WO2007071347A2 - Selektive markierung der glykane von immunglobulinen - Google Patents

Selektive markierung der glykane von immunglobulinen Download PDF

Info

Publication number
WO2007071347A2
WO2007071347A2 PCT/EP2006/012111 EP2006012111W WO2007071347A2 WO 2007071347 A2 WO2007071347 A2 WO 2007071347A2 EP 2006012111 W EP2006012111 W EP 2006012111W WO 2007071347 A2 WO2007071347 A2 WO 2007071347A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
udp
labeling
glycans
galactose
labeled
Prior art date
Application number
PCT/EP2006/012111
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2007071347A3 (de
Inventor
Lothar Elling
Thomas Schumacher
Darius-Jean Namdjou
Original Assignee
Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen filed Critical Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen
Publication of WO2007071347A2 publication Critical patent/WO2007071347A2/de
Publication of WO2007071347A3 publication Critical patent/WO2007071347A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91091—Glycosyltransferases (2.4)
    • G01N2333/91097—Hexosyltransferases (general) (2.4.1)
    • G01N2333/91102—Hexosyltransferases (general) (2.4.1) with definite EC number (2.4.1.-)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins

Definitions

  • the invention relates to methods for labeling immunoglobulins, in which a galactosyltransferase-catalyzed selective labeling of the glycans of the glycoconjugates with C-6 modified UDP- ⁇ -D-galactose derivatives takes place.
  • the invention also relates to labeled immunoglobulins and recombinant enzymes.
  • the Nishimura group was able to show that UDP-6-biotinyl-Gal strongly related compounds such as uridine-5 '- (6-amino- ⁇ 2 - [(7-methyl-naphthyl) methoxycarbonylmethoxy] ethoxy ⁇ acetyl 6-deoxy- ⁇ -D-galactopyranosyl) diphosphate monoammonium salt are inhibitors of human recombinant ⁇ 4GalT-1.
  • the inhibitory studies were performed with fluorescently labeled GlcNAc monosaccharide derivatives (Takaya et al., 2005). These observations are supported by the results of the applicants.
  • the disadvantage of the described labeling method of Bayer and Wilchek is the lack of selectivity. It comes to the randomized labeling of the glycans of a Glykoko ⁇ jugats. Selective methods for labeling the N-glycans of antibodies by a galactosyltransferase have not previously been described.
  • the abovementioned examples of the methods for selective labeling have the disadvantage that the donor substrates used must first be produced by partially complex chemical syntheses. An application of these donor substrates for the labeling of glycans on antibodies has not been shown. For the in vivo methods described, the acceptance of an entire biosynthetic pathway for the modified substrate is necessary.
  • the object of the present invention is to provide a method for labeling glycoconjugates, in particular glycoproteins and immunoglobulins, which overcomes the disadvantages described.
  • the method according to the invention should be simple, quick and effective and allow the synthesis of new labeled molecules, in particular labeled immunoglobulins.
  • another task of the present invention is to provide a method for labeling glycoconjugates, in particular glycoproteins and immunoglobulins, which overcomes the disadvantages described.
  • the method according to the invention should be simple, quick and effective and allow the synthesis of new labeled molecules, in particular labeled immunoglobulins.
  • Glykoproteinen be provided.
  • the enzymes should also be easily accessible and manageable and allow efficient labeling reactions.
  • Another object of the invention is to enable selective labeling of the glycans of antibodies or other glycoproteins with C-6 modified UDP-Gal derivatives catalyzed by recombinant galactosyltransferases (e.g., ⁇ 4GalT-I).
  • Another object of the invention is to chemoenzymatically synthesize the C-6 modified UDP-GaI derivatives starting from UDP-Glc.
  • the object is achieved by methods, labeled immunoglobulins, galactosyltransferases, nucleic acids and kits according to claims 1 to 28.
  • the method according to the invention is named Galactosyltransferase Mediated Labeling (GalTMedLab).
  • the invention represents the first selective labeling of glycans of antibodies ( Figure 1).
  • the transfer reaction shown in FIG. 1 (reaction 1 in FIG. 1A) is catalyzed by recombinant enzyme variants of the human ⁇ 4GalT-1 (EC 2.4.1.38) as a representative of the ⁇ 4-galactosyltransferase family.
  • the residue Ri stands for di- and oligosaccharides, N-glycans, O-glycans, glycoproteins with N- and O-glycans, and glycolipids.
  • the gene and amino acid sequences of the recombinant enzyme variants are shown in Appendix I.
  • the labeling of the antibody is detected photometrically using streptavidin conjugates using ELISA-like techniques.
  • the method for labeling glycans of the antibodies is used to detect disease - associated changes in the galactosylation of glycans and represents a new method for the diagnosis of rheumatoid arthritis (RA) and IgA nephropathy (IgAN).
  • RA rheumatoid arthritis
  • IgAN IgA nephropathy
  • RA rheumatoid arthritis
  • IgAN IgA nephropathy
  • the invention encompasses a method for the galactosyltransferase-catalyzed selective labeling of the glycans of glycoproteins and glycolipids with C-6-modified UDP-galactose derivatives, in particular C-6-modified UDP- ⁇ -D-galactose derivatives.
  • the invention relates to the labeling of glycoconjugates, namely glycoproteins and glycolipids.
  • constructs of a native galactosyltransferase in particular from a ⁇ -galactosyltransferase, having the catalytic domain and the luminal domain of the native enzyme but not the transmembrane region or not more than 11 aa of the transmembrane region.
  • the UDP- ⁇ -D-galactose derivatives which can be used according to the invention are chemically modified, preferably with a substance which can be detected in a simple manner in an assay.
  • a photometric assay is suitable, which can be carried out with biotin-modified UDP- ⁇ -D-galactose derivatives.
