DE102005060813A1 - Selektive Markierung der Glykane von Antikörpern mit modifizierten Nukleotidzuckern als Substrate von rekombinanten Galactosyltransferasen - Google Patents

Selektive Markierung der Glykane von Antikörpern mit modifizierten Nukleotidzuckern als Substrate von rekombinanten Galactosyltransferasen Download PDF

Info

Publication number
DE102005060813A1
DE102005060813A1 DE200510060813 DE102005060813A DE102005060813A1 DE 102005060813 A1 DE102005060813 A1 DE 102005060813A1 DE 200510060813 DE200510060813 DE 200510060813 DE 102005060813 A DE102005060813 A DE 102005060813A DE 102005060813 A1 DE102005060813 A1 DE 102005060813A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
udp
glycans
selective labeling
galactosyltransferase
biotinyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE200510060813
Other languages
English (en)
Inventor
Lothar Elling
Darius-Jean Namdjou
Thomas Schumacher
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Original Assignee
Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH filed Critical Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority to DE200510060813 priority Critical patent/DE102005060813A1/de
Priority to PCT/EP2006/012111 priority patent/WO2007071347A2/de
Publication of DE102005060813A1 publication Critical patent/DE102005060813A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91091—Glycosyltransferases (2.4)
    • G01N2333/91097—Hexosyltransferases (general) (2.4.1)
    • G01N2333/91102—Hexosyltransferases (general) (2.4.1) with definite EC number (2.4.1.-)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur galactosyltransferase-katalysierten selektiven Markierung der Glykane von Antikörpern mit C-6-modifizierten UDP-Gal-Derivaten. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass für den selektiven Transfer des modifizierten Nukleotidzuckers UDP-6-biotinyl-Gal die nach dem bisherigen Stand der Technik ungeeignete rekombinante humane beta4GalT-1 eingesetzt wird. Das Verfahren ist zudem dadurch gekennzeichnet, dass die durch die humane beta4GalT-1 vermittelte selektive Markierung der N-Glykane von IgG-Antikörpern ein neuartiger Prozess ist. DOLLAR A In Figur 1 ist die galactosyltransferase-katalysierte selektive Markierung von untergalactosylierten Glykanen dargestellt. Der Rest R¶1¶ steht für Di- und Oligosaccharide, N-Glykane, O-Glykane, Glykoproteine mit N- und O-Glykanen und Glykolipide. Der Rest R¶2¶ stellt Proteine dar, die den Zucker GalNAc in der dargestellten Verknüpfung in den Seitenketten von Serin oder Threonin tragen.

