JPH10511082A

JPH10511082A - 組換え分泌成分の製造

Info

Publication number: JPH10511082A
Application number: JP8518228A
Authority: JP
Inventors: ファン・オーストルム，ヤン; アセルベルフス，フレデリクス・アルフォンスス・マリア; ライスト，クリスティアン; グリュッター，マルクス
Original assignee: ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1995-12-06
Publication date: 1998-10-27
Also published as: AU4302796A; WO1996018734A1; EP0799310A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、結晶化でき、従って、その三次元構造の全体的研究が可能な、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞から得られる新規組換え分泌成分(ｒＳＣ)の新規な形態に関する。結晶化された形態は、直接的または間接的に(例えば、由来構造を経て)、端緒発見、スクリーニングおよび結合研究に使用し得る。

Description

【発明の詳細な説明】組換え分泌成分の製造本発明は、組換えチャイニーズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞系から得られる組換え分泌成分(ｒＳＣ)の新規形態に関し、それは結晶化でき、従って、その三次元構造の全体的研究が可能である。結晶可能形は、直接的に(例えば、免疫グロブリンを安定化するのに)または間接的に(例えば、由来構造を経て)、端緒発見、スクリーニングおよび結合研究に使用し得る。インビボで分泌成分(ＳＣ)は、重合免疫グロブリン(Ｉｇ)の外部粘膜表面への輸送を担う特異的細胞の必須膜糖タンパクの細胞外部分として合成される。このような細胞は、呼吸器、胃腸、胆管および泌尿管の内側の細胞を含む幾つかの組織の上皮細胞および唾液、涙および乳腺中およびまた肝細胞に見られる。膜タンパク質は、重合免疫グロブリン受容体(pＩgＲ)と名付けられ、細胞の基底部の重合ＩｇＡ(ポリ−ＩｇＡ)およびＩｇＭ(ポリ−ＩｇＭ)と特異的に結合する。pＩg Ｒ／ポリ−Ｉｇ複合体が細胞の基底部から頂上部(体外)側へ輸送される間、pＩg Ｒは開裂されて、その結果ＳＣを形成する。ほとんどのＳＣがＳＣ／ポリ−Ｉｇ複合体の一部として細胞から遊離されるが、遊離ＳＣもまた外部分泌物中に見られる。ＳＣ／ポリ−Ｉｇ複合体中、ＳＣはポリ−Ｉｇの四基構造を安定化し、種々のタンパク質分解酵素に対する耐性を増加させると考えられている。例えば、消化プロテアーゼに対するこの耐性は、分泌免疫グロブリンの保護機能に必須でないとしても重要な条件である。従って、ＳＣは通常３つの分子形態で発現する： −上皮細胞および肝細胞の表面の膜タンパクとして； −分泌性ＩｇＡおよび可溶性ＩｇＭの組成鎖として；および −幾つかの外部分泌物における遊離糖タンパクとして。ｃＤＮＡ(配列番号１)を基本にして、ヒトpＩgＲ(配列番号２)の推定アミノ酸配列は、７６４残基を有し、ウサギおよびラットの対応物とそれぞれ５６％および６４％の相対的な相同性を示す(Ｋrajci et al.，Ｈuman Ｇenetics(1991)，8 7，642-648)。ヒト乳から単離された遊離ＳＣは、２０％までの炭水化物を含む７８ｋＤａ一本鎖糖タンパクである。最初の配列分析は、ＳＣが、各々が約１００アミノ酸長の５つのドメインから成ることを示す。これらのドメインは大きさは均一であり、ドメインに対する配列はタンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーに特徴的である。上記のように、pＩgＲはＩｇＡおよびＩｇＭの粘膜分泌物への輸送を媒介する。粘膜抗体は、免疫応答において非常に重要である。それらは、まだ体内に入っていない病原体、および、体内に入っていないが、体内に取り込まれる毒素を分泌することにより疾病を引き起こす病原体を不活性化する。従って、ＳＣのアンタゴニストおよび好ましくはアゴニストは、粘膜免疫応答の調整に大きな医薬的価値がある。有効な医薬設計のために受容体の三次元構造知ることは重要である。種々の努力にもかかわらず、pＩgＲも天然ＳＣもまだ結晶化に成功していない。ｒＳＣのような組換え糖タンパクの糖付加パターンは、タンパク質のアミノ酸配列におけるある間違えて理解された決定基により、およびグリカンの最終構造を決定する競合処理酵素活性の利用により決定されている。従って、同じポリペプチドの、グリコフォームと呼ばれる異なる糖付加変異体は、それらの細胞系中の競合オリゴサッカライド処理酵素活性の分布に依存して、異なる細胞系により製造できる。糖タンパクの糖付加のタイプは、タンパク質の機能的および構造的パラメーターに影響する。例えば、糖付加は、しばしばタンパク質分解酵素存在下でポリペプチドの安定性を増加させる。一方、特に、ＳＣの場合のように、実質的糖付加は、しばしば、タンパク質結晶化の試みを妨害する。ＣＨＯ細胞中に発現される組換え糖タンパクは、シアル酸で末端置換された炭水化物鎖を含むことが知られている。最も多いシアル酸、α２−３結合Ｎ,Ｏ− アセチルノイラミン酸(ＮeuＡc)およびα２−３結合Ｎ−グリコイルノイラミン酸(ＮeuＧc)は、約９７：３の比率で存在する(Ｈokke et al.，FEBS Ｌett．(19 90)，275，9-14)。ＣＭＰ−Ｎeu５Ａｃから糖タンパクへのＮeu５Ｇｃの取り込みの前駆体として働くＣＭＰ−Ｎeu５Ｇへの変換をもたらすＣＮ−アセチルノイラミンモノオキシゲナーゼ(ＥＣ1.14.99.18)活性が、正常成人ヒト組織中で発現されることは証明されていない。更なる研究は、正常成人ヒト細胞が動物の血清に暴露された場合に、免疫原性応答が起こり得ることを示した。いわゆるＨanga nutziu-Ｄeicher(血清病)抗体は、β−Ｇalに末端Ｎeu５Ｇc、α２−３−結合を含む糖結合体を指向する。驚くべきことに、我々は、CHO SSF 3細胞が他のＣＨＯ細胞で産生される典型的糖タンパクで見られたのより遥かに低い量で、ｒＳＣの炭水化物鎖にＮeuＧcを取り込むことを発見した。CHO SFF3細胞で製造されるｒＳＣに対するＮeuＧｃの比率は、全シアル酸の０.２５％以下であり、ＣＨＯ細胞で産生される典型的組換え糖タンパクは約３％含む。通常ヒト糖タンパクで存在しないＮeuＧcの減少した濃度は、CHO SSF 3細胞で産生されるｒＳＣを、よりヒトに近くし、従って、より抗原性が低く、ヒトへの使用に、より安全である。更に驚くべき事実は、結合重合免疫グロブリンに両方とも活性であり、結晶化できる組換えＳＣ(ｒＳＣ)のグリコフォームを産生することが可能なことである。本発明の糖付加ｒＳＣは、例えば、“懸滴法”により結晶化でき、ＳＣの三次元構造の評価の理想的な出発点を提供し、ＳＣポリペプチド自体の変異体を含むＳＣアンタゴニストおよび好ましくはＳＣアゴニストの研究を容易にする。発明の詳細な説明本発明は、分泌成分またはその機能的フラグメントをコードするＤＮＡを含むベクターで形質導入したCHO SSF 3細胞を培養し、発現タンパク質を培養培地から単離することを含む工程により得られる、組換え分泌成分(ｒＳＣ)またはその機能的フラグメントに関する。上記で定義のｒＳＣは、例えば、全シアル酸に関して０.５％より低いＮ−グリコリルノイラミン酸(ＮeuＧc)の含量を有する。従って、本発明のｒＳＣは、例えば、ヒトに対して減少した抗原性を示す。本発明の方法は、好ましくは以下の工程を含む：ａ）分泌成分またはその機能的フラグメントを発現できるベクターの構築；ｂ）該ベクターによるCHO SSF 3細胞の形質導入；ｃ）形質導入細胞の培養；およびｄ）培養培地からの分泌成分またはそのフラグメントの単離。分泌成分(ＳＣ) pＩgＲは、ポリ−Ｉｇ、特にＩｇＡおよびＩｇＭに結合できる受容体である。