  • UDP-6-biotinyl- ⁇ -D-galactose is preferably used for the labeling of the glycans of glycoproteins and glycolipids.
  • Glycoconjugates is preferably a ⁇ -galactosyltransferase, a Core 1 ⁇ 1-
  • the enzyme and its coding gene are of human origin in a preferred embodiment. They are preferably recombinantly produced enzymes.
  • the immunoglobulin to be labeled is preferably derived from the serum of patients
  • the labeled glycoconjugates are preferably with an avidin or
  • the detection of the label is preferably carried out by a spectroscopic method or with a Western blot.
  • the invention also provides a method for labeling glycoproteins or glycolipids, in which a galactosyltransferase-catalyzed selective labeling of the glycoproteins or glycolipids with C-6 modified UDP- ⁇ -D-galactose derivatives is carried out, wherein the galactosyltransferase one of the amino acid sequences SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 or SEQ ID NO 3.
  • UDP-6-biotinyl- ⁇ -D-galactose is preferably used in this embodiment of the invention. It is also possible to use other donor sugars which have a similar hydrophobicity and provide a similar space requirement in the transfer reaction.
  • the labeled glycans are coupled with an avidin or streptavidin conjugate, after which the detection of the label is carried out by a spectroscopic method.
  • the invention also provides a diagnostic method comprising the steps of the labeling method according to the invention.
  • a measured value is preferably determined and compared with a reference value. For example, if there is a difference of more than 5, 10 or 20% of the reference value, a diagnosed disease may be present.
  • the invention also provides a labeled immunoglobulin obtainable by a method according to the invention and a labeled immunoglobulin in which the glycans are linked to a C-6-modified ⁇ -D-galactose derivative and a labeled immunoglobulin in which the donor substrate is a derivative is the UDP-6-biotinyl- ⁇ -D-galactose.
  • immunoglobulin is synonymous with "immunoglobulin antibody” or "antibody”.
  • the immunoglobulin preferably carries an N- or O-glycosylation, which is selectively labeled according to the invention.
  • the invention also provides the galactosyltransferases having one of the amino acid sequences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO 2 or SEQ ID NO 3 and nucleic acids having one of the nucleotide sequences SEQ ID NO 4, 5 or 6.
  • FIG. 1 shows the galactosyltransferase-catalyzed selective labeling of undergalactosylated glycans.
  • FIG. ID Reactions of galactosyltransferase-catalyzed selective labeling of
  • FIG. 1A reaction 1: ⁇ -galactosyltransferases
  • Figure IB Reaction 2: ⁇ 1-3 galactosyltransferases
  • FIG. 2 Chemoenzymatic synthesis of UDP-6-biotinyl-Gal and UDP-6-biotinyl
  • GaINAc starting from UDP-GIc or UDP-GIcNAc.
  • FIG 3 and Figure 4 show the results of labeling IgG of various species with Gal-6-biotin by variants of human ⁇ 4GalT-1.
  • the detection of biotin is carried out with an enzyme-linked streptavidin assay (ELSA).
  • ELSA enzyme-linked streptavidin assay
  • FIG. 3 Result of the ELSA for detecting the labeling of the IgG N-glycans
  • FIG. 4 Result of the ELSA for detecting the labeling of the IgG N-glycans
  • Figure 5 shows the gene and amino acid sequences of nucleic acids and peptides used.
  • reaction solution was distributed to 2 ml Eppendorf tubes and the synthesis was stopped by heating at 95 ° C for five minutes. It was then centrifuged for 15 min at 13000 rpm. The supernatant was collected in a 100 ml Schott flask.
  • reaction solution was first concentrated by evaporation in vacuo to half of
  • Millipore H 2 O was first filtered and degassed, then methanol was added thereto.
  • the isolated UDP-6-biotinyl-Gal (NAc) was combined and then dried in a vacuum in the Speedvac, the resulting yellow solid was stored at -20 0 C.
  • Transfer reaction for the transfer reaction, the antibody was reduced and blocked before the transfer (Liljeblad et al., 2000).
  • the IgG was first with 50 mM Tris / HCl pH 8.0 to a Concentration of 70 ug / ml diluted.
  • Nine volumes of this IgG solution were mixed with one volume of 2-mercaptoethanol (1 M in 50 mM Tris / HCl buffer pH 8.0) and incubated for 2 h at 37 ° C.
  • a volume of 0.2 M iodoacetamide final concentration 0.1 M was added to the solution. This step can also be omitted.
  • the sample filled up in the starting volume was then stored at -20 ° C. until further use.
  • Microtiter plate (ELSA modules Nunc-Immuno, Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden).
  • TBS buffer 50 mM Tris / HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl
  • anti-IgG antibody anti-IgG antibody to the Fc portion of IgGs
  • the sample was washed three times with 400 ⁇ l TBS-Tween buffer (50 mM Tris / HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% (v / v) Tween 20) for at least 30 s each.
  • the absorbance of the samples was determined in 490 nra in the microtiter plate photometer.
  • Enzyme A corresponds to the enzyme variant 1 with SEQ ID NO. 1
  • enzyme B corresponds to the enzyme variant 2 with SEQ ID NO. 2.
  • sequence of enzyme C is not included in the application. It is a fusion protein of the propeptide (shortened by 5 amino acids at the C-terminal end) of the lipase from Staphylococcus hyicus and the catalytic domain of the human ß4Gal-Tl.
  • the experiment shows that a particularly efficient labeling of IgG with enzyme A or B, the donor substrate UDP-6-Biotinyl-Gal and the glycoprotein acceptor IgG is achieved.
  • the reaction is specific and highly dependent on the enzyme, the acceptor and the molecule transferred.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Markierung von Immunglobulinen, bei dem eine Galactosyltransferase-katalysierte selektive Markierung der Glykane von Glykokonjugaten mit C-6 modifizierten UDP-alpha-D-Galactose Derivaten erfolgt. Die Erfindung betrifft auch markierte Immunglobuline und rekombinante Enzymen.

