JPH02163096A - モノクローナル抗体の不均質性を減少させる方法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、抗体産生細胞から分泌された抗体の不均質性
を減少させる方法、さらに詳しくは、抗体重鎖の一方ま
たは両方のカルボキシ末端アミノ酸またはアミノ酸群を
変化させることを特徴とする方法に関する。

［従来の技術］ ハイブリドーマ細胞からのモノクローナル抗体の大量生
産が、種々の疾病状態の診断、治療、および予後におい
て革命をもたらした。また、モノクローナル抗体は妊娠
などの様々な自然の状態の段階を調べるのにも有用であ
る。しかし、多数のハイブリドーマ由来の抗体が不均質
な形態を示し、これが産生菌株からの高収率を達成する
ために必要とされる精製および単離工程を太き（妨げる
ことがわかった。カチオン交換クロマトグラフィーは、
インビトロで増殖させた細胞から分泌される抗体には少
な（とも３種の別個の不均質な形態が存在することを示
した。これらの形態はその相対的な量を変えて見られる
こともある。これら不均質な形態は腹水液由来の抗体で
は同程度には観察されないが、腹水液からの大量の抗体
の製造は産業用には極めて面倒なものであり、高価なも
のになる。

この不均質性の生化学的な根拠は、抗体重鎖のカルボキ
シ末端に結合している余分のアミノ酸または酸群の存在
に起因する。抗体遺伝子のＤＮＡ配列から導かれる推定
のアミノ酸配列は余分のアミノ酸を含んでいるので、通
常、末端のアミノ酸は内部でのプロセッシングまたは細
胞からの抗体の分泌の間に除去されるという可能性が最
も高い。

３種の不均質な形態のうちの１つは、重鎖のどちらにも
余分の末端アミノ酸を含んでいない抗体である。３種の
別個の不均質な形態のうちの第２のものは重鎖の一方に
余分のアミノ酸を含んでおり、第３の形態は重鎖の両方
に余分のアミノ酸を含んでいる。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、あらゆるアイソタイプの不均質抗体の重鎖か
ら余分のアミノ酸を特異的に切断し、それによって３種
の形態すべてを１種類の実質的に純粋な均質混合物に変
換する方法を包含する。モノクローナル抗体法の開発・
展開は、大量の実質的に均質な抗体の利用性に依存して
いる。この開発は、種々の不均質な形態の分泌抗体を精
製し、その特徴を調べることが簡単にできないことから
幾分遅れていた。本発明は、はとんどの不均質な抗体を
精製前に１種類の実質的に均質な形態に変換することを
可能にするものであり、この点で有用であり、特に重要
である。この変換によって、−層明確な生化学的特徴を
備えた一層高い収率の抗体、並びに不均質な形態の抗体
に伴われる精製不純物の減少が導かれる。さらに、高度
に精製された単一形態の抗体の所有は、後に行う修飾、
例えば免疫コンジニゲーションあるいは固定化反応など
の再現性および一貫性を大きく増加させる。

本明細書中に開示した発明のために、以下の用語を定義
する。

抗体産生細胞：インビトロまたはインビボのどちらかで
抗体を産生ずるあらゆる細胞、形質転換された細胞、ま
たはハイプリドーマ。

腹水液：腹水腫瘍に感染させた動物の腹腔から抜き取っ
た液体。

ＣＰ；カルボキシペプチダーゼ。

ＣＰＩＰ比：カルボキシペプチダーゼ（酵素単位）／免
疫グロブリンタンパク質（肩９）の比。

培養液：抗体を含むあらゆる液体であって、培養液から
直接取った液体、培養液から取ってその後に濃縮した液
体、または予め単離もしくは精製した抗体を含む液体を
包含するが、これらに限定はされない。

Ｇニゲリシン残基。

不均質性；分泌された抗体が、例えば、抗体重鎖の一方
または両方のカルボキシ末端の余分のアミノ酸または酸
酢などのように（これに限定はされない）、種々の別個
の生化学的形態を有している現象である。