ヒトpＩgＲは配列番号１に記載のヌクレオチド配列および基本的に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。pＩgＲはpＩgＲ／ポリ−Ｉｇ複合体の細胞の基底から頂上(細胞外)への輸送中に開裂され、従ってＳＣを形成する。ｒＳＣの機能的フラグメントは一個またはそれ以上のアミノ酸欠損または修飾を有し、ポリ− Ｉｇ、特にポリ−ＩｇＡと結合できるおよび／またはアンタゴニストおよび好ましくはアゴニストの存在下で天然ＳＣと同等に反応できるpＩgＲの誘導体である。好ましいフラグメントは、例えば、pＩgＲのアミノ酸６３９−６６１の間にある、例えば、膜固定ドメインおよび／またはアミノ酸６６２−７６４の間の細胞内Ｃ−末端ドメインを欠く可溶性フラグメントである。特に好ましいのは、配列番号３および配列番号４に記載のフラグメントである。ｒＳＣまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントは、例えば、宿主の好ましいコドン用法に適用する限り修飾し得、またはコード配列の直前または直後のＤＮＡ配列を、転写の促進、産生したｍＲＮＡの安定化のために修飾し得、または例えば、制限部位の挿入により、遺伝子修飾を容易にする。プラスミド上記の分泌成分またはその機能的フラグメントをコードするＤＮＡは、通常、該ＤＮＡを発現できるポリペプチド発現カセット中に含まれる。本発明の好ましい発現カセットにおいては、プロモーターが、該プロモーターの制御下で転写する該ＤＮＡに、およびターミネーターに操作可能に結合している。プロモーターはほとんど任意の起源であり得る。例えば、緊密に制御されたプロモーターまたは該ＤＮＡに天然に結合しているプロモーターの使用が可能である。好ましくは、ＣＨＯ細胞中で活性な、ＳＶ４０の“初期”プロモーターのようなウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス(マウス、サルまたはヒト)の即時初期プロモーター、またはβ−アクチン遺伝子、メタロチオネイン遺伝子または熱ショック遺伝子のような細胞性プロモーターである。特に好ましいのは、ＮＥＯ遺伝子のＳＶ４０初期プロモーター、ＳＣのマウスまたはヒトサイトメガロウイルス即時初期プロモーターおよびＤＨＦＲ遺伝子のヒトアデノウイルス２型プロモーターである。転写停止信号を含むＤＮＡ配列は、好ましくは、所望の宿主の転写およびポリアデニル化の停止の正確な信号を含む遺伝子の３'フランキング配列である。好適な信号は、例えば、ヒト成長ホルモンまたはウサギβ−グロビン遺伝子のような細胞性遺伝子またはＳＶ“初期”および“遅延”遺伝子のようなウイルス遺伝子である。プラスミドは、所望の宿主中の安定性を増加させるまたはプラスミドＤＮＡまたはその必須部分の、所望の宿主の染色体への統合を容易にするＤＮＡのフラグメントを含み得る。好適なＤＮＡフラグメントの例は、組換え遺伝子がレトロウイルス粒子、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＡＡＶ、ワクシニア、パピローマウイルス、セムリキ森林ウイルスなどのウイルス起源複製またはＣＲＥおよびＦＬＰのような部位特異的リコンビナーゼの認識部位を含むＤＮＡセグメントとして移入しなければならない場合、レトロウイルスの長末端反復である。プロモーター、分泌成分またはその機能的フラグメントをコードするＤＮＡ配列および転写停止信号を含むＤＮＡ配列は、互いに操作可能に連結している、すなわち、それらの通常の機能が維持されるように、並列している。配列は、プロモーターがＳＣ遺伝子の適切な発現に作用し、転写停止信号が転写およびポリアデニル化の好適な停止に作用するようなものである。これらの配列の結合は、例えば、具体的エンドヌクレアーゼの認識配列を担持する合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーにより行い得る。本発明の発現カセットは、好適なエピソームまたはプラスミドの形でまたは染色体の一部として所望の宿主中で維持され、後者の場合が好ましい。しかしながら、本発明の発現プラスミドが、プラスミド、マーカーおよび細菌宿主、特にＥscherichia coliの複製起源の構築、増幅および試験に使用するための宿主の１個またはそれ以上、特に１個または２個の選択遺伝子マーカーを含むことも同様に可能である。選択遺伝子マーカーに関して、マーカー遺伝子の表現型の発現により、形質転換体の選択を容易にする、任意のマーカー遺伝子が使用できる。好適なマーカーは、例えば、抗生物質または他の抗代謝物に耐性を発現するもの、または、栄養要求宿主変異体の場合、宿主の障害を補う遺伝子である。対応する遺伝子は、例えば、抗生物質テトラサイクリン、アンピシリン、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、ピューロマイシンまたはブレオマイシンに耐性を付与するものまたは(条件)栄養要求変異体に原栄養を提供するもの、例えば、チミジンキナーゼ(ＴＫ)遺伝子、ジヒドロフルオレートレダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子およびＥ．coli gpt、Ｈis ＤまたはＴrp遺伝子である。これらの選択可能マーカー遺伝子は、また、発現遺伝子と物理的に無関係な選択遺伝子の共形質導入により提供できる。このような共形質導入後、酵素的機構が高い可能性で、非形質転換細胞の除去が可能なように、二つの遺伝子のセットを共制御する。発現プラスミドの増幅が通常、Ｅ．coliのような原核生物で行われるため、原核生物、例えばＥ．coli遺伝子マーカーおよび原核生物、例えばＥ．coli複製起源は、有利に含まれる。これらは、原核生物、例えばＥ．coli複製起源およびアンピシリンおよびテトラサイクリンのような抗生物質に耐性を付与する遺伝子マーカーの両方を含む、対応する原核生物プラスミド、例えば、pＢＲ３２２、pＴＺ１８ＲまたはpＵＣプラスミド、例えば、ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９のようなＥ．coliプラスミドから得ることができる。ポリペプチド発現カセット、複製起源および遺伝子マーカーとは別に、本発明の発現プラスミドは、同一または異なり得る１個から３個の付加ポリペプチド発現カセットのような付加発現カセットを所望により含むことができる。好適なベクターの例は、例えば、ｐＥＵＫ−Ｃ１(Ｃlontech Inc.，Ｐaro Ａl to，Ｃalifornia，USA)、pcＤＮＡＩneo(Ｉnvitrogen Ｃorp．Ｓan Ｄiego Ｃal ifornia，USA)、pＣＧＡ２８(Ａsselbergs et al.，Ｆibrinolysis(1993)，7，1 -14)またはpCGA93D-PPREN(Ａsselbergs et al.，Ｂiotech．(1994)，32，191-20 2)を基本にした、哺乳類細胞発現ベクターである。本発明の発現プラスミドは、当分野で既知の方法、例えば、ポリペプチド発現カセット、試験で使用する宿主および所望により細菌宿主の選択遺伝子マーカー、複製起源を含むＤＮＡフラグメントおよび所望により付加ポリペプチド発現カセットを、予め決定した配列で、既知の化学的または生物学的インビトロ合成法により結合させて、製造する。好ましくは、プラスミドは組換えＤＮＡ法を使用して構築および製造される。組換えＤＮＡ法による製造においては、ＤＮＡフラグメントはインビトロで既知の方法でライゲートする。次いでライゲーション混合物を、使用した制御因子の性質に応じて、好適な原核または真核宿主に形質転換し、所望のベクターを含む形質転換体を既知の方法で選択する。プラスミドは、形質転換宿主により増幅でき、既知の方法により単離できる。宿主の選択は、ベクターに存在する制御配列に依存する。ベクターの構築および増幅においては、原核宿主、例えばＥ．coliが好ましい。宿主、形質導入および培養ｒＳＣの製造に好適な宿主は、CHO SSF 3細胞(Ｇandor，Ｃ.