JP2925181B2

JP2925181B2 - モノクローナル抗体の不均質性を減少させる方法

Info

Publication number: JP2925181B2
Application number: JP1256890A
Authority: JP
Inventors: リチャード・マーク・バーソロミュー; トーマス・チャールズ・ファーマン; ロドネイ・アラン・ジュー; ジェイムズ・パトリック・マクドノウ
Original assignee: IIRAI RIRII ANDO CO
Current assignee: IIRAI RIRII ANDO CO
Priority date: 1988-09-28
Filing date: 1989-09-28
Publication date: 1999-07-28
Anticipated expiration: 2014-07-28
Also published as: MX170441B; EP0361902A3; BG60017B2; EP0361902A2; IE893094L; CA1332367C; IL91778A; DK475389A; DK475389D0; CN1041392A; RO105652B1; DE68913251T2; NZ230786A; JPH02163096A; IE63562B1; ATE101876T1; AU615576B2; AU4234389A; EP0361902B1; PL162260B1

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、抗体産生細胞から分泌された抗体の不均質
性を減少させる方法、さらに詳しくは、抗体重鎖の一方
または両方のカルボキシ末端アミノ酸またはアミノ酸群
を変化させることを特徴とする方法に関する。

［従来の技術］ハイブリドーマ細胞からのモノクローナル抗体の大量
生産が、種々の疾病状態の診断、治療、および予後にお
いて革命をもたらした。また、モノクローナル抗体は妊
娠などの様々な自然の状態の段階を調べるのにも有用で
ある。しかし、多数のハイブリドーマ由来の抗体が不均
質な形態を示し、これが産生菌株からの高収率を達成す
るために必要とされる精製および単離工程を大きく妨げ
ることがわかった。カチオン交換クロマトグラフィー
は、インビトロで増殖させた細胞から分泌される抗体に
は少なくとも３種の別個の不均質な形態が存在すること
を示した。これらの形態はその相対的な量を変えて見ら
れることもある。これら不均質な形態は腹水液由来の抗
体では同程度には観察されないが、腹水液からの大量の
抗体の製造は産業用には極めて面倒なものであり、高価
なものになる。

この不均質性の生化学的な根拠は、抗体重鎖のカルボ
キシ末端に結合している余分のアミノ酸または酸群の存
在に起因する。抗体遺伝子のDNA配列から導かれる推定
のアミノ酸配列は余分のアミノ酸を含んでいるので、通
常、末端のアミノ酸は内部でのプロセッシングまたは細
胞からの抗体の分泌の間に除去されるという可能性が最
も高い。３種の不均質な形態のうちの１つは、重鎖のど
ちらにも余分の末端アミノ酸を含んでいない抗体であ
る。３種の別個の不均質な形態のうちの第２のものは重
鎖の一方に余分のアミノ酸を含んでおり、第３の形態は
重鎖の両方に余分のアミノ酸を含んでいる。

［発明が解決しようとする課題］本発明は、あらゆるアイソタイプの不均質抗体の重鎖
からの余分のアミノ酸を特異的に切断し、それによって
３種の形態すべてを１種類の実質的に純粋な均質混合物
に変換する方法を包含する。モノクローナル抗体法の開
発・展開は、大量の実質的に均質な抗体の利用性に依存
している。この開発は、種々の不均質な形態の分泌抗体
を精製し、その特徴を調べることが簡単にできないこと
から幾分遅れていた。本発明は、ほとんどの不均質な抗
体を精製前に１種類の実質的に均質な形態に変換するこ
とを可能にするものであり、この点で有用であり、特に
重要である。この変換によって、一層明確な生化学的特
徴を備えた一層高い収率の抗体、並びに不均質な形態の
抗体に伴われる精製不純物の減少が導かれる。さらに、
高度に精製された単一形態の抗体の所有は、後に行う修
飾、例えば免疫コンジュゲーションあるいは固定化反応
などの再現性および一貫性を大きく増加させる。