不均質な抗体：例えば、抗体重鎖の一方または両方のカ
ルボキシ末端の余分のアミノ酸または酸酢などのように
、種々の別個の生化学的形態を示す抗体。

ハイプリドーマ：モノクローナル抗体を分泌する細胞ま
たはセルライン；ここで、該セルラインは適切に免疫さ
れた動物由来の肺細胞とミエローマ細胞の融合によって
得られたものである。

Ｋ：リジン残基。

Ｐニブロリン残基。

一次均質形態：抗体重鎖のカルボキシ末端が余分のアミ
ノ酸を含んでいない形態。

組換えＤＮＡクローニングベクター：ｌまたはそれ以上
の別のＤＮＡセグメントを付加したか、または付加する
ことができるＤＮＡ分子を含有するあらゆる自律的に複
製するか、または組み込まれる媒体であって、プラスミ
ドを含むがこれに限定はされない。

トランスフェクション：ファージＤＮＡｆｎ子による受
容宿主細胞へのＤＮＡの導入。

形質転換体：形質転換を受けた受容宿主細胞。

形質転換：遺伝子型を変化させ、受容宿主細胞が変化す
ることになる受容宿主細胞へのＤＮＡの導入。

第１図は、モノクローナル抗体ＣＥＭ２３１の不均質な
形態間の相違を図式的に示す模式図である。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、抗体産生細胞から分泌された抗体の不均質性
を減少させる方法であって、抗体重鎖の一方または両方
のカルボキシ末端アミノ酸または酸酢を変化させること
を特徴とする方法を提供するものである。本発明は、抗
体重鎖の一方または両方のカルボキシ末端からのアミノ
酸またはアミノ酸群の選択的な除去によって最もよ（例
示的に説明される。この所望の結果を得るための方法の
１つは、分泌された抗体を含有している培養液のｐＨを
、該抗体の不均質性を減少させるに十分なｐＨまで低下
させ、次いで、該抗体の不均質性を減少させるに十分な
時間および温度で該培養液をインキュベートすることか
らなる。通常、ｐＨは〜３．０から〜５．５の範囲内ま
で低下させてよいが、ｐＨが〜３．５から〜４．５の範
囲内のときに一層効率的に反応か起こる。反応は、ｐＨ
が〜４Ｏから〜４．５の範囲内であるときにさらに効率
的に起こり、多くの抗体の不均質性を減少させるに好ま
しいｐＨは〜４．０である。

また、インキュベート温度Ｌ度および時間も、不均質抗
体の重鎖からのカルボキシ末端アミノ酸またはアミノ酸
群の除去速度に影ワを及ぼす。インキュベート時間は数
秒から多数日までのいずれであってもよいか、〜１時間
から〜７２時間の範囲内で反応か起こるようにするのが
好ましい。多くの場合、〜４時間から〜２４時間の範囲
で反応させるのかさらに好ましい。しかし、抗体の生化
学的性質および反応の他のパラメーターに依存するが、
インキュベートは〜２４時間だけで〜９５％完結するこ
ともあるし、〜４８時間から〜７２時間程度かかること
もある。インキュベート温度は広い範囲にまたがるか、
〜２℃から〜３７℃の範囲で最もよく反応が起こる。ま
た、反応は〜４℃から〜３７℃の範囲、さらに〜４℃か
ら〜３０℃の範囲で都合よく起こる。多くの抗体にとっ
て好ましい反応温度は〜４℃から〜２５℃の範囲であり
、 最らＱ子ましく冒、′Ｉ！度は〜２５℃である。

分泌抗体の不均質性を減少させる別の方法は、抗体の不
均質性を減少させるに十分な量で腹水液を分泌抗体含有
の培養液に加え、次いで、該抗体の不均質性を減少させ
るに十分な時間、温度、およびｐＨで該培養液をインキ
ュベートすることからなる。広範囲の電の腹水液か反応
を起こさしめるか、腹水液と培養液が〜２：ｌから〜１
：２０の量であるように腹水液を加えた混合物を用いる
のがより効率的である。反応の速度および完結性のため
には、腹水液を〜１．１から〜１．１０の量で加えるの
かよく、腹水液を〜１・１から〜１２の里で加えるのが
さらによい。好ましい反応液は〜１：１の容量の腹水液
と培養液を含んでいる。

