JP2009542750A - 糖が操作された抗体 - Google Patents
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Abstract
・抗体またはその誘導体または断片はフコースおよびキシロースを有さないN-グリカン構造を含む、および
・改変抗体、その誘導体または断片の少なくとも 90%、好ましくは少なくとも 95%、より好ましくは少なくとも 99%、もっとも好ましくは少なくとも 100% は、C-末端リシン残基を欠いている。
Description
抗体またはその誘導体または断片は、フコースおよびキシロースを含まないN-グリカン構造を含む、および、
調製物のADCC 活性の阻害の程度は、動物の非特異的抗体を含む少なくとも10% の血清溶液 (100% は、非希釈の血清である)において、同じ抗原に特異的な動物の非改変抗体調製物と比較して、少なくとも 10%低い、および/または、改変抗体、その誘導体または断片の少なくとも 90%、好ましくは 少なくとも 95%、より好ましくは少なくとも 99%、もっとも好ましくは少なくとも 100%は、C-末端リシン残基を欠く。
本明細書において使用される用語は、以下において別に定義しない限り、当該技術分野において一般的に使用されるものと同様である。
材料および方法
哺乳類細胞株およびコケ産生株
腫瘍細胞株 TF-1 (Kitamura、T. et al.、J Cell Physiol 140、323-334 (1989))、Ovcar-3 (Hamilton、T.C. et al.、Cancer Res 43、5379-5389 (1983))、SK-BR-3 (Trempe、G.L.、Recent Results Cancer Res 57、33-41 (1976)) は、American Type Culture Collection (Manassas、CA)から購入した。標的抗原密度(Lewis Y)は、1 ng/ml から 100 μg/mlまで段階希釈した、Lewis Y に特異的なヒト化抗体 IGN311 を用いた FACS分析によって測定した。さらなる分析のために、10 μg/ml で測定した平均蛍光強度 (MFI) 値 を記録した。
臨床グレードの IGN311 対照抗体は、FCS を含有する中空繊維産生プロセスおよびプロテインA 捕獲工程を含む古典的な下流のプロセスを用いて、SP 2.0 細胞で発現させた。
サンプルである IGN311 および IGN314 の重鎖を、Kolarich、D. & Altmann、Anal Biochem 285、64-75 (2000)で記載されたように、還元性 SDS-PAGEによって単離した。前掲の Kolarich、D. により記載されたように、クーマシー染色したバンドを切り出し、脱染し、カルバミドメチル化し、トリプシンで消化した後、ゲル断片から抽出した。抽出物を Speed Vac 濃縮器で乾燥させ、0.1 % ギ酸を含有する水で再構成した。質量分析を、標準的なエレクトロスプレーユニット、Cap-LC システム (Waters Micromass) および 10-ポートの溶媒切替えモジュール(Rheodyne)を備えた Q-TOF Ultima Global (Waters Micromass)で行った。サンプルを最初、溶媒として水を使用して Aquasil C18 プレカラム (30 x 0.32 mm、Thermo Electron)で捕獲した。分析用カラムは、溶媒切替え前は 5 % アセトニトリルで保持し、その後 2 μl/分 の流速で、5 から 50 % までのアセトニトリルの直線的勾配を適用した。全ての溶出液は 0.1 % ギ酸を含有していた。TOF 分析装置のマス・チューニング(Mass tuning)を [Glu1]-フィブリノペプチド B を使用してタンデム MS モードで行った。サンプルを MS モードで分析した。MSモードおよびタンデムMSモード間の切替えを行わなかったので、特に糖ペプチドの分析に関してはシグナルの損失が起こらなかった。データ分析を MassLynx 4.0 SP4 ソフトウェア (Waters Micromass)で行った。
