KR100328769B1 - 에리스로포이에틴유사체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적어도 하나의 부가 글리코실레이션 부위, 또는 적어도 하나의 글리코실레이션 부위의 재배열을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 기술한 것이다. 또한 본 발명은 상기 에리스로포이에틴 유사체를 암호화하는 DNA 시퀸스, 및 유사체 발현을 위한 재조합 플라스미드와 숙주세포에 관한 것이다.

Description

에리스로포이에틴 유사체

본원은 1992년 9월 8일자로 제출된 미국 특허 출원 제 07/942,126 호의 일부 계속 출원이다. 본 발명은 적어도 하나의 부가 글리코실레이션 부위나 적어도 하나의 글리코실레이션 부위의 재배열을 갖는 에리스로포이에틴 유사체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 에리스로포이에틴 유사체를 암호화하는 DNA 시퀀스, 및 유사체의 발현을 위한 재조합 플라스미드와 숙주세포에 관한 것이다.

발명의 배경

에리스로포이에틴(EPO)은 적혈구계 선조세포를 적혈구로 성숙시키는 당단백질 호르몬이다. 이것은 순환에 있어서 적혈구의 수준을 조절하는데 필수적이다. 자연 발생적인 에리스로포이에틴은 태아일 때는 간에서 생성되고 어른이 되면 신장에서 생성되며 혈액내로 순환되어 골수에서 적혈구 생성을 자극한다. 빈혈증은 거의 언제나 신장에서 에리스로포이에틴의 생성이 감소되어 나타나는 신부전의 결과이다. 에러스로포이에틴을 암호화하는 유전자로 형질전환된 숙주세포로부터 단백질 생성물을 발현하도록 하는 유전공학 기술에 의해 생성된 재조합 에리스로포이에틴이 만성 신부전으로 인한 빈혈증 치료에 사용될 때 유효하다고 밝혀졌다.

보통 인체 요에는 지수준의 에리스로포이에틴이 존재하나, 재생불량성빈혈로 고통받는 사람에게는 증가된 수준의 요에리스로포이에틴이 나타난다. Miyake 등의 in J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977) 문헌에 의한 인체 요에리스로포이에틴의 정제는 재생불량성빈혈증 환자의 요를 출발물질로 사용하는 것이다. 그러나, 현재까지 요에리스로포이에틴은 치료학적으로 유용하다고 보여지지 않고 있다.

에리스로포이에틴을 암호화하는 유전자의 확인, 클로닝, 및 발현에 관하여는 본원에서 참고문헌으로 인용한 Lin의 미국 특허 제 4,703,008호에 기술되어 있다. 세포배지로부터 재조합 에리스로포이에틴을 정제하는 방법은 Lai 등의 미국 특허 제 4,667,016 호에 기술되어 있다.

처음으로, 재조합 플라스미드 상의 에리스로포이에틴 유전자를 함유하는 포유동물 숙주세포로부터 생물학적 활성 재조합 에리스로포이에틴을 발현시키고 회수하여 치료적용에 적합한 유효량의 에리스로포이에틴을 제조하였다. 또한, 유전자 시퀀스의 인시 및 더 많은 양의 정제된 단백질의 유효성으로 이 단백질의 작용방식을 더 잘 이해할 수 있었다.

많은 세포 표면 및 진핵세포에 의해 생성된 분비단백질은 하나 또는 그 이상의 올리고당 그룹에 의해 변형된다. 글리코실레이션이라 부르는 이 변형은 단백질의 물리적 성질에 극적으로 영향을 미칠 수 있으며 또한 단백질의 안정성, 분비, 및 세포하 펀재에 중요할 수 있다. 적합한 글리코실레이션은 생물학적 활성에 필수적일 수 있다.

사실, 전핵 유기체의 다소의 유전자가 글리코실레이팅 단백질에 대한 세포과정(cellular process)이 결여된 박테리아(예를들어, E. coli)에서 발현되면, 글리코실레이션의 결여로 인해 활성이 적거나 없는 단백질이 산출된다.

글리코실레이션은 폴리펩티드 골격에 따른 특이위치에서 일어나며 이 위치는보통 다음 두 유형이다 :

O -결합 올리고당은 세린이나 트레오닌 잔기에 가해지는 반면 N -결합 올리고당은 아스파라긴 잔기에 가해지되 이는 이들이 시퀀스 Asn - X - Ser/Thr 의 일부일 때이며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산일 수 있다. 각 유형에서 발견되는 N -결합 및 O -결합 올리고당의 구조와 당 잔기는 상이하다. 두 유형에서 주로 발견되는 당의 한 형태는 N -아세틸뉴라민산(이후에는 시알산이라 언급함)이다. 시알산은 보통 N - 결합 및 O - 결합 올리고당 둘 다의 말단 잔기이며 음전하로 인해 당단백질에 산의 성질을 부여한다.

인체 요에서 유래된 에리스로포이에틴과 인체 에리스로포이에틴의 아미노산 시퀀스 1 - 165 를 갖는 재조합 에리스로포이에틴(포유동물 세포에서 발현됨) 둘 다 당단백질의 총 분자량의 약 40 % 를 함께 포함하는 세 개의 N -결합 올리고당과 한 개의 O -결합 올리고당을 함유한다. N -결합 글리코실레이션이 위치 24, 38 및 83에 위치한 아스파라긴 잔기에서 일어나는 반면 O -결합 글리코실례이션은 위치 126에 위치한 세린 잔기에시 일어난다 [Lai 등의 J Biol. chem. 261, 3116 (1986) : Broudy 등의 Arch. Biochem, Biophys. 265, 329 (1988) 참조]. 올리고당 사슬은 말단의 시알산 잔기에 의해 변형된다고 보여진다. 모든 시알산 잔기를 제거하기 위해 글리코실레이션된 에리스로포이에틴을 효소처리하면 결과적으로 생체 내 활성이 상실되나 시험관 내 활성에는 영향을 미치지 않는다[Lowy 등의 Nature 185, 102 (1960) : Goldwasser 등의 J. Biol. Chem. 249, 4202 (1974) 참조]. 이러한 반응은 간의 아시알로당단백질 결합 단백질과의 상호작용에 따른 순환으로부터 아시알로-에리스로포이에틴을 금속히 제거시킴으로서 설명되어 진다. [Morrell등의 J. Blol. chem. 243, 155 (1968) : Briggs 등의 Am. J. Pysiol. 227, 1385 (1974) ; Ashwell 등의 Methods Enzymol. 50, 287 (1978) 참조]. 따라서, 에리스로포이에틴은 간 결합 단백질에 의한 결합을 피하기 위해 시알산화될 때에만 생체 내 생물학적 활성을 가진다.

에리스로포이에틴의 올리고당 사슬의 다른 성분들의 역할은 충분히 정의되어 있지 않다. 부분적으로 탄글리코실레이션된 에리스로포이에틴은 글리코실레이션형에 비해 생체 내 활성도가 휠썬 감소되지만 시험관 내 활성도는 유지된다[Dordal 등의 Endocrinology 116, 2293 (1985) ; Lin 의 특허, 상기문헌 참조]. 그러나, 다른 연구에 있어, 글리코실레이션 부위인 아스파라긴이나 세린 잔기의 돌연변이유발로 N -결합 또는 O -결합 올리고당 사슬을 단독으로 제거하거나 함께 제거하면 포유동물세포에서 생성되는 상기 변형된 에리스로포이에틴의 시험관 내 활성도는 뚜렷이 감소한다[Dube 등의 J. Biol, chem. 263, 17516 (1988) 참조].