インキュベート時間、インキュベート温度、および培養
液のｐＨも、上記の腹水法の連関および効率に影響を及
ぼす。好ましいインキュベート時間は数秒から多数日ま
でにわたるが、時間が〜１時間から〜７２時間の範囲内
であるときに反応は一層効率的になる。インキュベート
時間が〜１６時間から〜７２時間の範囲であるときに反
応か一層好都合になることが多く、〜１６時間から〜４
８時間の範囲であるときにさらに都合のよいものとなる
。最も好ましい反応時間は〜１６時間である。反応温度
はほとんと限定のない範囲にわたるが、温度が〜２℃か
ら〜４２℃の範囲内であるときに一層効率的なものにな
る。温度が〜２℃から〜３７℃の範囲内であるときに反
応か好ましいものとなり、〜２６℃から〜３７℃である
ときにさらに好ましいものとなる。最も好ましい反応温
度は〜３７℃である。培養液のｐＨも反応速度を早くし
たり、遅くしたりすることができ、また、抗体の解離を
妨げるのに重要である。培養液のｐＨは広い範囲にわた
って変化しうるが、ｐＨが〜４゜０から〜９．０の範囲
内であるときに効率がよい。

ｐＨカ〜７．５から〜８．５の範囲内であるときに反応
は良好に進行し、ｐＨが〜７．５から〜８．０の範囲内
であるときにはさらによい。最も好ましい培養液のｐＨ
は〜７．５であり、従って、低ｐＨ法とは対照的に、こ
の腹水液法は生理学的なｐＨで実施されてよい。

分泌抗体の不均質性を減少させるさらに別の方法は、抗
体の不均質性を減少させるに十分なＣＰＩＰ比でカルボ
キシペプチダーゼを分泌抗体含有の培養液に加え、次い
で、該抗体の不均質性を減少させるに十分な時間、温度
、およびｐＨで該培養液をインキュベートすることから
なる。広範囲のＣＰ　Ｉ　Ｐ比が反応を起こさしめるで
あろうか、〜０．０１から〜１０．０の範囲内のＣＰＩ
Ｐ比を用いると一層効率的である。〜０．２から〜８０
の範囲のＣＰＩＰ比で反応させるのかよく、〜０２から
〜１．０の範囲のＣＰＩＰ比を用いるのがもっとよい。

通常、〜０．４のＣＰＩＰ比か最も好ましいが、酵素量
か高（なるほどさらに高い速度での反応を引き起こすで
あろうことは当業者の認めるところであろう。また、多
数の別タイプのカルボキシペプチダーゼ、例えばＣｐＡ
、ＣｐＢ、ＣｐＣ，ＣｐＧ、ＣｐＰ、ＣｐＷ、ｃｐｙお
よびその他か当分野でよく知られており、これらすべて
を本発明の方法において用いることができることも当業
者の認めるところであろう。さらに、カルホキジペプチ
ダーゼの単位は規格化されており、当分野では周知であ
るので、本発明の実施は特定のカルボキシペプチダーゼ
供給元によって定義されている単位に限定されるもので
はない。また、当業者なら、酵素を固体支持体に固定化
することにより精製中の酵素の除去を避けることができ
ることも認識しているであろう。

インキュベート時間、インキュベート温度、および培養
液のｐＨも、上記のカルホキジペプチダーゼ法の速度お
よび効率に影響を及ぼす。適切なインキュベート時間は
数秒から数日までにわたるか、この時間が〜１時間から
〜４８時間の範囲内であるときに反応が一層効率的にな
る。インキュベート時間が〜１時間から〜２４時間の範
囲内であるときに反応がさらに好ましいものになること
が多く、〜１時間から〜１６時間の範囲であるときにさ
らに良好なものとなる。反応は、インキュベート時間が
〜５時間から〜１６時間の範囲内であるときになお一層
好ましいものとなり、〜５時間であるときに最も好まし
い。反応温度はほとんど限定のない範囲にわたるか、温
度が〜１℃から〜４２℃の範囲内であるときに好ましい
ものとなる。