Ｒ．(1993)Ｅstab lishment and charaterization of growth-prototropic Ｃhinese hamster ovar ：Ｄissertation Ｎr 10087，Ｓwiss Ｆederal Ｉnstitute of Ｔechnology)またはそれ由来であり、ｒＳＣの同じグリコフォームを形成する細胞である。上記のように、好適な宿主は、例えば、カチオン性脂質小胞、エレクトロポレーションまたは粒子ガンを使用して、遺伝子工学の標準法で形質導入できる。産生ｒＳＣの量を増加させるために、高コピープラスミドを使用するのが、またはプラスミドＤＮＡを数コピーのゲノムに統合するのが有利である。後者は、例えば、(Ａsselbergs et al.，Ｊ．Ｂiotechnol．(1994)，32，191-202；Ａsselber gs et al.，Ｊ．Ｂiotechnol．(1992)，23，143-151；Ａsselbergs et al.，Ｊ．Ｍol．Ｂiol．(1986)，189，401-411およびＫaufman et al.，Ｍol．Ｃell Ｂ iol．(1985)，5，1750-1759)に記載のように、メトトレキサートでの増幅によって達成できる。修飾CHO SSF 3細胞は、細胞培養の標準法で培養できる。本発明の好ましい態様においては、細胞を無血清培地、およびより好ましくは、無血清無タンパク質培地で培養する。驚くべきことに、Ｐluronic(登録商標)の培養培地への添加は、生産性向上効果を有することが判明した。平均倍加時間はＰluronic(登録商標)非存在下より約２０％低いが、ｒＳＣの１日収量は数倍高い。この細胞に体する特異的生産性向上効果は驚くべきことであり、今まで観察されていなかった。培地に添加するＰluronic(登録商標)、特にＰluronic Ｆ−68(登録商標)の量は、好ましくは約０.００５から０.５％(ｗ／ｖ)、より好ましくは０.０１から０.１％(ｗ／ｖ)である。単離本発明の方法により製造されたｒＳＣを、主として培養培地に分泌させる。それは、既知の手段で、単離できる。単離中、タンパク質安定化剤、プロテイナーゼ阻害剤等の慣用の添加剤を添加し得る。例えば、第１段階は、通常、遠心または濾過の手段による細胞の培養液からの分離から成る。添加タンパク質および不純物存在下で、得られる上清はｒＳＣに富むことができる。代表的精製スキームは、例えば、ほとんどの非タンパク質性物質を除去するためのポリエチレンイミンとの処理および硫酸アンモニウム等の溶液で飽和させることによるタンパク質の沈殿、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ゲル電気泳動、無担体電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣのようなクロマトグラフィー処理、Ｓephadex(登録商標)での処置、透析または他の工程、特に文献から既知のものを含む。当業者は、精製スキームの組み合わせを使用できることを認識するであろう。一般に、実質的に不純物がないｒＳＣ生産物を得るために、数工程の精製が必要とされるだけである。結晶化本発明の更なる態様は、分泌成分の溶液を、沈殿剤緩衝液を含む容器に入れ、そこでは溶液および緩衝液が分離されている、本発明の分泌成分(ＳＣ)の結晶化法である。“懸滴法(the hanging drop method)”によるタンパク質の結晶化の一般法および詳細は、例えば、ＭcＰherson，Ａ(1982)：Ｐreparation and Ａna lysis of protein crystals，Ｊohn Ｗiley and Ｓons，NYに記載されている。タンパク質を結晶化するために、分泌成分またはその機能的フラグメントの溶液は、沈殿剤緩衝液を含むことができる。例えば、本発明のｒＳＣを含む溶液および沈殿剤緩衝液を、１：２から２：１、好ましくはおよそ等量で混合することが好ましい。沈殿剤緩衝液は、通常、あるｐＨを確立するのに使用する化合物、１個またはそれ以上の吸湿性化合物および防腐剤を含む。好適な成分の例は、ＮａＮ₃、クエン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、リン酸アンモニウムおよび／またはＬｉ₂ＳＯ₄ である。好ましい緩衝液は、例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸アンモニウムおよびＮａＮ₃の混合物；またはＨＥＰＥＳ、Ｌｉ₂ＳＯ₄およびＮａＮ₃の混合物である。更に好ましい方法においては、ｒＳＣを含む溶液を沈殿剤緩衝液上に、懸滴状態で置く(懸滴法)。結晶化は、３℃から３０℃、より好ましくは５℃から２５℃および特に好ましくは室温で行う。単離ｒＳＣの使用上記のように単離および結晶化したｒＳＣを、タンパク質全体または少なくともポリ−Ｉｇへの結合および分泌を担う領域の三次元構造の決定に使用できる。三次元構造を決定するための既知の方法は、例えば、Ｘ線法またはＮＭＲ法である。これらまたは同様な方法から得られたデータは、ｒＳＣ媒介ＩｇＡ輸送のアンタゴニストまたは好ましくはアゴニストの同定に直接的または間接的に使用し得る。これに関して通常使用されている方法は、例えば、コンピューターを使用したドラッグデザインまたは分子モデリングである。高度に富化されたｒＳＣは、また、直接、結合研究およびポリ−Ｉｇ結合に影響する能力についての化合物のスクリーニングに使用し得る。これらの試験においては、本発明のｒＳＣは、例えば、マイクロタイタープレートまたはビーズのような固体担体上に固定し得るし、またはビオチンまたは放射活性、蛍光または化学発光基のような１個またはそれ以上の同定可能なマーカーを担持し得る。本発明の更なる態様は、本発明のｒＳＣまたはそれの三次元構造を使用して同定され、治療方法に使用するためのアンタゴニストまたは好ましくはアゴニストに関する。本発明のｒＳＣは、先に知られているＳＣと比較して、低い免疫原性のために、貴重な医薬特性を有する。この低い免疫原性は、例えば、ＮeuＧcの低い含量( 全シアル酸の０.２５％またはそれ以下)に基づく。従って、本発明の更なる態様は、上記で定義のｒＳＣの、例えば、ポリＩｇ、特にポリＩｇＡの安定化を行う治療方法への使用に関する。実施例：以下の実施例は本発明を説明するものであり、限定するものと見なしてはならない。制限酵素での開裂、ライゲーション、形質転換およびアニーリングのような遺伝子工学における標準法は、本質的に、Ｓambrook et al.，Ｍolecular Ｃlonin g：Ａ laboratory manual，第２版，Ｃold Ｓpring Ｈabor Ｌaboratory Ｐress ，Ｃold Ｓpring Ｈabor NY，1989に記載のように行う。実施例１：ヒト重合免疫グロブリン受容体ｃＤＮＡヒト重合免疫グロブリン受容体のｃＤＮＡ配列(pＩgＲ、配列番号１)は既知である(Ｋrajci et al.，Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun．(1989)，158，783 -789；Ｋrajci et al.，Ｈum．Ｇenet．(1991)，87，642-648；Ｐiskurich et a l.，Ｍol．Ｉmmunol．(1993)，30，413-421；配列番号１)。このようなｃＤＮＡは、遺伝子工学の標準法を使用して、例えば、pＩgＲを発現する組織サンプル( Ｋrajci et al.，1989，前掲)またはＨＴ２９(ATCC HTC-38，Ｐiskurich et al. ，Ｍol．Ｉmmunol．(1993)30，413-421)のような公的に入手可能な細胞系からのｍＲＮＡの逆転写により産生できる。クローンｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ混合物と公知のｃＤＮＡ配列を使用して設計されたプライマーから産生されたＰＣＲフラグメントとのハイブリダイゼーションにより同定できる。ｃＤＮＡは、Ｅ．