本願明細中に開示した発明のために、以下の用語を定
義する。

抗体産生細胞：インビトロまたはインビボのどちらか
で抗体を産生するあらゆる細胞、形質転換された細胞、
またはハイブリドーマ。

腹水液：腹水腫瘍に感染させた動物の腹腔から抜き取
った液体。

CP:カルボキシペプチダーゼ。

CPIP比：カルボキシペプチダーゼ（酵素単位）／免疫
グロブリンタンパク質（mg）の比。

培養液：抗体を含むあらゆる液体であって、培養液か
ら直接取った液体、培養液から取ってその後に濃縮した
液体、または予め単離もしくは精製した抗体を含む液体
を包含するが、これらに限定はされない。

G:グリシン残基。

不均質性：分泌された抗体が、例えば、抗体重鎖の一
方または両方のカルボキシ末端の余分のアミノ酸または
酸群などのように（これに限定はされない）、種々の別
個の生化学的形態を有している現象である。

不均質な抗体：例えば、抗体重鎖の一方または両方の
カルボキシ末端の余分のアミノ酸または酸群などのよう
に、種々の別個の生化学的形態を示す抗体。

ハイブリドーマ：モノクローナル抗体を分泌する細胞
またはセルライン；ここで、該セルラインは適切に免疫
された動物由来の脾細胞とミエローマ細胞の融合によっ
て得られたものである。

K:リジン残基。

P:プロリン残基。

一次均質形態：抗体重鎖のカルボキシ末端が余分のア
ミノ酸を含んでいない形態。

組換えDNAクローニングベクター:1またはそれ以上の
別のDNAセグメントを付加したか、または付加すること
ができるDNA分子を含有するあらゆる自律的に複製する
か、また組み込まれる媒体であって、プラスミドを含む
がこれに限定はされない。

トランスフェクション：ファージDNA粒子による受容
宿主細胞へのDNAの導入。

形質転換体：形質転換を受けた受容宿主細胞。

形質転換：遺伝子型を変化させ、受容宿主細胞が変化
することになる受容宿主細胞へのDNAの導入。

第１図は、モノクローナル抗体CEM231の不均質な形態
間の相違を図式的に示す模式図である。

［課題を解決するための手段］本発明は、抗体産生細胞から分泌された抗体の不均質
性を減少させる方法であって、抗体重鎖の一方または両
方のカルボキシ末端アミノ酸またはアミノ酸群を変化さ
せることを特徴とする方法を提供するものである。本発
明は、抗体重鎖の一方または両方のカルボキシ末端から
のアミノ酸またはアミノ酸群の選択的な除去によて最も
よく例示的に説明される。この所望の結果を得るための
方法の１つは、分泌された抗体を含有している培養液の
pHを、該抗体の不均質性を減少させるに十分なpHまで低
下させ、次いで、該抗体の不均質性を現象させるに十分
な時間および温度で該培養液をインキュベートすること
からなる。通常、pHは〜3.0から〜5.5の範囲内まで低下
させてよいが、pHが〜35から〜4.5の範囲内のときに一
層効率的に反応が起こる。反応は、pHが〜4.0から〜4.5
の範囲内であるときにさらに効率的に起こり、多くの抗
体の不均質性を減少させるに好ましいpHは〜4.0であ
る。

また、インキュベート温度および時間も、不均質抗体
の重鎖からのカルボキシ末端アミノ酸またはアミノ酸群
の除去速度に影響を及ぼす。インキュベート時間は数秒
から多数日までのいずれであってもよいが、〜１時間か
ら〜72時間の範囲内で反応が起こるようにするのが好ま
しい。多くの場合、〜４時間から〜24時間の範囲で反応
させるのがさらに好ましい。しかし、抗体の生化学的性
質および反応の他のパラメーターに依存するが、インキ
ュベートは〜24時間だけで〜95％完結することもある
し、〜48時間から〜72時間程度かかることもある。イン
キュベート温度は広い範囲にまたがるが、〜２℃から〜
37℃の範囲で最もよく反応が起こる。また、反応は〜４
℃から〜37℃の範囲、さらに〜４℃から〜30℃の範囲で
都合よく起こる。多くの抗体にとって好ましい反応温度
は〜４℃から〜25℃の範囲であり、最も好ましい温度は
〜25℃である。