この反応は、温度が〜１５℃から〜３７℃の範囲内であ
るときに一層好ましいものとなり、〜２０℃から〜３０
℃の範囲内であるときになお一層好ましいものとなる。

最も好ましい反応温度は〜２３℃である。また、培養液
のｐＦ（も反応速度を上げたり下げたりすることかでき
、広範囲に変化しうるか、ｐＨが〜６．０から〜９．０
の範囲内であるときに効率的なものとなる。この反応は
、 ｐＨが〜７．０から〜８．０の範囲内であるときに良好
に進行し、ｐＨが〜７．５から〜８．０の範囲内である
ときになお一層良好なものとなる。培養液の最も好まし
いｐＨは〜７．５である。

培養液のｐＨ、インキュベート時間、インキュベート温
度、腹水液比、あるいはＣＰＩＰ比を変えることによっ
て、上記方法のすべてをあらゆる免疫グロブリン精製法
の要求に適合させることかできることは当業者の認める
ところであろう。不均質性を減少させる反応に続き、当
分野で周知の方法を用いて培養液から抗体を不均質性が
減少した形態で単離することができる。当業者なら、上
記の方法を用いて、既に精製が為された抗体の不均質性
を減少させることもできることを容易に認めるであろう
。

実質的に同じ結果が、ペプチドからカルボキシ末端残基
を除去する多種の他の化学的な処理によって得られるこ
ともある。例えば、ある選ばれたケースでは、ヒドラジ
ツリシス、トリチウム化およびヒダントイン生成、これ
に続くアセトヒドロキサム酸による処理が有用となろう
。実質的には、免疫グロブリンのフラグメントのカルボ
キシ末端からペプチドまたはペプチド群を除去するあら
ゆる化学反応が、本発明の範囲内に含まれることになろ
う。特に、カルボキシ末端からジペプチド類を除去する
ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ類が本方法を実施
する際に有用となるであろうが、リジジ残基の内側にあ
るカルボキシ末端領域において特冗的に切断することが
可能なその他のあらゆる酵し同様であろう。

本発明実施のさらに別の方法は、免疫グロブリン重鎖を
コードしている遺伝子から、カルボキシ末端のリジンま
たはりシン群をコードしているコドンまたはコドン詳を
選択的に除去することからなる。当業者なら、抗体をコ
ードしているＤＮＡ配列か推定されると、組換えＤＮＡ
法を用いてカルボキシ末端ペプチドをコードしているコ
ドンまたはコドン群を除去することは技術者の問題であ
ることを認識している。トランスフェクションまたは形
質転換か行われた細胞内でこの先端を切除した遺伝子か
発現すると、その遺伝子産物は、野生型の抗体路とはカ
ルボキシ末端ペプチドの除去だけが異なっている抗体路
で構成されているであろう。別法によれば、組換えＤＮ
Ａ法を用いて別の残基をコードしているコドンをポリペ
プチドのカルボキシ末端に付加することかでき、これに
よって、カルホキ／末端の量を変え、抗体群の不均質性
を減少させることができる。従って、化学的あるいは生
物学的な操作のいずれであっても、抗体のカルボキシ末
端を変えることによって抗体群の不均質性を減少させる
あらゆる操作が本発明の範囲内に含まれる。

本発明の好ましい態様は、モノクローナル抗体ＣＥＭ２
３１の変換によって最もよく例示される。

モノクローナル抗体ＣＥＭ２３１は、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション［ＡＴＣＣ。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ、　　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　
Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５
２］に１９８８年１月７日に寄託され、その永久保存培
養物コレクションの一部となっている菌株であるハイブ
リドーマＣＥＭ２３１．６．７から分泌される。この株
は取得番号ＡＴＣＣＨＢ９６２０のもと、抗体の供給源
および貯蔵受容体としてだれでも入手することができる
。

血清を含まない培地でハイブリドーマを増殖させた後、
細胞を含まない培養液を４Ｏ−１１５Ｘに濃縮し、この
液のｐＨをＨ，ＰＯ，による滴定によってｐＨ４，０ま
で低下させた。液を２５℃で２４時間インキュベートし
た後には、培養液中の抗体の９５％以上が一次均質形態
に変換されていた。