coli内で増殖できるプラスミドベクターにクローン化する。プラスミドＤＮＡは、既知の方法(Ｓambrook et al.，Ｍolecular Ｃloning：Ａ laboratory manual，第２版，Ｃold Ｓpring Ｈabor Ｌaboratory Ｐress，Ｃo ld Ｓpring Ｈabor NY，1989)で製造され、ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を決定する。pＩgＲタンパク質前駆体の天然コード配列(配列番号２)はＡＴＧメチオニンコドンで開始し、ＴＡＧ停止コドンで終わる。コード配列中の明らかな特徴は：ａ）開始コドン直後の疎水性リーダー配列の存在(アミノ酸１−１８)およびｂ）細胞外アミノ末端部分をpＩgＲの細胞内カルボキシ末端部分と分ける、膜通過領域に対応する疎水性アミノ酸の第２の伸長(６３９−６６１) である。リーダーペプチドは、細胞膜の受容体タンパク質発現前に細胞内で前駆体ポリペプチドから開裂される。実施例２：ヒトpＩgＲｃＤＮＡのＰＣＲ変異誘発分泌成分をコードする人工ＤＮＡ分子を、ＰＣＲ変異誘発を使用して膜通過セグメントの直前に停止コドンを作ることにより製造する。この目的のために、プレーpＩgＲをコードするＤＮＡ配列に含まれる情報が充分であるが、所望により、分泌成分をコードするＤＮＡ分子を作るために、ＡＴＧ開始コドンの上流に位置するベクターＤＮＡ配列が使用できる。ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)は、２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーで行い、本明細書で前部および後部プライマーと呼ぶ(用語は、pＩgＲ翻訳リーディングフレームの方向に対応して各々のオリゴヌクレオチドにより開始される転写の方向に対応する)。前部ＰＣＲプライマーは、リーダーペプチドの機能的性質が残されるように選択する。これを達成するのに最も単純な方法は、天然リーダーペプチド配列を変えないことである。ＡＴＧコドンの上流のプライマー配列は、更に、適当な発現ベクターの制限部位と適合可能な制限部位を作るように、選択する。一つの好ましい制限部位は、制限エンドヌクレアーゼＨindIIIのもの、ＡＡＧＣＴＴである。ＰＣＲ修飾のために好ましいＤＮＡ分子は、ベクターｐＣＢ６にクローンされたpＩgＲｃＤＮＡである。このベクターにおいて、pＩgＲｃＤＮＡをヒトサイトメガロウイルスの主要即時初期プロモーターの下流にクローン化する。この場合、サイトメガロウイルスプロモーターセグメントにハイブリダイズしたプライマーを使用でき、開始部位とＡＴＧの間のベクターに既に存在する制限部位を残す。好ましいオリゴヌクレオチドプライマーは５'ＰＣＲプライマー１(配列番号５) である。オリゴヌクレオチドの設計に使用される第２の基準は、ＡＴＧコドンの周りの配列が、ＡＴＧからのタンパク質合成の開始が効率的であるようになっていることである。天然ｍＲＮＡのＡＴＧコドンの上流に見られるＤＮＡ配列は、天然条件下では限られた量のタンパク質しか必要とされないので、必ずしも最適ではない。最適開始効率の基準は既知である(Ｋozak et al.，Ｎucleic Ａcids Ｒes． (1987)，15，8125-8148；Ｐeabody Ｄ．Ｓ．in Ｓetlow Ｊ．Ｋ．ed．Ｇenetic Ｅngineering Ｖol．12，99-76頁)。ＡＴＧの直後のヌクレオチドがＧであることが好ましい。これは、天然pＩgＲのｃＤＮＡとは異なるが、前部ＰＣＲプラーマーをそれに応じて設計することにより達成できる。しかしながら、これは、第２のアミノ酸、ロイシンのコドンを、Ｇで始まる、バリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはグリシンをコードするものに変えることによってのみ達成できる。好ましいアミノ酸はバリンである。これは、量アミノ酸が疎水性アミノ酸クラスに属するので、保存的置換である。タンパク質の分泌促進におけるペプチドリーダー配列の機能的特性は保存される。ＡＴＧＧの直ぐ上流の好ましいＤＮＡ配列の一つはＣＣであり、従って、ＡＴＧコドンを、制限エンドヌクレアーゼＮcoＩの認識部位内、ＣＣＡＴＧＧに置く。このＮcoＩ部位は多くの効率的な発現ベクター内のＮcoＩ部位と適合する。ＡＴＧＧの直ぐ上流の他の好ましいＤＮＡ配列は、ＧＣＣＡＣＣである。ＡＴＧの上流にまたＨindIII部位を作る好ましい５'プライマーは、５'ＰＣＲプライマー２(配列番号６)である。後部プライマーは、二つの主な基準を考慮して設計する。第１は、pＩgＲタンパク質の疎水性膜通過セグメントのちょうど上流の１９０６位に停止コドンを産生するために働く。初期翻訳生産物は、従って、Ｓer−Ｇlu−Ｇlu−Ｇln−Ｇly −Ｇly−ＣＯＯＨで終了する。第２は、新規停止コドンの下流に、好適な発現ベクターの制限部位と適合する制限エンドヌクレアーゼ部位を作るために働く。一つの好ましい停止コドンはＴＧＡおよび好ましい制限部位は、好ましい３'ＰＣＲプライマー１(配列番号表７)により作られるようなＸbalのもの、ＴＣＴＡＧＡである。実施例３：ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡフラグメントは、実施例２に記載のように、特異的前部および３'ＰＣＲプライマーを使用して、熱安定ＤＮＡポリメラーゼにより、および鋳型としてのプラスミドベクターにクローン化されたpＩgＲｃＤＮＡをもって転写される。ＰＣＲ反応を(Ｓambrook et al.，Ｍolecular Ｃloning：Ａ laboratory manu al，第２版，Ｃold Ｓpring Ｈabor Ｌaboratory Ｐress，Ｃold Ｓpring Ｈabo r NY，1989に従い)、４つのデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートを含む緩衝溶液中で行い、温度は、ＳＣ−コードフラグメントのプライマー誘発転写の多重サイクルが行われるように、制御されたインキュベーションのものである。これは、２つのオリゴヌクレオチドプライマーのＤＮＡ配列で終了するＤＮＡフラグメントを製造する。ＳＣをコードするＨindIII−Ｘbalフラグメントは、第１にＳＣＤＮＡフラグメントをプライマーおよびＰＣＲ反応の他の成分から分離し、次いでこのＤＮＡをＨindIIIおよびＸbalで、完了まで消化させることによりこのＤＮＡフラグメントから産生する。続いて、１.９kb ＨindIII−Ｘbal フラグメントを制限酵素反応から精製し、制限発現ベクターＤＮＡへのライゲーションに準備ができる。この方法で、５'ＰＣＲプライマー１(配列番号５)および３'ＰＣＲプライマー１(配列番号１)で製造したＰＣＲ生産物は、ＳＣＤＮＡフラグメント１(配列番号３)と称する。この方法で、５'ＰＣＲプライマー２(配列番号６)および３'ＰＣＲプライマー１(配列番号７)で製造したＰＣＲ生産物は、ＳＣＤＮＡフラグメント２(配列番号４)と称する。実施例４：ゲネチシン耐性遺伝子を有するＳＣ発現ベクターの構築分泌成分(ＳＣ)をコードする人工ＤＮＡセグメントを、好適な哺乳類細胞発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ部位の間に挿入する。一つの好ましい発現ベクターはｐＣＢ６であり、その主な性質を表１に記載し、それは遺伝子工学の標準法で容易に合成できる：ｐＣＢ６またはpＩgＲｃＤＮＡを含むｐＣＢ６(pＣＢ６pＩgＲ)を完了するまでＨindIIIおよびＸbalで切断し、６.１kbフラグメントを単離する。このＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡリガーゼ１(バクテリオファージＴ４からまたはライゲーション活性を有する他の酵素から)を使用して、ＳＣＤＮＡフラグメント１にライゲートする。このライゲーション生産物を、Ｅ．coli ＤＨ５αを形質転換するのに使用し、アンピシリン耐性株を単離する。