Description

  • Anwendungsgebiet
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs I.
  • Stand der Technik
  • Grundlegende Experimente zur Modifikation von Kohlenhydraten in Glykokonjugaten wurden in der Arbeitsgruppe von Bayer und Wilchek durchgeführt (Wilchek and Bayer 1987; Bayer et al. 1988). So wurden beispielsweise die OH-Gruppen von Kohlenhydratstrukturen in Zellmembranen chemisch (mit Periodat) oder enzymatisch (6-Position der Galactose durch Galactose Oxidase) oxidiert und anschließend mit Hydraziden umgesetzt. "Molekulare Werkzeuge" in Form von modifizierten Nukleotidzuckern sind bisher für Untersuchungen von Sialyl- und Fucosyltransferasen entwickelt worden. Der enzymatische Transfer eines fluoreszenzmarkierten Zuckers durch eine Glykosyltransferase wurde zuerst mit Sialyltransferasen durchgeführt (Gross and Brossmer 1988; Gross and Brossmer 1991). Brossmer und Mitarbeiter konnten zeigen, dass verschiedene, an C-9 derivatisierte, Sialinsäuren nicht nur von der CMP-Neu5Ac Synthase aktiviert, sondern auch mit α2,3- und α2,6-Sialyltransferasen in vitro übertragen werden (Gross et al. 1987; Gross et al. 1989). Auf dieser Basis wurden Strategien für den metabolischen Einbau von Sialinsäurederivaten in Glykokonjugate der Zelloberfläche entwickelt (Kayser et al. 1992; Keppler et al. 1995; Lee et al. 1999; Lemieux and Bertozzi 1998; Schmidt et al. 1998). So wurde z.B. die Ketogruppe der N-Levulinoylsialinsäure chemoselektiv biotinyliert und die Zellen anschließend gezielt mit einem Avidin-Zellgift Konjugat abgetötet (Mahal et al. 1997; Yarema et al. 1998). Die chemische Synthese eines biotinylierten Derivates von GDP-β-L-Fucose ausgehend von L-Galactose wurde von Hällgren und Hindsgaul vorgestellt (Hällgren and Hindsgaul 1995). Mit einer Fucosyltransferase gelang der Transfer des biotinylierten Zuckers auf ein N-Acetyllactosaminderivat. Der Arbeitsgruppe Bertozzi gelang es auch, die selektive Markierung auf den Biosyntheseweg von UDP-GalNAc auszuweiten. Hierbei wurde der „salvage pathway" für dieses Substrat ausgenutzt, so dass die Aufnahme von einem chemisch synthetisierten Azidoanalogon von GalNAc zum entsprechenden UDP-GalNAc-Derivat führte. Der Transfer des letztgenannten Zuckers erfolgte über zelleigene Polypeptid-GalNAc-Transferasen; der Zucker ist also ein "molekulares Werkzeug" für diese Enzymfamilie. Ob andere GalNAcTs den Transfer ebenfalls katalysieren, ist nicht bekannt. Mithilfe der chemoselektiven Kopplung über die Staudinger-Reaktion konnte so eine Methode zur Identifizierung von Proteinen mit O-Glykosylierung vom Mucin-Typ entwickelt werden. Diese Methode nutzt aus, dass alle O-Glykane des Mucin-Typs ein core GalNAc besitzen, an welchem die chemoselektive Reaktion angreift (Hang et al. 2003). Eine in vitro-Strategie zur Idenfikation von O-GlcNAc-tragenden Proteinen wurde von Khidekel et al. entwickelt. Hierbei wird der Nukleotidzucker UDP-Gal chemisch durch Einbringen einer Keto-Funktionalität modifiziert. Dieses modifizierte Substrat wird von einer Mutante der rekombinanten bovinen β4Gal-T1 auf das O-GlcNAc tragende Protein α-Crystallin übertragen. Die posttranslationale Modifikation konnte schließlich über chemoselektive Aminooxy-Kopplung mit einem Biotin-Reagenz nachgewiesen werden (Khidekel et al. 2003). In neuesten Arbeiten gelang derselben Arbeitsgruppe mit der dargestellten Strategie die in vivo-Identifikation von O-GlcNAc-Proteinen am Beispiel des Gehirns von Ratten (Khidekel et al. 2004).
  • Die Synthese des modifizierten Nukleotidzucker UDP-6-biotinyl-Gal wurde von der Arbeitsgruppe der Anmelder dieser provisorischen Patentanmeldung bereits publiziert (Bülter et al. 2001). Ein selektiver Transfer dieses Kohlenhydrats konnte für mehrere Mitglieder der humanen Galactosyltransferase-Familie (stets rekombinante Proteine) auf das N-Glykane tragende Glykoprotein Ovalbumin demonstriert werden. Hierbei war der Transfererfolg bezüglich des natürlichen Glykoproteins entscheidend mit der Wahl des Enzyms verknüpft.
  • Überraschenderweise zeigte das in der Literatur für die N-Glykan-Biosynthese beschriebene Enzym β4GalT-1 eine sehr niedrige Transferrate, während das für die Glykolipid-Biosynthese beschriebene Enzym β4GalT-4 (Amado et al. 1999; Bülter et al. 2001) eine deutlich bessere Rate aufwies.