Description

Selektive Markierung der Glykane von Immunglobulinen
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Markierung von Immunglobulinen, bei dem eine Galactosyltransferase-katalysierte selektive Markierung der Glykane der Glykokonjugaten mit C-6 modifizierten UDP-α-D-Galactose Derivaten erfolgt. Die Erfindung betrifft auch markierte Immunglobuline und rekombinante Enzymen.
Stand der Technik Grundlegende Experimente zur Modifikation von Kohlenhydraten in Glykokonjugaten wurden in der Arbeitsgruppe von Bayer und Wilchek durchgeführt (Wilchek and Bayer 1987; Bayer et al. 1988). So wurden beispielsweise die OH-Gruppen von Kohlenhydratstrukturen in Zellmembranen chemisch (mit Periodat) oder enzymatisch (6-Position der Galactose durch Galactose Oxidase) oxidiert und anschließend mit Hydraziden umgesetzt. "Molekulare Werkzeuge" in Form von modifizierten Nukleotidzuckern sind bisher für Untersuchungen von Sialyl- und Fucosyltransferasen entwickelt worden. Der enzymatische Transfer eines fluoreszenzmarkierten Zuckers durch eine Glykosyltransferase wurde zuerst mit Sialyltransferasen durchgeführt (Gross and Brossmer 1988; Gross and Brossmer 1991). Brossmer und Mitarbeiter konnten zeigen, dass verschiedene, an C-9 derivatisierte, Sialinsäuren nicht nur von der CMP-Neu5Ac Synthase aktiviert, sondern auch mit α2,3- und α2,6-Sialyltransferasen in vitro übertragen werden (Gross et al. 1987; Gross et al. 1989). Auf dieser Basis wurden Strategien für den metabolischen Einbau von Sialinsäurederivaten in Glykokonjugate der Zelloberfläche entwickelt (Kayser et al. 1992; Keppler et al. 1995; Lee et al. 1999; Lemieux and Bertozzi 1998; Schmidt et al. 1998). So wurde z.B. die Ketogruppe der N-Levulinoylsialinsäure chemoselektiv biotinyliert und die Zellen anschließend gezielt mit einem Avidin-Zellgift Konjugat abgetötet (Mahal et al. 1997; Yarema et al. 1998). Die chemische Synthese eines biotinylierten Derivates von GDP-ß-L-Fucose ausgehend von L- Galactose wurde von Hällgren und Hindsgaul vorgestellt (Hällgren and Hindsgaul 1995). Mit einer Fucosyltransferase gelang der Transfer des biotinylierten Zuckers auf ein N- Acetyllactosaminderivat. Der Arbeitsgruppe Bertozzi gelang es auch, die selektive Markierung auf den Biosyntheseweg von UDP-GaINAc auszuweiten. Hierbei wurde der „salvage pathway" für dieses Substrat ausgenutzt, so dass die Aufnahme von einem chemisch synthetisierten Azidoanalogon von GaINAc zum entsprechenden UDP-2-GalNAc-Derivat führte. Der Transfer des letztgenannten Zuckers erfolgte über zelleigene Polypeptid-GalNAc- Transferasen; der Zucker ist also ein "molekulares Werkzeug" für diese Enzymfamilie. Ob andere GaINAcTs den Transfer ebenfalls katalysieren, ist nicht bekannt. Mithilfe der chemoselektiven Kopplung über die Staudinger-Reaktion konnte so eine Methode zur Identifizierung von Proteinen mit O-Glykosylierung vom Mucin-Typ entwickelt werden. Diese Methode nutzt aus, dass alle O-Glykane des Mucin-Typs ein core GaINAc besitzen, an welchem die chemoselektive Reaktion angreift (Hang et al. 2003). Eine in v/Yro-Strategie zur Idenfikation von O-GlcNAc-tragenden Proteinen wurde von Khidekel et al. entwickelt. Hierbei wird der Nukleotidzucker UDP-GaI chemisch durch Einbringen einer Keto- Funktionalität modifiziert. Dieses modifizierte Substrat wird von einer Mutante der rekombinanten bovinen ß4Gal-Tl auf das O-GlcNAc tragende Protein α-Crystallin übertragen. Die posttranslationale Modifikation konnte schließlich über chemoselektive Aminooxy-Kopplung mit einem Biotin-Reagenz nachgewiesen werden (Khidekel et al. 2003). In neuesten Arbeiten gelang derselben Arbeitsgruppe mit der dargestellten Strategie die in v/vo-Identifikation von O-GlcNAc-Proteinen am Beispiel des Gehirns von Ratten (Khidekel et al. 2004).
Die Synthese des modifizierten Nukleotidzucker UDP-6-biotinyl-Gal wurde von der Arbeitsgruppe der Anmelder dieser Patentanmeldung bereits publiziert (Bülter et al. 2001). Ein selektiver Transfer dieses Kohlenhydrats konnte für mehrere Mitglieder der humanen Galactosyltransferase-Familie (stets rekombinante Proteine) auf das N-Glykane tragende Glykoprotein Ovalbumin demonstriert werden. Hierbei war der Transfererfolg bezüglich des natürlichen Glykoproteins entscheidend mit der Wahl des Enzyms verknüpft. Überraschenderweise zeigte das in der Literatur für die N-Glykan-Biosynthese beschriebene Enzym ß4GalT-l eine sehr niedrige Transferrate, während das für die Glykolipid-Biosynthese beschriebene Enzym ß4GalT-4 (Amado et al. 1999; Bülter et al. 2001) eine deutlich bessere Rate aufwies. Bülter et. al. verwenden eine humane rekombinante Galaktosyltransferase ß4Gal-Tl, ohne deren Sequenz oder Aufbau anzugeben. Sie spekulieren auch, dass entsprechende Methoden zur Diagnose von Krankheiten wie Rheumatioder Arthritis geeignet sein könnte, es wird jedoch kein Weg aufgezeigt, wie ein solches Verfahren durchgeführt werden könnte. Grundsätzlich verlaufen entsprechende Enzymreaktionen sehr spezifisch und sind abhängig vom verwendeten Enzym, Proteinsubstrat, Markierungsreagens und den sonstigen Reaktionsbedingungen. Die Arbeitsgruppe um Nishimura konnte zeigen, dass mit UDP-6-biotinyl-Gal stark verwandte Verbindungen wie etwa Uridin-5'-(6-Amino-{2-[(7-methyl-naphthyl)methoxy- carbonylmethoxy]ethoxy}-acetyl-6-deoxy-α-D-galactopyranosyl)-diphosphatmonoammonium Salz Inhibitoren der humanen rekombinanten ß4GalT-l darstellen. Die inhibitori sehen Studien wurden mit fluoreszenzmarkierten GlcNAc-Monosaccharidderivaten durchgeführt (Takaya et al. 2005). Gestützt werden diese Beobachtungen durch die Ergebnisse der Anmelder. Es zeigte sich bei Verwendung rekombinanter humaner ß4GalT-l keine Aktivität mit UDP-6-biotinyl-Gal bei Transfer auf einfache Monosaccharidakzeptoren wie GIcNAc oder GIcNAc ßl-Benzyl. Eine in der Literatur beschriebenes konkretes Verfahren für eine selektive Markierung der Glykane von Antikörpern durch eine Galactosyltransferase ist nach dem derzeitigen Stand der Technik nicht bekannt.
Nachteile des Standes der Technik
Der Nachteil der geschilderten Markierungsmethode von Bayer und Wilchek besteht in der mangelnden Selektivität. Es kommt zur zufallsverteilten Markierung der Glykane eines Glykokoηjugats. Selektive Methoden zur Markierung der N-Glykane von Antikörpern durch eine Galactosyltransferase sind bisher nicht beschrieben worden. Die oben genannten Beispiele der Verfahren zur selektiven Markierung besitzen den Nachteil, dass die eingesetzten Donorsubstrate erst durch teilweise aufwendige chemische Synthesen erzeugt werden müssen. Eine Anwendung dieser Donorsubstrate für die Markierung von Glykanen auf Antikörpern wurde nicht gezeigt. Für die beschriebenen in vivo Verfahren ist die Akzeptanz eines gesamten Biosynthesewegs für das modifizierte Substrat notwendig. Krankheiten wie Rheumatoide Arthritis (Routier et al. 1998) oder auch AIDS (Moore et al. 2005) zeichnen sich durch ein Defizit der N-Glykane der IgG-Antikörper an Galactose aus. Eine Diagnostik dieses Galactosemangels wird durch den selektiven Transfer eines modifizierten Galactosemoleküls als molekulares Werkzeug möglich und stellt damit eine spezifische Markierung dar. Theoretisch wäre solch ein Transfer auch basierend auf den Arbeiten zur Modifikation von UDP-GaI nach Khidekel et al. möglich. Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass das modifizierte Donorsubstrat eine mehrstufige chemische Synthese benötigt und eine Mutation des Transferenzyms notwendig ist, womit der Prozess insgesamt aufwendiger wird. Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Markierung von Glykokonjugaten, insbesondere Glykoproteinen und Immunglobulinen, dass die beschriebenen Nachteile überwindet. Das erfindungsgemäße Verfahren soll insbesondere einfach, schnell und effektiv durchführbar sein und die Synthese neuer markierter Moleküle, insbesondere markierter Immunglobuline ermöglichen. In einer weiteren Aufgabe der
