JP2001514851A - 有利なグリコシル化プロフィルを有する組換えヒトエリスロポエチン - Google Patents
有利なグリコシル化プロフィルを有する組換えヒトエリスロポエチンInfo
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Abstract
Description
、改変されたグリコシル化プロフィルのため改良された生体内の半減期と生体活
性を持っているポリペプチドに関する。本発明はまた、真核宿主細胞におけるD
NA塩基配列の発現を可能とする調節要素に有効に連結された前述のポリペプチ
ドのアミノ酸配列をコードするDNA塩基配列、およびそのようなDNA塩基配
列を包括するベクターを提供する。本発明はまた、 前述のDNA塩基配列とベ クターを含む宿主細胞および前述のポリペプチドの生産のためのそれらの用途に
関する。その上、本発明は前述のポリペプチド、DNA塩基配列およびベクター
を含んでいる医薬および診断組成物に関する。本発明はまた、エリスロポエチン
の不足によって引き起こされるすべての種類の貧血を処置するための医薬組成物
の調製のための前述のポリペプチド、DNA塩基配列およびベクターの使用に関
する。
ヘモグロビンでいっぱいな状態で詰まっていて、実際に普通の細胞オルガネラの
いずれも含んでいない。成人の哺乳動物の赤血球では、核、小胞体、ミトコンド
リア、およびリボゾームさえ存在せず、その発育の間に細胞から押出されている
。したがって、赤血球は増殖および分裂することはできない;より多くの赤血球
を作る唯一の可能な方法は幹細胞によってである。その上、赤血球はヒトでおよ
そ120日間の限られた寿命である。古くなった赤血球はヒト1人当たり1日当
たり1011以上の老化した赤血球を取り除く肝臓と脾臓のマクロファージによっ
て食作用されて、消化される。酸素の不足か、または赤血球の不足が腎臓の中の
細胞を刺激して血流に増加したエリスロポエチンの量を生合成して分泌する。エ
リスロポエチンは順番により多くの赤血球の生産を刺激する。血中への新しい赤
血球の放出の速度変化は血中でのエリスロポエチンレベルの増加後の1日か2日
のように早く観測されるので、このホルモンは成熟した赤血球の非常に近い前駆
体である細胞に作用しているのに相異ない。エリスロポエチンに応答する細胞は
エリスロポエチンの存在下での半固体基質の中の骨髄細胞を培養することによっ
て確認することができる。数日中におよそ60の赤血球のコロニーが現れ、各々
は単独始動した赤血球前駆細胞単の近くで見出された。この細胞は赤血球コロニ
ー形成細胞、またはCFC−Eとして知られていて、およそ6回またはそれ以下
の分裂サイクル後に成熟した赤血球を生じる。このCFC−Esはまだヘモグロ
ビンを含まず、それらはその増殖がエリスロポエチンに依存しない初期のタイプ
の前駆細胞から得られる。CFC−Es自体はそれらの増殖と同様、生存のため
にエリスロポエチンに依存している:すなわち、もしもエリスロポエチンが培養
液から除去されると、細胞は急速にプログラムされた細胞死を受ける。他のコロ
ニー刺激因子としてのエリスロポエチンは特定の細胞膜表面レセプターに結合す
ることによって低濃度(およそ10-12M)で作用する糖蛋白質である。これら のレセプターは、通常、二つ以上のサブユニットで構成され、その一つがいくつ
かのレセプタータイプ中で頻繁に共有される、いわゆる「サイトカインレセプタ
ーファミリー」という大きなレセプターファミリーに所属している。成熟したヒ
トエリスロポエチンは34〜38kDの分子量をもつ糖蛋白質であり、166のア
ミノ酸(AS)から成り、グリコシル残基は分子量のおよそ40%を占める。エ
リスロポエチンが赤血球の再生に要求されるので、このホルモンは特に、例えば
透析、または細胞増殖の抑制に基づく治療の結果として、または先天性または後
天性エリスロポエチン生産不足によって生じる赤血球の前駆体細胞の減少を通し
て、引き起こされる赤血球の数の減少による貧血と低酸素症に罹っている患者に
とって生活の質に影響を及ぼすために不可欠である。エリスロポエチンをコード
しているヒトの遺伝子の同定により、非相同宿主細胞中でのこのタンパク質の組
