KR102293106B1 - 항체의 시험관 내 당조작 방법 - Google Patents

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Abstract

본원에는 Fc-영역에 변형된 글리코실화를 가진 항체의 효소적 제조 방법이 보고되어 있는데, 이는 Fc-영역의 글리코실화를 가진 항체 경쇄 친화성 리간드-결합된 모노클로날 항체를 Fc-영역의 글리코실화를 변형하기에 적합한 조건 및 충분한 시간 하에 제 1 효소와 인큐베이션하고, 항체 경쇄 친화성 리간드로부터 항체를 회수하고, 회수된 항체를 용액 중에서 제 2 효소와 Fc-영역의 글리코실화를 규정된 형태로 변형하기에 적합한 조건 및 충분한 시간 동안 인큐베이션하고, 양이온 교환 크로마토그래피에서 제 2 효소로부터 Fc-영역 중의 변형된 글리코실화를 가진 항체를 분리하여, 이로써 Fc-영역에 변형된 글리코실화를 가진 항체를 제조하는 단계를 포함하는 방법이다.

Description

항체의 시험관 내 당조작 방법
본 발명은 항체 조작의 분야에 속한다. 보다 상세하게는, 본원에는 항체의 Fc-영역에서의 글리코실화의 시험관 내 당조작 방법이 보고되어 있다.
IgG 는 가장 풍부한 항체 아이소타입이며, IgG1 항체는 효과기 기능의 가장 중요한 정도와 배열을 나타내는 서브클래스이다. IgG1 항체는 ADCC 와 CDC 가 종종 중요하다고 생각되는 면역요법에서 가장 일반적으로 사용되는 항체이다. 항체의 구조 내에서, CH2 도메인 뿐만 아니라 IgG 힌지 영역은 Fc 매개된 항체 효과기 기능에 중요한 역할을 한다. 각각의 CH2 도메인은 대략 297 위치 (Kabat 의 EU 인덱스에 따라 넘버링) 에 위치하는 아스파라긴 잔기에 보존된 글리코실화 부위를 포함하고, 여기서 글리칸 모이어티는 공유 결합된다 (Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32). 성숙 IgG 분자에서, 글리칸은 CH2 도메인 사이에 묻혀, IgG 분자의 3 차 구조에 영향을 미친다.
항체의 Fc-영역의 글리칸은 주로 고도로 이종적인 복합 바이안테너리 구조이다. 추가의 비-보존된 글리코실화 부위가 항체의 Fab 영역 내에 존재할 수 있지만, 항체 글리코실화가 이펙터 기능에 미치는 영향은 Fc-영역 글리코실화에 기인한다.
항체의 Fc-영역에 존재하는 N-연결된 글리칸은 항체가 ADCC 와 같은 효과기 기능을 매개하는데 필수적인 것으로 알려져 있다 (Lively, M.R. et al. Glycobiol. 8 (1995) 813-822; Jefferis R. et al. Immunol Rev. 163 (1998) 59-76). N-연결된 글리칸의 조성은 IgG 분자의 Fc-영역의 구조에 영향을 미치고, 이에 따라 Fc-수용체 결합, ADCC 활성 및 CDC 활성과 같은 항체 효과기 기능을 변화시키는 것으로 나타났다 (Presta, L., Curr. Opin. Struct. Biol. 13 (2003) 519-525).
예를 들어, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서의 발현에 의한, 재조합 발현 시스템에서 발현된 IgG 항체 내에서, N-연결된 글리칸 구조는 개별 항체 분자 사이에서 다양하다. 그러므로, 재조합 발현 시스템에서 생산된 항체는 "항체 집단" (본 명세서에서 더 사용되는 용어) 으로 간주될 수 있으며, 항체는 그들의 아미노산 서열은 동일하지만 그들의 Fc-영역의 N-연결된 글리칸 패턴에 대해서는 이종성을 나타낸다.
Fc-영역 글리칸의 조성은 재조합 항체의 발현에 사용된 상이한 숙주 세포 종 사이에서 다양하다고 알려져 있다. 항체의 재조합 발현을 위해 일반적으로 사용되는 두 가지 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포) 와 마우스 골수종 세포 (예를 들어, sp2/0, P3X63Ag8.653, NSO) 이다. CHO 세포는 말단 시알산 잔기가 실질적으로 결여된 반면, 글리칸 패턴의 주요 분획은 푸코실화된 재조합 항체를 발현한다. 대조적으로, 마우스 골수종 세포는 50 % (상대 빈도) 까지의 시알산 잔기를 함유하지만 푸코오스 잔기는 적은 항체 집단을 발생시킨다.
글리칸 구조의 말단 잔기의 일부가 IgG 효과기 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 말단 푸코오스 잔기의 존재는 감소된 FcgammaRllla 결합 및 감소된 ADCC 에 기여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 말단 푸코오스 잔기가 결여된 항체 ("아푸코실화된 (afucosylated)" 항체) 는 항체 집단에 의해 매개되는 ADCC 의 증가와 관련된다. ADCC 조정의 개선에 대한 아푸코실화의 영향이 당해 분야에 널리 수용되어 있지만, ADCC 조정에서 Fc-영역 갈락토실화의 역할은 논쟁의 여지가 있다. 몇몇 연구에 의하면 갈락토실화는 ADCC 에는 효과가 없는 반면 (Boyd, P.N., et al. Mol Immunol. 32 (1995) 1311-1318; Hodoniczky, J., et al. Biotechnol. Prog. 21 (2005) 1644-1652; Raju, T.S., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 471-478); 다른 연구는 IgG 의 갈락토실화가 FcgammaRllla 결합을 증가시키는 것으로 보고하고 있다 (Houde, D., et al., Mol. Cell. Proteom. 9 (2010) 1716-1728; Kumpel, B.M., et al., Hum. Antibod. Hybridom. 6 (1995) 82-88; Thomann, M., et al., Mol. Immunol. 73 (2016) 69-75).
현재, 항체에 의해 매개되는 ADCC 를 개선하기 위한 IgG 분자의 조작은 IgG 분자의 푸코실화 조절에 초점을 맞추고 있다. 유전자 조작 숙주 세포, 예를 들어 단백질 푸코실화가 결핍된 Lecl3 CHO 세포 또는 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8) 유전자의 녹아웃을 갖는 CHO 세포와 같은 녹아웃 세포주에서 항체를 발현시킴으로써 재조합적으로 발현된 IgG 의 아푸코실화를 달성할 수 있다.
그러나, 현재 발현 시스템, 예를 들어 CHO 세포에 의해 생성된 항체는 이종 글리칸 패턴을 나타내어, 생성된 항체의 상이한 배치 내에서 구별되는 글리칸 종의 분포에 변이를 가져온다. 그러므로, 재조합 IgG 항체의 효과기 기능을 맞추기 위한, 특히 치료용 항체에 의해 매개되는 ADCC 를 개선시키는 수단의 제공을 위한 필요성이 여전히 있다.
WO 2011/012297 에는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 함유하는 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 제공하는 단계, 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 식물 유래의, 예를 들어, 그린 커피빈 유래의 (EC 3.2.1.22) (a1,3) 갈락토시다제와 인큐베이션하는 단계, 인큐베이션된 친화성 크로마토그래피 컬럼 용리액을 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계 및 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 회수하여 규정된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 제조하는 방법이 보고된다.
WO 2015/123754 에는 친화성 리간드 결합된 이종 당형태 항체 샘플을 치료 용도를 위한 실질적으로 동종 단일 당형태 항체 샘플에 재구성하기 위한 효소적 방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 키트가 제공된다. 이종 당형태로부터 친화성 리간드 결합된 항체의 Fc 영역을 실질적으로 동종 단일 당형태로 효소적으로 변형시키는 방법은: 특정 당형태 변형을 위해 디자인된 반응 완충액과 친화성 리간드 결합된 이종 당형태 항체를 충분한 시간 동안 Fc 영역의 당형태를 실질적으로 동종 단일 형태로 변형시키는 조건 하에 접촉시키는 단계; 임의로 하나 이상의 뉴클레오티드 당 및/또는 조인자를 첨가하는 단계; 및 상기 친화성 리간드로부터 실질적으로 동종 단일 당형태 항체 샘플을 방출시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 암 및 면역 장애의 치료를 위해 효소적으로 제조된 단일 당형태 mAb 및 폴리클로날 항체를 포함하는 생물약제 뿐만 아니라 생물약제로서 단일 당형태 항체를 포함하는 조성물을 포함한다.
WO 2016/037947 에는 IgG1 아이소타입의 갈락토조작된 재조합 항체, 상기 항체의 제조 방법 및 그 용도가 보고되어 있다.
본원에는 2 단계 공정인, 항체의 시험관 내 당조작 방법이 보고되어 있고, 재조합적으로 생산된 모노클로날 항체의 하나의 구현예에서 제 1 단계에서 항체는 효소 변형 동안 항체 (경쇄 또는 Fc-영역) 친화성 리간드에 결합되고, 제 2 단계는 용액 중에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 사용된 효소(들) 은 항체의 변형 후에 회수되고 임의로 재사용을 위해 조건화될 수 있다. 본원에 보고된 방법은 그 중에서도, 항체의 변형을 위한 개선된 방법, 특히 좀더 경제적인 방법이다.
본원에 보고된 바와 같은 방법으로, 항체의 글리코실화의 변형에 사용된 효소를 항체 제제로부터 제거하여 개선된 제제를 도출할 수 있다.
본원에 보고된 바와 같은 방법은 선행 업스트림 생산 공정 단계를 변형할 필요없이 임의의 모노클로날 항체의 변형에 유용하다. 본원에 보고된 방법은 기존 프로세스에 통합될 수 있다. 당구조 변형이 다운스트림 프로세싱 동안 본원에 보고된 바와 같은 방법에 의해 제공되기 때문에, 본질적으로 존재하는 항체 생산 세포주에 현저한 변화는 요구되지 않는다.
효소 활성의 유해한 손실 없이 동일한 반응에 대해 재조건화된 효소의 재사용을 허용하는 형태로 항체의 글리코실화의 변형에 사용되는 효소를 회수하는 것이 가능하다는 것이 밝혀졌다. 놀랍게도, 효소가 효소 활성 및 전환 효율의 유의한 손실 없이 적어도 한번 재사용될 수 있음이 밝혀졌다.
또한 항체 경쇄 친화성 리간드 결합 항체가, 항체가 용액 상태에 있는 것처럼 효과적으로 효소적으로 변형될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
본원에 보고된 하나의 양상은 하기를 포함하는 N-글리코실화 부위에서 변형된 (실질적으로 동종의) 글리코실화를 가진 항체의 효소적 제조/생성 방법이다:
a) N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 항체 (경쇄 또는 Fc-영역) 친화성 리간드-결합 모노클로날 항체를 제 1 효소와 N-글리코실화 부위의 글리코실화를 규정된 (실질적으로 동종의) 형태 (동종 글리코실화) 로 변형시키기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계,
b) 임의로 제 1 효소를 회수하고 이로써 재순환된 제 1 효소를 생성시키는 단계,
c) 항체 경쇄 친화성 리간드로부터 항체를 회수하는 단계,
d) 회수된 항체를 제 2 효소와 N-글리코실화 부위의 글리코실화를 (규정된 (실질적으로 동종의) 형태 (동종 글리코실화) 로) 변형시키기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 용액 중에서 인큐베이션하는 단계,
e) 양이온 교환 크로마토그래피에서 제 2 효소로부터의 N-글리코실화 부위에 변형된 글리코실화를 가진 항체를 분리하고, 그에 의해 N-글리코실화 부위에 변형된 글리코실화를 가진 항체 및 임의로 재순환된 제 2 효소를 생성하는 단계, 및
f) 임의로 단계 a) 를 단계 b) 의 제 1 재순환된 효소로 적어도 1 회 반복하고, 단계 d) 를 단계 e) 의 제 2 재순환된 효소로 적어도 1 회 반복하는 단계.
본원에 보고된 방법의 하나의 구현예에서, 반응 후 효소는 항체로부터 분리되고 동일한 반응에서 적어도 1 회 재사용된다.
하나의 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 술포프로필 양이온 교환기를 갖는 가교결합된 아가로오스의 매트릭스 (SP-Sepharose) 를 갖는다. 상기 방법은 가교결합된 폴리(스티렌 디비닐벤젠) 의 매트릭스로는 작동하지 않는 것으로 밝혀졌다.
하나의 구현예에서, 제 1 효소는 갈락토실트랜스페라제이고, 제 2 효소는 시알릴트랜스페라제이다.
하나의 구현예에서, 갈락토실트랜스페라제는 β4GalT1 이다.
하나의 구현예에서, 시알릴트랜스페라제는 ST6 이다.
하나의 구현예에서, 시알릴트랜스페라제는 ST6Gal1 또는 ST6Gal2 이다.
하나의 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 하기의 단계를 포함한다:
i) 임의로 갈락토실트랜스페라제 및 시알릴트랜스페라제를 포함하는 용액 및 N-글리코실화 부위에 변형된 글리코실화를 가진 항체를 (강한) 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계,
ii) ((강한) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 결합되지 않은 화합물을 제거하기 위해) 임의로 (강한) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 세척하는 단계,
iii) 임의로 갈락토실트랜스페라제가 존재하는 경우 (강한) 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 제 1 용액을 적용하고 이에 의해 (강한) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 갈락토실트랜스페라제를 회수하는 단계,
iv) 제 2 용액을 (강한) 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 이에 의해 (강한) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 N-글리코실화 부위에 변형된 글리코실화를 가진 항체를 회수하는 단계, 및
v) 선형 구배를 (강한) 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 이에 의해 (강한) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 시알릴트랜스페라제를 회수하는 단계.
하나의 구현예에서, 단계 i) 의 용액은 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 완충액이다. 하나의 구현예에서, 단계 i) 의 용액은 약 50 mM MES 를 포함하고 약 pH 6.4 의 pH 값을 갖는다.
하나의 구현예에서, 단계 ii) 의 용액은 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 완충액이다. 하나의 구현예에서, 단계 ii) 의 용액은 약 50 mM MES 를 포함하고 약 pH 6.4 의 pH 값을 갖는다.
하나의 구현예에서, 단계 iii) 의 용액은 pH 6.6 내지 pH 8.0 의 pH 값을 갖는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 완충액이다. 하나의 구현예에서, 단계 iii) 의 용액은 약 40 mM TRIS 를 포함하고 약 pH 7.4 의 pH 값을 갖는다.
하나의 구현예에서, 단계 iv) 의 용액은 약 75 mM 내지 약 125 mM 소듐 클로라이드 (NaCl) 를 포함하는 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 완충액이다. 하나의 구현예에서, 단계 iv) 의 용액은 약 30 mM MES, 약 90 mM NaCl 을 포함하고 약 pH 5.6 의 pH 값을 갖는다.
7.4 에서 pH 6.0 이하, 예를 들어 pH 5.6 으로 pH 값을 감소시키면 응집된 갈락토실트랜스페라제가 용리되는 것으로 밝혀졌다.
하나의 구현예에서, 선형 구배는 단계 iv) 의 용액으로부터 약 750 mM 내지 약 1250 mM 소듐 클로라이드 (NaCl) 를 포함하는 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 완충액으로이다. 하나의 구현예에서, 선형 구배는 단계 iv) 의 용액으로부터 약 50 mM MES, 약 1000 mM NaCl 을 포함하고 약 pH 6.4 의 pH 값을 갖는 용액으로이다.