精製された発現産物の完全性、分子量および生じうる分解産物を、Novex 電気泳動システム (Invitrogen)を用いて、製造者の説明書に従って NuPAGE 4-12% ビス-トリス ゲルで SDS-PAGE を行うことにより分析した。ゲルは銀染色した (SilverQuest; Invitrogen)。純度、完全性および生じうる分解に関して抗体を分析するために、サイズ排除 HPLCを行った。Dionex HPLC システムで ZORBAX G-250 (Agilent-technologies) カラムを用いてサンプルを分析した。生じうる凝集体を崩壊させるためおよび生じうる沈殿を阻害するため、ランニングバッファーとして 10% アセトニトリル (CH3CN)を含む 220 mM NaH2PO4 (pH=7.0) を使用した(流速 1 ml/分)。溶出液を 214 nm および 280 nm の波長で、オンラインでモニターした。ポリクローナルヒト IgG (Pentaglobin(登録商標)、Biotest)で標準化し、ピークを積分して産物濃度を算出した。
特異的なサンドウィッチ ELISA において、モノクローナル 抗-イディオタイプ 抗体 MMA383 (Perkins、M. et al., Pharm Res 17、1110-1117 (2000))でコートされたマイクロタイターウェル内で、段階希釈 (100 pg から 1 μg/ml まで)された抗体サンプルをインキュベートすることにより発現産物の結合活性を分析した。5% FCSでのブロッキングおよび洗浄の後、ヒト IgG、IgM および IgA (Zymed、CA)に特異的なヤギ-免疫グロブリン-ペルオキシダーゼ接合体と反応させて o-フェニレンジアミン/過酸化水素 で染色することにより、結合した発現産物を測定した。吸光度 (492nm) を抗体濃度 (ng/ml) の対数に対してプロットし、GraphPad Prism 4 ソフトウェア を使用してシグモイド4パラメーターフィットにより適合させた。EC50 値を算出し、定量のために使用した。
補体に媒介される細胞溶解活性を、標的として Lewis Y-陽性 SK-BR-3 乳癌細胞株を用いた 51Cr-放出アッセイで3回試験した。標的細胞を 100μCi の 51Cr と共に1時間インキュベートし、培地で2回洗浄した後、分析予定のサンプルの段階希釈(72 ng から 75 μg/ml)およびボランティアドナーの補体が活性化した血清とともにウェルあたり 20 x 103 細胞の密度で 96-ウェル マイクロプレートに播種した。プレートをCO2-インキュベーター内で37℃で1時間インキュベートした。上清を収集し、放出された 51Cr (“Cs”)を計数した。代表的なサンプルを培地のみおよび洗浄剤 (SDS)と共にそれぞれインキュベーションした後、自発的な放出 (“Sr”) および 最大放出 (“Mr”) の値を測定した。補体に媒介される細胞毒性を、100 x (Cs-Sr) / (Mr-Sr) の式によって細胞溶解の百分率として算出し、抗体濃度 (ng/ml)の対数に対してプロットし、GraphPad Prism 4 ソフトウェア を使用してシグモイド4パラメーターフィットにより適合させた。EC50 値を算出し、定量のために使用した。負の溶解データを示したサンプルは 0 % に設定した。
ADCC を、標的細胞として様々な Lewis Y-陽性 癌細胞株(SK-BR-3、TF-1、Kato-III および Ovcar 3)を用いた51Cr 放出アッセイで3回試験した。標的細胞を 100μCi の 51Crと共に1時間インキュベートし、洗浄し、ウェルあたり 25 x 103 細胞 の密度で 96-ウェル マイクロプレートに播種した。エフェクター細胞 (健康なボランティアドナーからの末梢血単核球) を新鮮に調製し、分析予定の抗体サンプルの段階希釈 (100 pg から 10 μg/ml)とともに、E:T(エフェクター細胞:標的細胞)が 40:1 の比になるように標的細胞に添加した。CO2-インキュベーター内で37℃で16時間インキュベーションした後、細胞上清を収集し、放出された 51Cr (“Cs”)を計数した。代表的なサンプルを培地のみおよび洗浄剤 (SDS)と共にそれぞれインキュベーションした後、自発的な放出 (“Sr”) および 最大放出 (“Mr”) の値を測定した。細胞毒性を 100 x (Cs-Sr) / (Mr-Sr) の式によって、細胞溶解の百分率として算出した。細胞毒性の百分率を抗体濃度 (ng/ml)の対数に対してプロットし、GraphPad Prism 4 ソフトウェア を使用してシグモイド4パラメーターフィットにより適合させた。EC50 値を算出し、定量のために使用した。