에리스로포이에틴과 같은 당단백질은 등전점전기이동(isoeleckric foeusing : IEF)과 각은 기술을 이용하여 서로 다른 전하형으로 분리될 수 있다. 여러 관계자들은 조(粗)에리스로포이에틴 및 부분적으로 정제한 에리스로포이에틴 제조물에 관한 IEF 연구보고를 가지고있다 [Lukowsky 등의 J. Bioehem 50, 909 (1972) ; Shelton 등의 Biochem. Med. 12, 45 (1975) ; Fuhr 등의 Biochem. Biophys- Res. Comm. 98, 930 (1981) 참조]. 이들 연구에서 에리스로포이에틴 활성도를 갖는, 많아야 세 개나 네 개의 분획이 IEF에 의해 식별되었으나 어느 것도 탄수화물 함량에관하여는 특정화되지 않았다. 또한, 상기 분획의 등전점과 그들의 생물학적 활성도 사이에는 어떠한 상관관계도 없었다.

Miyake 등의 상기문헌에 기술된 인체 요로부터 요 에리스로포이에틴을 정제하는 동안 히드록실아파타이트 크로마토그래피에서 수득한 II 와 IIIA 로 명명된 두 개의 에리스로포이에틴 분획이 유사한 고유활성도를 지니고 있음이 보고되었다.

분획 II 와 IIIA 의 후속적인 탄수화물 분석은 분획 II 가 분획 IIIA보다 더 많은 평균 시알산 함량을 가지고 있음을 나타냈다(Dordal 등의 상기문헌 참조).

본 발명의 목적은 규정 시알산 함량과 생물학적 활성도를 갖는 에리스로포이에틴의 분리된 동형(isoform)을 제공하는 것이다. 그러한 분자를 함유하는 제약학적 조성물은 치료상 유용할 것이다.

발명의 요약

본 발명은 적어도 하나의 부가 글리코실레이션 부위를 포함하는 아미노산 시퀀스를 함유하는 인체 에리스로포이에틴의 유사체에 관한 것이다. 부가 글리코실레이션 부위는 결과적으로 인체 에리스로포이에틴보다 더 많은 수의 탄수화물 사슬을 가지며, 더 많은 시알산 함량을 지닌다. 또한 본 발명은 적어도 하나의 글리코실레이션 부위의 재배열을 포함하는 아미노산 시퀀스를 함유하는 에리스로포이에틴 유사체를 제공한다. 또한, 에리스로포이에틴의 카르복시 말단에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 부가를 포함하는 유사체를 포함하며, 여기서 부가는 적어도 하나의 글리코실레이션 부위를 의미한다. 본 발명은 상기 에리스로포이에틴 유사제를 암호화하는 DNA 시퀀스, 및 유사제의 발현을 위한 재조합 플라스미드와 숙주세포도 포함한다.

제 1 도는 분리된 재조합 에리스로포이에틴 동형의 분석 등전점전기이동 겔을 나타낸 것이다. 겔 레인 1 - 11 은 레일 1 의 더 적은 산성 (더 높은 pI) 에서 레인 11 의 더 많은 산성 (더 낮은 pI) 까지의 동형을 나타낸다. 또한 동형 9 - 14의 혼합물을 함유하는 정제된 재조합 에리스로포이에틴도 겔의 왼쪽 레인과 오른쪽 레인의 멀리 떨어진 곳에 나타나 있다.

제 2 도는 에리스로포이에틴 동형당 시알산 수와 단위/mg 의 에리스로포이에틴 폴리펩티드로서 표현한 각 동형의 생체 내 고유활성도간의 관계를 나타낸 것이다. 제 2A도에서, 각 에리스로포이에틴 동형의 농도는 브라드포드 단백질 분석으로 측정하였고, 제 2B 도에서 농도는 280 nm 에서의 흡광도로 측정하였으며, 제 2C 도에서 농도는 RIA 로 측정하였다.

제 3 도는 상이한 조건하에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 제조된 재조합 에리스로포이에틴 동형의 규정 혼합물의 분석 등전점전기이동 겔을 나타낸 것이다. 겔 레인 1 - 6 은 각각, 150 mM 아세트산, pH 4.7, 150 mM 아세트산 (완충되지 않음), 200 mM 아세트산, pH 4.7, 250 mM 아세트산, pH 4.7, 300 mM 아세트산, pH 4.7 또는 300 mM 아세트산(완충되지 않음)으로 Q -세파로스 고속 흐름 컬럼(fast flow column)뜰 세척한 후 고 염 세척액으로 용리시킨 에리스로포이에틴 동형을 나타낸다. DEAE - 아가로스 크로마토그래피를 Q -세파로스 크로마토그래피로 대체한 것을 제외하고는, Lai 등의 문헌 실시예 2에 기술된 방법을 이용하여 수득한 동형 혼합물을 포함하는 정제된 재조합 에리스로포이에틴도 겔 왼쪽 레인의 멀리 떨어진 곳에 나타나 있다.

제 4도는 감소하는 pH와 증가하는 이온강도의 기울기의 Q -세파로스 컬럼에 적용한 세포 조정배지에서 수득한 에리스로포이에틴 동형 8 내지 12 의 분리를 나타낸 것이다. 분획 2 내지 분획 40 까지의 짝수 분획의 분취량을 분석 등전점전기이동시켰다. DEAE -아가로스 크로마토그래피를 Q -세파로스 크로마토그래피로 대체한 것을 제외하고는, Lai 등의 상기문헌 실시예 2 에 기술된 방법을 이용하여 수득한 동형 혼합물을 포함하는 정제된 재조합 에리스로포이에틴도 겔 왼쪽 레인의 멀리 떨어진 곳에 나타나 있다.

제 5 도는 인체 에리스로포이에틴의 아미노산 시퀀스를 나타낸 것이다. 네모는 N - 결합 탄수화물 사슬이 부가된 아스파라긴 잔기를 가리키고 별표는 O - 결합 탄수화물 사슬로 변형된 세린 잔기를 가리킨다.

제 6A, 6B, 및 6C도는 인제 에리스로포이에틴 유사체의 구성과 분석을 위한 플라스미드 생성에 사용된 일련의 클로닝 단계를 나타낸 것이다. 이들 유사체는 제 5 도에 도시된 바와 같이, 부가 글리코실레이션 부위를 제공하는 변형된 아미노산을 가진다.

제 7 도는 인체 시퀀스 에리스로포이에틴 및 제시된 에리스포이에틴 유사체의 COS 세포 상청액의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 유사체 [Asn⁹, Ser¹¹]EPO, [Asn⁶⁹]EPO, [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO, 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO 는 실시예 6 에기술된 대로 구성한 것이다. 또한 부가 탄수화물 사슬을 포함하지 않은 유사체 [Pro¹²⁵, Thr¹²⁷]EPO 와 [Asn¹²⁶, Ser¹²⁸]EPO 도 비교를 위해 나타나 있다.

제 8도는 N - 글리카나제로 처리한 후의 인체 시퀀스 에리스로포이에틴 및 제시된 에리스로포이에틴 유사체의 COS 세포 상청액의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 유사체 [Thr¹²⁵]EPO 와 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO 는 실시예 6 에 기술된 대로 구성하였다. 유사체 [Val¹²⁶]EPO, [Pro¹²⁴]EPO, [Pro¹²⁵]EPO, [Thr¹²⁷]EPO, [Pro¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO 및 [Thr¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO 는 비교를 위한 것이다.

제 9도는 [Thr¹²⁵] 돌연변이를 포함하는 에리스로포이에틴 cDNA로 형질감연된 CHO 세포의 성장을 지지하는 세포배지를 Q -세파로스 및 C4 역상 크로마토그래피하여 수득한 풀 2, 3 및 4의 등전점진기이동 겔을 나타낸 것이다. 동형 혼합물을 함유하는 정제된 재조합 에리스로포이에틴은 DEAE-아가로스 크로마토그래피를 Q - 세파로스 크로마토그래피로 대체한 것을 제외하고는, Lai 등의 상기문헌 실시예 2 에 기술된 방법을 이용하여 수득하였으며, 또한 겔의 왼쪽과 오른쪽 레인에 나타나 있다.