하나의 구현예에서, 반복은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 회이다. 하나의 구현예에서, 반복은 1 내지 5 회이다. 하나의 구현예에서, 반복은 1 내지 3 회이다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 본 방법은 제 1 인큐베이션 단계 a) 전에 하기의 단계를 포함한다:
- N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 모노클로날 항체를 항체 (경쇄 또는 Fc-영역) 친화성 리간드에 결합시키는 단계.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 본 방법은 단계 a) 내지 c) 대신에 하기의 단계를 하기 순서로 포함한다:
- N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 항체를 포함하는 (완충된) 용액을 고상에 결합된 항체 (경쇄 또는 Fc-영역) 친화성 리간드 (항체 경쇄 친화성 리간드 크로마토그래피 물질) 에 적용하여, 항체를 리간드에 결합시키는 단계 (리간드-결합 항체를 산출함),
- 임의로 완충액으로 고상을 세척하는 단계,
- 리간드-결합 항체의 효소적 변형에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 제 1 글리코실화 변형 효소 (및 제 1 활성화된 당 잔기) 를 포함하는 (완충된) 용액을 적용함으로써 항체의 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 효소적으로 변형시키는 단계, 임의로 변형된 리간드-결합 항체를 세척함,
- 임의로 제 1 효소를 회수하고 이로써 재순환된 제 1 효소를 생성시키는 단계, 및
- 항체 경쇄 친화성 리간드로부터 항체를 회수하는 단계.
본원에 보고된 바와 같은 방법에서 사용된 항체는 Fab 단편, 단일 사슬 항체, 다중특이적 항체 및 항체 융합체를 포함하는 임의의 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
따라서, 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체는 전체 길이 항체, 2가 단일특이적 항체, 이중특이적 항체, 2가 이중특이적 항체, 3가 이중특이적 항체, 4가 이중특이적 항체, 3가 삼중특이적 항체 및 4가 사중특이적 항체로 이루어진 항체의 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 항체는 2가 단일특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 항체는 2가 또는 3가 또는 4가 이중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 항체는 키메라 또는 인간화 또는 인간 항체이다.
하나의 구현예에서, 항체는 폴리클로날 항체 제제이다.
하나의 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 (제제) 는 인간 IgG 클래스의 항체 (제제) 이다. 하나의 구현예에서, 항체는 인간 IgG 또는 IgG4 서브클래스의 항체이다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 구현예에서, 규정된 글리코실화는 G2 당형태, G0 당형태, M3 당형태, S2 당형태, A2B 당형태, A2BG2 당형태 및 S1 당형태로 이루어진 군으로부터 선택된 글리코실화이다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 구현예에서, 규정된 글리코실화는 말단 당으로서 갈락토오스, 말단 당으로서 GlcNAc, 말단 당으로서 만노오스 및 말단 당으로서 시알산으로 이루어진 군으로부터 선택된 글리코실화이다.
하나의 구현예에서, 항체는 재조합으로 생성된 항체이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 방법으로 생성된 항체이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 방법으로 생성된 규정된 글리코실화를 가진 항체를 포함하는 약학 제형이다.
본 발명의 또 다른 양상은 하기 단계를 포함하는, N-글리코실화 부위에 규정된 글리코실화를 가진 항체 또는 그의 단편의 재조합 제조 방법이다:
a) 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 (포유동물 또는 CHO) 세포에서 (IgG1 아이소타입의) 항체 또는 그의 단편을 재조합으로 제조하여 N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 항체 또는 그의 단편을 수득하는 단계,
b) N-글리코실화 부위에 이종 글리코실화를 가진 항체 또는 그의 단편을 단리 (회수 및 임의로 정제) 하는 단계,
c) 갈락토실트랜스퍼라제 및/또는 시알릴트랜스퍼라제로 N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 항체 또는 그의 단편을 효소적으로 변형시켜 N-글리코실화 부위에 규정된 글리코실화를 가진 항체 또는 그의 단편을 수득하는 단계, 이는 N-글리코실화 부위에 적어도 70% 의 바이-갈락토실화 항체 (G2F 당형태) (여기에서 100% 는 G0F, G1F 및 G2F 당형태의 양에 상응함) 의 상대적 양을 포함함, 및 이어서 본원에 보고된 방법으로 효소 (들)로부터 변형된 항체를 분리하는 단계,
d) 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의해 변형된 항체 또는 그의 단편을 임의로 정제하는 단계,
이에 의해 N-글리코실화 부위에 규정된 글리코실화를 가진 항체를 생산함.
본원에서 보고되는 바와 같은 모든 양상의 하나의 구현예에서, 제 1 글리코실화 변형 효소는 갈락토실트랜스페라제이다.
본원에서 보고되는 바와 같은 모든 양상의 하나의 구현예에서, 제 1 글리코실화 변형 효소는 갈락토실트랜스페라제이고, 제 2 글리코실화 변형 효소는 시알릴트랜스페라제이다.
하나의 구현예에서, 갈락토실트랜스페라제는 β4GalT1 이다.
하나의 구현예에서, 시알릴트랜스페라제는 ST6 이다.
하나의 구현예에서, 시알릴트랜스페라제는 ST6Gal1 또는 ST6Gal2 이다.
하나의 구현예에서, (제 1) 완충액은 UDP-Gal 을 포함한다.
하나의 구현예에서, (제 2) 완충액은 CMP-NANA 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 인큐베이션은 실온 (20 내지 25℃, 바람직하게는 약 22℃) 에서 행해진다.
하나의 구현예에서, 인큐베이션은 25℃ 에서 행해진다.
하나의 구현예에서, 인큐베이션은 37℃ 에서 행해진다.
하나의 구현예에서, 인큐베이션은 7 내지 48 시간 동안이다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 구현예에서, 용액은 크로마토그래피로 정제된 항체를 포함하고, (제 1) 글리코실화 변형 효소는 GalT1 이고, (제 1) 글리코실화 변형 효소와의 인큐베이션은 24시간 동안 20-27℃ 또는 37℃ 에서 행해진다. 하나의 구현예에서, 인큐베이션은 실온 (약 22℃) 에서 행해진다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 구현예에서, (제 2) 글리코실화 변형 효소는 ST6 이고, (제 2) 글리코실화 변형 효소와의 인큐베이션은 24시간 동안 20-27℃ 또는 37℃ 에서 행해진다. 하나의 구현예에서, 인큐베이션은 실온 (약 22℃) 에서 행해진다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 하기 순서로 포함하는, 항체 또는 그의 단편의 제조 방법이다:
- (임의로 항체 경쇄를 적어도 포함하는) 항체 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계;
- N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 항체 또는 그의 단편의 발현에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계,
- 세포 또는 배양 배지로부터 항체 또는 그의 단편을 회수하는 단계,
- 항체 또는 그의 단편을 포함하는 용액을, 항체 또는 그의 단편을 친화성 크로마토그래피 물질에 결합시키는데 적합한 조건 하에 항체 (Fc-영역의 경쇄) 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용시키는 단계,
- 본원에 보고된 방법으로 N-글리코실화 부위에서 항체 또는 그의 단편의 글리코실화를 변형시키는 단계, 및
- N-글리코실화 부위에서 규정된 글리코실화를 갖는 변형된 항체 또는 그의 단편을 회수하는 단계,
이에 의해 항체를 제조함.
하나의 구현예에서, 방법은 최종 단계로서 다음 단계를 포함한다:
- 1 내지 3 개의 크로마토그래피 단계로 변형된 항체 또는 그의 단편을 정제하는 단계.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 친화성 크로마토그래피 컬럼은 항체 경쇄 친화성 크로마토그래피 컬럼이다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 친화성 크로마토그래피 컬럼은 항체 Fc-영역 친화성 크로마토그래피 컬럼이다.
하나의 구현예에서, 항체 친화성 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼이다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, N-글리코실화 부위는 Fab 또는 Fc-영역에 있다.
정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 문헌 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 에 기재된 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되고, 본원에서 "Kabat 에 따른 넘버링" 으로 언급된다. 구체적으로는, 문헌 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 의 Kabat 넘버링 시스템 (페이지 647-660 참조) 이 카파 및 람다 이소타입의 경쇄 불변 도메인 CL 에 대해 사용된다. 구체적으로는, Kabat EU 인덱스 넘버링 시스템 (페이지 661-723 참조) 은 불변 중쇄 도메인 (CH1, 힌지, CH2 및 CH3, 이것은 본원에서 이 경우 “Kabat EU 인덱스에 따른 넘버링” 을 언급함으로써 추가로 상세화된다) 에 대해 사용된다.
본 명세서와 첨부된 청구항에서 사용시, 단수형 "한", "하나" 및 "그" 는 달리 명확하게 명시하지 않으면 복수 인용을 포함한다는 것을 주의해야만 한다. 따라서, 예를 들어, "세포" 에 대한 언급은 다수의 이러한 세포 및 당업자에게 공지된 이의 균등물 등을 포함한다. 역시, 용어 ""하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나" 는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "포함하는", "포괄하는", 및 "갖는" 도 역시 상호교환적으로 사용될 수 있다는 것에 주의한다.
예컨대 폴리펩티드의 아미노산 서열을, 이 아미노산 서열을 인코딩하는 상응 핵산 서열로 전환하는 절차 및 방법은 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 그러므로 핵산은, 각각의 뉴클레오티드로 이루어진 자체의 핵산 서열, 그리고 이와 유사하게는 이 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 의해 특징지어진다.
용어 "약" 은 그 후에 이어지는 수치 값의 +/- 20 % 의 범위를 나타낸다. 일 구체예에서 용어 '약'은 이후에 후속되는 수치값의 +/- 10% 범위를 의미한다. 일 구체예에서 용어 '약'은 이후에 후속되는 수치값의 +/- 5 % 범위를 의미한다.
용어 "항체" 는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고 요망되는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하나 그에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 망라한다.
용어 "항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC)" 은 Fc 수용체 결합에 의해 매개되는 기능이며, 효과기 세포의 존재 하에서 본원에 보고된 항체에 의한 표적 세포의 용해를 의미한다. ADCC 는 하나의 구현예에서 효과기 세포 예컨대 신선하게 단리된 PBMC (말초 혈액 단핵 세포) 또는 단핵구 또는 NK (자연 살해) 세포와 같은 버피 코트로부터 정제된 효과기 세포의 존재 하에서 본원에서 보고된 바와 같은 항체로의 CD19 발현 적혈구 세포 (예를 들어, 재조합 인간 CD19 를 발현하는 K562 세포) 의 조제물의 처리에 의해 측정된다. 표적 세포는 Cr-51 로 표지되고 이후에 항체와 인큐베이션된다. 표지된 세포를 효과기 세포와 인큐베이션시키고 상청액을 방출된 Cr-51 에 대해 분석한다. 대조군은 항체 없이 효과기 세포와 표적 내피 세포의 인큐베이션을 포함한다. ADCC 매개하는 초기 단계를 유도시키는 항체의 능력은 Fcγ 수용체 발현 세포, 예컨대 FcγRI 및/또는 FcγRIIA 를 재조합적으로 발현하는 세포 또는 NK 세포 (본질적으로 FcγRIIIA 를 발현함) 에 대한 이들의 결합을 측정하여 조사된다. 바람직한 하나의 구현예에서 NK 세포 상의 FcγR 의 결합이 측정된다.
"항체 단편" 은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 한편, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종에서 유래하는 항체를 나타낸다.
항체의 "클래스" 는 이의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. 5 가지 주요 클래스의 항체가 있고: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 이들 중 여럿은 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 라고 한다.
용어 "보체-의존적 세포독성 (CDC)" 은 보체의 존재 하 본원에서 보고하는 바와 같은 항체에 의해 유도된 세포의 용해를 나타낸다. CDC 는 하나의 구현예에서 보체의 존재 하에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체로 CD19 발현 인간 내피 세포를 처리하여 측정된다. 세포는 하나의 구현예에서 칼세인으로 표지된다. 항체가 30 ㎍/㎖ 의 농도에서 표적 세포의 20% 이상의 용해를 유도하는 경우, CDC 가 발견된다. 보체 인자 C1q 에 대한 결합은 ELISA 에서 측정될 수 있다. 이러한 검정에서 원칙적으로 ELISA 플레이트는 항체의 농도 범위로 코팅되는데, 이에 정제된 인간 C1q 또는 인간 혈청이 첨가된다. C1q 결합은 C1q 에 대해 유도되는 항체, 이후 퍼옥시다아제-표지된 접합체에 의해 검출된다. 결합의 검출 (최대 결합 Bmax) 은 퍼옥시다제 기질 ABTS® (2,2'-아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린-6-술포네이트]) 에 대한 405 nm (OD405) 에서의 광학 밀도로서 측정된다.
"효과기 기능" 은 항체 클래스에 따라 가변적인, 항체의 Fc-영역에 기인하는 이들 생물학적 활성을 나타낸다. 항체 효과기 기능의 예에는: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체) 의 하향 조절; 및 B-세포 활성화가 포함된다.
Fc 수용체 결합 의존적 효과기 기능은 항체의 Fc-영역과 Fc 수용체 (FcR) (조혈 세포 상 특화된 세포 표면 수용체임) 의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. Fc 수용체는 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하며, 면역 복합체의 식균작용에 의한 항체-코팅된 병원체의 제거, 및 항체 의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC) 을 통한 적혈구 및 상응하는 항체로 코팅된 다양한 기타 세포 표적 (예를 들어 종양 세포) 의 용해 둘 모두를 매개하는 것으로 나타난다 (예를 들어, Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524 참고). FcR 은 면역글로블린 이소타입에 대한 특이성에 의해 정의된다: IgG 항체에 대한 Fc 수용체는 FcγR 로서 지칭된다. Fc 수용체 결합은 예를 들어 하기 문헌에 기재된다: Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; 및 Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248.
IgG 항체의 Fc-부위에 대한 수용체 (FcγR) 의 교차결합은, 면역 복합체 소거 및 항체 생성의 조절 뿐 아니라 식균작용, 항체-의존적 세포 세포독성, 및 염증 매개제의 배출을 포함하는 광범위한 효과기 기능을 촉발시킨다. 인간에서, 3가지 클래스의 FcγR 이 특징규명되었고, 다음과 같다:
- FcγRI (CD64) 은 높은 친화성으로 단량체 IgG 에 결합하고 마크로파지, 단핵구, 호중구 및 호산구 상에서 발현된다. Fc-영역 IgG 에서 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327 및 P329 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 중 적어도 하나의 변형은 FcγRI 와의 결합을 감소시킨다. IgG1 및 IgG4 로 치환된, 위치 233-236 에서의 IgG2 잔기는 FcγRI 에 대한 결합을 103-배로 감소시켰으며, 항체-민감화 적혈구 세포에 대한 인간 단핵구 반응을 제거하였다 (Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).
- FcγRII (CD32) 는 중간 내지 낮은 친화성으로 복합 IgG 에 결합하고 광범위하게 발현된다. 이러한 수용체는 2개의 서브-타입, FcγRIIA 및 FcγRIIB 로 분류될 수 있다. FcγRIIA 는 사멸에 관련되는 많은 세포 (예를 들어 대식세포, 단핵구, 호중구) 상에서 발견되며 사멸 과정을 활성화시킬 수 있는 것으로 보인다. FcγRIIB 는 억제 과정에서 역할을 하는 것으로 보이고 B 세포, 대식세포 및 비만 세포 및 호산구 상에서 발견된다. B 세포 상에서, 이것은 추가의 면역글로불린 생산 및 예를 들어 IgE 클래스로의 이소타입 전환을 억제하는 기능을 하는 것으로 보인다. 대식세포 상에서, FcγRIIB 는 FcγRIIA 를 통해 매개되는 바와 같이 식균작용을 저해하는 작용을 한다. 호산구 및 비만 세포 상에서 B-형태는 그의 별개 수용체에 대한 IgE 결합을 통해 이들 세포의 활성화를 억제하는 것을 도울 수 있다. FcγRIIA 에 대한 감소된 결합은 예를 들어 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 및 K414 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 중 적어도 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc-영역을 포함하는 항체에 대해 발견된다.