Erfindung sollen verbesserte, oder zumindest alternative Enzyme zur Markierung von
Glykoproteinen bereitgestellt werden. Die Enzyme sollen ebenfalls auf einfache Art zugänglich und handhabbar sein und effiziente Markierungsreaktionen ermöglichen.
Ein weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine selektive, durch rekombinante Galactosyltransferasen (z.B. ß4GalT-l) katalysierte, Markierung der Glykane von Antikörpern oder anderen Glykoproteinen mit C-6 modifizierten UDP-Gal-Derivaten zu ermöglichen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die C-6 modifizierten UDP-GaI- Derivate ausgehend von UDP-GIc chemoenzymatisch zu synthetisieren.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wird gelöst durch Verfahren, markierte Immunglobuline, Galactosyltransferasen, Nukleinsäuren und Kits gemäß den Ansprüchen 1 bis 28. Das erfindungsgemäße Verfahren erhält den Namen Galactosyltransferase Mediated Labelling (GalTMedLab).
Die Erfindung stellt die erste selektive Markierung der Glykane von Antikörpern dar (Figur 1). Die in Figur ID dargestellte Transferreaktion (Reaktion 1 in Figur IA) wird von rekombinanten Enzymvarianten der humanen ß4GalT-l (EC 2.4.1.38) als Vertreter der ß4Galactosyltransferase-Familie katalysiert. Der Rest Ri steht für Di- und Oligosaccharide, N-Glykane, O-Glykane, Glykoproteine mit N- und O-Glykanen, und Glykolipide. Die Gen- und Aminosäuresequenzen der rekombinanten Enzymvarianten sind im Appendix I dargestellt. Weitere Beispiele stellen die Reaktionen der α3GalT (Ggta-1, EC 2.4.1.124 und 2.4.1.151, Reaktion 2 in Figur IB) und die core 1 ß3GalT (O-Glykan Biosynthese, Reaktion 3 in Figur IC) dar. Der Rest R2 stellt Proteine dar, die den Zucker GaINAc in der dargestellten Verknüpfung in den Seitenketten von Serin oder Threonin tragen. Das Donorsubstrat UDP-6-biotinyl-Gal wird in einer einfachen chemoenzymati sehen Reaktion ausgehend von kostengünstiger UDP-GIc hergestellt (Figur 2). Mit dem dargestellten Verfahren kann auch UDP-6-biotinyl-GalNAc hergestellt werden. Erfindungsgemäß besonders geeignet ist UDP-6-biotinyl-α-D-Galactose (Figur 2).
Eine Mutagenisierung oder anderweitige genetische Veränderung des zur Markierung eingesetzten Enzyms ist nicht notwendig. Die Markierung des Antikörpers wird mit Streptavidinkonjugaten über ELISA-ähnliche Techniken photometrisch nachgewiesen. Das Verfahren zur Markierung von Glykanen der Antikörper wird zum Nachweis krankheitsassoziierter Veränderungen der Galactosylierung von Glykanen eingesetzt und stellt ein neues Verfahren zur Diagnostik der Krankheiten Rheumatoide Arthritis (RA) und IgA Nephropathie (IgAN) dar. Im Fall der RA wird untergalactosyliertes IgG (Reaktion 1 in Figur IA), bei der IgAN untergalactosylierte O-Glykane, das Tn-Antigen (Reaktion 3 in Figur IC), durch das beschriebene Verfahren nachgewiesen. Weitere diagnostische Anwendungen des Verfahrens betreffen prinzipiell Krankheiten mit Galactosylierungsdefekten, wie z.B. AIDS oder Tuberkulose (Moore et al. 2005, Rook et al. 1994). Beispielhaft wird die Verwendung des Verfahrens zum Nachweis von Galactosylierungsdefekten anhand der IgGs verschiedener Spezies gezeigt (Figur 3 und Figur 4). In der Literatur ist beschrieben, dass die N-Glykane des IgG verschiedener Spezies sich im Grad der Galactosylierung unterscheiden (Raju et al. 2000). Diese mit aufwändigen Isolierungsverfahren und Massenspektrometrie der N-Glykane verbundenen Analysen werden durch das erfindungsgemäße einfache Verfahren ersetzt.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Ergebnisse zum Transfer von UDP-6-biotinyl-Gal auf Ovalbumin oder Monosaccharidakzeptoren mit rekombinanter humaner ß4GalT-l zeigen deutlich, dass es keinerlei Erwartung geben konnte, dass eben dieses Enzym für eine selektive Markierung der N-Glykane von IgG-Antikörpern mit UDP-6-biotinyl-Gal Verwendung finden könnte.
Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur Galactosyltransferase-katalysierten selektiven Markierung der Glykane von Glykoproteinen und Glykolipiden mit C-6 modifizierten UDP- Galactose Derivaten, insbesondere C-6 modifizierten UDP-α-D-Galactose Derivaten. Die Erfindung betrifft die Markierung von Glykokonjugaten, nämlich Glykoproteinen und Glykolipiden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Konstrukte einer nativen Galactosyltransferase, insbesondere von einer ßl-4Galactosyltransferase, verwendet, die die katalytische Domäne und die luminale Domäne des nativen Enzyms aufweisen, nicht aber die Transmembranregion oder nicht mehr als 11 AS der Transmembranregion. Die erfindungsgemäß verwendbaren UDP-α-D-Galactose Derivate sind chemisch modifiziert, bevorzugt mit einer Substanz, die in einem Assay auf einfache Art nachweisbar ist. Dazu eignet sich beispielsweise ein photometrisches Assay, das mit Biotin-modifizierten UDP-α-D- Galactose Derivaten durchgeführt werden kann.
Für die Markierung der Glykane von Glykoproteinen und Glykolipiden wird bevorzugt UDP- 6-biotinyl-α-D-Galactose eingesetzt. Das Enzym für die Markierung der Glykane von
Glykokonjugaten ist bevorzugt eine ßl-4Galactosyltransferase, eine Core 1 ßl-
3 Galactosyltransferase, eine α 1-3 Galactosyltransferase oder eine αl-4Galactosyltransferase.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung von ß4GalT-l oder von löslichen Fragmenten dieses
Proteins. Das Enzym und ihr kodierendes Gen sind in einer bevorzugten Ausführungsform humanen Ursprungs. Es handelt sich bevorzugt um rekombinant hergestellte Enzyme. Das zu markierende Immunglobulin stammt bevorzugt aus dem Serum von Patienten mit
Rheumatoider Arthritis, Nephropathie, insbesondere IgA-Nephropathie, AIDS oder
Tuberkulose. Die markierten Glykokonjugaten werden bevorzugt mit einem Avidin bzw.