プラスミドＤＮＡを、このようなアンピシリン耐性株から単離し、ｐＣＢ６−ＳＣと名付ける。これは、ｐＣＢのような構造であるが、ｐＣＢ６の小さいＨindIII−Ｘbalフラグメントが１. ９kb ＳＣＤＮＡフラグメント１(実施例３)で置換されている。別の発現ベクターは、ヒトサイトメガロウイルスの主要即時初期プロモーターを、マウスサイトメガロウイルス(ｍＣＭＶ)由来のより強い主要即時初期プロモーターに置換して、ｐＣＢ６−ＳＣから構築する。このプロモーターは、１.１k b Ｐvul−ＨindIIIフラグメントとして、アンピシリン耐性遺伝子の開始と共に、プラスミドpCGA93D-PPPRN(Ａsselbergs et al.，Ｊ．Ｂiotechnol．(1994)，3 2，191-202)から得られる。並行して、ｐＣＢ６をＰvulおよびＨindIIIで切断し、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター以外およびｐＴＺ１８Ｒ−由来アンピシリン耐性以外、発現ベクターの全ての構造要素を含む(表１参照)最大フラグメント(６.１kb)を精製する。１.１kbおよび６.１kbフラグメントをライゲートし、ライゲーション生産物でＥ．coliを形質転換した後、プラスミドｐＭＣ−ＳＣ含有アンピシリン耐性コロニーを得る。ｐＭＣ−ＳＣは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターが、マウスのものに置換されている以外、ｐＣＢ−６(表１参照) と機能的に同等である。実施例５：ＳＣ発現プラスミドｐＣＧＡ９３Ｄ−ＳＣの構築分泌成分(ＳＣ)をコードする人工ＤＮＡセグメントを、好適な哺乳類細胞発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ部位の間に挿入する。一つの好ましい発現ベクターは、Ａsselbergs et al.，Ｊ．Ｂiotech．(1994)，32，191-202に従い構築されたpCGA93D-PPPENであり、その主要な特性を表２に記載する。ベクターpCGA93D-PPPENを、ＢamＨＩで完全に切断し、大きい４.９kbフラグメントを単離し、自己ライゲートし、Ｅ．coli ＤＨ５αの形質転換に使用する(プラスミドはpINTERMED1と名付ける)。アンピシリン耐性株から、プラスミドpINTE RMED1(４.９kb)を精製する。pINTERMED1において、プロレニンｃＤＮＡＨindIII およびＸbal部位は独特な制限部位である。pINTERMED1を、ＨindIIIおよびＸbal で完了するまで切断し、３.５kbフラグメントを単離する。このＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡリガーゼ２(バクテリオファージＴ４からまたはライゲーション活性を有する他の酵素から)を使用して、ＳＣＤＮＡフラグメント２(実施例３) にライゲートする。このライゲーション生産物を、Ｅ．coli ＤＨ５αを形質転換するのに使用し、アンピシリン耐性株を単離する。プラスミドＤＮＡを、このようなアンピシリン耐性株から単離し、pINTERMED2(６.８kb)と名付ける。pINTE RMED2をＳalＩおよびＸbalで完全に切断し、大きい(６.５kb)フラグメントを単離する。並行して、pCGA93D-PPRENを、ＳalＩおよびＸbalで完全に切断し、３. ３kbフラグメントを単離する。二つのＤＮＡフラグメントをライゲートし、生産物をＥ．coli ＤＨ５αの形質転換に使用する。アンピシリン耐性株から、このようにして得たpCGA93D-SCを単離する。pCGA93D-SCにおいて、ＳＣコードＤＮＡはＮcol部位で開始し、ＳＣのＡＴＧ開始コドンの周りのＤＮＡ配列は、組換えＳＣｍＲＮＡの翻訳を効率よく開始させる。実施例６：ｐＣＢ６−ＳＣまたはｐＭＣ−ＳＣで形質導入したCHO SSF3細胞中におけるヒト分泌成分の発現 CHO SSF 3細胞は既知である(Ｇandor Ｃ．Ｒ.，Ｅstablishment and characte rization of growth-factor-prototropic Ｃhinese hamster ovary（CHO）cell li #10087，Ｓwiss Ｆederal Ｉnstitute of Ｔechnology，1993)。細胞ストックは、更なる添加剤なしにＦＭＸ−８培地(Ｄr．Ｆ．Ｍessi Ｃell Ｃulture Ｔechn ol 導入を血清無しで行わなければならない場合、１００万から１０００万個の細胞を低速度で遠心してペレットにし、細胞を、２００,０００細胞／mlで、新鮮なＦＭＸ−８培地に３７℃で再懸濁する。別法において、CHO SSF 3細胞の濃密培養を、４％ウシ胎児血清含有ＦＭＸ−８培地で１０倍に希釈し、３cm直径の組織培養ペトリ皿に入れる。この方法で培養して、CHO SSF 3細胞は単層を形成し、それはペトリ皿のプラスチックに粘着する。この単層が３０−５０％コンフルエントな場合、それらを形質導入に使用できる。形質導入用溶液を、使用したカチオン性脂質およびカチオン性脂質とＤＮＡから形成された複合体の容器壁への吸着を防止するためポリスチレン溶液中で調製する。ｐＣＢ６−ＳＣ(実施例３)ＤＮＡを、以下のように形質導入用に製造する：プラスミドＤＮＡ４μgをＦＭＸ−８培地０.１mlに溶解する。別に、カチオン性脂質溶液(リポフェクチン、GIBCO)１４μlをＦＭＸ−８培地０.１mlで希釈する。次いで、ＤＮＡ溶液およびリポフェクチン溶液を注意深く混合し、室温で１５分インキュベートし、リポフェクチン−ＤＮＡ複合体の形成をさせる。無血清方法については、リポフェクチン−ＤＮＡ複合体をCHO SSF 3細胞懸濁液(最終量０.５ml)と混合し、ＣＯ₂インキュベーター(５％ＣＯ₂)中に３７℃で置く。１６時間後、ＦＭＸ−８１mlを細胞に添加し、インキュベーションを続ける。更に２４時間後、細胞を新鮮ＦＭＸ−８＋０.２５mg／mlゲネチシンで１０倍に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートに分け、３７℃でインキュベートし、約３週間インキュベーション後、濃密細胞成育がウェルの幾つかで検出される。このようなウェル由来の培地のアリコートを、ヒトＳＣの存在について評価する。ＳＣが検出されたウェル由来の細胞を大きい培養容器に移し、撹拌タンクバイオリアクターを接種するのに充分な細胞が得られるまで成育させる。別の方法においては、血清含有培地を吸引し、細胞を血清無しのＦＭＸ−８で洗浄し、血清無しのＦＭＸ−８培地０.３mlを添加する。この培地に、リポフェクチン−ＤＮＡ複合体溶液を添加し、細胞をＣＯ₂インキュベーター(５％ＣＯ₂) 中で、３７℃でインキュベートし、その後、４％血清含有ＦＭＸ−８１mlを添加する。２４時間後、細胞を、Ａsselbergs et al.，Ｊ．Ｂiotechnol．(1992) ，26，301-313に記載のように非希釈０.２５％ブタトリプシン(ＪＲＨＢioscie nces Ｌenexa，Ｋansas Ｕ.Ｓ.Ａ.)でトリプシン処理し、４％血清および１mg／ mlゲネチシン含有ＦＭＸ−８で２０倍に希釈し、ペトリ皿に入れる。２−３週間後、ゲネチシン耐性細胞のコロニーが成育し、それを個々に削り取り、２４ウェルマイクロタイタープレートに移す。血清無し、０.２５mg／mlゲネチシン含有ＦＭＸ−８を細胞に添加する。１週間後、ほとんどの非粘着細胞の濃密培養が発達する。各ウェルからの条件培地中のＳＣの濃度をELISA(実施例１０に記載のように)で測定し、高い量のＳＣが検出されたウェルからの細胞を大きい培養容器に移し、撹拌タンクバイオリアクターを接種するのに充分な細胞が得られるまで成育させる。ヒトＳＣを産生するCHO SSF 3の一つの細胞系をSSF3-HCS-1と名付け、撹拌タンクバイオリアクターでのヒトＳＣの産生に使用する。細胞集団は、一日に１０ μgＳＣ／１００万細胞以上を製造する。同様な方法を使用して、ｐＣＢ６−ＳＣの変わりにｐＭＣ−ＳＣで形質導入した細胞を得る。