능한 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
특정 실시형태에서, 조성물은 목적하는 투여량에 적합한 w/v를 얻는 농도로 인간 항체 또는 Fc 융합 단백질을 포함한다. 항체는 적어도 1㎎/㎖, 적어도 5㎎/㎖, 적어도 10㎎/㎖, 적어도 15㎎/㎖, 적어도 20㎎/㎖, 적어도 25㎎/㎖, 적어도 30㎎/㎖, 적어도 35㎎/㎖, 적어도 40㎎/㎖, 적어도 45㎎/㎖, 적어도 50㎎/㎖, 적어도 55㎎/㎖, 적어도 60㎎/㎖, 적어도 65㎎/㎖, 적어도 70㎎/㎖, 적어도 75㎎/㎖, 적어도 80㎎/㎖, 적어도 85㎎/㎖, 적어도 90㎎/㎖, 적어도 95㎎/㎖, 적어도 100㎎/㎖, 적어도 105㎎/㎖, 적어도 110㎎/㎖, 적어도 115㎎/㎖, 적어도 120㎎/㎖, 적어도 125㎎/㎖, 적어도 130㎎/㎖, 적어도 135㎎/㎖, 적어도 140㎎/㎖, 적어도 150㎎/㎖, 적어도 200㎎/㎖, 적어도 250㎎/㎖, 또는 적어도 300㎎/㎖의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 완충제, 당류, 염, 계면활성제, 가용화제, 폴리올, 희석제, 결합제, 안정화제, 염, 친유성 용매, 아미노산, 킬레이트제, 방부제 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 인간 항체 또는 Fc 융합 단백질을 혼합함으로써, 목적하는 최종 농도의 동결 건조된 조성물 또는 수성 용액의 형태로 제조된다(Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th edition, L. Brunton, et al. and Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1999)). 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 히스티딘, 포스페이트, 시트레이트, 글리신, 아세테이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜, 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리바이닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 트레할로스, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염 형성 반대 이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, TWEEN, 폴리솔베이트 80, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 완충제는 히스티딘, 시트레이트, 포스페이트, 글리신 또는 아세테이트이다. 당류 부형제는 트레할로스, 수크로스, 만니톨, 말토스 또는 라피노스일 수 있다. 계면활성제는 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 40, 폴리솔베이트 80 또는 Pluronic F68일 수 있다. 염은 NaCl, KCl, MgCl2 또는 CaCl2일 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 개선된 pH 제어를 제공하기 위해 완충제 또는 pH 조절제를 포함한다. 이러한 조성물은 약 3.0 내지 약 9.0, 약 4.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 6.5, 약 5.5 내지 약 8.0, 약 5.5 내지 약 7.0 또는 약 5.5 내지 약 6.5의 pH를 가질 수 있다. 추가 실시형태에서, 이러한 조성물은 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5 또는 약 9.0의 pH를 갖는다. 구체적인 실시형태에서, 조성물은 약 6.0의 pH를 갖는다. 당업자는 조성물의 pH가 일반적으로 조성물에 사용될 인간 항체 또는 Fc 융합 단백질의 등전점과 같아서는 안된다는 것을 이해한다. 전형적으로, 완충제는 유기 또는 무기산 또는 염기로부터 제조되는 염이다. 대표적인 완충제는 유기산염, 예컨대, 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타타르산, 석신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염; Tris, 트로메타민 염산염, 또는 포스페이트 완충제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 게다가, 아미노산 성분은 또한 완충능의 기능을 할 수 있다. 조성물에 완충제로서 사용될 수 있는 대표적인 아미노산 성분은 글리신 및 히스티딘을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 완충제는 히스티딘, 시트레이트, 포스페이트, 글리신 및 아세테이트로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에서, 완충제는 히스티딘이다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 완충제는 시트레이트이다. 추가의 또 다른 구체적인 실시형태에서, 완충제는 글리신이다. 완충제의 순도는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이다. 히스티딘 및 글리신과 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "순도"는 예를 들어, 문헌[The Merck Index, 13th ed., O'Neil et al. ed. (Merck & Co., 2001)]에 기재된 바와 같이 당업계에서 이해되는 바와 같이 히스티딘 또는 글리신의 화학적 순도를 나타낸다.
특정 실시형태에서, 조성물은 완충제로서 히스티딘을 포함한다. 특정 실시형태에서 히스티딘은 적어도 약 1mM, 적어도 약 5mM, 적어도 약 10mM, 적어도 약 20mM, 적어도 약 30mM, 적어도 약 40mM, 적어도 약 50mM, 적어도 약 75mM, 적어도 약 100mM, 적어도 약 150mM, 또는 적어도 약 200mM 히스티딘의 농도로 조성물 중에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 약 1mM 내지 약 200mM, 약 1mM 내지 약 150mM, 약 1mM 내지 약 100mM, 약 1mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 200mM, 약 10mM 내지 약 150mM, 약 10mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 40mM, 약 10mM 내지 약 30mM, 약 20mM 내지 약 75mM, 약 20mM 내지 약 50mM, 약 20mM 내지 약 40mM, 또는 약 20mM 내지 약 30mM 히스티딘을 포함한다. 추가 실시형태에서, 조성물은 약 1mM, 약 5mM, 약 10mM, 약 20mM, 약 25mM, 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 60mM, 약 70mM, 약 80mM, 약 90mM, 약 100mM, 약 150mM 또는 약 200mM의 히스티딘을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 조성물은 약 10mM, 약 25mM의 히스티딘을 포함할 수 있거나, 히스티딘을 포함하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 탄수화물 부형제를 포함한다. 탄수화물 부형제는 예를 들어, 점도 증진제, 안정화제, 증량제(bulking agent), 가용화제 및/또는 이와 유사한 것으로서 작용할 수 있다. 탄수화물 부형제는 일반적으로 중량 또는 부피 기준으로, 약 1% 내지 약 99%, 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 약 15%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 8% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 20%, 0.1% 내지 20%, 5% 내지 15%, 8% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 15% 내지 약 20%로 존재한다. 추가의 다른 실시형태에서, 탄수화물 부형제는 1%, 또는 1.5%, 또는 2%, 또는 2.5%, 또는 3%, 또는 4%, 또는 5%, 또는 10%, 또는 15%, 또는 20%로 존재한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 탄수화물 부형제를 포함한다. 조성물에서 사용하기에 적합한 탄수화물 부형제는 단당류, 예컨대, 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 이당류, 예컨대, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 다당류, 예컨대, 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 알디톨, 예컨대, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 솔비톨(글루시톨) 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물에 사용하기 위한 탄수화물 부형제는 수크로스, 트레할로스, 락토스, 만니톨 및 라피노스로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에서, 탄수화물 부형제는 트레할로스이다. 다른 구체적인 실시형태에서, 탄수화물 부형제는 만니톨이다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 탄수화물 부형제는 수크로스이다. 추가의 또 다른 구체적인 실시형태에서, 탄수화물 부형제는 라피노스이다. 탄수화물 부형제의 순도는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 트레할로스를 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 4%, 적어도 약 8%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%의 트레할로스를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 20%, 약 4% 내지 약 40%, 약 4% 내지 약 30% 또는 약 4% 내지 약 20%의 트레할로스를 포함한다. 추가 실시형태에서, 조성물은 약 1%, 약 2%, 약 4%, 약 6%, 약 8%, 약 15%, 약 20%, 약 30% 또는 약 40%의 트레할로스를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 조성물은 약 4%, 약 6% 또는 약 15%의 트레할로스를 포함한다.
특정 실시형태에서, 조성물은 부형제를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 조성물은 당, 염, 계면활성제, 아미노산, 폴리올, 킬레이트제, 유화제 및 보존제로부터 선택되는 적어도 1종의 부형제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 염, 예를 들어 NaCl, KCl, CaCl2, 및 MgCl2로부터 선택되는 염을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 조성물은 NaCl을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 아미노산, 예를 들어, 라이신, 아르기닌, 글리신, 히스티딘 또는 아미노산염을 포함한다. 조성물은 적어도 약 1mM, 적어도 약 10mM, 적어도 약 25mM, 적어도 약 50mM, 적어도 약 100mM, 적어도 약 150mM, 적어도 약 200mM, 적어도 약 250mM, 적어도 약 300mM, 적어도 약 350mM, 또는 적어도 약 400mM의 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 약 1mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 150mM, 약 25mM 내지 약 250mM, 약 25mM 내지 약 300mM, 약 25mM 내지 약 350mM, 약 25mM 내지 약 400mM, 약 50mM 내지 약 250mM, 약 50mM 내지 약 300mM, 약 50mM 내지 약 350mM, 약 50mM 내지 약 400mM, 약 100mM 내지 약 250mM, 약 100mM 내지 약 300mM, 약 100mM 내지 약 400mM, 약 150mM 내지 약 250mM, 약 150mM 내지 약 300mM, 또는 약 150mM 내지 약 400mM의 아미노산을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 조성물은 약 1mM, 1.6mM, 25mM, 약 50mM, 약 100mM, 약 150mM, 약 200mM, 약 250mM, 약 300mM, 약 350mM 또는 약 400mM의 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 계면활성제를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "계면활성제"는 양친매성 구조를 갖는 유기 물질을 의미하며; 즉, 이들은 반대되는 용해 경향의 기, 전형적으로 유용성(oil-soluble) 탄화수소쇄 및 수용성 이온기로 구성된다. 계면활성제는 계면활성 부분의 전하에 따라, 음이온성, 양이온성 및 비이온성 계면활성제로 분류될 수 있다. 계면활성제는 종종 다양한 생물학적 물질의 약제학적 조성물 및 제제의 습윤제, 유화제, 가용화제 및 분산제로서 사용된다. 폴리솔베이트(예를 들어, 폴리솔베이트 20 또는 80)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 계면활성제; 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188); Triton; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸- 또는 세틸-베타인; 라우라미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미타미도프로필- 또는 아이소스테아라미도프로필-베타인(예를 들어, 라우라미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미타미도프로필- 또는 아이소스테아라미도프로필-다이메틸아민; 나트륨 메틸 코코일 - 또는 이나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUA® 시리즈(모나 인더스트리즈사(Mona Industries, Inc.(미국 뉴저지주 패터슨 소재)), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로 필렌 글리콜의 공중합체(예를 들어, 플루로닉스® PF68 등)가 응집을 감소시키기 위해 조성물에 임의로 첨가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 40, 폴리솔베이트 60 또는 폴리솔베이트 80을 포함한다. 계면활성제는 펌프 또는 플라스틱 용기를 사용하여 조성물을 투여하는 경우에 특히 유용하다. 약제학적으로 허용 가능한 계면활성제의 존재는 단백질 응집 경향을 완화시킨다. 상기 조성물은 약 0.001% 내지 약 1% 또는 약 0.001% 내지 약 0.1% 또는 약 0.01% 내지 약 0.1%. 범위의 농도의 폴리솔베이트를 포함할 수 있다. 다른 구체적인 실시형태에서, 조성물은 0.001%, 또는 0.002%, 또는 0.003%, 또는 0.004%, 또는 0.005%, 또는 0.006%, 또는 0.007%, 또는 0.008%, 또는 0.009%, 또는 0.01%, 또는 0.015%, 또는 0.02%의 농도인 폴리솔베이트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 희석제, 결합제, 안정제, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다른 부형제 및/또는 첨가제를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 첨가제는 본 명세서에 제공된 조성물에 사용될 수 있다. 통상적으로 사용되는 부형제/첨가제, 예컨대 약제학적으로 허용 가능한 킬레이트제(예를 들어, 비제한적으로 EDTA, DTPA 또는 EGTA)는 임의로 조성물에 첨가되어 응집을 감소시킬 수 있다. 이러한 첨가제는 펌프 또는 플라스틱 용기를 사용하여 조성물을 투여하는 경우에 특히 유용하다.
일부 실시형태에서, 조성물은 보존제를 포함한다. 보존제, 예컨대, 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 페닐머큐릭 나이트라이트(phenylmercuric nitrite), 페녹시에탄올, 폼알데하이드, 클로로부탄올, 염화마그네슘(예를 들어, 비제한적으로 육수화물), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살 또는 이들의 혼합물은 적절한 농도, 예를 들어 약 0.001% 내지 약 5%, 또는 임의의 범위 또는 그 내의 값으로 조성물에 임의로 첨가될 수 있다. 조성물에 사용되는 보존제의 농도는 미생물 효과를 발생시키기에 충분한 농도이다. 그러한 농도는 선택된 보존제에 따라 달라지며, 숙련된 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 인간 혈액과 등장성이며, 조성물은 인간 혈액과 기본적으로 동일한 삼투압을 갖는다. 이러한 등장성 조성물은 일반적으로 약 250mOSm 내지 약 350mOSm의 삼투압을 가질 것이다. 등장성은 예를 들어, 증기압 또는 결빙형 삼투압계를 사용하여 측정될 수 있다. 조성물의 긴장성(tonicity)은 긴장성 조절제(tonicity modifier)를 사용하여 조절된다. "긴장성 조절제"는 조성물의 등장성을 제공하기 위해 조성물에 첨가될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 불활성 물질이다. 본 명세서에 제공된 조성물에 적합한 긴장성 조절제는 당류, 염 및 아미노산을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 조성물은 내독소 및/또는 관련 발열물질을 실질적으로 함유하지 않는 발열물질 비함유 조성물이다. 내독소는 미생물 내부에 한정되고, 미생물이 분해되거나 사멸되는 경우에만 방출되는 독소를 포함한다. 발열물질은 또한 박테리아 및 다른 미생물의 외막 유래의 내열성 발열물질을 포함한다. 이들 물질은 모두 인간에게 투여하는 경우, 발열, 저혈압 및 쇼크를 일으킬 수 있다. 잠재적인 유해 작용 때문에, 적은 양이더라도 내독소는 정맥 내 투여되는 약제학적 용액으로부터 제거되어야 한다. 미국 식품 의약국(The Food & Drug Administration" FDA)은 정맥 내 약물 적용을 위해 단 1시간 동안에 체중 1킬로그램당 용량당 5 내독소 단위(endotoxin unit: EU)의 상한선을 설정하였다(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). 치료용 단백질이 체중 1킬로그램당 수 백 또는 수 천 밀리그램의 양으로 투여되는 경우에, 관심대상 단백질(예를 들어, 항체)의 경우와 같이, 미량이더라도 유해하고 위험한 내독소는 제거되어야 한다. 일부 실시형태에서, 조성물 중의 내독소 및 발열물질 수준은 10Eu/㎎ 미만, 5Eu/㎎ 미만, 1Eu/㎎ 미만, 0.1Eu/㎎ 미만, 0.01Eu/㎎ 미만 또는 0.001Eu/㎎ 미만이다.
생체내 투여를 위해서 사용되는 경우, 본 명세서에 기재된 조성물은 멸균되어야 한다. 조성물은 멸균 여과, 방사선 등을 포함하는 다양한 멸균법에 의해 멸균될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 미리 멸균된 0.22마이크미터 필터로 여과 멸균된다. 주사용 무균 조성물은 문헌["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005)]에 기재된 바와 같은 통상적인 약무(pharmaceutical practice)에 따라 제형화될 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 관심대상 단백질(예를 들어, 항체)을 포함하는 조성물은 통상적으로 동결 건조된 형태 또는 용액으로 저장될 것이다. 관심대상 단백질(예를 들어, 항체)을 포함하는 멸균 조성물은 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 조성물을 회수할 수 있는 어댑터, 예컨대, 피하 주사 바늘로 찌를 수 있는 마개를 갖는 정맥 주사용 용액 백(bag) 또는 바이알에 주입되는 것으로 고려된다. 특정 실시형태에서, 조성물은 미리 충전된 주사기로서 제공된다.
특정 실시형태에서, 조성물은 동결 건조 제형이다. 용어 "동결 건조된" 또는 "냉동 건조된"은 적어도 50%의 수분이 제거된 동결 건조와 같은 건조 절차를 거친 물질의 상태를 포함한다.
선택되는 투여 경로에 관계없이, 적절한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 명세서에 제공된 작용제 및/또는 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태로 제형화된다.
본 명세서에 제공된 방법에서, 인간 항체, Fc 융합 단백질 및/또는 약제학적 조성물은 경구로, 비강내로, 예를 들어, 스프레이에 의해서와 같이, 직장내로, 질내로, 비경구로, 수조내로 및 협측 및 설하를 비롯하여 분말, 연고 또는 점적액에 의해서와 같이 국소적으로를 포함하는 임의의 적절한 투여 경로에 의해 전달될 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 일반적으로 (예를 들어, 경구 또는 비경구 투여를 통해) 전달된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 동물 모델에서 독성이 없이, 동물 모델에서 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양, 조성 및 투여 모드를 결정하도록 달라질 수 있다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 비-인간 동물을 사용하여 하나 이상의 인간 항체 후보물질의 약동학적 프로파일을 결정한다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 비-인간 동물 및 하나 이상의 대조군 또는 참조 비-인간 동물을 각각 다양한 용량(예를 들어, 0.1㎎/㎏, 0.2㎎/㎏, 0.3㎎/㎏, 0.4㎎/㎏, 0.5㎎/㎏, 1㎎/㎏, 2㎎/㎏, 3㎎/㎏, 4㎎/㎏, 5㎎/㎎, 7.5㎎/㎏, 10㎎/㎏, 15㎎/㎏, 20㎎/㎏, 25㎎/㎏, 30㎎/㎏, 40㎎/㎏ 또는 50㎎/㎏ 이상)의 하나 이상의 인간 항체 후보물질에 노출시킨다. 후보물질 치료용 항체는 비경구 투여 경로 및 비-비경구 투여 경로를 비롯한 임의의 목적하는 투여 경로를 통해서 투여될 수 있다. 비경구 경로는 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 문맥내(intraportal), 근육내, 피하, 복강내, 척추내, 척수강내, 뇌실내, 두개내, 흉막내 또는 기타 주사 경로를 포함한다. 비-비경구 경로는 예를 들어, 경구, 비강, 경피, 폐, 직장, 협측, 질내, 안내를 포함한다. 투여는 또한 주입, 국소 투여, 이식물로부터의 지속 방출(겔, 막 등) 및/또는 정맥내 주사에 의해서 수행될 수 있다. 혈액은 다양한 시간 지점(예를 들어, 0시간, 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 또는 최대 30일 또는 그 초과의 일)에서 비-인간 동물(인간화된 및 대조군)로부터 단리된다. 다양한 검정을 수행하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 얻은 샘플을 사용하여, 총 IgG, 항-치료용 항체 반응, 응집 반응 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 투여된 후보물질 치료용 항체의 약동학적 프로파일을 결정할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 사용하여 관심대상 폴리펩타이드의 활성을 차단 또는 조절하는 치료 효과 및 세포 변화의 결과로서의 유전자 발현의 효과 또는 수용체 폴리펩타이드와 관련하여, 비-인간 동물에서 세포의 표면 상의 수용체 폴리펩타이드의 밀도를 측정한다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물 또는 이로부터 단리된 세포를 관심대상 폴리펩타이드에 결합하는 후보물질 치료제에 노출시키고, 후속 시간 기간 후에, 관심대상 상기 폴리펩타이드와 관련된 특정 세포 과정에 대한 효과, 예를 들어, 리간드-수용체 상호작용 또는 신호 전달을 분석한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 종양학 및/또는 감염 질환에서 사용하기 위한 인간 항체의 개발 및 선택을 위한 개선된 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물 및 대조군 비-인간 동물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것과 상이한 유전자 변형을 갖는 것 또는 유전자 변형이 없는 것, 즉, 야생형)은 종양(또는 종양 세포)가 이식되거나 바이러스(예를 들어, 인플루엔자, HIV, HCV, HPV 등)로 감염될 수 있다. 감염의 이식 후에, 비-인간 동물은 후보물질 치료제가 투여될 수 있다. 종양 또는 바이러스는 후보물질 치료제의 투여 전에 비-인간 동물 내의 하나 이상의 위치에서 확립되기에 충분한 시간이 허용될 수 있다. 대안적으로 및/또는 추가로, 치료제로서 개발될 수 있는 잠재적인 인간 항체를 특징규명하고 선택하도록 이러한 비-인간 동물에서 면역 반응을 모니터링될 수 있다.
인간 항체의 제조 방법
특정 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 인간화된 중쇄 유전자좌 및 본 명세서에 제공된 인간 경쇄 유전자좌(예를 들어, 본 명세서에 제공된 인간화된 κ 및/또는 λ 경쇄 유전자좌)를 포함하는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)를 사용하여 인간 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 설치류는 본 명세서에 제공된 인간화된 CD79a 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 인간화된 CD79b 유전자좌를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 설치류는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcRn 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 인간화된 β2M 유전자좌를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 설치류는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcγR1a 유전자좌를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 설치류는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcεR1α 유전자좌를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 설치류는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcγR2b 유전자좌, 본 명세서에 제공된 인간화된 FcγR2c 유전자좌, 본 명세서에 제공된 인간화된 FcγR3a 유전자좌, 및/또는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcγR3b 유전자좌를 추가로 포함한다.
본 명세서에 제공된 설치류는 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 항체(예를 들어, 인간 항체)를 제조하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류는 설치류가 관심대상 항원에 대한 면역 반응을 발달시키기에 충분한 조건 및 시간 하에서 관심대상 항원으로 면역화된다. 일부 실시형태에서, 관심대상 항원은 인간 항체(예를 들어, 인간 치료용 항체) 또는 Fc-융합 단백질(예를 들어, 치료용 Fc-융합 단백질)이다. 항체를 설치류(또는 하나 이상의 세포, 예를 들어, 하나 이상의 B 세포)로부터 단리시키고, 예를 들어, 친화도, 특이성, 에피토프 매핑, 리간드-수용체 상호작용의 차단 능력, 수용체 활성화의 저해 등을 측정하는 다양한 검정을 사용하여 특징규명한다.
일부 실시형태에서, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)에서 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 항체를 생산한 설치류를 관심대상 항원으로 면역화시키는 단계, (b) 설치류가 관심대상 항원에 대한 면역 반응을 생성시키기에 충분한 조건 하에 설치류를 유지시키는 단계, 및 (c) 관심대상 항원에 결합하는, 설치류 또는 설치류 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서 방법은 설치류에서 항원에 대한 면역학적 내성을 파괴하거나 또는 관심대상 항원을 달리 제거하는 단계, 예를 들어, 다중 가이드 RNA를 사용하여 CRISPR/Cas9를 사용하여 설치류가 면역화되는 관심대상 항원과 관심대상 에피토프를 공유하거나 이에 상동성인 자가-항원의 발현을 감소시키거나 제거하는 단계를 추가로 포함한다(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 공개 2017/0332610에 기재된 바와 같음).
일부 실시형태에서, 설치류에서 인간 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산을 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 항체를 발현하는 설치류를 관심대상 항원으로 면역화시키는 단계, (b) 설치류가 관심대상 항원에 대한 면역 반응을 생성시키기에 충분한 조건 하에서 설치류를 유지시키는 단계, 및 (c) 설치류, 또는 설치류 세포로부터 인간 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산을 회수하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 설치류는 항-약물 항체(예를 들어, 항-이디오타입 항체)의 제조에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 본 명세서에 제공된 설치류는 설치류가 인간 치료용 항체에 대한 면역 반응을 발달시키기에 충분한 조건 하에서 그리고 충분한 시간 동안 인간 치료용 항체로 면역화된다. 일부 실시형태에서, 인간 치료용 항체는 본 명세서에 제공된 설치류의 인간화된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 의해서 암호화된 중쇄 불변 도메인과 동일한 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, 인간 치료용 항체는 본 명세서에 제공된 설치류의 인간화된 면역글로불린 경쇄 유전자좌(예를 들어, 인간화된 κ 및/또는 λ 경쇄 유전자좌)에 의해서 암호화된 경쇄 불변 도메인과 동일한 경쇄 불변 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서 설치류는 치료용 항체가 유래된 이의 게놈 내에 인간 가변 영역 유전자 분절 중 하나 이상을 포함하지 않는다(예를 들어, 설치류에서 하나 이상의 면역글로불린 유전자좌는 설치류 가변 영역 또는 이의 부분을 포함한다). 항-약물 항체(예를 들어, 항-이디오타입 항체)를 설치류(또는 하나 이상의 세포, 예를 들어, 하나 이상의 B 세포)로부터 단리시키고, 예를 들어, 친화도, 특이성, 에피토프 매핑, 항원-치료용 항체 상호작용의 차단 능력 등을 측정하는 다양한 검정을 사용하여 특징규명한다. 생성된 항-약물 항체(예를 들어, 항-이디오타입 항체)는 인간 치료용 항체의 약동학적(PK) 분석을 위해서 사용될 수 있거나 또는 전임상 분석 동안 인간 치료용 항체의 면역원성을 분석하기 위해서 사용될 수 있거나 또는 인간 치료용 항체를 국지화시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)에서 항-약물 항체(예를 들어, 항-이디오타입 항체)의 생산 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 불변 영역(들)을 포함하는 항체를 생산하는 설치류를 설치류에 존재하는 인간 불변 영역에 매칭되는 아이소타입-매칭된 인간 치료용 항체로 면역화시키는 단계, (b) 설치류가 인간 치료용 항체에 대한 면역 반응을 생성시키기에 충분한 조건 하에 설치류를 유지시키는 단계, 및 (c) 인간 치료용 항체에 결합하는, 설치류 또는 설치류 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
유전자 변형된 비-인간 동물 및 ES 세포의 제조 방법
특정 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 유전자좌 중 하나 이상을 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트) 및 ES 세포의 제조 방법이 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 인간화된 중쇄 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 인간 경쇄 유전자좌(예를 들어, 본 명세서에 제공된 인간화된 κ 및/또는 λ 경쇄 유전자좌)를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트) 및 ES 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 인간화된 CD79a 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 인간화된 CD79b 유전자좌를 추가로 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트) 및 ES 세포의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcRn 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 인간화된 β2M 유전자좌를 추가로 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트) 및 ES 세포의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcεR1α 유전자좌를 추가로 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트) 및 ES 세포의 제조 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcγR1a 유전자좌를 추가로 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트) 및 ES 세포의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcεR1α 유전자좌를 추가로 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트) 및 ES 세포의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcγR2a 유전자좌, 본 명세서에 제공된 인간화된 FcγR2b 유전자좌, 본 명세서에 제공된 인간화된 FcγR2c 유전자좌, 본 명세서에 제공된 인간화된 FcγR3a 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcγR3b 유전자좌를 추가로 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트) 및 ES 세포의 제조 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcRn 유전자좌 및/또는 본 명세서에 제공된 인간화된 β2M 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트) 및 ES 세포의 제조 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 인간화된 FcεR1α 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트) 및 ES 세포의 제조 방법이 제공된다. 본 명세서에 제공된 유전자 변형된 비-인간 동물 및 ES 세포의 예시적인 제조 방법을 본 명세서의 설명, 실시예 및/또는 도면에 기재한다.