Streptavidin-Konjugat gekoppelt. Der Nachweis der Markierung erfolgt vorzugsweise mit einer spektroskopischen Methode oder mit einem Western-Blot.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Markierung von Glykoproteinen oder Glykolipiden, bei dem eine Galactosyltransferase-katalysierte selektive Markierung der Glykoproteine oder Glykolipide mit C-6 modifizierten UDP-α-D-Galactose Derivaten erfolgt, wobei die Galactosyltransferase eine der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 3 aufweist. Für die Markierung der Glykane von Glykoproteinen und Glykolipiden wird bei dieser Ausführungsform der Erfindung bevorzugt UDP-6-biotinyl-α-D- Galactose eingesetzt. Es können auch andere Donorzucker verwendet werden, die eine ähnliche Hydrophobizität besitzen und einen ähnlichen Raumanspruch bei der Transferreaktion stellen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die markierten Glykane mit einem Avidin bzw. Streptavidin-Konjugat gekoppelt, wonach der Nachweis der Markierung mit einer spektroskopischen Methode erfolgt. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Diagnostikverfahren, umfassend die Schritte des erfindungsgemäßen Markierungsverfahrens. In einem zusätzlichen Schritt wird bevorzugt ein Messwert bestimmt und mit einem Referenzwert verglichen. Bei einer Abweichung von mehr als 5, 10 oder 20% vom Referenzwert kann beispielsweise eine diagnostizierte Erkrankung vorliegen.
Gegenstand der Erfindung sind auch ein markiertes Immunglobulin, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren, sowie ein markiertes Immunglobulin, bei dem die Glykane mit einem C-6 modifizierten α-D-Galactose Derivat verbunden sind, sowie ein markiertes Immunglobulin, bei dem das Donorsubstrat ein Derivat der UDP-6-biotinyl-α-D-Galactose ist. Immunglobulin ist im Sinne der Erfindung gleichbedeutend mit „Immunglobulin-Antikörper" oder „Antikörper". Das Immunglobulin trägt vorzugsweise eine N- oder O-Glykosylierung, die erfindungsgemäß selektiv markiert wird.
Gegenstand der Erfindung sind auch die Galactosyltransferasen mit einer der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 3 und Nucleinsäuren mit einer der Nucleotidsequenzen SEQ ID NO 4, 5 oder 6.
Figuren: In Figur 1 ist die Galactosyltransferase-katalysierte selektive Markierung von untergalactosylierten Glykanen dargestellt.
Figur ID: Reaktionen der galactosyltransferase-katalysierten selektiven Markierung von
Glykanen.
Figur IA: Reaktion 1 : ßl-4Galactosyltransferasen; Figur IB: Reaktion 2: α 1-3 Galactosyltransferasen;
Figur IC: Reaktion 3: core 1 ßl-3Galactosyltransferase.
Figur 2: Chemoenzymatische Synthese von UDP-6-biotinyl-Gal und UDP-6-biotinyl-
GaINAc ausgehend von UDP-GIc bzw. UDP-GIcNAc.
Figur 3 und Figur 4 zeigen die Ergebnisse der Markierung von IgG verschiedener Spezies mit Gal-6-Biotin durch Varianten der humanen ß4GalT-l . Der Nachweis von Biotin erfolgt mit einem Enzyme-Linked Streptavidin Assay (ELSA).
Figur 3: Ergebnis des ELSA zum Nachweis der Markierung der N-Glykane des IgG aus
Huhn, Mensch und Ratte mit Reaktion 1 in Figur IA. Figur 4: Ergebnis des ELSA zum Nachweis der Markierung der N-Glykane des IgG aus
Pferd, Maus und Ratte mit Reaktion 1 in Figur IA.
Figur 5 zeigt die Gen- und Aminosäuresequenzen verwendeter Nucleinsäuren und Peptide.
Beispiele:
Chemoenzymatische Synthese nach Figur 2:
Die präparative chemoenzymatische Synthese von UDP-6-biotinhydrazono-Gal(NAc) fand in einem 50 ml-Reaktor mit integrierter blasenfreier Sauerstoffbegasung statt. Das Biotinylierungsreagenz BACH wurde in Puffer vorgegeben und durch Erhitzen auf 50°C unter Rühren in Lösung gebracht. Die Lösung wurde hierauf vorsichtig auf Eis abgekühlt, bis sie wieder RT erreichte. Die übrigen Substanzen des Ansatzes bis auf Galactose Oxidase wurden hinzugefügt und der Pumpkreislauf gestartet. Hierauf wurden 0,5 mbar Überdruck an der Anlage angelegt. War der Überdruck nach 10 min. konstant geblieben, wurde die Synthese durch Zugabe von Galactose Oxidase gestartet. Nach 48 h wurde die Reaktionslösung auf 2 ml Eppendorf-Gefäße verteilt und die Synthese durch fünfminütiges Erhitzen bei 95°C abgestoppt. Hierauf wurde für 15 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in einer 100 ml-Schott-Flasche gesammelt.
Ansatz (alle Konzentrationen Endkonzentrationen)
UDP-GIc(NAc) 8 mM
BACH 12 mM
Katalase 2700 U/ml
UDP-GIc 4-Epimerase 10 U/ml Galactose Oxidase 3 U/ml
CuSO4 0,5 mM
Natriumphosphat-Puffer (NaH2PO4ZNa2HPO4) pH 6,0 25 mM Ansatzvolumen: 50 ml Reaktionsdauer: 24 h
Die Reduktion von UDP-6-biotinhydrazono-Gal(NAc) erfolgte unmittelbar nach der
Synthese. NaCNBH3 wurde zur in der Schott-Flasche befindlichen Lösung gegeben, die Flasche kurz geschüttelt, um das Reduktionsmittel in Lösung zu bringen, und der Ansatz bei -20°C eingefroren. Ansatz (alle Konzentrationen Endkonzentrationen)
UDP-6-biotinhydrazono-Gal(NAc) 6,6 mM (83 % Syntheseausbeute)
NaCNBH3 10O mM Natriumphosphat-Puffer (NaH2PO4/Na2HPO4) pH 6,0 25 mM (aus der Synthese) Ansatzvolumen: 50 ml Temperatur: - 20°C Reaktionsdauer: 48 h
Die Reaktionslösung wurde zunächst durch Einengen im Vakuum auf die Hälfte des
Volumens aufkonzentriert. Hierauf erfolgte die Isolierung von UDP-6-biotinyl-Gal(NAc) über HPLC. Die nach der Aufreinigung erhaltene Produktlösung wurde durch Einengen im Vakuum in der Speedvac getrocknet.
Bedingungen:
Säule HPLC-Säule (Thermo Hypersil, Dreieich)
Material ODS-Hypersil (reversed phase) Cl 8, Porengröße: 5 μm Länge 250 mm
Durchmesser 4,6 mm
Äquilibrierung Mobile Phase A: Methanol 1% / Millipore H2O 99% (v/v), pH 7,0, Fluss: 0,3 ml/min
Probenaufgabe pro analytischer Lauf 250 μl der eingeengten Reaktionslösung mit 6,6 μmol Produkt, Fluss: 0,3 ml/min
Elution Mobile Phase A, Fluss: 0,3 ml/min
Detektion UV (205 nm, 260 nm)
Bei der Herstellung der mobilen Phase A wurde zunächst Millipore H2O filtriert und entgast, darauf Methanol dazugegeben.
Das isolierte UDP-6-biotinyl-Gal(NAc) wurde vereinigt und im Anschluss im Vakuum in der Speedvac getrocknet, der erhaltene gelbe Feststoff wurde bei -200C gelagert.
Transferreaktion nach Figur 1: Für die Transferreaktion wurde der Antikörper vor dem Transfer reduziert und blockiert (Liljeblad et al. 2000). Hierbei wurde das IgG zunächst mit 50 mM Tris/HCl pH 8,0 auf eine Konzentration von 70 μg/ml verdünnt. Neun Volumen dieser IgG-Lösung wurden mit einem Volumen 2-Mercaptoethanol (1 M in 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,0) gemischt und für 2 h bei 370C inkubiert. Um das Reoxidieren der Disulfidbrücken zu verhindern, wurde ein Volumen 0,2 M Iodoacetamid (Endkonzentration 0,1 M) zur Lösung hinzugegeben. Dieser Schritt kann auch weggelassen werden. Die Inkubation mit Iodoacetamid erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur. Die Proben wurden je nach Volumen durch Ultrafiltration und fünfmaliges Waschen in einem Ultrafiltrationsmodul, Vivaspin® 20 (Vivascience, Hannover) oder Microcon® YM 10 (Millipore, Schwalbach; jeweils cut-off 10 kDa), von Mercaptoethanol und Iodoacetamid befreit. Schließlich wurde der Antikörper zum Einsatz im Transfer-Assay über die eben genannten Membran-Module aufkonzentriert.
Ansatz (alle Konzentrationen Endkonzentrationen): 50 μl IgG von Ratte, Maus,
Pferd, Mensch oder Huhn [6 mg/ml] 1 ,5 mg/ml Endkonzentration 2 μl UDP-6-biotinyl-Gal [15O mM] 1,5 mM Endkonzentration
50 μl HEPES/NaOH pH 7,4 [100 mM] 25 mM Endkonzentration
2 μl MgCl2 [100 mM] 1 mM Endkonzentration
2 μl Triton X-100 [10% (v/v)] 0,1% (v/v) Endkonzentration
