ES2529769T3

ES2529769T3 - Anticuerpos glicomanipulados

Info

Publication number: ES2529769T3
Application number: ES11163178.4T
Authority: ES
Inventors: Manfred Schuster; Ralf Kircheis; Andreas Nechansky; Wolfgang Jost; Gilbert Gorr
Original assignee: Greenovation Biotech GmbH
Current assignee: Eleva GmbH
Priority date: 2006-07-11
Filing date: 2007-07-11
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2027-07-11
Also published as: ES2428875T3; US20150284461A1; IL196022A; PL2368913T3; JP2009542750A; DK2044121T3; KR20090039756A; DK2368913T3; WO2008006554A8; WO2008006554A2; CA2657605C; EP2368913B1; IL196022A0; EP2044121B1; EP2044121A2; CA2657605A1; CN101495514A; US9051577B2; JP5424878B2; US20090291078A1

Abstract

Preparación de anticuerpos que comprende unos anticuerpos modificados de un animal o derivados o fragmentos de los mismos, que comprende un dominio de unión a inmunoglobulina y una región Fc, específica para un antígeno, caracterizada por que · los anticuerpos o derivados o fragmentos de los mismos comprenden una estructura de N-glicano sin fucosa ni xilosa seleccionada de entre GlcNAc2Man3, GlcNAc2Man3GlcNAc o GlcNAc2Man3GlcNAc2, y · por lo menos 90%, preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 99%, todavía más preferentemente por lo menos 100% de los anticuerpos modificados, derivados o fragmentos de los mismos no presenta un residuo lisina C-terminal.

Description

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con preparaciones de anticuerpos parentales y el anticuerpo según la invención, en comparación con células NK que expresan el receptor de baja afinidad (CD16 158F/F). La comparación lado a lado sobre las células Ovcar-3 reveló un incremento del potencial lítico del anticuerpo según la invención de un factor de aproximadamente 40, independientemente del fenotipo de CD16 seleccionado.

El anticuerpo según la invención puede ser un anticuerpo murino, quimérico, humano o humanizado, preferentemente el anticuerpo es uno humanizado. En una realización preferida, el anticuerpo es IgG o un fragmento

o derivado del mismo, preferentemente IgG1 o un fragmento o derivado del mismo. En una realización adicional, el presente anticuerpo de la invención es una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de la IgG humana.

Así, en un aspecto la presente invención se refiere a una preparación farmacéutica que contiene el anticuerpo según la invención en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Además, la presente invención se refiere a la utilización de dicho anticuerpo como producto farmacéutico.

El producto farmacéutico puede utilizarse como medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico para la reducción o inhibición, respectivamente, del crecimiento de células tumorales en un paciente, especialmente para el tratamiento del cáncer sólido, por ejemplo para el tratamiento de tumores metastatizados o células tumorales diseminadas de origen epitelial. Además, el anticuerpo según la invención puede utilizarse para el tratamiento de una enfermedad residual mínima.

El anticuerpo según la invención a una concentración dada fue capaz de lisar células diana en un abanico más amplio de densidades de antígeno. Este fenómeno puede resultar relevante en la terapia tumoral, especialmente debido a que las densidades del antígeno diana no pueden considerarse constantes sobre los tumores epiteliales y pueden variar tanto en los tumores primarios como en las metástasis derivadas. En resumen, los anticuerpos terapéuticos activos expresados por cepas de producción glico-optimizadas (tal como el anticuerpo IGN314 producido por un musgo) muestran una actividad lítica incrementada y podrían reducir las dosis terapéuticas o, a una concentración dada, lisar un espectro más amplio de células tumorales con diferentes densidades de antígenos. Especialmente las células con bajas densidades de antígenos, que escaparían a los anticuerpos terapéuticos estándares pero que podrían ser la diana y resultar destruidos por dichos anticuerpos glicomanipulados. Además de lo anterior, los anticuerpos glico-optimizados mostraron valores de EC50 más bajos en todas las líneas celulares investigadas y en ambos fenotipos de CD16158, lo que es indicativo de una afinidad más alta para tanto el fenotipo CD16158F/F como CD16158V/V. Esta fuerte interacción reduce las concentraciones EC50 y permite una reducción de la concentración umbral necesaria para iniciar la lisis de las células diana para ambos fenotipos. Este fenómeno puede reportar un beneficio terapéutico especialmente para pacientes con el fenotipo de baja afinidad, que de otra manera requeriría concentraciones de anticuerpos más altas para obtener el mismo efecto terapéutico al tratarlo con preparaciones de anticuerpos clásicas.