分泌抗体の不均質性を減少させる別の方法は、抗体の
不均質性を減少させるに十分な量で腹水液を分泌抗体含
有の培養液に加え、次いで、該抗体の不均質性を減少さ
せるに十分な時間、温度、およびpHで該培養液をインキ
ュベートすることからなる。広範囲の量の腹水液が反応
を起こさしめるが、腹水液と培養液が〜2:1から〜1:20
の量であるように腹水液を加えた混合物を用いるのがよ
り効率的である。反応の速度および完結性のためには、
腹水液を〜1:1から〜1:10の量で加えるのがよく、腹水
液を〜1:1から〜1:2の量で加えるのがさらによい。好ま
しい反応液は〜1:1の容量の腹水液と培養液を含んでい
る。

インキュベート時間、インキュベート温度、および培
養液のpHも、上記の腹水法の速度および効率に影響を及
ぼす。好ましいインキュベート時間は数秒から多数日ま
でにわたるが、時間が〜１時間から〜72時間の範囲内で
あるときに反応は一層効率的になる。インキュベート時
間が〜16時間から〜72時間の範囲であるときに反応が一
層好都合になることが多く、〜16時間から〜48時間の範
囲であるときにさらに都合のよいものとなる。最も好ま
しい反応時間は〜16時間である。反応温度はほとんど限
定のない範囲にわたるが、温度〜２℃から〜42℃の範囲
内であるときに一層効率的なものになる。温度が〜２℃
から〜37℃の範囲内であるときに反応が好ましいものと
なり、〜26℃から〜37℃であるときにさらに好ましいも
のとなる。最も好ましい反応温度は〜37℃である。培養
液のpHも反応速度を早くしたり、遅くしたりすることが
でき、また、抗体の解離を妨げるのに重要である。培養
液のpHは広い範囲にわたって変化しうるが、pH〜4.0か
ら〜9.0の範囲内であるときに効率がよい。pHが〜7.5か
ら〜8.5の範囲内であるときに反応は良好に進行し、pH
が〜7.5から〜8.0の範囲内であるときにはさらによい。
最も好ましい培養液のpHは〜7.5であり、従って、低pH
法とは対照的に、この腹水液法は生理学的なpHで実施さ
れてよい。

分泌抗体の不均質性を減少させるさらに別の方法は、
抗体の不均質性を減少させるに十分なCPIP比でカルボキ
シペプチダーゼを分泌抗体含有の培養液に加え、次い
で、該抗体の不均質性を減少させるに十分な時間、温
度、およびpHで該培養液をインキュベートすることから
なる。広範囲のCPIP比が反応を起こさしめるであろう
が、〜0.01から〜10.0の範囲内のCPIP比を用いると一層
効率的である。〜0.2から〜8.0の範囲のCPIP比で反応さ
せるのがよく、〜0.2から〜1.0の範囲のCPIP比を用いる
のがもっとよい。通常、〜0.4のCPIP比が最も好ましい
が、酵素量が高くなるほどさらに高い速度での反応を引
き起こすであろうことは当業者の認めるところであろ
う。また、多数の別タイプのカルボキシペプチダーゼ、
例えばCpA、CpB、CpC、CpG、CpP、CpW、CpYおよびその
他が当分野でよく知られており、これらすべてを本発明
の方法において用いることができることも当業者の認め
るところであろう。さらに、カルボキシペプチダーゼの
単位は規格化されており、当分野では周知であるので、
本発明の実施は特定のカルボキシペプチダーゼ供給元に
よって定義されている単位に限定されるものではない。
また、当業者なら、酵素を固体支持体に固定化すること
により精製中の酵素の除去を避けることができることも
認識しているであろう。

