KR20120087882A - 효소적 항체 가공 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 제조 방법을 포함한다: a) 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 함유하는 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 제공하는 단계, b) 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 식물 기원, 예를 들어, 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제 (EC 3.2.1.22) 와 인큐베이션하는 단계, c) 인큐베이션된 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용하고, 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하여, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 제조하는 단계.
Description
본 발명은 재조합적으로 제조된 면역글로불린의 효소적 다운스트림 가공 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 효소 처리에 의한 친화성 크로마토그래피 후 전장 면역글로불린 또는 면역글로불린 Fc-부분의 (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스 함량의 개질 방법에 관한 것이다.
진핵 세포로부터 수득된 폴리펩티드는 글리코실화 폴리펩티드로서 제조된다. 당구조는 번역후 효소적 개질로서 아미노산 골격에 부착된다.
글리코실트랜스페라아제는 당단백질, 프로테오글리칸 및 당지질을 비롯한 폴리펩티드의 당구조의 생합성 조정에 참여하는 추정되는 250-300 개의 상이한 세포내, 막-결합 효소의 기능적 계열로서 인지된다. 글리코실트랜스페라아제는 그들의 뉴클레오티드 당단류 주게 특이성에 근거하여 분류된다. 예를 들어, 갈락토실트랜스페라아제는 활성화된 당단류 주게로서 UDP-갈락토오스를 사용하는 글리코실트랜스페라아제의 하위 세트인 반면, 시알릴트랜스페라아제는 CMP-시알산을 사용하고 푸코실트랜스페라아제는 GDP-푸코오스를 사용한다 (Shaper, N.L., et al., J. Mamm. Gland Biol. Neopl. 3 (1998) 315-324).
인간에서 1% 정도의 순환 IgG 항체가 올리고당류 잔기-알파-갈락토실과 반응하므로 다양한 포유동물 세포에 대한 알파-갈락토실 에피토프의 개질은 특히 관심이 있다. "항-Gal" 이라고 지칭되는 상기 천연 항체는 이전에, 생화학적으로 규정된 당지질 상의 말단 Gal(α1,3)Gal(β1,4)GlcNAc-R 에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (Galili, U., et al., J. Exp. Med. 162 (1985) 573-582; Galili, U., et al., J. Exp. Med. 165 (1987) 693-704). 다양한 유핵 세포에 대한 방사선 표지된 반데이라에아 (Bandeiraea) (Griffonia) 심플리시폴리아 (simplicifolia) IB4 렉틴의 결합 측정은 항-Gal 에 결합하는 세포가 106 내지 3.5 x 107 알파-갈락토실 에피토프를 발현하는 것을 암시하고, 이들의 대부분은 항-Gal 특이성에 근거하여 Gal(α1,3)Gal(β1,4)GlcNAc-R 의 구조를 갖는 것으로 보인다. 인간 세포 유래의 상기 에피토프의 부재는 효소 (α1,3)갈락토실트랜스페라아제의 활성 감소를 야기한다 (Galili, U., et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 17755-17762).
쥣과 기원 (Cummings, R.D. and Mattox, S.A., J. Biol. Chem. 263 (1988) 511-519; Blake, D.A., 및 Goldstein, I.J., J. Biol. Chem. 256 (1981) 5387-5393; Elices, M.J., Blake, D.A., 및 Goldstein, I.J. J. Biol. Chem. 261 (1986) 6064-6072), 토끼 기원 (Basu, M., and Basu, S., J. Biol. Chem. 248 (1973) 1700-1706; Betteridge, A., and Watkins, W.M., Eur. J. Biochem. 132 (1983) 29-35), 돼지 기원 및 소 기원 (Blanken, W.M., and Van den Eijnden, D.H., J. Biol. Chem. 260 (1985) 12927-12934) 의 세포의 골지체에서의 Gal(α1,3)에피토프의 합성은 효소 (α1,3)갈락토실트랜스페라아제에 의해 촉매되는 것으로 입증되었다.
인간에 대한 적용을 위해 의도되는 폴리펩티드에서, (α1,3)글리코시드로 결합된 말단 갈락토오스 잔기의 존재는 상기 당구조가 인간 면역계에 의한 반응을 도출할 것이므로 최소화되어야만 한다. 이것은 예를 들어, 치료적 폴리펩티드의 당구조 내에 (α1,3)글리코시드로 결합된 말단 갈락토오스 잔기를 도입하지 않는 치료적 폴리펩티드의 재조합체 제조를 위한 세포주의 시간-소모적 발달에 의해 달성될 수 있다. 미정제 폴리펩티드의 다운스트림 가공에 일반적으로 사용되는 크로마토그래피 방법으로는 Gal(α1,3)-함유 당구조가 제거될 수 없다.
EP 0 255 153 호에서, 1,4 연결 베타-D-만노피라노실 단위의 주쇄에 부착된 1,6 연결 알파-D-갈락토피라노실 단위의 분할에 의해 갈락토만난의 갈락토오스 함량을 감소시킬 수 있는 α-갈락토시다아제의 제조 방법이 보고되어 있다. 면역글로불린 G-연결 올리고당의 구조에 근거한 임상 시험 방법이 EP 0 698 793 호에 보고되어 있다. EP 1 878 747 호에는 당-조작된 항체가 보고되어 있다. 면역글로불린 글리칸의 선별적 표지화가 WO 2007/071347 호에 보고되어 있다. WO 1997/016064 호에는 이종이식 거부 감소를 위한 방법 및 조성물이 보고되어 있다. 효소적 처리, 특정 조건하에서의 발현, 특정 숙주 세포의 사용, 및 혈청과의 접촉에 의해 제조된, 실질적으로 동종이고 비-시알릴화된 당형태 (glycoform), 예컨대 G0 및 G2 를 갖는 항체 제제가 WO 2007/024743 호에 보고되어 있다.