En otro aspecto de la presente invención está previsto un procedimiento para la fabricación de una preparación de anticuerpos como se ha definido anteriormente, en el que el anticuerpo se expresa en células, preferentemente células vegetales, siendo deficiente en actividad de β1,2-xilosiltransferasa y de α1,3-fucosiltransferasa, preferentemente careciendo completamente de actividades de β1,2-xilosiltransferasa y de α1,3-fucosiltransferasa, así como el anticuerpo que puede obtenerse mediante esta expresión. Por ejemplo, puede utilizarse por lo menos un vector que comprende ácidos nucleicos codificantes de cadenas de anticuerpo, para transformar una célula o célula vegetal que, a su vez, puede multiplicarse y utilizarse para producir el anticuerpo modificado.

Preferentemente, las células también son deficientes en actividad de 1,4-galactosiltransferasa.

En las formas de realización preferidas el ADN codificante de los anticuerpos, fragmentos o derivados utilizados para expresar los anticuerpos, fragmentos o derivados carece del codón para la lisina C-terminal.

En otras formas de realización, la lisina C-terminal de los anticuerpos, fragmentos o derivados se elimina, preferentemente con una carboxipeptidasa, por ejemplo la carboxipeptidasa B, o in vivo mediante la selección de las condiciones de cultivo celular apropiadas, preferentemente mediante la selección de sistemas de expresión de células animales. La expresión se realiza preferentemente en células BY2, células de zanahoria, levaduras (por ejemplo Pichia o Saccharomyces), ciliados, algas o células de insecto.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: secuencias de la región variable de cadena ligera humanizada del anticuerpo monoclonal IGN314 con diana en Lewis Y.

Fig. 2: secuencia de la región variable de cadena pesada humanizada del anticuerpo monoclonal IGN34 con diana en Lewis Y. Puede utilizarse la secuencia 1 ó 2.

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La expresión citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) utilizada en la presente memoria se refiere a cualquier actividad para dañar una célula tumoral o similar mediante la activación de una célula efectora mediante la unión de la región Fc de un anticuerpo a un receptor de Fc existentes sobre la superficie de una célula efectora, tal como una célula asesina, una célula asesina natural, un macrófago activado o similar.

Un anticuerpo con actividad de ADCC incrementada puede determinarse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido por el experto en la materia. En los ejemplos se describe un ensayo aceptado.

Puede medirse una ADCC incrementada a partir de un potencial lítico incrementado, medido como una reducción de la concentración EC50 de anticuerpos que indica la concentración de anticuerpos necesaria para lisar específicamente la mitad de la cantidad máxima de células diana.

La expresión citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se define como la toxicidad celular directa mediante la unión y activación del complemento. Un anticuerpo se une a su diana sobre la superficie celular de, por ejemplo, la célula tumoral e inicia el sistema del complemento, también conocido como "cascada del complemento", resultando en un complejo de ataque membranal que literalmente realiza un orificio en la membrana celular, causando la lisis y muerte celulares.

Un anticuerpo con una actividad de CDC reducida puede determinarse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido por el experto en la materia. En los ejemplos se describe un ejemplo aceptado.

Puede definirse la actividad de CDC reducida como una concentración EC50 de anticuerpos incrementada que permite la lisis de la mitad de la cantidad máxima de células diana. La actividad de CDC del anticuerpo según la presente invención puede reducirse hasta en 10%, alternativamente hasta 20%, alternativamente hasta 30%. En otras formas de realización la actividad de CDC no resulta modificada.

La actividad de unión del anticuerpo de la invención al antígeno diana, por ejemplo al antígeno Lewis-Y, CD20, Ep-CAM o Her-2, es de por lo menos 80% en comparación con el anticuerpo parental, preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 100% en comparación con el anticuerpo parental.

Un posible objetivo de tratamiento es la unión y reducción efectivas de las células tumorales, es decir, del tejido tumoral o metástasis o, en particular, de células tumorales diseminadas. El número de células tumorales, o micrometástasis, respectivamente, detectable en la sangre, médula ósea u órganos se reduce significativamente. La formación de metástasis se retarda y su crecimiento por lo menos se enlentece. De esta manera, la duración de vida sin recaídas, y de esta manera el tiempo total de supervivencia, de los pacientes puede alargarse mediante la inmunoterapia específicamente dirigida.

Comprendida dentro del alcance de uso según la invención, en particular el tratamiento para reducir, o inhibir, respectivamente, el crecimiento de las células tumorales en un paciente de cáncer, también resulta posible una hemodiálisis.