50 μl humane rekombinante ß4GalT-l [200 mU/ml] 50 mU/ml Endkonzentration
Ansatzvolumen: 200 μl Inkubationszeit: 14 h Inkubationstemperatur: 37 °C
Nach Beendigung der Reaktion wurde jede Probe fünfmal mit TBS-T ween-Puffer (50 mM
Tris/HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1 % (v/v) Tween 20) in Microcon® YM 10 gewaschen.
Die auf das Ausgangsvolumen aufgefüllte Probe wurde hierauf bis zum weiteren Gebrauch bei -20°C gelagert.
Nachweis des transferierten Gal-Biotins:
Die selektive Markierung der IgGs wurde mit einem Sandwich-ELSA-Test in einer
Mikrotiterplatte (ELSA-Module Nunc-Immuno, Nunc GmbH &Co. kG, Wiesbaden) nachgewiesen. Zunächst wurden je 200 μl TBS-Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl) mit 0,04 mg Anti-IgG- Antikörper (Anti-IgG- Antikörper gegen den Fc-Teil der IgGs) plattiert und 8 h bei 4°C immobilisiert. Hierauf wurden diejenigen Vertiefungen der Platte, die Probe enthielten, dreimal mit 400 μl TBS-Tween-Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1 % (v/v) Tween 20) für mindestens je 30 s gewaschen. Zum Blockieren wurden je 200 μl Blocking Fertiglösung hinzugegeben (Roche Diagnostics, Mannheim) und für 1 h bei RT inkubiert. Von den Transfer-Ansätzen wurden hierauf 200 μl mit 0,03 mg IgG in die Vertiefungen pipettiert. Es wurden Doppelbestimmungen durchgeführt. Zur Bindung des markierten IgG wurde die Platte über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Nach dieser Zeit wurde fünfmal mit 400 μl TBS-Tween-Puffer gewaschen. Zum Blockieren wurden je 200 μl Blocking Fertiglösung hinzugegeben (Roche Diagnostics, Mannheim) und für 1 h bei RT inkubiert. Es wurde erneut fünfmal mit 400 μl TBS-Tween-Puffer gewaschen. Im Weiteren erfolgte die zweistündige Inkubation mit jeweils 100 μl Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Roche; Konjugat verdünnt 1 :10000 in TBS-Tween) bei RT. Auch hier folgte wiederum ein fünffacher Waschschritt. Hierauf erfolgte die Zugabe von jeweils 100 μl o-Phenylendiamin (OPD)-Lösung (DAKO Diagnostica, Hamburg), wobei solange inkubiert wurde, dass sich eine sichtbare Färbung der Proben ergab. Die Farbreaktion wurde durch Zugabe von je 100 μl 0,5 M H2SO4 abgestoppt.
Anschließend wurde im Mikrotiterplatten-Photometer die Extinktion der Proben bei 490 nra bestimmt.
Aktivitätsmessung mit verschiedenen Substraten und Enzymen: In einem weiteren Experiment wurde die Aktivität verschiedener rekombinanter Galactosyl- transferase- Varianten für zwei verschiedene Akzeptoren, nämlich GlcNAcßl-Benzyl und IgG untersucht. Das Experiment wurde mit UDP-GaI und mit UDP-6-Biotinyl-Gal (UDP-GaI- Biotin) durchgeführt.
Die Ergebnisse sind Tabelle 1 zu entnehmen. Es zeigt sich eine schlechte bzw. fehlende Akzeptanz der Enzyme A und B für UDP-Gal-Biotin in Anwesenheit des niedermolekularen Akzeptors GlcNAcß l-Bn, das ein Standardsubstrat für das Enzymassay ist. Beide Enzyme enthalten den luminalen Anteil (354 As) der humanen ß4Gal-Tl, der aus der katalytische Domäne und der Stammregion besteht. Dagegen zeigt sich für die Enzyme A und B eine selektive, effiziente Reaktion mit IgG. Das Enzym C verhält sich unterschiedlich. Es katalysiert die untersuchten Reaktionen effizient mit Ausnahme der Markierung von IgG mit UDP-Gal-Biotin. Tabelle 1 : Aktivitäten verschiedener rekombinanter Galactosyltransferasen: Enzym A entspricht der Enzymvariante 1 mit SEQID NO. 1 , Enzym B entspricht der Enzymvariante 2 mit SEQ ID NO. 2. Die Sequenz von Enzym C ist nicht in der Anmeldung enthalten. Es handelt sich um ein Fusionsprotein des Propeptids (um 5 Aminosäuren am C-terminalen Ende verkürzt) der Lipase aus Staphylococcus hyicus und der katalytischen Domäne der humanen ß4Gal-Tl.
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
Das Experiment zeigt, dass eine besonders effiziente Markierung von IgG mit Enzym A oder B, dem Donorsubstrat UDP-6-Biotinyl-Gal und dem Glykoproteinakzeptor IgG erreicht wird. Die Reaktion verläuft spezifisch und ist in hohem Maße vom Enzym, vom Akzeptor und vom transferierten Molekül abhängig.
Literatur:
Amado, M., Almeida, R., Schwientek, T. and Clausen, H. "Identification and characterization of large galactosyltransferase gene families: galactosyltransferases for all functions." Biochim Biophys Acta, 1999, 1473 (1), 35-53.
Bayer, E. A., Ben-Hur, H. and Wilchek, M. "Biocytin hydrazide~a selective label for sialic acids, galactose, and other sugars in glycoconjugates using avidin-biotin technology." Anal Biochem, 1988, 170 (2), 271-81.
Bülter, T., Schumacher, T., Namdjou, D. J., Gutierrez Gallego, R., Clausen, H. and Elling, L. "Chemoenzymatic synthesis of biotinylated nucleotide sugars as Substrates for glycosyltransferases." Chembiochem, 2001, 2 (12), 884-94. Gross, H. J. and Brossmer, R. "Enzymatic introduction of a fluorescent sialic acid into Oligosaccharide chains of glycoproteins." Eur J Biochem, 1988, 177 (3), 583-9.
Gross, H. J. and Brossmer, R. "Characterization of human plasma sialytransferase using a novel fluorometric assay." Clin Chim Acta, 1991, 197 (3), 237-47. Gross, H. J., Bunsch, A., Paulson, J. C. and Brossmer, R. "Activation and transfer of novel synthetic 9-substituted sialic acids." Eur J Biochem, 1987, 168 (3), 595-602.
Gross, H. J., Rose, U., Krause, J. M., Paulson, J. C, Schmid, K., Feeney, R. E. and Brossmer, R. "Transfer of synthetic sialic acid analogues to N- and O-linked glycoprotein glycans using four different mammalian sialyltransferases." Biochemistry, 1989, 28 (18), 7386-92.
Hällgren, C. and Hindsgaul, O. "An Aminated GDP-Fucose Analog Useful in the Fucosyl-
Transferase Catalyzed Addition of Biological Probes Onto Oligosaccharide Chains." J. Carbohydr. Chem., 1995, 14, 453-464.
Hang, H. C, Yu, C, Kato, D. L. and Bertozzi, C. R. "A metabolic labeling approach toward proteomic analysis of mucin-type O-linked glycosylation." Proc Natl Acad Sei U S A,
2003, 100 (25), 14846-51.
Kayser, H., Zeitler, R., Kannicht, C, Grunow, D., Nuck, R. and Reutter, W. "Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D- hexosamines as precursors." J Biol Chem, 1992, 267 (24), 16934-8. Keppler, O. T., Stehling, P., Herrmann, M., Kayser, H., Grunow, D., Reutter, W. and Pawlita, M. "Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses." J Biol Chem, 1995, 270 (3), 1308-14.
Khidekel, N., Arndt, S., Lamarre-Vincent, N., Lippert, A., Poulin-Kerstien, K. G.,
Ramakrishnan, B., Qasba, P. K. and Hsieh- Wilson, L. C. "A chemoenzymatic approach toward the rapid and sensitive detection of O-GlcNAc posttranslational modifications." J Am Chem Soc, 2003, 125 (52), 16162-3.
Khidekel, N., Ficarro, S. B., Peters, E. C. and Hsieh- Wilson, L. C. "Exploring the O-GlcNAc proteome: direct identification of O-GlcNAc-modified proteins from the brain." Proc Natl Acad Sei U S A, 2004, 101 (36), 13132-7. Lee, J. H., Baker, T. J., Mahal, L. K., Zabner, J., Bertozzi, C. R., Wiemer, D. F. and Welsh, M. J. "Engineering novel cell surface receptors for virus-mediated gene transfer." J Biol Chem, 1999, 274 (31), 21878-84.