WO 2008/057634 호에는 항-염증성이 향상되고 세포독성 특성이 감소된 폴리펩티드 및 관련 방법이 보고되어 있다. 단백질분해 내성 항체 제제가 WO 2007/024743 호에 보고되어 있다.
발명의 요약
식물 기원, 예를 들어, 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제 (EC 3.2.1.22) 가 면역글로불린 CH2 도메인 내 아미노산 Asn297 에서의 올리고당으로부터 (α1,3)글리코시드로 결합된 말단 갈락토오스 잔기를 선택적으로 제거하는데 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 비-식물 기원 유래의 (α1,3)갈락토시다아제는 (β1,4)갈락토시다아제 부 반응성을 갖는 것으로 발견되었고/거나 삼중- 또는 사중-안테나구조 올리고당과는 반응하지 않거나 거의 반응하지 않았다.
그러므로, 본원에서는 하기 단계를 하기 순서로 포함하는, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 제조 방법을 보고한다:
- 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 함유하는 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 제공하는 단계,
- 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 말단 단당류 잔기를 절단하는 효소와 인큐베이션하는 단계,
- 인큐베이션된 친화성 크로마토그래피 용리액을 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 단백질 A 크로마토그래피 물질에 대한 결합에 적합한 조건 하에서 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용하고, 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하여, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 제조하는 단계.
하나의 구현예에서, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 비-환원 말단에서 단당류 잔기를 절단하는 효소는 식물 기원의 효소이다. 하나의 구현예에서, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 비-환원 말단에서 단당류 잔기를 절단하는 효소는 α-D-갈락토시드 갈락토히드롤라아제 (EC 3.2.1.22) 또는 멜리비아제 (Melibiase) 로부터 선택된다. 또다른 구현예에서, 효소는 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제 (EC 3.2.1.22) 이다. 또다른 구현예에서, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 말단 단당류 잔기는 (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스 잔기이다.
하나의 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 비-환원 말단에서 단당류 잔기를 절단하는 효소와 인큐베이션하는 단계는, 하기 단계를 포함한다:
- 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 (α1,3)글리코시다아제와 인큐베이션하는 단계,
- 인큐베이션 혼합물로부터 샘플을 취하는 단계,
- 하기 단계 세트 중 하나를 수행하는 단계
o 샘플을 단백질 A 코팅 세파로오스 비이드에 적용한 후 비이드를 세정하는 단계,
o 단백질 A 세파로오스 비이드로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하는 단계,
o 글리코시다아제/시알리다아제 소화를 위해 완충제 조건을 조정하는 단계, 및
o 모든 N-글리칸을 절단하기 위해 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 글리코시다아제/시알리다아제로 인큐베이션하는 단계, 및
o MALDI 분석 전에 소화물의 분취액을 취하는 단계,
또는
o 샘플을 단백질 A 코팅 자석 비이드에 적용한 후 비이드를 세정하는 단계,
o 비이드를 글리코시다아제와 인큐베이션하고 절단된 올리고당을 회수하는 단계, 및
o 절단된 올리고당을 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계,
- 질량 분석에 의해 절단된 올리고당류 내 당구조의 비-환원 말단에서의 단당류 잔기의 종류 및 양을 측정하는 단계,
- 효소에 의해 절단될 수 있는 당구조의 비-환원 말단에서 모든 단당류 잔기가 절단될 때까지 인큐베이션을 지속하는 단계.
더욱 추가의 구현예에서 방법은 제 1 단계로서 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
- 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계,
- 세포를 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계,
- 세포 또는 배양 배지로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하는 단계,
- 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 단백질 A 크로마토그래피 물질에 대한 면역글로불린의 결합에 적합한 조건하에서 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용하고, 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린을 회수하는 단계.
하나의 구현예에서, 방법은 최종 단계로서 하기 단계를 포함한다:
- 규정된 당구조를 갖는 제조된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 1 내지 3 회의 크로마토그래피 단계로 정제하는 단계.
하나의 구현예에서, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 비-환원 말단에서 단당류 잔기를 절단하는 효소는 식물 기원의 효소이다. 또다른 구현예에서, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 비-환원 말단에서 단당류 잔기를 절단하는 효소는 α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 만노시다아제, 푸코시다아제, 또는 시알리다아제로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 또다른 구현예에서, 포유동물 세포는 햄스터 세포, 또는 쥣과 세포, 또는 토끼 세포, 또는 양 세포, 또는 이들의 하이브리도마 세포이다. 더욱 추가의 구현예에서 세포는 CHO 세포, NS0 세포, BHK 세포 또는 SP2/0 세포이다.
본원에 보고된 추가의 양상은 재조합적으로 제조된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조로부터 말단 (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스 잔기의 절단을 위한 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제 (EC 3.2.1.22) 의 용도이다.
발명의 상세한 설명
본원에서는, 예를 들어, 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제 (EC 3.2.1.22) 가 면역글로불린 CH2 도메인 내 아미노산 잔기 Asn297 에 부착된 올리고당으로부터 (α1,3)글리코시드로 결합된 말단 갈락토오스 잔기를 선택적으로 제거하는데 사용될 수 있다는 것을 보고한다. 식물 이외의 다른 기원의 (α1,3)갈락토시다아제는 (β1,4)갈락토시다아제 부 반응성을 갖는 것으로 발견되었고/거나 삼중- 또는 사중-안테나구조 올리고당과는 반응하지 않거나 거의 반응하지 않았다 (표 1 참조).