키트(kit)
본 명세서에는 본 명세서의 설명, 실시예 및/또는 도면에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 비-인간 동물, 비-인간 세포, DNA 단편 및/또는 표적화 벡터로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 팩(pack) 또는 키트가 제공된다. 키트는 임의의 적용 가능한 방법(예를 들어, 연구 방법)에 사용될 수 있다. 선택적으로 그러한 용기(들)와 관련된 것은 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정한 형식의 통지일 수 있는데, 이 통지는 (a) 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인, (b) 사용 지침, (c) 둘 이상의 엔티티와 이들의 조합물 간의 물질 및/또는 생물학적 제품(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물 또는 비-인간 세포)의 전달을 규제하는 계약을 반영한다.
추가의 예시적인 실시형태
예시적인 실시형태 1에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 2에서, 본 명세서에는 실시형태 1의 설치류가 제공되며, 여기서 IgG 막관통 도메인은 설치류 IgG 막관통 도메인이다.
예시적인 실시형태 3에서, 본 명세서에는 실시형태 1의 설치류가 제공되며, 여기서 IgG 막관통 도메인은 인간 IgG 막관통 도메인이다.
예시적인 실시형태 4에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, IgG 세포질 도메인은 설치류 IgG 세포질 도메인이다.
예시적인 실시형태 5에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, IgG 세포질 도메인은 인간 IgG 세포질 도메인이다.
예시적인 실시형태 6에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG1 도메인이다.
예시적인 실시형태 7에서, 본 명세서에는 실시형태 6의 설치류가 제공되며, 여기서 IgG1 도메인은 IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 및 IGHG1*05로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
예시적인 실시형태 8에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG2 도메인이다.
예시적인 실시형태 9에서, 본 명세서에는 실시형태 8의 설치류가 제공되며, 여기서 IgG2 도메인은 IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 및 IGHG2*06으로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
예시적인 실시형태 10에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG3 도메인이다.
예시적인 실시형태 11에서, 본 명세서에는 실시형태 10의 설치류가 제공되며 여기서, IgG3 도메인은 IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 및 IGHG3*19로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
예시적인 실시형태 12에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG4 도메인이다.
예시적인 실시형태 13에서, 본 명세서에는 실시형태 8의 설치류가 제공되며, 여기서 IgG4 도메인은 IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 및 IGHG4*04로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
예시적인 실시형태 14에서, 본 명세서에는 실시형태 6 내지 13 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2a 또는 Cγ2c 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 15에서, 본 명세서에는 실시형태 14의 설치류가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2a 또는 Cγ2c 유전자 분절을 대체한다.
예시적인 실시형태 16에서, 본 명세서에는 실시형태 6 내지 13 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ1 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 17에서, 본 명세서에는 실시형태 16의 설치류가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ1 유전자 분절을 대체한다.
예시적인 실시형태 18에서, 본 명세서에는 실시형태 6 내지 13 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2b 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 19에서, 본 명세서에는 실시형태 18의 설치류가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2b 유전자 분절을 대체한다.
예시적인 실시형태 20에서, 본 명세서에는 실시형태 6 내지 13 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ3 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 21에서, 본 명세서에는 실시형태 20의 설치류가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ3 유전자 분절을 대체한다.
예시적인 실시형태 22에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cμ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 23에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 24에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cδ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 25에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cδ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 26에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ1 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 27에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 26 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 28에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 27 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ2b 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 29에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ3 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 30에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 31에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 32에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 31 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 33에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 31 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 34에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ3 유전자 분절 및 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 35에서, 본 명세서에는 실시형태 34의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절 및 인간 Cγ4 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 36에서, 본 명세서에는 실시형태 34 또는 실시형태 35의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 37에서, 본 명세서에는 실시형태 34 내지 36 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 38에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 인간 CH1 도메인, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, 인간 CH4 도메인, 인간 IgM 막관통 도메인 및 인간 IgM 세포질 도메인을 포함하는 IgM 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgM 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 39에서, 본 명세서에는 실시형태 38의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cδ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 40에서, 본 명세서에는 실시형태 38 또는 39의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ3 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 41에서, 본 명세서에는 실시형태 38 내지 40 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ1 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 42에서, 본 명세서에는 실시형태 38 내지 41 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 43에서, 본 명세서에는 실시형태 38 내지 42 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ4 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 44에서, 본 명세서에는 실시형태 38 내지 43 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ3 유전자 분절 및 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 45에서, 본 명세서에는 실시형태 44의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절 및 인간 Cγ4 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 46에서, 본 명세서에는 실시형태 44 또는 실시형태 45의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 47에서, 본 명세서에는 실시형태 44 내지 46 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 48에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 H1 도메인, 인간 힌지 H2 도메인, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, 인간 IgD 막관통 도메인 및 인간 IgD 세포질 도메인을 포함하는 IgD 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgD 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 49에서, 본 명세서에는 실시형태 48의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 50에서, 본 명세서에는 실시형태 48 또는 49의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ3 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 51에서, 본 명세서에는 실시형태 48 내지 50 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ1 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 52에서, 본 명세서에는 실시형태 48 내지 51 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 53에서, 본 명세서에는 실시형태 48 내지 52 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ4 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 54에서, 본 명세서에는 실시형태 48 내지 53 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ3 유전자 분절 및 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 55에서, 본 명세서에는 실시형태 54의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절 및 인간 Cγ4 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 56에서, 본 명세서에는 실시형태 54 또는 실시형태 55의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 57에서, 본 명세서에는 실시형태 54 내지 56 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 58에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 57 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 인트론성 인핸서(Ei)를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 59에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 57 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 인트론성 인핸서(Ei)를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 60에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 59 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 61에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 3' 조절 영역(3' RR)을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 62에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 61 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sμ 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 63에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 62 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ3 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 64에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ1 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 65에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 64 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ2b 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 66에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 65 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ2a 및/또는 Sγ2c 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 67에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 66 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sε 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 68에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 67 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sα 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 69에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 61 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sμ 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 70에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 61 및 69 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ3 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 71에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 61 및 69 내지 70 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ1 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 72에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 61 및 69 내지 71 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ2 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 73에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 61 및 69 내지 72 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ4 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 74에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 61 및 69 내지 73 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sε 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 75에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 61 및 69-74 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sα 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 76에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 75 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, VH 유전자 분절은 설치류 VH 유전자 분절이고, DH 유전자 분절은 설치류 DH 유전자 분절이며, JH 유전자 분절은 설치류 JH 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 77에서, 본 명세서에는 실시형태 76의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절은 내인성 설치류 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 78에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 75 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, VH 유전자 분절은 인간 VH 유전자 분절이고, DH 유전자 분절은 인간 DH 유전자 분절이며, JH 유전자 분절은 인간 JH 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 79에서, 본 명세서에는 실시형태 78의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 적어도 3개의 인간 VH 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 80에서, 본 명세서에는 실시형태 78 또는 실시형태 79의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 인간 DH 유전자 분절의 전부를 포함한다.
예시적인 실시형태 81에서, 본 명세서에는 실시형태 78 내지 80 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 인간 JH 유전자 분절의 전부를 포함한다.
예시적인 실시형태 82에서, 본 명세서에는 실시형태 78 내지 81 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 기능성 내인성 설치류 Adam6 유전자가 결여되어 있다.
예시적인 실시형태 83에서, 본 명세서에는 실시형태 78 내지 82 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 생식세포계열 게놈은 기능성 설치류 Adam6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 84에서, 본 명세서에는 실시형태 83의 설치류가 제공되며, 여기서, 기능성 설치류 Adam6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편이 발현된다.
예시적인 실시형태 85에서, 본 명세서에는 실시형태 83 또는 실시형태 84의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 동일한 염색체 상에 포함된다.
예시적인 실시형태 86에서, 본 명세서에는 실시형태 83 내지 85 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 포함된다.
예시적인 실시형태 87에서, 본 명세서에는 실시형태 83 내지 86 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 Adam6 위유전자 대신에 존재한다.
예시적인 실시형태 88에서, 본 명세서에는 실시형태 83 내지 87 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 Adam6 위유전자를 대체한다.
예시적인 실시형태 89에서, 본 명세서에는 실시형태 83 내지 88 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 제1 인간 VH 유전자 분절과 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에 존재한다.
예시적인 실시형태 90에서, 본 명세서에는 실시형태 89의 설치류가 제공되며, 여기서, 제1 인간 VH 유전자 분절은 VH1-2이고, 제2 인간 VH 유전자 분절은 VH6-1이다.
예시적인 실시형태 91에서, 본 명세서에는 실시형태 83 내지 86 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 존재한다.
예시적인 실시형태 92에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 91 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 존재한다.
예시적인 실시형태 93에서, 본 명세서에는 실시형태 92의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 94에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 93 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 95에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 93 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 96에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii)(a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 설치류 Cγ1 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 인간 IgG1 CH1 도메인, 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인, 설치류 IgG2a 막관통 도메인 및 설치류 IgG2a 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 변형된 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 97에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii)(a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 설치류 Cγ1 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 인간 IgG1 CH1 도메인, 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인, 인간 IgG1 막관통 도메인 및 인간 IgG1 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 변형된 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 98에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii)설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii)(a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 IgG4 CH1 도메인, 인간 IgG4 힌지 영역, 인간 IgG4 CH2 도메인, 인간 IgG4 CH3 도메인, 설치류 IgG1 막관통 도메인 및 설치류 IgG1 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 변형된 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 99에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii)설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii)(a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 IgG4 CH1 도메인, 인간 IgG4 힌지 영역, 인간 IgG4 CH2 도메인, 인간 IgG4 CH3 도메인, 인간 IgG4 막관통 도메인 및 인간 IgG4 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 변형된 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 100에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 인간 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 완전 인간 중쇄를 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 101에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 인간 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절; (c) 인간 Cγ2 유전자 분절; (d) 인간 Cγ4 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 완전 인간 중쇄를 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 102에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 설치류 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 103에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii)(a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절; (c) 인간 Cγ2 유전자 분절; (d) 인간 Cγ4 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 설치류 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 104에서, 본 명세서에는 실시형태 96 내지 103 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 존재한다.
예시적인 실시형태 105에서, 본 명세서에는 실시형태 104의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 106에서, 본 명세서에는 실시형태 96 내지 105 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 107에서, 본 명세서에는 실시형태 96 내지 105 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 108에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (1) 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ쇄 가변 영역; 및 (2) 인간 Cκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 카파(κ)쇄 유전자좌를 더 포함하되, 여기서 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 설치류가 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 및 인간 Cκ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 불변 도메인을 포함하는 항체를 생산하도록 면역글로불린 κ쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 109에서, 본 명세서에는 실시형태 108의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 설치류 인트론성 κ 인핸서(Eκi)를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 110에서, 본 명세서에는 실시형태 108의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 인간 인트론성 κ 인핸서(Eκi)를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 111에서, 본 명세서에는 실시형태 108 내지 110 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 설치류 3' κ 인핸서(Eκ3')를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 112에서, 본 명세서에는 실시형태 108 내지 110 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 인간 3' κ 인핸서(Eκ3')를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 113에서, 본 명세서에는 실시형태 108 내지 112 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 적어도 6개의 인간 Vκ 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 114에서, 본 명세서에는 실시형태 108 내지 113 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 인간 Jκ 유전자 분절의 전부를 포함한다.
예시적인 실시형태 115에서, 본 명세서에는 실시형태 108 내지 114 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 존재한다.
예시적인 실시형태 116에서, 본 명세서에는 실시형태 115의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 117에서, 본 명세서에는 실시형태 108 내지 116 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 118에서, 본 명세서에는 실시형태 108 내지 116 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 119에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 118 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 Vλ 유전자 분절, 인간 Jλ 유전자 분절 및 인간 Cλ 유전자 분절을 포함하는 조작된 면역글로불린 람다(λ)쇄 유전자좌를 더 포함하되, 여기서 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절은 설치류가 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 및 인간 Cλ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 불변 도메인을 포함하는 항체를 생산하도록 인간 Cλ 유전자 분절에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 120에서, 본 명세서에는 실시형태 119의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ1 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 121에서, 본 명세서에는 실시형태 120의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ1 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 122에서, 본 명세서에는 실시형태 119의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ2 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 123에서, 본 명세서에는 실시형태 122의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ2 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 124에서, 본 명세서에는 실시형태 119의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ3 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 125에서, 본 명세서에는 실시형태 124의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ3 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 126에서, 본 명세서에는 실시형태 119의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ6 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 127에서, 본 명세서에는 실시형태 126의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ6 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 128에서, 본 명세서에는 실시형태 119의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ7 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 129에서, 본 명세서에는 실시형태 119 내지 128 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 Cλ1 유전자 분절, 인간 Cλ2 유전자 분절, 인간 Cλ3 유전자 분절, 인간 Cλ6 유전자 분절 및 설치류 C λ1 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 130에서, 본 명세서에는 실시형태 129의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 Jλ1 유전자 분절, 인간 Jλ2 유전자 분절, 인간 Jλ3 유전자 분절, 인간 Jλ6 유전자 분절 및 인간 Jλ7 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 131에서, 본 명세서에는 실시형태 130의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 Jλ1-Cλ1 유전자 분절 클러스터, 인간 Jλ2-Cλ2 유전자 분절 클러스터, 인간 Jλ3-Cλ3 유전자 분절 클러스터, 인간 Jλ6-Cλ6 유전자 분절 클러스터 및 인간 Jλ7-설치류 Cλ1 유전자 분절 클러스터를 포함한다.
예시적인 실시형태 132에서, 본 명세서에는 실시형태 119 내지 131 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 적어도 7개의 인간 Vλ 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 133에서, 본 명세서에는 실시형태 119 내지 132 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 설치류 λ 인핸서 2.4를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 134에서, 본 명세서에는 실시형태 119 내지 133 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 설치류 3' λ 인핸서를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 135에서, 본 명세서에는 실시형태 119 내지 134 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 설치류 λ 인핸서 3.1을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 136에서, 본 명세서에는 실시형태 119 내지 135 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 3' λ 인핸서를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 137에서, 본 명세서에는 실시형태 119 내지 136 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 존재한다.
예시적인 실시형태 138에서, 본 명세서에는 실시형태 137의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 139에서, 본 명세서에는 실시형태 119 내지 138 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 140에서, 본 명세서에는 실시형태 119 내지 138 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 141에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 140 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 신생아 Fc 수용체(FcRn) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 142에서, 본 명세서에는 실시형태 141의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 143에서, 본 명세서에는 실시형태 141의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 144에서, 본 명세서에는 실시형태 141 내지 143 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 145에서, 본 명세서에는 실시형태 141 내지 143 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 146에서, 본 명세서에는 실시형태 141 내지 145 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 147에서, 본 명세서에는 실시형태 146의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 148에서, 본 명세서에는 실시형태 141의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 149에서, 본 명세서에는 실시형태 141 내지 148 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcRn을 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 150에서, 본 명세서에는 실시형태 141 내지 149 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcRn 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 151에서, 본 명세서에는 실시형태 141 내지 149 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcRn 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 152에서, 본 명세서에는 실시형태 141 내지 151 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 또는 인간화된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 153에서, 본 명세서에는 실시형태 152의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 154에서, 본 명세서에는 실시형태 153의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 155에서, 본 명세서에는 실시형태 152 내지 154 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 핵산 서열은 인간 β2M 유전자의 엑손 2-4를 포함한다.
예시적인 실시형태 156에서, 본 명세서에는 실시형태 152 내지 155 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 β2M 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 157에서, 본 명세서에는 실시형태 152 내지 156 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 β2M 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 158에서, 본 명세서에는 실시형태 152 내지 156 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 β2M 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 159에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 158 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 엡실론 수용체 1 알파(FcεR1α) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 160에서, 본 명세서에는 실시형태 159의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 161에서, 본 명세서에는 실시형태 159의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 162에서, 본 명세서에는 실시형태 159 내지 161 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 163에서, 본 명세서에는 실시형태 159 내지 161 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 164에서, 본 명세서에는 실시형태 159 내지 163 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 165에서, 본 명세서에는 실시형태 164의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 166에서, 본 명세서에는 실시형태 165의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포외 도메인, 인간 막관통 도메인 및 인간 세포질 도메인을 포함한다.
예시적인 실시형태 167에서, 본 명세서에는 실시형태 159의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 168에서, 본 명세서에는 실시형태 159 내지 167 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcεR1α를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 169에서, 본 명세서에는 실시형태 159 내지 168 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 170에서, 본 명세서에는 실시형태 159 내지 168 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 171에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 170 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 1a(FcγR1a) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 172에서, 본 명세서에는 실시형태 171의 설치류가 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 173에서, 본 명세서에는 실시형태 171의 설치류가 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 174에서, 본 명세서에는 실시형태 171 내지 173 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 175에서, 본 명세서에는 실시형태 171 내지 173 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 176에서, 본 명세서에는 실시형태 171 내지 175 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcγR1a 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 177에서, 본 명세서에는 실시형태 176의 설치류가 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcγR1a 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 178에서, 본 명세서에는 실시형태 171의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 FcγR1a 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcγR1a 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 179에서, 본 명세서에는 실시형태 171 내지 178 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcγR1a를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 180에서, 본 명세서에는 실시형태 171 내지 179 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR1a 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 181에서, 본 명세서에는 실시형태 171 내지 179 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR1a 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 182에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 181 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 FcγR2a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 2a(FcγR2a) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 183에서, 본 명세서에는 실시형태 182의 설치류가 제공되며, 여기서, FcγR2a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 184에서, 본 명세서에는 실시형태 183의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 FcγR2a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 185에서, 본 명세서에는 실시형태 182 내지 184 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2a 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 186에서, 본 명세서에는 실시형태 182 내지 184 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2a 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 187에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 186 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 FcγR2b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 2b(FcγR2b) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 188에서, 본 명세서에는 실시형태 187의 설치류가 제공되며, 여기서, FcγR2b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 189에서, 본 명세서에는 실시형태 188의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 FcγR2b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 190에서, 본 명세서에는 실시형태 187 내지 189 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2b 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 191에서, 본 명세서에는 실시형태 187 내지 189 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2b 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 192에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 191 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 FcγR3a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 3a(FcγR3a) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 193에서, 본 명세서에는 실시형태 192의 설치류가 제공되며, 여기서, FcγR3a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 194에서, 본 명세서에는 실시형태 193의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 FcγR3a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 195에서, 본 명세서에는 실시형태 192 내지 194 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR3a 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 196에서, 본 명세서에는 실시형태 192 내지 194 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR3a 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 197에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 196 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 FcγR3b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 3b(FcγR3b) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 198에서, 본 명세서에는 실시형태 197의 설치류가 제공되며, 여기서, FcγR3b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 199에서, 본 명세서에는 실시형태 197의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 FcγR3b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 200에서, 본 명세서에는 실시형태 197 내지 199 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR3b 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 201에서, 본 명세서에는 실시형태 197 내지 199 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR3b 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 202에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 201 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 FcγR2c 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 2c(FcγR2c) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 203에서, 본 명세서에는 실시형태 202의 설치류가 제공되며, 여기서, FcγR2c 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 204에서, 본 명세서에는 실시형태 203의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 FcγR2c 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 205에서, 본 명세서에는 실시형태 202 내지 204 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcγR2c를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 206에서, 본 명세서에는 실시형태 202 내지 205 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2c 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 207에서, 본 명세서에는 실시형태 202 내지 205 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2c 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 208에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 신생아 Fc 수용체(FcRn) 유전자좌를 포함한다.
예시적인 실시형태 209에서, 본 명세서에는 실시형태 208의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 210에서, 본 명세서에는 실시형태 208의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 211에서, 본 명세서에는 실시형태 208 내지 210 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 212에서, 본 명세서에는 실시형태 208 내지 210 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 213에서, 본 명세서에는 실시형태 208 내지 212 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 214에서, 본 명세서에는 실시형태 213의 설치류가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 215에서, 본 명세서에는 실시형태 208의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 216에서, 본 명세서에는 실시형태 208 내지 215 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcRn을 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 217에서, 본 명세서에는 실시형태 208 내지 216 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcRn 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 218에서, 본 명세서에는 실시형태 208 내지 216 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcRn 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 219에서, 본 명세서에는 실시형태 208 내지 218 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 또는 인간화된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 β-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 220에서, 본 명세서에는 실시형태 219의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 221에서, 본 명세서에는 실시형태 220의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 222에서, 본 명세서에는 실시형태 219 내지 221 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 핵산 서열은 인간 β2M 유전자의 엑손 2-4를 포함한다.
예시적인 실시형태 223에서, 본 명세서에는 실시형태 219 내지 222 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 β2M 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 224에서, 본 명세서에는 실시형태 219 내지 223 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 β2M 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 225에서, 본 명세서에는 실시형태 219 내지 223 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 β2M 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 226에서, 본 명세서에는 설치류가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 엡실론 수용체 1 알파(FcεR1α) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 227에서, 본 명세서에는 실시형태 226의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 228에서, 본 명세서에는 실시형태 226의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 229에서, 본 명세서에는 실시형태 226 내지 228 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 230에서, 본 명세서에는 실시형태 226 내지 228 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 231에서, 본 명세서에는 실시형태 226 내지 230 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 232에서, 본 명세서에는 실시형태 231의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 233에서, 본 명세서에는 실시형태 232의 설치류가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포외 도메인, 인간 막관통 도메인 및 인간 세포질 도메인을 포함한다.
예시적인 실시형태 234에서, 본 명세서에는 실시형태 226의 설치류가 제공되며, 여기서, 인간 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 235에서, 본 명세서에는 실시형태 226 내지 234 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcεR1α를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 236에서, 본 명세서에는 실시형태 226 내지 235 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 237에서, 본 명세서에는 실시형태 226 내지 235 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 238에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 237 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 마우스이다.
예시적인 실시형태 239에서, 본 명세서에는 실시형태 1 내지 237 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 설치류는 래트이다.
예시적인 실시형태 240에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질의 시험 방법이 제공되며, 이 방법은 치료용 단백질을 실시형태 1 내지 207 중 어느 하나의 설치류에게 투여하는 단계 및 투여된 치료용 단백질의 하나 이상의 약동학적 특성을 측정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 241에서, 본 명세서에는 실시형태 240의 방법이 제공되며, 여기서 하나 이상의 약동학적 특성은 혈장 농도 대 시간 하의 면적(AUC), 생체내 회수율(IVR), 청소율(CL), 평균 체류 시간(MRT), 작용제 반감기(t½) 및 정상 상태에서의 분포 용적(Vss) 중 하나 이상으로부터 선택된다.