Según la invención, está comprendida una preparación farmacéutica que contiene el anticuerpo según la invención en un portador o diluyente farmacéutico. La preparación puede utilizarse para preparar un medicamento destinado al tratamiento profiláctico y/o terapéutico para reducir o inhibir, respectivamente, el crecimiento de las células tumorales en un paciente. La reducción del crecimiento de las células tumorales puede incrementarse por lo menos en 5% en comparación con la utilización del anticuerpo no modificado específico para el mismo antígeno.

Una preparación que contenga el anticuerpo según la presente invención también resulta útil para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de cáncer sólido, preferentemente de origen epitelial, o de enfermedad residual mínima.

El anticuerpo de la invención puede utilizarse para la inmunoterapia pasiva.

También se proporciona la utilización de los anticuerpos de la invención o su preparación para un procedimiento de cribado (preferentemente in vitro) que comprende proporcionar una muestra de un sujeto, preferentemente un ser humano, y detectar sucesos de unión de los anticuerpos a un antígeno en la muestra. De manera similar, se proporciona el procedimiento de cribado, que comprende obtener una muestra de un sujeto (por ejemplo un ser humano), poner en contacto la muestra con los anticuerpos y detectar sucesos de unión. Con este procedimiento pueden identificarse sujetos que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención. Además, puede identificarse el anticuerpo/preparación óptimo para el tratamiento de una enfermedad o sujeto particular. Se proporciona además el procedimiento de diagnóstico de una enfermedad específica, que comprende obtener una muestra de un sujeto (que puede sufrir la enfermedad), poner en contacto la muestra con anticuerpos de la invención específicos para un antígeno que es característico de la enfermedad, detectar sucesos de unión de los anticuerpos a antígenos en la muestra y diagnosticar la enfermedad en caso de que se detecten sucesos de unión.

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Producción de anticuerpos recombinantes

Se expresó anticuerpo de control IGN311 de grado clínico en células SP 2.0 utilizando un procedimiento de producción de fibra hueca que contenía FCS y un procedimiento posterior clásico que incluía una etapa de captura con proteína A.

La variante de IGN311 glicomanipulada ∆xyl-t/∆fuc-t de doble inactivación génica expresada en musgo se denominó IGN314. Las regiones codificantes de las cadenas pesadas y ligeras de IGN311 (excluyendo sus péptidos de señal respectivos) se amplificaron por PCR (polimerasa pfu) y se clonaron con los extremos romos en el vector de expresión de musgo p127, diseñado para secretar los correspondientes productos génicos mediante la utilización de un péptido de señal vegetal (Gorr G. y Jost W., Bioprocessing J. 4:26-30, 2005; Weise et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 70:337-345). Los constructos resultantes (p127-IGN-HC y p127-IGN-LC, respectivamente) se verificaron mediante digestión de restricción y secuenciación. La transformación de los protoplastos de musgo se llevó a cabo tal como se ha indicado anteriormente, en Jost et al., Curr. Genet. 47:111-120, 2005, mediante la utilización simultánea de 45 µg de cada uno de los dos constructos y con las modificaciones siguientes: se utilizó tres veces el número de protoplastos y seis veces la cantidad de solución PEG (añadidos a la mezcla de protoplastos/ADN, seguido de una incubación de 12 minutos) conjuntamente con el medio estándar (3 M; 480mOsm; Jost W. et al., Curr. Genet. 47:111-120, 2005). Debido a que los títulos de IgG en el medio estándar resultaron ser relativamente bajos, para la producción en masa se llevaron a cabo en total 167 transformaciones en ocho días diferentes bajo condiciones de medio optimizado (mezcla 1:1 de medio estándar con medio W5; Baur A. et al., J. Biotechnol. 119:332-342, 2005). Todos los medios se suplementaron con BSA al 0,01% (p/v). Tras el procedimiento de transformación, las células se reservaron en 400 µl de medio y posteriormente 300 µl del sobrenadante de cultivo fueron sustituidos por medio idéntico fresco. Las transformaciones simuladas sirvieron de controles negativos (no purificado y copurificado). Cada semana se agruparon los sobrenadantes de todas las transformaciones realizadas en un mismo día y se purificaron mediante carga directa en columnas HiTrap-proteína A equilibrada de 1 ml (Amersham). Se analizaron los sobrenadantes de cultivo en bruto, así como los anticuerpos purificados, mediante un ELISA de tipo sándwich anti-idiotípico y SDS-PAGE con tinción de plata.