CD16 (Fc γRIIIa)-158V/F 遺伝子多型を、Koene、H.R. et al.、Blood 90、1109-1114 (1997)によって記載された方法からわずかに改変された PCR に基づくアレル特異的な制限分析アッセイによって分析した。
コケ Δxyl-t/Δfuc-t プロトプラストを、重鎖および軽鎖を発現するコンストラクト (p127-IGN-HC、p127-IGN-LC)で一過性に形質転換し、培養上清のプールにおける IgG1 力価を抗-イディオタイプサンドウィッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって毎週評価した。標準的な培養条件の下では、IgG1 力価は比較的低い(0.1-0.5 μg/ml)ことが判明した。しかし、最適化された培地条件下では IGN314 の分泌は3ヶ月以上の間、有意に増加した。その結果全体として、5 週間のサンプル回収の後すでに得られていた2.0 mgと合わせて、14 週の間に全部で 167の 形質転換の実施によって 3.8 mg の IGN314 が得られた(全体平均: 6.1 μg/ml)。銀染色した粗培養上清のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲルには - コケの培養においては一般的に混入タンパク質によるバックグラウンドが低いうえ - タンパク分解によりプロセシングされたかもしくは正常に機能しない重鎖または軽鎖またはより小さな抗体断片に相当する追加のバンドは全く見られず、高い割合での完全な IgG1 のアセンブリーが証明された。培養上清をプールし、プロテイン-A による精製を行った後、その抗原への結合特異性を試験するため、精製された IGN314 を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE)、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー (HPLC)および抗-イディオタイプサンドウィッチ ELISA により分析した。結果を図 3 に示し、IgG1 アセンブリー、純度および標的抗原に対する親和性に関してIGN314 の完全性が証明された。さらに重鎖および軽鎖のペプチドマッピングを行い、どちらの場合においても植物のシグナルペプチドが正確に切断され、IGN311 および IGN314 のアミノ酸一次配列が同一である - 両方の重鎖におけるC-末端リシンの除去を含む - ことを確認した。
糖が操作された IGN314 の溶解能力を IGN311 の溶解能力と比較し、癌免疫療法において起こり得る生物学的多様性の側面を包含させることを試みた。この多様性は標的およびエフェクター細胞の両方に関係する。個々の腫瘍標的細胞に発現する標的抗原密度は異なり、患者は 158番目のアミノ酸に影響を及ぼす遺伝的多型 (CD16158V/F)に起因して、ナチュラルキラー (NK) エフェクター細胞上に発現する CD16 受容体のアレルの違いに関連した IgG 親和性の変動を示すからである。それ故、一方で膜性の Lewis Y 抗原を異なる密度で発現する3つの異なる腫瘍細胞株 (Ovcar-3、SK-BR-3 および TF-1)を分析した。ADCC 実験に先立ち、蛍光補助細胞分取 (FACS)を用いてこれら標的細胞株を Lewis Y 密度について分析した。Ovcar-3 が最も高い抗原密度を示し、SK-BR-3 および TF-1 がそれに次いだ(平均蛍光強度の値は 表 1 を参照)。他方では、規定されたエフェクター細胞の調製物を使用するため、末梢血単核球細胞 (PBMC) ドナーの CD16158 多型を分析したところ、約 50% (10人のうち5人) が高親和性 CD16158V/V 表現型を示すことが判明した (示さず)。両方の表現型すなわち158V/V および 158F/F のドナーの末梢血単核球の調製物を、全ての ADCC アッセイのために調製した。測定に先立ち、全てのサンプルにおいてエンドトキシンが存在しないことを確認した。同時に精製された偽形質転換の培養上清も調査したところ、バックグラウンドと異なるいかなる溶解活性も示さなかった。ADCC 実験の結果 (算出された 50% 有効濃度 (EC50) 値) を 表 1 に要約する。IGN314 について測定された EC50 値は、IGN311 のEC50値と比較して有意に低かった。これは IGN314 が、親抗体 IGN311 と比較して 7 から 40 倍増強された、細胞傷害に媒介される溶解能力を有することを意味する。さらに、両方の抗体について、標的細胞上の Lewis Y 密度と EC50 濃度との間に逆相関が認められた。Lewis Y 標的抗原密度の低い細胞株(TF-1)と比較すると、標的抗原密度が上昇している細胞株(Ovcar-3) は、同じ溶解を誘導するためにかなり低い抗体濃度しか要求しなかった。抗原密度が中程度の細胞株(SK-BR-3)について測定されたEC50 値は、予想通り、高抗原密度および低抗原密度の細胞株について算出された値の間に分布した。