- FcγRIII (CD16) 은 중간 내지 저친화성으로 IgG 에 결합하며 2 개 유형으로서 존재한다. FcγRIIIA 는 NK 세포, 대식세포, 호산구 및 일부 단핵구 및 T 세포 상에서 발견되며 ADCC 를 매개한다. FcγRIIIB 는 호중구 상에서 고도로 발현된다. FcγRIIIA 에 대한 감소한 결합이 예를 들어 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 및 D376 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 중 적어도 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc-영역을 포함하는 항체에 대해 발견된다.
Fc 수용체에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위의 맵핑, 상술한 돌연변이 위치, 및 FcγRI 및 FcγRIIA 에 대한 결합 측정 방법이 하기 문헌에 기재된다: Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "Fc 수용체" 는 수용체와 연관된 세포질 (cytoplasmatic) ITAM 서열의 존재에 의해 특징지어지는 활성화 수용체를 나타낸다 (참고, 예를 들어, Ravetch, J.V. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290). 이러한 수용체는 FcγRI, FcγRIIA 및 FcγRIIIA 이다. 용어 "FcγR 에 대해 결합하지 않음" 은 10 ㎍/㎖ 의 항체 농도에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체의 NK 세포에 대한 결합이 WO 2006/029879 에서 보고된 바와 같이 항-OX40L 항체 LC.001 에 대해 발견된 결합의 10% 이하라는 것을 나타낸다.
IgG4 가 감소한 FcR 결합을 나타내지만, 다른 IgG 서브클래스의 항체는 강력한 결합을 나타낸다. 그러나 Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물 손실), Pro329 및 234, 235, 236 및 237 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435 는, 변경되는 경우 또한 FcR 결합을 감소시키는 잔기이다 (Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434).
본 명세서에서 용어 "Fc-영역" 은 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 이 용어는 천연 서열 Fc-영역 및 변이체 Fc-영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226, 또는 Pro230, 또는 Ala231 로부터 중쇄의 카복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 리신 (Lys447) 은 존재할 수도, 존재하지 않을 수도 있다.
본원에 보고된 항체는 Fc-영역으로서, 하나의 구현예에서는 인간 기원 유래의 Fc-영역을 포함한다. 하나의 구현예에서 Fc-영역은 인간 불변 영역의 모든 부분을 포함한다. 항체의 Fc-영역은 보체 활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접적으로 관련된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향이 특정 조건에 따라 좌우되는 반면, C1q 에 대한 결합은 Fc-영역에서 정의된 결합 부위에 의해 초래된다. 이러한 결합 부위는 당 업계의 기술 수준에서 공지되어 있으며, 예를 들어 하기 문헌에 기재되어 있다: Lukas, TJ, et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434. 이러한 결합 부위는 예를 들어, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 이다. 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG3 의 항체는 일반적으로 보체 활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 보이는데 반해, IgG4 는 보체 시스템을 활성화시키지 않고, C1q 에 결합하지 않으며 C3 을 활성화시키지 않는다. "항체의 Fc-영역" 은 당업자에게 잘 알려진 용어이고 항체의 파파인 절단을 기반으로 정의된다. 하나의 구현예에서 Fc-영역은 인간 Fc-영역이다. 하나의 구현예에서 Fc-영역은 돌연변이 S228P 및/또는 L235E 및/또는 P329G (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 를 포함하는 인간 IgG4 서브클래스의 것이다. 하나의 구현예에서 Fc-영역은 돌연변이 L234A 및 L235A 및 임의로 P329G (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 를 포함하는 인간 IgG1 서브클래스의 것이다.
용어 "야생형 Fc-영역" 은 자연계에 존재하는 Fc-영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 의미한다. 야생형 인간 Fc-영역은 천연 인간 IgG1 Fc-영역 (비-A 및 A 알로타입), 천연 인간 IgG2 Fc-영역, 천연 인간 IgG3 Fc-영역, 및 천연 인간 IgG4 Fc-영역을 비롯하여 이의 자연 발생 변이체를 포함한다. 야생형 Fc-영역은 SEQ ID NO:01 (IgG1, 코카시안 알로타입), SEQ ID NO:02 (IgG1, 아프리카아메리칸 알로타입), SEQ ID NO:03 (IgG2), SEQ ID NO:04 (IgG3) 및 SEQ ID NO:05 (IgG4) 로 표시된다.
변이체 (인간) Fc-영역은 함유하는 아미노산 돌연변이에 의해 정의된다. 따라서, 예를 들어, 용어 P329G 는 부모 (야생형) Fc-영역 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 에 비하여 아미노산 위치 329 에 프롤린의 글리신으로의 돌연변이를 갖는 변이체 Fc-영역을 의미한다. 야생형 아미노산의 동일성은 명시되지 않을 수 있는데, 이러한 경우 상술한 변이체를 329G 로서 나타낸다.
IgG1 서브클래스의 야생형 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 위치 227 의 시스테인 잔기에서 시작하여 위치 446 의 글리신 잔기로 종결되는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00001
돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00002
돌연변이 T366W 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00003
돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00004
돌연변이 L234A, L235A, T366S, L368A 및 Y407V 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00005
돌연변이 L234A, L235A 및 T366W 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00006
돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00007
돌연변이 L234A, L235A, P329G, T366S, L368A 및 Y407V 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00008
돌연변이 L234A, L235A, P329G 및 T366W 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00009
돌연변이 L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00010
돌연변이 L234A, L235A, P329G, S354C 및 T366W 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00011
돌연변이 L234A, L235A, P329G, S354C, T366S, L368A 및 Y407V 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00012
돌연변이 L234A, L235A, P329G, Y349C 및 T366W 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00013
돌연변이 I253A, H310A 및 H435A 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00014
돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00015
돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00016
IgG4 서브클래스의 야생형 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00017
돌연변이 S228P 및 L235E 를 갖는 IgG4 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00018
돌연변이 S228P, L235E 및 P329G 를 갖는 IgG4 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00019
돌연변이 S228P, L235E, P329G, T366S, L368A 및 Y407V 를 갖는 IgG4 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00020
돌연변이 S228P, L235E, P329G 및 T366W 를 갖는 IgG4 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063046676-pct00021
용어 "전체 길이 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체" 는 본 명세서에서 정의되는 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖거나 또는 고유 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 의미하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "글리신" 은 다당류 또는 올리고당을 의미한다. 글리칸은 당단백질, 당지질, 당펩티드, 당단백질체, 펩티도글리칸, 지질다당류 또는 프로테오글리칸과 같은 당접합체의 탄수화물 부분을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 글리칸은 통상 단당류 사이의 β-글리코시드 연결로만 이루어진다. 글리칸은 단당류 잔기의 단독중합체 또는 이종중합체일 수 있고, 선형 또는 분지형일 수 있다.
용어 "글리코실트랜스퍼라제" 는 올리고당 내의 당 분자와 같은 수용체 분자로 뉴클레오티드 당으로부터 단당류 잔기를 전달할 수 있는 효소를 나타낸다. 이러한 글리코실트랜스퍼라제의 예로는 갈락토실트랜스퍼라제 및 시알릴트랜스퍼라제가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "힌지 영역" 은 야생형 항체 중쇄에서, CH1 도메인 및 CH2 도메인을 연결하는, 예를 들어 Kabat 의 EU 번호 체계에 따라서 약 위치 216 에서 약 위치 230 까지, 또는 Kabat 의 EU 번호 체계에 따라서 약 위치 226 에서 약 위치 230 까지의 항체 중쇄 폴리펩티드의 일부분을 의미한다. 다른 IgG 서브클래스의 힌지 영역은 IgG1 서브클래스 서열의 힌지-영역 시스테인 잔기와의 정렬에 의해 결정될 수 있다.
힌지 영역은 보통은 동일한 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 분자이다. 힌지 영역은 일반적으로 약 25 개 아미노산 잔기를 포함하고 회합된 표적 결합 부위가 독립적으로 움직일 수 있도록 유연하다. 힌지 영역은 3 개의 도메인: 상부, 중간, 및 하부 힌지 도메인으로 다시 나뉠 수 있다 (예를 들어, Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083 참고).
"인간화" 항체는 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 나타낸다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 및 통상 2 개 모두의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR) 은 비-인간 항체의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태" 는, 인간화를 거친 항체를 나타낸다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "과가변 영역" 또는 "HVR" 은, 서열에서 과가변인 아미노산 잔기 스트레치 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR") 를 포함하고/하거나 구조적으로 규정된 루프 ("과가변 루프") 를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기 ("항원 접촉부") 를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역 각각을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6 개의 HVR 을 포함하는데; 3 개는 VH (H1, H2, H3) 에 있고, 3 개는 VL (L1, L2, L3) 에 있다.
HVR 은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) 에서 발생하는 과가변 루프 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3) 에서 발생하는 CDR (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3) 에서 발생하는 항원 접촉부 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3) 를 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c) 의 조합.
달리 표시하지 않으면, HVR 잔기 및 가변 도메인의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 본 명세서에서 문헌 [Kabat et al., 상동] 에 따라서 넘버링된다.
"단리된" 항체는 그의 자연적 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의해 측정되는 바와 같이 95% 또는 99% 초과 순도로 정제된다. 항체 순도 평가를 위한 방법의 리뷰를 위해서는, 예를 들어 [Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87] 을 참고한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연적 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 나타낸다. 단리된 핵산은 대개는 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 또는 이의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
용어 "경쇄" 는 고유의 IgG 항체의 보다 짧은 폴리펩티드 사슬을 의미한다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 카파 (κ) 및 람다 (λ) 라고 불리는 2 개 유형 중 하나로 지정될 수 있으며, 인간 카파 경쇄 불변 도메인에 대해 SEQ ID NO:27 및 인간 람다 경쇄 불변 도메인에 대해 SEQ ID NO:28 을 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종의 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 나타내며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합하며, 그 예외는, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체이며, 그러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 통상 상이한 결정부 (에피토프) 에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정부에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "모노클로날" 은 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 얻어진 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특별한 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 여겨져서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 그에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 그러한 방법 및 기타 예시적 모노클로날 항체 제조 방법은 본원에 기재되어 있다.
"고유의 항체" 는 다양한 구조를 가진 자연 발생적 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들어, 고유의 IgG 항체는 디술피드-결합된 2 개의 동일한 경쇄 및 2 개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체성 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VH), 후속하여 3 개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3) 을 가져, 그로써 첫 번째와 두 번째 불변 도메인 사이에 힌지 영역이 위치한다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역 (VL), 후속하여 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 카파 (κ) 및 람다 (λ) 라고 불리는, 2 개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "N-연결된 올리고당" 은 아스파라긴-N-아세틸 글루코사민 연결에 의해, 아스파라긴 아미노산 잔기에서 펩티드 백본에 연결된 올리고당을 나타낸다. N-연결된 올리고당은 또한 "N-글리칸" 이라고도 불린다. 모든 N-연결된 올리고당은 Man3GlcNAc2 의 공통의 5당류 코어를 갖는다. 이들은 N-아세틸 글루코사민, 갈락토오스, N-아세틸 갈락토사민, 푸코오스 및 시알산과 같은 말초 당의 분지 (또한 안테나로 불림) 의 존재, 및 수가 상이하다. 임의로, 이 구조는 또한 코어 푸코오스 분자 및/또는 자일로오스 분자를 함유할 수 있다.
용어 "O-연결된 올리고당" 은 트레오닌 또는 세린 아미노산 잔기에서 펩티드 백본에 연결된 올리고당을 나타낸다.
용어 "시알산" 은 9-탄소 카르복실화 당의 패밀리의 임의의 일원을 나타낸다. 시알산 패밀리의 가장 일반적인 일원은 N-아세틸-뉴라민산 (2-케토-5-아세타미도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노뉼로피라노스-1-온산 (종종 Neu5Ac, NeuAc, 또는 NANA 로 약칭됨) 이다. 패밀리의 두 번째 일원은 NeuAc 의 N-아세틸 기가 히드록실화된 N-글리콜릴 뉴라민산 (Neu5Gc 또는 NeuGc) 이다. 제 3 시알산 패밀리 일원은 2-케토-3-데옥시-노뉼로손산 (KDN) 이다 (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). 또한 9-치환된 시알산, 예컨대 9-O--C1-C6 아실-NeuSAc, 예컨대 9-O-락틸-Neu5Ac 또는 9-O-아세틸-NeuSAc, 9-데옥시-9-플루오로-Neu5Ac 및 9-아지도-9-deoxyNeu5Ac 가 포함된다. 시알산 패밀리의 리뷰를 위해서는, 예를 들어, 하기를 참고한다: Varki, Glycobiol. 2 (1992) 25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). 시알릴화 절차에서 시알산 화합물의 합성 및 사용은 WO 92/16640 에 보고되어 있으며, 그 개시 내용은 전체가 본 명세서에 포함된다.
항체와 관련하여, 용어 "실질적으로" 는 해당 상태가 단일 부위 또는 다중 부위에서 글리코실화를 포함하든 아니든, 각각의 생성물 (항체) 이 단일 글리코실화 상태를 갖는 것을 나타낸다. 전형적으로, 항체는 제제 중 항체의 중량을 기준으로 적어도 60% 를 구성하는 경우 실질적으로 순수하다. 예를 들어, 제제 중의 항체는 목적하는 항체의 중량을 기준으로 적어도 약 75%, 특정 구현예에서는 저겅도 약 80%, 특정 구현예에서는 약 85%, 특정 구현예에서는 적어도 약 90%, 특정 구현예에서는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 가장 바람직하게는 적어도 약 99% 이다.
용어 "글리코실화 상태" 는 항체의 특이적 또는 목적하는 글리코실화 패턴을 나타낸다. "당형태" 는 특정 글리코실화 상태를 포함하는 항체이다. 이러한 글리코실화 패턴은 예를 들어, 항체의 Fc-영역의 위치 N-297 (Kabat 에 따른 넘버링) 에 하나 이상의 당을 부착시키는 것을 포함하며, 상기 당은 자연적으로, 재조합적으로, 합성적으로 또는 반-합성적으로 생산된다. 글리코실화 패턴은 당 업계에 공지된 많은 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 단백질 상의 탄수화물을 분석하는 방법이 US 2006/0057638 및 US 2006/0127950 에 보고되어 있다 (이들의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 인용됨).
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체의 항원에 대한 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 나타낸다. 고유 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (HVR) 을 포함한다. (참고, 예를 들어, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 게다가, 특별한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 참고, 예를 들어, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).
용어 "N-글리코실화 부위" 는 글리칸이 부착되거나 부착될 수 있는 N-글리코실화 부위 합의 서열 내의 아미노산 잔기를 나타낸다. 일반적으로 N-연결된 글리칸은 아스파라긴 아미노산 (Asn, N) 측쇄의 아미드 질소 원자에 부착된다. N-글리코실화 부위 합의 서열은 Asn-X-Ser/Thr 이고, 여기서 X 는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 용어 "N-연결된 글리코실화" 는 예를 들어, 아스파라긴의 아미드 질소 원자에 대한 당 분자 올리고당 (글리칸으로 나타냄) 의 부착 결과를 나타낸다.