換えによる発現や、記載された病気の治療のための十分な量の組換え型のヒトエ
リスロポエチン(rhuEpo)を供給することが可能となった。
oは動物への適用でどんな効果も示さない。それにもかかわらず、これはレセプ ターに結合して、前駆体細胞を刺激する。生体内のアシアロ−Epoの活性減少は 、脱シアルEpoで影響されやすいガラクトシル残基のために特異性があるレセプ ターを通して肝臓で除去されるという事実で説明することができる。
ないが、分化や赤血球への前駆体細胞の分化や分裂の割合を刺激するものである
。何人かの患者で見つけられるEpoのさらにその他の副作用は血小板形成のため の巨核球の刺激である。したがって、すぐに中止されなければならないEpoによ る治療中の血栓症の潜在的危険がある。この場合、使用されるEpoのより高い特 異性が望まして。
いるrhuEpoを提供することである。上記の技術的な課題の解決は、請求項で特徴
付けられる態様を提供することによって達成される。
グロビン生合成または鉄の取り込みを増加させる生物学的性質を有するエリスロ
ポエチンの一次構造の配置の一部またはすべてを持っているポリペプチドに関し
、このポリペプチドは外来DNA塩基配列の真核での発現の産物であり、そして
以下の生理化学的性質を有している: (i) そのアミノ酸配列はSEQ ID No.1で与えられたアミノ酸配列、またはコ
ンセンサスN−連結グリコシル化部位の少なくともひとつが、コンセンサスN−
連結グリコシル化部位以外のものに修飾されているSEQ ID No.1で与えられたア
ミノ酸配列のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加および(または)変換による断
片または誘導体を含む; (ii) それはグリコシル化されている; (iii) N−グリカン構造の5%より多くが硫酸化されている;そして (iv) N−グリコシル化部位の数に対する総N−グリカン電荷Zの比率Z*は 170より大である。
Asn 83)を有している1)。これらの糖残基の適切なシアル化が生体内の半減期お
よびその次のEpoの効力に重要であることが証明された2)。その上、rhuEpoの異 なったグリコシル化部位が糖鎖の構造とシアル化の複雑さ関し異なってグリコシ
ル化されることが証明された7.8)。遺伝子工学によるグリコムテインの分析によ
り、グリコムテインrhuEpo(Gln24)(SEQ ID NO.:2)を生じるrhuEpo分子(SEQ
ID NO.:1)のグリコシル化部位Asn24の除去は発現及び生体内の効果の両方に
有利であることが示された4)。驚くべきことに、硫酸化N−グリカン構造および
グリコシル化部位あたりのN−グリカン電荷数に関する改変されたグリコシル化
プロフィルを有するrhuEpoは、今までのところ記述されているrhuEpoかいずれか
他のrhuEpoグリコムテインと比較して改善された生体内半減期および生物学的活
性を有することが見いだされた。本発明は、CHO細胞中のウシ乳頭腫ウイルス 1(BPV-1)ベクターpHOEBE 40-7の調整要素のコントロール下で対応するDNA
塩基配列の発現によって、ムテインrhuEpo(Gln24)(SEQ ID NO.:2)のグリコ シル化プロフィルがさらに改良されるという知見に基づくものである。一つのN
−グリコシル部位を欠失しているけれども、ポリペプチド(SEQ ID No:2)はr
huEpo(野生型)より高く、そして以前に記述されたrhuEpo(Gln24)4.5.6)より
さらに高い総電荷数を有し、顕著に高いZ*を生じる(実施例9の表IIを参照) 。本発明のポリペプチドは、肝臓に特異的なアシアロガラクトシルレセプターに
よる分子のクリアランスを減少させるようなグリコシル部位あたりのシアル化/
硫酸化糖構造を多い量で有している。その上、rhuEpo(野生型)のある適用量の
同じ生物学的効果は本発明のポリペプチドのより低い適用量で得られる(図1B
参照)。さらに、ヒトの尿のEpoが、硫酸化されたオリゴ糖9)をかなりの量で含 んでいることが発見されたので、本発明のポリペプチドは、これまで利用可能で
あったその他のrhuEpoのいずれよりヒトの尿のEpoにさらに類似している。