예시적인 실시형태 242에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질의 치료 효능을 시험하는 방법이 제공되며, 이 방법은 치료용 단백질을 실시형태 1 내지 207 중 어느 하나의 설치류에게 투여하는 단계 및 투여된 치료용 단백질의 치료 효능을 측정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 243에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질의 치료적 유효 용량을 결정하는 방법이 제공되며, 이 방법은 치료용 단백질의 복수의 용량을 실시형태 1 내지 207 중 어느 하나의 설치류에게 투여하는 단계 및 치료용 단백질의 각각의 용량의 치료 효능을 결정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 244에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질의 안전한 용량을 결정하는 방법이 제공되며, 이 방법은 치료용 단백질의 복수의 용량을 실시형태 1 내지 207 중 어느 하나의 설치류에게 투여하는 단계 및 치료용 단백질의 각각의 용량의 안전성을 결정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 245에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질의 내약 용량을 결정하는 방법이 제공되며, 이 방법은 치료용 단백질의 복수의 용량을 실시형태 1 내지 207 중 어느 하나의 설치류에게 투여하는 단계 및 치료용 단백질의 각각의 용량의 내약성을 결정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 246에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질의 시험 방법이 제공되며, 이 방법은 치료용 단백질을 실시형태 148 내지 239 중 어느 하나의 설치류에게 투여하는 단계 및 설치류에서 하나 이상의 Fc 수용체 매개된 반응을 측정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 247에서, 본 명세서에는 실시형태 246의 방법이 제공되며, 여기서, 하나 이상의 Fc 수용체 매개된 반응은 ADCC 반응을 포함한다.
예시적인 실시형태 248에서, 본 명세서에는 인간 항체의 인간 Fc 영역을 포함하는 치료제를 스크리닝하는 방법이 제공되며, 이 방법은, (a) 인간 항체의 Fc 영역을 포함하는 치료제를 실시형태 148 내지 239 중 어느 하나의 설치류에 투여하는 단계로서, 치료제는 마우스에서 표적 세포에 결합하는, 상기 투여하는 단계; (b) 표적 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포의 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 측정하는 단계 및 (c) 단계 (b)에서 ADCC의 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 증가된 표적 세포 사멸은 치료제가 ADCC를 매개하는 증가된 능력을 갖는다는 것을 나타낸다.
예시적인 실시형태 249에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질에 대해서 설치류에 의해서 생성된 면역 반응을 측정하는 방법이 제공되며, 이 방법은 치료용 단백질을 실시형태 1 내지 207 중 어느 하나의 설치류에 투여하는 단계 및 치료용 단백질에 대해서 설치류에 의해서 생성된 면역 반응을 측정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 250에서, 본 명세서에는 실시형태 240 내지 249 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 항체이다.
예시적인 실시형태 251에서, 본 명세서에는 실시형태 240 내지 249 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 Fc 융합 단백질이다.
예시적인 실시형태 252에서, 본 명세서에는 실시형태 240 내지 251 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다.
예시적인 실시형태 253에서, 본 명세서에는 실시형태 252의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG1 항체이다.
예시적인 실시형태 254에서, 본 명세서에는 실시형태 252의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질이다.
예시적인 실시형태 255에서, 본 명세서에는 실시형태 252 내지 254 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 Cγ1 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 256에서, 본 명세서에는 실시형태 240 내지 251 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Fc 도메인은 인간 IgG2 Fc 도메인이다.
예시적인 실시형태 257에서, 본 명세서에는 실시형태 256의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG2 항체이다.
예시적인 실시형태 258에서, 본 명세서에는 실시형태 256의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG2 Fc 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질이다.
예시적인 실시형태 259에서, 본 명세서에는 실시형태 256 내지 258 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 Cγ2 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 260에서, 본 명세서에는 실시형태 240 내지 251 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Fc 도메인은 인간 IgG3 Fc 도메인이다.
예시적인 실시형태 261에서, 본 명세서에는 실시형태 260의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG3 항체이다.
예시적인 실시형태 262에서, 본 명세서에는 실시형태 260의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG3 Fc 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질이다.
예시적인 실시형태 263에서, 본 명세서에는 실시형태 260 내지 262 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 Cγ3 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 264에서, 본 명세서에는 실시형태 240 내지 251 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Fc 도메인은 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
예시적인 실시형태 265에서, 본 명세서에는 실시형태 264의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG4 항체이다.
예시적인 실시형태 266에서, 본 명세서에는 실시형태 264의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질이다.
예시적인 실시형태 267에서, 본 명세서에는 실시형태 264 내지 266 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 Cγ4 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 268에서, 본 명세서에는 실시형태 250, 252, 253, 255 내지 257, 259 내지 261, 263 내지 265 및 267 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 κ 경쇄를 갖는 인간 항체이고, 설치류는 인간 κ 경쇄를 포함하는 항체를 발현한다.
예시적인 실시형태 269에서, 본 명세서에는 실시형태 250, 252, 253, 255 내지 257, 259 내지 261, 263 내지 265 및 267 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 λ 경쇄를 갖는 인간 항체이고, 설치류는 인간 λ 경쇄를 포함하는 항체를 발현한다.
예시적인 실시형태 270에서, 본 명세서에는 실시형태 중 240 내지 269 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 마우스이다.
예시적인 실시형태 271에서, 본 명세서에는 실시형태 중 240 내지 269 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 래트이다.
예시적인 실시형태 272에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질을 시험하기 위한 동물 모델이 제공되며, 이 모델은 치료용 단백질을 실시형태 1 내지 207 중 어느 하나의 설치류에게 투여하는 단계 및 투여된 치료용 단백질의 하나 이상의 약동학적 특성을 측정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 273에서, 본 명세서에는 실시형태 272의 동물 모델이 제공되며, 여기서 하나 이상의 약동학적 특성은 혈장 농도 대 시간 하의 면적(AUC), 생체내 회수율(IVR), 청소율(CL), 평균 체류 시간(MRT), 작용제 반감기(t½) 및 정상 상태에서의 분포 용적(Vss) 중 하나 이상으로부터 선택된다.
예시적인 실시형태 274에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질의 치료 효능을 시험하기 위한 동물 모델이 제공되며, 이 동물 모델은 치료용 단백질을 실시형태 1 내지 207 중 어느 하나의 설치류에게 투여하는 단계 및 투여된 치료용 단백질의 치료 효능을 측정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 275에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질의 치료적 유효 용량을 결정하기 위한 동물 모델이 제공되며, 이 동물 모델은 치료용 단백질의 복수의 용량을 실시형태 1 내지 207 중 어느 하나의 설치류에게 투여하는 단계 및 치료용 단백질의 각각의 용량의 치료 효능을 결정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 276에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질의 안전한 용량을 결정하기 위한 동물 모델이 제공되며, 이 동물 모델은 치료용 단백질의 복수의 용량을 실시형태 1 내지 207 중 어느 하나의 설치류에게 투여하는 단계 및 치료용 단백질의 각각의 용량의 안전성을 결정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 277에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질의 내약 용량을 결정하기 위한 동물 모델이 제공되며, 이 동물 모델은 치료용 단백질의 복수의 용량을 실시형태 1 내지 207 중 어느 하나의 설치류에게 투여하는 단계 및 치료용 단백질의 각각의 용량의 내약성을 결정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 278에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질을 시험하기 위한 동물 모델이 제공되며, 이 동물 모델은 치료용 단백질을 실시형태 148 내지 239 중 어느 하나의 설치류에게 투여하는 단계 및 설치류에서 하나 이상의 Fc 수용체 매개된 반응을 측정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 279에서, 본 명세서에는 실시형태 278의 방법이 제공되며, 여기서, 하나 이상의 Fc 수용체 매개된 반응은 ADCC 반응을 포함한다.
예시적인 실시형태 280에서, 본 명세서에는 인간 항체의 인간 Fc 영역을 포함하는 치료제를 스크리닝하기 위한 동물 모델이 제공되며, 이 동물 모델은, (a) 인간 항체의 Fc 영역을 포함하는 치료제를 실시형태 148 내지 239 중 어느 하나의 설치류에 투여하는 단계로서, 치료제는 마우스에서 표적 세포에 결합하는, 상기 투여하는 단계; (b) 표적 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포의 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 측정하는 단계 및 (c) 단계 (b)에서 ADCC의 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함하되, 증가된 표적 세포 사멸은 치료제가 ADCC를 매개하는 증가된 능력을 갖는다는 것을 나타낸다.
예시적인 실시형태 281에서, 본 명세서에는 인간 Fc 도메인을 포함하는 치료용 단백질에 대해서 설치류에 의해서 생성된 면역 반응을 측정하기 위한 동물 모델이 제공되며, 이 동물 모델은 치료용 단백질을 실시형태 1 내지 207 중 어느 하나의 설치류에 투여하는 단계 및 치료용 단백질에 대해서 설치류에 의해서 생성된 면역 반응을 측정하는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 282에서, 본 명세서에는 실시형태 272 내지 281 중 어느 하나의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 항체이다.
예시적인 실시형태 283에서, 본 명세서에는 실시형태 272 내지 281 중 어느 하나의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 Fc 융합 단백질이다.
예시적인 실시형태 284에서, 본 명세서에는 실시형태 272 내지 283 중 임의의 하나의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 인간 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다.
예시적인 실시형태 285에서, 본 명세서에는 실시형태 284의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG1 항체이다.
예시적인 실시형태 286에서, 본 명세서에는 실시형태 284의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질이다.
예시적인 실시형태 287에서, 본 명세서에는 실시형태 272 내지 286 중 임의의 하나의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 Cγ1 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 288에서, 본 명세서에는 실시형태 272 내지 283 중 임의의 하나의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 인간 Fc 도메인은 인간 IgG2 Fc 도메인이다.
예시적인 실시형태 289에서, 본 명세서에는 실시형태 288의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG2 항체이다.
예시적인 실시형태 290에서, 본 명세서에는 실시형태 288의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG2 Fc 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질이다.
예시적인 실시형태 291에서, 본 명세서에는 실시형태 288 내지 290 중 임의의 하나의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 Cγ2 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 292에서, 본 명세서에는 실시형태 272 내지 283 중 임의의 하나의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 인간 Fc 도메인은 인간 IgG3 Fc 도메인이다.
예시적인 실시형태 293에서, 본 명세서에는 실시형태 292의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG3 항체이다.
예시적인 실시형태 294에서, 본 명세서에는 실시형태 292의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG3 Fc 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질이다.
예시적인 실시형태 295에서, 본 명세서에는 실시형태 292 내지 294 중 임의의 하나의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 Cγ3 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 296에서, 본 명세서에는 실시형태 272 내지 283 중 임의의 하나의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 인간 Fc 도메인은 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
예시적인 실시형태 297에서, 본 명세서에는 실시형태 296의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG4 항체이다.
예시적인 실시형태 298에서, 본 명세서에는 실시형태 296의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 인간 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질이다.
예시적인 실시형태 299에서, 본 명세서에는 실시형태 296 내지 298 중 임의의 하나의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 Cγ4 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 300에서, 본 명세서에는 실시형태 282, 284, 285, 287 내지 289, 291 내지 293, 295 내지 297 및 299 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 κ 경쇄를 갖는 인간 항체이고, 설치류는 인간 κ 경쇄를 포함하는 항체를 발현한다.
예시적인 실시형태 301에서, 본 명세서에는 실시형태 282, 284, 285, 287 내지 289, 291 내지 293, 295 내지 297 및 299 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 치료용 단백질은 λ 경쇄를 갖는 인간 항체이고, 설치류는 인간 λ 경쇄를 포함하는 항체를 발현한다.
예시적인 실시형태 302에서, 본 명세서에는 실시형태 중 272 내지 301 임의의 하나의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 설치류는 마우스이다.
예시적인 실시형태 303에서, 본 명세서에는 실시형태 중 272 내지 301 임의의 하나의 동물 모델이 제공되며, 여기서, 설치류는 래트이다.
예시적인 실시형태 304에서, 본 명세서에는 설치류 배아 줄기(ES) 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 (i) VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 305에서, 본 명세서에는 실시형태 304의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 IgG 막관통 도메인은 설치류 IgG 막관통 도메인이다.
예시적인 실시형태 306에서, 본 명세서에는 실시형태 304의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 IgG 막관통 도메인은 인간 IgG 막관통 도메인이다.
예시적인 실시형태 307에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 306 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 IgG 세포질 도메인은 설치류 IgG 세포질 도메인이다.
예시적인 실시형태 308에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 306 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 IgG 세포질 도메인은 인간 IgG 세포질 도메인이다.
예시적인 실시형태 309에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 308 중 어느 하나의 설치류가 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG1 도메인이다.
예시적인 실시형태 310에서, 본 명세서에는 실시형태 309의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 IgG1 도메인은 IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 및 IGHG1*05로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
예시적인 실시형태 311에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 308 중 어느 하나의 설치류가 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG2 도메인이다.
예시적인 실시형태 312에서, 본 명세서에는 실시형태 311의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 IgG2 도메인은 IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 및 IGHG2*06으로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
예시적인 실시형태 313에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 308 중 어느 하나의 설치류가 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG3 도메인이다.
예시적인 실시형태 314에서, 본 명세서에는 실시형태 313의 설치류 ES 세포가 제공되며 여기서, IgG3 도메인은 IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 및 IGHG3*19로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
예시적인 실시형태 315에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 308 중 어느 하나의 설치류가 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG4 도메인이다.
예시적인 실시형태 316에서, 본 명세서에는 실시형태 315의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 IgG4 도메인은 IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 및 IGHG4*04로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
예시적인 실시형태 317에서, 본 명세서에는 실시형태 309 내지 316 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2a 또는 Cγ2c 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 318에서, 본 명세서에는 실시형태 317의 설치류 ES 세포가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2a 또는 Cγ2c 유전자 분절을 대체한다.
예시적인 실시형태 319에서, 본 명세서에는 실시형태 309 내지 316 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ1 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 320에서, 본 명세서에는 실시형태 319의 설치류 ES 세포가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ1 유전자 분절을 대체한다.
예시적인 실시형태 321에서, 본 명세서에는 실시형태 309 내지 316 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2b 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 322에서, 본 명세서에는 실시형태 321의 설치류 ES 세포가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2b 유전자 분절을 대체한다.
예시적인 실시형태 323에서, 본 명세서에는 실시형태 309 내지 316 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ3 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 324에서, 본 명세서에는 실시형태 323의 설치류 ES 세포가 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ3 유전자 분절을 대체한다.
예시적인 실시형태 325에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 324 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cμ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 326에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 324 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 327에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 326 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cδ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 328에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 326 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cδ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 329에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 328 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ1 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 330에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 329 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 331에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 330 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ2b 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 332에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 331 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ3 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 333에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 332 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 334에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 332 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 335에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 334 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 336에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 334 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 337에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 324 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ3 유전자 분절 및 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 338에서, 본 명세서에는 실시형태 337의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절 및 인간 Cγ4 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 339에서, 본 명세서에는 실시형태 337 내지 338 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 340에서, 본 명세서에는 실시형태 337 내지 339 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 341에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 340 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 인트론성 인핸서(Ei)를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 342에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 340 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 인트론성 인핸서(Ei)를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 343에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 342 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 344에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 342 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 3' 조절 영역(3' RR)을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 345에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 344 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sμ 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 346에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 345 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ3 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 347에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 346 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ1 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 348에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 347 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ2b 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 349에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 348 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ2a 및/또는 Sγ2c 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 350에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 349 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sε 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 351에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 350 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sα 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 352에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 344 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sμ 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 353에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 344 및 352 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ3 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 354에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 344 및 352 내지 353 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ1 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 355에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 344 및 352 내지 354 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ2 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 356에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 344 및 352 내지 355 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ4 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 357에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 344 및 352 내지 356 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sε 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 358에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 344 및 352 내지 357 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sα 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 359에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 358 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, VH 유전자 분절은 설치류 VH 유전자 분절이고, DH 유전자 분절은 설치류 DH 유전자 분절이며, JH 유전자 분절은 설치류 JH 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 360에서, 본 명세서에는 실시형태 359의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절은 내인성 설치류 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 361에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 358 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, VH 유전자 분절은 인간 VH 유전자 분절이고, DH 유전자 분절은 인간 DH 유전자 분절이며, JH 유전자 분절은 인간 JH 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 362에서, 본 명세서에는 실시형태 361의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 적어도 3개의 인간 VH 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 363에서, 본 명세서에는 실시형태 361 또는 실시형태 362의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 인간 DH 유전자 분절의 전부를 포함한다.
예시적인 실시형태 364에서, 본 명세서에는 실시형태 361 내지 363 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 인간 JH 유전자 분절의 전부를 포함한다.
예시적인 실시형태 365에서, 본 명세서에는 실시형태 361 내지 364 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 기능성 내인성 설치류 Adam6 유전자가 결여되어 있다.
예시적인 실시형태 366에서, 본 명세서에는 실시형태 361 내지 365 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 생식세포계열 게놈은 기능성 설치류 Adam6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 367에서, 본 명세서에는 실시형태 366의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 기능성 설치류 Adam6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편이 발현된다.
예시적인 실시형태 368에서, 본 명세서에는 실시형태 366 또는 실시형태 367의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 동일한 염색체 상에 포함된다.
예시적인 실시형태 369에서, 본 명세서에는 실시형태 366 내지 368 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 포함된다.
예시적인 실시형태 370에서, 본 명세서에는 실시형태 366 내지 369 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 Adam6 위유전자 대신에 존재한다.
예시적인 실시형태 371에서, 본 명세서에는 실시형태 366 내지 370 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 Adam6 위유전자를 대체한다.
예시적인 실시형태 372에서, 본 명세서에는 실시형태 366 내지 371 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 제1 인간 VH 유전자 분절과 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에 존재한다.
예시적인 실시형태 373에서, 본 명세서에는 실시형태 372의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 제1 인간 VH 유전자 분절은 VH1-2이고, 제2 인간 VH 유전자 분절은 VH6-1이다.
예시적인 실시형태 374에서, 본 명세서에는 실시형태 366 내지 369 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 존재한다.
예시적인 실시형태 375에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 374 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 존재한다.
예시적인 실시형태 376에서, 본 명세서에는 실시형태 375의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 377에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 376 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 378에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 376 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 379에서, 본 명세서에는 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii)(a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 설치류 Cγ1 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 인간 IgG1 CH1 도메인, 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인, 설치류 IgG2a 막관통 도메인 및 설치류 IgG2a 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 380에서, 본 명세서에는 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 설치류 Cγ1 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 인간 IgG1 CH1 도메인, 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인, 인간 IgG1 막관통 도메인 및 인간 IgG1 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 381에서, 본 명세서에는 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii)설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii)(a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 IgG4 CH1 도메인, 인간 IgG4 힌지 영역, 인간 IgG4 CH2 도메인, 인간 IgG4 CH3 도메인, 설치류 IgG1 막관통 도메인 및 설치류 IgG1 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 382에서, 본 명세서에는 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii)설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii)(a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 IgG4 CH1 도메인, 인간 IgG4 힌지 영역, 인간 IgG4 CH2 도메인, 인간 IgG4 CH3 도메인, 인간 IgG4 막관통 도메인 및 인간 IgG4 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 383에서, 본 명세서에는 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 인간 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 384에서, 본 명세서에는 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 인간 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절; (c) 인간 Cγ2 유전자 분절; (d) 인간 Cγ4 유전자 분절; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 385에서, 본 명세서에는 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 (i) 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 매인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 386에서, 본 명세서에는 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 (i) 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절; (c) 인간 Cγ2 유전자 분절; (d) 인간 Cγ4 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 387에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 386 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 (1) 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ쇄 가변 영역; 및 (2) 인간 Cκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 카파(κ)쇄 유전자좌를 더 포함하되, 여기서 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 면역글로불린 κ쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 388에서, 본 명세서에는 실시형태 387의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 설치류 인트론성 κ 인핸서(Eκi)를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 389에서, 본 명세서에는 실시형태 387의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 인간 인트론성 κ 인핸서(Eκi)를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 390에서, 본 명세서에는 실시형태 387 내지 389 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 설치류 3' κ 인핸서(Eκ3')를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 391에서, 본 명세서에는 실시형태 387 내지 389 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 인간 3' κ 인핸서(Eκ3')를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 392에서, 본 명세서에는 실시형태 387 내지 391 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 적어도 6개의 인간 Vκ 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 393에서, 본 명세서에는 실시형태 387 또는 실시형태 392의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 인간 Jκ 유전자 분절의 전부를 포함한다.
예시적인 실시형태 394에서, 본 명세서에는 실시형태 387 내지 393 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 395에서, 본 명세서에는 실시형태 394의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 396에서, 본 명세서에는 실시형태 387 내지 395 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 397에서, 본 명세서에는 실시형태 387 내지 395 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 398에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 397 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 Vλ 유전자 분절, 인간 Jλ 유전자 분절 및 인간 Cλ 유전자 분절을 포함하는 조작된 면역글로불린 람다(λ)쇄 유전자좌를 더 포함하되, 여기서 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Cλ 유전자 분절에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 399에서, 본 명세서에는 실시형태 398의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ1 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 400에서, 본 명세서에는 실시형태 399의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ1 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 401에서, 본 명세서에는 실시형태 398의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ2 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 402에서, 본 명세서에는 실시형태 401의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ2 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 403에서, 본 명세서에는 실시형태 398의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ3 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 404에서, 본 명세서에는 실시형태 403의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ3 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 405에서, 본 명세서에는 실시형태 398의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ6 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 406에서, 본 명세서에는 실시형태 405의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ6 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 407에서, 본 명세서에는 실시형태 398의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ7 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 408에서, 본 명세서에는 실시형태 398 내지 407 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 Cλ1 유전자 분절, 인간 Cλ2 유전자 분절, 인간 Cλ3 유전자 분절, 인간 Cλ6 유전자 분절 및 설치류 C λ1 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 409에서, 본 명세서에는 실시형태 408의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 Jλ1 유전자 분절, 인간 Jλ2 유전자 분절, 인간 Jλ3 유전자 분절, 인간 Jλ6 유전자 분절 및 인간 Jλ7 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 410에서, 본 명세서에는 실시형태 409의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 Jλ1- Cλ1 유전자 분절 클러스터, 인간 Jλ2-Cλ2 유전자 분절 클러스터, 인간 Jλ3-Cλ3 유전자 분절 클러스터, 인간 Jλ6-Cλ6 유전자 분절 클러스터 및 인간 Jλ7-설치류 Cλ1 유전자 분절 클러스터를 포함한다.
예시적인 실시형태 411에서, 본 명세서에는 실시형태 398 내지 410 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 적어도 7개의 인간 Vλ 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 412에서, 본 명세서에는 실시형태 398 내지 411 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 설치류 λ 인핸서 2.4를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 413에서, 본 명세서에는 실시형태 398 내지 412 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 설치류 3' λ 인핸서를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 414에서, 본 명세서에는 실시형태 398 내지 413 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 설치류 λ 인핸서 3.1을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 415에서, 본 명세서에는 실시형태 398 내지 414 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 3' λ 인핸서를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 416에서, 본 명세서에는 실시형태 398 내지 415 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 존재한다.
예시적인 실시형태 417에서, 본 명세서에는 실시형태 416의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 418에서, 본 명세서에는 실시형태 398 내지 417 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 419에서, 본 명세서에는 실시형태 398 내지 417 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 420에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 419 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 조작된 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 신생아 Fc 수용체(FcRn) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 421에서, 본 명세서에는 실시형태 420의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 422에서, 본 명세서에는 실시형태 420의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 423에서, 본 명세서에는 실시형태 420 내지 422 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 424에서, 본 명세서에는 실시형태 420 내지 422 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 425에서, 본 명세서에는 실시형태 420 내지 424 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 426에서, 본 명세서에는 실시형태 425의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 427에서, 본 명세서에는 실시형태 420의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 428에서, 본 명세서에는 실시형태 420 내지 427 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcRn을 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 429에서, 본 명세서에는 실시형태 420 내지 428 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcRn 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 430에서, 본 명세서에는 실시형태 420 내지 428 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcRn 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 431에서, 본 명세서에는 실시형태 420 내지 430 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 또는 인간화된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 432에서, 본 명세서에는 실시형태 431의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 433에서, 본 명세서에는 실시형태 432의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 434에서, 본 명세서에는 실시형태 431 내지 433 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 핵산 서열은 인간 β2M 유전자의 엑손 2-4를 포함한다.
예시적인 실시형태 435에서, 본 명세서에는 실시형태 431 내지 434 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 β2M 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 436에서, 본 명세서에는 실시형태 431 내지 435 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 β2M 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 437에서, 본 명세서에는 실시형태 431 내지 435 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 β2M 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 438에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 437 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 엡실론 수용체 1 알파(FcεR1α) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 439에서, 본 명세서에는 실시형태 438의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 440에서, 본 명세서에는 실시형태 438의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 441에서, 본 명세서에는 실시형태 438 내지 440 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 442에서, 본 명세서에는 실시형태 438 내지 440 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 443에서, 본 명세서에는 실시형태 438 내지 442 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 444에서, 본 명세서에는 실시형태 443의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 445에서, 본 명세서에는 실시형태 444의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포외 도메인, 인간 막관통 도메인 및 인간 세포질 도메인을 포함한다.