항체 글리코실화
인간 항체는 중쇄 CH2 도메인의 약 위치 297 (Asn297) 의 아스파라긴 잔기에서 또는 다소간 푸코실화된 바이안테너리 복합체 올리고당 (상기 Kabat 에 따른 항체 아미노산 잔기 넘버링) 을 갖는 Fab 영역에서 주로 글리코실화된다. 바이안테너리 당구조는 각 팔에 있는 2 개까지 연속적인 갈락토오스 (Gal) 잔기에 의해 종료될 수 있다. 팔은 중앙 만노오스 잔기에 대한 글리코시드 결합에 따라 (1,6) 및 (1,3) 으로 표시된다. G0 로 나타낸 당구조는 갈락토오스 잔기를 포함하지 않는다. G1 로 나타낸 당구조는 한 팔에 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 함유한다. G2 로 나타낸 당구조는 각 팔에 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 함유한다 (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53). 인간 불변 중쇄 영역은 Kabat, supra 및 Brueggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527 에 상세히 보고되어 있다. 항체 Fc-영역의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들어 Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207 에 기재되어 있다.
용어 "항체" 는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 T-세포 항원 고갈 항체와 같은 다양한 형태의 항체를 나타내며 포함한다 (예를 들어, WO 98/33523, WO 98/52976, 및 WO 00/34317 참조). 하나의 구현예에서, 본원에 보고되는 방법에서 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 항체의 유전 공학은 예를 들어 하기 문헌에 기재되어 있다: Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US　5,202,238 및 US 5,204,244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125.
일반적으로 항체는 2 개의 소위 전체 길이 경쇄 폴리펩티드 (경쇄) 및 2 개의 소위 전체 길이 중쇄 폴리펩티드 (중쇄) 를 포함한다. 전체 길이 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 각각은 항원과 상호작용하는, 결합 영역을 포함하는 가변 도메인 (가변 영역) (일반적으로 전체 길이 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 부분) 을 함유한다. 전체 길이 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 각각은 불변 영역 (일반적으로 카복시 말단 부분) 을 포함한다. 전체 길이 중쇄의 불변 영역은 i) Fc 감마 수용체 (FcγR) 를 가지고 있는 세포, 예컨대 식세포, 또는 ii) 브람벨 (Brambell) 수용체로도 알려져 있는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 를 가지고 있는 세포에 대한 항체의 결합을 매개한다. 이것은 또한 고전적인 보체 시스템의 인자, 예컨대 성분 (C1q) 를 포함하는 일부 인자에 대한 결합을 매개한다. 전체 길이 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인은 상이한 분절, 즉 4 개의 프레임워크 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (CDR) 을 포함한다. "전체 길이 항체 중쇄" 는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 힌지 영역, 항체 불변 도메인 2 (CH2), 항체 불변 도메인 3 (CH3), 및 임의로는 서브클래스 IgE 의 항체의 경우 항체 불변 도메인 4 (CH4) 로 이루어지는 폴리펩티드이다. "전체 길이 항체 경쇄" 는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 및 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 으로 이루어지는 폴리펩티드이다. 전체 길이 항체 사슬은 CL-도메인과 CH1 도메인 사이 및 전체 길이 항체 중쇄의 힌지 영역 사이의 인터-폴리펩티드 디설파이드 결합을 통해 함께 연결된다.
최근 수년간, 항체의 글리코실화 패턴, 즉 부착된 당구조의 당 조성 및 규모가 생물학적 특성에 강한 영향을 미친다는 보고가 있다 (참고, 예를 들어, Jefferis, R., Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11-16). 포유동물 세포에 의해 생성된 항체는 2 내지 3 질량% 의 올리고당을 함유한다 (Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 (1985) 5551-5557). 이것은 예를 들어, 마우스 기원의 IgG 중의 2.3 올리고당 잔기 (Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394) 및 인간 기원의 IgG 중의 2.8 올리고당 잔기 (Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457) 에 대한 클래스 G 의 항체 (IgG) 에서 동등하고, 일반적으로 2 개가 Asn297 의 Fc-영역에 위치하고 나머지는 가변 영역에 존재한다 (Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31).
본 출원에서 사용 된 용어 "당구조 (glycostructure)" 는 특정 아미노산 잔기에서 단일한, 정의된 N- 또는 O-연결된 올리고당을 나타낸다. 따라서, 용어 "G1 당구조를 가진 항체" 는 Kabat 넘버링 체계에 따른 대략 아미노산 위치 297 에 아스파라긴 아미노산 잔기에서 또는 FAB 영역에서 올리고당의 비-환원 말단에 오직 하나의 말단 갈락토오스 잔기를 포함하는 바이안테너리 올리고당을 포함하는 항체를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "올리고당" 은 2 개 이상의 공유 연결된 단당류 단위를 포함하는 중합체성 당류를 나타낸다.
본 발명에서 상이한 N- 또는 O-연결된 올리고당의 표기법을 위해, 개별 당 잔기는 올리고당 분자의 비-환원 말단에서 환원 말단으로 나열된다. 가장 긴 당 사슬이 표기법의 기본 사슬로 선택된다. N- 또는 O-연결된 올리고당의 환원 말단은 항체의 아미노산 백본의 아미노산에 직접 결합되는 단당류 잔기인 반면, 기본 사슬의 환원 말단으로서 반대 말단에 위치하는, N- 또는 O-연결된 올리고당의 말단은 비-환원 말단으로 명명된다.
모든 올리고당은 본원에서 비-환원성 당류의 명칭 또는 약어 (즉, Gal) 를 기재하고, 이어서 글리코시드 결합의 배열 (α 또는 β), 고리 결합 (1 또는 2), 결합에 관여하는 환원당의 고리 위치 (2, 3, 4, 6 또는 8), 그 다음 환원성 당류의 명칭 또는 약어 (즉, GlcNAc) 로 기술된다. 각각의 당류는 바람직하게는 피라노오스이다. 표준 당생물학 (glycobiology) 명명법에 대한 리뷰는 하기 문헌을 참고한다: Essentials of Glycobiology Varki et al. eds., 1999, CSHL Press.
용어 "규정된 당구조" 는 본 출원에서 당구조의 비-환원 말단의 단당류 잔기가 특정 종류의 것인 당구조를 나타낸다. 용어 "규정된 당구조" 는 본 출원에서 당구조의 비-환원 말단의 단당류 잔기가 규정되고 특정 종류의 것인 당구조를 나타낸다.
항체 정제
본원에서 사용된 용어 "친화성 크로마토그래피" 는 "친화성 크로마토그래피 물질" 을 사용하는 크로마토그래피 방법을 나타낸다. 친화성 크로마토그래피에서, 항체는 크로마토그래피 물질의 크로마토그래피 작용기에 대한 정전기적 상호작용, 소수성 결합 및/또는 수소 결합의 형성에 따라 이들의 생물학적 활성 또는 화학적 구조에 기초하여 분리된다. 친화성 크로마토그래피 물질로부터 특이적으로 결합된 항체를 회수하기 위해, 경쟁자 리간드가 첨가되거나 또는 완충액의 pH 값, 극성 또는 이온 강도와 같은 크로마토그래피 조건이 변경될 수 있다. 예시적인 "친화성 크로마토그래피 물질" 은 금속 킬레이트 크로마토그래피 물질, 예컨대 Ni(II)-NTA 또는 Cu(II)-NTA, 또는 항체 친화성 크로마토그래피 물질, 예컨대 그곳에 공유 연결된 단백질 A 또는 단백질 G 를 포함하는 크로마토그래피 물질, 또는 효소 결합 친화성 크로마토그래피 물질, 예컨대 그곳에 공유 결합된 효소 기질 유사체, 효소 조인자 또는 효소 억제제를 크로마토그래피 작용기로서 포함하는 크로마토그래피 물질, 또는 렉틴 결합 크로마토그래피 재료, 예컨대 그곳에 공유 연결된 다당류, 세포 표면 수용체, 당단백질 또는 미손상 세포를 크로마토그래피 작용기로서 포함하는 크로마토그래피 물질이다.
하나의 구현예에서 항체 경쇄 친화성 리간드는 경쇄 불변 도메인 특이적인, 예를 들어, 카파 또는 람다 경쇄가 항체에 함유되어 있는지에 따라 카파 또는 람다 불변 경쇄에 특이적인, 포획 시약을 사용한다. 이러한 경쇄 불변 도메인 특이적 포획 시약의 예는 예를 들어, KappaSelect™ 및 LambdaFabSelect™ (GE Healthcare/BAC 로부터 이용가능) 이고, 이들은 대규모에서 높은 유속 및 낮은 배압을 허용하는 고도의 강성인 아가로오스 기반 매트릭스에 기반한다. 상기 물질은 카파 또는 람다 경쇄, 각각의 불변 영역에 결합하는 리간드를 함유한다 (경쇄의 불변 영역이 결핍된 항체 또는 그의 단편은 결합하지 않을 것임). 따라서 둘 다는 경쇄, 예를 들어, IgG, IgA 및 IgM 의 불변 영역을 함유하는 다른 표적 분자에 결합할 수 있다. 리간드는 이들을 표적 분자에 대한 결합을 쉽게 이용가능하게 만드는 긴 친수성 스페이서 팔을 통해 매트릭스에 부착된다. 이들은 인간 Ig 카파 또는 람다에 대해 스크리닝된 단일-사슬 항체 단편에 기반한다.
용어 "경쇄" 는 고유의 IgG 항체의 보다 짧은 폴리펩티드 사슬을 의미한다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 카파 (κ) 및 람다 (λ) 라고 불리는 2 개 유형 중 하나로 지정될 수 있으며, 인간 카파 경쇄 불변 도메인에 대해 SEQ ID NO:27 및 인간 람다 경쇄 불변 도메인에 대해 SEQ ID NO:28 을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "~ 에의 적용" 및 이의 문법적 등가물은 관심 성분을 함유하는 용액이 정지상과 접촉하게 되는 정제 방법의 부분 단계를 나타낸다. 정제될 관심 성분을 함유하는 용액은 고정상을 통과하여 고정상과 용액 중의 물질 간의 상호작용을 제공한다. 조건, 예컨대 pH, 전도도, 염 농도, 온도 및/또는 유속에 따라서, 용액 중 어떤 성분은 정지상에 결합하게 되고, 이로 말미암아 용액으로부터 제거된다. 다른 성분은 용액 중에 남아 있다. 용액 중에 남아있던 성분들은 통과액 (flow-through) 중에서 발견될 수 있다. "통과액" 이란, 크로마토그래피 장치를 통과한 후 수득된 용액으로서, 컬럼을 세척하는데 사용되거나 또는 정지상에 결합되어 있던 하나 이상의 성분의 용리를 야기하는데 사용되는, 관심의 성분을 함유하는 적용된 용액 또는 완충액 중 어느 하나일 수 있다. 관심의 성분은 정제 단계 후에 용액으로부터 예를 들어 침전, 염석, 한외 여과, 정용 여과, 동결 건조, 친화성 크로마토그래피 또는 용매 부피 감소와 같은 당업자에게 친숙한 방법에 의해 회수되어, 실질적으로 동종의 형태의 성분을 수득할 수 있다.
당구조가 본원에 보고된 방법에서 변형될 수 있는 항체 또는 항체 단편은 재조합 수단에 의해 생성될 수 있다. 재조합 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 항체 또는 항체 단편의 후속 단리 및 약학적으로 허용가능한 순도로의 정제를 수반하는 진핵 세포에서의 단백질 발현을 포함한다. 항체 또는 항체 단편의 발현을 위해, 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입된 하이브리도마 세포 또는 진핵 세포가 사용된다. 하나의 구현예에서, 진핵 세포는 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, BHK 세포, 토끼 세포 또는 양 세포 중에서 선택된다. 다른 구현예에서, 진핵 세포는 CHO 세포, HEK 세포 또는 토끼 세포로부터 선택된다. 발현 후, 항체 또는 항체 단편은 세포로부터 (상청액 또는 용해 후 세포로부터) 회수된다. 항체의 재조합 생산을 위한 일반적인 방법은 당 업계의 기술 수준에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880 의 리뷰 논문에 보고되어 있다.
항체의 정제는 세포 성분 또는 기타 오염물질, 예를 들어, 기타 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴드화, 컬럼 크로마토그래피, 아가로오스 젤 전기영동, 및 당업계에 잘 공지된 기타 기술을 포함하는 표준 기술에 의해 수행된다 (참고, 예를 들어, Ausubel, F.M, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (2005)). 다양한 방법들, 예컨대, 미생물 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 양이온 교환 (카복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합 방식 교환), (예를 들어, β-메르캅토에탄올 및 다른 SH 리간드를 사용한) 티오친화성 (thiophilic) 흡착, (예를 들어, 페닐-세파로스, 아자-아레노친화성 (arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용한) 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어, Ni(II)-친화성 및 Cu(II)-친화성 물질을 사용한) 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 전기영동 방법 (예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동), 뿐 아니라 이의 조합, 예컨대 친화성 크로마토그래피와 미생물 단백질, 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피가 잘 확립되어 있고, 단백질 정제를 위해 널리 사용된다 (참고, 예를 들어, Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102). 일반적인 크로마토그래피 방법과 그 용도는 당 업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 하기를 참고한다: Heftmann, E. (ed.), Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York (1992); Deyl, Z. (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands (1998); Poole, C. F., and Poole, S. K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); 또는 Ausubel, F.M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (2005).
예를 들어, 세포 배양 방법에 의해 생성된 항체 또는 항체 단편의 정제를 위해, 일반적으로 상이한 크로마토그래피 단계의 조합이 사용될 수 있다. 일반적으로 (단백질 A) 친화성 크로마토그래피 다음에는 하나 또는 두 개의 추가의 분리 단계가 뒤따른다. 하나의 구현예에서, 추가의 크로마토그래피 단계는 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계이거나 또는 그 반대이다. 최종 정제 단계는 응집된 면역글로불린, 잔류 HCP (숙주 세포 단백질), DNA (숙주 세포 핵산), 바이러스 또는 내독소와 같은 미량의 불순물 및 오염 물질을 제거하기 위한 "연마 단계" 로 불린다. 하나의 구현예에서, 최종 정제 단계는 통과 (flow-through) 방식의 음이온 교환 크로마토그래피이다.
본원에서 보고된 바와 같은 방법
재조합적으로 생산된 항체 또는 항체 단편의 당구조는 사용된 세포주 및 사용된 배양 조건에 의해 결정될 것이다. 기존의 다운스트림 프로세싱 기술을 사용하면 특정 당구조를 선택적으로 제거할 수 없다.
보다 상세하게는, 재조합적으로 생산된 모노클로날 항체는 일반적으로 글리코실화 부위에 당형태의 이종 혼합물을 포함한다. 이러한 글리코실화 프로파일은 배양 배지뿐만 아니라 숙주 세포에 존재하는 효소 활성, 및 배양 조건과 같은 재조합 생산 동안 상이한 인자에 의해 영향을 받는다.
예를 들어 다른 것들 중에서도 치료 효과와 같이 널리 퍼져 있거나 또는 심지어 미리 결정된 글리코실화를 가진 항체를 생산할 필요가 있다.