  • Die Arbeitsgruppe um Nishimura konnte zeigen, dass UDP-6-biotinyl-Gal stark verwandte Verbindungen wie etwa Uridin-5'-(6-Amino-{2-[(7-methyl-naphthyl)methoxy-carbonylmethoxy]ethoxy}-acetyl-6-deoxy-α-D-galactopyranosyl)-diphosphatmonoammonium Salz Inhibitoren der humanen rekombinanten α4GalT-1 darstellen. Die inhibitorischen Studien wurden mit fluoreszenzmarkierten GlcNAc-Monosaccharidderivaten durchgeführt (Takaya et al. 2005). Gestützt werden diese Beobachtungen durch die Ergebnisse der Anmelder. Es zeigte sich bei Verwendung rekombinanter humaner β4GalT-1 keinerlei Aktivität mit UDP-6-biotinyl-Gal bei Transfer auf einfache Monosaccharidakzeptoren wie GlcNAc oder GlcNAcβ1-Benzyl. Die genannten Ergebnisse zum Transfer von UDP-6-biotinyl-Gal auf Ovalbumin oder Monosaccharidakzeptoren mit rekombinanter humaner β4GaT-1 zeigen deutlich, dass es keinerlei Erwartung geben konnte, dass eben dieses Enzym für eine selektive Markierung der N-Glykane von IgG-Antikörpern mit UDP-6-biotinyl-Gal Verwendung finden könnte. Eine andere in der Literatur beschriebene selektive Markierung der Glykane von Antikörpern durch eine Galactosyltransferase ist den Erfindern nicht bekannt.
  • Nachteile des Standes der Technik
  • Der Nachteil der geschilderten Markierungsmethode von Bayer und Wilchek besteht in der mangelnden Selektivität. Es kommt zur zufallsverteilten Markierung der Glykane eines Glykokonjugats. Selektive Methoden zur Markierung der N-Glykane von Antikörpern durch eine Galactosyltransferase sind bisher nicht beschrieben worden. Die oben genannten Beispiele der Verfahren zur selektiven Markierung besitzen den Nachteil, dass die eingesetzten Donorsubstrate erst durch teilweise aufwendige chemische Synthesen erzeugt werden müssen. Eine Anwendung dieser Donorsubstrate für die Markierung von Glykanen auf Antikörpern wurde nicht gezeigt. Für die beschriebenen in vivo Verfahren ist die Akzeptanz eines gesamten Biosynthesewegs für das modifizierte Substrat notwendig. Krankheiten wie Rheumatoide Arthritis (Routier et al. 1998) oder auch AIDS (Moore et al. 2005) zeichnen sich durch ein Defizit der N-Glykane der IgG-Antikörper an Galactose aus. Eine Diagnostik dieses Galactosemangels wird durch den selektiven Transfer eines modifizierten Galactosmoleküls als molekulares Werkzeug möglich und stellt damit eine spezifische Markierung dar. Theoretisch wäre solch ein Transfer auch basierend auf den Arbeiten zur Modifikation von UDP-Gal nach Khidekel et al. möglich. Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass das modifizierte Donorsubstrat eine mehrstufige chemische Synthese benötigt und eine Mutation des Transferenzyms notwendig ist, womit der Prozess insgesamt aufwendiger wird.
    •
  • Aufgabe der Erfindung
  • Aufgabe der Erfindung ist es, eine selektive, durch die rekombinante Galactosyltransferasen (z.B. β4GalT-1) katalysierte, Markierung der Glykane von Antikörpern mit C-6 modifizierten UDP-Gal-Derivaten zu ermöglichen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die C-6 modifizierten UDP-Gal-Derivate ausgehend von UDP-Glc chemoenzymatisch zu synthetisieren.
  • Lösung der Aufgabe
  • Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und Anspruch 8 gelöst.
  • Vorteile der Erfindung
  • Die Erfindung stellt die erste selektive Markierung der Glykane von Antikörpern dar ( 1). Die in 1 dargestellte Transferreaktion (Reaktion 1 in 1A) wird von rekombinanten Enzymvarianten der humanen β4GalT-1 (EC 2.4.1.38) als Vertreter der β4Galactosyltransferase-Familie katalysiert. Der Rest R1 steht für Di- und Oligosaccharide, N-Glykane, O-Glykane, Glykoproteine mit N- und O-Glykanen, und Glykolipide. Die Gen- und Aminosäuresequenzen der rekombinanten Enzymvarianten sind im Appendix I dargestellt. Weitere Beispiele stellen die Reaktionen der α3GalT (Ggta-1, EC 2.4.1.124 und 2.4.1.151, Reaktion 2 in 1B) und die core 1 β3GalT (O-Glykan Biosynthese, Reaktion 3 in 1C) dar. Der Rest R2 stellt Proteine dar, die den Zucker GalNAc in der dargestellten Verknüpfung in den Seitenketten von Serin oder Threonin tragen.
  • Das Donorsubstrat UDP-6-biotinyl-Gal wird in einer einfachen chemoenzymatischen Reaktion ausgehend von kostengünstiger UDP-Glc hergestellt (2). Mit dem dargestellten Verfahren kann auch UDP-6-biotinyl-GalNAc hergestellt werden.