Para la generación de plantas transformadas establemente, se llevó a cabo la transferencia directa de ADN mediada por PEG tal como se ha descrito previamente (Jost et al., Curr. Genet. 47:111-120, 2005). Se preparó el ADN mediante digestión de p127-IGN-HC y p127-IGN-LC con los enzimas de restricción XhoI, HindIII y ScaI. Las bandas de ADN relacionadas con la digestión con XhoI/HindIII, que comprendían las secuencias promotoras de la expresión, las secuencias codificantes de la cadena ligera o pesada fusionada con el péptido de señal vegetal y la señal de terminación, se separaron mediante electroforesis en gel, se extrajeron y se eluyeron de la matriz de gel. Los protoplastos se aislaron de las líneas doblemente inactivadas ∆xyl-t/∆fuc-t y se cotransformaron con 5 µg de cada uno de los constructos de ADN linearizados y eluidos. Tras el procedimiento de transformación y posteriores etapas de dilución y lavado, los protoplastos se incubaron en medio de regeneración (medio Knop que contenía 6% de glicosa y 3,6% de mannit, pH 5,6, ~580 mOsm) durante la noche a razón de 5 µmoles m-2 s-1, seguido de la incubación con 40 a 50 µmoles m-2 s-1 de luz durante 7 a 10 días.

Las líneas transgénicas que contenían ambos constructos y que produjeron IGN314 ensamblado se aislaron mediante cribado para la producción de anticuerpos con un ELISA de tipo sándwich anti-idiotípico. Las líneas transgénicas identificadas se cultivaron adicionalmente en medio Knop.

Determinación de los perfiles de oligosacáridos N-ligados

Se aislaron cadenas pesadas de IGN311 e IGN314 de las muestras mediante SDS-PAGE reductora, tal como se describe en Kolarich D. y Altmann, Anal. Biochem. 285:64-75, 2000. Se extrajeron las bandas teñidas con Coomassie, se destiñeron, se carbamidometilaron, se digirieron con tripsina y se extrajeron a partir de trozos del gel tal como se describe en Kolarich D., supra. Los extractos se llevaron a sequedad en un concentrador Speed-Vac y se reconstituyeron con agua que contenía ácido fórmico al 0,1%. El análisis de espectrometría de masas se llevó a cabo en un Q-TOF Ultima Global (Waters Micromass) dotado de una unidad de electropulverización estándar, un sistema Cap-LC (Waters Micromass) y un módulo de distribución de solventes de 10 puertos (Rheodyne). En primer lugar las muestras se capturaron en una precolumna C18 Aquasil (30x0,32 mm, Thermo Electron) utilizando agua como el solvente. La columna analítica se mantuvo en 5% de acetonitrilo antes de cambiar el solvente y después se aplicó un gradiente lineal de 5% a 50% de acetonitrilo a un caudal de 2 µl/min. Todos los eluyentes contenían ácido fórmico al 0,1%. El ajuste de masas del analizador TOF se llevó a cabo en el modo de EM en tándem utilizando nuevamente [Glu1]-fibrinopéptido B. Las muestras se analizaron en el modo de EM. Debido a que no se llevó a cabo ningún cambio entre los modos de EM y EM en tándem, no se produjeron pérdidas de señal, especialmente para el análisis de los glucopéptidos. El análisis de los datos se llevó a cabo con el software MassLynx 4.0 SP4 (Waters Micromass).

Procedimientos analíticos

La integridad, el peso molecular y los potenciales productos de degradación del producto de expresión purificado se analizaron mediante SDS-PAGE utilizando un sistema de electroforesis Novex (Invitrogen) en geles NuPAGE 4-Bis

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ambos anticuerpos en un experimento de lisis con PBMC derivadas de un donante CD16 158V/V eran tres veces más bajos que los valores obtenidos en un diseño idéntico con PBMS procedentes de un donante CD16 158F/F. En resumen, una reducción de como máximo 40 veces de la concentración de IGN314 conduce al mismo efecto de lisis de ADCC (EC50) en comparación con IGN311 (Ovcar-3, comparar en la Tabla 1) y esta reducción es independiente del fenotipo de CD16 de las células efectoras (158V/V ó 158F/F).

Tabla 1: comparación entre los potenciales líticos de IGN311 e IGN314 sobre líneas celulares con diferente densidad de diana Lewis-Y utilizando células efectoras (NK) de ambos fenotipos de CD16158 (IMF: intensidad media de fluorescencia; EC50: concentración efectiva al 50%).