본원에 보고된 바와 같은 방법은 N-글리코실화 부위, 예를 들어 Fab 영역 또는 Fc-영역의 N-글리코실화 부위, 즉 글리코실화 부위에 부착된 단일 당형태를 본질적으로 함유하는 N-글리코실화 부위, 예를 들어 배양물로부터 항체를 수확한 후 N-글리코실화 부위에서 글리칸을 효소적으로 변형시킴으로써 Fc-영역의 Asn297 에서 규정된 글리코실화를 가진 항체를 제공하는 동시에 변형에 사용되는 효소가 여러번 재순환 및 재사용되도록 한다. 항체가 항체 친화성 리간드에 단단히 결합되기 때문에, 그 글리코실화는 원하는 방식으로 변형될 수 있고, 따라서 본원에 보고된 바와 같은 방법은 배양 상청액으로부터의 항체 정제에 사용된 표준 조작 절차에 쉽게 도입될 수 있다는 장점을 갖는다. 항체가 항체 친화성 리간드에 결합되고, 이것이 추가로 고상에 고정화될 수 있기 때문에, 그 중에서도 변형을 위해 사용되는 효소의 양은 변형이 용액에서 수행될 경우 필요할 것인 양에 비해 감소될 수 있고; 부가적으로 전체 변형은 단일 단계에서 달성될 수 있다.
용어 "규정된 글리코실화를 가진 항체" 또는 "규정된 당구조를 가진 항체" 는 제한된 수의 상이한 글리칸이, 예를 들어 Asn297 의 Fc-영역 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 에 (미리결정된) 글리코실화 부위에 부착된 항체 분자의 집단을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 글리칸 중 하나는 G0F, G1F 및 G2F 당형태의 50% 이상을 차지하거나 G0F, G1F, G2F, G1S1F, G2S1F 및 G2S2F 당형태의 30% 이상을 차지한다.
본원에서 사용된 용어 "실질적으로" 는 화합물의 40% 이상, 하나의 구현예에서는 50% 이상이 동일한 글리코실화를 갖는, 즉 N-글리코실화 부위에, 예를 들어, Fc-영역에 Asn207 (Kabat 에 따른 넘버링) 에 동일한 글리신을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 보고된 바와 같은 방법으로, 유형 및 크기에 관계없이, 항체는 규정된 당형태를 포함하도록 변형될 수 있다. 보다 구체적으로, 예를 들어 Fc-영역에서 N-글리코실화 부위의 글리코실화는 예를 들어, 항체의 의도된 치료적 적용을 위해 맞춤화될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc-영역의 갈락토실화는 암의 치료에 유용하다. 또한, 예를 들어, 항체의 Fc-영역의 규정된 당형태로의 시알릴화는 자가면역 질환의 치료에 유용하다. 상이한 용도에 있어서, Fc-영역의 탈-갈락토실화 및/또는 탈-시알릴화가 요구될 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, N-아세틸 글루코사민, GlcNAc; 또는 만노오스-N-아세틸 글루코사민-N-아세틸 글루코사민, Man-GlcNAc-GlcNAc 과 같이 GlcNAc 및 만노오스 잔기의 코어를 갖는 하이브리드 구조의 생산이 수행될 수 있다. 임의의 항체 및 상기 항체의 임의의 당구조가 본원에 보고된 방법을 일련의 방법으로 상이한 글리코실화 효소로 반복하여 원하는 규정된 당형태 항체를 생산함으로써 단계적으로 변형될 수 있으므로, 상기 임의의 것을 본원에 보고된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
예를 들어, G2 당형태를 갖는 항체는 본원에 보고된 방법을 사용하여 모노클로날 항체의 이종 집단으로부터 생산될 수 있다. 동일한 방법을 사용하여 당조작 방법으로 생산될 수 있는, 비-푸코실화 이종 항체를 동종 G2-당형태로 전환시킬 수 있다. 또한, 항체의 갈락토실화의 배치 간의 가변성은 또한 본원에 보고된 방법을 사용하여 갈락토실화를 원하는 수준으로 조절함으로써 해결될 수 있다.
간략하게, 본원에 보고된 바와 같은 방법은 N-글리코실화 부위, 예를 들어 Fc-영역에서 글리코실화를 가진 항체를 하나 이상의 글리코실화 변형 효소와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 이 인큐베이션은 온-컬럼에 이어 용액 중에서 수행된다. 반응 완충액은 선택된 2 차 효소(들), 임의로 조인자(들) 및 임의로 뉴클레오티드 당(들) 의 첨가로 더욱 최적화될 수 있다. 그 다음 실온 또는 약 37℃ 의 승온에서 혼합물을 인큐베이션한다. 변형된 항체 및 변형 효소는 이후 분리된다. 예를 들어, 변형이 용액 내에서 수행된 경우, 항체 또는 효소 (들) 또는 둘 모두는 크로마토그래피 물질에 결합되고, 순차적인 용리에 의해 서로 분리된다.
하나의 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 방법은 N-글리코실화 부위에, Fc-영역에서 글리코실화를 가진 항체를 포함하는 용액을 고상/지지체에 고정화된 항체 (경쇄 또는 Fc-영역) 친화성 리간드에 적용시키는 단계를 포함한다. 지지체는 세척 완충액으로 세척한 후 제 1 글리코실화 변형 효소를 사용하는 컬럼 당구조 변형에 상응하는 원하는 효소에 적합한 반응 완충액으로 세척되는 컬럼을 포함한다. 반응 완충액은 선택된 2 차 효소(들), 임의로 조인자(들) 및 임의로 뉴클레오티드 당(들) 의 첨가로 더욱 최적화될 수 있다. 그 다음 실온 또는 약 37℃ 의 승온에서 컬럼을 인큐베이션한다. 그 후, 컬럼을 세척 완충액으로 세척하고 용리 완충액을 사용하여 변형된 모노클로날 항체를 고체 지지체로부터 용리시킨다. 용리된 항체는 이어서 중화 완충액을 사용하여 중화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 방법은 N-글리코실화 부위에, 예를 들어, Fc-영역에서 글리코실화를 가진 항체를 포함하는 용액을 반응 완충액에서 제 2 글리코실화 효소와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 반응 완충액은 선택된 2 차 효소(들), 임의로 조인자(들) 및 임의로 뉴클레오티드 당(들) 의 첨가로 더욱 최적화될 수 있다. 그 다음 실온 또는 약 37℃ 의 승온에서 인큐베이션을 할 수 있다. 항체 및 변형 효소는 이후 크로마토그래피 단계를 사용하여 분리된다.
반응 완충액에 사용하기 위한 뉴클레오티드 당은 UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-GalNAc, UDP-GlcNAc, UDP-GlcUA, UDP-Xyl, GDP-Man, GDP-Fuc, CMP-NeuSAc, CMP-NeuSGc 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 반응 완충액에서 사용되는 농도는 약 0.5 mM 내지 약 5 mM 의 범위, 약 1 mM 내지 약 1.5 mM 의 양상이다. 반응 완충액에 사용되는 조인자는 Mn2+, Ca2+, Mg2+, Na+, K+, α-락트알부민 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 반응 완충액에서의 사용을 위한 조인자의 농도는 약 2 mM 내지 약 10 mM 의 범위일 수 있다.
항체 경쇄 친화성 리간드는 정제 및 변형 과정 중에 칼럼에 보유된 고상에 고정화된다. 고상은 비-표적 단백질 및 변형 효소의 무시할 정도의 비-특이적 흡착을 제공하는, 아가로오스, 세파로오스, 폴리아크릴, 폴리스티렌 및 다른 합성 중합체를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 친화성 리간드는 예를 들어 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르, 에폭시드, 알데히드 또는 시아노겐 브로마이드와 같은 다양한 화학 물질 중 임의의 것에 의해 고상에 공유 결합된다. 이러한 접합 화학은 하기에 예시되는 바와 같이, 당업계에 잘 공지된다: Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (Amsterdam, the Netherlands, Ed. 2008) 및 Wong, S., Chemistry of Protein Conjugation and CrossLinking, CRC Press (Boca Raton, Fla., 1991).
세척 완충액은 세척 단계 동안 항체와 친화성 리간드 사이의 높은 친화도가 유지되도록 한다. 예를 들어, 약 7.2 의 pH 를 갖는 인산 완충 식염수 용액 (PBS) 이 세척 완충제로서 사용될 수 있지만, 당업자는 pH 가 어느 정도 변할 수 있음을 이해한다. 세척 및 반응 완충액은 항체와 친화성 리간드 사이의 높은 친화도가 유지됨과 동시에 각각의 효소 (들) 의 활성이 유지되는 것을 보증한다. 세척 및 반응 완충액은 약 25℃ 내지 약 40℃ 의 온도 및 그 사이의 임의의 온도에서 사용된다. 약 37℃ 의 온도가 자주 사용된다. 경쇄 친화성 리간드에 대한 항체의 고 친화성을 위한 최적 pH 범위는 약 6.0 내지 약 8.0 이다. 이러한 pH 범위 내에서, 완충액은 본원에 보고된 바와 같은 방법에서 사용될 수 있는 친화성 리간드의 최적 pH 범위와 중첩된다. 이들은 TRIS 완충액, BIS-TRIS 완충액, MES 완충액, BES 완충액, MOPS 완충액 및 HEPES 완충액을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
친화성 컬럼의 세척 조건은 비-특이적 결합을 최소화하여 효소 반응 및 그에 따른 항체 변형에 영향을 미친다. 세척 조건은 항체 경쇄 친화성 리간드와 표적 모노클로날 항체 사이의 결합을 파괴시키지 않는 조건이다.
본원에 보고된 바와 같은 방법에서의 사용에 적합한 효소는 만노실-글루코사민 트랜스퍼라제 (MGAT1, MGAT2 및 MGAT3); 갈락토실트랜스퍼라제 (β4GalT1, β4GalT2, β4GalT3, β4GalT4, β4GalT5, β4GalT6, β4GalT7), 시알릴트랜스퍼라제 (ST6Gal1, ST6Gal2); 만노시다아제 (α 만노시다제-I, α 만노시다제-II, α(1-2) 만노시다아제, α(1-6) 만노시다아제, α(1-2,3) 만노시다아제, α(1-2,3,6) 만노시다제); 헥소사미니다제 (β-N-아세틸 헥소사미니다제, β-N-아세틸 글루코사미니다제, α-N-아세틸 글루코사미니다제); 갈락토시다제 (β-갈락토시다제, β(1-4) 갈락토시다제, α(1-3,6) 갈락토시다제); 시알리다제 (α(2-3,6,8) 시알리다제, α(2-3) 시알리다제), 푸코시다제 (α-L-푸코시다제, α(1-6) 푸코시다제, α(1-2) 푸코시다제, α(1-3,4) 푸코시다제, α(1-2,3,4) 푸코시다제) 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 변형에 따라 선택될 수 있다.
본원에 보고된 방법은 예를 들어 Fc-영역에서, 동종 G2 당구조를 갖는 항체의 생성을 위해 갈락토오스로부터 말단 시알산을 제거 또는 첨가하는데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 임의의 결합으로부터 시알산을 제거하는 비-특이적 뉴라미니다제 효소 또는 각각의 시알산을 첨가하는 특정 시알리다제를 사용할 수 있다. 이 효소는 갈락토실트랜스페라제와 조합으로 사용하여 갈락토실화 및 시알산의 제거 또는 첨가에 동시에 작용할 수 있다. 따라서, Fc-영역에, 규정된 G2 당형태를 갖는 항체는 적어도 당형태 G0, G1, G2, G1S1 및 G2S2 를 포함하는, Fc-영역에 글리코실화를 가진 항체로부터 수득될 수 있다.
이들 프로토콜 중 어느 것이든 용액 반응에서 완전히 변형된 것 또는 단백질 A 에 고정화된 항체로 변형된 것에 비해 개선된 변형을 초래한다.
본원에 보고된 바와 같은 방법에서 사용되는 효소 변형 단계는 상응하는 트랜스퍼라제 효소의 사용에 의해 Fc-영역에 규정된 갈락토실화 및 시알릴화를 갖는 항체를 제공함으로써 하기에 예시된다.
온-칼럼 갈락토실화
IgG1 서브클래스의 정제된 인간화 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질 및 항체 경쇄 친화성 리간드 크로마토그래피 물질 (GE Healthcare 사의 Kappa select) 에 적용하였다. 결합된 항체를 갈락토실트랜스페라제 (GalT1) 및 UDP-GAL 을 포함하는 완충액으로 온-컬럼 인큐베이션하였다. 결과를 하기 표에 제시한다. 항체가 항체 경쇄 친화성 리간드를 포함하는 컬럼에 결합될 때 더 많은 양의 갈락토실화가 달성됨을 볼 수 있다.
Figure 112019063046676-pct00022
G0F = 2 개의 말단 N-아세틸 글루코사민 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합 N-글리칸
G1F = 1 개의 말단 N-아세틸 글루코사민 잔기 및 1 개의 말단 갈락토오스 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합 N-글리칸
G2F = 2 개의 말단 갈락토오스 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합 N-글리칸
Fc-영역에 동종 글리코실화 (동종 G2F 당형태) 를 갖는 IgG1 서브클래스의 정제된 인간화 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질 및 항체 경쇄 친화성 리간드 크로마토그래피 물질 (GE Healthcare 사의 Kappa select) 에 적용하였다. 결합된 항체를 갈락토실트랜스페라제 (ST6) 및 CMP-NANA 를 포함하는 완충액으로 온-컬럼 인큐베이션하였다. 결과를 하기 표에 제시한다. 항체가 항체 경쇄 친화성 리간드를 포함하는 컬럼에 결합될 때 더 많은 양의 시알릴화가 달성됨을 볼 수 있다.
Figure 112019063046676-pct00023
Figure 112019063046676-pct00024
알칼리성 포스파타아제의 존재 또는 부재는 단백질 A 칼럼 (19 % G2F, 56 % G2S1F, 25 % G2S2F) 의 수율을 변화시키지 않았다. 용액에서 다음 결과를 얻을 수 있다.
Figure 112019063046676-pct00025
G2F = 2 개의 말단 갈락토오스 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합 N-글리칸
G2S1F = 2 개의 말단 갈락토오스 잔기 (하나는 시알리화됨) 및 푸코오스를 갖는 복합 N-글리칸
G2S2F = 2 개의 말단 갈락토오스 잔기 (둘다 시알리화됨) 및 푸코오스를 갖는 복합 N-글리칸
IgG4 서브클래스의 인간 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질 및 항체 경쇄 친화성 리간드 크로마토그래피 물질 (GE Healthcare 사의 Kappa select) 에 적용하였다. 결합된 항체를 갈락토실트랜스페라제 (GalT1) 및 UDP-GAL 을 포함하는 완충액으로 온-컬럼 인큐베이션하였다. 결과를 하기 표에 제시한다. 항체가 항체 경쇄 친화성 리간드를 포함하는 컬럼에 결합될 때 더 많은 양의 갈락토실화가 달성됨을 볼 수 있다.
Figure 112019063046676-pct00026
G0F = 2 개의 말단 N-아세틸 글루코사민 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합 N-글리칸
G1F = 1 개의 말단 N-아세틸 글루코사민 잔기 및 1 개의 말단 갈락토오스 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합 N-글리칸
G2F = 2 개의 말단 갈락토오스 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합 N-글리칸
Fc-영역에 동종 글리코실화 (동종 G2F 당형태) 를 갖는 IgG4 서브클래스의 인간 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질 및 항체 경쇄 친화성 리간드 크로마토그래피 물질 (GE Healthcare 사의 Kappa select) 에 적용하였다. 결합된 항체를 갈락토실트랜스페라제 (ST6) 및 CMP-NANA 를 포함하는 완충액으로 온-컬럼 인큐베이션하였다. 결과를 하기 표에 제시한다. 항체가 항체 경쇄 친화성 리간드를 포함하는 컬럼에 결합될 때 더 많은 양의 시알릴화가 달성됨을 볼 수 있다.