製する可能性があり、例えば基本的なDNAの部位特異的突然変異による単一お
よび(または)多数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加および(または)交換
によってさまざまに修飾される。組換えDNA技術は当業者によく知られている
。これに含まれるのは、骨髄細胞に赤血球と赤血球の生産を増加させ、かつヘモ
グロビン生合成または鉄の取り込みを増加させて必須のグリコシル化プロフィル
を保持している生物活性を有する、すなわちN−グリカン構造の5%を超えて硫
酸化されていて、そしてN−グリコシル化部位の数に対する総N−グリカン電荷
Zの比率Z*が170より大であるエリスロポエチンの一次構造配置を保有する 誘導体の調製である。
)異なったアミノ酸と置換したものである。 別の好まして態様では、コンセンサスN−グリコシル化部位の少なくとも一つ
は上述されたようにポリペプチドに付加される。 特に好ましい態様では、SEQ ID No:1で与えられているアミノ酸配列のアミ ノ酸位置24(Asn)のグリコシル化部位が、好ましくはSEQ ID No:1で示され
るアミノ酸配列の24の位置におけるアミノ酸Asnを、例えばSEQ ID No:2のア
ミノ酸配列に示されるアミノ酸Glnで置換することによって欠失したものである 。
位の数に対する総N−グリカン電位Zの比率Z*を有している。好ましい態様で はZ*は180より大、例えば183であり、望ましくは190より大、例えば 194である。
乳頭腫ウイルス1(BPV-1)の調節要素に機能的に作用するように連結された前 述のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA塩基配列に関する。本発明
の範囲内で実施された実験では、突然変異タンパク質rhuEpo(Gln24)がBPV-1発現
系を通してCHO細胞中で発現されるとき、グリコシル化パターンはpABE-40-7 発現ベクターを通してCHO細胞中で発現した突然変異タンパク質rhuEpo(Gln24
)とは著しく異なっていることが明らかなった(表IIの C3とC4/C5を参照
)。BPV-1発現系を使用して、rhuEpo(Gln24)はより高いシアル化と硫酸化を通し
て電荷のより高い新しい品質を包含している(表II参照)。予期された組換え型
のタンパク質以外にBPV-1発現ベクターは、例えば、宿主システムの細胞活性を 調節することができるトランス活性化因子等のような、さらにその他のいくつか
の機能的な活性を発現することができる。しかしながら、また、翻訳後の修飾、
例えばCHO細胞中のrhuEpo(Gln24)のグリコシル化または硫酸化のパターンを 明白に調節することができることは驚くべきことである。
遺伝子の調節要素を包含している。可能な調節要素に関するさらなる例はSV40プ
ロモーターとエンハンサー要素のようなウイルスの調節要素である。 本発明はまたベクター、望ましくは上述されたDNA塩基配列を含んでいる発
現ベクターに関する。 好ましい態様では、この発現ベクターは以下の実施例に記述するBPV-1ベクタ ーpPHOEBE-40-7である。
関する。宿主細胞の中に存在する本発明のDNA塩基配列またはベクターは、宿
主細胞のゲノムに組込まれているか、または外来染色体の何らかの形で維持され
ている。宿主細胞はCHO、BHK、C127i等のようないずれかの真核細胞
であってよい。好ましい宿主細胞はCHO細胞である。
前述のポリペプチドを単離することからなり、骨髄細胞に網状赤血球と赤血球の
生産を増加させ、ヘモグロビン生合成または鉄の取り込みを増加させるような生
物学的性質を持っているエリスロポエチンの一次構造配座の一部またはすべてを
持っている本発明のポリペプチドの生産方法である。使用される特異的な構造と
条件によって、ポリペプチドは細胞、培養液または両方から採取することができ
る。当業者にとって、自然なポリペプチドを発現させるだけではなく、融合タン
パク質としてポリペプチドを発現させることが可能であり、または培地などにポ
リペプチドの分泌を確実にする宿主細胞の特異的な分画にポリペプチドを指向す
るシグナル配列を付加することも可能であることがよく知られている。本発明の