제 10 도는 재조합 인체 에리스로포이에틴(rHuEPO) 및 선택된 유사체의 COS 세포 상청액의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 유사체 N9, N14, N18, N19, N21, N24 및 N39 는 보다 느린 겔 이동성으로 입증된 바와 같이 적어도 하나의 부가 탄수화물 사슬을 가진다.

제 11 도는 N -글리카나제 소화작용 중의 재조합 인체 에리스로포이에틴 및 EPO N14 유사체의 COS 세포 상청액의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 시점은 0, 4, 12 및 45 분, 그리고 밤새 소화된 후로 선택하였다.

제 12도는 EPO N14 유사체 동형 제조물의 등전점전기이동 겔을 나타낸 것이다. 저 동형 풀은 분자당 대개 6 - 12 개의 시알산을 갖는 EPO N14 유사체를 포함하고, 중간 동형 풀은 분자당 대게 10 - 15 개의 시알산을 갖는 유사체 N14 를 포함하며, 고 동형 풀은 분자당 대개 12 - 17개의 시알산을 갖는 EPO N14 유사체를 포함한다.

제 13도는 재조합 인체 에리스로포이에틴, 분리된 동형 14 및 EPO N14 유사체 (동형 15 - 17) 을 쥐(rat)내로 정맥내주사한 후의 약동력학을 나타낸 것이다.

제 14도는 다양한 양의 비표지 rHuEPO, 분리된 동형 14 또는 EPO N14 유사체의 존재시 에리스로포이에틴 수용체에 결합하는¹²⁵I 표지 재조합 인체 에리스로포이에틴의 콜드(cold) 치환분석을 나타낸 것이다.

제 15도는 EPO N14 고 동형 풀(0.036 및 0.0712 ㎍), 분리된 동형 14 (0.036 및 0.0712 ㎍), EPO 177 저 동형 풀(0.0712 ㎍) 및 rHuEPO (0.071 ㎍)의 활성도를 비교한 쥐(mouse) 헤마토크리트(hematocrit) 실험을 나타낸 것이다.

본 발명은 에리스로포이에틴 동형을 제공한다. 본 발명에 따라 수득한 에리스로포이에틴의 특이 동형, 및 그들의 특성은 출발물질원에 따라 다양하다. 예를들어, 요 유래 인체 에리스로포이에틴의 동형은 재조합 에리스로포이에틴의 동형과 상이하다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 에리스로포이에틴 분자당 시알산의 특정수 (예를들어, 0 보다 큰 일정수)를 갖는 에리스로포이에틴 동형에 관한 것이며, 상기 수는 1 - 14중에서 선택한 것이다. 상기 수가 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14인 것이 유리하다. 다른 구체예에 있어서, 상기 수는 14 보다 크며, 16 - 23 인 것이 유리하다.

본원에서 사용된 용이 "에리스로포이에틴 동형" 이란 단일 등전점(pI)을 갖고, 동일한 아미노산 시퀀스를 갖는 에리스로포이에틴 제조물을 말한다. 용어 "에리스로포이에틴"은 자연발생적인 에리스로포이에틴, 망상적혈구와 적혈구의 생성을 증가시키도록 하는 골수세포의 생체 내 생물학적 특성을 가지도록 자연 발생적인 에리스로포이에틴의 폴리펩티드를 충분히 복제하는 아미노산과 글리코실레이션 부위를 갖는 비-자연 발생적인 폴리펩티드뿐만 아니라 요 유레 인체 에리스로포이에틴을 포함한다.

1 - 14 시알산을 갖는 에리스로포이에틴 분자에 상응하는 요 유래 인체 에리스로포이에틴의 아미노산 시퀀스를 가지는 재조합 에리스로포이에틴의 분리된 동형은 이 동형이 가지고 있는 시알산 수와 관련된 생체 내 활성도를 지니고 있음이 밝혀졌다.

바람직한 구체에에서, 에리스로포이에틴은 비 -인체 진핵 숙주 세포내로 형질감염된 외인성 DNA 시퀀스의 발현 생성물이다. 즉, 바람직한 구체예에서 에리스로포이에틴은 "재조합 에리스로포이에틴" 이다. 재조합 에리스로포이에턴은 본원에서 참고문헌으로 인용한 Lin의 미국 특허 제 4,703,008 호에 기술된 방법에 따라 유리하게 생성된다. 제조합 에리스로포이에틴은 본원에서 참고문헌으로 인용한 Lai 등의 미국 특허 제 4,667,016의 실시예 2 에 기술된 일반적인 방법에 따라 정제할 수 있다. 여기서 DEAE -아가로스 크로마토그래피를 Q -세파로스 크로마토그래피로 대체한다.

Lai 등의 상기문헌 실시예 2 에 따라 정제한 에리스로포이에틴을 IEF로 분석하면, 현저하게 6개의 동형을 포함한다.

또한, 실시예 4에 기술된 크로마토그래피 방법을 이용하여 더 많은 산성도를 가지는 적어도 하나의 부가 동형을 검출하였다(IEF 겔 상에서 >14 시알산으로 이동한, 보다 산성인 이러한 형태는 시알리다제 소화작용에 대한 전하중 다소의 내성에 의해 보여진 바와 같이 비시알산 음성 전하를 포함할 수도 있다). 이들 동형은 시알산 함량이 서로 다르다. 실시예에 제시된 바와 같이, 이것은 예비 IEF 로 이들 동형중 10 개를 분리하여 그들 중 5 개의 시알산 함량을 측정함으로써 입증된다. 시알산 함량을 분석한 동형중, 5개의 동형이 9, 10, 11, 12 또는 13개의 시알산 잔기를 함유했음이 밝혀졌다.

동형 5 내지 11 의 에리스로포이에틴 분자당 시알산 잔기수와 에리스로포이에틴의 생체 내 그 상대 고유활성도 사이에는 관계가 있다 (본원에서 에리스로포이에틴 분자당 시알산의 수로서 각 동형을 명명함). 동형 11 내지 14 는 대략 동일한 생체 내 상대 고유 활성도를 가진다. 동형 5 - 14 에 대해 익스하이폭식(exhypoxic) 다혈구증 쥐(mouse)생물검정으로 생체 내 활성도를 측정하고 각 동형의 양을 브라드포드 단백질 분석, 280 nm 에서의 흡광도 또는 에리스로포이에틴에 대한 방사선면역측정법(RIA)으로 측정하였다. 유닛/ml 로 표현한 RIA 측정치 [Egrie 등의 Immunobiology 172, 213, (1986) 참조]를 RIA로 측정한 정제된 에리스로포이에틴의 평균 고유활성도인 212,770 유닛/mg 에리스로포이에틴 폴리펩니드로 나누어 mg 에리스로포이에틴 폴리펩티드/ ml 로서 표현한 분리된 동형 또는 동형 혼합물의 단백질 농도를 결정한다. 실시예에 제시된 바와 같이, 생체 내 상대 고유활성도는 동형 5 에서 동형 11 로 점차적으로 증가한다 (표 2 참조).

본원의 생체 내 고유활성도는 생체 내 상대 고유활성도의 측정치이지 생체 내 절대 고유활성도의 측정치는 아니다. 본 출원의 목적을 위한 고유활성도는 단지 동일 측정법, 동일한 본질적 표준을 포함하는 동일조건, 동물의 동일유형, 고유활성도를 계산하기 위해 사용된 테이타의 동일분석, 단백질 함량을 결정하기 위한 동일분석법을 이용하여 측정한 동형의 상대 활성도를 비교하기 위해서만 사용된다. 모든 동형에 대해 기록된 모든 생체 내 고유활성도 값이 그 동형에 대한 고유값이나 절대값을 나타내는 것은 아니다.