  • Eine Mutagenisierung oder anderweitige genetische Veränderung des zur Markierung eingesetzten Enzyms ist nicht notwendig. Die Markierung des Antikörpers wird mit Streptavidinkonjugaten über ELISA-ähnliche Techniken photometrisch nachgewiesen. Das Verfahren zur Markierung von Glykanen der Antikörper wird zum Nachweis krankheitsassoziierter Veränderungen der Galactosylierung von Glykanen eingesetzt und stellt ein neues Verfahren zur Diagnostik der Krankheiten Rheumatoide Arthritis (RA) und IgA Nephropathie (IgAN) dar. Im Fall der RA wird untergalactosyliertes IgG (Reaktion 1 in 1A), bei der IgAN untergalactosylierte O-Glykane, das Tn-Antigen (Reaktion 3 in 1C), durch das beschriebene Verfahren nachgewiesen. Weitere diagnostische Anwendungen des Verfahrens betreffen prinzipiell Krankheiten mit Galactosylierungsdefekten, wie z.B. AIDS oder Tuberkulose (Moore et al. 2005) (Rook et al. 1994). Beispielhaft wird die Verwendung des Verfahrens zum Nachweis von Galactosylierungsdefekten anhand der IgGs verschiedener Spezies gezeigt (3 und 4). In der Literatur ist beschrieben, dass die N-Glykane des IgG verschiedener Spezies sich im Grad der Galactosylierung unterscheiden (Raju et al. 2000). Diese mit aufwändigen Isolierungsverfahren und Massenspektrometrie der N-Glykane verbundenen Analysen werden durch das erfindungsgemäße einfache Verfahren ersetzt.
    •
  • Beispielbeschreibung
  • In 1 ist die galactosyltransferase-katalysierte selektive Markierung von untergalactosylierten Glykanen dargestellt.
  • 1: Reaktionen der galactosyltransferase-katalysierten selektiven Markierung von Glykanen.
  • 1A: Reaktion 1: β1-4Galactosyltransferasen;
  • 1B: Reaktion 2: α1-3Galactosyltransferasen;
  • 1C: Reaktion 3: core 1 β1-3Galactosyltransferase.
  • 2: Chemoenzymatische Synthese von UDP-6-biotinyl-Gal und UDP-6-biotinyl-GalNAc ausgehend von UDP-Glc bzw. UDP-GlcNAc.
  • 3 und 4 zeigen die Ergebnisse der Markierung von IgG verschiedener Spezies mit Gal-6-Biotin durch Varianten der humanen β4GalT-1. Der Nachweis von Biotin erfolgt mit einem Enzyme-Linked Streptavidin Assay (ELSA).
  • 3: Ergebnis des ELSA zum Nachweis der Markierung der N-Glykane des IgG aus Huhn, Mensch und Ratte mit Reaktion 1 in 1A.
  • 4: Ergebnis des ELSA zum Nachweis der Markierung der N-Glykane des IgG aus Pferd, Maus und Ratte mit Reaktion 1 in 1A.
  • Chemoenzymatische Synthese nach 2:
  • Die präparative chemoenzymatische Synthese von UDP-6-biotinhydrazono-Gal(NAc) fand in einem 50 ml-Reaktor mit integrierter blasenfreier Sauerstoffbegasung statt. Das Biotinylierungsreagenz BACH wurde in Puffer vorgegeben und durch Erhitzen auf 50°C unter Rühren in Lösung gebracht. Die Lösung wurde hierauf vorsichtig auf Eis abgekühlt, bis sie wieder RT erreichte. Die übrigen Substanzen des Ansatzes bis auf Galactose Oxidase wurden hinzugefügt und der Pumpkreislauf gestartet. Hierauf wurden 0,5 mbar Überdruck an der Anlage angelegt. War der Überdruck nach 10 min. konstant geblieben, wurde die Synthese durch Zugabe von Galactose Oxidase gestartet. Nach 48 h wurde die Reaktionslösung auf 2 ml Eppendorf-Gefäße verteilt und die Synthese durch fünfminütiges Erhitzen bei 95°C abgestoppt. Hierauf wurde für 15 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in einer 100 ml-Schott-Flasche gesammelt. Ansatz (alle Konzentrationen Endkonzentrationen)
    UDP-Glc(NAc) 8 mM
    BACH 12 mM
    Katalase 2700 U/ml
    UDP-Glc 4-Epimerase 10 U/ml
    Galactose Oxidase 3 U/ml
    CuSO4 0,5 mM
    Natriumphosphat-Puffer (NaH2PO4/Na2HPO4) pH 6,0 25 mM
    Ansatzvolumen: 50 ml
    Reaktionsdauer: 24 h
  • Die Reduktion von UDP-6-biotinhydrazono-Gal(NAc) erfolgte unmittelbar nach der Synthese. NaCNBH3 wurde zur in der Schott-Flasche befindlichen Lösung gegeben, die Flasche kurz geschüttelt, um das Reduktionsmittel in Lösung zu bringen, und der Ansatz bei –20°C eingefroren. Ansatz (alle Konzentrationen Endkonzentrationen)
    UDP-6-biotinhydrazono-Gal(NAc) 6,6 mM (83 % Syntheseausbeute)
    NaCNBH3 100 mM
    Natriumphosphat-Puffer (NaH2PO4/Na2HPO4) pH 6,0 (aus der Synthese) 25 mM
    Ansatzvolumen: 50 ml
    Temperatur: –20°C
    Reaktionsdauer: 48 h
  • Die Reaktionslösung wurde zunächst durch Einengen im Vakuum auf die Hälfte des Volumens aufkonzentriert. Hierauf erfolgte die Isolierung von UDP-6-biotinyl-Gal(NAc) über HPLC. Die nach der Aufreinigung erhaltene Produktlösung wurde durch Einengen im Vakuum in der Speedvac getrocknet. Bedingungen:
    Säule HPLC-Säule (Thermo Hypersil, Dreieich)
    Material ODS-Hypersil (reversed phase) C18, Porengröße: 5 μm
    Länge 250 mm
    Durchmesser 4,6 mm
    Äquilibrierung Mobile Phase A: Methanol 1 %/Millipore H2O 99% (v/v), pH 7,0, Fluss: 0,3 ml/min
    Probenaufgabe pro analytischer Lauf 250 μl der eingeengten Reaktionslösung mit 6,6 μmol Produkt, Fluss: 0,3 ml/min
    Elution Mobile Phase A, Fluss: 0,3 ml/min
    Detektion UV (205 nm, 260 nm)
  • Bei der Herstellung der mobilen Phase A wurde zunächst Millipore H2O filtriert und entgast, darauf Methanol dazugegeben.