Lemieux, G. A. and Bertozzi, C. R. "Chemoselective ligation reactions with proteins, Oligosaccharides and cells." Trends Biotechnol, 1998, 16 (12), 506-13. Liljeblad, M., Lundblad, A. and Pahlsson, P. "Analysis of agalacto-IgG in rheumatoid arthritis using surface plasmon resonance." Glycoconj J, 2000, 17 (S), 323-9.
Mahal, L. K., Yarema, K. J. and Bertozzi, C. R. "Engineering chemical reactivity on cell surfaces through Oligosaccharide biosynthesis." Science, 1997, 276 (5315), 1125-8.
Moore, J. S., Wu, X., Kulhavy, R., Tomana, M., Novak, J., Moldoveanu, Z., Brown, R., Goepfert, P. and Mestecky, J. "Increased levels of galactose-deficient IgG in sera offflV-1-infected individuals." AIDS, 2005, 19 (A), 381-389.
Raju, T. S., Briggs, J. B., Borge, S. M. and Jones, A. J. "Species-specific Variation in glycosylation of IgG: evidence for the species-specific sialylation and branch-speeifie galactosylation and importance for engineering recombinant glycoprotein therapeutics." Glycobiology, 2000, 10 (5), 477-86. Rook, G. A., Onyebujoh, P., Wilkins, E., Ly, H. M., al Attiyah, R., Bahr, G., Corrah, T.,
Hernandez, H. and Stanford, J. L. "A longitudinal study of per cent agalactosyl IgG in tuberculosis patients receiving chemotherapy, with or without immunotherapy." Immunology, 1994, 81 (1), 149-54. Routier, F. H., Hounsell, E. F., Rudd, P. M., Takahashi, N., Bond, A., Hay, F. C, Alavi, A., Axford, J. S. and Jefferis, R. "Quantitation of the Oligosaccharides of human serum IgG from patients with rheumatoid arthritis: a critical evaluation of different methods." J Immunol Methods, 1998, 213 (2), 113-30.
Schmidt, C, Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W. and Horstkorte, R. "Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor." J Biol Chem, 1998, 273 (30), 19146-52.
Takaya, K., Nagahori, N., Kurogochi, M., Furuike, T., Miura, N., Monde, K., Lee, Y. C. and Nishimura, S. "Rational design, synthesis, and characterization of novel inhibitors for human betal,4-galactosyltransferase." J Med Chem, 2005, 48 (19), 6054-65. Wilchek, M. and Bayer, E. A. "Labeling glycocoηjugates with hydrazide reagents." Meth Enzymol, 1987, 138, 429-42.
Yarema, K. J., Mahal, L. K., Bruehl, R. E., Rodriguez, E. C. and Bertozzi, C. R. "Metabolie delivery of ketone groups to sialic acid residues. Application To cell surface glycoform engineering." J Biol Chem, 1998, 273 (47), 31168-79.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Markierung von Immunglobulinen, bei dem eine Galactosyltransferase- katalysierte selektive Markierung der Glykane der Immunglobuline mit C-6 modifizierten UDP-Galactose Derivaten erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für die Markierung der Glykane von Glykoproteinen und Glykolipiden UDP-6-biotinyl-α-D-Galactose eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass für die Markierung der Glykane von Glykokonjugaten eine ßl-4Galactosyltransferase eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass für die
Markierung der Glykane von Glykoproteinen eine core 1 ßl-3Galactosyltransferase eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierende Gen humanen Ursprungs ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierende Gen eine der Sequenzen SEQ ID No. 1 , 2 oder 3 aufweist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das zu markierende Immunglobulin G aus dem Serum von Patienten mit Rheumatoider Arthritis stammt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, dass das zu markierende Immunglobulin Al im Serum von Patienten mit IgAl Nephropathie enthalten ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, dass für die Markierung der Glykokonjugate eine αl-3Galactosyltransferase eingesetzt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, dass für die Markierung der Glykokonjugate eine αl-4Galactosyltransferase eingesetzt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet dadurch, dass die markierten Glykokonjugate mit einem Avidin bzw. Streptavidin-Konjugat gekoppelt werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gekennzeichnet dadurch, dass der Nachweis der Markierung mit einer spektroskopischen Methode erfolgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem der Nachweis der selektiven Markierung der Glykane von Glykokonjugaten mit einem Western-Blot geschieht.
14. Verfahren zur Markierung von Glykoproteinen oder Glykolipiden, bei dem eine Galactosyltransferase-katalysierte selektive Markierung der Glykoproteine oder
Glykolipide mit C-6 modifizierten UDP-α-D-Galactose Derivaten erfolgt, wobei die Galyctosyltransferase eine der Aminosäuresequenzen SEQ. ID NO 1, SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 3 aufweist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass für die Markierung der
Glykane von Glykoproteinen und Glykolipiden UDP-6-biotinyl-α-D-Galactose eingesetzt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, gekennzeichnet dadurch, dass die markierten Glykane mit einem Avidin bzw. Streptavidin-Konjugat gekoppelt werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, gekennzeichnet dadurch, dass der Nachweis der Markierung mit einer spektroskopischen Methode erfolgt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, bei dem der Nachweis der selektiven
Markierung der Glykane von Glykokonjugaten mit einem Western-Blot geschieht.
19. Diagnostikverfahren, umfassend ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis, IgA-Nephropathie, AIDS oder Tuberkulose.
20. Markiertes Immunglobulin, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis 15.
21. Markiertes Immunglobulin, bei dem die Glykane mit einem C-6 modifizierten α-D- Galactose Derivat verbunden sind.
22. Markiertes Immunglobulin nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat 6-biotinyl-α-D-Galactose ist.
23. Markiertes Immunglobulin nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunglobulin IgG oder IgAl ist.
24. Galactosyltransferase, die eine der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 3 aufweist.
25. Nucleinsäure, die eine der Nucleotidsequenzen SEQ ID NO 4, 5 oder 6 aufweist.
26. Verfahren zur chemoenzymatischen Synthese von UDP-6-biotinyl-α-D-Galactose und UDP-6-biotinyl-N-Acetyl-α-D-Galactosamin ausgehend von UDP-GIc oder UDP- GIcNAc, in dem eine UDP-GIc(NAc) 4-Epimerase (EC 5.1.3.2) zusammen mit der Galactose Oxidase (EC 1.1.3.9) in einem Eintopfverfahren kombiniert wird.
27. Kit, enthaltend eine Galaktosyltransferase und ein modifiziertes UDP-α-D-Galactose Derivat zur Anwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19.
PCT/EP2006/012111 2005-12-20 2006-12-15 Selektive markierung der glykane von immunglobulinen WO2007071347A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005060813.2 2005-12-20
DE200510060813 DE102005060813A1 (de) 2005-12-20 2005-12-20 Selektive Markierung der Glykane von Antikörpern mit modifizierten Nukleotidzuckern als Substrate von rekombinanten Galactosyltransferasen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2007071347A2 true WO2007071347A2 (de) 2007-06-28
WO2007071347A3 WO2007071347A3 (de) 2007-11-15