예시적인 실시형태 446에서, 본 명세서에는 실시형태 438의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 447에서, 본 명세서에는 실시형태 438 내지 446 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcεR1α을 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 448에서, 본 명세서에는 실시형태 438 내지 447 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 449에서, 본 명세서에는 실시형태 438 내지 447 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 450에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 449 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 1a(FcγR1a) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 451에서, 본 명세서에는 실시형태 450의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 452에서, 본 명세서에는 실시형태 450의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 453에서, 본 명세서에는 실시형태 450 내지 452 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 454에서, 본 명세서에는 실시형태 450 내지 452 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 455에서, 본 명세서에는 실시형태 450 내지 454 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcγR1a 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 456에서, 본 명세서에는 실시형태 455의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcγR1a 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 457에서, 본 명세서에는 실시형태 450의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 FcγR1a 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcγR1a 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 458에서, 본 명세서에는 실시형태 450 내지 457 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcγR1a를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 459에서, 본 명세서에는 실시형태 450 내지 458 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR1a 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 460에서, 본 명세서에는 실시형태 450 내지 458 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR1a 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 461에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 460 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 FcγR2a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 2a(FcγR2a) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 462에서, 본 명세서에는 실시형태 461의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcγR2a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 463에서, 본 명세서에는 실시형태 462의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 FcγR2a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 464에서, 본 명세서에는 실시형태 461 내지 463 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2a 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 465에서, 본 명세서에는 실시형태 461 내지 463 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2a 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 466에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 465 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 FcγR2b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 2b(FcγR2b) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 467에서, 본 명세서에는 실시형태 466의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcγR2b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 468에서, 본 명세서에는 실시형태 467의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 FcγR2b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 469에서, 본 명세서에는 실시형태 466 내지 468 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2b 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 470에서, 본 명세서에는 실시형태 466 내지 468 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2b 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 471에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 470 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 FcγR3a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 3a(FcγR3a) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 472에서, 본 명세서에는 실시형태 471의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcγR3a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 473에서, 본 명세서에는 실시형태 472의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 FcγR3a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 474에서, 본 명세서에는 실시형태 471 내지 473 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR3a 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 475에서, 본 명세서에는 실시형태 471 내지 473 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR3a 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 476에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 475 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 FcγR3b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 3b(FcγR3b) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 477에서, 본 명세서에는 실시형태 476의 설치류ES 세포가 제공되며, 여기서, FcγR3b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 478에서, 본 명세서에는 실시형태 477의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 FcγR3b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 479에서, 본 명세서에는 실시형태 476 내지 478 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR3b 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 480에서, 본 명세서에는 실시형태 476 내지 478 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR3b 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 481에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 480 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 FcγR2c 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 2c(FcγR2c) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 482에서, 본 명세서에는 실시형태 481의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcγR2c 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 483에서, 본 명세서에는 실시형태 482의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 FcγR2c 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 484에서, 본 명세서에는 실시형태 481 내지 483 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcγR2c를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 485에서, 본 명세서에는 실시형태 481 내지 484 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2c 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 486에서, 본 명세서에는 실시형태 481 내지 484 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2c 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 487에서, 본 명세서에는 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 신생아 Fc 수용체(FcRn) 유전자좌를 포함한다.
예시적인 실시형태 488에서, 본 명세서에는 실시형태 487의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 489에서, 본 명세서에는 실시형태 487의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 490에서, 본 명세서에는 실시형태 487 내지 489 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 491에서, 본 명세서에는 실시형태 487 내지 489 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 492에서, 본 명세서에는 실시형태 487 내지 491 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 493에서, 본 명세서에는 실시형태 492의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 494에서, 본 명세서에는 실시형태 493의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 495에서, 본 명세서에는 실시형태 487 내지 494 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcRn을 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 496에서, 본 명세서에는 실시형태 487 내지 495 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcRn 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 497에서, 본 명세서에는 실시형태 487 내지 495 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcRn 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 498에서, 본 명세서에는 실시형태 487 내지 497 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 또는 인간화된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 499에서, 본 명세서에는 실시형태 498의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 500에서, 본 명세서에는 실시형태 499의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 501에서, 본 명세서에는 실시형태 498 내지 500 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 핵산 서열은 인간 β2M 유전자의 엑손 2-4를 포함한다.
예시적인 실시형태 502에서, 본 명세서에는 실시형태 498 내지 501 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 β2M 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 503에서, 본 명세서에는 실시형태 498 내지 502 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 β2M 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 504에서, 본 명세서에는 실시형태 498 내지 502 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 β2M 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 505에서, 본 명세서에는 설치류 ES 세포가 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 엡실론 수용체 1 알파(FcεR1α) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 506에서, 본 명세서에는 실시형태 505의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 507에서, 본 명세서에는 실시형태 505의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 508에서, 본 명세서에는 실시형태 505 내지 507 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 509에서, 본 명세서에는 실시형태 505 내지 507 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 510에서, 본 명세서에는 실시형태 505 내지 509 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 511에서, 본 명세서에는 실시형태 510의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 512에서, 본 명세서에는 실시형태 511의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포외 도메인, 인간 막관통 도메인 및 인간 세포질 도메인을 포함한다.
예시적인 실시형태 513에서, 본 명세서에는 실시형태 505의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 인간 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 514에서, 본 명세서에는 실시형태 505 내지 513 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcεR1α을 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 515에서, 본 명세서에는 실시형태 505 내지 514 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 516에서, 본 명세서에는 실시형태 505 내지 514 중 어느 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 517에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 516 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 마우스이다.
예시적인 실시형태 518에서, 본 명세서에는 실시형태 304 내지 516 중 임의의 하나의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 설치류는 래트이다.
예시적인 실시형태 519에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 방법은 (i) VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하며, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 520에서, 본 명세서에는 실시형태 519의 방법이 제공되며, 여기서 IgG 막관통 도메인은 설치류 IgG 막관통 도메인이다.
예시적인 실시형태 521에서, 본 명세서에는 실시형태 519의 방법이 제공되며, 여기서 IgG 막관통 도메인은 인간 IgG 막관통 도메인이다.
예시적인 실시형태 522에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 521 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, IgG 세포질 도메인은 설치류 IgG 세포질 도메인이다.
예시적인 실시형태 523에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 521 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, IgG 세포질 도메인은 인간 IgG 세포질 도메인이다.
예시적인 실시형태 524에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 523 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG1 도메인이다.
예시적인 실시형태 525에서, 본 명세서에는 실시형태 524의 방법이 제공되며, 여기서 IgG1 도메인은 IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 및 IGHG1*05로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
예시적인 실시형태 526에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 523 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG2 도메인이다.
예시적인 실시형태 527에서, 본 명세서에는 실시형태 526의 방법이 제공되며, 여기서 IgG2 도메인은 IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 및 IGHG2*06으로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
예시적인 실시형태 528에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 523 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG3 도메인이다.
예시적인 실시형태 529에서, 본 명세서에는 실시형태 528의 방법이 제공되며 여기서, IgG3 도메인은 IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 및 IGHG3*19로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
예시적인 실시형태 530에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 523 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인은 IgG4 도메인이다.
예시적인 실시형태 531에서, 본 명세서에는 실시형태 530의 방법이 제공되며, 여기서 IgG4 도메인은 IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 및 IGHG4*04로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화된다.
예시적인 실시형태 532에서, 본 명세서에는 실시형태 524 내지 531 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2a 또는 Cγ2c 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 533에서, 본 명세서에는 실시형태 532의 방법이 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2a 또는 Cγ2c 유전자 분절을 대체한다.
예시적인 실시형태 534에서, 본 명세서에는 실시형태 524 내지 531 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ1 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 535에서, 본 명세서에는 실시형태 534의 방법이 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ1 유전자 분절을 대체한다.
예시적인 실시형태 536에서, 본 명세서에는 실시형태 524 내지 531 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2b 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 537에서, 본 명세서에는 실시형태 536의 방법이 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2b 유전자 분절을 대체한다.
예시적인 실시형태 538에서, 본 명세서에는 실시형태 524 내지 531 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ3 유전자 분절 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 539에서, 본 명세서에는 실시형태 538의 방법이 제공되며, 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인 및 인간 CH3 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ3 유전자 분절을 대체한다.
예시적인 실시형태 540에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 539 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cμ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 541에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 539 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 542에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 541 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cδ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 543에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 541 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cδ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 544에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 543 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ1 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 545에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 544 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 546에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 545 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ2b 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 547에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 546 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ3 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 548에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 547 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 549에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 548 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 550에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 549 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 551에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 549 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 552에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 539 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ3 유전자 분절 및 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 553에서, 본 명세서에는 실시형태 552의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절 및 인간 Cγ4 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 554에서, 본 명세서에는 실시형태 552 내지 553 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 555에서, 본 명세서에는 실시형태 552 내지 554 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 556에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 인간 CH1 도메인, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, 인간 CH4 도메인, 인간 IgM 막관통 도메인 및 인간 IgM 세포질 도메인을 포함하는 IgM 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 이 방법은 (i) VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 인간 CH1 도메인, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, 인간 CH4 도메인, 인간 IgM 막관통 도메인 및 인간 IgM 세포질 도메인을 포함하는 IgM 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgM 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 557에서, 본 명세서에는 실시형태 556의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cδ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 558에서, 본 명세서에는 실시형태 556 또는 557의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ3 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 559에서, 본 명세서에는 실시형태 556 내지 558 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ1 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 560에서, 본 명세서에는 실시형태 556 내지 559 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 561에서, 본 명세서에는 실시형태 556 내지 560 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ4 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 562에서, 본 명세서에는 실시형태 556 내지 561 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ3 유전자 분절 및 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 563에서, 본 명세서에는 실시형태 562의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절 및 인간 Cγ4 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 564에서, 본 명세서에는 실시형태 562 내지 563 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 565에서, 본 명세서에는 실시형태 562 내지 564 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 566에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 H1 도메인, 인간 힌지 H2 도메인, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, 인간 IgD 막관통 도메인 및 인간 IgD 세포질 도메인을 포함하는 IgD 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 방법은 (i) VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 H1 도메인, 인간 힌지 H2 도메인, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, 인간 IgD 막관통 도메인 및 인간 IgD 세포질 도메인을 포함하는 IgD 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgD 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 567에서, 본 명세서에는 실시형태 566의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 568에서, 본 명세서에는 실시형태 566 또는 567의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ3 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 569에서, 본 명세서에는 실시형태 566 내지 568 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ1 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 570에서, 본 명세서에는 실시형태 566 내지 569 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 571에서, 본 명세서에는 실시형태 566 내지 570 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ4 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 572에서, 본 명세서에는 실시형태 566 내지 571 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ3 유전자 분절 및 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 573에서, 본 명세서에는 실시형태 572의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절 및 인간 Cγ4 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 574에서, 본 명세서에는 실시형태 572 내지 573 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 575에서, 본 명세서에는 실시형태 572 내지 574 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 576에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 575 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 인트론성 인핸서(Ei)를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 577에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 575 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 인트론성 인핸서(Ei)를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 578에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 577 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 579에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 577 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 3' 조절 영역(3' RR)을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 580에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 579 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sμ 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 581에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 580 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ3 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 582에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 581 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ1 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 583에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 582 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ2b 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 584에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 583 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ2a 및/또는 Sγ2c 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 585에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 584 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sε 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 586에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 585 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sα 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 587에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 579 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sμ 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 588에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 579 및 587 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ3 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 589에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 579 및 587 내지 588 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ1 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 590에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 579 및 587 내지 589 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ2 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 591에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 579 및 587 내지 590 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ4 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 592에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 579 및 587 내지 591 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sε 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 593에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 579 및 587 내지 592 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sα 스위치 부위를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 594에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 593 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, VH 유전자 분절은 설치류 VH 유전자 분절이고, DH 유전자 분절은 설치류 DH 유전자 분절이며, JH 유전자 분절은 설치류 JH 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 595에서, 본 명세서에는 실시형태 594의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절은 내인성 설치류 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 596에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 593 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, VH 유전자 분절은 인간 VH 유전자 분절이고, DH 유전자 분절은 인간 DH 유전자 분절이며, JH 유전자 분절은 인간 JH 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 597에서, 본 명세서에는 실시형태 596의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 적어도 3개의 인간 VH 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 598에서, 본 명세서에는 실시형태 596 또는 실시형태 597의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 인간 DH 유전자 분절의 전부를 포함한다.
예시적인 실시형태 599에서, 본 명세서에는 실시형태 596 내지 598 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 인간 JH 유전자 분절의 전부를 포함한다.
예시적인 실시형태 600에서, 본 명세서에는 실시형태 596 내지 599 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 기능성 내인성 설치류 Adam6 유전자가 결여되어 있다.
예시적인 실시형태 601에서, 본 명세서에는 실시형태 596 내지 600 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 생식세포계열 게놈은 기능성 설치류 Adam6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 602에서, 본 명세서에는 실시형태 601의 방법이 제공되며, 여기서, 기능성 설치류 Adam6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편이 발현된다.
예시적인 실시형태 603에서, 본 명세서에는 실시형태 601 또는 실시형태 602의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 동일한 염색체 상에 포함된다.
예시적인 실시형태 604에서, 본 명세서에는 실시형태 601 내지 603 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 포함된다.
예시적인 실시형태 605에서, 본 명세서에는 실시형태 601 내지 604 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 Adam6 위유전자 대신에 존재한다.
예시적인 실시형태 606에서, 본 명세서에는 실시형태 601 내지 605 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 Adam6 위유전자를 대체한다.
예시적인 실시형태 607에서, 본 명세서에는 실시형태 601 내지 606 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 제1 인간 VH 유전자 분절과 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에 존재한다.
예시적인 실시형태 608에서, 본 명세서에는 실시형태 607의 설치류가 제공되며, 여기서, 제1 인간 VH 유전자 분절은 VH1-2이고, 제2 인간 VH 유전자 분절은 VH6-1이다.
예시적인 실시형태 609에서, 본 명세서에는 실시형태 601 내지 604 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능성 오쏘로그, 기능성 동족체 또는 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 존재한다.
예시적인 실시형태 610에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 609 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 존재한다.
예시적인 실시형태 611에서, 본 명세서에는 실시형태 610의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 612에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 611 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 613에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 611 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 614에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 설치류 Cγ1 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 인간 IgG1 CH1 도메인, 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인, 설치류 IgG2a 막관통 도메인 및 설치류 IgG2a 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 이 방법은 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii)설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 설치류 Cγ1 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 인간 IgG1 CH1 도메인, 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인, 설치류 IgG2a 막관통 도메인 및 설치류 IgG2a 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 변형된 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 615에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 설치류 Cγ1 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 인간 IgG1 CH1 도메인, 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인, 인간 IgG1 막관통 도메인 및 인간 IgG1 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 이 방법은 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii)설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 설치류 Cγ1 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 인간 IgG1 CH1 도메인, 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인, 인간 IgG1 막관통 도메인 및 인간 IgG1 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하고, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 변형된 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 616에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii)설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii)(a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 IgG4 CH1 도메인, 인간 IgG4 힌지 영역, 인간 IgG4 CH2 도메인, 인간 IgG4 CH3 도메인, 설치류 IgG1 막관통 도메인 및 설치류 IgG1 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 이 방법은 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 IgG4 CH1 도메인, 인간 IgG4 힌지 영역, 인간 IgG4 CH2 도메인, 인간 IgG4 CH3 도메인, 설치류 IgG1 막관통 도메인 및 설치류 IgG1 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하며; 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 변형된 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 617에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii)설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii)(a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 IgG4 CH1 도메인, 인간 IgG4 힌지 영역, 인간 IgG4 CH2 도메인, 인간 IgG4 CH3 도메인, 인간 IgG4 막관통 도메인 및 인간 IgG4 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절; (g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 이 방법은 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii)설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 설치류 Cμ 유전자 분절; (b) 설치류 Cδ 유전자 분절; (c) 설치류 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 IgG4 CH1 도메인, 인간 IgG4 힌지 영역, 인간 IgG4 CH2 도메인, 인간 IgG4 CH3 도메인, 인간 IgG4 막관통 도메인 및 인간 IgG4 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절; (e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절; (f) 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절;(g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및 (h) 설치류 Cα 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및(iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 변형된 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 618에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 인간 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 이 방법은 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 인간 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 완전 인간 중쇄를 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 619에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 인간 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절; (c) 인간 Cγ2 유전자 분절; (d) 인간 Cγ4 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 이 방법은 (i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 인간 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절; (c) 인간 Cγ2 유전자 분절; (d) 인간 Cγ4 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 완전 인간 중쇄를 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 620에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 이 방법은 (i) 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii)설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 설치류 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 621에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 (i) 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절; (c) 인간 Cγ2 유전자 분절; (d) 인간 Cγ4 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 이 방법은 (i) 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; (ii)설치류 인트론성 인핸서(Ei); (iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절; (b) 인간 Cδ 유전자 분절; (c) 인간 Cγ3 유전자 분절; (d) 인간 Cγ1 유전자 분절; (c) 인간 Cγ2 유전자 분절; (d) 인간 Cγ4 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 설치류가 설치류 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 622에서, 본 명세서에는 실시형태 614 내지 621 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 존재한다.
예시적인 실시형태 623에서, 본 명세서에는 실시형태 622의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 624에서, 본 명세서에는 실시형태 614 내지 623 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 625에서, 본 명세서에는 실시형태 614 내지 623 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 626에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 625 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 이 방법은 게놈 내에 (1) 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ쇄 가변 영역; 및 (2) 인간 Cκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ쇄 불변 영역을 포함하는 조작된 면역글로불린 카파(κ)쇄 유전자좌를 더 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 더 포함하며, 여기서 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 설치류가 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 및 인간 Cκ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 불변 도메인을 포함하는 항체를 생산하도록 면역글로불린 κ쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 627에서, 본 명세서에는 실시형태 626의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 설치류 인트론성 κ 인핸서(Eκi)를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 628에서, 본 명세서에는 실시형태 626의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 인간 인트론성 κ 인핸서(Eκi)를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 629에서, 본 명세서에는 실시형태 626 내지 628 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 설치류 3' κ 인핸서(Eκ3')를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 630에서, 본 명세서에는 실시형태 626 내지 628 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 인간 3' κ 인핸서(Eκ3')를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 631에서, 본 명세서에는 실시형태 626 내지 630 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 적어도 6개의 인간 Vκ 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 632에서, 본 명세서에는 실시형태 626 내지 631 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 인간 Jκ 유전자 분절의 전부를 포함한다.
예시적인 실시형태 633에서, 본 명세서에는 실시형태 626 내지 632 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 존재한다.
예시적인 실시형태 634에서, 본 명세서에는 실시형태 633의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 635에서, 본 명세서에는 실시형태 626 내지 634 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 636에서, 본 명세서에는 실시형태 626 내지 634 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 637에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 636 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 이의 게놈 내에 인간 Vλ 유전자 분절, 인간 Jλ 유전자 분절 및 인간 Cλ 유전자 분절을 포함하는 조작된 면역글로불린 람다(λ)쇄 유전자좌를 더 포함하되, 여기서 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절은 설치류가 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 및 인간 Cλ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 불변 도메인을 포함하는 항체를 생산하도록 인간 Cλ 유전자 분절에 작동 가능하게 연결된다.
예시적인 실시형태 638에서, 본 명세서에는 실시형태 637의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ1 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 639에서, 본 명세서에는 실시형태 638의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ1 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 640에서, 본 명세서에는 실시형태 637의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ2 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 641에서, 본 명세서에는 실시형태 640의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ2 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 642에서, 본 명세서에는 실시형태 637의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ3 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 643에서, 본 명세서에는 실시형태 642의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ3 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 644에서, 본 명세서에는 실시형태 637의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ6 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 645에서, 본 명세서에는 실시형태 644의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ6 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 646에서, 본 명세서에는 실시형태 637의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ7 유전자 분절이다.
예시적인 실시형태 647에서, 본 명세서에는 실시형태 637 내지 646 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 Cλ1 유전자 분절, 인간 Cλ2 유전자 분절, 인간 Cλ3 유전자 분절, 인간 Cλ6 유전자 분절 및 설치류 C λ1 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 648에서, 본 명세서에는 실시형태 647의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 Jλ1 유전자 분절, 인간 Jλ2 유전자 분절, 인간 Jλ3 유전자 분절, 인간 Jλ6 유전자 분절 및 인간 Jλ7 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 649에서, 본 명세서에는 실시형태 648의 설치류 ES 세포가 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 Jλ1- Cλ1 유전자 분절 클러스터, 인간 Jλ2-Cλ2 유전자 분절 클러스터, 인간 Jλ3-Cλ3 유전자 분절 클러스터, 인간 Jλ6-Cλ6 유전자 분절 클러스터 및 인간 Jλ7-설치류 Cλ1 유전자 분절 클러스터를 포함한다.
예시적인 실시형태 650에서, 본 명세서에는 실시형태 637 내지 649 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 적어도 7개의 인간 Vλ 유전자 분절을 포함한다.
예시적인 실시형태 651에서, 본 명세서에는 실시형태 637 내지 650 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 설치류 λ 인핸서 2.4를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 652에서, 본 명세서에는 실시형태 637 내지 651 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 설치류 3' λ 인핸서를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 653에서, 본 명세서에는 실시형태 637 내지 652 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 설치류 λ 인핸서 3.1을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 654에서, 본 명세서에는 실시형태 637 내지 653 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 3' λ 인핸서를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 655에서, 본 명세서에는 실시형태 637 내지 654 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 존재한다.
예시적인 실시형태 656에서, 본 명세서에는 실시형태 655의 방법이 제공되며, 여기서, 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 657에서, 본 명세서에는 실시형태 637 내지 656 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 658에서, 본 명세서에는 실시형태 637 내지 656 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 659에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 658 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 신생아 Fc 수용체(FcRn) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 660에서, 본 명세서에는 실시형태 659의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 661에서, 본 명세서에는 실시형태 659의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 662에서, 본 명세서에는 실시형태 659 내지 661 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 663에서, 본 명세서에는 실시형태 659 내지 661 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 664에서, 본 명세서에는 실시형태 659 내지 663 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 665에서, 본 명세서에는 실시형태 664의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 666에서, 본 명세서에는 실시형태 665의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 667에서, 본 명세서에는 실시형태 659 내지 666 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcRn을 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 668에서, 본 명세서에는 실시형태 659 내지 667 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcRn 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 669에서, 본 명세서에는 실시형태 659 내지 667 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcRn 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 670에서, 본 명세서에는 실시형태 659 내지 669 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 또는 인간화된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 671에서, 본 명세서에는 실시형태 670의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 672에서, 본 명세서에는 실시형태 671의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 673에서, 본 명세서에는 실시형태 670 내지 672 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 핵산 서열은 인간 β2M 유전자의 엑손 2-4를 포함한다.
예시적인 실시형태 674에서, 본 명세서에는 실시형태 670 내지 673 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 β2M 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 675에서, 본 명세서에는 실시형태 560 내지 674 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 β2M 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 676에서, 본 명세서에는 실시형태 560 내지 674 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 β2M 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 677에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 676 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 엡실론 수용체 1 알파(FcεR1α) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 678에서, 본 명세서에는 실시형태 677의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 679에서, 본 명세서에는 실시형태 677의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 680에서, 본 명세서에는 실시형태 677 내지 679 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 681에서, 본 명세서에는 실시형태 677 내지 679 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 682에서, 본 명세서에는 실시형태 677 내지 681 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 683에서, 본 명세서에는 실시형태 682의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 684에서, 본 명세서에는 실시형태 683의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포외 도메인, 인간 막관통 도메인 및 인간 세포질 도메인을 포함한다.