또한 본 발명은 둘 또는 그 이상의 에리스로포이에틴 동형을 포함하는 조성물을 제공한다. 한 구체예에서 이 조성물은 에리스로포이에틴 분자당 시알산의 예정수보다 큰수, 예를들어 에리스로포이에틴 분자당 11 시알산보다 큰수, 또는 분자당 12 시알산보다 큰 수를 갖는 동형의 혼합물, 예를들어 동형 12, 13 및 14의 혼합물을 갖는 동형 혼합뭍을 포함한다. 다른 구체예에서 조성물은 에리스로포이에틴 분자당 시알산의 예정수, 예를들어 12 보다 작지만 분자당 8 시알산보다 큰 수를갖는 동형의 혼합물, 예를들어 동형 9, 10, 및 11의 혼합물을 포함한다. 또한 본 발명은 동형의 상대량이 동일하거나 상이한 에리스로포이에틴 동형의 조성물을 제공한다. 예를들어, 동형 9, 10 및 11 의 혼합물은 1 : 1 : 1, 2 : 3 : 1 또는 20 : 20 : 1 과 같이 다양한 비율로 존재하는 동형을 가질수 있다.

본 조성불은 4개 이하의 동형 혼합물, 예를들어 동형 11, 12 및 13의 혼합물, 또는 12와 14의 혼합물, 또는 7 과 13 의 혼합물을 포함하는 것이 유리하다.

에리스로포이에틴 동형 혼합물을 생성하기 위해, 동시에 본 발명은 선택된 에리스로포이에틴 동형을 분리하는 방법도 제공한다. 이 방법은 예비 등전점전기이동과 같은 기술에 의한 개개의 동형의 분리 또는 이온 교환 크로마토그래피나 크로마토포커싱과 같은 기술에 의해 분자당 시알산의 예정수(예를들어, 11 보다 큰 수)를 갖는 동형의 혼합물의 제조를 포함한다. 이들 모든 기술은 전하에 따른 단백질의 분리를 기초로 한다.

일반적으로, 이온 교환 크로마토그래피 및 크로마토포커싱은 에리스로포이에틴 동형의 다소나 전부를 수지에 결합시키도록 하는 조건하에서 컬럼수지에 조(組) 인체 에리스로포이에틴(세포조정배지)이나 아니면 정제된 물질을 적용하는 것이다.

조 에리스로포이에틴 제조물에 대하여는 단백질을 약 pH 7의 컬럼에 가하는 것이 바람직한 반면 정제된 제조물에 대하여는 단백직을 pH 7 에서 약 pH 4로 낮춘 컬럼에 가할 수 있다. 약 pH 4 의 완충용액으로 컬럼을 세척한 후, 이온 교환 컬럼에 결합되어 남아있는 그들 에리스로포이에틴 동형을 pH와 완충용액의 염 농도를 증가시킴으로써 용리시키거나 pH 를 저하시키고 약 pH 4에서 이온강도를 증가시킨기울기로 용리시킨다. 크로마토포커싱에 있어서, 동형은 저하하는 pH 의 기울기에 의해 컬럼으로 부터 용리되거나 고농도의 염으로 컬럼을 세척함으로써 용리된다.

바람직한 구체예에서, 개개의 동형을 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리한다. 실례로서, 동형 14 를 실시예 8에 기술된 대로 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다.

또한 본 발명은 인체 에리스로포이에틴의 특정 유사체를 포함한다. 본원에서 사용된 문구 "인체 에리스로포이에틴의 유사체"란 결과적으로 시알산 부가를 위한 부위의 수가 증가하는, 인체 에리스로포이에틴의 아미노산 시퀀스의 하나 또는 그 이상의 변화를 지닌 에리스로포이에틴을 말한다. 유사체는 글리코실레이션을 증가시키는 아미노산 잔기의 부가, 삭제 또는 치환을 갖거나 글리코실레이션에 유용한 변경부위를 갖는 특정 부위 돌연변이유발에 의해 생성된다. 그러한 유사체는 인체 에리스로포이에틴보다 더 많은 수의 탄수화물 사슬을 가질 수도 있다.

본 발명의 에러스포이에틴 유사체는 적어도 하나의 부가 글리코실레이션 부위를 포함하는 아미노산 시퀀스를 함유한다. 인체 에리스로포이에틴에서 발견된 수준보다 더 많은 시알산 수준을 갖는 유사체는 생물학적 활성에 요구되는 2차 입체형태나 3차 입체형태를 혼란시키지 않는 글리코실레이션을 가함으로써 생성된다. 인체 에리스로포이에틴의 유사체는 1, 2 또는 3개의 부가 N - 글리코실레이션이나 O -글리코실레이션 부위를 가지는 것이 유리하며, 결과적으로 1,2 또는 3개의 부가 N-결합이나 O-결합 탄수화물 사슬의 부가를 초래한다. 예를 들어, 위치 69의 로이신은 아스파라긴으로 치환되어 N-글리코실레이션을 위한 제 4 부위로 작동하는 시퀀스 Asn-Leu-Ser을 제공한다. 그리한 변경으로 통상 분자 당 4 이하의 부가적인 시알산을 제공할 수 있다. 부가 O-글리코실레이설 부위를 형성하는 변경의 예로는 위치 125의 알라닌이 트레오닌으로, 위치 124 및 125 의 알라닌이 각각 프롤린 및 트레오닌으로 되는 것이다. 유사체는 하나 이상의 부가적 N-결합 또는 O-결합 사슬을 갖는 유사체, 예컨데 표 5에 기재한 유사체 NO1 및 NO2이 작성될 수 있다. 당해 기술분야의 숙련자라면 쉽게 알 수 있듯이, 본 발명은 글리코실레이션을 위한 부가 부위를 갖는 인체 에리스로포이에틴의 수납을 위한 유사체를 포함한다.

글리코실레이션 부위에 부착되는 탄화수소를 높은 수준으로 갖는 유사체도 또한 본 발명에 포함된다. 그러한 유사체는 보통 N-결합 또는 O-결합 부위와 근접하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변경의 결과로, 에리스로포이에틴 폴리펩티드의 더 많은 부분이 탄화수소 변형을 갖는다. 글리코실레이션 부위는 자연적으로 존재하거나 돌연변이에 의하여 생성된다. 예를 들어, N13 유사체는 글리코실레이션 부위가 위치 88에 도입될지라도 부가적인 탄화수소 사슬을 생성하지 않는다. 그리나 위치 87에 치환된 세린 및 발린 잔기를 갖는 N14 및 N18 유사체는 위치 88에서 부가적인 탄화수소 사슬을 갖는다.

또한 본 발명에서는 에리스로포이에틴의 카르복시 말단으로부터 연장된 하나 이상의 아미노산을 갖고, 카르복시 말단 연장은 하나 이상의 부가적인 탄화수소 부위를 갖는 유사체를 제공한다. 한 구체예에 있어서, 인체 에리스로포이에틴의 위치 166의 아르기닌 잔기에 인체 융모성 성선자극 호르몬 (HCG)의 카르복시 - 말단의 28 개 아미노산을 융합시킴으로써 유사체를 구성하였다. HCG 카르복시 - 말단 단편은 4개의 O - 글리코실레이션 부위를 가지고 있다[Kessler 등의 J. Biol. Chem. 254, 7907 (1973) 참조].

표 3, 4 및 5는 부가 N - 결합 및/또는 O - 결합 탄수화물 사슬 부위를 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 기록한 것이다. 이 유사체는 N - 결과 부위를 창출하기 위해 인체 에리스로포이에틴 폴리펩티드 사슬의 여러 위치에서 치환시킨 시퀀스 Asn - X - Ser/Thr 를 가지거나 O -결합 부위를 창출하기 위해 도입시킨 세린이나 트레오닌 잔기를 가진다.