  • Das isolierte UDP-6-biotinyl-Gal(NAc) wurde vereinigt und im Anschluß im Vakuum in der Speedvac getrocknet, der erhaltene gelbe Feststoff wurde bei –20°C gelagert.
  • Transferreaktion nach 1:
  • Für die Transferreaktion wurde der Antikörper vor dem Transfer reduziert und blockiert (Liljeblad et al. 2000). Hierbei wurde das IgG zunächst mit 50 mM Tris/HCl pH 8,0 auf eine Konzentration von 70 μg/ml verdünnt. Neun Volumen dieser IgG-Lösung wurden mit einem Volumen 2-Mercaptoethanol (1 M in 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,0) gemischt und für 2 h bei 37°C inkubiert. Um das Reoxidieren der Disulfidbrücken zu verhindern, wurde ein Volumen 0,2 M Iodoacetamid (Endkonzentration 0,1 M) zur Lösung hinzugegeben. Dieser Schritt kann auch weggelassen werden. Die Inkubation mit Iodoacetamid erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur. Die Proben wurden je nach Volumen durch Ultrafiltration und fünfmaliges Waschen in einem Ultrafiltrationsmodul, Vivaspin® 20 (Vivascience, Hannover) oder Microcon® YM 10 (Millipore, Schwalbach; jeweils cut-off 10 kDa), von Mercaptoethanol und Iodoacetamid befreit. Schließlich wurde der Antikörper zum Einsatz im Transfer-Assay über die eben genannten Membran-Module aufkonzentriert.
  • Ansatz (alle Konzentrationen Endkonzentrationen)
    Figure 00090001
  • Nach Beendigung der Reaktion wurde jede Probe fünfmal mit TBS-Tween-Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1 % (v/v) Tween 20) in Microcon® YM 10 gewaschen. Die auf das Ausgangsvolumen aufgefüllte Probe wurde hierauf bis zum weiteren Gebrauch bei –20°C gelagert.
  • Nachweis des transferierten Gal-Biotins:
  • Die selektive Markierung der IgGs wurde mit einem Sandwich-ELSA-Test in einer Mikrotiterplatte (ELSA-Module Nunc-Immuno, Nunc GmbH &Co. kG, Wiesbaden) nachgewiesen. Zunächst wurden je 200 μl TBS-Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl) mit 0,04 mg Anti-IgG-Antikörper (Anti-IgG-Antikörper gegen den Fc-Teil der IgGs) plattiert und 8 h bei 4°C immobilisiert. Hierauf wurden diejenigen Vertiefungen der Platte, die Probe enthielten, dreimal mit 400 μl TBS-Tween-Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1 % (v/v) Tween 20) für mindestens je 30 s gewaschen. Zum Blockieren wurden je 200 μl Blocking Fertiglösung hinzugegeben (Roche Diagnostics, Mannheim) und für 1 h bei RT inkubiert. Von den Transfer-Ansätzen wurden hierauf 200 μl mit 0,03 mg IgG in die Vertiefungen pipettiert. Es wurden Doppelbestimmungen durchgeführt. Zur Bindung des markierten IgG wurde die Platte über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Nach dieser Zeit wurde fünfmal mit 400 μl TBS-Tween-Puffer gewaschen. Zum Blockieren wurden je 200 μl Blocking Fertiglösung hinzugegeben (Roche Diagnostics, Mannheim) und für 1 h bei RT inkubiert. Es wurde erneut fünfmal mit 400 μl TBS-Tween-Puffer gewaschen. Im Weiteren erfolgte die zweistündige Inkubation mit jeweils 100 μl Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Roche; Konjugat verdünnt 1:10000 in TBS-Tween) bei RT. Auch hier folgte wiederum ein fünffacher Waschschritt. Hierauf erfolgte die Zugabe von jeweils 100 μl o-Phenylendiamin (OPD)-Lösung (DAKO Diagnostica, Hamburg), wobei solange inkubiert wurde, dass sich eine sichtbare Färbung der Proben ergab. Die Farbreaktion wurde durch Zugabe von je 100 μl 0,5 M H2SO4 abgestoppt.
  • Anschließend wurde im Mikrotiterplatten-Photometer die Extinktion der Proben bei 490 nm bestimmt.
  • Literatur:
    • Amado, M., Almeida, R., Schwientek, T. and Clausen, H. "Identification and characterization of large galactosyltransferase gene families: galactosyltransferases for all functions." Biochim Biophys Acta, 1999, 1473 (1), 35-53.
    • Bayer, E. A., Ben-Hur, H. and Wilchek, M. "Biocytin hydrazide--a selective label for sialic acids, galactose, and other sugars in glycoconjugates using avidin-biotin technology." Anal Biochem, 1988, 170 (2), 271-81.
    • Bülter, T., Schumacher, T., Namdjou, D. J., Gutierrez Gallego, R., Clausen, H. and Elling, L. "Chemoenzymatic synthesis of biotinylated nucleotide sugars as substrates for glycosyltransferases." Chembiochem, 2001, 2 (12), 884-94.
    • Gross, H. J. and Brossmer, R. "Enzymatic introduction of a fluorescent sialic acid into oligosaccharide chains of glycoproteins." Eur J Biochem, 1988, 177 (3), 583-9.
    • Gross, H. J. and Brossmer, R. "Characterization of human plasma sialytransferase using a novel fluorometric assay." Clin Chim Acta, 1991, 197 (3), 237-47.