표 1: 상이한 기원의 (α1,3)갈락토시다아제의 비교
그러므로, 하나의 구현예에서, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 말단 단당류 잔기를 절단하는 본원에 보고된 방법에서의 효소는 식물 기원의 효소이다. 또다른 구현예에서, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 말단 단당류 잔기를 절단하는 본원에 보고된 방법에서의 효소는 (i) (α1,3)글리코시드로 결합된 당 잔기를 절단하는 효소, 및 (ii) (α1,4)글리코시드로 결합된 당 잔기를 절단하지 않는 효소, 및 (iii) 이중-, 삼중- 및 사중-안테나구조 올리고당으로부터의 잔기를 절단하는 효소이다.
본원에서는 하기 단계를 포함하는, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 제조 방법을 보고한다:
- 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 함유하는 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 제공하는 단계,
- 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을, 생 커피콩 유래의 (α1,3)-갈락토시다아제 (EC 3.2.1.22) 와 인큐베이션하는 단계,
- 인큐베이션된 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을, 임의로 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 단백질 A 크로마토그래피 물질에 대한 결합에 적합한 조건 하에서 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용하고, 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하여, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 제조하는 단계.
인간 면역글로불린은 코어 푸코실화 이중안테나구조 (biantennary) 복합체 올리고당을 갖는 중쇄 CH2 도메인의 위치 297 의 아스파라긴 잔기 (Asn297) (Kabat 에 따른 면역글로불린 아미노산 잔기 넘버링, 하기 참조) 에서 주로 글리코실화된다. 이중안테나구조 당구조는 각각의 분지 내에 2 개까지의 연속 갈락토오스 (Gal) 잔기에 의해 종결될 수 있다. 분지는 중앙 만노오스 잔기에 대한 글리코시드 결합에 따라 (1,6) 및 (1,3) 으로 표시된다. G0 으로서 표시되는 당구조는 갈락토오스 잔기를 함유하지 않는다. G1 로서 표시되는 당구조는 하나의 분지 내에 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 함유한다. G2 로서 표시되는 당구조는 각각의 분지 내에 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 함유한다 (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53). 인간 불변 중쇄 영역은 문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)], 및 [Brueggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527] 에 상세히 보고되어 있다. 면역글로불린 Fc 부분의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들어, 문헌 [Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207] 에 기재되어 있다.
"면역글로불린" 이라는 용어는 다양한 형태의 면역글로불린, 예컨대 인간 면역글로불린, 인간화 면역글로불린, 키메라성 면역글로불린, 또는 T-세포 항원 제거 면역글로불린을 표시하고 포함한다 (예를 들어, WO 98/33523 호, WO 98/52976 호, 및 WO 00/34317 호). 하나의 구현예에서, 본원에 보고된 방법에서 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 면역글로불린의 유전적 조작은 예를 들어, 문헌 [Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 및 US 5,204,244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125] 에 기재되어 있다.
면역글로불린은 일반적으로 2 개의 소위 전장 경쇄 폴리펩티드 (경쇄) 및 2 개의 소위 전장 중쇄 폴리펩티드 (중쇄) 를 포함한다. 전장 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 각각은 항원과 상호작용하는 결합 영역을 포함하는 가변 도메인 (가변 영역) (일반적으로 전장 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 부분) 을 함유한다. 전장 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 각각은 불변 영역 (일반적으로 카르복실 말단 부분) 을 포함한다. 전장 중쇄의 불변 영역은 i) Fc 감마 수용체 (FcγR) 를 갖는 세포, 예컨대 포식 세포, 또는 ii) 또한 브람벨 (Brambell) 수용체로서 알려진 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 를 갖는 세포에 대한 면역글로불린의 결합을 매개한다. 이것은 또한 성분 (C1q) 와 같은 고전적인 보체계의 인자를 포함하는 일부 인자에 대한 결합을 매개한다. 전장 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인은 상이한 분절, 즉, 4 개의 골격 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (CDR) 을 포함한다. "전장 면역글로불린 중쇄" 는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH), 면역글로불린 불변 도메인 1 (CH1), 면역글로불린 경첩 영역, 면역글로불린 불변 도메인 2 (CH2), 면역글로불린 불변 도메인 3 (CH3), 및 서브계열 IgE 의 면역글로불린인 경우 임의로 면역글로불린 불변 도메인 4 (CH4) 로 이루어지는 폴리펩티드이다. "전장 면역글로불린 경쇄" 는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인 (CL) 으로 이루어지는 폴리펩티드이다. 전장 면역글로불린 사슬은 CL-도메인과 CH1 도메인 사이 및 전장 면역글로불린 중쇄의 경첩 영역 사이의 상호-폴리펩티드 디술피드 결합을 통해 서로 연결된다.
"면역글로불린 단편" 이라는 용어는 본 출원에서 전장 면역글로불린 중쇄의 적어도 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 면역글로불린 단편은 또한 부가적인 비-면역글로불린 유래 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
최근, 면역글로불린의 글리코실화 패턴, 즉 부착된 당구조의 당류 조성 및 군집이 생물학적 특성에 큰 영향을 주는 것으로 보고되었다 (예를 들어, Jefferis, R., Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11-16 참조). 포유동물 세포에 의해 생성된 면역글로불린은 2-3 질량% 의 올리고당을 함유한다 (Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 (1985) 5551-5557). 이것은 예를 들어, 마우스 기원의 계열 G 의 면역글로불린 (IgG) 내 2.3 올리고당류 잔기 (Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394) 및 인간 기원의 IgG 내 2.8 올리고당류 잔기 (Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457) 에 대한 계열 G 의 면역글로불린 (IgG) 에 상당하고, 이중 2 개는 일반적으로 Asn297 의 Fc-영역에 위치하고 나머지는 가변 영역에 위치한다 (Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31).