표 6은 SDS 겔 상애서 당단백질 이동에 의해 입증된 바와 같이 (실시예 7), 적어도 하나의 부가 N - 결합 탄수화물 사슬이나 하나의 부가 O - 결합 탄수화물 사슬을 부가시킨 그들 유사체, 또는 동시에 부가 N - 결합 및 O - 결합 사슬을 부가시킨 유사체를 기록한 것이다. 표 3 - 6 에서 알 수 있는 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 부가 탄수화물 부위를 갖는 유사제가 필수적으로 부가 탄수화물 사슬을 갖는 에리스로포이에틴 분자를 초래하지는 않는다. 예를들어, 위치 123과 125에서 트레오닌 잔기의 치환은 결과적으로 O - 결합 탄수화물 사슬의 부가를 초래하지만 다른 위치에서 세린리나 트레오닌의 치환은 부가 O - 결합 사슬을 지닌 유사체를 초래하지 않는다 (표 4참조). 그러나, 인체 에리스포이에틴 아미노산 시퀀스의 위치 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 및 138에서 아스파라긴 잔기의 치환은 그들 부위에서 N-긴합 사슬의 부가를 초래한다. 인체 에리스로포이에틴의 위치 166 의 아르기닌 잔기에 HCG 폴리펩티드 단편을 융합시키면 적어도 두개의 부가 O -결합 탄수화물 사슬을 갖는 에리스로포이에틴 - HCG 융합분자가 생성된다.

또한 본 발명의 에리스로포이에틴 유사체는 적어도 하나의 글리코실레이션 부위의 재배열을 갖는 아미노산 시퀀스를 함유하는 에리스로포이에틴을 포함한다.

본원에서 사용된 글리코실레이션 부위의 재배열이란 인체 에리스로포이에틴에서 하나 또는 그 이상의 글리코실레이션 부위의 삭제 및 하나 또는 그 이상의 비 - 자연 발생적인 글리코실레이션 부위의 부가를 말한다. 유사체 R1, R2 및 R3 가 그러한 재배열의 예이며, 각각 위치 24, 38 또는 83 에서 N -결합 부위를 삭제하고 위치 88에서 N -결합 부위를 부가함으로써 구성 하였다. 그러나, 무수한 다른 유형의 탄수화물 부위의 재배열이 가능하며 결과적으로 생성된 유사체는 인체 에리스로포이에틴과 비교하여 더 많은 수의 글리코실레이션 부위를 가질 수도 있거나 가질 수 없을 수도 있다.

유사체 R1, R2 및 R3를 생체 내 생물학적 활성도에 대해 분석하고 그 결과를 표 7에 나타냈다. Asn 88 에 N - 결합 사슬을 도입하여 삭제된 3 개의 자연 발생적인 N - 결합부위중 어느 하나라도 가지는 에리스로포이에틴에 대한 생물학적 활성도를 회복시켰다. 이러한 결과는 에리스로포이에틴의 탄수화물 사슬의 위치가 생물학적 활성도에 상당한 영향을 미치지 않는 유용한 유사체를 생성하도록 변화될 수 있음을 나타낸다. 또한 본 발명은 부가 N - 결합 및/ 또는 O - 결합 사슬 부위를 갖는 에리스로포이에틴 유사체, 적어도 하나의 부가 탄수화물 사슬 부위의 재배열을 갖는 유사체, 및 에리스로포이에틴의 카르복시 - 말단에서 연장된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 유사체를 암호화하는 DNA 시퀸스를 포함한다. 부가 탄수화물 부위를 창출하고 변경시키기 위해 인체 에리스로포이에틴 DNA 시퀸스를 변화시키는데 사용된 방법은 실시예 6 에 기술되어 있다.

이들 에리스로포이에틴 유사체는 외인성 DNA 시퀀스, 예를들어 재조합 DNA 기술로 생성된 외인성 DNA 시퀀스의 발현 산물일 수 있거나, 합성산물일 수 있다. 외인성 DNA 시퀀스는 cDNA, 게놈 DNA 또는 에리스로포이에틴 유사체를 암호화하는 화학적으로 합성된 DNA 를 포함한다. 상기 유사체의 발현에 유용한 재조합 DNA 플라스미드와 진핵 숙주세포 또한 제공한다. 발현벡터는 클로닝된 DNA 시퀀스를 진핵 숙주 세포에서 발현시킬 수 있는 모든 벡터, 특히 COS 및 CHO 세포 내 발현을 위해 사용된 벡터를 포함한다.

그러한 벡터의 예로는 명세서의 실시예 6 에 기술된 플라스미드 pEC 와 pDEC△ 을 포함한다. 에리스로포이에틴 유사체를 발현하는 숙주세포인 COS 세포(ATCC 제 CRL - 1561 호) 및 CHO 세포(ATCC 제 CCL - 61 호)의 배양은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 방법을 사용하여 수행하였다.

에리스로포이에틴 유사체로부터 유도한 분리된 동형 및 동형 혼합물은 인체 에리스로포이에틴의 동형을 제조하기 위해 상기에 기술된 방법을 사용하여 수득한다. 이들 방법은 등전점전기이동, 이온 교환 크로마토그래피 및 크로마토포커싱을 포함할 수 있다. 에리스로포이에틴 유사체로부터 유도한 개개의 동형 및 동형 혼합물을 제조하는데 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 것이 바람직하다.

에리스로포이에틴 상의 탄수화물 사슬수를 증가시키면, 결과적으로 에리스로포이에틴 분자당 시알산의 수는 증가된 용해도, 단백질 가수분해에 대한 더 큰 저항성, 감소된 면역원성, 증가된 혈청 반감기, 및 증가된 생물학적 활성도와 같은이로운 특성을 제공할 수 있다.

에리스로포이에틴 유사체를 발현하는 CHO 세포로부터의 조정배지를 생체 내 생물학적 활성도에 대해 분석하고 그 결과를 표 6 에 제시하였다. 시험된 몇 개의 유사체는 인체 에리스로포이에틴의 3 배의 활성도를 지니거나 더 높은 활성도를 지녔다. 특히, 위치 30 이나 위치 88 둘 중 하나에서 부가 N - 결합 탄수화물 사슬을 갖는 유사체가 인체 에리스로포이에틴보다 2배 내지 3배 더 높은 활성도를 나타낸 반면 HCG 폴리렘티드 단편에 인체 에리스로포이에틴을 융합시킨 결과로서 부가 O -결합 사슬을 갖는 유사체는 적어도 2배 더 높은 활성도를 지녔다.

부가 탄수화물 사슬을 갖는 2개의 에리스로포이에틴 유사체를 정제하여 상이한 시알산 함량을 갖는 동형 혼합물을 분리하였다 (실시예 8). Thr¹²⁵및 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰(EpoN14) 유사체를 3개의 분리된 동형 분적으로 분리하여 각 분획에 대한 생체 내 생물학적 활성도를 측정하였다.

표 8 에 나타난 결과는 더 높은 시알산 함량을 갖는 EPO N14동형 분획이 더 많은 생체 내 활성도를 지님을 입증한다.

EPO N14유사체의 고 시알산 동형의 풀과 재조합 인체 에리스로포이에틴(동형 9 - 14)을 수용체 결합 분석, 약동력학 실험, 및 쥐(mouse)의 헤마토크리트의 증가를 측정하는 실험에 대해 연구하였다. 이들 측정결과는 시알산 함량, 정화 값 반감기, 및 처리된 쥐의 헤마토크리트를 증가시키는 능력 사이에 직접적인 관계가 있음을 나타낸다.