    • Gross, H. J., Bunsch, A., Paulson, J. C. and Brossmer, R. "Activation and transfer of novel synthetic 9-substituted sialic acids." Eur J Biochem, 1987, 168 (3), 595-602.
    • Gross, H. J., Rose, U., Krause, J. M., Paulson, J. C., Schmid, K., Feeney, R. E. and Brossmer, R. "Transfer of synthetic sialic acid analogues to N- and O-linked glycoprotein glycans using four different mammalian sialyltransferases." Biochemistry, 1989, 28 (18), 7386-92.
    • Hällgren, C. and Hindsgaul, O. "An Aminated GDP-Fucose Analog Useful in the Fucosyl-Transferase Catalyzed Addition of Biological Probes Onto Oligosaccharide Chains." J. Carbohydr. Chem., 1995, 14, 453-464.
    • Hang, H. C., Yu, C., Kato, D. L. and Bertozzi, C. R. "A metabolic labeling approach toward proteomic analysis of mucin-type O-linked glycosylation." Proc Nat1 Acad Sci USA, 2003, 100 (25), 14846-51.
    • Kayser, H., Zeitler, R., Kannicht, C., Grunow, D., Nuck, R. and Reutter, W. "Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors." J Biol Chem, 1992, 267 (24), 16934-8.
    • Keppler, O. T., Stehling, P., Herrmann, M., Kayser, H., Grunow, D., Reutter, W. and Pawlita, M. "Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses." J Biol Chem, 1995, 270 (3), 1308-14.
    • Khidekel, N., Arndt, S., Lamarre-Vincent, N., Lippert, A., Poulin-Kerstien, K. G., Ramakrishnan, B., Qasba, P. K. and Hsieh-Wilson, L. C. "A chemoenzymatic approach toward the rapid and sensitive detection of O-GlcNAc posttranslational modifications." J Am Chem Soc, 2003, 125 (52), 16162-3.
    • Khidekel, N., Ficarro, S. B., Peters, E. C. and Hsieh-Wilson, L. C. "Exploring the O-GlcNAc proteome: direct identification of O-GlcNAc-modified proteins from the brain." Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101 (36), 13132-7.
    • Lee, J. H., Baker, T. J., Mahal, L. K., Zabner, J., Bertozzi, C. R., Wiemer, D. F. and Welsh, M. J. "Engineering novel cell surface receptors for virus-mediated gene transfer." J Biol Chem, 1999, 274 (31), 21878-84.
    • Lemieux, G. A. and Bertozzi, C. R. "Chemoselective ligation reactions with proteins, oligosaccharides and cells." Trends Biotechnol, 1998, 16 (12), 506-13.
    • Liljeblad, M., Lundblad, A. and Pahlsson, P. "Analysis of agalacto-IgG in rheumatoid arthritis using surface plasmon resonance." Glycoconj J, 2000, 17 (5), 323-9.
    • Mahal, L. K., Yarema, K. J. and Bertozzi, C. R. "Engineering chemical reactivity on cell surfaces through oligosaccharide biosynthesis." Science, 1997, 276 (5315), 1125-8.
    • Moore, J. S., Wu, X., Kulhavy, R., Tomana, M., Novak, J., Moldoveanu, Z., Brown, R., Goepfert, P. and Mestecky, J. "Increased levels of galactose-deficient IgG in sera of HIV-1-infected individuals." AIDS, 2005,19 (4), 381-389.
    • Raju, T. S., Briggs, J. B., Borge, S. M. and Jones, A. J. "Species-specific variation in glycosylation of IgG: evidence for the species-specific sialylation and branch-specific galactosylation and importance for engineering recombinant glycoprotein therapeutics." Glycobiology, 2000,10 (5), 477-86.
    • Rook, G. A., Onyebujoh, P., Wilkins, E., Ly, H. M., al Attiyah, R., Bahr, G., Corrah, T., Hernandez, H. and Stanford, J. L. "A longitudinal study of per cent agalactosyl IgG in tuberculosis patients receiving chemotherapy, with or without immunotherapy." Immunology, 1994, 81 (1), 149-54.
    • Routier, F. H., Hounsell, E. F., Rudd, P. M., Takahashi, N., Bond, A., Hay, F. C., Alavi, A., Axford, J. S. and Jefferis, R. "Quantitation of the oligosaccharides of human serum IgG from patients with rheumatoid arthritis: a critical evaluation of different methods." J Immunol Methods, 1998, 213 (2), 113-30.
    • Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W. and Horstkorte, R. "Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor." J Biol Chem, 1998, 273 (30), 19146-52.
    • Takaya, K., Nagahori, N., Kurogochi, M., Furuike, T., Miura, N., Monde, K., Lee, Y. C. and Nishimura, S. "Rational design, synthesis, and characterization of novel inhibitors for human beta1,4-galactosyltransferase." J Med Chem, 2005, 48 (19), 6054-65.
    • Wilchek, M. and Bayer, E. A. "Labeling glycoconjugates with hydrazide reagents." Meth Enzymol, 1987, 138, 429-42.
    • Yarema, K. J., Mahal, L. K., Bruehl, R. E., Rodriguez, E. C. and Bertozzi, C. R. "Metabolic delivery of ketone groups to sialic acid residues. Application To cell surface glycoform engineering." J Biol Chem, 1998, 273 (47), 31168-79.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (9)