ヒトＳＣを産生する一つのｐＭＣ−ＳＣ形質導入CHO SSF3細胞系を、CHO-SSF3/pMC-SC3(DSM ACC2203)と名付け、撹拌バイオリアクター中のヒトＳＣの製造に使用する。この細胞集団は、一日に１０μgＳＣ／１００万細胞以上を製造する。実施例７：pCGA93D-SCで形質導入したCHO SSF 3細胞中におけるヒト分泌成分の発現 CHO SSF 3細胞およびリポフェクチン−ＤＮＡ複合体を、プラスミドｐＣＢ６ −ＳＣの変わりにプラスミドpCGA993DOSC(実施例５)を使用した以外、上記(実施例６)のように製造する。無血清方法については、リポフェクチン−ＤＮＡ複合体をCHO SSF 3細胞懸濁液(最終量０.５ml)と混合し、ＣＯ₂インキュベーター(５％ＣＯ₂)中に３７℃で置く。１６時間後、ＦＭＸ−８−マイナス(グリシン、ヒポキサンチンおよびチミジン非含有ＦＭＸ−８) １mlを細胞に添加し、インキュベーションを続ける。更に２４時間後、細胞を新鮮ＦＭＸ−８−マイナス＋５nＭメトトレキサートで１０倍に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートに分け、３７℃でインキュベートし、約３週間インキュベーション後、濃密細胞成育がウェルの幾つかで検出される。このようなウェル由来の培地のアリコートを、ヒトＳＣの存在について評価する。ＳＣが検出されたウェル由来の細胞を大きい培養容器に移し、増加したメトトレキサート耐性を有する細胞系を選択するのに充分な細胞が得られるまで(実施例８)または撹拌タンクバイオリアクターを接種するのに充分な細胞が得られるまで成育させる。別の方法においては、血清含有培地を吸引し、細胞を血清無しのＦＭＸ−８で洗浄し、血清無しのＦＭＸ−８培地０.３mlを添加する。この培地に、リポフェクチン−ＤＮＡ複合体溶液を添加し、細胞をＣＯ₂インキュベーター(５％ＣＯ₂) 中で、３７℃でインキュベートし、その後、４％血清含有ＦＭＸ−８−マイナス１mlを添加する。２４時間後、細胞をトリプシン処理し、４％透析血清および５ nＭメトトレキサート含有ＦＭＸ−８−マイナスで２０倍に希釈し、ペトリ皿に入れる。２−３週間後、ゲネチシン耐性細胞のコロニーが成育し、それを個々に削り取り、２４ウェルマイクロタイタープレートに移す。血清無し、５nＭメトトレキサート含有ＦＭＸ−８−マイナスを細胞に添加する。１週間後、ほとんどの非粘着細胞の濃密培養が発達する。各ウェルからの条件培地中のＳＣの濃度を測定し、高い量のＳＣが検出されたウェルからの細胞を大きい培養容器に移し、増加したメトトレキサート耐性を有する細胞系を選択するのに充分な細胞が得られるまで(実施例８)または撹拌タンクバイオリアクターに接種するのに充分な細胞が得られるまで成育させる。ヒトＳＣを産生する一つのCHO SSF 3細胞系をSSF-HSC-M1と名付け、撹拌タンクバイトリアクター中でのヒトＳＣの産生に使用する。この細胞集団は、一日に１０μgＳＣ／１００万細胞以上を製造する。実施例８：pCGA93D-SCのコピーの増加した数による、細胞系のメトトレキサート選択形質導入CHO SSF 3細胞の染色体に編入されたプラスミドＤＮＡの自然増幅を選択することは可能である。これを達成するために、５nＭメトトレキサートに耐性であることを選択した形質導入CHO SSF 3細胞を、徐々に濃度を増加したメトトレキサート中で副次培養する。形質導入と同様に、この工程は、無タンパク質培地または血清含有培地中で行うことができる。後者の方法が、高い濃度のメトトレキサートに耐性な細胞の個々のコロニーの単離が容易なため有利であるが、細胞は無タンパク質培地中で成育するように再適合させなければならない。これは、２週間の成長期間にわたり、血清を徐々に希釈除外することにより行う。無血清工程において、ＦＭＸ−８−マイナス(グリシン、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠くＦＭＸ−８)＋５nＭメトトレキサート中で培養した細胞を培地中で、約５００細胞／mlの細胞濃度まで、新しいメトトレキサート濃度で希釈し、幾つかの９６ウェルマイクロタイター培養皿に分割する。増幅の頻度は、約１／１００００であり、メトトレキサート濃度の僅かな上昇は、他の遺伝子変質よりむしろ遺伝子増幅による耐性の発達を助ける(Ｋaufman Ｒ．Ｊ.，Ｍethods in Ｅnzymology(1990)，185，537-566)。従って、選択は、最初の濃度の５nＭメトトレキサートの約２倍で開始する。２０ウェル中の約１つにおいて、増加したメトトレキサート耐性を有する細胞の濃密培養が、約２−３週間の期間にわたり発達する。このような細胞を大きい培養容器に移し、分泌成分の特異的製造の試験のために充分な細胞が得られるまで成長させる。より高い特異的ＳＣ製造の細胞は、より耐性の副次培養の２０−４０％の頻度で得られる。この選択工程を数回繰り返し、各回にメトトレキサートを１.５−２.５倍増加させる。５０−１５０nＭメトトレキサートの濃度に到達した場合、１０μg ＳＣ／１００万細胞／日以上を産生する細胞集団を得る。次いで、これらの細胞を、大規模ＳＣ製造のために好適なバイオリアクターに移す。別法において、細胞を、４％透析ウシ胎児血清および最初５nＭメトトレキサート含有ＦＭＸ−８−マイナス培地中でプラスチックに付着させて培養する。これらの細胞をトリプシン処理し、同じ培地であるが、高い濃度のメトトレキサートを含有する、幾つかの１０cm直径のペトリ皿(全量１０ml培地)中に２００００細胞／mlで再び置く。上記と同様に、選択を最初の濃度の５nＭメトトレキサートの約２倍で開始する。３週間後、より耐性な細胞のコロニーが発育し、それを個々に削り取り、同じ濃度のメトトレキサートの培地を含む多数個ウェル皿に移す。充分な細胞が得られた場合、ＳＣの特異的製造を測定する。非常に特異的ＳＣ製造の細胞が、より耐性な副次培養から、２０−４０％の頻度で得られる。この選択工程を数回繰り返し、各回にメトトレキサートを１.５−２.５倍増加させる。５０−１５０nＭメトトレキサートの濃度に到達した場合、１０μg ＳＣ／１００万細胞／日以上を産生する細胞集団を得る。このようにして得た細胞を、１−２週間の期間にわたり、血清濃度を徐々に減少させることにより、無タンパク質ＦＭＸ−８マイナス中での成育に再適合させる。次いで、これらの細胞を大規模ＳＣ製造のために好適なバイオリアクターに移す。実施例９：条件培地中の形質導入CHO SSF 3細胞のヒトＳＣのELISA検定ポリスチレンマイクロタイタープレートを、０.１mg／mlの静細菌性エチルメルクリチオサリチル酸エチルナトリウム含有、ＭｇＣｌ₂およびＣａＣｌ₂無しのＰＢＳ(GIBCO)中に溶解した、１００μl／ウェルの１０μg／mlウサギ抗−ヒトＳＣ免疫グロブリン(DAKO Code nr．A187)で一晩４℃でコートする。続いて、プレートを洗浄溶液：ＭｇＣｌ₂およびＣａＣｌ₂を欠き、０.０５％トゥイン−２０(EIA−グレード、BIORAD)および０.１mg／mlメルクリチオサリチル酸エチルナトリウム含有ＰＢＳで３回濯ぐ。ポリスチレンの非特異的タンパク質結合部位をブロッキング緩衝液：２％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、０.５％ウサギ血清および０.０５％トゥイン−２０含有ＰＢＳとインキュベーションすることにより中和する。続いて、プレートを３回洗浄溶液で濯ぐ。ブロッキング溶液で希釈されたＳＣ−含有溶液(条件培地、精製工程のカラムフラクション等)のサンプル１００μlを各ウェルに加え、一晩４℃でインキュベートする。続いて、プレートを３回洗浄溶液で濯ぐ。次に、ブロッキング緩衝液中の２５０ng／mlビオチニル化抗ヒトＳＣ免疫グロブリンを含む溶液５０μlを添加し、続いて室温で１時間インキュベーションする。このビオチニル化抗体を、ウサギ抗ヒトＳＣ免疫グロブリン(DAKO Code nr．