カチオン交換クロマトグラフィーから明らかなように、
この−次均質形態は、抗体鎖のカルボキシ末端が外側の
アミノ酸を含んでいない形態である。

さらに、ある場合には、反応混合物にＥＤＴＡ（１１０
ｍＭ）などのキレート化試薬を加えることによって本変
換法の効率が向上することもある。

また、腹水液法を用いて不均質なＣＥＭ２３１を一次均
質形態に変換することもできる。濃縮したＣＥＭ２３１
培養液を腹水液と１：１容量比でａ合し、次いで３７℃
、ｐＨ７，４でインキュベートした。この反応は、１６
時間でほぼ等モル濃度の不均質な抗体を８０％以上の一
次均質抗体に変換した。ある場合には、反応混合物にＥ
ＤＴＡ（１１０ｍＭ）などのキレート化試薬を加えるこ
とによって、この変換法の効率を向上させることもでき
る。あらゆる腹水液を本変換法に用いることができるが
、変換を受ける抗体とは実質的に異なる生化学的性質を
有する抗体を含有しているものを用いるのが好ましい。

即ち、この別の性質は、精製工程中における腹水産生さ
れた抗体と変換された抗体の交叉汚染を防止するのに有
用である。

さらに、カルボキシペプチダーゼ法を用いて不均質なＣ
ＥＭ２３１を一次均質形態に変換することもできる。血
清不含の培地でハイブリドーマを増殖させた後、細胞不
含の培養液を７０Ｘに濃縮し、次いでカルホキジペプチ
ダーゼＢをこの培養液にＣＰＩＰ比３．０で加えた。こ
の液を２３℃で５時間インキュベートした後には培養液
中の抗体の９５％以上が一次均質形態に変換された。

モノクローナル抗体ＣＥＭ２３１の変換に加え、上記方
法は、ハイブリドーマセルラインおよび形質転換または
トランスフェクションを受けたセルラインの両者由来の
多種多様の抗体の不均質性を減少させるために用いられ
る。第１表は、試験した種々抗体の代表的な試料と得ら
れた結果を示すものである。

第１表 抗体 ＥＶ１２４ Ｃ１０５４ ５ＥＯ３１ ５ＥＯ３１ ＦＵ２１２ ２１１８０６ｇ ＥＶ１２４ Ｃ１０５４ １１ＣＵＯ６１ ＥＶ１２４ Ｃ１０５４ ０２Ｍ２３１ キメラ性　　　　ＣＰ ＣＥＭ２３１／ＣｌｌＡ２５５ 変換の結果 方法 り１１４ ｐＨ４ ｐＨ４（低濃度） ｐＨ４（高濃度） ｐＨ４ ｐＨ１４ 腹水 腹水 腹水 ＣＰ ＣＰ 結果 〉８０％ピーク（４℃，４−２４時間）６０％ピーク（
４°０１４３時間） 〉８０％ピーク（４℃１４８時間） 〉８０％ピーク（４℃１１４時間） 〉８０％ピーク（４℃１５６時間） 〉８０％ピーク（４℃１７２時間） 〉８０％ピーク（３７°０１１６時間）６９％ビーク（
３７℃、２４時間） 〉８０％ピーク（３７°０１１７時間）〉８０％ピーク
（２３℃，５時間） 〉８０％ピーク（２２℃、１６時間） 〉８０％ピーク（２２℃１１６時間） 当業者なら、本発明の方法がハイブリドーマ以外の細胞
から産生される抗体の不均質性を減少させるのにも有用
であることを容易に認めるであろう。特に、モノクロー
ナル抗体をコードしている遺伝子を種々の組換えＤＮＡ
クローニングベクターに連結することができ、次いで細
菌あるいは酵母を含む適切な宿主細胞に導入するか、ま
たはトランスフェクションすることができる。次いで、
適切な条件のもとでは、形質転換されたか、またはトラ
ンスフェクションされた細胞はモノクローナル抗体を産
生ずるか、または分泌するであろう。