본 출원에서 사용되는 "당구조" 라는 용어는 면역글로불린 내에 특정화된 아미노산 잔기에 부착된 모든 올리고당을 나타내고 포함한다. 세포의 글리코실화 이종성으로 인해, 재조합적으로 제조된 면역글로불린은 특정화된 아미노산 잔기에서 단일의, 규정된 N- 또는 O-연결된 올리고당을 포함할 뿐 아니라, 각각 동일한 아미노산 서열을 갖지만 특정화된 아미노산 위치에서 상이하게 구성된 올리고당을 갖는 폴리펩티드 (면역글로불린 분자) 의 혼합물이다. 그러므로, "당구조" 라는 용어는 재조합적으로 제조된 면역글로불린의 특정화된 아미노산 위치에 부착된 올리고당류 그룹, 즉, 부착된 올리고당의 이종성을 나타낸다. 본 출원에서 사용되는 "올리고당" 이라는 용어는 2 개 이상의 공유 연결된 당단류 단위를 포함하는 중합체성 당류를 나타낸다.
본 발명에서 상이한 N- 또는 O-연결 올리고당의 표기법에 대해 개개의 당 잔기는 올리고당류 분자의 비-환원 말단에서 환원 말당 방향으로 나열된다. 최장 당 사슬이 표기법을 위한 기본 사슬로서 선택되었다. N- 또는 O-연결 올리고당의 환원 말단은 단당류 잔기이며, 이것은 면역글로불린의 아미노산 골격의 아미노산에 직접 결합된 반면, 기본 사슬의 환원 말단으로서 반대 종결에 위치하는 N- 또는 O-연결 올리고당의 말단은 비-환원 말단이라고 불린다.
본 출원에서 사용되는 "친화성 크로마토그래피" 라는 용어는 "친화성 크로마토그래피 물질" 을 사용하는 크로마토그래피 방법을 나타낸다. 친화성 크로마토그래피에서 폴리펩티드는 크로마토그래피 물질의 크로마토그래피 기능 그룹에 대한 정전기 상호작용, 소수성 결합 및/또는 수소 결합 형성에 따라, 이들의 생물학적 활성 또는 화학적 구조에 근거하여 분리된다. 친화성 크로마토그래피 물질로부터 특이적으로 결합된 폴리펩티드를 회수하기 위해, 경쟁자 리간드가 첨가될 수 있거나, 또는 완충제의 pH 값, 극성 또는 이온 강도와 같은 크로마토그래피 조건이 변화될 수 있다. 예시적인 "친화성 크로마토그래피 물질" 은 금속 킬레이트 크로마토그래피 물질, 예컨대 Ni(II)-NTA 또는 Cu(II)-NTA, 또는 면역글로불린 친화성 크로마토그래피 물질, 예컨대 본원에 보고된 방법의 하나의 구현예에서, 공유 연결된 단백질 A 또는 단백질 G 를 포함하는 크로마토그래피 물질, 또는 효소 결합 친화성 크로마토그래피 물질, 예컨대 크로마토그래피 기능 그룹으로서 공유 결합된 효소 기질 유사체, 효소 보조인자, 또는 효소 억제제를 포함하는 크로마토그래피 물질, 또는 렉틴 결합 크로마토그래피 물질, 예컨대 크로마토그래피 기능 그룹으로서 공유 연결된 다당류, 세포 표면 수용체, 당단백질, 또는 미손상 세포를 포함하는 크로마토그래피 물질이다.
"면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 비-환원 말단에서 단당류 잔기를 절단하는 효소" 라는 용어는 당구조의 비-환원 말단에서 단당류 잔기를 선택적으로 절단하는 효소를 나타낸다. 이러한 효소는 식물 기원의 효소이다. 하나의 구현예에서, 효소는 식물 기원의 효소이고, α-갈락토시다아제 ((α1,3)-, (α1,4)-, 및/또는 (α1,6)글리코시드로 결합된 갈락토오스 잔기의 절단), β-갈락토시다아제 ((β1,4)글리코시드로 결합된 갈락토오스 잔기의 절단), 만노시다아제 (만노오스 잔기의 절단), 푸코시다아제 (푸코오스 잔기의 절단), 및 시알리다아제 (시알산 잔기의 절단) 로부터 선택된다. 예시적인 α-갈락토시다아제는 (α1,3)갈락토시다아제, 예컨대 EC 3.2.1.22 또는 EC 2.4.1.151 (예를 들어, Dabkowski, P.L., et al., Transplant Proc. 25 (1993) 2921 및 Yamamoto, F., et al., Nature 345 (1990) 229-233 참조) 이다. 하나의 구현예에서, 효소는 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제 (EC 3.2.1.22) 이다.