예시적인 실시형태 685에서, 본 명세서에는 실시형태 677의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 686에서, 본 명세서에는 실시형태 677 내지 685 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcεR1α를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 687에서, 본 명세서에는 실시형태 677 내지 686 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 688에서, 본 명세서에는 실시형태 677 내지 686 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 689에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 688 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 1a(FcγR1a) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 690에서, 본 명세서에는 실시형태 689의 방법이 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 691에서, 본 명세서에는 실시형태 689의 방법이 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 692에서, 본 명세서에는 실시형태 689 내지 691 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 693에서, 본 명세서에는 실시형태 689 내지 691 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 694에서, 본 명세서에는 실시형태 689 내지 693 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcγR1a 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 695에서, 본 명세서에는 실시형태 694의 방법이 제공되며, 여기서, FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcγR1a 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 696에서, 본 명세서에는 실시형태 689의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 FcγR1a 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcγR1a 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 697에서, 본 명세서에는 실시형태 689 내지 696 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcγR1a를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 698에서, 본 명세서에는 실시형태 689 내지 697 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR1a 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 699에서, 본 명세서에는 실시형태 689 내지 697 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR1a 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 700에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 699 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 FcγR2a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 2a(FcγR2a) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 701에서, 본 명세서에는 실시형태 700의 방법이 제공되며, 여기서, FcγR2a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 702에서, 본 명세서에는 실시형태 701의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 FcγR2a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 703에서, 본 명세서에는 실시형태 700 내지 702 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2a 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 704에서, 본 명세서에는 실시형태 700 내지 702 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2a 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 705에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 704 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 FcγR2b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 2b(FcγR2b) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 706에서, 본 명세서에는 실시형태 705의 방법이 제공되며, 여기서, FcγR2b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 707에서, 본 명세서에는 실시형태 706의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 FcγR2b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 708에서, 본 명세서에는 실시형태 705 내지 707 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2b 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 709에서, 본 명세서에는 실시형태 705 내지 707 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2b 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 710에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 709 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 FcγR3a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 3a(FcγR3a) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 711에서, 본 명세서에는 실시형태 710의 방법이 제공되며, 여기서, FcγR3a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 712에서, 본 명세서에는 실시형태 711의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 FcγR3a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 713에서, 본 명세서에는 실시형태 710 내지 712 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR3a 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 714에서, 본 명세서에는 실시형태 710 내지 712 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR3a 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 715에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 714 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 FcγR3b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 3b(FcγR3b) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 716에서, 본 명세서에는 실시형태 715의 방법이 제공되며, 여기서, FcγR3b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 717에서, 본 명세서에는 실시형태 716의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 FcγR3b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 718에서, 본 명세서에는 실시형태 715 내지 717 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR3b 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 719에서, 본 명세서에는 실시형태 715 내지 717 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR3b 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 720에서, 본 명세서에는 실시형태 519 내지 719 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 이 설치류 ES 세포는 이의 게놈 내에 인간 FcγR2c 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 Fc 감마 수용체 2c(FcγR2c) 유전자좌를 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 721에서, 본 명세서에는 실시형태 720의 방법이 제공되며, 여기서, FcγR2c 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 722에서, 본 명세서에는 실시형태 721의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 FcγR2c 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 723에서, 본 명세서에는 실시형태 720 내지 722 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcγR2c를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 724에서, 본 명세서에는 실시형태 720 내지 723 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2c 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 725에서, 본 명세서에는 실시형태 720 내지 723 중 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcγR2c 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 726에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 신생아 Fc 수용체(FcRn) 유전자좌를 포함하고, 방법은 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 신생아 Fc 수용체(FcRn) 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 727에서, 본 명세서에는 실시형태 726의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 728에서, 본 명세서에는 실시형태 726의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 729에서, 본 명세서에는 실시형태 726 내지 728 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 730에서, 본 명세서에는 실시형태 726 내지 728 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 731에서, 본 명세서에는 실시형태 726 내지 730 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 732에서, 본 명세서에는 실시형태 731의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 733에서, 본 명세서에는 실시형태 732의 방법이 제공되며, 여기서, FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 734에서, 본 명세서에는 실시형태 726 내지 733 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcRn을 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 735에서, 본 명세서에는 실시형태 726 내지 734 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcRn 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 736에서, 본 명세서에는 실시형태 726 내지 734 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcRn 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 737에서, 본 명세서에는 실시형태 726 내지 736 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 또는 인간화된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자좌를 더 포함한다.
예시적인 실시형태 738에서, 본 명세서에는 실시형태 737의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 739에서, 본 명세서에는 실시형태 738의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 740에서, 본 명세서에는 실시형태 737 내지 739 중 어느 하나의 설치류가 제공되며, 여기서, 핵산 서열은 인간 β2M 유전자의 엑손 2-4를 포함한다.
예시적인 실시형태 741에서, 본 명세서에는 실시형태 737 내지 740 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 β2M 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 742에서, 본 명세서에는 실시형태 737 내지 741 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 β2M 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 743에서, 본 명세서에는 실시형태 737 내지 741 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 β2M 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 744에서, 본 명세서에는 설치류의 제조 방법이 제공되며, 이 설치류는 이의 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는Fc 엡실론 수용체 1 알파(FcεR1α) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 FcεR1α 유전자좌를 포함하며, 이 방법은 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 FcεR1α 유전자좌를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태 745에서, 본 명세서에는 실시형태 744의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 746에서, 본 명세서에는 실시형태 744의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 747에서, 본 명세서에는 실시형태 744 내지 746 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 748에서, 본 명세서에는 실시형태 744 내지 746 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태 749에서, 본 명세서에는 실시형태 744 내지 748 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcγR1 유전자좌에 위치된다.
예시적인 실시형태 750에서, 본 명세서에는 실시형태 749의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자의 전부 또는 일부를 대체한다.
예시적인 실시형태 751에서, 본 명세서에는 실시형태 750의 방법이 제공되며, 여기서, FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포외 도메인, 인간 막관통 도메인 및 인간 세포질 도메인을 포함한다.
예시적인 실시형태 752에서, 본 명세서에는 실시형태 744의 방법이 제공되며, 여기서, 인간 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 설치류 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체한다.
예시적인 실시형태 753에서, 본 명세서에는 실시형태 744 내지 752 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 설치류 FcεR1α를 발현하지 않는다.
예시적인 실시형태 754에서, 본 명세서에는 실시형태 744 내지 753 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 이형접합성이다.
예시적인 실시형태 755에서, 본 명세서에는 실시형태 744 내지 753 중 어느 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 조작된 FcεR1α 유전자좌에 대해서 동형접합성이다.
예시적인 실시형태 756에서, 본 명세서에는 실시형태 중 519 내지 755 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 마우스이다.
예시적인 실시형태 757에서, 본 명세서에는 실시형태 중 519 내지 755 임의의 하나의 방법이 제공되며, 여기서, 설치류는 래트이다.
실시예
실시예 1: 인간화된 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 마우스의 유전자 조작
본 실시예는, 비-인간 동물 예컨대, 설치류(예를 들어, 마우스)의 게놈 내에 삽입하기 위한 일련의 표적화 벡터를 작제하는 예시적인 방법을 기재한다. 본 실시예에 기재된 방법은 게놈이 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역 및/또는 조작된 면역글로불린 경쇄(카파 또는 람다) 불변 영역을 포함하는 비-인간 동물의 생산을 설명한다. 특히, 본 실시예는 비-인간 동물이 전체적으로 또는 부분적으로 인간인(예를 들어, 인간 부분 및 설치류 부분을 포함하는) 인간 가변 도메인 및 불변 도메인을 갖는 면역글로불린 중쇄를 포함하는 항체를 발현 및/또는 생산하도록 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 조작하기 위한 표적화 벡터의 작제를 설명한다. 또한 비-인간 동물이 전체적으로 또는 부분적으로 인간인(예를 들어, 인간 부분 및 설치류 부분을 포함하는) 인간 가변 도메인 및 불변 도메인을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체를 발현 및/또는 생산하도록 면역글로불린 경쇄 불변 영역을 조작하기 위한 표적화 벡터의 작제를 설명한다. 추가로, 이러한 항체는 비-인간 동물에서 B 세포의 표면 상에서 기능성 B 세포 수용체를 형성하는 것으로 고려된다. 선택된 조작된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 함유하는 다양한 설치류 균주의 개략적인 요약을 도 1a에 제시하고, 선택된 조작된 면역글로불린 경쇄 불변 영역을 함유하는 다양한 설치류 균주의 개략적인 요약을 도 2a에 제시한다. 간략화를 위해서, 인간 VH 유전자 분절은 도시하지 않으며; 단지 적은 수의 유전자 분절을 개략적으로 나타내고 - 가능한 존재하는 V(D)J 유전자 분절의 완전 레퍼토리의 경우 모두 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[imgt.org; Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001); Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001); 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호; 또는 문헌[Macdonald et al. PNAS (2014) vol. 111 (14):5147-5152]을 참고하기 바란다.
VELOCIGENE® 기술(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-9] 참조) 및 당업계에 공지된 생물 공학 기술을 사용하여 인간 및 마우스 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome: BAC)로부터 선택된 설치류 면역글로불린 불변 영역에 삽입하기 위한 인간 면역글로불린 불변 영역 암호 서열을 함유하는 표적화 벡터 및 DNA 작제물을 생성시켰다. 본 실시예에 기재된 방법을 사용하여 임의의 인간 면역글로불린 불변 영역 암호 서열 또는 목적하는 서열(또는 서열 단편)의 조합물을 활용할 수 있다.
표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 ES 세포를 전기천공하여 도 1a 및 도 2a에 도시된 바와 같은 인간 또는 키메라 마우스/인간 면역글로불린 불변 영역 암호 서열을 발현하는 마우스를 생성시키기 위한 변형된 ES 세포를 생성시켰다. 정량 TAQMANTM 검정(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48] 참조)에 의해서 적절한 변형을 함유하는 ES 세포를 식별하였다. 인간 서열의 삽입(대립유전자의 획득(gain-of-allele), GOA) 및 마우스 서열의 결실(대립유전자의 결실(loss-of-allele), LOA)을 검출하도록 특정 프라이머 세트 및 프로브를 설계하였다.
표적화된 ES 세포를 공여자 ES 세포로 사용하였고, VELOCIMOUSE® 방법(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 문헌[Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99] 참조)에 의해서 8-세포기 마우스 배아에 도입하였다. 고유한 유전자 서열, 예를 들어, 인간 유전자 서열의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형을 사용한 유전자형분석에 의해서 변형된 대립유전자를 독립적으로 보유하는 VELOCIMOUSE®(공여자 ES 세포로부터 전체적으로 유래된 F0 마우스)를 식별하였다. 변형된 대립유전자를 보유하는 선택된 이형접합성 마우스를 동형접합성으로 번식시켰다.
실시예 1.1: 인간 중쇄 가변 영역 및 키메라 또는 완전 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 마우스의 유전자 조작
인간 항체 시험(예를 들어, 치료용 항체의 약동학적 연구 및 투여 연구)을 위해서 사용될 수 있는 설치류를 생성시키기 위해서, 몇몇 접근법을 실시하였다. 제1 접근법에서, 키메라(인간 CH1-H-CH2-CH3 암호 서열 및 마우스 M1-M2 암호 서열) 또는 완전 인간(CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 암호 서열) 중쇄 불변 영역 유전자 분절을 함유한 인간 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 마우스를 생성시켰다. 이러한 마우스를 사용하여, 예를 들어, 아이소타입이 변형된 유전자 분절에 의해서 암호화된 면역글로불린 불변 도메인과 매칭하는 치료용 항체를 시험할 수 있다(즉, 불변 도메인의 CH1-H-CH2-CH3 부분)(예를 들어, 유전자 조작된 IgG1 불변 영역을 포함하는 마우스에서 IgG1 항체를 시험함).
일례에서, 인간 중쇄 가변 영역 서열 및 키메라 인간(인간 CH1-H-CH2-CH3)-마우스(마우스 M1-M2) 불변 영역 서열을 포함하는 마우스를 작제하였는데, 여기서 인간 IgG1의 CH1-H-CH2-CH3 암호 서열을 내인성 IgG2a 유전자좌에서 마우스 IgG2a의 M1-M2 암호 서열과 작동 가능하게 연결시켰다(도 1a, 마우스 유전자좌 1). 간략하면, 블루 헤론사(Blue Heron)로부터의 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3 합성 유전자를 포함하고, 마우스 IgG2a 불변 영역 유전자와의 중첩 영역이 측접된 DNA 단편을 사용하여 플라스미드를 작제하였다. 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3 서열이 마우스 IgG2a 불변 영역 유전자의 막관통 및 세포질-암호화 서열(즉, M1 및 M2 엑손)에 작동 가능하게 연결되도록 생성된 플라스미드를 소화/결찰/CRIPSR-Cas9 등온 조립의 수 단계를 통해서 클로닝시켜 BAC 클론을 생성시켰다. BAC 클론은 또한 마우스 IgG2a 스위치 영역(Sγ2a) 및 마우스 IgE 스위치 영역(Sε), 뿐만 아니라 마우스 IgE 불변 영역 유전자 분절 둘 다를 함유하였다. 클론을 전기천공을 통해서 마우스 ES 세포에 도입하여 도 1a, 유전자좌 1에 도시된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 마우스를 생성시키는 데 사용될 수 있는 변형된 ES 세포를 생성시켰는데, 여기서 불변 도메인의 인간 IgG1 세포외 부분을 암호화하는 핵산 서열은 내인성 마우스 IgG2a 유전자좌에서 불변 도메인의 마우스 IgG2a 연결, 막관통 및 세포질 부분을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 나머지 중쇄 불변 영역 아이소타입 서열은 완전히 마우스였다. 전기천공을 위해서 사용된 마우스 ES 세포는 삽입된 뮤린 Adam6-암호화 서열을 포함하는 마우스 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 인간 중쇄 가변 유전자 분절(인간 VH, D 및 JH 가변 유전자 분절)을 포함하였다; (예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호 참조).
또 다른 실시예에서, 내인성 마우스 IgG2a 유전자좌(도 1a, 마우스 유전자좌 2)에 인간 중쇄 가변 영역 서열 및 완전 인간 IgG1 불변 영역 서열(인간 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2)을 포함하는 마우스를 작제하였다. 간략하면, 인간 M1-M2 서열을 주형으로서 BAC 클론 RP11-448n5(써모 피셔 사이언티픽사(Thermo Fisher Scientific))를 사용하여 증폭시키고, 몇몇 유전자 조작 단계 동안 내인성 마우스 IgG2a M1-M2 서열 대신에 상기에 기재된 마우스 유전자좌 1을 생성시키는 데 사용되는 BAC 클론에 도입하였다. ES 세포 내로의 도입에 사용하기 위한 생성된 BAC 클론은 인간 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 암호 서열, 마우스 IgG2a(Sγ2a) 및 IGE(Sε) 스위치 영역 및 마우스 IgE 불변 영역 유전자 분절을 함유하는 DNA 단편을 함유하였다. 유전자 변형된 ES 세포로부터 생성된 마우스는 도 1a, 유전자좌 2에 도시된 면역글로불린 유전자좌를 포함하였는데, 여기서 인간 IgG1 불변 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 내인성 마우스 IgG2a 유전자 분절 유전자좌에서 내인성 마우스 IgG2a 불변 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 대체하였다. 나머지 중쇄 불변 영역 아이소타입 서열은 완전히 마우스였다. 본 명세서에서 사용된 마우스 ES 세포는 삽입된 뮤린 Adam6-암호화 서열을 포함하는 마우스 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 인간 중쇄 가변 유전자 분절(인간 VH, D 및 JH 가변 유전자 분절)을 포함하였다; (예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호 참조).
추가의 또 다른 예에서, 인간 중쇄 가변 영역 서열 및 키메라 인간(인간 CH1-H-CH2-CH3) - 마우스(마우스 M1-M2) 불변 영역 서열을 포함하는 마우스를 작제하였는데, 여기서 인간 IgG4의 CH1-H-CH2-CH3 암호 서열을 내인성 IgG1 유전자좌에서 마우스 IgG1의 M1-M2 암호 서열과 작동 가능하게 연결시켰다(도 1a, 마우스 유전자좌 3). 간략하면, 주형으로서 BAC CTD-3034B12(써모 피셔 사이언티픽사)를 사용하여, 마우스 IgG1 불변 영역 유전자와의 중첩 영역이 측접된, 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3을 암호화하는 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 작제하였다. 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3 서열이 마우스 IgG1 불변 영역 유전자의 막관통 및 세포질-암호화 서열(즉, M1 및 M2 엑손)에 작동 가능하게 연결되도록 생성된 플라스미드를 소화/결찰/CRIPSR-Cas9 등온 조립의 수 단계를 통해서 BMQ-263J18(더 생어 센터(The Sanger Centre)) 내에 클로닝시켜 BAC 클론을 생성시켰다. 이러한 BAC 클론은 또한 마우스 IgG1 스위치 영역(Sγ1), 및 마우스 IgG2b 불변 영역 유전자 분절을 함유하였다. 클론을 전기천공을 통해서 마우스 ES 세포에 도입하여 도 1a, 유전자좌 3에 도시된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 마우스를 생성시키기 위한 변형된 ES 세포를 생성시켰는데, 여기서 불변 도메인의 인간 IgG4 세포외 부분을 암호화하는 핵산 서열은 내인성 마우스 IgG1 유전자 분절 유전자좌에서 불변 도메인의 마우스 IgG1 막관통 부분을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 나머지 중쇄 불변 영역 아이소타입 서열은 완전히 마우스였다. 전기천공을 위해서 사용된 마우스 ES 세포는 삽입된 뮤린 Adam6-암호화 서열을 포함하는 마우스 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 인간 중쇄 가변 유전자 분절(인간 VH, D 및 JH 가변 유전자 분절)을 포함하였다(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호 참조).
추가의 또 다른 실시예에서, 내인성 마우스 IgG1 유전자좌(도 1a, 마우스 유전자좌 4)에 인간 중쇄 가변 영역 서열 및 완전 인간 IgG4 불변 영역 서열(인간 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2)을 포함하는 마우스를 작제하였다. 간략하면, 인간 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 서열을 주형으로서 BAC 클론 CTD-3034B12(써모 피셔 사이언티픽사)를 사용하여 증폭시키고, 몇몇 유전자 조작 단계 동안 내인성 마우스 IgG1 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 서열 대신에 BAC 클론 BMQ-263J18(더 생어 센터)에 도입하였다. ES 세포 내로의 도입에 사용하기 위한 생성된 BAC 클론은 인간 IgG4 CH1-H-CH2-CH3-M1-M2 암호 서열, 마우스 IgG1(Sγ1) 스위치 영역 및 마우스 IgG2b 불변 영역 유전자 분절을 함유하는 DNA 단편을 함유하였다. 유전자 변형된 ES 세포로부터 생성된 마우스는 도 1a, 유전자좌 4에 도시된 면역글로불린 유전자좌를 포함하였는데, 여기서 인간 IgG4 불변 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 내인성 마우스 IgG1 유전자 분절 유전자좌에서 내인성 마우스 IgG1 불변 도메인을 암호화하는 핵산을 대체하였다. 나머지 중쇄 불변 영역 아이소타입 서열은 완전히 마우스였다. 전기천공을 위해서 사용된 마우스 ES 세포는 삽입된 뮤린 Adam6-암호화 서열을 포함하는 마우스 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 인간 중쇄 가변 유전자 분절(인간 VH, D 및 JH 가변 유전자 분절)을 포함하였다; (예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호 참조).
내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 완전 인간 IgM, IgD, IgG3, 및 IgG1 유전자 분절을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 마우스를 또한 작제하였다(도 1a, 마우스 5).
인간 중쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 마우스 ES 세포를 표적으로 하기 위한 작제물을 생성시키기 위해서, 인트론성 인핸서(Eμ)와 3' 조절 영역(3'RR) 사이에 전체 마우스 IgH 불변 영역(IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgE, 및 IGA)의 결실을 포함하는 제1 작제물을 생성시켰고, 그 다음 VELOCIMMUNE® ES 세포에 표적화시켰다.
간략하면, 박테리아 상동성 재조합(bacterial homologous recombination: BHR) 및 선택 카세트 스왑(selection cassette swap)에 의한 3hVH의 3' 마우스 IgM 유전자의 제거 및 5' 마우스 상동성 아암의 제거에 의해서 문헌[Macdonald et al. PNAS (2014) vol. 111 (14):5147-5152](본 명세서에 참조에 의해 포함됨)에 이미 기재된 3hVh BACvec라고 지정된 BAC를 변형시켰다. BAC RP23-351j19(써모 피셔 사이언티픽사)의 2개의 BHR 변형에 의해서 3' 마우스 상동성 아암을 제조하였는데, 이것은 RP23-351j19의 5' 단부로부터 마우스 IgG2b, IgG2a, IgE, 및 IgA 유전자의 결실 및 고유한 제한 부위의 혼입을 포함하였다. 이러한 제2 작제물의 제한 단편을 제1 작제물에 결찰시켜 최종 LTVEC(MAID6022)를 제조하였다. MAID6022는 5'에서부터 3'로 하기를 함유하였다: EM7 hyg 카세트, 인간 IGHD/IGHJ, BAC CT7-302a07로부터의 마우스 IgM 인핸서, 합성 링커, 고유한 I-CeuI 부위, 3' lox2372 부위의 고유한 AscI 부위 5'를 갖는 lox2372-ub-neo-lox2372 카세트, IgA 유전자의 3' UTR에서 시작하여 3' RR의 하류에서 끝나는 마우스 IgH 유전자좌의 40.5kb 영역 및 고유한 PI-SceI 부위.
이러한 벡터를 MAID6022(도 1b)라고 지정하였고, 다음 조작 단계에서 인간 중쇄 가변 영역 서열을 도입하기 위해서 사용하였다.
다음으로, BAC RP11-448n5(써모 피셔 사이언티픽사)로부터의 인간 DNA를 BHR에 의해서 변형시켜 BAC의 3' 단부를 잘라내고, lox2372-ub-hyg-lox2372 카세트를 삽입하였다. 카세트는 3' lox2372 부위의 고유한 AscI 부위 5'를 함유하였다. 인간-lox2372 접합부는 IgG1 폴리A 신호의 하류 3.7kb였다. 이 작제물을 VI694로 지정하였다. 수 단계의 BHR을 통해서 마우스 BAC RP23-351j19 써모 피셔 사이언티픽사로부터 3' 마우스 상동성 아암을 획득하고, 인간 BAC 상에 결찰시켰다. 생성된 BAC 클론은 표 1에 열거된 하기 서열을 포함하였다.
생성된 큰 표적화 벡터를 인간 중쇄 가변 유전자 분절을 포함하는 ES 세포 내에 전기천공하고, 뮤린 Adam6-암호화 서열을 삽입하고, 마우스 중쇄 불변 영역 서열을 170Kb 결실시켰다(도 1b 참조). 인간 불변 영역 서열을 도입한 후, 선택 카세트를 Cre 재조합효소를 사용하여 제거하였다. 선택 카세트 결실 전에, 도 1a로부터의 마우스 유전자좌 5의 변형된 대립유전자의 다양한 서열의 접합부를 하기 표 2에 열거한다.
유전자 변형된 ES 세포로부터 생성된 마우스는 도 1a, 유전자좌 5에 도시된 면역글로불린 유전자좌를 포함하였는데, 여기서 인간 IgM, IgD, IgG3, IgG1 불변 영역 유전자 분절을 암호화하는 핵산 서열은 내인성 마우스 중쇄 불변 영역 유전자좌에서 내인성 마우스 중쇄 불변 영역 유전자 분절을 암호화하는 핵산을 대체하였다.
내인성 중쇄 유전자좌에 추가의 인간 중쇄 불변 영역 서열, 예컨대, 인간 IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2, 및 IgG4 서열을 포함하는 마우스를 또한 작제하였다. 도 1a에 도시된 이들 마우스, 마우스 6은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 인간 중쇄 가변 영역 및 완전 인간 IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2, 및 IgG4 서열을 포함하였다.
간략하면, IgG2 및 IgG4 서열을 포함하는 42.9Kb의 인간 DNA 서열을 인간 BAC CTD-3034B12(써모 피셔 사이언티픽사)로부터 입수하였고, 박테리아 상동성 재조합, 소화 및 결찰의 수 단계를 통해서 변형시키고, 5' 및 3' 인간 상동성 아암을 추가하였다. 생성된 BAC 클론에 대한 게놈 좌표를 하기 표 3에 열거한다.
생성된 큰 표적화 벡터를 상기에 기재된 마우스 유전자좌 5의 인간 중쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 IgM, IgD, IgG3, 및 IgG1 불변 영역 유전자 분절을 포함하는 ES 세포에 전기천공하였다(도 1c 참조). 생성된 대립유전자의 다양한 접합부를 하기 표 4에 기재한다. 선택 카세트를 Cre 재조합효소에 의해서 제거하였다.
유전자 변형된 ES 세포로부터 생성된 마우스는 도 1a, 유전자좌 6에 도시된 면역글로불린 유전자좌를 포함하였는데, 여기서 인간 IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2, 및 IgG4 불변 영역 유전자 분절을 암호화하는 핵산 서열은 내인성 마우스 중쇄 불변 영역 유전자좌에서 내인성 마우스 중쇄 불변 영역 유전자 분절을 암호화하는 핵산을 대체하였다.
본 실시예에서 생성된 인간 중쇄 가변 영역 및 키메라 또는 완전 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 모든 유전자 변형된 ES 세포를 사용하여 상기에 기재된 VELOCIMOUSE® 방법을 사용하여 유전자 변형된 마우스를 제조하였다.
실시예 1.2: 마우스 중쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 마우스의 유전자 조작
마우스 중쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 마우스 ES 세포를 표적으로 하기 위한 작제물를 생성시키기 위해서, 인트론성 인핸서(Eμ)와 3' 조절 영역(3'RR) 사이에 전체 마우스 IgH 불변 영역(IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgE, 및 IGA)의 결실을 포함하는 제1 작제물을 생성시켰다.