Family

ID=38050066

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2006/012111 WO2007071347A2 (de) 2005-12-20 2006-12-15 Selektive markierung der glykane von immunglobulinen

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102005060813A1 (de)
WO (1) WO2007071347A2 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011012297A1 (en) 2009-07-30 2011-02-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Enzymatic antibody processing
WO2013050335A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for antibody g1 glycoform production
US9187564B2 (en) 2010-10-05 2015-11-17 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human TWEAK and uses thereof

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3720842A4 (de) 2017-12-06 2021-11-03 Ontario Institute For Cancer Research Acylhydrazon-linker, verfahren und verwendungen davon
US11850287B2 (en) 2017-12-22 2023-12-26 Ontario Institute For Cancer Search (Oicr) Heterocyclic acyl hydrazone linkers, methods and uses thereof
WO2020248065A1 (en) * 2019-06-12 2020-12-17 Ontario Institute For Cancer Research (Oicr) Unsaturated heterocycloalkyl and heteroaromatic acyl hydrazone linkers, methods and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2256197A (en) * 1991-05-31 1992-12-02 Ciba Geigy Ag Process for the production of glycosyltransferases
JP2003189873A (ja) * 2001-12-27 2003-07-08 Takeda Chem Ind Ltd がんの予防・治療剤

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2256197A (en) * 1991-05-31 1992-12-02 Ciba Geigy Ag Process for the production of glycosyltransferases
JP2003189873A (ja) * 2001-12-27 2003-07-08 Takeda Chem Ind Ltd がんの予防・治療剤

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALMEIDA R ET AL: "A family of human beta4-Galactosyltransferases. Cloning and expression of two novel UDP-galactose:beta-N-acetylglucosamine beta1,4-galactosyltransferases, beta4Gal-T2 and beta4Gal-T3" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOCHEMICAL BIOLOGISTS, BIRMINGHAM,, US, Bd. 272, Nr. 51, 19. Dezember 1997 (1997-12-19), Seiten 31979-31991, XP002977545 ISSN: 0021-9258 *
AMADO M ET AL: "Identification and characterization of large galactosyltransferase gene families: galactosyltransferases for all functions" BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA - GENERAL SUBJECTS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, NL, Bd. 1473, Nr. 1, 17. Dezember 1999 (1999-12-17), Seiten 35-53, XP004276500 ISSN: 0304-4165 *
BÜLTER T ET AL: "Chemoenzymatic synthesis of biotinylated nucleotide sugars as substrates for glycosyltransferases." CHEMBIOCHEM : A EUROPEAN JOURNAL OF CHEMICAL BIOLOGY 3 DEC 2001, Bd. 2, Nr. 12, 3. Dezember 2001 (2001-12-03), Seiten 884-894, XP002974357 ISSN: 1439-4227 in der Anmeldung erwähnt *
ELLING (Apr. 2004); Current Chemistry and Biochemistry of Saccharides, Cukrblik (CZ), UND NAMDJOU & ELLING (Sept. 2005); GLYCO XVIII, XVIII International Symposium on Glycoconjugates, Firenze (IT); "Modified nucleotide sugars as novel tools for glycobiology" XP002435587 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011012297A1 (en) 2009-07-30 2011-02-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Enzymatic antibody processing
US8524470B2 (en) 2009-07-30 2013-09-03 Hoffman-La Roche, Inc. Enzymatic antibody processing
US9187564B2 (en) 2010-10-05 2015-11-17 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human TWEAK and uses thereof
WO2013050335A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for antibody g1 glycoform production

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007071347A3 (de) 2007-11-15
DE102005060813A1 (de) 2007-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Streamlining the chemoenzymatic synthesis of complex N-glycans by a stop and go strategy
Li et al. An automated platform for the enzyme-mediated assembly of complex oligosaccharides
Gao et al. Unique binding specificities of proteins toward isomeric asparagine-linked glycans
Roth Cytochemical localization of terminal N-acetyl-D-galactosamine residues in cellular compartments of intestinal goblet cells: implications for the topology of O-glycosylation.
Kranz et al. COG8 deficiency causes new congenital disorder of glycosylation type IIh
Luchansky et al. Constructing azide-labeled cell surfaces using polysaccharide biosynthetic pathways
Cioce et al. Generating orthogonal glycosyltransferase and nucleotide sugar pairs as next-generation glycobiology tools
Rouhanifard et al. Chemical probing of glycans in cells and organisms
Sauerzapfe et al. Chemo-enzymatic synthesis of poly-N-acetyllactosamine (poly-LacNAc) structures and their characterization for CGL2-galectin-mediated binding of ECM glycoproteins to biomaterial surfaces
Freeze Congenital disorders of glycosylation: CDG-I, CDG-II, and beyond
Laurent et al. Glycoarrays—tools for determining protein–carbohydrate interactions and glycoenzyme specificity
Park et al. Chemical tools for functional studies of glycans
WO2007071347A2 (de) Selektive markierung der glykane von immunglobulinen
Wu et al. Identification of the binding roles of terminal and internal glycan epitopes using enzymatically synthesized N-glycans containing tandem epitopes
Virgilio et al. Enzymatic synthesis of natural and 13C enriched linear poly-N-acetyllactosamines as ligands for galectin-1
Echeverria et al. Chemo-enzymatic synthesis of 13C labeled complex N-glycans as internal standards for the absolute glycan quantification by mass spectrometry
Prudden et al. A multifunctional anomeric linker for the chemoenzymatic synthesis of complex oligosaccharides
Peanne et al. Differential effects of lobe A and lobe B of the conserved oligomeric Golgi complex on the stability of β1, 4-galactosyltransferase 1 and α2, 6-sialyltransferase 1
Hirose et al. Insight into glycan diversity and evolutionary lineage based on comparative avio-N-glycomics and sialic acid analysis of 88 egg whites of galloanserae
Santra et al. Regioselective one-pot multienzyme (OPME) chemoenzymatic strategies for systematic synthesis of sialyl core 2 glycans
Both et al. Applications of a highly α2, 6-selective pseudosialidase
Villacrés et al. Strategic feeding of NS0 and CHO cell cultures to control glycan profiles and immunogenic epitopes of monoclonal antibodies
Cao et al. Systematic synthesis of bisected N-glycans and unique recognitions by glycan-binding proteins
Vos et al. Oxidative release of O-glycans under neutral conditions for analysis of glycoconjugates having base-sensitive substituents
Vliegenthart The impact of defining glycan structures

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06840990

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2