"규정된 당구조" 라는 용어는 본 출원에서 당구조의 비-환원 말단 각각에서의 단당류 잔기가 특정 종류의 것이고, 당구조의 나머지에 대해 특이적 글리코시드 결합으로 연결된 당구조, 즉, 모든 추가의 당단류 잔기가 절단된 당구조를 나타낸다. "규정된 당구조" 라는 용어는 본 출원에서 특정 종류의 것이고 당구조에 대해 특이적 글리코시드 결합으로 연결된 당구조의 비-환원 말단에서의 모든 단당류 잔기가 절단된 당구조, 즉 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 당구조가 당구조의 나머지에 대해 특이적 글리코시드 결합을 통해 연결된 특이적 말단 단당류 잔기가 감소되거나 결여된 당구조를 나타낸다. 예를 들어, 하나의 구현예에서와 같이, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 (α1,3)갈락토시다아제와 인큐베이션하는 경우에는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 모든 당구조는 비-환원 말단에서 (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스 단당류 잔기가 결여되어 있다, 즉, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편은 (α1,3)글리코시드로 결합된 말단 갈락토오스 잔기가 결여된 규정된 당구조를 갖는다.
본 출원에서 사용되는 "~ 에 적용하는" 이라는 구절 및 이의 문법적 동등 구절은 관심의 성분을 함유하는 용액을 정지상과 접촉시키는 정제 방법의 일부 단계를 나타낸다. 정제되어지는 관심의 성분을 함유하는 용액은 정지상을 통해 통과하여 정지상과 용액 내 성분 사이의 상호작용을 발생시킨다. 예를 들어, pH, 전도성, 염 농도, 온도, 및/또는 유속과 같은 조건에 따라, 용액의 일부 성분이 정지상에 결합되어 그와 함께 용액으로부터 제거된다. 기타 성분은 용액에 남는다. 용액 내에 남는 성분은 플로우-쓰루에서 발견될 수 있다. "플로우-쓰루 (flow-through)" 는 크로마토그래피 장치의 통과 후 수득된 용액을 나타내며, 이것은 관심의 성분을 함유하는 적용된 용액 또는 완충제일 수 있고, 이는 컬럼을 플러쉬하는데 또는 정지상에 결합된 하나 이상의 성분의 용리를 야기하는데 사용될 수 있다. 관심의 성분은 실질적으로 균질한 형태의 성분을 수득하기 위한 예를 들어, 침전, 염석, 초여과, 투석여과 (diafiltration), 동결건조, 친화성 크로마토그래피, 또는 용매 부피 감소와 같이, 당업자에게 친숙한 방법에 의한 정제 단계 후 용액으로부터 회수될 수 있다.
당구조가 본원에 보고된 방법으로 개질될 수 있는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편은 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 재조합 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 진핵 세포 내 단백질 발현, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 후속 단리 및 약학적으로 허용가능한 순도로의 정제를 포함한다. 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 발현을 위해서는, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되어 있는 하이브리도마 세포 또는 진핵 세포가 사용된다. 하나의 구현예에서, 진핵 세포는 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK 293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, BHK 세포, 토끼 세포, 또는 양 세포로부터 선택된다. 또다른 구현예에서, 진핵 세포는 CHO 세포, HEK 세포, 또는 토끼 세포로부터 선택된다. 발현 후, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편은 세포로부터 회수된다 (용해 후 상청액으로부터 또는 세포로부터). 일반적인 면역글로불린의 재조합 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고 예를 들어, [Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880] 의 리뷰 논문에 보고되어 있다.
면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 정제는 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로오스 젤 전기영동을 비롯한 표준 기술, 및 당업계에 공지된 기타 기술 (예를 들어, Ausubel, F., et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) 참조) 에 의해 세포 성분 또는 기타 오염물, 예를 들어, 기타 세포성 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해 수행될 수 있다. 예컨대 미생물 단백질로의 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 교환), 친황성 (thiophilic) 흡착 (예를 들어, 베타-메르캅토에탄올 및 기타 SH 리간드로의), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어, 페닐-세파로오스, 아자-아레노필릭 수지, 또는 m-아미노페닐보론산으로의), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질로의), 크기 배재 크로마토그래피, 및 전기영동 방법 (예컨대 젤 전기영동, 모세관 전기영동), 뿐 아니라 이들의 조합, 예컨대 미생물 단백질로의 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피와 같은 상이한 방법도 또한 단백질 정제에 대해 성립되고 널리 사용된다 (예를 들어, Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102 참조).
재조합적으로 제조된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 당구조는 사용되는 세포주 및 사용되는 배양 조건에 의해 결정될 것이다. 통상적인 다운 스트림 공정 기술로는, 특이적 당구조의 선택적인 제거는 가능하지 않다.
본원에 보고된 방법으로는, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편은 다운 스트림 공정에서 수득될 수 있다. 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 당구조의 비-환원 말단에서의 (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스 잔기의 제거를 위해서는 식물 기원, 특히 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제만이 유일하게 적합하다는 것이 밝혀졌다.
본원에 보고된 방법으로 재조합적으로 제조된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 다운 스트림 공정 동안의 (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스 잔기의 제거는
- 재조합적으로 제조된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 면역원성을 감소시키는 방법을 제공하고,
- 말단 (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스 잔기를 갖는 당구조를 제조하지 않는 세포주를 수득/선별/사용할 필요성을 없애고,
- 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 부가적인 인큐베이션 단계로 인했던, 부가적인 인큐베이션이 없는 방법과 비교하여 생성물 품질을 변화시키지 않고,
- 다운 스트림 공정 동안, 즉, 발현이 시험관 내에서 종료된 후 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 제조하는 방법을 제공하고,
- 원치 않는 당구조를 갖는 면역글로불린을 제거하지는 없으나 모든 면역글로불린이 규정된 당구조로 효소적으로 전환되므로, 개선된 수율의 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린을 제공한다.
그러므로, 본원에 보고된 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 제조 방법이다:
- 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 말단 단당류 잔기를 특이적으로 절단하는 효소와 인큐베이션하는 단계.