インキュベート時間、インキュベート温度、および培
養液のpHも、上記のカルボキシペプチダーゼ法の速度お
よび効率に影響を及ぼす。適切なインキュベート時間は
数秒から数日までにわたるが、この時間が〜１時間から
〜48時間の範囲内であるときに反応が一層効率的にな
る。インキュベート時間が〜１時間から〜24時間の範囲
内であるときに反応がさらに好ましいものになることが
多く、〜１時間から〜16時間の範囲であるときにさらに
良好なものとなる。反応は、インキュベート時間が〜５
時間から〜16時間の範囲内であるときになお一層好まし
いものとなり、〜５時間であるときに最も好ましい。反
応温度はほとんど限定のない範囲にわたるが、温度が〜
１℃から〜42℃の範囲内であるときに好ましいものとな
る。この反応は、温度が〜15℃から〜37℃の範囲内であ
るときに一層好ましいものとなり、〜20℃から〜30℃の
範囲内であるときになお一層好ましいものとなる。最も
好ましい反応温度は〜23℃である。また、培養液のpHも
反応速度を上げたり下げたりすることができ、広範囲に
変化しうるが、pHが〜6.0から〜9.0の範囲内であるとき
に効率的なものとなる。この反応は、pHが〜7.0から〜
8.0の範囲内であるときに良好に進行し、pHが〜7.5から
〜8.0の範囲内であるときになお一層良好なものとな
る。培養液の最も好ましいpHは〜7.5である。

培養液のpH、インキュベート時間、インキュベート温
度、腹水液化、あるいはCPIP比を変えることによって、
上記方法のすべてをあらゆる免疫グロブリン精製法の要
求に適合させることができることは当業者の認めるとこ
ろであろう。不均質性を減少させる反応に続き、当分野
で周知の方法を用いて培養液から抗体を不均質性が減少
した形態で単離することができる。当業者なら、上記の
方法を用いて、既に精製が為された抗体の不均質性を減
少させることもできることを容易に認めるであろう。

実質的に同じ結果が、ペプチドからカルボキシ末端残
基を除去する多種の他の化学的な処理によって得られる
こともある。例えば、ある選ばれたケースでは、ヒドラ
ジノリシス、トリチウム化およびヒダントイン生成、こ
れに続くアセトヒドロキサム酸による処理が有用となろ
う。実質的には、免疫グロブリンのフラグメントのカル
ボキシ末端からペプチドまたはペプチド群を除去するあ
らゆる化学反応が、本発明の範囲内に含まれることにな
ろう。特に、カルボキシ末端からペプチド類を除去する
ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ類が本方法を実
施する際に有用となるであろうが、リジン残基の内側に
あるカルボキシ末端領域において特異的に切断すること
が可能なその他のあらゆる酵も同様であろう。

本発明実施のさらに別の方法は、免疫グロブリン重鎖
をコードしている遺伝子から、カルボキシ末端のリジン
またはリジン群をコードしているコドンまたはコドン群
を選択的に除去することからなる。当業者なら、抗体を
コードしているDNA配列が推定されると、組換えDNA法を
用いてカルボキシ末端ペプチドをコードしているコドン
またはコドン群を除去することは技術者の問題であるこ
とを認識している。トランスフェクションまたは形質転
換が行われた細胞内でこの先端を切除した遺伝子が発現
すると、その遺伝子産物は、野生型の抗体鎖とはカルボ
キシ末端ペプチドの除去だけが異なっている抗体鎖で構
成されているであろう。別法によれば、組換えDNA法を
用いて別の残基をコードしているコドンをポリペプチド
のカルボキシ末端に付加することができ、これによっ
て、カルボキシ末端の量を変え、抗体群の不均質性を減
少させることができる。従って、化学的あるいは生物学
的な操作のいずれであっても、抗体のカルボキシ末端を
変えることによって抗体群の不均質性を減少させるあら
ゆる操作が本発明の範囲内に含まれる。

本発明の好ましい態様は、モノクローナル抗体CEM231
の変換によって最もよく例示される。モノクローナル抗
体CEM231は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション［ATCC;American Type Culture Collection,1230
1 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852］に1988年１月
７日に寄託され、その永久保存培養物コレクションの一
部となっている菌株であるハイブリドーマCEM231.6.7か
ら分泌される。この株は取得番号ATCC HB9620のもと、
抗体の供給源および貯蔵受容体としてだれでも入手する
ことができる。