また、ある抽出来の可変領域とこれに結合した第２の種
由来の不変領域を含有するキメラ抗体も構築することが
でき、組換え法によって形質転換あるいはトランスフェ
クションされた宿主細胞で発現させることができる。ブ
ーリアン［Ｂｏｕｌｉａｎｎｅｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔ
ｕｒｅ　３１２　：　６４３−６４６（１９８４）］ら
を参照（この文献は参考のために挙げた）。さらに、本
発明の方法はヒト抗体あるいは二官能性抗体の不均質性
を減少させるのにも有用である。また、本発明の方法を
用いて血液、ｆｉｌｌ清またはその他の体液から単離し
た抗体の不均質性を減少させることらできる。

さらに、多数の別の化合物を用いて培養液のｐＨを低下
させうること、およびそのような等価なものすべてが本
発明の範囲内に入ることも当業者の認めるところであろ
う。腹水法を用いるときには、抗体培養１夜と腹水液の
多くの異なる比率を用いてよく、そのような等価なもの
すべてが本発明の範囲内に入る。また、抗体の不均質性
を減少させるためにカルポキンペプチターセ法を用いる
ときには、多くのＣＰＩＰ比を用いることかでき、この
すべてか本発明の範囲内に入る。さらに、最適の変換に
必要なインキュベートの時間および温度、並びに培養液
のｐＨは、使用する抗体の正確な生化学的性質によって
変わるであろう。また、変換工程を始める前に培養液を
？農縮するのか好都合であることもあるか、本発明の新
規方法は濃縮および希釈試料の両方で行いうるので、本
発明は試料の濃縮によって限定されるものではない。

ハイブリドーマおよびその他の抗体分泌セルラインをフ
ラスコ中で、あるいは持続的に流れる発酵タンク中で増
殖させてよい。血清不含の培地を用いることができ、培
養液のｐ）（を約６．５〜８５の範囲内に維持し、温度
を３０℃〜４０℃の範囲内に維持する。抗体分泌セルラ
インのそれぞれはそれ独自の最適条件を必要とするか、
このような条件は当技術者により容易に見つけられるは
ずである。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。試薬ある
いは装置の供給元は単に利便のために挙げたものであっ
て、本発明を限定するものではない。本発明実施につい
ての説明および実際の方法は適当なところに記載した。

実施例１　ハイブリドーマＣＥＭ２３１．６．７の培養 モノクローナル抗体ＣＥＭ２３１を分泌するハイブリド
ーマＯＥＭ２３１．６．７をアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。ハイ
ブリドーマＣＥＭ２３１．６．７はＡＴＣＣの永久保存
培養物コレクションの一部となっており、取得番号ＡＴ
ＣＣＩ（Ｂ９６２０のもとて抗体の供給源および貯蔵受
容体としてだれでも入手できる。凍結細胞を素堅く解凍
し、次いて直ちに４＋ｎＭグルタミンを追加したＨ　ｌ
−１培地（約１０１１ので洗浄した。ＨＬＩ培地はヘン
ドレックス・オブ・ポートランド［Ｖｅｎｔｒｅｘ　ｏ
ｆ　Ｐｏｒｔｌａｎｄ。

Ｍａｉｎｅ］から購入した。この細胞を′Ｆフラスコに
入れ、高密度の細胞が得られるまでインキュベートした
。

４ｍＭグルタミンを追加したＨＬＩ培地を入れた２５０
ｉＱのスピナーピン２個に、抗体を分に・しているＣＥ
Ｍ２３１．６．７細胞を１ｍＱあたり約３ｏｏ、ｏｏｏ
細胞で蒔いた。細胞密度かＬｔｘＱあたり約９００，０
００細胞に達するまでこの細胞を３７℃で約４８時間イ
ンキュベートした。次いで、それぞれのスピナーにさら
にグルタミンを加え、培養液の最終濃度を４ｍＭグルタ
ミンにした。次に、ＯＥＭ２３１．６．７細胞を含んで
いるスビナ−をさらに８〜１０日間、３７℃てインキュ
ベートした。