ポリペプチドは、好ましくは、rhuEpo分子の上のhuEpo-レセプター結合部位に特
異的なモノクローナル抗体を使用して、アフィニティクロマトグラフィによって
精製される10)。そのようなモノクローナル抗体は、先行技術で知られている通 常の方法に従って得ることができる。
する。本発明のポリペプチドについて上述するような有利なグリコシル化プロフ
ィルをもたないが、網状赤血球と赤血球の生産を増加させ、かつヘモグロビン生
合成または鉄の取り込みを増加させるような骨髄細胞の生物学的性質を持ってい
るエリスロポエチンの一次構造の配置の一部分か、すべてを持っている同じポリ
ペプチドと比べて、本発明のポリペプチドはその増加した半減期と生体内の生物
活性によって特徴付けられる。
(または)ベクター単独または組み合わせ、そして場合によっては薬学的に許容
できる担体または医薬品添加物を含む医薬組成物に関する。適当な製剤担体に関
する例は当該技術でよく知られていて、燐酸塩緩衝生理食塩水、水、油と水の乳
剤のような乳剤、様々なタイプの湿潤剤、滅菌水などを含む。通常の方法によっ
てそのような担体を含む組成物は処方することができる。医薬組成物は適当な用
量で患者に投与することができる。用法・容量は患者の状態、病気のおもさや他
の臨床上の要素を考慮する主治医によって決定される。適当な用量は、例えば1
,000〜10,000単位、好ましくは3,000〜6,000単位、さらに好ま
しくは4,000単位である。ヘマトクリットの定期的な検査、網状赤血球の数 、赤血球の数、および患者の一般的な健康状態によって経過をモニターすること
ができる。適当な組成物の投与は様々な方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋
肉内、局所または皮内投与によって実施することができる。
は)ベクター、単独または組み合わせ、および場合によっては適当な検出手段を
含んでいる診断組成物に関する。前述の診断組成物は抗ヒトEpo抗体かEpoレセプ
ターを検出するための方法に使用することができる。診断組成物に含まれる本発
明のポリペプチドはペルオキシダーゼや99Tcなどのいずれかのレポーターシ
ステムと結合していてよい。
球の総数を増加するためのエリスロポエチンの不足によってが引き起こされるす
べての種類の貧血を治療するための医薬組成物の製造のために前述のポリペプチ
ド、DNA塩基配列および(または)ベクターの単独または組み合わせの使用に
関する。例えば、透析の間、赤血球が破壊され、そのために透析患者が貧血にな
る。これらの患者の腎臓がしばしば機能不全で、非機能的なので、適切なエリス
ロポエチン供給が保証されず、そのために透析患者は十分なrhuEpoレベルを提供
するためにrhuEpo治療を必要とし、これで破壊された赤血球を絶え間なく取り替
えることができる。
ルリンペット(keyhole limpet)のヘモシアニンおよび(または)エフェクター
システム、例えばリシンや99Tcなどに共有または非共有結合で結合していて
よい。
ールとして一緒にアッセイした。赤色コロニーの数を各サンプルについて2週間
の培養後に評価した。
ルとして一緒にアッセイした。赤色コロニーの数を各サンプルについて2週間の
培養後に評価した。 実施例により本発明を例証する。
るために、ACC Triplettを部位特異的変位によるEpoコード配列の最初のATGコド
ンの直接上流に挿入した。次に、ベクターpCES(BamHI--BglII断片)のrhuEpo(野
生型)コード配列を最適な転写開始部位をもつEpo配列によって交換し、発現ベ クターpHOEBE-40-1を得た。代わりに、突然変異タンパク質rhuEpo(Gln24)をコー
ドする配列は、コザック配列もまた含み、発現ベクター中にクローン化され、pH
OESE-40-7を生じた。さらなる実験で、pABE-40発現ベクターシステム4)をCHO
細胞中で発現させるために使用した。突然変異タンパク質配列とコザック(Kozak
)配列は部位特異的変異13)によって得られて、その配列はシークエンス解析によ
って確かめられた。BPV-1発現系pHOEBE-40-は異なった起源のDNA断片を含ん でいる。異なった要素は、