따라서, 제 13, 14및 15 도에 나타난 바와 같이, EPO N14 고 시알산 동형 풀은 상당히 더 긴 생체 내 반감기를 가지며, 비록 N14 고 시알산 동형 풀이 수용체에 강하게 결합되지 않았다하더라도 분리된 동형 14 나 재조합 인체 에리스로포이에틴 둘 중 하나 보다 더 많은 헤마토크리트를 더 많이 증가시키도록 촉진하였다.

본 발명의 또 다른 구체예는 인체 에리스로포이에틴의 동형 또는 분자당 시알산의 특이수, 예를들어 분자당 10 시알산보다 큰 수를 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 우선적으로 합성하는 포유동물(예를들어, 중국산 햄스터 난소, CHO) 숙주세포에 관한 것이다. 에리스로포이에틴 분자는 분자의 시알산 함량을 제한할 수 있는 N - 결합 및 O - 결합 올리고당 구조를 갖는다. 예를들어, 4 갈래(tetraantennary) (4 - 가지난) N - 결합 올리고당이 대부분 일반적으로 4개의 가능한 시알산 부가 부위를 제공하는 반면 아스파라긴 - 결합부위에서 3 갈래형으로 치환될 수 있는 2 갈래(biantennary) 및 3 갈래 (triantennary) 올리고당 사슬은 주로 2개나 3개의 부가 시알산만을 갖는다. O - 결합 올리고당은 보통 2 개의 시알산 부가부위를 제공한다. 따라서 에리스로포이에틴 분자는 3개의 N - 결합 올리고당 모두가 4 갈래로 제공된 총 14 시알산 잔기를 수용할 수 있다. 포유동물 세포 배양주는 재조합 에리스로포이에틴애 4 갈래 사슬을 우선적으로 가하여 시알산 부가 부위의 수가 최대로 된 세포에 대해 선별한다.

요 에리스로포이에틴의 N -결합 올리고당은 갈락토스에 대한 α 2, 3 결합과 α 2, 6 결합 둘 다에서 시알산을 함유한다. [Takeuchi 등의 J. Biol. chem. 263, 3657 (1988) 참조]. 보통 α 2, 3 결합의 시알산은 만노스 α 1, 6가지 (branch)상의 갈락토스에 부가되고 α 2, 6 결합의 시알산은 만노스 α 1, 3 가지상의 갈락토스에 부가된다. 이들 시알산이 가해진 효소 ( β - 갈락토시드 α 2, 3 시알릴전이효소와 β - 갈락토시드 α 2, 6 시알릴전이효소)는 대개 각기 만노스 α 1, 6 과 만노스 α 1, 3 가지에 시알산을 부과시키는데 효과적이다.

디히드로 엽산 환원효소 (DHFR) 결핍 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포가 보통 재조합 에리스로포이에틴을 함유하는 재조합 당단백질의 생성을 위한 숙주세포로서 사용된다.

이들 세포는 효소 β -갈락토시드 α 2, 6 시알린전이효소를 발현하지 않으며, 따라서 이들 세포에서 생성된 당단백질의 N -결합 올리고당에 대한 α 2, 6 결합에 시알산을 부가하지 않는다[Mutsaers 등의 Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986) ; Taksuchi 등의 J. Chromstogr. 400, 207 (1987) 참조].

따라서, CHO 세포에서 생성된 재조합 에리스로포이에틴은 갈락토스에 대한 2, 6 결합에서 시알산이 부족하다[Sasaki 등의 (1987), 상기문헌 ; Takeuehi 등의 (1987), 상기문헌 참조].

본 발명의 다른 구체예에서, 인체 에리스로포이에틴과 에리스로포이에틴 유사체는 갈락토스에 대한 α 2, 6 결합에 시알산이 가해지도록 기능적인 β - 갈락토시드 α 2, 6 시알릴 전이효소 유전자로 형질감염시킨 CHO 세포에서 생성된다.

결과적으로 생성된 동형은 갈락토스에 대한 α 2, 3과 α 2, 6 결합 둘 다를 갖는 시알산을 포함할 것이다. 변형된 CHO 세포나 다른 포유동물 숙주세포를 창출하기 위한 기술에 대한 상세한 설명은 본원에서 참고문헌으로 인용한 Lee등의 J.Biol. Chem. 264, l3848 (1989) 문헌을 참조하라.

또한 본 발명은 에리스로포이에틴 치료에 유용한, 적합한 희석제, 보조제 및/또는 담체와 함께 치료상 유효량의 특이 동형이나 동형 혼합물을 함유하는 제약학적 조성물을 포함한다. 또한 적합한 희석제, 보조제 및/또는 담체와 함께 치료상 유효량의 에리스로포이에틴 유사체를 함유하는 제약학적 조성물을 포함한다. 본원에서 사용된 "치료상 유효량" 이란 주어진 증상과 투여 양생법에 대한 치료상 유효한 양을 의미한다. 인체 에리스로포이에틴의 동형이나 에리스로포이에틴 유사체의 투여는 비경구적 경로가 바람직하다. 특이경로의 선택은 치료할 증상에 따라 좌우될 것이다.

인체 에리스로포이에틴의 동형이나 에리스로포이에틴 유사체의 투여는 인체 혈청 알부민과 같은 적합한 담체, 완충식염용액과 같은 적합한 희석제, 및/또는 적합한 보조제를 함유하는 제제형의 일부로서 투여함이 바람직하다. 요구되는 투여량은 환자의 헤마노크리트를 증가시키기에 충분한 양일 것이며, 치료될 증상의 중도, 사용된 투여방법 등에 따라 다양할 것이다.

다음 실시예는 본 발명을 더 상세히 설명하고자 함이지 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 실시예에 사용된 생체 내 생물검정에 이용한 에리스로포이에틴 표준은 부분적으로 정제한 요 에리스로포이에틴 표준에 대하여 표준으로 한 재조합에리스로포이에틴 표준이다. 따라서, 단지 생체 내 상대 고유활성도만을 측정한다. 또한 생체 내 고유활성도를 "IU/ml", IU/mg" 및 "IU/A₂₈₀" 으로서가 아니라"단위/ml", "단위/mg" 및 "단위/A₂₈₀"으로 표현하였는데 이는 사용된 에리스로포이에틴 표준이 모든 현재 국제 표준과 서로 직접적인 관계가 없기 때문이다.

실시예 1 : 제조합 에리스포이에틴 동형의 분리

재조합 에리스로포이에틴은 Lin 의 상기문헌에 기술된 대로 생성한다. 첫번째와 세번째 동형 분리에 대한 출발물질로서 사용된 재조합 에리스로포이에틴은 Lai 등의 상기문헌의 실시예 2에 기술된 방법에 따라 정제한다. 두번째와 다섯번째 동형 분리에 대한 출발물질은 Q -세파로스 크로마토그래피를 변형한 Lai 등의 상기문헌에 따라 정제한다. 이들 제조물은 요 유래 인체 에리스로포이에틴과 동일한 아미노산 시퀀스를 갖는 재조합 에리스로포이에틴의 동형 혼합물을 포함하되 주로 동형 9 내지 14 를 포함한다.

네번째 동형 재조물을 위한 출발물질은 Lai 등의 문헌 실시예 2 에 기술된 음이온 교환 컬럼을 5 mM 아세트산/1 mM 글리신/6 M 요소로 세척하는 동안 용리되는 물질이다.

이 분획은 9 시알산보다 적거나 동일한 동형을 함유하며 예비등전점전기이동 과정에 사용하기 전에 Lai 등의 문헌 실시예 2에 기술된 대로 겔 여과 크로마토그래피로 더 정제하였다.

4 내지 13 시알산을 갖는 재조합 에리스로포이에틴의 정제된 제조물을 여섯번째 동형 제조물의 출발물질로 사용하였다.