  1. Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur galactosyltransferase-katalysierten selektiven Markierung der Glykane von Immunglobulin-Antikörpern mit C-6 modifizierten UDP-Gal Derivaten. Nach dem Stand der Technik bekannte technische Merkmale der Erfindung, die beim beschriebenen Verfahren Anwendung finden, sind: • Grundlegend die glykosyltransferase-vermittelte selektive Markierung von Proteinen. • Im Speziellen die galactosyltransferase-vermittelte selektive Markierung von Proteinen mit dem modifizierten Nukleotidzucker UDP-6-biotinyl-α-D-Galactose (UDP-6-biotinyl-Gal). • der Nachweis der selektiven Markierung über einen ELSA Test. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass für den selektiven Transfer des modifizierten Nukleotidzuckers UDP-6-biotinyl-Gal die nach dem bisherigen Stand der Technik ungeeignete rekombinante humane β4GalT-1 eingesetzt wird. Das Verfahren ist zudem dadurch gekennzeichnet, dass die durch die humane β4GalT-1 vermittelte selektive Markierung der N-Glykane von IgG-Antikörpern ein neuartiger Prozess ist. Das Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die durch die α3GalT vermittelte selektive Markierung der Glykane von Proteinen und Lipiden ein neuartiger Prozess ist. Das Verfahren ist zudem dadurch gekennzeichnet, dass die durch die β3GalT vermittelte selektive Markierung der O-Glykane (Tn-Antigen) des Immungobulins IgA 1 ein neuartiger Prozess ist.
  2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte Enzym eine andere Galactosyltransferase der β1-4Galactosyltransferase-Familie ist.
  3. Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der modifizierte Donorzucker ein anderer als UDP-6-biotinyl-Gal ist, aber eine ähnliche Hydrophobizität besitzt und einen ähnlichen Raumanspruch bei der Transferreaktion stellt.
  4. Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zur selektiven Markierung genutzte Enzym eine α1,3Galactosyltransferase ist.
  5. Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zur selektiven Markierung genutzte Enzym eine α1,4Galactosyltransferase ist.
  6. Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper (z.B. IgA) eine O-Glykosylierung trägt, welche mit einer Galactosyltransferase der O-Glykanbiosynthese, z.B. die core1 β1,3Galactosyltransferase, selektiv markiert wird.
  7. Ein Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Nachweis der selektiven Markierung mit einem Western Blot geschieht.
  8. Ein Verfahren zur chemoenzymatischen Synthese von UDP-6-biotinyl-α-D-Galactose und UDP-6-biotinyl-N-Acetyl-α-D-Galactosamin ausgehend von UDP-Glc oder UDP-GlcNAc.
  9. Ein Verfahren nach Anspruch 8, in dem eine UDP-Glc(NAc) 4-Epimerase (EC 5.1.3.2) zusammen mit der Galactose Oxidase (EC 1.1.3.9) in einem Eintopfverfahren kombiniert wird.
DE200510060813 2005-12-20 2005-12-20 Selektive Markierung der Glykane von Antikörpern mit modifizierten Nukleotidzuckern als Substrate von rekombinanten Galactosyltransferasen Withdrawn DE102005060813A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200510060813 DE102005060813A1 (de) 2005-12-20 2005-12-20 Selektive Markierung der Glykane von Antikörpern mit modifizierten Nukleotidzuckern als Substrate von rekombinanten Galactosyltransferasen
PCT/EP2006/012111 WO2007071347A2 (de) 2005-12-20 2006-12-15 Selektive markierung der glykane von immunglobulinen