간략하면, 5.2kb 5' 마우스 상동성 아암을 PCR에 의해서 BAC 클론 BMQ-451A16(더 생어 센터)으로부터 증폭시키고, 등온 조립을 사용하여 R6K 복제 기점 및 lox2372-ub-neo 카세트를 갖는 플라스미드 내에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 5'에서부터 3'로 392bp R6K ori, 고유한 I-CeuI 부위, DQ52, JH1-4 및 Eμ를 포함하는 5.2kb 영역의 마우스 IgH 유전자좌, 고유한 NotI 부위, lox2372-ub-neo 카세트 및 고유한 AscI 부위를 함유한다. 이 플라스미드를 소화시키고, 플라스미드의 I-CeuI-AscI 단편을 5'에서부터 3'로 고유한 I-CeuI 부위, 3' lox2372 부위의 고유한 AscI 부위 5'를 갖는 lox2372-ub-hyg-lox2372 카세트, IgA 유전자의 3' UTR에서 시작하여 3' RR의 하류에서 끝나는 마우스 IgH 유전자좌의 40.5kb 영역, 고유한 PI-SceI 부위 및 스펙티노마이신-내성(Spec) 카세트를 함유하는 마우스 BAC 클론 RP23-351j19(써모 피셔 사이언티픽사)로부터 유래된 벡터에 결찰시켰다. 생성된 벡터는 5'에서부터 3'로 고유한 I-CeuI 부위, 5.2kb 5' 마우스 상동성 아암(DQ52, JH1-4 및 Eμ를 포함함), 고유한 NotI 부위, lox2372-ub-neo-lox2372 카세트, 40.5kb 3' 마우스 상동성 아암(IgH 3'RR을 포함함), 고유한 PI-SceI 부위 및 Spec 카세트를 함유하였다. 이 벡터(도 1d에서 MAID6577로 도시됨)를 다음 조작 단계에서 인간 중쇄 가변 영역 서열을 도입하기 위해서 그리고 또한 마우스 ES 세포로의 전기천공을 위해서 사용하여 전체 마우스 전체 마우스 IgH 불변 영역의 결실을 갖는 ES 세포를 생성시켰다.
다음 조작 단계에서, 인간 BAC 클론 RP11-448n5을 BHR에 의해서 변형시켜 인간 삽입부와 CM 카세트의 5.3kb를 lox2372-ub-hyg-lox2372 카세트로 대체하였다. 카세트는 3' lox2372 부위의 고유한 AscI 부위 5'를 함유하였다. 인간-lox2372 접합부는 IgG1 폴리A 신호의 하류 3.7kb였다. 이 작제물을 VI694로 지정하였다. 그 다음, VI694를 BHR에 의해서 변형시켜 인간 삽입부의 34.3kb를 CM 카세트 및 고유한 NotI 부위로 대체하였다. NotI-인간 접합부는 Eμ의 3' 및 IgM 스위치 영역(Sμ)의 5'였다. 이 작제물을 VI695로 지정하였다. VI695의 131.7kb NotI-AscI 단편(인간 삽입부 및 lox2372-ub-hyg 카세트)를 MAID6577에 결찰시켜 최종 표적화 벡터 MAID6739(도 1a의 마우스 유전자좌 7)를 제조하였다. MAID6739는 5'에서부터 3'로 고유한 I-CeuI 부위, 5.2 kb 5' 마우스 상동성 아암(DQ52, JH1-4, 및 Eμ 포함), 고유한 NotI 부위, 인간 IgH 불변 유전자 유전자좌의 130kb 영역(IgM, IgD, IgG3, 및 IgG1 유전자 포함), lox2372-ub-hyg-lox2372 카세트, 40.5kb 3' 마우스 상동성 아암(IgA의 3' UTR에서 시작하여 3' RR의 3'에서 끝남), 고유한 PI-SceI 부위 및 Spec 카세트를 함유한다. 표적화 벡터에 대한 게놈 좌표를 표 5에 제시하며, 변형된 대립유전자의 접합부 서열을 표 6에 열거한다.
인간 IgM, IgD, IgG3, 및 IgG1 유전자 분절을 삽입하기 위해서 생성된 큰 표적화 벡터를 전체 마우스 IgH 불변 영역(MAID 6577)의 결실을 포함하는 마우스 ES 세포에 전기천공하였다. 선택 카세트를 Cre 재조합효소에 의해서 제거하였다.
유전자 변형된 ES 세포로부터 생성된 마우스는 도 1a, 유전자좌 7에 도시된 면역글로불린 유전자좌를 포함하였는데, 여기서 인간 IgM, IgD, IgG3, IgG1 불변 영역 유전자 분절을 암호화하는 핵산 서열은 내인성 마우스 중쇄 불변 영역 유전자좌에서 내인성 마우스 중쇄 불변 영역 유전자 분절을 암호화하는 핵산을 대체하였다.
도 1a, 유전자좌 7에 도시된 마우스 유전자좌를 포함하는 ES 세포 및 마우스를 생성시킨 후에, 내인성 중쇄 유전자좌에 추가의 인간 중쇄 불변 영역 서열, 예컨대, 인간 IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2, 및 IgG4 서열을 포함하는 마우스를 생성시켰다. 도 1a, 유전자좌 8에 도시된 이들 마우스는 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 인간 중쇄 가변 영역 및 완전 인간 IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2, 및 IgG4 영역 유전자 서열을 포함하였다. 이들 마우스를 생성시키기 위해서, 동일한 표적화 벡터 및 프로토콜을 도 1e에 도시된 바와 같이 마우스 유전자좌 6을 작제하기 위해서 상기에 기재된 바와 같은 사용하였다.
본 실시예에서 생성된 마우스 중쇄 가변 영역 및 키메라 또는 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 모든 유전자 변형된 ES 세포를 사용하여 상기에 기재된 VELOCIMOUSE® 방법을 사용하여 유전자 변형된 마우스를 제조하였다.
실시예 1.3: 인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 마우스의 유전자 조작
인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 유전자 조작된 마우스를 하기와 같이 생성시켰다.
먼저, 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 마우스를 생성시키기 위해서, 0.5Kb의 인간 IGKC 유전자를 BlueHeron에 의해서 합성하였고, 이것은 IGKC 유전자의 원위 단부에서 5'UTR에서부터 폴리A 테일의 하류의 3' 단부로 게놈 핵산 서열을 함유하였다. loxP-Ub-Neo-loxP 선택 카세트를 이 서열의 3' 단부에 추가하였다. CRISPR/Cas9 및 등온 조립 기술을 사용하여 인간 IGKC 서열을 마우스 BAC BMQ-126m16(더 생어 센터)에 도입하였다. 이어서, 5' CM 카세트 및 마우스 IgKJ를 BHR에 의해서 spec 선택 카세트를 사용하여 제거하였다. 생성된 BAC 클론의 게놈 좌표를 표 7에 기재하며, 변형된 대립유전자의 접합부 서열을 표 8에 열거한다.
도 2b에 도시된 바와 같이, 인간 IgKC 영역 서열을 포함하는 생성된 큰 표적화 벡터를 마우스 불변 카파 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 인간 카파 경쇄 가변 유전자 분절을 갖는 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 ES 세포에 전기천공하였다(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Macdonald et al. PNAS (2014) vol. 111 (14):5147-5152] 참조). 선택 카세트를 Cre 재조합효소에 의해서 제거하였다. 유전자 변형된 ES 세포를 사용하여 상기에 기재된 VELOCIMOUSE®를 사용하여 유전자 변형된 마우스를 제조하였다.
마지막으로, 또 다른 실시예에서, 인간 람다 불변 영역 서열을 포함하는 마우스가 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 US 15/803,513(출원일: 2017년 11월 3일(미국 특허 제2008/0125043호로 공개됨)에 기재되어 있다.
실시예 1.4: 인간 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 마우스의 생성
조작된 중쇄 불변 영역을 보유하는, 예를 들어, 예를 들어, 실시예 1.1 내지 1.2에 기재된 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 완전 인간 또는 키메라 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 마우스를, 실시예 1.3에 기재된 인간 IgK 불변 영역 서열 및/또는 인간 IgL 불변 영역 서열을 포함하는 마우스와 번식시켰다. 번식은 당업계에 인지된 표준 기술에 의해서 수행된다. 목적하는 조작된 유전자좌를 보유하는 마우스 균주를 인간 중쇄 불변 영역 서열(들) 및 인간 경쇄 불변 영역 서열(들)의 존재에 대해서 스크리닝한다. 따라서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 인간 중쇄 가변 유전자 분절 서열 및 인간 또는 키메라 인간/마우스 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 마우스를 실시예에 기재된 인간 카파 경쇄 가변 유전자 분절 서열 및 인간 카파 경쇄 불변 영역 서열 및/또는 인간 람다 경쇄 가변 유전자 분절 서열 및 인간 람다 경쇄 불변 영역 서열을 포함하는 마우스와 번식시켰다.
실시예 2: 인간 치료제의 약동학적 연구 및 투여 연구를 위한 마우스 모델
인간 항체에 대해서 마우스에 의해 생성된 면역 반응인 마우스 항-인간 항체(Mouse Anti-Human Antibody: MAHA)는 약동학 및/또는 효능 실험을 위해 투여되는 순환 인간 단일클론성 항체의 신속한 청소를 초래할 수 있다. 마우스 모델에서 완전 인간 항체의 더 관련된 PK 및 투여 연구를 얻기 위해, 상기 실시예 1에 기재된 인간 IgH 불변 영역을 포함하는 마우스를 MAHA 반응을 회피하는 능력에 대해 시험하였다. 인간 IgH 불변 영역에 대해서 이형접합성 마우스는 정상 B 세포 발달을 나타내었고, 인간 및 마우스 IgM/IgD를 둘 다를 발현하고, 무손상 대립유전자 배제를 입증하였다.
일례에서, 도 1a, 유전자좌 5에 도시된 바와 같이 인간 중쇄 가변 영역에 대해서 동형접합성이고 인간 IgM, IgD, IgG3 및 IgG1 불변 영역 유전자 분절에 대해서 이형접합성인 마우스를 MAHA 반응의 감소에 대해 시험하였다. 이 실험을 위해, 모든 마우스를 레저네런 파마슈티컬즈사(Regeneron Pharmaceuticals)의 무-병원균 시설에서 가두고, 번식시켰다. 미경험 VELOCIMMUNE® 대조군 마우스(16주령, 수컷, n=2) 및 미경험 hVs, hIgM, hIgD, hIgG3 및 hIgG1(도 1a의 유전자좌 5, 20주령, 수컷, n=4) 마우스를 희생시켰고, 혈액 및 비장을 수거하였다. 비장을 ACK 용해 완충액으로 용해시킨 후, 5% FBS를 함유한 RPMI 배지로 세척하였다. 혈액을 혈청 분리기 튜브(BD, 카탈로그 번호 365956)에 수집하고, 제조사의 지침에 따라 혈청을 수집하였다. ELISA에 대한 양성 대조군으로 정상 인간 혈청(퀴델사(Quidel), 카탈로그 번호 A113)을 사용하였다.
총 인간 IgM 항체를 하기와 같이 ELISA를 사용하여 검정하였다. 플레이트를 2ug/㎖ 토끼 항-인간 IgM 항체(잭슨 이뮤노리서치사(Jackson ImmunoResearch) 카탈로그 번호 309-005-095)로 4℃에서 밤새 코팅하고, 세척하고 PBS-T 중의 1% BSA로 차단하였다. ChromPure Human IgM 표준(잭슨 이뮤노리서치사 카탈로그 번호 009-000-012)을 PBS-T에서 600ng/㎖에서 0.823ng/㎖로 연속 희석하고, 웰에 첨가하였다. 웰을 희석된 혈청 샘플과 함께 배양하고, 세척하고, HRP 접합 항-인간 IgM 항체(잭슨 이뮤노리서치사#309-035-095)와 함께 배양하였다. 플레이트를 세척하고, Opt EIA TMB 기질 시약 세트(BD 카탈로그 번호 555214)로 현상하였다. 1N 황산으로 반응을 중지하고, 블랭크-보정된 OD를 Molecular Devices Spectramax M5 마이크로 플레이트 리더 및 SoftMax Pro 소프트웨어로 450nm에서 측정하였다. 데이터는 Prism 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 표시된 데이터는 반복 지점이다. 또한 제조사의 지침에 따라 인간 IgG1 및 인간 IgG3 ELISA를 수행하였다(각각 인비트로젠사 카탈로그 번호 BMS2092 및 BMS2094). 도 3a에 도시된 Ig 아이소타입 수준에 대한 결과는 도입된 인간 중쇄 불변 아이소타입이 마우스 유전자좌 5의 유전자 변형된 마우스의 혈청에서 발현되었음을 입증한다.
유세포 분석 실험을 위해, 1×106개의 세포를 10분동안 얼음에서 항-마우스 CD16/CD32(2.4G2, BD)와 함께 인큐베이션시켰다. 그 다음 세포를 얼음에서 30분 동안 하기 항체 패널로 표지하였다: 항-마우스 FITC-CD3(17A2, BD), A700-CD19(1D3, BD), Pe-Cy7-IgM(11/41, 이바이오사이언스사(eBioscience)), PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a, 바이오레전드사(BioLegend)), 항-인간 PE-IgD(IA6-2, 바이오레전드사) 및 BV421-IgM(G20-127, BD). 염색 후, 세포를 세척하고 2% 폼알데하이드에서 고정시켰다. 데이터 수집을 BD LSRFortessa 유세포 분석기에서 수행하였고, FlowJo로 분석하였다. B 세포(CD19+)를 hIgM 대 mIgM 및 hIgD 대 mIgD에 대해서 플로팅하여 대립유전자 활용 및 대립유전자 제외를 나타낸다(도 3b).
면역글로불린 인간 불변 영역에 대해서 이형접합성 몇몇 마우스 버전(예를 들어, 도 1a에 도시된 유전자좌 1, 4, 6 및 8 마우스)으로부터 얻은 혈청에서 항체의 분자량을 웨스톤 블로팅으로 검정하였다. 혈청을 4 내지 12% Tris-Glycine 겔(인비트로젠사)에서 전개시키고, 막으로 옮기고, 밤새 4℃에서 차단시키고, 이어서 항체를 HRP 접합된 항-인간 IgG(써모사 #31412) 및 HRP 접합된 항-마우스 IgG(써모사 31439)를 사용하여 검출하고, ELC 웨스턴 블로팅 검출 시약(ELC Western Blotting Detection Reagents)(지이 헬쓰 케어사(GE Health Care) #RPN2106)으로 현상하였다. 웨스턴 블롯은, 이형접합성 인간 Ig 불변 영역 마우스의 혈청에서 항-인간 IgG 항체에 의해서 검출되는 바와 같이 인간 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 항체의 분자량은 정상 인간 혈청에서의 항체의 분자량과 유사함을 나타내었다(데이터 도시하지 않음). 이형접합성 인간 Ig 불변 영역 마우스의 혈청에서 항-마우스 IgG에서 검출되는 바와 같은 마우스 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 항체의 분자량은 또한 야생형 및 역 키메라 VELOCIMMUNE® 마우스의 마우스 혈청에서 항체의 분자량과 비교할 때 유사하였다(데이터 도시하지 않음).
관련 아이소타입 항체에 대한 MAHA 반응에 대해서 시험하는 경우, hIgM, hIgD, hIgG3 및 hIgG1(유전자좌 5)에 대해서 이형접합성인 마우스는 대조군 마우스에 비해서 감소된 MAHA 반응을 나타내었다(데이터 도시하지 않음).
또 다른 예에서, 도 1a, 유전자좌 6에 도시된 바와 같은 인간 중쇄 가변 영역에 대해서 동형접합성인 마우스 및 인간 IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2, 및 IgG4 불변 영역에 대해서 이형접합성인 마우스, 또는 도 1a, 유전자좌 8에 도시된 바와 같은 마우스 중쇄 가변 영역에 대해서 동형접합성인 마우스 및 인간 IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2, 및 IgG4 불변 영역에 대해서 이형접합성인 마우스를 MAHA 반응의 감소에 대해서 시험하였다. 이 실험을 위해, 모든 마우스를 레저네런 파마슈티컬즈사의 특정 무-병원균 시설에서 가두고, 번식시켰다. (1) 마우스 중쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 불변 영역(mVs-hFC; 도 1a의 마우스 유전자좌 8) 및 (2) 인간 중쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 불변 영역(hVs-hFC; 도 1a의 마우스 유전자좌 6)을 포함하는 두 마우스는 각각 마우스 또는 인간 가변 영역에 대해서 동형접합성이고, 인간 중쇄 불변 영역에 대해서 이형접합성이었다. VELOCIMMUNE® 마우스(hVs-mFc; 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호 참조)는 인간 중쇄 가변 영역에 대해서 동형접합성이고, 마우스 중쇄 불변 영역에 대해서 동형접합성이었다. 미경험 WT 대조군 마우스(15주령, 암컷, n=6); hVs-mFc 마우스(14주령, 수컷, n=5); hVs-hFc 마우스: 인간 가변부, hIgM, hIgD, hIgG3, hIgG1, hIgG2 및 hIgG4 마우스(11주령, 수컷, n=6); 및 mVs-hFc: 마우스 가변부, hIgM, hIgD, hIgG3, hIgG1, hIgG2 및 hIgG4 마우스(11주령, 암컷, n=6)를 번식시킨 후, 혈청 항체 아이소타입 농도(도 3c) 및 인간 항체 역가에 대한 초기 마우스(도 3d, 0일)를 결정하기 위해서 항체를 주사하였다. 혈액을 혈청 분리기 튜브(BD, 카탈로그 번호 365956)에 수집하고, 제조사의 지침에 따라 혈청을 수집하였다. 완전 인간 IgG4 항체를 피하 둘베코 PBS(Dulbecco's PBS)에 희석된 1㎎/㎏의 농도로 피하 주사하였다. 마우스를 MAHA에 대해서 시험하기 위해서 주사 후 7일, 15일, 22일 및 34일 번식시켰다(도 3d; 단지 제34일의 데이터를 나타냄).
총 항체 아이소타입(마우스 IgM, 총 마우스 IgG, 인간 IgM 및 인간 IgG1, 및 인간 IgG4) ELISA의 측정을 제조사의 지침(인비트로젠사, mIgM: 88-50470-88, total mIgG: 88-50400-88, hIgM: 8850620-88, hIgG1: 88-50560-22, hIgG4: 88-50590-22)에 따라서 수행하였다. 대부분의 마우스 특징규명을 도 3c에 요약한다(일부 데이터 나타내지 않음). 요약하면, 인간화된 Fc 마우스와 야생형 마우스 간에는 마우스 IgM 및 IgG에 대해서 유사한 혈청 수준인 것으로 보였고, hIgM, hIgG1 및 hIgG4의 수준은 인간화된 중쇄 불변 영역 마우스의 두 버전(mVs-hFc: 유전자좌 8 및 hVs-hFc: 유전자좌 6) 간에 유사하였다.
MAHA 연구를 위해서, 이형접합성 마우스에게 hIgG4 항체의 단일 피하 주사를 제공하였고, 이어서 MAHA ELISA를 하기와 같이 수행하였다. Maxisorb 플레이트(뉴크사(Nunc) 카탈로그 번호430341)를 밤새 4℃에서 1ug/㎖ 용량의 인간 IgG4 항체로 코팅하고, 차단하고, 밤새 희석된 혈청 샘플로 인큐베이션시키고, 그 다음 HRP 접합된-항-마우스 IgG 항체(잭슨 이뮤노리서치사, 코드 번호 115-035-164)로 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 Opt EIA TMB 기질 시약 세트(BD 카탈로그 번호 555214)로 현상하였다. 1N 황산으로 반응을 중지하고, OD를 Molecular Devices Spectramax M5 마이크로 플레이트 리더 및 SoftMax Pro 소프트웨어로 450nm에서 측정하였다. 데이터는 Prism 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 3d에 나타낸 바와 같이, 인간화된 IgH 가변부 및 IGH 불변부(hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1-hIgG2-hIgG4; 유전자좌 6)를 갖는 마우스는 주사 후 제34일에 시험한 다른 3마리의 마우스 중 임의의 것과 비교할 때 완전 인간 IgG4 항체에 대해서 상당히 더 낮은 MAHA 역가를 갖는다. 감소된 MAHA 반응이 또한 인간 중쇄 가변 영역 및 키메라 마우스-인간(주입된 인간 항체는 인간화된 불변 유전자와 동일하였음) 또는 완전 인간 중쇄 불변 영역(데이터 도시하지 않음)을 포함하는 다른 마우스(예를 들어, 도 1a에 도시된 다른 마우스)에서 관찰되었다.
혈청에 잔류하는 투여된 항체의 농도를 상기 도 3d에 기재된 바와 같은 동일한 마우스에 대해서 0일, 2일, 7일, 15일, 22일 및 34일에 혈청에서 ELISA로 결정하였다. Maxisorb 플레이트(뉴크사 카탈로그 번호430341)를 밤새 4℃에서 1ug/㎖의 항체로 코팅하고, PBS 중의 BSA로 차단하고, 희석된 혈청 샘플로 인큐베이션시키고, 그 다음 HRP 접합된-항-인간 IgG 항체(잭슨 이뮤노리서치사, 코드 번호 109-035-098)로 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 Opt EIA TMB 기질 시약 세트(BD 카탈로그 번호 555214)로 현상하였다. 1N 황산으로 반응을 중지하고, OD를 Molecular Devices Spectramax M5 마이크로 플레이트 리더 및 SoftMax Pro 소프트웨어로 450nm에서 측정하였다. 데이터는 Prism 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 표준으로서 투여된 항체를 사용하여 농도를 결정하였다.
강한 MAHA 반응을 갖는 마우스는 MAHA 반응이 없는 마우스에 비해서 투여된 항체의 더 신속한 청소율을 가졌다(도 3e). 각각의 유전자형으로부터의 MAHA 반응을 갖는 마우스의 수는 다음과 같다; mVs-hFc를 갖는 6마리의 마우스 중 5마리, hVs-hFC를 갖는 6마리의 마우스 중 0마리, hVs-mFc를 갖는 5마리의 마우스 중 4, 및 mVs-mFc를 갖는 6마리의 마우스 중 4마리. MAHA 반응이 없는 마우스는 제34일에 혈청에서 투여된 항체의 검출 가능한 수준을 여전히 가졌다.
실시예 3: 인간 항체 재순환을 연구하기 위한 생체내 모델로서 인간화된 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 포함하는 마우스
마우스 염색체 7에 위치된 마우스 FcRn 유전자좌를 VELOCIGENE® 기술(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659], 둘 다 본 명세서에 참조에 의해 포함됨)을 사용하여 인간 및 마우스 박테리아 인공 염색체(BAC) DNA로부터의 고유한 표적화 벡터의 작제에 의해서 인간화하였다. 마우스 BAC RP23-19D22로부터의 DNA(인비트로젠사-써모 피셔사)를 상동성 재조합에 의해서 변형시켜 마우스 FcRn의 세포외 부분을 암호화하는 마우스 게놈 DNA 8.3Kb를 결실시키고, 그 다음 상응하는 인간 FcRn 서열의 11.5Kb를 삽입하였다. 따라서, 마우스 FcRn 유전자의 알파 1, 알파 2 및 알파 3 도메인(엑손 3, 4 및 5)을 암호화하는 마우스 엑손은 인간 FcRn 유전자의 알파 1, 알파 2 및 알파 3 도메인(엑손 3, 4 및 5)을 암호화하는 인간 엑손으로 대체하였다(도 4 참조). 생성된 키메라 FcRn 유전자는 마우스 엑손 1(비-암호 엑손), 마우스 엑손 2(신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 포함) 및 인간 엑손 3-6, 마우스 엑손 6 및 7(막관통 도메인 및 세포질 도메인을 암호화함)을 포함하였다.
구체적으로, 인간화된 FcRn 마우스를 생성시키기 위해서, 키메라 유전자의 작제에 사용된 큰 표적화 벡터는 하기 표 9에 열거된 핵산 서열을 포함하였다. LoxP-Ub-Neo-LoxP 카세트를 벡터의 인트론 5에 삽입하였다.
표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 FcRn 엑손에서 결실을 포함하는 마우스 ES 세포를 전기천공하여 인간화된 FcRn을 발현하는 마우스를 생성시키기 위한 변형된 ES 세포를 생성하였다(도 4). 정량 TAQMANTM 검정(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48] 참조)에 의해서 인간 FcRn 엑손 서열의 삽입부를 함유하는 ES 세포를 식별하였다. 인간 서열의 삽입(대립유전자의 획득, GOA) 및 마우스 서열의 결실(대립유전자의 결실, LOA)을 검출하도록 특정 프라이머 세트 및 프로브를 설계하였다(도시하지 않음).
당업자에게 공지된 방법에 의해서 선택 카세트를 제거할 수 있다. 예를 들어, 인간화된 FcRn 유전자좌를 보유하는 ES 세포에 플록스드(floxed) 카세트를 제거하기 위해서 Cre를 발현하는 작제물을 형질주입하였다. Cre 재조합효소를 발현하는 마우스를 번식시킴으로써 선택 카세트를 선택적으로 제거할 수 있다. 선택적으로, 선택 카세트가 마우스에 보유된다. 선택 카세트 결실 이전에 인간화된 FcRn 대립유전자의 접합부를 하기 표 10에 제시한다.