得られる2317bpのSalI−EcoRI断片は、アンピシリン耐性遺伝子(Amp) とバクテリアの複製の領域(E. coli ORI)を含んでいる; b) 逆配向のマウスのメタロチオネイン1(MT-1)プロモーターとマウスMT-1
遺伝子の3′非コード領域を含んでいる2801bpのEcoRI−BamHI断片。ク
ローン化方法のために、MT-1遺伝子の二つの部分がベクターpJYM14)の31bp(H
ind III--EcoRI)の短いpBR322由来の配列によって分割されている; c) rhuEpo(Gln24)のc−DNA(E40-7)7)を含む766bpのBamHI−Bql II 断片、および上流の最適化された翻訳開始部位。
片15); e) ウシ乳頭腫ウイルスBPV-1(100%のBPV-1ゲノムBamHI断片に対応) の総ゲノム配列を含む7953bpのBamHI−SalI断片16)。この配列が真核の 複製領域を含んで、約100bp(1の位置のHpaIサイトに隣接したBPV-1ゲノム の7900bp−52bp)の断片中に位置された。その上、その配列はBPV-1に特 異的な複製因子、転写因子および形質転換因子をコードしているオープンリーデ
ィングを含んでいる。これらの因子が翻訳後の修飾の過程を調節し得ることを示
唆している
amとVan der Ebによる方法17)を使用して実行された。一過性発現と分泌はrhuEp
o発現ベクターDNA(pABE-40-7)の10μg/mlのトランスフェクション後、24、
48および72時間後分析された。それぞれの一過性発現現実験において、SV40
プロモーター19.20)のコントロール下における端が欠けているヒトIgG1 Fc(rhu
IgG、Fc)のコードされた配列を持つベクターp4EGD18)を共トランスフェクション
し、そしてrhuEpoとrhu IgG、Fcの両方の発現率を、特異的なELISA21.10)を使用 して測定した。rhuEpo突然変異タンパク質の相対的な分泌はrhuEpo(野生型)とrh
u IgG, Fcの分泌率で標準化された(表I参照)。
G、Fc融合たんぱく質と関連してそれぞれ24、48、72時間でテストされた 。各トランスフェクションセットからの絶対分泌レベルの三回反復の測定(n=
3)の平均値を平均した。三回反復値の変動がrhuEpo/rhuEpo突然変異タンパク
質分泌またはrhuEpoRFc分泌(カラム2)のどちらかについて5%以下であった 。これらのデータから、IgG1Fc(100%Fc)に関連するrhuEpo発現ベクターは 各実験についてパーセント基準で計算された(カラム3)。これらの値から、rh
uEpo(Gln24)分泌レベルを各実験(カラム4)についてパーセント基準でrhuEpo (野生型)に関連して推定した。
G1 Fc発現レベル 一過性または安定したトランスフェクト培養液の上清をrhuEpoに特異的なELIS
A21.10)によってrhuEpo(野生型)またはrhuEpo突然変異タンパク質の含量をテ ストした。ポリクローナルウサギ抗血清に基づいて、このアッセイは以下の通り
実施された:マイクロタイタープレートを一晩、 ウサギの抗rhuepo免疫グロブ リン画分の1mlあたり500ngを用いてコーティングした。次にプレートを0. 01%のTween2Oを含んでいるPBSで3回洗い、37℃で風乾した。使用前に 、0.05%(w/v)のウシ血清アルブミン(BSA)を含んでいるPBSでプレート
は飽和状態にした。次に、プレートをPBS-Tween2Oで3回洗い、30分間上澄サ ンプルと共にインキュベートした。0.05%(w/v)のBSAを含んでいるPBS
で3回洗った後に、結合されたrhuEpoまたはrhuEpo突然変異タンパク質がペルオ
キシダーゼでラベルされたウサギの抗rhuEpo免疫グロブリン画分(Ig-POD)によ
って検出された。30分間インキュベーション後に、マイクロタイタープレート
は洗浄し、基質としてテトラメチルベンジジン(TMB)を使用して捕捉されてい
るrhuEpoに対応する残存ペルオキシダーゼ活性を発現させた。次に、反応をH2 SO4の添加で停止して、プレートをBehring ELISA Processor II(Behringwerk
e AG, Marburg, FRG)で測定した。一過性トランスフェクションされた細胞培養