하나의 구현예에서, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 말단 단당류 잔기를 특이적으로 절단하는 효소는 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제이다. 또다른 구현예에서, 말단 당단류는 (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스이다.
그러므로, 본원에 보고된 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 제조 방법이다:
- 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 함유하는 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 제공하는 단계,
- 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 말단 단당류 잔기를 특이적으로 절단하는 효소와 인큐베이션하는 단계,
- 효소적으로 개질된 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용하고, 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하여, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 제조하는 단계.
효소적 반응 과정을 모니터링하기 위해, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 글리코실화 프로파일의 온라인 측정이 수행될 수 있다. 그러므로, 본원에 보고된 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 제조 방법이다:
- 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 함유하는 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 제공하는 단계,
- 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액에 함유된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 하기 단계 a) ~ g) 에 의해 개질하는 단계:
a) 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 말단 단당류 잔기를 특이적으로 절단하는 효소와 인큐베이션하는 단계,
b) 인큐베이션 혼합물로부터 샘플을 취하는 단계,
c) 샘플을 단백질 A 코팅 자석 비이드에 적용한 후 비이드를 세정하는 단계,
d) 비이드를 글리코시다아제와 인큐베이션하고 절단된 올리고당을 회수하는 단계,
e) 절단된 올리고당을 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계,
f) 질량 분석, 예를 들어 MALDI-TOF MS 에 의해 절단된 올리고당류 내 당구조의 비-환원 말단에서의 단당류 잔기의 종류 및 양을 측정하는 단계,
g) 효소에 의해 절단될 수 있는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 당구조의 비-환원 말단에서 모든 단당류 잔기가 절단될 때까지 단계 a) 내지 f) 를 반복하는 단계,
- 효소적으로 개질된 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을, 임의로 함유된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 상기 단백질 A 크로마토그래피 물질에 대한 결합에 적합한 조건 하에서 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용하고, 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하여, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 제조하는 단계.
생 커피콩 유래의 효소 (α1,3)갈락토시다아제가 놀랍게도 본원에 보고된 방법에 유용하다는 것이 밝혀졌다. 박테리아 기원의 (α1,3)갈락토시다아제는 본원에 보고된 방법에서 평가되었으나, 적합하지 않은 것으로 밝혀졌다. 모든 상기 효소는 올리고당류 내 (α1,3)글리코시드 결합을 절단할 수 있지만, 오직 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제만이 적합한 조건에서, 적합한 특이성으로, 및 적합한 기질 특이성으로, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 당구조 내 결합을 절단한다.
본원에 보고된 추가의 양상은 하기 단계를 포함하는, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 제조 방법이다:
- 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계,
- 세포를 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계,
- 세포 또는 배양 배지로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하는 단계,
- 회수된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용하고, 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 용리함으로써 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린을 회수하는 단계,
- 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액에 함유된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 하기 단계 a) ~ g) 에 의해 개질하는 단계:
a) 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 말단 단당류 잔기를 특이적으로 절단하는 효소와 인큐베이션하는 단계,
b) 인큐베이션 혼합물로부터 샘플을 취하는 단계,
c) 샘플을 단백질 A 코팅 자석 비이드에 적용한 후 비이드를 세정하는 단계,
d) 비이드를 글리코시다아제와 인큐베이션하고 절단된 올리고당을 회수하는 단계,
e) 절단된 올리고당을 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계,
f) 질량 분석, 예를 들어 MALDI-TOF MS 에 의해 절단된 올리고당의 비-환원 말단에서의 단당류 잔기의 종류 및 양을 측정하는 단계,
g) 효소에 의해 절단될 수 있는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 당구조의 비-환원 말단에서 모든 단당류 잔기가 절단될 때까지 단계 a) 내지 f) 를 반복하는 단계,
- 효소적으로 개질된 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용하고, 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하여, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 제조하는 단계,
- 임의로, 규정된 당구조를 갖는 제조된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 1 내지 3 회의 부가적인 크로마토그래피 단계로 정제하는 단계.
예를 들어, 세포 배양 방법에 의해 제조된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 정제를 위해, 일반적으로 상이한 크로마토그래피 단계의 조합이 사용될 수 있다. 보통 단백질 A 친화성 크로마토그래피 후에 1 또는 2 회의 부가적인 분리 단계가 후속될 수 있다. 하나의 구현예에서, 부가적인 크로마토그래피 단계는 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계 또는 반대이다. 최종 정제 단계는 응집된 면역글로불린, 잔류 HCP (숙주 세포 단백질), DNA (숙주 세포 핵산), 바이러스, 또는 내독소와 같은 미량의 불순물 및 오염물의 제거를 위한 소위 "연마 단계" 이다. 하나의 구현예에서, 최종 정제 단계는 플로우-쓰루 방식의 음이온 교환 크로마토그래피이다.
일반적인 크로마토그래피 방법 및 이들의 용도는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다 [Chromatography, 제 5 판, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F., 및 Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 또는 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York].
그 당시 본 발명으로 N-말단 돌연변이 또는 비-돌연변이 IL-15 부분 및 C-말단 Fc 부분으로 이루어진 융합 단백질을 제조하였고, 본 실험실에서 충분한 양으로 이용가능하였다. 상기 융합 단백질은 예시로서 사용된 것으로 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 그러므로, 하나의 구현예에서, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편은 SEQ ID NO: 1 또는 2 의 인간 기원의 인터류킨-15 부분 및 Fc 부분의 융합 단백질이다. 이러한 분자는 WO 2005/100394 호의 실시예 1 및 SEQ ID NO: 3 및 4 (쥣과 Fc 부분을 갖는) 에 보고되어 있다.