過剰な内在性免疫グロブリンGによる抗体依存性細胞傷害の阻害を補うため、天然血清において高濃度の治療用 IgG1 抗体 が必要とされている。正常血清の IgG レベルは、NK 細胞上に存在する低親和性 IgG 受容体 (CD16) に対する、治療用 IgG1 抗体の結合を阻止している。CD64 と合わせて、これら2つの Fcγ 受容体が、ADCC を媒介する主な細胞受容体である。
血清由来の、および組換えにより産生された IgG1 分子は、その C-末端 Lys-残基の出現に関して微少な不均一性を示す。保存された C-末端 Lys-残基の (部分的な) 切断は、細胞内において塩基性カルボキシペプチダーゼの作用によって触媒される翻訳後の現象である(Lazar et al.、Rapid Communications in Mass Spectrometry (18)、3、239 - 244、2004)。
Claims (33)
- 抗原に対して特異的な、動物の改変抗体またはその誘導体または断片を含む、以下を特徴とする抗体調製物:
抗体またはその誘導体または断片が、フコースおよびキシロースを含まないN-グリカン構造を含む、および
改変抗体、その誘導体または断片の少なくとも 90%、好ましくは少なくとも 95%、より好ましくは少なくとも 99%、もっとも好ましくは少なくとも 100% がC-末端リシン残基を欠く。 - 抗体またはその誘導体または断片のN-グリカン構造がガラクトースも含まないことを特徴とする、請求項1に記載の抗体調製物。
- 非改変抗体調製物が、抗原に対し、改変抗体またはその誘導体または断片の調製物と同じ親和性を有することを特徴とする、請求項1または2に記載の抗体調製物。
- 動物の、好ましくは哺乳類の非特異的抗体を含む、少なくとも10% の血清溶液において、調製物のADCC 活性の阻害の程度が、同じ抗原に対して特異的な動物の非改変抗体調製物と比較して、少なくとも 10% 低いことを特徴とする、請求項1ないし3いずれかに記載の抗体調製物。
- N-グリカン構造が、GlcNAc2Man3、GlcNAc2Man3GlcNAc または GlcNAc2Man3GlcNAc2 から選択されることを特徴とする、請求項1ないし4いずれかに記載の抗体調製物。
- ADCC エフェクター機能が、好ましくは同じ抗原に対して特異的な、動物の非改変抗体調製物と比較して、少なくとも 5倍、好ましくは少なくとも 10倍、特に好ましくは少なくとも 20倍、より好ましくは少なくとも 30倍、よりいっそう好ましくは少なくとも 40倍、もっとも好ましくは少なくとも 50倍上昇していることを特徴とする、請求項1ないし5いずれかに記載の抗体調製物。
- 抗体またはその誘導体または断片の 50% 未満、好ましくは 30% 未満、より好ましくは 10% 未満がN-グリカン構造を欠くことを特徴とする、請求項1ないし6いずれかに記載の抗体調製物。
- 動物が哺乳類、好ましくはヒトまたはラクダまたはマウスであることを特徴とする、請求項1ないし7いずれかに記載の抗体調製物。
- 動物の非特異的抗体を含む、少なくとも 10%、好ましくは少なくとも 40%の血清溶液において、調製物のADCC活性の阻害の程度が、同じ抗原に対して特異的な動物の非改変抗体調製物と比較して、少なくとも 15%、好ましくは少なくとも 20%低いことを特徴とする、請求項1ないし8いずれかに記載の抗体調製物。
- 非特異的抗体溶液において、調製物のADCC 活性の阻害の程度が、少なくとも 20%、好ましくは少なくとも 30%低いことを特徴とする、請求項1ないし9いずれかに記載の抗体調製物。
- 動物の改変抗体またはその誘導体または断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする、請求項1ないし11いずれかに記載の抗体調製物。
- CDC 活性が、同じ抗原に対して特異的な非改変抗体調製物と比較して、少なくとも 10%低下していることを特徴とする、請求項1ないし11いずれかに記載の抗体調製物。