血清を含まない培地でハイブリドーマを増殖させた
後、細胞を含まない培養液を40−115Xに濃縮し、この液
のpHをH₃PO₄による滴定によってpH4.0まで低下させた。
液を25℃で24時間インキュベートした後には、培養液中
の抗体の95％以上が一次均質形態に変換されていた。カ
チオン交換クロマトグラフィーから明らかなように、こ
の一次均質形態は、抗体鎖のカルボキシ末端が外側のア
ミノ酸を含んでいない形態である。さらに、ある場合に
は、反応混合物にEDTA（１−10mM）などのキレート化試
薬を加えることによって本変換法の効率が向上すること
もある。

また、腹水液法を用いて不均質なCEM231を一次均質形
態に変換することもできる。濃縮したCEM231培養液を腹
水液を1:1容量比で混合し、次いで37℃、pH7.4でインキ
ュベートした。この反応は、16時間でほぼ等モル濃度の
不均質な抗体を80％以上の一次均質抗体に変換した。あ
る場合には、反応混合物にEDTA（１−10mM）などのキレ
ート化試薬を加えることによって、この変換法の効率を
向上させることもできる。あらゆる腹水液を本変換法に
用いることができるが、変換を受ける抗体とは実質的に
異なる生化学的性質を有する抗体を含有しているものを
用いるのが好ましい。即ち、この別の性質は、精製工程
中における腹水産生された抗体と変換された抗体の交叉
汚染を防止するのに有用である。

さらに、カルボキシペプチダーゼ法を用いて不均質な
CEM231を一次均質形態を変換することもできる。血清不
含の培地でハイブリドーマを増殖させた後、細胞不含の
培養液を70Xに濃縮し、次いでカルボキシペプチダーゼ
Ｂをこの培養液にCPIP比3.0を加えた。この液を23℃で
５時間インキュベートした後には培養液中の抗体の95％
以上が一次均質形態に変換された。

モノクローナル抗体CEM231の変換に加え、上記方法
は、ハイブリドーマセルラインおよび形質転換またはト
ランスフェクションを受けたセルラインの両者由来の多
種多様の抗体の不均質性を減少させるために用いられ
る。第１表は、試験した種々抗体の代表的な試料と得ら
れた結果を示すものである。

当業者なら、本発明の方法がハイブリドーマ以外の細
胞から産生される抗体の不均質性を減少させるのにも有
用であることを容易に認めるであろう。特に、モノクロ
ーナル抗体をコードしている遺伝子を種々の組換えDNA
クローニングベクターに連結することができ、次いで細
菌あるいは酵母を含む適切な宿主細胞に導入するか、ま
たはトランスフェクションすることができる。次いで、
適切な条件のもとでは、形質転換されたか、またはトラ
ンスフェクションされた細胞はモノクローナル抗体を産
生するか、または分泌するであろう。また、ある種由来
の可変領域とこれに結合した第２の種由来の不変領域を
含有するキメラ抗体も構築することができ、組換え法に
よって形質転換あるいはトランスフェクションされた宿
主細胞で発現させることができる。ブーリアン［Boulia
nne et al.,Nature 312:643−646（1984）］らを参照
（この文献は参考のために挙げた）。さらに、本発明の
方法はヒト抗体あるいは二官能性抗体の不均質性を減少
させるのにも有用である。また、本発明の方法を用いて
血液、血清またはその他の体液から単離した抗体の不均
質性を減少させることもできる。

さらに、多数の別の化合物を用いて培養液のpHを低下
させうること、およびそのような等価なものすべてが本
発明の範囲内に入ることも当業者の認めるところであろ
う。腹水法を用いるときには、抗体培養液と腹水液の多
くの異なる比率を用いてよく、そのような等価なものす
べてが本発明の範囲内に入る。また、抗体の不均質性を
減少させるためにカルボキシペプチダーゼ法を用いると
きには、多くのCPIP比を用いることができ、このすべて
が本発明の範囲内に入る。さらに、最適の変換に必要な
インキュベートの時間および温度、並びに培養液のpH
は、使用する抗体の正確な生化学的性質によって変わる
であろう。また、変換工程を始める前に培養液を濃縮す
るのが好都合であることもあるが、本発明の新規方法は
濃縮および希釈試料の両方で行いうるので、本発明は試
料の濃縮によって限定されるものではない。