하기 실시예, 도면 및 서열은 본 발명의 이해를 돕고자 제공되는 것으로, 이의 참 범주는 특허청구범위에 언급되어 있다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 언급된 절차에 대한 개질이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
서열 목록의 설명
SEQ ID NO :1 인간 돌연변이 인터류킨 15/Fc 의 핵산 서열.
SEQ ID NO :2 인간 돌연변이 인터류킨 15/Fc 의 아미노산 서열.
도 1 돌연변이 IL15FC-Fc 융합 폴리펩티드의 참조 샘플 (상부) 및 잔토모나스 마니호티스 (Xanthomonas manihotis) 유래의 (α1,3)갈락토시다아제로의 인큐베이션 (하부) 의 총 이온 크로마토그램. 상기 효소가 또한 (β1,4)갈락토시다아제 활성을 갖는다는 것을 볼 수 있다.
도 2 돌연변이 IL15FC-Fc 융합 폴리펩티드의 참조 샘플 (상부) 및 에스케리챠 콜라이 (Escherichia Coli) 유래의 (α1,3)갈락토시다아제로의 인큐베이션 (하부) 의 총 이온 크로마토그램. 이중안테나구조 올리고당에서 오로지 (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스 만이 제거되었고, 상기 효소가 또한 (β1,4)갈락토시다아제 활성을 갖는다는 것을 볼 수 있다.
도 3 돌연변이 IL15FC-Fc 융합 폴리펩티드의 참조 샘플 (상부) 및 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제로의 인큐베이션 (하부) 의 총 이온 크로마토그램. (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스가 완전히 제거되었고, 상기 효소가 (β1,4)갈락토시다아제 활성을 갖지 않는다는 것을 볼 수 있다.
도 2 돌연변이 IL15FC-Fc 융합 폴리펩티드의 참조 샘플 (상부) 및 에스케리챠 콜라이 (Escherichia Coli) 유래의 (α1,3)갈락토시다아제로의 인큐베이션 (하부) 의 총 이온 크로마토그램. 이중안테나구조 올리고당에서 오로지 (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스 만이 제거되었고, 상기 효소가 또한 (β1,4)갈락토시다아제 활성을 갖는다는 것을 볼 수 있다.
도 3 돌연변이 IL15FC-Fc 융합 폴리펩티드의 참조 샘플 (상부) 및 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제로의 인큐베이션 (하부) 의 총 이온 크로마토그램. (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스가 완전히 제거되었고, 상기 효소가 (β1,4)갈락토시다아제 활성을 갖지 않는다는 것을 볼 수 있다.
실시예
1
정제된
인터류킨
-15/
Fc
융합 단백질의 제조
인터류킨-15/Fc 융합 단백질을 국제 특허 출원 WO 1997/041232 호, WO 2005/100394 호 및 WO 2005/100395 호에 보고된 데이터 및 방법에 따라 제조한다.
실시예
2
(α1,3)글리코시드로
결합된
갈락토오스
잔기의
절단
α-갈락토시다아제로의 소화
샘플을 투석에 의해 상응하는 완충제 조건 (표 2 참조) 으로 조정한 후, 효소로 인큐베이션하였다.
예를 들어:
약 1 mg/ml 의 농도를 갖는 40 ml 의 인터류킨-15/Fc 융합 단백질 용액을 1.5 mL 의 (α1,3)갈락토시다아제 (204 U/ml) 로 밤새 (16 시간) 25℃ 에서 소화시켰다.
표 2: 효소적 소화 조건
*제조사 매뉴얼에 따름
단백질
A 로의
소규모 정제
단백질 A 컬럼을 25 mM 염화나트륨 및 5 mM EDTA 를 함유하는 25 mM Tris (히드록시메틸) 아미노메탄 완충제 (TRIS) (pH 7.2) 로 평형화시켰다. 샘플을 컬럼에 적용하고, 컬럼을 평형 완충제로 세정하고 융합 단백질을 100 mM 시트레이트 완충액 (pH 3.6) 으로 용리하였다.
질량 분석용 샘플 제조
100 ㎍ 의 인터류킨-15/Fc 융합 단백질을 함유하는 샘플을 센트리콘에 의해 2 mM TRIS-HCl, pH 7.0 으로 완충제 교환시켰다. 50㎕ 의 인터류킨-15/Fc 융합 단백질을 1 ㎕ 의 N-글리코시다아제 F 및 1 ㎕ 시알리다아제로 소화시켜 단백질로부터 글리칸을 절단하고 시알산 부분을 제거한다.
이온 교환 수지 AG 50W-X8 을 물에 현탁하고 수 회 흔들었다. 수지 침강 후, 물을 폐기하였다. 이것을 3 회 수행하였다. 900 ㎕ 의 현탁액을 MICRO Bio-Spin 크로마토그래피 컬럼으로 옮기고, 1 분 동안 원심분리하였다.
소화된 샘플을 컬럼에 적용하고, 컬럼을 1 분 동안 원심분리하였다. 정제된 글리칸을 플루오-쓰루로 수집하였다. 수득된 용액을 sDHB 매트릭스 용액 (물 중 125 ㎕ 에탄올 및 125 ㎕ 10 mM 염화나트륨 중의 sDHB) 으로 1:1 희석하였다.
대안적으로는, 1㎕ 소화물의 분취액을 1 ㎕ 의 DHB 매트릭스 용액 (물 중 10 mM 염화나트륨 중의 10 mg DHB) 과 혼합하고 고진공을 사용하여 빠르게 건조시켜 MALDI-TOF 분석을 위한 균질 스팟을 수득하였다.