- 調製物が IgG 抗体またはその断片または誘導体であることを特徴とする、請求項1ないし12いずれかに記載の抗体調製物。
- 調製物がモノクローナル抗体、その断片または誘導体であることを特徴とする、請求項1ないし13いずれかに記載の抗体調製物。
- 動物の非特異的抗体を含む、少なくとも 10%、好ましくは少なくとも 40%の血清溶液において、改変抗体、その誘導体または断片のCD16158 F/F に対する結合の阻害の程度が、同じ抗原に対して特異的な動物の非改変抗体調製物と比較して、少なくとも 10% 低いことを特徴とする、請求項1ないし14いずれかに記載の抗体調製物。
- 動物の非特異的抗体を含む、少なくとも 10%、好ましくは少なくとも 40%の血清溶液において、いずれかの CD16158 遺伝子型のエフェクター細胞によって媒介される、改変抗体、その誘導体または断片の標的細胞の溶解の阻害の程度が、同じ抗原に対して特異的な動物の非改変抗体調製物と比較して、少なくとも 10% 低いことを特徴とする、請求項1ないし15いずれかに記載の抗体調製物。
- β-1,2-キシロシルトランスフェラーゼおよびα-1,3-フコシルトランスフェラーゼ活性を欠損した細胞、好ましくは植物細胞における、抗体、その断片または誘導体をコードする核酸の発現を介して得られ得る抗体調製物。
- 細胞がガラクトシルトランスフェラーゼを欠損していることを特徴とする、請求項17に記載の抗体調製物。
- 細胞が GnTIII 活性を有するよう改変されていることを特徴とする、請求項17または18記載の抗体調製物。
- 調製物の改変抗体、その誘導体または断片が、爬虫類、好ましくはワニのものであることを特徴とする、請求項1ないし19いずれかに記載の抗体調製物。
- 医薬担体または希釈剤中に請求項1ないし20いずれかに記載の抗体調製物を含有する医薬調製物。
- 患者、好ましくはヒトまたは哺乳類における、予防および/または治療処置のための、腫瘍細胞の増殖をそれぞれ低減または阻害するための薬剤を調製するための、請求項1ないし21いずれかに記載の抗体に基づく調製物の使用。
- 腫瘍細胞の増殖の低減が、同じ抗原に対して特異的な非改変抗体の使用と比較して少なくとも 5%、好ましくは少なくとも 10%、より好ましくは少なくとも 20%、さらにより好ましくは 30%を超えて、もっとも好ましくは 50%を超えて上昇する、請求項22に記載の調製物の使用。
- 固形癌の処置のための医薬を製造するための、請求項1ないし21いずれかに記載の調製物の使用。
- 上皮起源の固形癌の処置のための、請求項24に記載の使用。
- 微小残存病変の処置のための、請求項1ないし21いずれかに記載の調製物の使用。
- 受動免疫療法のための、請求項22ないし26いずれかに記載の使用。
- 抗体または抗体混合物が、少なくとも 1 mg/用量の投薬量で、好ましくは少なくとも 10mg/用量の投薬量で、より好ましくは少なくとも 50mg/用量の投薬量で使用される、請求項22ないし27いずれかに記載の使用。
- 対象の、好ましくはヒトのサンプルを提供すること、およびサンプルにおける抗原への抗体の結合現象を検出することを含むインビトロスクリーニング方法のための、請求項1ないし21いずれかに記載の抗体に基づく調製物の使用。
- 抗体、断片または誘導体が、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性およびα1,3-フコシルトランスフェラーゼ活性を欠く細胞、好ましくは植物細胞において発現されることを特徴とする、請求項1ないし20いずれかに記載の抗体調製物の製造方法。
- 細胞が、1,4 ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を欠くことを特徴とする、請求項30に記載の方法。
- 抗体、断片または誘導体を発現させるために使用される、抗体、断片または誘導体をコードする DNA が、C-末端のリシンのコドンを欠くことを特徴とする、請求項30または31に記載の方法。
- 好ましくはカルボキシペプチダーゼによって、またはインビボでの適切な細胞培養条件の選択、好ましくは動物細胞発現系の選択によって、抗体、断片または誘導体の C-末端リシンが取り除かれることを特徴とする、請求項30または31に記載の方法。
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