最終インキュベートの後、細胞培養液を２個の２５０ｉ
＆ビンに注ぎ、Ｂｅｃｋｍａ＊ｎ　Ｊ　２−２１遠心機
のＢｅｃｋｍａｎｎ　ＪＡ８０−ター中、約１０．ＯＯ
Ｏｒｐｍで２０分間遠心した。上清（約３７５ｉのを回
収し、予（ｌｉｉｉ定量することにより抗体濃度か約８
０μｙ／　ｉＱであることかわかった。次いで、ＹＭＩ
Ｏ７６ｒＩＮフイルターを備えた４００ＪＩＬ２の撹拌
細胞ｌ農縮器［アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ、　　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　２１１１ａｒｔｗｅｌｌ　
Ａｖｅｎｕｅ、　ＬｅｘｉｎｇｔｏｎＭＡ　ｆｌ１２１
７３）から入手できる］を用いて培養液を約４０ｍＱま
で濃縮した。ＹＭＩＯフィルターを備えた５０ｙ（ｌの
アミコン撹拌細胞濃縮器を用いてこの４０ｆｆ（！培ｆ
ｔ　１ｆｆｌをさらに約３２７１まで濃縮した。この濃
縮した上清を最後に１２μｘ２５ｉｚアクロデイスク（
Ａｃｒｏｄｉｓｃ）で濾過した。必要なら、この集めた
上清を一７０℃で凍結することかできる。

”ｆＭ　Ｆｉ　ｆｌλ低ｐＨ法を用いる抗体ＣＥＭ２３
１の変換 抗体ＣＥＭ２３１の細胞不含の濃縮液をｌＮの８３ＰＯ
４で滴定することによってｐ）（４，０に調節した。次
いて、この試料を２５℃で２４時間インキュベートし、
その不均質性を、Ｍｏｎｏ−Ｓ　ＩＩＲ５１５カラムの
カチオン交換クロマトグラフィー（ｐＨ４゜５．０．０
−０．２Ｍ　ＮａＣＱ勾配の０．１７Ｍ酢酸す）　ｌ）
ラム緩衝液）で評価した。実験結果は、２４時間後には
試料中に残っている検出可能な不均質物は存在しないこ
とを示した。

求塵創洛腹水液を用いる抗体ＣＥＭ２３１の変換 実質的にガルフレおよびミルシュタイン［Ｇａ１ｆｒａ
　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　７３　：　４３−４４（１９
８１）］（この文献は祭考のために挙げた）の教示に従
って、腹水を産生じているマウスから腹水液を単離した
。精製したモノクローナル抗体ＣＥＭ２３１の一部（各
部は約２００μ９の抗体を含んでいる）を腹水液と、ｌ
：２の腹水液／抗体培養液の比で混合した。この試料を
２４℃て２４時間インキュベートし、その不均質性を、
￥ｏｎｏ−８１１Ｒ５１５カラムのカチオン交換クロマ
トグラフィー（ｐＨ４、５，０，０−０，２Ｍ　ＮａＣ
Ｑ勾配の０．１７Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液）で評価した
。実験結果は、２４時間後には、抗体の８０％以上か一
次均質形態に変換されたか、腹水液なしてインキュベー
トした対照試料は３種の不均質な形態すへてかほぼ等モ
ルのままであることを示した。

実施例４ｃｐ２を用いる抗体ＣＥＭ２３１の変換 抗体ＣＥＭ２３１濃縮液（約５　ｕｌ？）をカルボキン
ペプチダーゼＢ（約５０μ９）とともに２３℃で５時間
インキュベートした。カルボキシペプチダーゼＢはカル
ビオケム［Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　
１２０８７Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉ
ａ　９２１１２］から購入した。この酵素は２９５１　
Ｕ／ｙｔｒｇの酵素活性を有している。