Figure 112019063046676-pct00027
n.d. = 확인되지 않음
Fab 에 부가적인 글리코실화 부위를 갖는 IgG1 서브클래스의 인간화 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질 및 항체 경쇄 친화성 리간드 크로마토그래피 물질 (GE Healthcare 사의 Kappa select) 에 적용하였다. 결합된 항체를 갈락토실트랜스페라제 (ST6) 및 CMP-NANA 를 포함하는 완충액으로 온-컬럼 인큐베이션하였다. 결과를 하기 표에 제시한다. 이 예에서 Fab 에서의 N-갈락토실화 부위의 글리코실화가 변형되었다. 항체가 항체 경쇄 친화성 리간드를 포함하는 컬럼에 결합될 때 개선된 반응 속도 (reaction kinetic) 가 달성됨을 볼 수 있다.
Figure 112019063046676-pct00028
G2 = 2 개의 말단 갈락토오스 잔기를 갖는 복합 N-글리칸　
G2S1 = 2 개의 말단 갈락토오스 잔기 (하나는 시알리화됨) 를 갖는 복합 N-글리칸　
G2S2 = 2 개의 말단 갈락토오스 잔기 (하나는 시알리화됨) 를 갖는 복합 N-글리칸　
IgG1 서브 클래스의 인간화 항체를 포함하는 무-세포 배양 상청액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질 및 항체 경쇄 친화성 리간드 크로마토그래피 물질 (GE Healthcare 사의 Kappa select) 에 적용하였다. 결합된 항체를 처음 갈락토실트랜스페라제 (GalT1) 및 UDP-GAL 을 포함하는 완충액으로, 두번째 시알릴트랜스퍼라제 (ST6) 및 CMP-NANA 를 포함하는 완충액으로 순차적으로 온-컬럼으로 인큐베이션하였다. 결과를 하기 표에 제시한다. 시알릴트랜스퍼라제는 6 시간의 인큐베이션 시간 후에 첨가되었다.
단백질 A
Figure 112019063046676-pct00029
Kappa select
Figure 112019063046676-pct00030
정제된 벌크 물질에 대해서도 동일한 실험을 반복하였다.
단백질 A
Figure 112019063046676-pct00031
Kappa select
Figure 112019063046676-pct00032
24 시간 후 시알릴트랜스페라제를 첨가한 kappa select 방법의 개선
Figure 112019063046676-pct00033
온-컬럼에서 사용되었을 때 효소 재순환
IgG1 서브클래스의 재조합 인간화 항체를 친화성 크로마토그래피 물질에 항체가 상기 물질에 결합된 조건 하에 적용하였다. 결합된 항체를 갈락토실트랜스페라제 (GalT1) 및 UDP-GAL 을 포함하는 완충액으로 온-컬럼 인큐베이션하였다. 이 용액은 인큐베이션 후 회수되었고, 추가의 효소적 변형 반응을 위한 농도 및 완충액 교환에 의해 재조건화되었다. 결과를 하기 표에 제시한다 (24 시간 시점).
Figure 112019063046676-pct00034
갈락토실트랜스페라제는 효소 전환 효율의 손실없이 한 번 재사용될 수 있고, 약 50% 의 효소 전환 효율의 손실로 두 번 재사용될 수 있음을 알 수 있다.
IgG1 서브클래스의 재조합 인간화 항체를 친화성 크로마토그래피 물질에 항체가 상기 물질에 결합된 조건 하에 적용하였다. 결합된 항체를 시알릴트랜스페라제 (ST6) 및 CMP-NANA 를 포함하는 완충액으로 온-컬럼 인큐베이션하였다. 이 용액은 회수되고, 인큐베이션 후 추가의 효소적 변형 반응을 위한 농도 및 완충액 교환에 의해 재조건화되었다. 결과를 하기 표에 제시한다 (6 시간 시점).
효소 농도 4 mg/ml
Figure 112019063046676-pct00035
효소 농도 1 mg/ml
Figure 112019063046676-pct00036
시알릴트랜스페라제는 효소 전환 효율의 손실없이 적어도 3 번 재사용될 수 있음을 알 수 있다.
용액에서 사용되었을 때 효소 재순환
GalT 와 ST6 과의 공동-인큐베이션
UDP-GAL 및 CMP-NANA 를 포함하는 반응 완충액에, IgG1 서브클래스의 인간화 항체, 갈락토실트랜스페라제 (GalT1) 및, 시알릴트랜스페라제 (ST6) 를 공동-인큐베이션하였다. 그 후, 효소적으로 변형된 항체 및 효소를 양이온 교환 크로마토그래피 (S-sepharose) 를 사용하여 분리하였다. 회수된 효소의 특정 효소 활성은 각 사용 사이클 후에 측정하였다. 결과를 하기 표에 제시한다.
Figure 112019063046676-pct00037
반응 조건: 25 mg 항체, 2.5 mg GalT, 2.5 mg ST6, 50 mM MES, pH 6.4, 10 ml 반응 부피
S-세파로스 (S-Sepharose) 크로마토그래피 조건: 0.5x10 cm S-세파로스 컬럼; 20 컬럼 부피 40 mM TRIS pH 7.4 Tris-HCl 로 세척으로 GalT 가 용리됨; 30 mM MES, 95 mM NaCl, pH 5.6 로의 단계로 항체의 용리; 50 mM MES, pH 6.4, 1 M NaCl 로의 선형 구배로 ST6 의 용리
SDS-페이지 겔 분석은 GalT 또는 ST6 의 분해 또는 응집 생성물 및 양호한 분리를 나타내지 않았다 (도 1 참조).
GalT, 변형된 항체 및 ST6 은 양이온 교환 컬럼 상에서 분리될 수 있었다.
GalT 와의 인큐베이션
UDP-GAL 을 포함하는 반응 완충액에, IgG1 서브클래스의 인간화 항체 및 갈락토실트랜스페라제 (GalT1) 를 공동-인큐베이션하였다. 그 후, 효소적으로 변형된 항체 및 효소를 양이온 교환 크로마토그래피 (S-sepharose) 를 사용하여 분리하였다. 갈락토실트랜스페라제는 3 번 재사용되었다. 결과를 하기 표에 제시한다.
Figure 112019063046676-pct00038
ST6 과의 인큐베이션
CMP-NANA 를 포함하는 반응 완충액에, IgG1 서브클래스의 인간화 항체 및 시알릴트랜스페라제 (ST6) 를 공동-인큐베이션하였다. 그 후, 효소적으로 변형된 항체 및 효소를 양이온 교환 크로마토그래피 (S-sepharose) 를 사용하여 분리하였다. 시알릴트랜스페라제는 3 번 재사용되었다. 결과를 하기 표에 제시한다.
Figure 112019063046676-pct00039
본원에 보고된 방법에서 사용된 항체
키메라 및 인간화 항체
특정 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 방법에서 변형된 항체는 키메라 항체이다.
특정 키메라 항체는 예를 들어, US 4,816,567; 및 Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 에 기재된다. 하나의 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모체 항체의 것으로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 본원에서 보고된 방법에서 사용된 항체 경쇄 친화성 리간드에 결합하는 한, 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모체 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 이의 일부) 이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 이의 일부) 가 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의로는 또한, 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화 항체 중의 일부 FR 잔기는 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체) 유래의 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성이 복원되거나 또는 개선된다.
인간화 항체 및 이들의 제조 방법은 예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 에 기재되어 있으며, 예를 들어 Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5, 821,337, US　7,527,791, US 6,982,321, 및 US 7,087,409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (특이성 결정 영역 (SDR) 그래프팅을 설명); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (“재표면화 (resurfacing)” 를 설명); Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (“FR 셔플링” 을 설명); 및 Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 및 Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (FR 셔플링에 대한 “가이드 선택” 접근법을 설명) 에 추가로 기재된다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "베스트-핏 (best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (참고, 예를 들어, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브그룹의 인간 항체의 합의 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고, 예를 들어, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); 인간 성숙 (체세포 돌연변이) 프레임워크 영역 또는 인간 생식 세포주 프레임워크 영역 (참고, 예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고, 예를 들어, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 및 Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618) 을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
인간 항체
특정 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 방법에서 변형된 항체는 인간 항체이다.
인간 항체는 당분야에 공지된 다양한 기술을 사용해 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 하기 문헌에 기재된다: van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 및 Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.
인간 항체는 항원 공격에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 온전한 인간 항체 또는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내생성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나, 또는 염색체외로 존재하거나 또는 동물의 염색체에 무작위적으로 통합된, 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내생성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 리뷰를 위해, 하기 문헌을 참고한다: Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. 또한 예를 들어, XENOMOUSETM 기술을 설명하는 US　6,075,181 및 US 6,150,584; HUMAB® 기술을 설명하는 US 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 설명하는 US 7,041,870; VELOCIMOUSE® 기술을 설명하는 US 2007/0061900; 면역재구성 마우스를 설명하는 WO 2007/131676 을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역을 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 추가로 변형시킬 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법으로 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 기재되어 있다 (참고, 예를 들어, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; 및 Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95) 에 의해 제조될 수 있다. 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 하기 문헌에 기재된다: Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562. 추가의 방법은 예를 들어, US 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 설명함) 및 Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (인간-인간 하이브리도마를 설명함) 에 기술된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술) 이 또한 문헌 [Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937] 및 [Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191]에 기술되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이러한 가변 도메인 서열은 이후에 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기술은 하기에 기술한다.
라이브러리-유래 항체
본원에서 보고된 바와 같은 방법에서 변형된 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 이러한 라이브러리를 바람직한 결합 특징을 보유하는 항체에 대해 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 방법들은 예를 들어, Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 에서 리뷰되어 있고, 예를 들어, 하기 문헌에 추가로 기재되어 있다: McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; 및 Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132.
특정한 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 개별적으로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이들은 이후 하기 문헌에 기재되는 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다: Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455. 파지는 전형적으로 단쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서, 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터 얻은 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 높은-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 (naive) 레파토리는 단일한 항체 공급원을 Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734 에 의해 기재되는 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가-항원에 제공하기 위해 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한 문헌 Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 에 의해 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 비-재배열된 V-유전자 분절을 클로닝하고, 고도의 가변 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관 내 재배열을 달성하기 위해 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써 종합적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허 공개문헌은, 예를 들어 하기를 포함한다: US 5,750,373, 및 US 2005/0079574, US　2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US　2007/0237764, US 2007/0292936, 및 US 2009/0002360.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본 명세서에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주한다.
다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 방법에서 변형된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2 개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 이중특이적 항체는 전체 길이 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다. 다중특이적 (이중특이적) 항체의 단편은 이들이 본원에서 보고된 방법에서 사용된 항체 경쇄 친화성 리간드에 결합하는 한 포함된다.
다중특이적 항체를 만들기 위한 기법은 비제한적으로 하기를 포함한다: 상이한 특이성을 갖는 2 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현 (Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, 및 Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659 참조), 및 "놉-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, US 5,731,168 참조). 다중-특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이량체 분자를 만들기 위한 정전 스티어링 효과 (electrostatic steering effect) 조작 (WO 2009/089004); 2 개 이상의 항체 또는 단편의 교차결합 (예를 들어, US 4,676,980, 및 Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83 참조); 이중특이적 항체를 생성하기 위한 류신 지퍼 사용 (예를 들어, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553 참조); 이중특이적 항체 단편을 생성하기 위한 "디아바디" 기술 사용 (예를 들어, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참조); 및 단일 사슬 Fv (sFv) 이량체 사용 (예를 들어 Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374 참조); 및 삼중특이적 항체 제조 (예를 들어, Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69) 에 의해 제조될 수 있다.
3 개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체, 예컨대 "문어 (Octopus) 항체" 가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어 US 2006/0025576 참조).
본원에 보고된 방법에서 변형된 항체 또는 단편에는 또한 "이중 작용 (Dual Acting) Fab" 또는 "DAF" 가 포함된다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2010/145793 에 기재된 다중특이적 항체를 포함한다.
재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들어 US 4,816,567 에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 이들 방법에 대해, 항체를 인코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산(들) 이 제공된다.
천연 항체 또는 천연 항체 단편의 경우, 2 개의 핵산이 필요하며, 하나는 경쇄 또는 그의 단편이고, 하나는 중쇄 또는 그의 단편이다. 이러한 핵산(들) 은 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄(들)) 을 인코딩할 수 있다. 이들 핵산은 동일한 발현 벡터 상에 또는 상이한 발현 벡터 상에 존재할 수 있다.
이종이량체 중쇄를 갖는 이중특이적 항체의 경우 4 개의 핵산이 필요한데, 하나는 제 1 경쇄, 하나는 제 1 이종단량체 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 제 2 경쇄, 하나는 제 2 경쇄, 및 제 2 이종단량체 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 제 2 경쇄이다. 예를 들어, 이종이량체 중쇄 중 하나는 소위 "놉 (knobs) 돌연변이" (T366W 및 선택적으로 S354C 또는 Y349C 중 하나) 를 포함하고, 다른 하나는 소위 "홀 (hole) 돌연변이" (T366S, L368A 및 Y407V 및 선택적으로 Y349C 또는 S354C) 를 포함한다 (참고, 예를 들어, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73). 이러한 핵산(들) 은 항체의, 제 1 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 제 1 이종단량체 Fc-영역을 포함하는 제 1 VH 를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 제 2 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 제 2 이종단량체 Fc-영역을 포함하는 제 2 VH 를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 제 1 및/또는 제 2 경쇄 및/또는 제 1 및/또는 제 2 중쇄) 을 인코딩한다. 이들 핵산은 동일한 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터 상에 존재할 수 있으며, 통상 이들 핵산은 2 개 또는 3 개의 발현 벡터 상에 위치한다, 즉, 하나의 벡터는 이들 핵산 중 1 개 초과를 포함할 수 있다. 이러한 이중특이성 항체의 예는 CrossMabs 및 T-세포 이중특이적 항체이다 (참고, 예를 들어, Schaefer, W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108 (2011) 11187-1191).
하나의 구현예에서, 본원에서 기재되는 방법에서 사용되는 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다.
추가의 구현예에서, 이러한 헥산(들) 을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다.
추가의 구현예에서, 이러한 핵산(들) 을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
하나의 이러한 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들어, 하기로 형질전환된다):
- 천연 항체 또는 천연 항체 단편의 경우:
(1) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는
(2) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터.
- 이종이량체 중쇄를 갖는 이중특이적 항체의 경우:
(1) 항체의 제 1 VL 을 포함하는 하나의 아미노산 서열 및 항체의 제 1 VH 를 포함하는 다른 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산의 제 1 쌍을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 제 2 VL 을 포함하는 하나의 아미노산 서열 및 항체의 제 2 VH 를 포함하는 다른 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산의 제 2 쌍을 포함하는 제 2 벡터, 또는
(2) 가변 도메인 (바람직하게는 경쇄 가변 도메인) 중 하나를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 제 1 핵산을 포함하는 제 1 벡터, 경쇄 가변 도메인을 포함하는 하나의 아미노산 서열 및 제 1 중쇄 가변 도메인을 포함하는 다른 아미노산 서열을 인코딩하는 한 쌍의 핵산을 포함하는 제 2 벡터, 및 하나는 제 2 벡터에서와 같이 각각의 다른 경쇄 가변 도메인을 포함하고 다른 하나는 제 2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 한 쌍의 핵산을 포함하는 제 3 벡터, 또는
(3) 항체의 제 1 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터, 항체의 제 1 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터, 항체의 제 2 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 3 벡터 및 항체의 제 2 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 4 벡터.