상기에 기재된 표적화된 ES 세포를 공여자 ES 세포로 사용하였고, VELOCIMOUSE® 방법(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 문헌[Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99] 참조)에 의해서 8-세포기 마우스 배아에 도입하였다. 고유한 인간 FcRn 유전자 서열의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형(상기 참조)을 사용한 유전자형분석에 의해서 인간화된 FcRn을 독립적으로 보유하는 VELOCIMICE®(공여자 ES 세포로부터 전체적으로 유래된 F0 마우스)를 식별하였다. 키메라 FcRn 유전자를 보유하는 이형접합성 마우스를 동형접합으로 번식시켰다.
유전자 변형된 마우스에 의해서 발현되는 생성된 키메라 FcRn 단백질의 서열을 하기에 도시하며(서열번호 16), 알파 1, 2 및 3 도메인은 이탤릭체로, 신호 펩타이드 및 막관통 도메인은 볼드체 및 밑줄로 나타낸다. 성숙 키메라 단백질은 하기에 도시된 서열의 아미노산 22에서 시작하고, 마우스-인간 및 인간-마우스 경계를 별표(*)로 표시한다. 참조를 위해, 인간 및 마우스 단백질 및 mRNA 서열에 대한 예시적인 젠뱅크 수탁 번호(Genbank Accession Number)를 하기 표 11에 열거한다.
전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 출원 공개 제2013/0111617호에 상세하게 기재된 바와 같이 키메라 FcRn 유전자를 포함하는 마우스를 내인성 마우스 B2M 유전자좌에 인간화된 B2M 유전자를 포함하는 마우스(도 5)와 번식시켰다. 마우스를 두 유전자좌 모두에서 동형접합성으로 번식시켰다.
키메라 FcRn 및 인간화된 B2M의 발현을 검출하기 위해서, 마우스를 희생시키고, 비장을 수집하였다. ACK 용해 완충액(깁코사(Gibco))으로 처리한 후, 비장을 해리시키고, 세포를 원심분리시키고, 세척하여 플레이트에 넣고, IC 고정 완충액(이바이오사이언스사)으로 고정시키고, Fc 블록(BD)을 포함하는 완충액으로 투과화시켜 염색을 준비했다. FcRn을 검출하기 위해 세포를 인-하우스 항-인간 FcRn 1차 항체 또는 항-마우스 FcRn 1차 항체(R&D AF6775)로 염색하고, 이어서 적절한 2차 항체(써모피셔사 1885920 또는 써모피셔사 1915848)로 염색하였다. 세포를 세척하고 샘플을 LSRFortessa X-20(BD) FACS 기기에서 분석하였다. B2M을 검출하기 위해, 세포를 항-마우스 B2M PE-표지된 항체(바이오레전드사 클론 A16041A) 또는 항-인간 B2M PE-표지된 항체(바이오레전드사 클론 2M2)로 염색하였다. 세포를 세척하고 샘플을 LSRFortessa X-20(BD) FACS 기기에서 분석하였다.
인간화된 FcRn/B2M 마우스는 검출 가능한 수준의 키메라 단백질을 발현하였다(데이터 도시하지 않음). 그러나, 인간 FcRn은 마우스 IgG에 결합할 수 없기 때문에, 인간 FcRn 및 인간화된 B2M에 대해서 동형접합성인 마우스는 혈액에서 마우스 IgG 수준이 현저하게 감소된 것으로 결정되었다(데이터 도시하지 않음). 인간화된 FcRn/B2M 마우스는 인간화된 B2M 단백질을 발현하였다(데이터 도시되지 않음).
마우스 FcRn은 인간 FcRn보다 높은 친화도로 인간 Ig에 결합하는 것으로 공지되어 있다. 키메라 마우스/인간 FcRn을 발현하는 마우스가 인간과 유사한 인간 항체 재순환 특성을 나타내는지의 여부를 시험하기 위해, 야생형 마우스 3마리 및 상기에 기재된 키메라 FcRn 및 인간화된 B2M에 대해서 동형접합성인 각각의 마우스에게 인간 IgG4 항체를 피하로 1㎎/㎏ 투여하고, 혈청 중의 항체 약물 수준을 Gyros 면역검정을 사용하여 주사 후 6시간, 1, 2, 3, 8, 10, 14, 22 및 30일에 측정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 키메라 FcRn(FcRn hu/hu) 및 인간화된 B2M(B2M hu/hu) 둘 다에 대해서 동형접합성인 마우스는 인간화된 단백질을 발현하지 않은 야생형 마우스보다 더 빠른 항체 청소율을 나타내었다. 따라서, 키메라 FcRn 및 인간화된 B2M을 발현하는 마우스는 인간과 더 유사한 인간 치료용 항체 재순환을 연구하기 위한 모델 역할을 하며, 따라서 치료제의 약동학적 및 약력학적 프로파일을 연구하는 훌륭한 모델로서 제공된다.
실시예 4: 인간화된 고 및 저 친화성 Fc감마 수용체 및 인간 중쇄 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 마우스
고 및 저 친화성 Fcγ 수용체 및 인간화된 불변 영역을 포함하는 인간화된 마우스를 생성시켰다. 이들 실험을 위해서, 고 친화성 Fcγ 수용체를 포함하는 마우스 및 저 친화성 Fcγ 수용체를 포함하는 마우스(이들 마우스의 생성은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제8,658,154호; 제9,056,130호; 제8,658,853호; 제8,883,496호; 제9,687,566호; 제9,089,599호; 제9,221,894호 및 제 9,474,255에 기재되어 있음)를 번식시키거나 또는 당업계에 공지된 기술에 따라서 ES를 재표적화시킴으로써 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 마우스(예를 들어, 도 1a의 마우스 유전자좌 7)와 함께 조합하였다. 생성된 마우스를 동형접합성으로 번식시켰다. 본 명세서에 기재된 인간화된 유전자좌의 다양한 예시적인 실시형태를 도 7에 제시한다.
유전자 표적화 완료시, ES 세포 또는 유전자 변형된 비인간 동물을 스크리닝하여 관심대상 외인성 뉴클레오타이드 서열의 성공적인 통합 또는 외인성 폴리펩타이드의 발현을 확인하였다. 다수의 기술이 당업자에게 공지되어 있으며, 서던 블롯팅, 긴 PCR, 정량적 PCR(예를 들어, TAQMAN을 사용한 실시간 PCR), 형광 현장 혼성화, 노던 블로팅, 유세포 분석, 웨스턴 분석, 면역세포화학, 면역 조직화학 등을 포함한다(이들로 제한되지 않음). 예를 들어, 관심 대상 유전자 변형, 즉, 인간 고 친화성 FcgR 및 저 친 화성 FcgR 및 인간 중쇄 불변 영역을 보유한 마우스는 문헌[Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659]에 기재된 대립유전자 검정의 변형을 사용하여 인간 대립유전자의 획득을 스크리닝하여 식별할 수 있다. 유전자 변형된 동물에서 특정 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 식별하는 다른 검정은 당업자에게 공지되어 있다.
도 7에 기재된 바와 같이 번식 또는 ES 세포 재표적화가 완결된 후, 생성된 마우스를 특징규명하였다. 이 실험을 위해, 모든 마우스를 레저네런 파마슈티컬즈사의 특정 무-병원균 시설에서 가두고, 번식시켰다. 야생형 WT 대조군 마우스(26 내지 36주령, 수컷 및 암컷, n=2) 및 미경험 고- 및 저-친화성 hFcgR, hIgM, hIgD, hIgG3 및 hIgG1(도 1a의 유전자좌 7, 19 내지 22주령, 수컷 및 암컷, n=5) 마우스를 희생시켰고, 혈액 및 비장을 수거하였다. 혈액 및 비장으로부터의 적혈구를 ACK 용해 완충액으로 용해시킨 후, 5% FBS를 함유한 RPMI 배지로 세척하였다. 혈액을 또한 혈청 분리기 튜브(BD, 카탈로그 번호 365956)에 수집하고, 제조사의 지침에 따라 혈청을 수집하였다. ELISA에 대한 양성 대조군으로 정상 인간 혈청(퀴델사, 카탈로그 번호 A113)을 사용하였다.
총 인간 IgM 항체를 하기와 같이 ELISA를 사용하여 검정하였다. 플레이트를 2ug/㎖ 당나귀 항-인간 IgM 항체(잭슨 이뮤노리서치사 카탈로그 번호 709-005-073)로 4℃에서 밤새 코팅하고, 세척하고 PBS-T 중의 1% BSA로 차단하였다. ChromPure Human IgM 표준(잭슨 이뮤노리서치사 카탈로그 번호 009-000-012)을 PBS-T에서 500ng/㎖에서 0.49ng/㎖로 연속 희석하고, 웰에 첨가하였다. 웰을 희석된 혈청 샘플과 함께 배양하고, 세척하고, HRP 접합 항-인간 IgM 항체(잭슨 이뮤노리서치사#009-035-073)와 함께 배양하였다. 플레이트를 세척하고, Opt EIA TMB 기질 시약 세트(BD 카탈로그 번호 555214)로 현상하였다. 1N 황산으로 반응을 중지하고, 블랭크-보정된 OD를 Molecular Devices Spectramax M5 마이크로 플레이트 리더 및 SoftMax Pro 소프트웨어로 450㎚에서 측정하였다. 데이터는 Prism 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 표시된 데이터는 반복 지점이다. 또한 제조사의 지침에 따라 인간 IgG1 및 인간 IgG3 ELISA를 수행하였다(각각 인비트로젠사 카탈로그 번호 BMS2092 및 BMS2094). (도 8c)
유세포 분석 실험을 위해, 1×106개의 세포를 Fixable Viability Dye eFluor 455UV(써모피셔사 카탈로그 번호 65-0868-14)로 염색하고, 10분동안 얼음에서 항-마우스 CD16/CD32(2.4G2, BD)와 함께 인큐베이션시켰다. 그 다음 세포를 얼음에서 30분 동안 하기 항체 패널로 표지하였다: 항-마우스 FITC-CD3(17A2, BD), A700-CD19(1D3, BD), Pe-Cy7-IgM(11/41, 이바이오사이언스사), PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a, 바이오레전드사), 항-인간 PE-IgD(IA6-2, 바이오레전드사) 및 BV421-IgM(G20-127, BD). 염색 후, 세포를 세척하고 2% 폼알데하이드에서 고정시켰다. 데이터 수집을 BD LSRFortessa 유세포 분석기에서 수행하였고, FlowJo로 분석하였다. B 세포(CD19+), 성숙 B 세포(CD19+ IgD-고 IgM-int), 이행/미성숙 B 세포(CD19+ IgD-int IgM-고). (도 8a 및 도 8b).
도 8a, 도 8b 및 도 8c에 요약된 바와 같이, 인간화된 고 및 저 친화성 Fcγ 수용체의 B 세포 및 인간화된 IgM, IgD, IgG3 및 IgG1 마우스에서 인간 IgM 및 인간 IgD 표면 발현의 상당한 획득이 존재한다. 추가로, 이들 마우스는 정상 비장 B 세포 집단 및 정상 혈청 항체 수준을 나타낸다. 고 및 저 친화성 hFCγR의 정확한 인간화 및 중쇄 불변 영역의 인간화를 나타낸 이들 마우스는 인간 Fc 수용체 효과기 기능을 연구하기 위한 신규 모델을 나타낸다.
실시예 5: 인간 IgE 항체 상호작용을 연구하기 위한 인간화된 Fcε 수용체 알파(FcεRα)를 포함하는 마우스
FcεR 단백질은 단일 α 소단위, β 소단위 및 2개의 γ 소단위로 이루어진다. α 소단위, FcεRIα의 세포외 부분은 2개의 면역글로불린-유사 도메인을 포함하고, 다른 소단위의 부재 하에서도 고 친화성으로 IgE에 결합한다. 따라서, 하기에 요약된 전략에서, FcεR의 α 소단위인 FcεRIα를 인간화시켰다.
마우스 염색체 1에 위치된 마우스 FcεRIα 유전자좌를 VELOCIGENE® 기술(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659], 둘 다 본 명세서에 참조에 의해 포함됨)을 사용하여 인간 및 마우스 박테리아 인공 염색체(BAC) DNA로부터의 고유한 표적화 벡터의 작제에 의해서 인간화하였다. 마우스 BAC RP23-332i14(인비트로젠사-써모피셔사)로부터의 DNA를 상동성 재조합에 의해서 변형시켜 마우스 FcεRIα의 암호 영역을 암호화하는 마우스 게놈 DNA의 5.7Kb를 결실시키고, 그 다음 BAC CTD-3064h17(인비트로젠사-써모피셔사)로부터의 인간 FcεRIα 암호 서열 및 인간 3' 미번역 영역의 6.1Kb를 삽입하였다(도 9). 따라서, 마우스 FcεRIα의 마우스 암호 엑손 1, 암호 엑손 2, 암호 엑손 3, 암호 엑손 4, 및 암호 엑손 5의 부분은 인간 FcεRIα 유전자의 인간 암호 엑손 1, 암호 엑손 2, 암호 엑손 3, 암호 엑손 4 및 암호 엑손 5의 부분으로 대체되었다. 생성된 키메라 FcεRIα 유전자는 키메라 마우스/인간 엑손 1(마우스 프로모터 및 5' UTR을 포함함), 정지 코돈을 통해서 인간 암호 엑손 2-5, 인간 3'UTR 및 폴리A, 그 다음 마우스 3'UTR 및 폴리A를 포함한다. 키메라 유전자 엑손 1(부분) 및 2는 신호 펩타이드를 암호화하고, 엑손 3 및 4는 IgE와 상호작용하는 것으로 여겨지는 FcεRIα의 2개의 Ig-유사 도메인을 암호화하고, 엑손 5는 단백질의 세포질 및 막관통 도메인을 암호화한다(도 9 참조).
구체적으로, 인간화된 FcεRIα 마우스를 생성시키기 위해서, 키메라 유전자의 작제에 사용된 큰 표적화 벡터는 하기 표 12에 열거된 핵산 서열을 포함하였다. 자가-결실 네오마이신 카세트를 마지막 암호 엑손의 3'에 삽입하였다.
표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 FcεRIα 엑손에서 결실을 포함하는 마우스 ES 세포를 전기천공하여 인간화된 FcεRIα를 발현하는 마우스를 생성시키기 위한 변형된 ES 세포를 생성하였다(도 9). 정량 TAQMANTM 검정(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48] 참조)에 의해서 인간 FcεRIα 엑손 서열의 삽입부를 함유하는 ES 세포를 식별하였다. 인간 서열의 삽입(대립유전자의 획득, GOA) 및 마우스 서열의 결실(대립유전자의 결실, LOA)을 검출하도록 특정 프라이머 세트 및 프로브를 설계하였다(도시하지 않음).
선택 카세트 결실 이전에 인간화된 FcεRIα 대립유전자의 접합부를 하기 표 13에 제시한다.
상기에 기재된 표적화된 ES 세포를 공여자 ES 세포로 사용하였고, VELOCIMOUSE® 방법(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 문헌[Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99] 참조)에 의해서 8-세포기 마우스 배아에 도입하였다. 고유한 인간 FcεRIα 유전자 서열의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형(상기 참조)을 사용한 유전자형분석에 의해서 인간화된 FcεRIα를 독립적으로 보유하는 VELOCIMICE®(공여자 ES 세포로부터 전체적으로 유래된 F0 마우스)를 식별하였다. 키메라 FcεRIα 유전자를 보유하는 이형접합성 마우스를 동형접합으로 번식시켰다.
마우스에 의해서 발현되는 생성된 FcεRIα 단백질은 완전히 인간이며, 유전자 변형된 마우스에 의해서 발현되는 인간 FcεRIα 단백질의 서열을 하기에 도시하고(서열번호 20), Ig-유사 도메인은 이탤릭체로, 신호 펩타이드 및 막관통 도메인 볼드체 및 밑줄로 나타낸다. 성숙 키메라 단백질은 하기에 도시된 서열의 아미노산 26에서 시작한다. 참조를 위해, 인간 및 마우스 단백질 및 mRNA 서열에 대한 예시적인 젠뱅크 수탁 번호를 하기 표 14에 열거한다.
인간화된 FcεRIα 마우스로부터의 비장 호염기의 표면 상의 인간화된 FcεRIα의 발현을 검증하기 위해서, 야생형(WT) 또는 동형접합성 인간화된 FcεRIα 마우스를 희생시키고, 비장을 수거하고, 단일 세포 현탁물을 적혈구 세포 용해(시그마사)에 따라서 제조하였다. 이어서, 세포를 생/사 세포 마커로 염색하고, Fc 블록으로 차단시키고, 하기 두 항체 혼합물 중 하나로 염색하였다: (1) 혼합물 1: 항-마우스 CD49b 항체(접합된 PECy7, 이바이오사이언스사 클론 DX5), 항-마우스 TCRβ(접합된 APC, BD 클론 H57-597), 항-마우스 B220(접합된 BUV395, BD 클론 RA3-682) 및 항-마우스 FcεRIα(접합된 eFluor 450, 이바이오사이언스사 클론 MAR-1) 또는 (2) 혼합물 2: 항-마우스 CD49b 항체(접합된 PECy7, 이바이오사이언스사 클론 DX5), 항-마우스 TCRβ(접합된 APC, BD 클론 H57-597), 항-마우스 B220(접합된 BUV395, BD 클론 RA3-682) 및 항-인간 FcεRIα(접합된 eFluor 450, 이바이오사이언스사 클론 AER-37(CRA1)). 세포를 LSRFortessa 기기에서 획득하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 호염기를 TCRβ-B220-CD49b+ FcεRIα+로서 식별하였다. 도 10의 FACS 플롯은 TCRβ-B220-집단을 나타내고, 호염기 집단을 화살표로 나타내었다. 이러한 집단은 WT 마우스에서만 마우스 FcεRIα에 대해서 양성이고, 인간화된 FcεRIα 마우스에서만 인간 FcεRIα에 대해서 양성이다. 그래프는 각각의 유전자형으로부터의 5마리 마우스의 비장에서 살아있는 세포의 백분율로서의 인간 또는 마우스 FceR1α+ 호염기의 정량을 나타낸다(도 10).
FcεRIα 인간화된 마우스를 수동 피부 과민증(PCA) 모델에서 검증하였다. 제1일에, WT 또는 인간화된 마우스의 군에게 2개의 알레르겐-특이적 인간 IgE 항체의 칵테일, 또는 미관련 IgG 항체(음성 대조군)을 각각 우측 귀 및 좌측 귀에 피내 투여하여, 비만 세포에서 알레르겐-특이적 IgE가 비만 세포 상의 FcεR에 결합하게 하였다. 24시간 후, 마우스를 0.5% 에반스 블루 염료로 희석된 1㎍의 알레르겐의 정맥내(IV) 주사로 시험감염시켰다. 알레르겐 시험감염 1시간 후, 마우스를 희생시키고, 에반스 블루 염료를 귀 조직으로부터 추출하고, 표준 곡선을 사용하여 분광광도계로 정량하였다. 이어서, 귀를 건조시키고, 칭량하였다. 결과는 국지적 비만 세포 탈과립화의 척도로서 에반스 블루/㎎ 조직으로서 정량된 조직에서 에반스 블루 염료 혈관외유출을 나타낸다. 도 11에 도시된 데이터는, 인간 알레르겐-특이적 IgE가 인간화된 FcεRIα 마우스에서 국지적인 과민성 반응을 매개할 수 있지만, WT 마우스에서는 그렇지 않음을 입증한다.
FcεRIα 인간화된 마우스를 또한 수동 전신 과민증(PSA)에서 검증하였다. 제1일에, 인간화된 FcεRIα 마우스의 군에게 2개의 알레르겐-특이적 인간 IgE 항체의 칵테일, 또는 미관련 IgG 항체(음성 대조군)을 정맥내(IV) 투여하여, 알레르겐-특이적 IgE가 FcεR1-발현 세포에 전신으로 결합하게 하였다. 24시간 후, 기저 중심 온도 측정치를 모든 마우스에 대해서 입수한 후, 1㎍의 알레르겐을 IV 주사하였다. 이어서 알레르겐 시험감염 후 30, 60, 120 및 240분에 모든 마우스에 대해서 중심 온도 측정치를 입수하고, 기저 온도에 대한 각각의 시간 지점에서의 중심 온도의 변화를 계산하였다. 중심 온도의 감소는 전신 과민증에 대한 판독이다. 도 12에 도시된 데이터는, 인간 알레르겐-특이적 IgE가 시험감염 30 내지 60분 후에 중심 온도의 상당한 감소에 의해서 측정되는 바와 같이 인간화된 FcεRIα 마우스에서 전신 과민성 반응을 매개할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 6: 인간 치료용 항체의 인간 Fc 수용체 상호작용 및 효능을 시험하기 위한 마스터 마우스
마우스 모델에서 완전 인간 단클론성 항체 및 인간 Fc 수용체 효과기 기능을 시험하기 위한 더 우수한 모델을 얻기 위해서, 마우스 A(인간화된 hβ2M; 실시예 3 참조), 마우스 B(hFCER1A; 실시예 5 참조), 마우스 C(hFCRN; 실시예 3 참조), 마우스 D(hFCGR1 참조), 마우스 E(hFCGR2/3 참조) 및 마우스 F(mVs, hIgM, hIgD, IgG3 및 IgG1; 도 1a의 마우스 유전자좌 7) 또는 대안적으로 도 13에 기재된 바와 같은 마우스 F'(hV, hIgM, hIgD, IgG3 및 IgG1; 도 1a의 마우스 유전자좌 5)를 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 기술에 따라서 ES 세포의 번식 또는 재표적화에 의해서 함께 조합한다. 생성된 마우스는 이들 유전자 중 임의의 것 또는 모두에 대해서 이형접합성이거나 동형접합성일 수 있다. 본 명세서에 기재된 인간화된 유전자좌의 다양한 예시적인 실시형태를 도 13에 도시한다. 도 1a에 도시된 인간 중쇄 불변 영역을 갖는 다른 마우스를 도 13의 나머지 마우스(마우스 A 내지 E)로 번식시켰다. 따라서, 마우스 A(인간화된 hb2M; 실시예 3 참조), 마우스 B(hFCER1A; 실시예 5 참조), 마우스 C(hFCRN; 실시예 3 참조), 마우스 D(hFCGR1 참조), 마우스 E(hFCGR2/3) 및 마우스(mVs, hIgM, hIgD, IgG3, IgG1, IgG2, 및 IgG4; 도 1a의 마우스 유전자좌 8) 또는 대안적으로 마우스(hVs, hIgM, hIgD, IgG3 IgG1, IgG2, 및 IgG4; 도 1a의 마우스 유전자좌 6)를 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 기술에 따라서 ES 세포의 번식 또는 재표적화에 의해서 함께 조합한다. 이들을 또한 도 2a에 도시된 경쇄 마우스로 번식시킬 수 있다. 추가 인간 면역글로불린 불변 영역을 실시예 1 및 당업계에 공지된 유전자 조작 기술을 통해서 추가하였다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조에 의해서 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 제시된 바와 같이 이들의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 충돌하는 경우, 본 명세서에서 임의의 정의를 비롯하여 본 출원이 우선시될 것이다.