A187)を、アミノヘキサノイル−ビオチン−ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル(Ｚymed)で、製造者の指示により処理することにより製造する。続いて、プレートを３回洗浄溶液で濯ぐ。次に、ブロッキング緩衝液で１０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(Ｚymed)に架橋したアビジン５０μlを添加し、続いて１時間室温でインキュベーションする。プレートを３回洗浄溶液で洗浄後、１５０μl／ウェルの酵素色素基質溶液、１.５mg／ml Ｏ −フェニルジアミン(SIGMA)および１μl／ml ３０％Ｈ₂Ｏ₂含有２１mg／mlクエン酸および３５.６mg／ml Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ４.５を添加する。３７℃で１５分後、酵素反応を０.５ＮＨ₂ＳＯ₄ ５０μl／ウェル添加することにより停止し、吸収を４９２nmで測定する。ＳＣの相対濃度(力価)を、特異単位(Ａ.Ｕ.)、すなわち、測定吸光度にサンプルの容量および希釈係数を掛けて計算する。あるいは、検定を、平行して精製組換えヒトＳＣの連続希釈を試験することにより標準化する。実施例１０：ＳＣのヒトＩｇＡへの結合のELISA検定ポリスチレンマイクロタイタープレートを、０.１mg／ml静細菌性メルクリチオサリチル酸エチルナトリウム含有、ＭｇＣｌ₂およびＣａＣｌ₂無しのＰＢＳ(G IBCO)に溶解した１０μg／ml ヒト血清アルブミン(陰性対照、Ｓigma A-6003) 、ヒトＩｇＧ(Ｓigma I-4506)、ＩｇＭ(Sigma I-8640)、ＩｇＡ(Sigma I-0633) またはウサギ抗ヒトＳＣ免疫グロブリン(DAKO Code nr．A187)の何れかで、一晩４℃でコートする。続いて、プレートを洗浄溶液：ＭｇＣｌ₂およびＣａＣｌ₂を欠き、０.０５％トゥイン−２０(EIA−グレード、BIORAD)および０.１mg／mlメルクリチオサリチル酸エチルナトリウム含有ＰＢＳで３回濯ぐ。ポリスチレンの非特異的タンパク質結合部位をブロッキング緩衝液：２％ウシ血清アルブミン( ＢＳＡ)、０.５％ウサギ血清および０.０５％トゥイン−２０含有ＰＢＳとインキュベーションすることにより中和する。続いて、プレートを３回洗浄溶液で濯ぐ。ブロッキング溶液で希釈されたＳＣ−含有溶液のサンプル１００μlを各ウェルに加え、一晩４℃でインキュベートする。続いて、プレートを３回洗浄溶液で濯ぐ。次に、ブロッキング緩衝液中の２５０ng／mlビオチニル化抗ヒトＳＣ免疫グロブリンを含む溶液５０μlを添加し、続いて室温で１時間インキュベーションする。このビオチニル化抗体を、ウサギ抗ヒトＳＣ免疫グロブリン(DAKO Code nr．A187)を、アミノヘキサノイル−ビオチン−ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル(Ｚymed)で、製造者の指示により処理することにより製造する。続いて、プレートを３回洗浄溶液で濯ぐ。次に、ブロッキング緩衝液で１０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(Ｚymed)に架橋したアビジン５０μlを添加し、続いて１時間室温でインキュベーションする。プレートを３回洗浄溶液で洗浄後、１５０μl／ウェルの酵素色素基質溶液、１５mg／ml Ｏ−フェニルジアミン(SIGMA)および１μl／ml ３０％Ｈ₂Ｏ₂含有２１mg／mlクエン酸および３５. ６mg／ml Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ４.５を添加する。３７℃で１５分後、酵素反応を０.５ＮＨ₂ＳＯ₄ ５０μl／ウェル添加することにより停止し、吸収を４９２nmで測定する。ＳＣの相対濃度(力価)を、特異単位(Ａ.Ｕ.)、すなわち、サンプル測定吸光度に容量および希釈係数を乗じて計算する。あるいは、検定を、平行して精製組換えヒトＳＣの連続希釈を試験することにより標準化する。実施例１１：血清および無タンパク質培養CHO SSF 3細胞における小試験的規模懸濁培養中のＩｇＡのＳＣの製造全ての培養を、海洋タイプインベラーを用いて、１０Ｌガラスバイオリアクター中で、懸濁反復段階的添加バッチ培養として行う。定常増殖期の開始により示される最大細胞密度および作業容量に到達した後、細胞懸濁液の９０％を回収し、残りの１０％を、新鮮培地で率１：１０に希釈する。工程を、温度、ｐＨおよびＰＯ₂のをオンライン制御ループで制御する。細胞濃度、細胞生存率および生産物濃度(最終濃度)をオフラインで測定する。基本培地はＦＭＸ−８から成る( Ｄr．造動態に関してはシアセンシティブであることが証明される。しかしながら、成長動態は僅かに影響を受けるだけである(下記参照)。培地に、従って、Ｐluroni c Ｆ−68(Ｐ−1300，SIGMA)を製造促進剤として添加する。二つの異なる培地形状を下記に比較する。実施例１１.１：ＦＭＸ−８培地でのバッチ培養バイオリアクターに１.２×１０⁵細胞／mlおよび２.５Ｌの作業容量を接種した後、細胞は９.８×１０⁵細胞／mlまで成育する。成育相の間、作業容量は、それぞれ４日後の新鮮培地３Ｌおよび７日後の新鮮培地２Ｌの添加により２倍に増加する。このバッチ培養は、培養９日後の最終作業容量８ＬおよびＩｇＡのＳＣの最終濃度１０９mg／Ｌをもたらす。細菌の平均倍増時間は２.８２日であり、ＩｇＡのＳＣに一日の収率は１２.１mg／Ｌ／日である。実施例１１.２：Pluronic F-68を添加したＦＭＸ−８培地でのバッチ培養ＦＭＸ−８培地に、製造促進剤として０.０５％(ｗ／ｖ)Pluronic F-68を添加する。バイオリアクターに２.３×１０⁵細胞／ml(実施例８から)および２.５Ｌの作業容量を接種した後、細胞は１.１×１０⁶細胞／mlまで成育する。成育相の間、作業容量は、それぞれ１日後の新鮮培地２.５Ｌ、３日後の３Ｌおよび４日後の１Ｌの添加により３倍に増加する。このバッチ培養は、培養９日後の最終作業容量９ＬおよびＩｇＡのＳＣの最終濃度２２９mg／Ｌをもたらす。細菌の平均倍増時間は２.２６日であり、Ｐluronic促進財を添加しない場合より２０％低いだけである。比較して、ＩｇＡのＳＣに一日の収率は３２.７mg／Ｌ／日で、促進剤を添加しない場合より３倍高い。実施例１２：Ｐluronic非存在下および存在下でチャイニーズハムスター卵巣細胞から製造されるヒト分泌成分残った細胞性バイオマスの除去後、ヒト分泌成分(ｈＳＣ)をＦＭＸ−８基本細胞培養培地から単離する。プロテアーゼ阻害剤、例えば、ＰＭＳＦ(２−プロパノール中に０.１Ｍ)およびＥ−６４(５０％(ｖ／ｖ)水性エタノール中に７mＭ) およびＮａＣｌを添加し、それぞれ最終濃度１mＭ、２.８μＭおよび０.５Ｍに調整し、ｐＨを４ＮＨＣｌで５.６に調節する。ＣａＣｌ₂およびＭｎＣｌ₂をそれぞれ最終濃度１mＭになるように添加した後、コンカナバリンＡセファロース(Ｐharmacia)スラリー１５０mlを添加し、一晩４℃で懸濁させる。固定化レクチンをガラスフィルター上に回収し、０.５ＭＮａＣｌ、１mＭＣａＣｌ₂および１mＭＭｎＣｌ₂(結合緩衝液)含有５mＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.６で洗浄し、２.６cm×３０cmカラム−ハウジングに詰める。コンカナバリンＡ−結合タンパク質を、０.５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド含有結合緩衝液で溶出する。ｈＳＣ−含有フラクションを濃縮し、０.１５ＭＮａＣｌおよび０. ０２％(ｗ／ｖ)ＮａＮ₃含有５０mＭ酢酸ナトリウムｐＨ５.５に対して、Ａmic onセルのＹＭ１０(登録商標)膜(AMICON)により限外濾過して透析する。更に、Ｓ ephacryl Ｓ−300(Ｐharmacia)のカラム(１.６cm×６１cm)でゲル透過クロマトグラフィーにより分画する。カラムを０.１５ＭＮａＣｌ含有５０mＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５で溶出し、溶出液を２７８nmで追跡する。