하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 하나의 구현예에서, 상기 제공된, 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 항체를 회수하는 단계, 및 본원에 보고된 방법으로 항체의 글리코실화를 변형시키는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법이 제공된다.
항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하고 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 이러한 핵산은 종래의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열분석되거나 재조합 방법에 의해 제조되거나 화학 합성에 의해 수득될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 항체는 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523 을 참조한다 (참고, 또한 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 (대장균에서의 항체 단편의 발현을 설명함). 발현 후, 항체는 가용성 분획의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵세포에 추가로, 글리코실화 경로가 "인간화" 되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 초래하는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵세포성 미생물이 항체-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참고: Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
글리코실화된 항체의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 에서 유래한다. 무척추동물 세포의 예로서는 식물 세포와 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인되어 있다.
식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서의 항체 생성을 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명함) 를 참조한다.
척추동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁 성장에 적합화된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7); 인간 배아 신장 주 (예를 들어, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. P., Biol. 36 (1977) 59-74 에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (TM4 세포, 예를 들어, 하기 문헌에 기재됨, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); TRI 세포, 예를 들어, 하기 문헌에 기재됨: Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포 (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220) 를 포함하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대, Y0, NS0 및 Sp2/0 를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정한 포유동물 숙주 세포주의 리뷰를 위해서는, 예를 들어, 하기 문헌을 참고한다: Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.
약학 제형
본원에 보고된 방법의 임의의 것으로 변형된 항체의 약학 제형은 원하는 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)) 와 혼합함으로써, 동결건조된 형태 또는 수용액의 형태로 제조한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 일반적으로 무독성이고, 제한 없이: 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이 포함된다. 본 명세서에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 간질성 약물 분산제 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 을 포함한다. rhuPH20 을 포함하여, 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968 에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP 는 하나 이상의 부가적인 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 US 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 US 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 명세서에서 제형은 또한 치료하려는 특정 징후에 필요하다면 하나를 초과하는 활성 성분, 바람직하게 서로 부정적으로 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수도 있다. 이러한 활성 성분은 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 미세캡슐, 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 미세에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀션에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)] 에 개시되어 있다.
서방출 제제를 제조할 수 있다. 서방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스 (매트릭스는 성형 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태임) 를 포함한다.
생체내 투여에 사용할 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 보고된 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체 중 임의의 것이 치료 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, 의약으로서 사용하기 위한 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체가 제공된다. 추가의 양상에서, 질환 치료에 사용하기 위한 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 유효량의 본원에서 보고하는 바와 같은 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체를 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 개인을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체를 제공한다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 유효량의 적어도 하나의 추가적 치료제를 개인에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 유효량의 본원에서 보고하는 바와 같은 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체를 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 개인에서의 치료 방법에서 사용하기 위한 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체를 제공한다. 임의의 상기 구현예에 따라서 "개인" 은 바람직하게 인간이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 의약의 생산 또는 제조에서의, 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체의 용도를 제공한다. 하나의 구현예에서, 의약은 질환의 치료를 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 의약은 질환을 가진 개인에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 유효량의 적어도 하나의 추가적 치료제를 개인에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 의약은 개인에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는 개인에서의 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 구현예에 따라 "개인" 은 인간일 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 방법은 유효량의 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체를 이러한 질환을 갖는 개인에게 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 유효량의 적어도 하나의 추가적 치료제를 개인에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 구현예에 따라 "개인" 은 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 예를 들어 상기 임의의 치료 방법에서 사용하기 위한, 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체를 포함하는 약학적 제형을 제공한다. 하나의 구현예에서, 약학 제형은 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약학 제형은 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체 및 적어도 하나의 부가적인 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 요법에서 다른 작용제와 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 부가적인 치료제와 공동-투여될 수 있다.
상기 나타낸 이러한 조합 치료요법은 병용 투여 (둘 이상의 치료제가 동일 또는 개별 제형에 포함됨), 및 개별 투여 (이 경우, 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체의 투여가 부가적인 치료제(들) 의 투여 이전, 동시 및/또는 이후에 발생할 수 있음) 를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체의 투여 및 부가적인 치료제의 투여는 서로 약 1 개월 내, 또는 약 1, 2 또는 3 주 내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 일 내 발생한다. 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체는 또한 방사선 치료요법과 조합으로 사용될 수 있다.
본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체 (및 임의의 부가적인 치료제) 은 임의의 적합한 수단, 예컨대 비경구, 폐내 및 비강내, 및 국부 치료에 대해 필요시, 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대 부분적으로 투여가 단시간인지 또는 만성인지 여부에 따라서, 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 제한없이 다양한 시점에 단회 또는 다수회 투여, 볼러스 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투약 스케쥴이 본 명세서에서 고려된다.
본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체는 표준 의료 행위 기준 (good medical practice) 과 일치하는 방식으로 제형화되고, 투약되고 투여될 수 있다. 이러한 점에서 고려되는 인자들은 치료하려는 특정 장애, 치료하려는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 항체는 논의의 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제일 필요는 없으나, 임의로 제형화된다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 인자에 따라 다르다. 이들은 일반적으로 본 명세서에서 기술된 바와 동일한 용량 및 투여 경로로 사용되거나, 또는 본 명세서에 기술된 용량의 약 1 내지 99%, 또는 임의 용량으로, 실험적으로/임상적으로 적당하다고 결정된 임의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원에 보고되는 방법 중 임의의 것으로 변형된 항체의 적합한 투약량 (단독으로 또는 하나 이상의 기타 부가적인 치료제와 조합으로 사용되는 경우) 은 치료하고자 하는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 심각도 및 경과, 항체가 예방적 또는 치료적 목적에 따라 투여되는 지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상적 이력 및 항체에 대한 반응, 및 참여하는 의사의 재량에 따라 다를 것이다. 항체는 1 회로 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 심각도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.5 mg/kg - 10 mg/kg) 의 항체가, 예를 들어, 하나 이상의 개별적 투여에 의한 것인지, 또는 연속 투입에 의한 것인지에 따라, 환자에 대한 투여를 위한 초기 후보 투약량일 수 있다. 한가지 전형적인 1일 용량은 상기 언급된 인자들에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상 동안 반복 투여를 위해서, 병태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 바람직한 저해가 일어날 때까지 지속되어진다. 항체의 하나의 예시적인 투약량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5　mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3 주마다 (예를 들어 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어 약 6 용량의 항체를 받도록) 투여될 수 있다. 초기에 더 높은 적재 용량 이후에 하나 이상의 낮은 용량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 용량 계획이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 어세이를 통해 쉽게 모니터링된다.
본원에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원 및 공개의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
하기의 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 제시되어 있다. 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고, 제시된 절차들에 수정이 가하여질 수 있음이 이해된다.
도 1 본원에 보고되고 실시예 5 에 따른 S-세파로스 분리의 용리된 분획의 SDS-페이지를 나타낸다.
실시예
GalT 반응 용액 (5 mM MnCl2, 10 mM UDP-Gal, 100 mM MES, 0.05　mg/ml GalT, pH 6.5)
153 mg UDP-Gal (MW=610.27 g/mol)
32 mg MnCl2 (MW=125.84 g/mol)
단일 사용: 460 ㎕ GalT (c=5.43 mg/mL; 10 ㎍/2 mg 항체 --> 300 ㎕ 중 10 ㎍ = 0.033 mg/ml)
다중 사용: 460 ㎕ GalT (c=5.43 mg/mL; 15 ㎍/1 mg AK --> 300 ㎕ 중 15 ㎍ = 0.05 mg/mL)
100 mM MES 완충액 pH 6.5 중
ST6 반응 용액 (0.1 mM ZnCl2, 200 nM AP, 50 mM MES, 1.7 mg/ml CMP-NANA, 0.7 mg/ml ST6, pH 6.5)
50 ㎕ ZnCl (100 mM 용액: 1 mL 50 mM MES 중 13.6 mg)
28 ㎕ 알칼리 포스파타아제 (AP) (c = 20 mg/mL, MW = 56,000g/mol)
단일 사용: 167 mg CMP-NANA (1000 ㎍/2 mg 항체 --> 300 ㎕ 중 1000 ㎍ = 3.34 mg/mL)
다중 사용: 83.5 mg CMP-NANA (500 ㎍/1 mg AK --> 300 ㎕ 중 500 ㎍ = 1.67 mg/mL)
단일 사용: 6 mL ST6 (c=5.45 mg/mL, 표적: 300 ㎕ 중 200 ㎍ (2 mg AK) = 0.67　mg/mL)
다중 사용: 6 mL ST6 (c=5.45 mg/mL, 표적: 300 ㎕ 중 200 ㎍ (1 mg AK) = 0.67 mg/mL)
50 mM MES 완충액 pH 6.5 중
완충액:
재생 완충액 1 (0.1 M 인산)
재생 완충액 2 (3 M 구아니딘-HCl)
평형 완충액 (25 mM Tris, 25 mM NaCl, 5mM EDTA, pH7.1)
세척 완충액 1 (100 mM MES, pH 6.5): 1000 mL H2O, pH 6.5 (50　% (w/v) NaOH 로 조정됨) 중 21.3 mg MES
세척 완충액 2 (1 mM MES, pH 7.2)
세척 완충액 3 (50 mM MES, pH 6.5): 세척 완충액 100 mM MES 1:1 (증류 H2O 와)
용리 완충액 Kappa select (0.1 M 글리신, pH 2.7): 100 mL H2O, pH 2.7 (25 % (w/v) NaOH 로 조정됨) 중 750 mg 글리신
용리 완충액 단백질 A (25 mM Na-시트레이트, pH 2.8)
실시예 1
칼럼 상의 벌크 물질의 갈락토실화
· Kappa select 컬럼에 2 컬럼 부피 재생 완충액 1, 10 컬럼 부피 평형 완충액 및 4 컬럼 부피 세척 완충액 1 을 적용함으로써 단백질 A 를 각각 재생, 평형 및 세척함
· 2 mg 의 IgG (벌크 물질) 를 컬럼 상에 적용함
· 10 컬럼 부피 세척 완충액 1 로 세척함
· 2 mL 갈락토실화 반응 용액 (0.033 mg/ml GalT) 을 적용하고, 0.8 mL 통과 (flow through) 하게 함
· 각각 25℃ (2, 7 또는 24 h) 에서 인큐베이션함
· 8 컬럼 부피 세척 완충액 1 로 세척함
· 각각의 용리 완충액 (단백질 A 에 대해 2 컬럼 부피; kappa select 에 대해 8 컬럼 부피) 으로 용리시키고 pH 조절을 위해 1 M Tris 완충액 (pH 9.0) 을 사용함
실시예 2
컬럼 상의 IgG1 벌크 물질의 시알릴화 (단백질 A)
· Kappa Select 컬럼에 2 컬럼 부피 재생 완충액 1, 10 컬럼 부피 평형 완충액 및 10 컬럼 부피 세척 완충액 3 을 적용함으로써 단백질 A 를 각각 재생, 평형 및 세척함
· 2 mg 의 IgG (벌크 물질) 를 컬럼 상에 적용함
· 2 mL 시알릴화 반응 용액 (1.7　mg/ml 대신 3.3 mg/ml CMP-NANA, +/- AP) 을 적용하고, 0.8 mL 통과 (flow through) 하게 함
· 각각 37℃ (2, 7, 24 또는 48 시간) 및 25℃ (48 h) 에서 인큐베이션함
· 4 컬럼 부피 세척 완충액 3 으로 세척함
· 2 컬럼 부피의 용리 완충액 (소듐 시트레이트) 로 용리시키고 pH 조절을 위해 1M Tris 완충액 (pH 9.0) 을 사용함
컬럼 상의 IgG1 벌크 물질의 시알릴화 (Kappa select)
· Kappa select 컬럼에 2 컬럼 부피 평형 완충액, 3 컬럼 부피 재생 완충액 2, 4 컬럼 부피 평형 완충액 및 2 컬럼 부피 세척 완충액 3 을 적용함으로써 단백질 A 를 각각 재생, 평형 및 세척함
· 2 mg 의 IgG (벌크 물질) 를 컬럼 상에 적용함
· 3 컬럼 부피 세척 완충액 3 으로 세척함
· 2 mL 시알릴화 반응 용액 (3.3 mg/ml CMP-NANA, +/- AP) 을 적용하고, 0.8 mL 통과 (flow through) 하게 함
· 각각 37℃ (2, 7 및 24 h) 및 25℃ (24 h) 에서 인큐베이션함
· 3 컬럼 부피 세척 완충액 3 으로 세척함
· 8 컬럼 부피의 용리 완충액으로 Kappa select 를 용리시키고 pH 조절을 위해 1M Tris 완충액 (pH 9.0) 을 사용함
실시예 3
세포 배양 상청액의 순차적 갈락토실화 및 시알릴화
· Kappa select 컬럼에 2 컬럼 부피 재생 완충액 1, 10 컬럼 부피 평형 완충액을 적용함으로써 단백질 A 를 각각 재생 및 평형시킴
· 1 mg 의 IgG (상청액 중) 를 컬럼 상에 적용함
· 10 컬럼 부피 평형 완충액, 그 다음 2 컬럼 부피 세척 완충액 2 및 6 컬럼 부피 세척 완충액 1 로 세척함
· 2 mL 갈락토실화 반응 용액을 적용하고, 0.8 mL 통과 (flow through) 하게 함
· 25℃ 에서 약 6 내지 24 h 동안 인큐베이션함 (충분한 갈락토실화가 가능하도록)
· 8 컬럼 부피 세척 완충액 1, 10 컬럼 부피 평형 완충액, 2 컬럼 부피 세척 완충액 2 및 6 컬럼 부피 세척 완충액 3 으로 세척함
· 2 mL 시알릴화 반응 용액을 적용하고, 0.8 mL 통과 (flow through) 하게 함
· 인큐베이션함 (예를 들어, 25℃ 각각 2, 7 또는 24 h 또는 그 이상)
· 8 컬럼 부피 세척 완충액 1 로 세척함
· 각각의 용리 완충액 (단백질 A 에 대해 2 컬럼 부피; kappa select 에 대해 8 컬럼 부피) 으로 용리시키고 pH 조절을 위해 1 M Tris 완충액 (pH 9.0) 을 사용함
실시예 4
벌크 물질의 순차적 갈락토실화 및 시알릴화
· Kappa Select 컬럼에 2 컬럼 부피 재생 완충액 1, 10 컬럼 부피 평형 완충액 및 4 컬럼 부피 세척 완충액 1 을 적용함으로써 단백질 A 를 각각 재생, 평형 및 세척함
· 1 mg 의 IgG (벌크 물질) 를 컬럼 상에 적용함