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200510060813 DE102005060813A1 (de) 2005-12-20 2005-12-20 Selektive Markierung der Glykane von Antikörpern mit modifizierten Nukleotidzuckern als Substrate von rekombinanten Galactosyltransferasen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102005060813A1 true DE102005060813A1 (de) 2007-06-28

Family

ID=38050066

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE200510060813 Withdrawn DE102005060813A1 (de) 2005-12-20 2005-12-20 Selektive Markierung der Glykane von Antikörpern mit modifizierten Nukleotidzuckern als Substrate von rekombinanten Galactosyltransferasen

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102005060813A1 (de)
WO (1) WO2007071347A2 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020248065A1 (en) * 2019-06-12 2020-12-17 Ontario Institute For Cancer Research (Oicr) Unsaturated heterocycloalkyl and heteroaromatic acyl hydrazone linkers, methods and uses thereof
US11576981B2 (en) 2017-12-06 2023-02-14 Ontario Institute For Cancer Research (Oicr) Acyl hydrazone linkers, methods and uses thereof
US11850287B2 (en) 2017-12-22 2023-12-26 Ontario Institute For Cancer Search (Oicr) Heterocyclic acyl hydrazone linkers, methods and uses thereof

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2538819T3 (es) 2009-07-30 2015-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Procesamiento enzimático de anticuerpos
CA2809632A1 (en) 2010-10-05 2012-04-12 Monika Baehner Antibodies against human tweak and uses thereof
EP2764020B1 (de) 2011-10-05 2015-08-12 F. Hoffmann-La Roche AG Verfahren zur antikörper-g1-glykoform-herstellung

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2256197B (en) * 1991-05-31 1995-11-22 Ciba Geigy Ag Yeast as host for expression of heterologous glycosyl transferase enzymes
JP2003189873A (ja) * 2001-12-27 2003-07-08 Takeda Chem Ind Ltd がんの予防・治療剤

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11576981B2 (en) 2017-12-06 2023-02-14 Ontario Institute For Cancer Research (Oicr) Acyl hydrazone linkers, methods and uses thereof
US11850287B2 (en) 2017-12-22 2023-12-26 Ontario Institute For Cancer Search (Oicr) Heterocyclic acyl hydrazone linkers, methods and uses thereof
WO2020248065A1 (en) * 2019-06-12 2020-12-17 Ontario Institute For Cancer Research (Oicr) Unsaturated heterocycloalkyl and heteroaromatic acyl hydrazone linkers, methods and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007071347A3 (de) 2007-11-15
WO2007071347A2 (de) 2007-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Streamlining the chemoenzymatic synthesis of complex N-glycans by a stop and go strategy
Li et al. An automated platform for the enzyme-mediated assembly of complex oligosaccharides
Luchansky et al. Constructing azide-labeled cell surfaces using polysaccharide biosynthetic pathways
Sauerzapfe et al. Chemo-enzymatic synthesis of poly-N-acetyllactosamine (poly-LacNAc) structures and their characterization for CGL2-galectin-mediated binding of ECM glycoproteins to biomaterial surfaces
Kranz et al. COG8 deficiency causes new congenital disorder of glycosylation type IIh
Cioce et al. Generating orthogonal glycosyltransferase and nucleotide sugar pairs as next-generation glycobiology tools
Laurent et al. Glycoarrays—tools for determining protein–carbohydrate interactions and glycoenzyme specificity
EP0432157B1 (de) Verfahren zur herstellung von oligosacchariden
DE102005060813A1 (de) Selektive Markierung der Glykane von Antikörpern mit modifizierten Nukleotidzuckern als Substrate von rekombinanten Galactosyltransferasen
JP5975577B2 (ja) シアル酸含有糖鎖の製造方法
Wu et al. Identification of the binding roles of terminal and internal glycan epitopes using enzymatically synthesized N-glycans containing tandem epitopes
Prudden et al. A multifunctional anomeric linker for the chemoenzymatic synthesis of complex oligosaccharides
Santra et al. Regioselective one-pot multienzyme (OPME) chemoenzymatic strategies for systematic synthesis of sialyl core 2 glycans
Del Solar et al. Robustness in glycosylation systems: effect of modified monosaccharides, acceptor decoys and azido sugars on cellular nucleotide-sugar levels and pattern of N-linked glycosylation
Both et al. Applications of a highly α2, 6-selective pseudosialidase
Noel et al. MicroPlate sialyltransferase assay: A rapid and sensitive assay based on an unnatural sialic acid donor and bioorthogonal chemistry
Villacrés et al. Strategic feeding of NS0 and CHO cell cultures to control glycan profiles and immunogenic epitopes of monoclonal antibodies
Abukar et al. Development of BODIPY labelled sialic acids as sialyltransferase substrates for direct detection of terminal galactose on N-and O-linked glycans
Anwar et al. Sugar nucleotide regeneration system for the synthesis of Bi-and triantennary N-glycans and exploring their activities against siglecs
Cao et al. Systematic synthesis of bisected N-glycans and unique recognitions by glycan-binding proteins
EP0272603A2 (de) Verfahren zur Messung von Glycosyltransferasen
Patil et al. Scaling down the size and increasing the throughput of glycosyltransferase assays: activity changes on stem cell differentiation
Gadi et al. Convergent chemoenzymatic synthesis of O-GalNAc rare cores 5, 7, 8 and their sialylated forms
Schoenhofen et al. Biosynthesis of legionaminic acid and its incorporation into glycoconjugates
Bårström et al. New derivatives of reducing oligosaccharides and their use in enzymatic reactions: efficient synthesis of sialyl Lewis a and sialyl dimeric Lewis x glycoconjugates

Legal Events

Date Code Title Description
8139 Disposal/non-payment of the annual fee