液の上清は、異なったrhuEpo突然変異タンパク質の相対的な分泌を測定するため
にIgG1 Fcの分泌についてスクリーニングした。これに関しては、マイクロタイ タープレートはヤギの抗ヒトFcポリクローナル免疫グロブリン画分でコーティ
ングした。洗浄と飽和(上記参照)後に、プレートは1時間上清と共にインキュ
ベートした。そして、捕捉されているIgG1 Fc分子は上で記述されるペルオキシ ダーゼ(POD)によってラベルされたヤギ抗ヒトFc抗体によって検出された
。
レキセートに対して耐性をそれぞれ示している18)ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺 伝子を発現させるベクターpSV2 dhfrとの共トランスフェクションによって得ら れた。トランスフェクション後、培養液はメトトレキセートの存在下に選択され
た。2〜3週間後に、細胞コロニーが増殖して、単細胞クローンがクローニング
シリンダを用いるか限界希釈方法によってクローン化された。rhuEpo(Gln24)の 生産を実施例2で記述したように分析した。
された。エリスロポエチンを生産するために、それぞれの種ロットからの細胞は
集密するように回転びん中で拡大された。そして、増殖培地は無血清のDMEM
で置換し、生産期の終わりに採集した。
によってモノクローナル抗体146/0056を使用して得られた。この抗体はFibi10) に従ってセファロースCL48(Pharmacia, Uppsala, Sweden)と共有結合された。
pH9.5の1M Tris-HCl 1mlへのpH2.5における溶出後に、サンプルはPBS
pH7.0に対して透析された。タンパク質濃度はO.D. 280nmから計算されて 、製品の純度はポリアクリルアミドゲルでの分離およびその後の銀染色法(Phas
t System, Pharmacia)後に目視によりコントロールされた。
-Buchler, Braunschweig, FRGから入手)が用いられたのを除いてPhast System を使用して、SDS-PAGEとウェスタンブロット法操作は最近記述されたように10) 実施された。
の勾配精製された間期細胞は25分間、12℃で1分あたり2200回転におけ
る遠心沈殿後、集めた。その細胞を3回洗い、補助物と抗生物質としてセルトマ
イシン(certomycin)を含むMEM−アルファ培地で再懸濁した。その細胞数を
1.1×106/mlに調整し、そしてその細胞は4mlのrhuEpo培地(19.1ml F
CS/15.2mlトランスフェリン/BSA/FeCl3/13.7ml MEM−al
pha培地)および0.7ml寒天(約70℃)と混合した。テストサンプルの希釈を
含んでいる24穴の組織培養プレートに1穴あたり寒天細胞懸濁液の200μl
を加えた。培養液をテストサンプルと混合された。そして7%のC02と10% の02を含む大気圧で14日間、37℃でインキュベートした。
離が実施した。以前に記述された22)シアル化グリカンについてセットアップと 最適化された標準の勾配「S」を使用して、遊離されたN−グリカンプールをパ
ルスアンペロメトリー検出(HPAE-PAD)で高pHアニオン交換クロマトグラフィー
によって測定された。仮定のN−グリカン電荷ZはHermentin23.24)によって記 述されたように決定した。要するに、rhuEpoサンプルの仮定しているN−グリカ
ン電荷は、次の如くして得られた。
グループの面積%に、それぞれゼロ(アシアロ)、1(MS)、2(DiS)、3(TriS)、 .4(TetraS)、5(硫酸化)をかけること、そして
るアシアロ(as)、モノシアロ(MS)、ジシアロ(DiS)、トリシアロ(TriS)、テトラ シアロ(TetraS)、そして硫酸化領域でのそれぞれの面積(A)の積の合計と定義さ
れた。:
ようにして、Z*はN−グリコシル化部位あたりの電荷の数、そしてこれにより グリコシル化部位の電荷のグレードの推定値を与える。
ムC4とC5)の結果を表IIで比較する。
uEpo(BHK)が記述されたrhuEpoの炭水化物分析は、最近、Hokke25), Watson26)(C