ハイブリドーマおよびその他の抗体分泌セルラインを
フラスコ中で、あるいは持続的に流れる発酵タンク中で
増殖させてよい。血清不含の培地を用いることができ、
培養液のpHを約6.5〜8.5の範囲内に維持し、温度を30℃
〜40℃の範囲内に維持する。抗体分泌セルラインのそれ
ぞれはそれ独自の最適条件を必要とするが、このような
条件は当技術者により容易に見つけられるはずである。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。試薬あ
るいは装置の供給元は単に利便のために挙げたものであ
って、本発明を限定するものではない。本発明実施につ
いての説明および実際の方法は適当なところに記載し
た。

実施例１ハイブリドーマCEM231.6.7の培養モノクローナル抗体CEM231を分泌するハイブリドーマ
CEM231.6.7をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ATCC）から入手した。ハイブリドーマCEM231.
6.7はATCCの永久保存培養物コレクションの一部となっ
ており、取得番号ATCC HB9620のもとで抗体の供給源お
よび貯蔵受容体としてだれでも入手できる。凍結細胞を
素早く解凍し、次いで尚ちに4mMグルタミンを追加したH
L1培地（約10ml）で洗浄した。HL1培地はベントレック
ス・オブ・ポートランド［Ventrex of Portland,Main
e］から購入した。この細胞をＴフラスコに入れ、高密
度の細胞が得られるまでインキュベートした。

4mMグルタミンを追加したHL1培地を入れた250mlのス
ピナービン２個に、抗体を分泌しているCEM231.6.7細胞
を1mlあたり約300,000細胞で蒔いた。細胞密度が1mlあ
たり約900,000細胞に達するまでのこの細胞を37℃で約4
8時間インキュベートした。次いで、それぞれのスピナ
ーにさらにグルタミンを加え、培養液の最終濃度を4mM
グルタミンにした。次に、CEM231.6.7細胞を含んでいる
スピナーをさらに８〜10日間、37℃でインキュベートし
た。

最終インキュベートの後起、細胞培養液を２個の250m
lビンに注ぎ、Beckmann J2−21遠心機のBackmann JA8ロ
ーター中、約10,000rpmで20分間遠心した。上清（約375
ml）を回収し、予備定量することにより抗体濃度が約80
μg/mlであることがわかった。次いで、YM10 76mmフィ
ルターを備えた400mlの撹拌細胞濃縮器［アミコン社（A
micon Corporation,Scientific Systems Division,21 H
artwell Avenue,Lexington,MA 02173）から入手でき
る］を用いて培養液を約40mlまで濃縮した。YM10フィル
ターを備えた50mlのアミコン撹拌細胞濃縮器を用いてこ
の40ml培養液をさらに約3.27mlまで濃縮した。この濃縮
した上清を最後に1.2μm25mmアクロディスク（Acrodis
c）で濾過した。必要なら、この集めた上清を−70℃で
凍結することができる。

実施例２低pH法を用いる抗体CEM231の変換抗体CEM231の細胞不含の濃縮液を1NのH₃PO₄で滴定す
ることによってpH4.0に調節した。次いで、この試料を2
5℃で24時間インキュベートし、その不均質性を、Mono
−S HR 5/5カラムのカチオン交換クロマトグラフィー
（pH4.5、0.0−0.2M NaCl勾配の0.17M酢酸ナトリウム緩
衝液）で評価した。実験結果は、24時間後には試料中に
残っている検出可能な不均質物は存在しないことを示し
た。