· 10 컬럼 부피 세척 완충액 1 로 세척함
· 2 mL 갈락토실화 반응 용액을 적용하고, 0.8 mL 통과 (flow through) 하게 함
· 25℃ 에서 약 6 내지 24 h 동안 인큐베이션함 (충분한 갈락토실화가 가능하도록)
· 8 컬럼 부피 세척 완충액 1, 10 컬럼 부피 평형 완충액, 2 컬럼 부피 세척 완충액 2 및 6 컬럼 부피 세척 완충액 3 으로 세척함
· 2 mL 시알릴화 반응 용액을 적용하고, 0.8 mL 통과 (flow through) 하게 함
· 인큐베이션함 (예를 들어, 25℃ 각각 2, 7 또는 24 h 또는 그 이상)
· 8 컬럼 부피 세척 완충액 1 로 세척함
· 각각의 용리 완충액 (단백질 A 에 대해 2 컬럼 부피; kappa select 에 대해 8 컬럼 부피) 으로 용리시키고 pH 조절을 위해 1 M Tris 완충액 (pH 9.0) 을 사용함
실시예 5
용액 중 갈락토실화 및 시알릴화 및 효소 회수
· 10 mL 50 mM MES 완충액, pH 6.4 에서 25 mg 항체, 2.5 mg 갈락토실트랜스페라제 및 2.5 mg 시알릴트랜스페라제의 인큐베이션
· 반응 후 반응 용액을 50 mM MES pH 6.4 로 평형화된 S-세파로스 컬럼 (0.5 x 10 cm) 에 적용함
· 비결합된 물질을 제거하기 위해 50 mM MES pH 6.4 의 5 컬럼 부피로 세척함
· 20 컬럼 부피 40 mM 트리스 완충액 pH 7.4 로 컬럼을 세척하여 갈락토실트랜스페라제를 용리함
· 50 mM MES pH 6.4 로 재-평형시킴
· 30 mM MES pH 5.6 및 95 mM NaCl 을 포함하는 완충액 (40 컬럼 부피) 으로 항체를 용리함
· 50 mM MES pH 6.4 및 1 M NaCl 까지 10 컬럼 부피 이상의 선형 구배로 시알릴트랜스페라제를 용리함
· 표적 효소 또는 인간화 항체를 함유하는 분획을 모아 한외여과 장치 (Amicon Ultra-15, 10 kDa) 를 사용하여 농축함
실시예 6
효소 재사용 시험
· 갈락토실트랜스페라제: 규정된 시간, 예를 들어, 6.5 h 또는 24 h 동안 37℃ 에서 2.5 ㎍ 갈락토실트랜스페라제가 있는 78.5 ㎕ 반응 완충액 (100 mM MES, 10 mM UDP-Gal, 5 mM MnCl2, pH　6.5) 에 500 ㎍ 항체를 인큐베이션함
· 시알릴트랜스페라제: 규정된 시간, 예를 들어, 6.5 h 또는 24 h 동안 37℃ 에서 61.8 ㎕ 물, 물에 용해된 250　㎍ CMP-NANA, 50 ㎍ 시알릴트랜스페라제, 200 nM 알칼리 포스파타제, 0.1 mM ZnCl2 에 500 ㎍ 항체를 인큐베이션함
· qTOF-ESMS 에 의한 갈락토실화 분석: 샘플의 변성 및 환원 (약 250 ㎍ 항체, 4 M 구아니디늄, TCEP); 1% 포름산으로 20% 아세토니트릴에 대한 완충액 교환; ESMS 분석
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Method for in vitro glycoengineering of antibodies <130> P34039 <150> EP16205585.9 <151> 2016-12-21 <150> EP17157006.2 <151> 2017-02-20 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 3 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 4 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 5 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu 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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 8 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a knob mutation <400> 8 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 9 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with the mutations L234A, L235A <400> 9 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 10 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A and hole mutation <400> 10 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 11 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A and knob mutation <400> 11 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 12 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A and P329G mutation <400> 12 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 13 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A, P329G and hole mutation <400> 13 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 14 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A, P329G and knob mutation <400> 14 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn 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Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 subclass with a L234A, L235A, P329G and Y349C, T366W mutation <400> 18 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 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130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 20 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 subclass with the mutations H310A, H433A and Y436A <400> 20 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser 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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 22 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 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variant human Fc-region of the IgG4 isotype with a S228P and L235E mutation <400> 23 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 24 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG4 isotype with a S228P, L235E and P329G mutation <400> 24 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu 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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 26 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG4 isotype with a S228P, L235E and P329G mutation <400> 26 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 28 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105

Claims (34)

  1. 하기를 포함하는, N-글리코실화 부위에 변형된 글리코실화를 가진 항체의 효소적 제조 방법:
    a) N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 항체 친화성 리간드-결합 모노클로날 항체를 제 1 효소 및 제 1 활성화된 당 잔기와 N-글리코실화 부위의 글리코실화를 변형시키기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계,
    b) 제 1 효소를 회수하고 이로써 재순환된 제 1 효소를 생성시키는 단계,
    c) 항체 친화성 리간드로부터 항체를 회수하는 단계,
    d) 회수된 항체를 제 2 효소 및 제 2 활성화된 당 잔기와 항체의 N-글리코실화 부위의 글리코실화를 변형시키기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 용액 중에서 인큐베이션하는 단계,
    e) 양이온 교환 크로마토그래피에서 제 2 효소로부터 N-글리코실화 부위에 변형된 글리코실화를 가진 항체를 분리하고, 그에 의해 N-글리코실화 부위에 변형된 글리코실화를 가진 항체 및 재순환된 제 2 효소를 생성하는 단계, 및
    f) 단계 a) 를 단계 b) 의 제 1 재순환된 효소로 적어도 1 회 반복하고, 단계 d) 를 단계 e) 의 제 2 재순환된 효소로 적어도 1 회 반복하는 단계,
    여기서, 상기 항체 친화성 리간드는 항체 경쇄 친화성 리간드이고,
    상기 양이온 교환 크로마토그래피는 술포프로필 양이온 교환기를 갖는 가교결합된 아가로오스의 매트릭스를 갖는 양이온 교환 크로마토그래피 물질로 수행됨.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 제 1 효소는 갈락토실트랜스페라제이고, 제 2 효소는 시알릴트랜스페라제인 제조 방법.
  4. 삭제
  5. 제 3 항에 있어서, 갈락토실트랜스페라제가 β4GalT1 인 제조 방법.
  6. 삭제
  7. 제 3 항에 있어서, 시알릴트랜스페라제가 ST6 인 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 제 5 항에 있어서, 시알릴트랜스페라제가 ST6 인 제조 방법.
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 하기의 단계를 포함하는 제조 방법:
    i) 갈락토실트랜스페라제 및/또는 시알릴트랜스페라제를 포함하는 용액 및 N-글리코실화 부위에 변형된 글리코실화를 가진 항체를 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계,
    ii) 임의로 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 세척하는 단계,
    iii) 임의로 갈락토실트랜스페라제가 존재하는 경우 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 제 1 용액을 적용하고 이에 의해 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 갈락토실트랜스페라제를 용리하는 단계,
    iv) 제 2 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 이에 의해 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 N-글리코실화 부위에 변형된 글리코실화를 가진 항체를 용리하는 단계, 및
    v) 선형 구배를 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 이에 의해 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 시알릴트랜스페라제를 용리하는 단계.
  12. 제 11 항에 있어서, 하기와 같은 제조 방법:
    - 단계 i) 의 용액은 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 완충액임,
    - 단계 ii) 의 용액은 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 완충액임,
    - 단계 iii) 의 용액은 pH 6.6 내지 pH 8.0 의 pH 값을 갖는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액임,
    - 단계 iv) 의 용액은 75 mM +/- 10 % 내지 125 mM +/- 10 % 소듐 클로라이드를 포함하는 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 완충액임,
    - 선형 구배는 단계 iv) 의 용액으로부터 750 mM +/- 10 % 내지 1250 mM +/- 10 % 소듐 클로라이드를 포함하는 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 완충액으로임.
  13. 제 1 항에 있어서, 단계 a) 내지 c) 대신에 하기 단계를 포함하는 제조 방법:
    - N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 항체를 포함하는 완충된 용액을 고상에 결합된 항체 친화성 리간드에 적용하여, 항체를 리간드에 결합시키는 단계,
    - 임의로 완충액으로 항체-리간드 상호작용을 파괴하지 않으면서 고상을 세척하는 단계,
    - 리간드-결합 항체의 효소적 변형에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 제 1 글리코실화 변형 효소 및 제 1 활성화된 당 잔기를 포함하는 완충된 용액을 적용함으로써 항체의 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 효소적으로 변형시키는 단계, 임의로 항체-리간드 상호작용을 파괴하지 않으면서 변형된 리간드-결합 항체를 세척함,
    - 제 1 효소를 회수하고 이로써 재순환된 제 1 효소를 생성시키는 단계, 및
    - 항체 친화성 리간드로부터 항체를 회수하는 단계.
  14. 삭제
  15. 제 3 항에 있어서, 단계 a) 내지 c) 대신에 하기 단계를 포함하는 제조 방법:
    - N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 항체를 포함하는 완충된 용액을 고상에 결합된 항체 친화성 리간드에 적용하여, 항체를 리간드에 결합시키는 단계,
    - 임의로 완충액으로 항체-리간드 상호작용을 파괴하지 않으면서 고상을 세척하는 단계,
    - 리간드-결합 항체의 효소적 변형에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 제 1 글리코실화 변형 효소 및 제 1 활성화된 당 잔기를 포함하는 완충된 용액을 적용함으로써 항체의 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 효소적으로 변형시키는 단계, 임의로 항체-리간드 상호작용을 파괴하지 않으면서 변형된 리간드-결합 항체를 세척함,
    - 제 1 효소를 회수하고 이로써 재순환된 제 1 효소를 생성시키는 단계, 및
    - 항체 친화성 리간드로부터 항체를 회수하는 단계.
  16. 삭제
  17. 제 5 항에 있어서, 단계 a) 내지 c) 대신에 하기 단계를 포함하는 제조 방법:
    - N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 항체를 포함하는 완충된 용액을 고상에 결합된 항체 친화성 리간드에 적용하여, 항체를 리간드에 결합시키는 단계,
    - 임의로 완충액으로 항체-리간드 상호작용을 파괴하지 않으면서 고상을 세척하는 단계,
    - 리간드-결합 항체의 효소적 변형에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 제 1 글리코실화 변형 효소 및 제 1 활성화된 당 잔기를 포함하는 완충된 용액을 적용함으로써 항체의 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 효소적으로 변형시키는 단계, 임의로 항체-리간드 상호작용을 파괴하지 않으면서 변형된 리간드-결합 항체를 세척함,
    - 제 1 효소를 회수하고 이로써 재순환된 제 1 효소를 생성시키는 단계, 및
    - 항체 친화성 리간드로부터 항체를 회수하는 단계.
  18. 삭제
  19. 제 7 항에 있어서, 단계 a) 내지 c) 대신에 하기 단계를 포함하는 제조 방법:
    - N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 항체를 포함하는 완충된 용액을 고상에 결합된 항체 친화성 리간드에 적용하여, 항체를 리간드에 결합시키는 단계,
    - 임의로 완충액으로 항체-리간드 상호작용을 파괴하지 않으면서 고상을 세척하는 단계,
    - 리간드-결합 항체의 효소적 변형에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 제 1 글리코실화 변형 효소 및 제 1 활성화된 당 잔기를 포함하는 완충된 용액을 적용함으로써 항체의 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 효소적으로 변형시키는 단계, 임의로 항체-리간드 상호작용을 파괴하지 않으면서 변형된 리간드-결합 항체를 세척함,
    - 제 1 효소를 회수하고 이로써 재순환된 제 1 효소를 생성시키는 단계, 및
    - 항체 친화성 리간드로부터 항체를 회수하는 단계.
  20. 삭제
  21. 제 9 항에 있어서, 단계 a) 내지 c) 대신에 하기 단계를 포함하는 제조 방법:
    - N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 항체를 포함하는 완충된 용액을 고상에 결합된 항체 친화성 리간드에 적용하여, 항체를 리간드에 결합시키는 단계,
    - 임의로 완충액으로 항체-리간드 상호작용을 파괴하지 않으면서 고상을 세척하는 단계,
    - 리간드-결합 항체의 효소적 변형에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 제 1 글리코실화 변형 효소 및 제 1 활성화된 당 잔기를 포함하는 완충된 용액을 적용함으로써 항체의 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 효소적으로 변형시키는 단계, 임의로 항체-리간드 상호작용을 파괴하지 않으면서 변형된 리간드-결합 항체를 세척함,
    - 제 1 효소를 회수하고 이로써 재순환된 제 1 효소를 생성시키는 단계, 및
    - 항체 친화성 리간드로부터 항체를 회수하는 단계.
  22. 삭제
  23. 제 11 항에 있어서, 단계 a) 내지 c) 대신에 하기 단계를 포함하는 제조 방법:
    - N-글리코실화 부위에 글리코실화를 가진 항체를 포함하는 완충된 용액을 고상에 결합된 항체 친화성 리간드에 적용하여, 항체를 리간드에 결합시키는 단계,
    - 임의로 완충액으로 항체-리간드 상호작용을 파괴하지 않으면서 고상을 세척하는 단계,
    - 리간드-결합 항체의 효소적 변형에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 제 1 글리코실화 변형 효소 및 제 1 활성화된 당 잔기를 포함하는 완충된 용액을 적용함으로써 항체의 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 효소적으로 변형시키는 단계, 임의로 항체-리간드 상호작용을 파괴하지 않으면서 변형된 리간드-결합 항체를 세척함,
    - 제 1 효소를 회수하고 이로써 재순환된 제 1 효소를 생성시키는 단계, 및
    - 항체 친화성 리간드로부터 항체를 회수하는 단계.
  24. 삭제
  25. 제 1 항, 제 3 항, 제 5 항, 제 7 항, 제 9 항, 제 11 항 내지 제 13 항, 제 15 항, 제 17 항, 제 19 항, 제 21 항 및 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 2가 단일특이적 항체 또는 2가 이중특이적 항체 또는 항체 Fab 단편인 제조 방법.
  26. 제 1 항, 제 3 항, 제 5 항, 제 7 항, 제 9 항, 제 11 항 내지 제 13 항, 제 15 항, 제 17 항, 제 19 항, 제 21 항 및 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 키메라 또는 인간화 또는 인간 항체인 제조 방법.
  27. 제 1 항, 제 3 항, 제 5 항, 제 7 항, 제 9 항, 제 11 항 내지 제 13 항, 제 15 항, 제 17 항, 제 19 항, 제 21 항 및 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 제조 방법.
  28. 제 1 항, 제 3 항, 제 5 항, 제 7 항, 제 9 항, 제 11 항 내지 제 13 항, 제 15 항, 제 17 항, 제 19 항, 제 21 항 및 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IgG1 또는 IgG4 서브클래스의 항체인 제조 방법.
  29. 제 1 항, 제 3 항, 제 5 항, 제 7 항, 제 9 항, 제 11 항 내지 제 13 항, 제 15 항, 제 17 항, 제 19 항, 제 21 항 및 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, N-글리코실화 부위가 Fab 영역 N-글리코실화 부위 또는 Kabat 에 따른 넘버링의 아스파라긴 잔기 297 에서의 Fc-영역 N-글리코실화 부위인 제조 방법.
  30. 제 25 항에 있어서, 항체 친화성 리간드가 항체 경쇄 친화성 리간드 또는 항체 Fc-영역 친화성 리간드인 제조 방법.
  31. 제 26 항에 있어서, 항체 친화성 리간드가 항체 경쇄 친화성 리간드 또는 항체 Fc-영역 친화성 리간드인 제조 방법.
  32. 제 27 항에 있어서, 항체 친화성 리간드가 항체 경쇄 친화성 리간드 또는 항체 Fc-영역 친화성 리간드인 제조 방법.
  33. 제 28 항에 있어서, 항체 친화성 리간드가 항체 경쇄 친화성 리간드 또는 항체 Fc-영역 친화성 리간드인 제조 방법.
  34. 제 29 항에 있어서, 항체 친화성 리간드가 항체 경쇄 친화성 리간드 또는 항체 Fc-영역 친화성 리간드인 제조 방법.
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