질량 분석
MALDI-TOF Mass Spectrometer Voyager DE Pro (Applied Biosystems 사제) 로, Reflectron Mode 방식으로 보정 스펙트럼을 획득하였다. 가속 전압 (Acceleration Voltage) 은 20000 V; 그리드 전압 (Grid Voltage) 은 76% 로, 거울 전압비 (Mirror Voltage Ratio) 는 1.12 로 설정하였다. 추출 지연 시간 (Extraction Delay Time) 은 110 ns 로 설정하였다. 습득 질량 범위는 1000 내지 5000 Da 였고, 레이저 강도 (Laser Intensity) 는 2460, 레이저 레프 속도 (Laser Rep Rate) 는 20.0 Hz 였다.
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<210> 1
<211> 1113
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid sequence of the human mutated IL15/Fc with CD5
leader peptide
<400> 1
atgcccatgg ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct 60
tcctgcctcg gaaactgggt gaatgtaata agtgatttga aaaaaattga agatcttatt 120
caatctatgc atattgatgc tactttatat acggaaagtg atgttcaccc cagttgcaaa 180
gtaacagcaa tgaagtgctt tctcttggag ttacaagtta tttcacttga gtccggagat 240
gcaagtattc atgatacagt agaaaatctg atcatcctag caaacaacag tttgtcttct 300
aatgggaatg taacagaatc tggatgcaaa gaatgtgagg aactggagga aaaaaatatt 360
aaagaatttt tggacagttt tgtacatatt gtcgacatgt tcatcaacac ttcggatccc 420
aaatctgctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 480
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 540
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 600
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 660
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 720
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 780
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 840
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 900
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 960
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1020
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1080
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1113
<210> 2
<211> 370
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of the human mutated IL15/Fc with CD5 leader
peptide
<400> 2
Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly
1 5 10 15
Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp
20 25 30
Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr
35 40 45
Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
50 55 60
Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp
65 70 75 80
Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn
85 90 95
Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
100 105 110
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Asp Ser Phe Val
115 120 125
His Ile Val Asp Met Phe Ile Asn Thr Ser Asp Pro Lys Ser Ala Asp
130 135 140
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
145 150 155 160
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
165 170 175
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
180 185 190
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
195 200 205
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
210 215 220
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
225 230 235 240
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
245 250 255
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
260 265 270
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
275 280 285
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
290 295 300
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
305 310 315 320
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
325 330 335
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
340 345 350
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
355 360 365
Gly Lys
370
Claims (11)
- 하기 단계를 포함하는, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 제조 방법:
- 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 함유하는 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 제공하는 단계,
- 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 비-환원 말단에서 단당류 잔기를 절단하는 식물 기원의 효소와 인큐베이션하는 단계,
- 인큐베이션된 친화성 크로마토그래피 용리액을 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용하고, 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하여, 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 제조하는 단계. - 제 1 항에 있어서, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 비-환원 말단에서 단당류 잔기를 절단하는 효소가 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제 (EC 3.2.1.22) 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 비-환원 말단에서 단당류 잔기를 절단하는 식물 기원의 효소와 인큐베이션하는 단계가, 하기 단계를 포함하는 방법:
- 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 (α1,3)글리코시다아제와 인큐베이션하는 단계,
- 인큐베이션 혼합물로부터 샘플을 취하는 단계,
- 하기 단계 세트 중 하나를 수행하는 단계
o 샘플을 단백질 A 코팅 세파로오스 비이드에 적용한 후 비이드를 세정하는 단계,
o 단백질 A 세파로오스 비이드로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하는 단계,
o 글리코시다아제/시알리다아제 소화를 위해 완충제 조건을 조정하는 단계, 및
o 모든 N-글리칸을 절단하기 위해 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 글리코시다아제/시알리다아제로 인큐베이션하는 단계,
또는
o 샘플을 단백질 A 코팅 자석 비이드에 적용한 후 비이드를 세정하는 단계,
o 비이드를 글리코시다아제와 인큐베이션하고 절단된 올리고당을 회수하는 단계, 및
o 절단된 올리고당을 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계,
- 질량 분석에 의해 절단된 올리고당류 내 당구조의 비-환원 말단에서의 단당류 잔기의 종류 및 양을 측정하는 단계,
- 효소에 의해 절단될 수 있는 당구조의 비-환원 말단에서 모든 단당류 잔기가 절단될 때까지 인큐베이션을 지속하는 단계. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 단계로서 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
- 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계,
- 세포를 배양하는 단계,
- 세포 또는 배양 배지로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하는 단계,
- 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용하고, 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린을 회수하는 단계. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 최종 단계로서 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
- 규정된 당구조를 갖는 제조된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 1 내지 3 회의 크로마토그래피 단계로 정제하는 단계. - 제 1 항 또는 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인 내 당구조의 비-환원 말단에서 단당류 잔기를 절단하는 상기 효소가 α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 만노시다아제, 푸코시다아제, 시알리다아제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 포유동물 세포가 햄스터 세포, 쥣과 세포, 토끼 세포, 양 세포, 또는 이들의 하이브리도마 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 세포가 CHO 세포, NS0 세포, BHK 세포 또는 SP2/0 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편이 SEQ ID NO:02 의 아미노산 잔기 18 내지 364 에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 재조합적으로 제조된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 CH2 도메인의 아미노산 아스파라긴에 부착된 당구조로부터 말단 (α1,3)글리코시드로 결합된 갈락토오스 잔기의 절단을 위한 생 커피콩 유래의 (α1,3)갈락토시다아제 (EC 3.2.1.22) 의 용도.
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