등가물
당업자는 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 구체적인 실시형태에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> HUMANIZED RODENTS FOR TESTING THERAPEUTIC AGENTS
<130> RPB-01925 (28744-01925)
<140>
<141>
<150> 62/689,628
<151> 2018-06-25
<150> 62/648,197
<151> 2018-03-26
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<170> PatentIn version 3.5
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 5
atgctcttta tcttattaac taaggtgtcg taaccagttc aaagtggaat taccggtata 60
acttcgtata aggtatccta tacgaagtta t 91
<210> 6
<211> 98
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 6
ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgag gcggccgcag gtggcagtca 60
tggagatggt ggggtacagg gtgggggcag gggcactc 98
<210> 7
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 7
ttaaatgaat gcaattatct agacttattt cagttgaaca tgctggttgg gcggccgctg 60
gcataagaga aaactcaatc agatagtgct gaagacagga ctgtggag 108
<210> 8
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 8
tctgtgccta gttaacagag aatggagaat ggcgatgact tctaccaagc accggtataa 60
cttcgtataa ggtatcctat acgaagttat 90
<210> 9
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 9
ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgag aggtggcagt catggagatg 60
gtggggtaca gggtgggggc aggggcactc 90
<210> 10
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 10
aaacaacaag attgtatata tgtgcatcct ggccccattg ttccttatct gggataagca 60
tgctgttttc tgtctgtccc taacatgccc tgtgattatc 100
<210> 11
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 11
tctgttgttt taccaactac tcaatttctc ttataaggga ctaaatatgt accggtataa 60
cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 90
<210> 12
<211> 106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 12
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgtcgac ctcgagaatc caccacactt 60
aaaggataaa taaaaccctc cacttgccct ggttggctgt ccacta 106
<210> 13
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 13
ctttctgggt gtctgtcccc ttctctctgg aggatcatgg cacttcagat ctgtcccctc 60
tctctgaatc tgtccccctc cctccataat agattcttct 100
<210> 14
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 14
tctccccact gcactggcac agccccgcct tgccgctgct gatccattgc cggtgtgacc 60
cgggctcgat aactataacg gtcctaaggt agcgactcga gataacttcg tataatgtat 120
gctatacgaa gttat 135
<210> 15
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 15
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcctagg ttggagctcg tgtgagaggg 60
gagagcagag gtgagtctgt gccatgggat acttgtggcg 100
<210> 16
<211> 363
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 16
Met Gly Met Pro Leu Pro Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Pro Gln Thr Trp Gly Ser Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu
20 25 30
Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser
35 40 45
Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly
50 55 60
Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp
65 70 75 80
Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe
85 90 95
Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln
100 105 110
Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr
115 120 125
Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys
130 135 140
Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln
145 150 155 160
Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu
165 170 175
Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg
180 185 190
Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg
195 200 205
Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe
210 215 220
Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala
225 230 235 240
Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His
245 250 255
Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys
260 265 270
Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu
275 280 285
Asp Ser Ser Ala Arg Ser Ser Val Pro Val Val Gly Ile Val Leu Gly
290 295 300
Leu Leu Leu Val Val Val Ala Ile Ala Gly Gly Val Leu Leu Trp Gly
305 310 315 320
Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Leu Ser Leu Ser Gly Asp
325 330 335
Asp Ser Gly Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn Leu Pro Pro Glu Ala Glu
340 345 350
Pro Gln Gly Ala Asn Ala Phe Pro Ala Thr Ser
355 360
<210> 17
<211> 104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 17
ttttcgaagc catagctctc tggtgcagtt agcacctgaa ggtgcagggg cgatgaagaa 60
gatggctcct gccatggaat cccctactct actgtgtgta gcct 104
<210> 18
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 18
tcttcttcag cttactaaat atgaactttc agttcttggc agaatcaggg ctcgagataa 60
cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 90
<210> 19
<211> 122
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 19
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagg taactataac ggtcctaagg 60
tagcgagcta gccctcaata gcttctccac tgtcaaaggc cactcatgtg atccctagaa 120
aa 122
<210> 20
<211> 257
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu
1 5 10 15
Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val
20 25 30
Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr
35 40 45
Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp
50 55 60
Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile
65 70 75 80
Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln
85 90 95
Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp
100 105 110
Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu
115 120 125
Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile
130 135 140
Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn
145 150 155 160
Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys
165 170 175
Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile
180 185 190
Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gln Phe Phe Ile
195 200 205
Pro Leu Leu Val Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Phe Ile
210 215 220
Ser Thr Gln Gln Gln Val Thr Phe Leu Leu Lys Ile Lys Arg Thr Arg
225 230 235 240
Lys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro His Pro Lys Pro Asn Pro Lys Asn
245 250 255
Asn
Claims (208)
- 인간 항체의 시험 방법으로서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 게놈 내에 포함하는 설치류에게 상기 항체를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는,
(i) VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
(ii) 인간 CH1 도메인, 인간 힌지 영역, 인간 CH2 도메인, 인간 CH3 도메인, IgG 막관통 도메인 및 IgG 세포질 도메인을 포함하는 IgG 불변 도메인을 암호화하는 CH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역
을 포함하고,
상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상기 설치류가 상기 VH 유전자 분절, 상기 DH 유전자 분절 및 상기 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 상기 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 인간 항체의 시험 방법. - 제1항에 있어서, 상기 IgG 막관통 도메인은 설치류 IgG 막관통 도메인인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 IgG 막관통 도메인은 인간 IgG 막관통 도메인인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IgG 세포질 도메인은 설치류 IgG 세포질 도메인인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IgG 세포질 도메인은 인간 IgG 세포질 도메인인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인, 상기 인간 힌지 영역, 상기 인간 CH2 도메인 및 상기 인간 CH3 도메인은 IgG1 도메인이고, 상기 인간 항체는 IgG1 항체인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 IgG1 도메인은 IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 및 IGHG1*05로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화되고, 상기 인간 항체의 상기 중쇄 불변 도메인은 동일한 대립유전자에 의해서 암호화되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인, 상기 인간 힌지 영역, 상기 인간 CH2 도메인 및 상기 인간 CH3 도메인은 IgG2 도메인이고, 상기 인간 항체는 IgG2 항체인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 IgG2 도메인은 IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 및 IGHG2*06으로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화되고, 상기 인간 항체의 중쇄 불변 도메인은 동일한 대립유전자에 의해서 암호화되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인, 상기 인간 힌지 영역, 상기 인간 CH2 도메인 및 상기 인간 CH3 도메인은 IgG3 도메인이고, 상기 인간 항체는 IgG3 항체인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 IgG3 도메인은 IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 및 IGHG3*19로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화되고, 상기 인간 항체의 상기 중쇄 불변 도메인은 동일한 대립유전자에 의해서 암호화되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인, 상기 인간 힌지 영역, 상기 인간 CH2 도메인 및 상기 인간 CH3 도메인은 IgG4 도메인이고, 상기 인간 항체는 IgG4 항체인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 IgG4 도메인은 IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 및 IGHG4*04로부터 선택된 대립유전자에 의해서 암호화되고, 상기 인간 항체의 상기 중쇄 불변 도메인은 동일한 대립유전자에 의해서 암호화되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인, 상기 인간 힌지 영역, 상기 인간 CH2 도메인 및 상기 인간 CH3 도메인을 암호화하는 상기 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2a 또는 Cγ2c 유전자 분절 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인, 상기 인간 힌지 영역, 상기 인간 CH2 도메인 및 상기 인간 CH3 도메인을 암호화하는 상기 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2a 또는 Cγ2c 유전자 분절을 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인, 상기 인간 힌지 영역, 상기 인간 CH2 도메인 및 상기 인간 CH3 도메인을 암호화하는 상기 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ1 유전자 분절 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인, 상기 인간 힌지 영역, 상기 인간 CH2 도메인 및 상기 인간 CH3 도메인을 암호화하는 상기 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ1 유전자 분절을 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인, 상기 인간 힌지 영역, 상기 인간 CH2 도메인 및 상기 인간 CH3 도메인을 암호화하는 상기 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2b 유전자 분절 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인, 상기 인간 힌지 영역, 상기 인간 CH2 도메인 및 상기 인간 CH3 도메인을 암호화하는 상기 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ2b 유전자 분절을 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인, 상기 인간 힌지 영역, 상기 인간 CH2 도메인 및 상기 인간 CH3 도메인을 암호화하는 상기 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ3 유전자 분절 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인, 상기 인간 힌지 영역, 상기 인간 CH2 도메인 및 상기 인간 CH3 도메인을 암호화하는 상기 CH 유전자 분절은 내인성 Cγ3 유전자 분절을 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cμ 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cδ 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cδ 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ1 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ2b 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cγ3 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cε 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 Cα 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cμ 유전자 분절, 인간 Cδ 유전자 분절, 인간 Cγ3 유전자 분절 및 인간 Cγ1 유전자 분절을 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cγ2 유전자 분절 및 인간 Cγ4 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cα 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 인간 Cε 유전자 분절을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 인트론성 인핸서(Ei)를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 인트론성 인핸서(Ei)를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 3' 조절 영역(3' regulatory region: 3' RR)을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 3' 조절 영역(3' RR)을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sμ 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ3 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ1 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ2b 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sγ2a 및/또는 Sγ2c 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sε 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 설치류 Sα 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제41항 및 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sμ 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제41항, 제48항 및 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ3 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제41항 및 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ1 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제41항 및 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ2 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제41항 및 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sγ4 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제41항 및 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sε 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제41항 및 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Sα 스위치 부위를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 유전자 분절은 설치류 VH 유전자 분절이고, 상기 DH 유전자 분절은 설치류 DH 유전자 분절이며, 상기 JH 유전자 분절은 설치류 JH 유전자 분절인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 설치류 VH 유전자 분절, 상기 설치류 DH 유전자 분절 및 상기 설치류 JH 유전자 분절은 내인성 설치류 유전자 분절인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 유전자 분절은 인간 VH 유전자 분절이고, 상기 DH 유전자 분절은 인간 DH 유전자 분절이며, 상기 JH 유전자 분절은 인간 JH 유전자 분절인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 적어도 3개의 인간 VH 유전자 분절을 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상기 인간 DH 유전자 분절 모두를 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상기 인간 JH 유전자 분절 모두를 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 기능성 설치류 Adam6 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 위치된, 인간 항체의 시험 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 상기 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 상기 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는,
(i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
(ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei);
(iii) (a) 설치류 Cμ 유전자 분절;
(b) 설치류 Cδ 유전자 분절;
(c) 설치류 Cγ3 유전자 분절;
(d) 설치류 Cγ1 유전자 분절;
(e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절;
(f) 인간 IgG1 CH1 도메인, 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인, 설치류 IgG2a 막관통 도메인 및 설치류 IgG2a 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절;
(g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및
(h) 설치류 Cα 유전자 분절
을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및
(iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)
을 포함하고,
상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상기 설치류가 상기 인간 VH 유전자 분절, 상기 인간 DH 유전자 분절 및 상기 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 상기 변형된 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 인간 항체의 시험 방법. - 제1항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 상기 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는,
(i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
(ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei);
(iii) (a) 설치류 Cμ 유전자 분절;
(b) 설치류 Cδ 유전자 분절;
(c) 설치류 Cγ3 유전자 분절;
(d) 설치류 Cγ1 유전자 분절;
(e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절;
(f) 인간 IgG1 CH1 도메인, 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인, 인간 IgG1 막관통 도메인 및 인간 IgG1 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절;
(g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및
(h) 설치류 Cα 유전자 분절
을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및
(iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)
을 포함하고,
상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상기 설치류가 상기 인간 VH 유전자 분절, 상기 인간 DH 유전자 분절 및 상기 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 상기 변형된 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 인간 항체의 시험 방법. - 제1항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 상기 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는,
(i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
(ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei);
(iii) (a) 설치류 Cμ 유전자 분절;
(b) 설치류 Cδ 유전자 분절;
(c) 설치류 Cγ3 유전자 분절;
(d) 인간 IgG4 CH1 도메인, 인간 IgG4 힌지 영역, 인간 IgG4 CH2 도메인, 인간 IgG4 CH3 도메인, 설치류 IgG1 막관통 도메인 및 설치류 IgG1 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절;
(e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절;
(f) 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절;
(g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및
(h) 설치류 Cα 유전자 분절
을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및
(iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)
을 포함하고,
상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상기 설치류가 상기 인간 VH 유전자 분절, 상기 인간 DH 유전자 분절 및 상기 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 상기 변형된 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 인간 항체의 시험 방법. - 제1항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 상기 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는,
(i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
(ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei);
(iii) (a) 설치류 Cμ 유전자 분절;
(b) 설치류 Cδ 유전자 분절;
(c) 설치류 Cγ3 유전자 분절;
(d) 인간 IgG4 CH1 도메인, 인간 IgG4 힌지 영역, 인간 IgG4 CH2 도메인, 인간 IgG4 CH3 도메인, 인간 IgG4 막관통 도메인 및 인간 IgG4 세포질 도메인을 암호화하는 변형된 CH 유전자 분절;
(e) 설치류 Cγ2b 유전자 분절;
(f) 설치류 Cγ2a 및/또는 Cγ2c 유전자 분절;
(g) 설치류 Cε 유전자 분절; 및
(h) 설치류 Cα 유전자 분절
을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및
(iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)
을 포함하고,
상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상기 설치류가 상기 인간 VH 유전자 분절, 상기 인간 DH 유전자 분절 및 상기 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 상기 변형된 CH 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 인간 항체의 시험 방법. - 제1항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 상기 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는,
(i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
(ii) 인간 인트론성 인핸서(Ei);
(iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절;
(b) 인간 Cδ 유전자 분절;
(c) 인간 Cγ3 유전자 분절;
(d) 인간 Cγ1 유전자 분절
을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및
(iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)
을 포함하고,
상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상기 설치류가 완전 인간 중쇄를 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 인간 항체의 시험 방법. - 제1항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 상기 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는,
(i) 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
(ii) 인간 인트론성 인핸서(Ei);
(iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절;
(b) 인간 Cδ 유전자 분절;
(c) 인간 Cγ3 유전자 분절;
(d) 인간 Cγ1 유전자 분절;
(c) 인간 Cγ2 유전자 분절;
(d) 인간 Cγ4 유전자 분절
을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및
(iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)
을 포함하고,
상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상기 설치류가 완전 인간 중쇄를 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 인간 항체의 시험 방법. - 제1항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 상기 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는,
(i) 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
(ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei);
(iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절;
(b) 인간 Cδ 유전자 분절;
(c) 인간 Cγ3 유전자 분절;
(d) 인간 Cγ1 유전자 분절
을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및
(iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)
을 포함하고,
상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상기 설치류가 설치류 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 인간 항체의 시험 방법. - 제1항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하되, 상기 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는,
(i) 설치류 VH 유전자 분절, 설치류 DH 유전자 분절 및 설치류 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
(ii) 설치류 인트론성 인핸서(Ei);
(iii) (a) 인간 Cμ 유전자 분절;
(b) 인간 Cδ 유전자 분절;
(c) 인간 Cγ3 유전자 분절;
(d) 인간 Cγ1 유전자 분절;
(c) 인간 Cγ2 유전자 분절;
(d) 인간 Cγ4 유전자 분절
을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및
(iv) 설치류 3' 조절 영역(3' RR)
을 포함하고,
상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상기 설치류가 설치류 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 IgG 항체를 생산하도록 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 인간 항체의 시험 방법. - 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 면역글로불린 카파(κ)쇄 유전자좌를 더 포함하되, 상기 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는,
(1) 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ쇄 가변 영역; 및
(2) 인간 Cκ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 κ쇄 불변 영역
을 포함하고,
상기 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 상기 설치류가 상기 인간 Vκ 유전자 분절 및 상기 인간 Jκ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 및 상기 인간 Cκ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 불변 도메인을 포함하는 항체를 생산하도록 상기 면역글로불린 κ쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결되고,
상기 시험될 인간 항체는 κ 경쇄를 포함하는, 인간 항체의 시험 방법. - 제75항에 있어서, 상기 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 설치류 인트론성 κ 인핸서(Eκi)를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제75항에 있어서, 상기 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 인간 인트론성 κ 인핸서(Eκi)를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 설치류 3' κ 인핸서(Eκ3')를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 인간 3' κ 인핸서(Eκ3')를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 적어도 6개의 인간 Vκ 유전자 분절을 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제75항 또는 제80항에 있어서, 상기 면역글로불린 κ쇄 가변 영역은 상기 인간 Jκ 유전자 분절 모두를 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제75항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 위치된, 인간 항체의 시험 방법.
- 제82항에 있어서, 상기 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 상기 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제75항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제75항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 면역글로불린 κ쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에,
인간 Vλ 유전자 분절, 인간 Jλ 유전자 분절 및 인간 Cλ 유전자 분절
을 포함하는 면역글로불린 람다(λ)쇄 유전자좌를 포함하되,
상기 인간 Vλ 유전자 분절 및 상기 인간 Jλ 유전자 분절은 상기 설치류가 상기 인간 Vλ 유전자 분절 및 상기 인간 Jλ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 및 상기 인간 Cλ 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 불변 도메인을 포함하는 항체를 생산하도록 상기 인간 Cλ 유전자 분절에 작동 가능하게 연결되고,
상기 시험될 인간 항체는 λ 경쇄를 포함하는, 인간 항체의 시험 방법. - 제86항에 있어서, 상기 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ1 유전자 분절인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제87항에 있어서, 상기 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ1 유전자 분절인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제86항에 있어서, 상기 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ2 유전자 분절인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제89항에 있어서, 상기 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ2 유전자 분절인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제86항에 있어서, 상기 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ3 유전자 분절인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제91항에 있어서, 상기 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ3 유전자 분절인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제86항에 있어서, 상기 인간 Cλ 유전자 분절은 인간 Cλ7 유전자 분절인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제93항에 있어서, 상기 인간 Jλ 유전자 분절은 인간 Jλ7 유전자 분절인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제86항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 Cλ1 유전자 분절, 인간 Cλ2 유전자 분절, 인간 Cλ3 유전자 분절 및 인간 Cλ7 유전자 분절 또는 설치류 C λ1 유전자 분절을 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제95항에 있어서, 상기 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 Jλ1 유전자 분절, 인간 Jλ2 유전자 분절, 인간 Jλ3 유전자 분절 및 인간 Jλ7 유전자 분절을 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제86항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 적어도 7개의 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제86항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 설치류 λ 인핸서 2.4를 더 포함하는, 항체의 시험 방법.
- 제86항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 설치류 3' λ 인핸서를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제86항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 설치류 λ 인핸서 3.1을 더 포함하는, 항체의 시험 방법.
- 제86항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 인간 3' λ 인핸서를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제86항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 위치된, 인간 항체의 시험 방법.
- 제102항에 있어서, 상기 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 상기 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제86항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제86항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 면역글로불린 λ쇄 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor: FcRn) 유전자좌를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제106항에 있어서, 상기 FcRn 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제106항에 있어서, 상기 FcRn 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcRn 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcRn 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제106항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제111항에 있어서, 상기 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제106항에 있어서, 상기 FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 상기 핵산 서열은 설치류 FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제106항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 설치류 FcRn을 발현하지 않는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제106항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcRn 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제106항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcRn 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제106항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 인간 또는 인간화된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 β-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자좌를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제117항에 있어서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제118항에 있어서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 상기 내인성 설치류 β2M 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제117항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 설치류 β2M 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 β2M 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 β2M 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 Fc 엡실론 수용체 1 알파(FcεR1α) 유전자좌를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제123항에 있어서, 상기 FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제123항에 있어서, 상기 FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제123항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제123항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제123항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제128항에 있어서, 상기 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제123항에 있어서, 상기 인간 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 상기 핵산 서열은 설치류 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제123항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 설치류 FcεR1α를 발현하지 않는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제123항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcεR1α 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제123항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcεR1α 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 Fc 감마 수용체 1a(FcγR1a) 유전자좌를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제134항에 있어서, 상기 FcγR1a 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제134항에 있어서, 상기 FcγR1a 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제134항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcγR1a 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제134항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcγR1a 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제134항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 FcγR1a 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제139항에 있어서, 상기 FcγR1a 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 FcγR1a 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제134항에 있어서, 상기 인간 FcγR1a 세포외 도메인을 암호화하는 상기 핵산 서열은 설치류 FcγR1a 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제134항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 설치류 FcγR1a를 발현하지 않는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제134항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcγR1a 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제134항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcγR1a 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 인간 FcγR2a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 Fc 감마 수용체 2a(FcγR2a) 유전자를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제145항에 있어서, 상기 FcγR2a 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제146항에 있어서, 상기 인간 FcγR2a 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제145항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcγR2a 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제145항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcγR2a 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 인간 FcγR2b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 Fc 감마 수용체 2a(FcγR2b) 유전자를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제150항에 있어서, 상기 FcγR2b 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제151항에 있어서, 상기 인간 FcγR2b 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제150항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcγR2b 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제150항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcγR2b 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 인간 FcγR3a 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 Fc 감마 수용체 3a(FcγR3a) 유전자를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제155항에 있어서, 상기 FcγR3a 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제156항에 있어서, 상기 인간 FcγR3a 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제155항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcγR3a 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제155항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcγR3a 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 인간 FcγR3b 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 Fc 감마 수용체 3b(FcγR3b) 유전자를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제160항에 있어서, 상기 FcγR3b 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제161항에 있어서, 상기 인간 FcγR3b 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제160항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcγR3b 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제160항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcγR3b 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는, 상기 설치류의 게놈 내에, 인간 FcγR2c 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 Fc 감마 수용체 2c(FcγR2c) 유전자를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제165항에 있어서, 상기 FcγR2c 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자좌에 위치되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제166항에 있어서, 상기 인간 FcγR2c 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 저 친화성 FcγR 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제165항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcγR2c 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제165항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcγR2c 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 마우스인, 인간 항체의 시험 방법.
- 설치류로서, 게놈 내에, 인간 세포외 도메인 및 설치류 세포질 도메인을 포함하는 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 신생아 Fc 수용체(FcRn) 유전자좌를 포함하는, 설치류.
- 제171항에 있어서, 상기 FcRn 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 더 포함하는, 설치류.
- 제171항에 있어서, 상기 FcRn 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 더 포함하는, 설치류.
- 제169항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자좌에 위치되는, 설치류.
- 제174항에 있어서, 상기 FcRn 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 FcRn 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는, 설치류.
- 제171항에 있어서, 상기 인간 FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 상기 핵산 서열은 설치류 FcRn 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체하는, 설치류.
- 제171항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 설치류 FcRn을 발현하지 않는, 설치류.
- 제171항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcRn 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 설치류.
- 제171항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcRn 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 설치류.
- 제171항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 내에 인간 또는 인간화된 β-2-마이크로글로불린(β2M) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 β-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자좌를 더 포함하는, 설치류.
- 제180항에 있어서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 β2M 유전자좌에 위치되는, 설치류.
- 제181항에 있어서, 인간 또는 인간화된 β2M 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 상기 내인성 설치류 β2M 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는, 설치류.
- 제180항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 설치류 β2M 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 설치류.
- 제180항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 β2M 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 설치류.
- 제180항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 β2M 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 설치류.
- 설치류로서, 게놈 내에 인간 세포외 도메인을 포함하는 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 Fc 엡실론 수용체 1 알파(FcεR1α) 유전자좌를 포함하는, 설치류
- 제186항에 있어서, 상기 FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 막관통 도메인을 더 포함하는, 설치류
- 제186항에 있어서, 상기 FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 막관통 도메인을 더 포함하는, 설치류
- 제186항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcεR1α 폴리펩타이드는 설치류 세포질 도메인을 더 포함하는, 설치류.
- 제186항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcεR1α 폴리펩타이드는 인간 세포질 도메인을 더 포함하는, 설치류.
- 제186항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자좌에 위치되는, 설치류.
- 제191항에 있어서, 상기 FcεR1α 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 서열은 내인성 설치류 FcεR1α 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는, 설치류.
- 제186항에 있어서, 상기 인간 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 상기 핵산 서열은 설치류 FcεR1α 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 핵산 서열을 대체하는, 설치류.
- 제186항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 설치류 FcεR1α를 발현하지 않는, 설치류.
- 제186항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcεR1α 유전자좌에 대해서 이형접합성인, 설치류.
- 제186항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 FcεR1α 유전자좌에 대해서 동형접합성인, 설치류.
- 제171항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 마우스인, 설치류.
- 인간 항체의 시험 방법으로서, 상기 항체를 제171항 내지 제197항 중 어느 한 항의 설치류에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제170항 및 제198항 중 어느 한 항에 있어서 상기 투여된 인간 항체의 하나 이상의 약동학적 특성을 측정하는 단계를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제199항에 있어서, 상기 하나 이상의 약동학적 특성은 혈장 농도 대 시간 하의 면적(area under the plasma concentration versus time: AUC), 생체내 회수율(in vivo recovery: IVR), 청소율(clearance rate: CL), 평균 체류 시간(mean residence time: MRT), 작용제 반감기(t½) 및 정상 상태에서의 분포 용적(volume of distribution: Vss) 중 하나 이상으로부터 선택되는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제170항 및 제198항 중 어느 한 항에 있어서 상기 투여된 인간 항체의 치료 효능을 측정하는 단계를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제170항 및 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체의 복수의 용량을 투여하는 단계 및 상기 인간 항체의 각각의 용량의 치료 효능을 결정하는 단계를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제170항 및 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체의 복수의 용량을 투여하는 단계 및 상기 인간 항체의 각각의 용량의 안전성을 결정하는 단계를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제170항 및 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체의 복수의 용량을 투여하는 단계 및 상기 인간 항체의 각각의 용량의 내약성(tolerability)을 결정하는 단계를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제170항 및 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류에서 하나 이상의 Fc 수용체 매개 반응을 측정하는 단계를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제205항에 있어서, 상기 하나 이상의 Fc 수용체 매개 반응은 ADCC 반응인, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제170항 및 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체는 상기 마우스 내의 표적 세포에 결합하고, 그리고 상기 방법은 상기 표적 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포의 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 측정하는 단계 및 ADCC의 양을 대조군과 비교하는 단계를 더 포함하되, 증가된 표적 세포 사멸은 작용제가 ADCC를 매개하는 증가된 능력을 갖는다는 것을 나타내는, 인간 항체의 시험 방법.
- 제1항 내지 제170항 및 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체에 대한 상기 설치류에 의해서 생성된 면역 반응을 측정하는 단계를 더 포함하는, 인간 항체의 시험 방법.
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