이 물질을 이온 교환 컬럼에 대한 변형을 제외하고는 (pH 8.4 에서 염화나트륨 기울기로 재조합 에리스로포이에틴을 용리시키고 아세트산/요소 세척은 생략함) Lai 등의 문헌 실시예 2 에 따라 정제하여 결과적으로 출발물질에 존재하는 동형의 대부분이 유지되었다.

개개 동형의 6개의 상이한 제조물을 필수적으로 LKB 출원 노트 198 에 따라 과립화 겔 베드 (울트로덱스, LKB)에서 예비등전점전기이동시킨다. 파말리트 (Pharmalyte) (파마시아) 2.5 - 5 양성전해질(파따시아)을 사용하며 겔 베드는 5 M 요소를 함유한다.

첫번째 제조물에 있어서, 대략 20 mg 의 재조합 에리스로포이에틴이 함유된 6.8 ml 의 20 mM 시트르산 나트륨/100mM 염화나트륨, pH 7.0 을 겔에 가하고 대략 16시간 동안 8 와트에서 포커싱시킨다. 등전점전기이동후, 겔 베드를 종이 밀착 인화시켜 겔에서 동형 밴드를 가시화시킨다. 인화물을 만든 다음 3 변화 (각각 대략 10 분, 실온)의 고정용액(40 % 메탄올 / 10 % 아세트산 / 10 % TCA /3.5 % 술포살리실산)에 담가두어 고정시키고, 1 변화 (약 10분)의 40 % 메탄을 / 10 % 아세트산(30 - 60℃)에 담그고, 60℃ 에서 15분간 0.125 % 쿠마시 블루 R - 256 / 40 % 메탄올 / 10 % 아세트산에서 착색시킨 다음, 분리된 동형을 가시화시키기 위해 7.5 % 메탄올 / 10 % 아세트산에서 재착색한다. 과립화 겔 베드에서 동형을 함유하는 부위 (수지의 ∼ 50 %)를 제거하고, 물을 가한 후 ( ∼ 16 ml), 슬러리를 5.5 × 24.5 인치(13.97 × 62.23 cm)의 접시에 분고 ∼ 40 g 의 실효무게가 되도록 증발시킨다. 이 제조물을 추가시간동안 포커싱시켜 예기한 바와 같이 겔 배드의 밀착인화를 만든다. 식별가능한 6개의 동형 각각을 함유하는 겔 부분을 겔 베드로부터 제거한다.

겔로부터 동형을 용리시키기 위해, 10 mM 트리스 - HC1, pH 7.0/5 mM 챕스 (Chaps) 를 함유하는 용액을 각 동형에 가하여 슬러리를 만든다. 이 슬러리를 작은 컬럼에 넣고 트리스 - 챕스 완충용액으로 세척한다. 흘러 내리는 것을 모으고 20 % 에탄올 / 10 mM 트리스 - HCl, pH 7.0 에서 평형화시킨 비닥 C4 역상 수지를 포함하는 작은 컬럼(열린 컬런형) 에 따로따로 가한다. 컬럼을 20 % 에탄올 / 10 mM 트리스 - HCl, pH 7.0, 35 % 에탄올 / 10 mM 트리스 - HCl, pH 7.0, 및 65 % 에탄올 / 10 mM 트리스 - HCl, pH 7.0 으로 한 방울씩 전개시킨다. 65 % 에탄올 / 10 mM 트리스에 의해 용리되는 분획을 10m M 트리스 - HCl 로 1:1 희석하고 센트리콘(Centricon) - 10 (아미콘) 마이크로농축기를 사용하여 농축시킨 다음 10 mM 트리스 - HCl, pH 7.0 으로 완충용액을 교환한다. 이 제조물의 분석 등전점 전기이동은 5번 요소를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔에서 서발리트(Servalyte) 3 - 5 암폴린 (서바)을 사용하여 필수적으로 LKB기술 노트 250 에 기술된 바와 같이 수행한다.

두번째 제조물에 있어서, 대략 26 mg 의 재조합 에리스로포이에틴이 함유된 6.5 ml 의 탈염수를 겔에 가하여 35 분간 2.5 와트에서 포커싱시키고 대략 17시간 동안 10 와트에서 포커싱시킨다. 포커싱된 단백질 밴드는 겔 베드에서 가시화될 수 있으며 11 개의 상이한 풀로 제거한다. 각 풀을 탈염수를 가하여 약 7.5 ml 가 되게 하여 결과적으로 생성된 각각의 풀 상청액 20 ml 를 상기한 바와 같이 분석 등전점전기이동시킨다. 각각의 풀에 5 ml 의 1.5 M 트리스 - HCl, pH 8.8 을 가하고슬러리를 각각 작은 컬럼에 넣어 액체상을 흘러 내리도록 한다. 대략 3 부피의 0.5 M 트리스 - HCl, pH 7로 수지를 세척하고 이 수지용액을 흘러 내린 것과 혼합한다. 10,000 달톤 분자량 차단기를 갖는 아미콘(Amicon)의 일회용 한외여과기를 사용하여 용출액을 농축시키고 20 mM 시트르산 나트륨/ 100 mM 염화나트튬, pH 7.0으로 완충용액을 교환한다. 그런다음 농축용액(대략 0.5 ml)을 0.22 미크론 차단의 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통과시킨다. 분석 등전점전기이동에 기초하여, 5개의 풀이 단일 동형 10,11,12,13 및 14를 현저하게 함유하고 있음을 밝혔다.

세번째 제조물에 있어서, 대략 30 mg 의 재조합 에리스로포이에틴이 함유된 21.8 ml 의 증류수를 겔에 가하여 2 와트애서 25 분간, 10 와트에서 20 시간동안 포커싱시키고 15 와트에서 15 분간 포커싱시킨다. 개개의 동형에 상응하는 단백질 밴드는 가시적으로 관찰되며 겔 베드로부터 제거한다.

겔-분리 동형에 증류수를 가하여 슬러리를 만들고 결과적으로 생성된 상청액을 분석 등전점전기이동으로 분석한다.

동부피의 1M트리스 - HC1, pH7.2 를 각 슬리리에 가하여 생성된 현탁액을 개개의 작은 컬럽에 붓고 액체상을 컬럼을 통하여 흘러 내리도록 하여 동형을 용리시킨다. 각 흘러내린 액을 10,000 달톤 분자량 차단기를 갖는 아미콘의 일회용 한외여과기를 사용하여 농축시키고 20 mM 시트르산 나트륨/100 mM염화나트륨, pH 7.0으로 완충용액을 교환한다.

분석 등전접전기이동 겔은 주로 단일 동형 9,10,11,12,13 및 14 를 함유하는 풀이 관찰되었음을 나타냈다.

네번째 동형의 제조물에 있어서 동형 3 - 9 (상기와 같이 제조함)를 함유하는 에리스로포이에틴을 출발물질로서 사용하였다. 상기 1-3 제조물에 대해 기술한 대로 예비 등전점전기이동을 필수적으로 수행하기 전에, 로토포(Rotofor)(미국 캘리포니아 리츠몬드에 소재하는 바이오-래드에서 구입) 액체상 등전점전기 이동 세포에서 양성전해질(파말리트 2,5-5)을 예비-분획화하여 출발물질의 보다 낮은 등전점에 보다 더 적합한 양성전해질 범위를 산출하였다. 예비분획화는 6.7 ml 의 파말리트 2.5-5와 15 g 의 요소를 섞고 정제수를 부피가 50 mL 가 되도록 가함으로써 수행하였다. 이 혼합물을 양극 전해액과 음극액으로서 각각 0.1 M 인산과 0.1 M 수산화나트륨을 사용하여 10 와트, 1 ℃ 에서 51/2 시간동안 로토포로 분획화하였다. 4,5와 대략 6 사이로 측정된 pH를 갗는 양성전해질 분획을 평상등전점전기이동에 사용하였다.