Línea celular diana: Densidades de Lewis-Y (IMF) Fenotipo de CD16 158 de células efectoras IGN311 (µg/ml) IGN314 (µg/ml) Factor de mejora

OVCAR-3: 435 V/V 0,315 ± 0,2 0,008 ± 0,005 39

OVCAR-3: 435 F/F 0,993 ± 0,3 0,025 ± 0,01 40

SK-BR-3: 213 V/V 1,040 ± 0,1 0,144 ± 0,02 7

TF-1: 109 V/V 5,318 ± 3,2 0,366 ± 0,06 15

En un segundo conjunto de experimentos de lisis utilizando células diana SK-BR-3, se comparó el potencial lítico de IGN314 para la activación del complemento (CDC) con el de IGN311 y con el de IGN311 desglicosilado. IGN311 mostró la curva de lisis esperada (valor de EC50 de 19,6 ± 1,5 µg/ml), mientras que la actividad lítica mediada por el complemento de IGN314 se encontraba drásticamente reducida en los valores máximos así como en las concentraciones EC50. IGN311 desglicosilado no mostró ninguna actividad lítica en absoluto.

Efectos séricos

En el suero natural se requieren concentraciones elevadas de anticuerpos IgG1 terapéuticos para compensar la inhibición de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos por parte de la inmunoglobulina G endógena en exceso. Los niveles séricos normales de IgG bloquean la unión de un anticuerpo IgG1 terapéutico al receptor de IgG de baja afinidad (CD16), el cual se encuentra presente sobre las células NK. Conjuntamente con CD64, dichos receptores de Fcγ son los receptores celulares principales que median en la ADCC.

Una posibilidad para superar el efecto inhibidor de la IgG sérica es la utilización de cantidades elevadas del anticuerpo terapéutico. Sin embargo, este enfoque resulta costoso y podría asociarse a efectos secundarios relacionados con la dosis causados por una mayor reactividad cruzada con el tejido normal, una actividad del complemento incrementada, efectos secundarios severos de la primera dosis, la inducción de una respuesta de anticuerpo humano anti-humano (HAHA) o la generación de complejos inmunológicos. Otro enfoque es la utilización de anticuerpos terapéuticos que han sido manipulados para presentar una afinidad mejorada para los receptores de Fcγ. Para la unión de los anticuerpos a FcγR, resulta esencial la presencia de oligosacáridos unidos covalentemente al residuo Asn297 conservado en la región CH2 de la cadena pesada de anticuerpo (figura 5, panel A) y se ha sugerido que las estructuras de carbohidrato estabilizan una conformación que facilita la unión. Tal como se ilustra en la figura 5, panel B, Asn297 se encuentra situado contiguamente al sitio de unión de receptor; sin embargo, se ha demostrado que los dominios carbohidrato se encuentran orientados alejándose de la interfaz sin realizar contactos específicos con el receptor.

Con respecto al enfoque de glicomodificación, puede incrementarse la actividad de ADCC de los anticuerpos mediante la modificación de su glicosilación, de un núcleo fucosilado de tipo complejo típico a una estructura sin esta fucosilación nuclear. Este tipo de anticuerpos desfucosilados pueden generarse mediante cotransfección de genes que afectan al aparato de glicosilación, mediante la expresión en huéspedes de producción que no presentan enzimas específicos de glicosilación o mediante la alteración de la expresión de los enzimas respectivos.

Anteriormente se ha demostrado que una variante glicomanipulada del anticuerpo humanizado IGN311 específico de Lewis-Y, sin los residuos de fucosa nucleares, muestra una actividad de ADCC incrementada en 29 veces sobre las células tumorales SK-BR-5 positivas para Lewis-Y en comparación con el anticuerpo de tipo salvaje portador del patrón característico de oligosacáridos nucleares fucosilados N-ligados (documento WO nº 2004/062556). Se generó IGN311 desfucosilado, denominado IGN312, mediante ingeniería genética de la maquinaria de glicosilación del huésped productor de anticuerpos mediante la cotransfección transitoria de genes de acetil-glicosaminiltransferasa III y cadenas pesada y ligera de IGN311 en células renales embrionarias humanas-antígeno nuclear del VEB. Con la presente invención se demostró un incremento de hasta 40 veces en la actividad de ADCC mediante la expresión de los genes de IGN311 para cadenas pesada ya ligera en un sistema de expresión vegetal glico-optimizado alternativo, es decir, el musgo Physcomitrella patens con inactivación de los genes de β1,2-xilosiltransferasa y de α1,3-fucosiltransferasa. En resumen, mediante la utilización de ambos enfoques (sistemas de expresión deficientes en fucosilo de mamífero y vegetal), se ha demostrado un incremento significativo de la potencia de ADCC del anticuerpo monoclonal humanizado terapéutico IGN314 que permite minimizar la dosis terapéutica necesaria. La actividad de ADCC mejorada del anticuerpo glicomanipulado se debe por lo menos en parte a una unión

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Claims

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