実施例３腹水液を用いる抗体CEM231の変換実質的にガルフレおよびミルシュタイン［Galfr an
d Milstein,Methods in Enzymology 73:43−44（198
1）］（この文献は参考のために挙げた）の教示に従っ
て、腹水を産生しているマウスから腹水液を単離した。
精製したモノクローナル抗体CEM231の一部（各部は約20
0μｇの抗体を含んでいる）を腹水液と、1:2の腹水液／
抗体培養液の比で混合した。この試料を24℃で24時間イ
ンキュベートし、その不均質性を、Mono−S HR 5/5カラ
ムのカチオン交換クロマトグラフィー（pH4.5、0.0−0.
2M NaCl勾配の0.17M酢酸ナトリウム緩衝液）で評価し
た。実験結果は、24時間後には、抗体の80％以上が一次
均質形態に変換されたが、腹水液なしでインキュベート
した対照試料は３種の不均質な形態すべてがほぼ等モル
のままであることを示した。

実施例４ CP法を用いる抗体CEM231の変換抗体CEM231濃縮液（約5mg）をカルボキシペプチダー
ゼＢ（約50μｇ）とともに23℃で５時間インキュベート
した。カルボキシペプチダーゼＢはカルビオケム［Calb
iochem,P.O.Box 12087,San Diego,California 92112］
から購入した。この酵素は295IU/mgの酵素活性を有して
いる。従って、この反応は約3.0のCPIP比に対応してい
る。５時間インキュベートした後、試料の不均質性を、
Mono−S HR 5/5カラムのカチオン交換クロマトグラフィ
ー（pH4.5、0.0−0.2MのNaCl勾配の0.17M酢酸ナトリウ
ム緩衝液）で評価した。実験結果は、試料中の95％以上
の抗体が一次均質形態に変換されたが、未処理の抗体は
ほぼ等モル比の不均質な形態を保持していることを示し
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、モノクローナル抗体CEM231の不均質な形態間
の相違を図式的に示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号３６４０５６ (32)優先日 1989年６月９日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (72)発明者ロドネイ・アラン・ジューアメリカ合衆国カリフォルニア92130、サン・ディエゴ、カーメル・ブルークス・ウエイ4081番 (72)発明者ジェイムズ・パトリック・マクドノウアメリカ合衆国インディアナ46227、インディアナポリス、グリフィン・ロード 421番 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 21/08 C07K 16/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】抗体産生細胞から分泌された抗体の不均質
性を減少させる方法であって、抗体重鎖の一方または両
方のカルボキシ末端のアミノ酸またはアミノ酸群を除去
することを特徴とする方法。
【請求項２】（ａ）抗体の不均質性を減少させるに十分
なCPIP比でカルボキシペプチダーゼを分泌抗体含有培養
液に加え、（ｂ）該抗体の不均質性を減少させるに十分な時間、温
度、およびpHで該培養液をインキュベートし、次いで、該培養液から不均質性が減少した形態の抗体を
単離すること、からなる請求項１記載の方法。
【請求項３】CPIP比が0.01から10.0の範囲内である請求
項２記載の方法。
【請求項４】インキュベート時間が１時間から48時間の
範囲内である請求項３記載の方法。
【請求項５】（ａ）抗体の不均質性を減少させるに十分
な量の腹水液を分泌抗体含有培養液に加え、（ｂ）該抗体の不均質性を減少させるに十分な時間、温
度、およびpHで該培養液をインキュベートし、次いで、該培養液から不均質性が減少した形態の抗体を
単離すること、からなる請求項１記載の方法。
【請求項６】腹水液と培養液が2:1から1:20容量の範囲
内であるように腹水液を加える請求項５記載の方法。
【請求項７】インキュベート時間が１時間から72時間の
範囲内である請求項６記載の方法。
【請求項８】（ａ）分泌抗体含有培養液のpHを、該抗体
の不均質性を減少させるに十分なpHまで低下させ、（ｂ）該抗体の不均質性を減少させるに十分な時間、お
よび温度で該培養液をインキュベートし、次いで、該培養液から不均質性が減少した形態の抗体を
単離すること、からなる請求項１記載の方法。
【請求項９】培養液のpHを3.0から5.5の範囲内まで低下
させる請求項８記載の方法。
【請求項１０】培養液のpHを4.0以下まで低下させ、イ
ンキュベート温度が40℃以下であり、インキュベート時
間が72時間以内である請求項８、または９に記載の方
法。