HO-rhuEpoについて)およびNimtz7)(BHK-rhuepoについて)の研究で拡大された 。新しい方法によると、仮定のN−グリカン電荷ZはHermentin23.24)によって記
述されたように決定することができる場合がある。このパラメタが適切にシアル
化N−グリカンのためのシアル化中のN−グリカンの量の最高の評価を与えるこ
とが示された。rhuEpoのグリカンは0−3 LacNAc反復をもつ四分枝構造が主構 成成分であることが知られているので、Zは300〜400の仮定のN−グリカ
ン電荷数に達するべきである。実際に、CHO-rhuEpo(Boehringer Mannheim)の N−グリカン電荷はZ=364+/− 2(CV=0.6%)(n=6;それぞ れ二つのHPAE-PAD操作による三つの異なった実験)まで決定し、そして、BHK-rh
uEpo(Merckle)のN−グリカン電荷はZ=323の+/−2(CV=0.7%)( n=4;四つの異なったロット;四つの異なった実験;HPAE-PADはそれぞれ操作
する)まで決定した(表II参照24))。したがって、MerckleからのBHK-rhuEpoの
、より小さいZ値はシアル化中のN−グリカンのより大きな割合を明確に反映し
ていた:N−グリカンの34%は一つの末端シアル酸残基を失っていて、N−グ
リカンの12%は二つの末端のシアル酸残基を失っていた;その構造は40.9 %がテトラシアル化され、35.0%がトリシアル化され、21.1%がジシアル
化構造(Nimtz7)から成っていた。文献によるこれらのデータはZ=311、すな
わちZ=323の上のEq.1に従って決定しているN−グリカン電荷とよく一致 し(偏差4%)、Merckle由来の同じrhuEpo(BHK)を使用することでN−グリカン
電荷について計算することができた(表II参照)。Amgen由来のCHO-rhuEpoにお いて、主な(95%以上)二、三、四分枝構造は完全にシアル化された26)。そ れらのPNGase Fに遊離されたN−グリカン(Glycopak DEAEカラムを使用する) の電荷に従った分離によって、この研究で使用される(Z=364、表II参照)
N−グリカン電荷についてBoehringer Mannheim由来rhuEpo(CHO)のグリカン電荷
とよく一致したZ=367と計算することができた。対照的に、Organon Teknik
a由来CHO-rhuEpoを研究しているHokkeら25)の研究によれば、N−グリカンの1 8〜20%が一つのシアル酸残基を失っていることを示し、N−グリカンの3%
は二つのシアル酸残基を失っていた。それらの構造的な分析は、N−グリカン電
荷についてAmgen(Z=367)またはBoehringer(Z=364)由来のCHO-rhuEpoよりも かなり少ないZ=286までの計算が可能となった(表II参照24))。
緒にアッセイした。赤色コロニーの数を各サンプルについて2週間の培養後に評
価した。
にアッセイした。赤色コロニーの数を各サンプルについて2週間の培養後に評価
した。
Claims (23)
- 【請求項1】 骨髄細胞に、網状赤血球と赤血球の生産を増加させ、かつヘ
モグロビン生合成または鉄の取込みを増加させる生物学的性質を有する、エリス
ロポエチンの主要な構造的な立体配置の一部か全部を持っているポリペプチドで
あって、該ポリペプチドが外来DNA配列の真核生物での発現の産物であり、そ
して以下の生理化学的性質を持っているポリペプチド。 (i) そのアミノ酸配列はSEQ ID No.1で与えられたアミノ酸配列、またはコ
ンセンサスN−連結グリコシル化部位の少なくとも一つがコンセンサスN−連結
グリコシル化部位以外のものに修飾されているSEQ ID No.1で与えられたアミノ
酸配列のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加および(または)変換によるいずれ
かの断片またはその誘導体を含む; (ii) それはグリコシル化されている; (iii) N−グリカン構造の5%より多くが硫酸化される;そして (iv) N−グリコシル化部位の数に対する総N−グリカン電荷Zの比率Z*は 170より大である。 - 【請求項2】 コンセンサスN−連結グリコシル化部位の少なくとも一つが