従って、この反応は約３０のＣＰＩＰ比に対応している
。５時間インキュベートした後、試料の不均質性を、Ｍ
ｏｎｏ−３ＨＲ５１５カラムのカチオン交換クロマトグ
ラフィー（ｐＨ４、５，０，０−０，２ＭのＮａＣＱ勾
配の０．１７Ｍ酢酸す）　ＩＪウム緩衝液）で評価した
。実験結果は、試料中の９５％以」二の抗体が一次均質
形態に変換されたが、未処理の抗体はほぼ等モル比の不
均質な形態を保持していることを示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、モノクローナル抗体ＣＥＭ２３１の不均質な
形態間の相違を図式的に示す模式図である。 特許出願人イーライ・リリー・アンド・カンパニー代理
　人弁理士　前出　葆　はか１名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗体産生細胞から分泌された抗体の不均質性を減少
   させる方法であって、抗体重鎖の一方または両方のカル
   ボキシ末端のアミノ酸またはアミノ酸群を除去するか、
   または該末端にアミノ酸またはアミノ酸群を付加するこ
   とを特徴とする方法。 ２、抗体重鎖の一方または両方からカルボキシ末端アミ
   ノ酸またはアミノ酸群を選択的に除去することからなる
   請求項１記載の方法。 ３、（ａ）抗体の不均質性を減少させるに十分なＣＰＩ
   Ｐ比でカルボキシペプチダーゼを分泌抗体含有培養液に
   加え、 （ｂ）該抗体の不均質性を減少させるに十分な時間、温
   度、およびｐＨで該培養液をインキュベートし、 次いで、該培養液から不均質性が減少した形態の抗体を
   単離すること、 からなる請求項２記載の方法。 ４、ＣＰＩＰ比が〜０．０１から〜１０．０の範囲内で
   ある請求項３記載の方法。 ５、インキュベート時間が〜１時間から〜４８時間の範
   囲内である請求項４記載の方法。６、インキュベート温
   度が〜１℃から〜４２℃の範囲内である請求項５記載の
   方法。 ７、培養液のｐＨが〜６．０から〜９．０の範囲内であ
   る請求項６記載の方法。 ８、ＣＰＩＰ比が〜３．０であり、インキュベート時間
   が〜５時間であり、インキュベート温度が〜２３℃であ
   り、培養液のｐＨが〜７．５である請求項４、５、６、
   または７のいずれかに記載の方法。 ９、（ａ）抗体の不均質性を減少させるに十分な量の腹
   水液を分泌抗体含有培養液に加え、 （ｂ）該抗体の不均質性を減少させるに十分な時間、温
   度、およびｐＨで該培養液をインキュベートし、 次いで、該培養液から不均質性が減少した形態の抗体を
   単離すること、 からなる請求項２記載の方法。 １０、腹水液と培養液が〜２：１から〜１：２０容量の
   範囲内であるように腹水液を加える請求項９記載の方法
   。 １１、インキュベート時間が〜１時間から〜７２時間の
   範囲内である請求項１０記載の方法。 １２、インキュベート温度が〜２℃から〜４２℃の範囲
   内である請求項１１記載の方法。１３、培養液のｐＨが
   〜４．０から〜９．０の範囲内である請求項１２記載の
   方法。 １４、〜１：１容量の腹水液が培養液に加えられ、イン
   キュベート時間が〜１６時間であり、インキュベート温
   度が〜３７℃であり、培養液のｐＨが〜７．５である請
   求項１０、１１、１２、または１３のいずれかに記載の
   方法。 １５、（ａ）分泌抗体含有培養液のｐＨを、該抗体の不
   均質性を減少させるに十分なｐＨまで低下させ、 （ｂ）該抗体の不均質性を減少させるに十分な時間、お
   よび温度で該培養液をインキュベートし、次いで、該培
   養液から不均質性が減少した形態の抗体を単離すること
   、 からなる請求項２記載の方法。 １６、培養液のｐＨを〜３．０から〜５．５の範囲内ま
   で低下させる請求項１５記載の方法。 １７、インキュベート時間が〜１時間から〜７２時間の
   範囲内である請求項１６記載の方法。 １８、インキュベート温度が〜２℃から〜３７℃の範囲
   内である請求項１７記載の方法。１９、培養液のｐＨを
   〜４．０まで低下させ、インキュベート温度が〜４０℃
   であり、インキュベート時間が〜７２時間である請求項
   １６、１７、または１８のいずれかに記載の方法。 ２０、分泌抗体がキメラ、二官能、およびヒトモノクロ
   ーナル抗体からなる群から選ばれる請求項１〜１９のい
   ずれかに記載の方法。