ＳＤＳ／ＰＡＧＥで追跡してｈＳＣを含む主要ピークを回収し、ＡmiconセルのＹＭ１０膜を使用して超濾過して濃縮し、約２０mg／mlの濃度にする。約３５mgのｈＳＣを、ＩｇＧを標準として使用したＢio−Ｒadタンパク質検定を使用して測定して、細胞培養培地当たり単離する。最終調整物は、９５％を越える見かけの純度を示し、０.０２％(ｗ／ｖ)ＮａＮ₃存在下、４℃で貯蔵する。実施例１３：組換え可溶性Ｉｇ受容体(ｈＳＣ)の結晶化結晶化実験は、懸滴法を使用して行う。実施例１２由来の、１００mＭＮａＣｌ含有、ｐＨ５.５の１０mＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の濃度約５mｇ／mlのＳＣ溶液２μlを、等量の沈殿剤緩衝液と混合する。沈殿剤緩衝液は：Ａ）０.１ＭＮａ−クエン酸、１.０Ｍリン酸アンモニウムおよび０.０２％ＮａＮ₃；またはＢ）０.１ＭＨＥＰＥＳ、１.５Ｍ (Ｌｉ)₂ＳＯ₄および０.０２％ＮａＮ₃である。タンパク質および沈殿剤溶液をガラスカバースライド上で混合する。対応する沈殿剤緩衝溶液(貯蔵物)１０００μlをＬinbroプレートのウェルの上に置く。タンパク質の懸滴のガラスカバースライドをウェルの上に置く。蒸気相を経由した貯蔵物と懸滴の間の沈殿剤の濃度の平衡化が、室温で数週間内に起こる。この期間の間、ｈＳＣのプレート様結晶が滴中に出現する。実施例１４：組換え可溶性重合化Ｉｇ受容体(ｈＳＣ)のシアル酸分析シアル酸分析は、本質的に、Ｈarra et al.，Ａnal．Ｂiochem．(1989)，179 ，162-166に記載のように行う。０.１５Ｍ塩化ナトリウム含有０.０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５１０μl中の組換え可溶性ポリＩｇ受容体(ｈＳＣ)の２３６μgのアリコートを減圧下で乾燥し、２Ｍ酢酸２００μlに溶解し、３時間８０℃で加熱する。遊離シアル酸を、０.７５Ｍ β−メルカプトエタノールおよび１８mＭジチオン酸ナトリウム含有１.４Ｍ酢酸中の７.０mＭ１,２−ジアミノ−４,５−メチレンジオキシベンゼン(ＤＭＢ)２００μlを、５０℃で２. ５時間添加することにより蛍光誘導体に変換する。Ｎ−アセチルノイラミン酸( Ｎeu５Ａc，Ｓigma)、Ｎ−グリコイルノイラミン酸(Ｎeu５Ｇc，Ｓigma)、ヒト血清トランスフェリン(ｈＳＴ，Ｓerva)、ウシ糖タンパク質フラクションVI(bＧＰ，Ｍiles Ｌaboratories)およびＮeu５Ａc、Ｎeu５Ｇc、Ｎ−アセチル−７− Ｏ−アセチルノイラミン酸(Ｎeu５,７Ａc₂)、Ｎ−グリコイル−９−Ｏ−アセチルノイラミン酸(Ｎeu９Ａc₅Ｇc)、Ｎ−アセチル−９−Ｏ−アセチルノイラミン酸(Ｎeu５,９Ａc₂)、Ｎ−アセチル−７(８),９−ジ−Ｏ−アセチルノイラミン酸 (Ｎeu５,７(８),９Ａc₃)(Ｏxford Ｇlycosystems)の混合物を、標準として工程中に取り入れる。ＨＰＬＣ分析を、２つのモデル、ＷＩＳＰモデル７１２サンプル処理機、モデル４９０プログラム可能多重波長検出機の５１０ＨＰＬＣポンプおよび、カットオフフィルターを使用して波長＞４１８nmで発光を検出する励起波長３７３nmで作動させるＫratos ＧＭ 970蛍光検出機を備えたＷaters 840クロマトグラフィーシステムを備えたＷaters Ｎovapak Ｃ¹⁸ ４−μm(６０Å)カラム(３.９×１５０mm)で行う。同時に、溶出液の吸光を３７３nmの波長で追跡する。溶出を、アセトニトリル：メタノール：水(６.４：４.９：８８.７、ｖ／ｖ／ｖ)を溶出液として、流速０.７ml／分でアイソクラティックに行う。ｈＳＴおよびｂＧＰ由来のＤＭＢシアル酸のＨＰＬＣプロフィールで、ｈＳＴについてはＮeu５Ａcのみ(Ｓpik et al.，FEBS Ｌett．(1975)，50，296-299およびＨokke et al.，FEBS Lett．(1990)，275，9-14に記載のように)およびｂＧＰについてはＮeu５ＧcおよびＮeu５Ａcの混合物が１.０：１.０の比率で示される。ｈＳＣ由来のＤＭＢシアル酸のＨＰＬＣパターンは、それぞれ、Ｎeu５Ｇc およびＮeu５Ａcの溶出位置でピークを示す。ｈＳＣのＮeu５Ａcの含量は、９９ .９％以上およびＮeu５Ｇcのは０.１％以下である。寄託以下の微生物株を、ドイツェ・サムルング・フォン・ミクロオルガニズメン( ＤＳＭ)、デー−３７１２４ブラウンシュヴェイグ、マシェロダーヴェーグ１ベー番に寄託した(受託番号および寄託日は)：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ライスト，クリスティアンスイス、ツェーハー−5073ギップフ−オーバーフリック、ホファッケルシュトラーセ７番 (72)発明者グリュッター，マルクススイス、ツェーハー−4146ホッホヴァルト、ネッテンベルクシュトラーセ１番

Claims

【特許請求の範囲】１．分泌成分またはその機能的フラグメントをコードするＤＮＡを含むベクターで形質導入したCHO SSF 3細胞を培養し、発現タンパク質を培養培地から単離することを含む工程により得られる、組換え分泌成分(ｒＳＣ)またはその機能的フラグメント。２．全シアル酸に関して０.５％より低いＮ−グリコリルノイラミン酸の含量を有する、請求項１記載の分泌成分。３．ａ）分泌成分またはその機能的フラグメントを発現できるベクターの構築；ｂ）該ベクターによるCHO SSF 3細胞の形質導入；ｃ）形質導入細胞の培養；およびｄ）培養培地からの分泌成分またはそのフラグメントの単離を含む、請求項１記載の分泌成分またはその機能的フラグメントの製造法。４．ベクターが分泌成分の可溶性フラグメントを発現できる、請求項３記載の方法。５．ベクターが配列番号３および配列番号４に記載の分泌成分の機能的フラグメントを含む、請求項３記載の方法。６．ベクターが哺乳類発現ベクターである、請求項３記載の方法。７．ベクターがｐＣＢ６またはpCGA93D-PPRENに基づくものである、請求項３記載の方法。８．ベクターがｐＣＢ６−ＳＣ、ｐＭＣ−ＳＣまたはpCGA93D-SCである、請求項３記載の方法。９．ベクターがCHO SSF 3細胞の染色体へ統合されている、請求項３記載の方法。１０．増幅された統合ベクターＤＮＡを有する形質導入CHO SSF 3細胞を選択する、請求項９記載の方法。１１．細胞を無血清培地で培養する、請求項３記載の方法。１２．生産性増加のために、Ｐluronic(登録商標)を培養培地へ添加する、請求項３記載の方法。１３．分泌成分またはその機能的フラグメントの溶液を、沈殿剤緩衝液を含む溶液に入れ、溶液および緩衝液を分離することを含む、分泌成分またはそのフラグメントの結晶化法。１４．分泌成分またはその機能的フラグメントの溶液が沈殿剤緩衝液を含む、請求項１３記載の方法。１５．沈殿剤緩衝液がＮａ−クエン酸、ＨＥＰＥＳ、ＮａＮ₃、リン酸アンモニウムおよび／またはＬｉ₂ＳＯ₄を含む、請求項１３記載の方法。１６．沈殿剤緩衝液がＮａ−クエン酸、ＮａＮ₃およびリン酸アンモニウム；またはＨＥＰＥＳ、ＮａＮ₃およびＬｉ₂ＳＯ₄を含む、請求項１３記載の方法。１７．分泌成分またはその機能的フラグメントが、懸滴法で沈殿剤緩衝液に置かれている、請求項１３記載の方法。１８．請求項１記載のｒＳＣの処置法への使用。１９．三次元構造の決定への、請求項１記載の結晶化ｒＳＣの使用。２０．結合研究への請求項１記載のｒＳＣの使用。２１．化合物のポリ−Ｉｇ結合への影響の能力のスクリーニングにおける請求項１記載のｒＳＣの使用。２２．ＳＣ媒介ＩｇＡ輸送のアンタゴニストまたはアゴニストの同定への請求項１記載のｒＳＣの使用。２３．固体担体に固定化されたもしくはビオチンまたは放射活性、蛍光または化学発光基を有する、請求項１記載の修飾ｒＳＣ。２４．請求項１記載のｒＳＣを使用して同定されたアンタゴニストまたはアゴニストの処置法における使用。２５．請求項１９に従った三次元構造を使用して同定されたアンタゴニストまたはアゴニストの処置法における使用。