欠失している請求項1記載のポリペプチド。 - 【請求項3】 コンセンサスN−連結グリコシル化部位の少なくとも一つが
異なったアミノ酸で交換されている請求項1または2記載のポリペプチド。 - 【請求項4】 コンセンサスN−連結グリコシル化部位の少なくとも一つが
付加されている請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 【請求項5】 SEQ ID No.1で与えられたアミノ酸配列のアミノ酸Asn24の グリコシル化部位が欠失されている請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項6】 SEQ ID No.1で示されるアミノ酸配列の24位のアミノ酸A
snがアミノ酸Glnと置換されている請求項1〜5のいずれか一項に記載のポ
リペプチド。 - 【請求項7】 SEQ ID No.2で示されるアミノ酸配列を持っている請求項6
記載のポリペプチ。 - 【請求項8】 Z*が180より大である請求項1〜7のいずれか一項に記 載のポリペプチド。
- 【請求項9】 Z*が190より大である請求項1〜8のいずれか一項に記 載のポリペプチド。
- 【請求項10】 真核宿主細胞中での前述のDNAの発現を可能とするウシ
乳頭腫ウイルス1(BPV−1)の調節要素に有効に連結された請求項1〜9の
いずれか一項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA塩基配列
。 - 【請求項11】 さらにメタロチオネイン1(MT−1)遺伝子の調節要素
を含む請求項10記載のDNA塩基配列。 - 【請求項12】 請求項10または11記載のDNA塩基配列を含む発現ベ
クター。 - 【請求項13】 BPV−1ベクターpHOEBE-40-7である請求項12記載の 発現ベクター。
- 【請求項14】 請求項10または11記載のDNA塩基配列、または請求
項12または13記載のベクターを含む真核宿主細胞。 - 【請求項15】 CHO細胞である請求項14記載の宿主細胞。
- 【請求項16】 骨髄細胞に網状赤血球と赤血球の生産を増加させ、そして
ヘモグロビン生合成または鉄の取込みを増加させる生物学的性質を有する、エリ
スロポエチンの一次構造の立体配置の一部分または全部を持っている請求項1〜
9のいずれか一項に定義されたポリペプチドの生産のための方法において、請求
項14または15記載の宿主細胞を培養し、そして場合によっては、培養物から
前記ポリペプチドを単離することを特徴とする上記の方法。 - 【請求項17】 請求項16記載の方法で入手可能なポリペプチド。
- 【請求項18】 以下の特性を示すことを特徴とする請求項1〜9か17の
いずれか一項に記載のポリペプチド。 (a) 生体内で増加した半減期;および(または) (b) 170より小さいZ*を持っている同じポリペプチドと比較して増加し た生物活性。 - 【請求項19】 請求項1〜9、17および18のいずれか一項に記載のポ
リペプチド、および場合によって、薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。 - 【請求項20】 請求項10または11記載のDNA塩基配列および(また
は)請求項12または13記載のベクター、および場合によって、薬学的に許容
できる担体を含む医薬組成物。 - 【請求項21】 請求項1〜9、17および18のいずれか一項に記載のポ
リペプチド、 および場合によって検出のための適当な方法を含む診断用組成物 。 - 【請求項22】 エリスロポエチンの不足で引き起こされるすべての種類の
貧血を処置するための医薬組成物の調製のための請求項1〜9、17および18
のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。 - 【請求項23】 エリスロポエチンの不足によって引き起こされるすべての
種類の貧血を処置するための医薬組成物の調製のための請求項10記載のDNA
塩基配列または請求項12または13記載のベクターの使用。
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