다음 변수를 사용하는 센트리엘루터(Centrieluter)(미국 메사츄세츠 댄버스에 소재하는 아미콘에서 구입)와 10,000 MW 차단센트리콘(Centrieon)(아미콘에서 구입)을 이용하여 동형으로부터 양성전해질을 제거하였다 : 0.18트리스 완충용액 pH 8.8, 100 볼트, 25-30 mA, 3시간. 그런 다음 동형을 세파덱스 G-25 (파마시아)를 사용하여 겔 여과함으로써 0.1 M 염화나트륨으로 완충용액을 교환하였다. 결과적으로 생성된 5 개의 풀을 분석 등전점전기이동시켜 그들이 동형 4,5,6,7및 8 을 함유하고 있음을 알 수 있다. 동형 4는 몇개의 밴드로서 나타났으며, 이는 동명 4 가 다소 분해되었음을 의미한다.

다섯번째 동형 제조물은 평상등전점전기이동 과정에 예비-포커 성 단계를 부가함으로써 변형하였다. 이와같은 변형에 있어서, 전기이동 전에는 양성전해질/요소/겔 혼합물에 단백질을 가하지 않았으나 겔 배드애서 pH 기울기의 생성에 따른 등전점전기이동 장치에는 가하였다. 음극으로부터 2.25-4.25 cm의 겔 베드 단편을 75 분간 (1500볼트-시) 예비포커싱한 후 제거하고, 에리스로포이에틴 용액과 혼합한 다음 겔 베드에 다시 가하였다. 등전점전기이동 후, 동형 10,11,12,13및 14 를 겔 배드로부터 용리하고 나서 센트리콘-10 (아미콘에서 구입)장치를 사용하여 한외여과하여 양성전해질로부터 분리하였다.

예비-포커싱 변형은 출발 재조합 에리스로포이에틴의 흡광도와 좀 더 유사한 동형 제조물에 특징적인 자외선 흡광도를 갖도록 하였다. 스펙트럼 특성에서의 이러한 개선은 분리된 동형에 대한 280 nm와 260 nm 에서의 흡광도의 비로 나타낼 수 있다. 제조물 2 와 3 (예비포커싱하지 않음)에서 수득한 동형에 대하여 260 nm 에서의 흡광도에 대한 280 nm 에서의 흡광도의 평균비(A₂₈₀/A₂₆₀)가 1.36±0.11 인 반면 제조물 5와 6 (예비-포커성함)에 대한 평균 A₂₈₀/A₂₆₀비는 1.68±0.20 이다. 계산에서 동형 #14를 제외하면, 제조물 2와 3 및 5 와 6 각각에 대한 평균 A₂₈₀/A₂₆₀비는 1.39±0.11과 1.74±0.09이다(동형 14는 가장 불규칙한 스펙트럼을 갖는데, 그 이유는 동형 14가 최저량으로 존재하여 양성 전해질 성분에 의한 미량의 오염에 더 많은 방해를 받기 때문이거나 평상등전점전기이동 과정 동안에 전극에 가장 가까이 있기 때문이다).

Lai 등의 문헌 실시예 2에 따라 제조한 재조합 에리스로포이에틴에 대한 평균 A₂₈₀/A₂₆₀(음이온 교환 수지로서 Q-세파로스를 사용하여 최초에 기재한 바와 같이 변형함)는 1.91±0.04 이다.

상기한 바와 같이, 동형 제조를 # 6에 대한 출발물질은 동형 4-13 을 함유하는 재조합 에리스로포이에틴 재조물이있다.

양성전해질을 네번째 제조에 따라 로토포 장치로 예비-포커싱하였다. 3.7 과 4.8 사이에 측정된 pH를 갖는 양성전해질 분획을 평상 등전점전기이동을 위해 사용하였다.

런 #5 에서와 같이 평상을 예비-포커싱하고 동형 9,10,11,12 및 13은 한외여과(센트리콘-10)하여 운반체인 양성전해질을 제거한 후 수득하였다.

실시예 2 : 제조합 에리스로포이에틴 동형의 시알산 함량

실시예 1 에 기술된 대로 분리한 동형과 Lai 등의 상기문헌에 기술된 과정에 따라 정제한 에리스로포이에틴(동형 9-14 의 혼합뭍)을 0.10-0.15 M 염화나트륨으로 완충용액을 교환하고 Jourdian 등의 J.Biol, Chem. 246, 430 (1971) 문헌의 방법을 변형시켜 시알산 함량을 분석한다. 80 ℃ 에서 30분간 0.35 M 술폰산으로 가수분해시켜 당단백질로부터 시알산 잔기를 절단하고 이 용액을 분석하기 전 수산화나트륨으로 중화시킨다.

존재하는 에리스로포이에틴 단백질의 양을 추정하기 위해, 표준으로서 인체 에리스로포이에틴의 아미노산 시퀸스를 갖는 재조합 에리스로포이에틴을 사용한 브라드포드 단백질 분석법[Bradford 의 Anal, Biochem. 72, 248 (1976) 참조]은 바이오-레드에서 공급한 분석용 시약과 미량법을 이용하여 수행한다.

그 결과는 에리스로포이에틴 몰당 시알산의 몰로시, 표 1 에 나타나 있다. 동형은 분자당 시알산의 수에 따라 명명한 것이며 최소산 (동형 9) 에서 최대 산(동형 13)의 범위이다. 동형 9-13은 제 1 도의 겔 레인 6-10 에 나타나 있다. 동형 14 의 양은 시알산 함량을 정확히 측정하기에 불충분하다.

이 동형의 시알산 함량은 IEF 겔 상의 이동을 다른 동명과 비교하여 추측한다. 동형 5-8 (제조를 #4)의 시알산 함량은 측정되지 않았으나 IEF 겔 상의 이동으로부터 추측할 수 있을 것이다.

[표 1]

실시예 3 : 재조합 에리스포이에틴 동형의 활성도

실시예 1에서 기술한 대로 분리한 동형을 280 nm 에서 흡광도를 측정하고, 브라드포드 단백질 분석하고, 에리스로포이에틴에 대한 RIA 를 시행하여 존재하는 재조합 에리스로포이애틴의 양을 결정하다. 생체 내 상대 생물학적 활성도를 측정하는데 익스하이폭식(exhypoxic) 다혈구증 쥐(mouse) 생물검정[cotes 등의 Nature 191, 1065(1961) 참조]을 이용한다.

에리스로포이에틴에 대한 방사선면역측정법을 사용하여 존재하는 에리스로포이에틴 단백질의 양을 정량하여, 에리스로포이에틴 농도를 과소형가하여 가장 음성인 동형에 대한 생체 내 상대 고유활성도를 과대평가하는 결과를 초래하는 다량의 시알산을 함유하는 동형의 분명히 감소된 면역반응성으로 인해 특정 동형에 대한 더 높은 생체 내 상대 고유활성도를 갖는 결과를 산출 하였다. 단위/ml 로 표현한 쥐(mouse) 생물검정 측장치를 상응 단백질 농도값으로 나누어 단위/mg 에리스로포이에틴폴리펩티드로 표현한 생체 내 고유활성도를 제공한다. 이들 고유활성도는 표 2 에 제시되어 있다.

표 2 에서, "n"은 고유활성도값애 기여하는 개개의 동형 제조물의 수이다. 대부분의 경우에 있어서 몇가지 생체 내 측정은 각 동형 제조물에 대해 수행하였다.

3개의 모든 컬럼에 대한 고유활성도 계산치는 동일한 생체 내 데이타에 의한 것이며, 280 nm 에서의 흡광도, 방사선면역측정의 효능, 브라드포드 단백질 분석 결과에 따라 단위/mg 에리스로포이에틴 폴리펩티드를 측정하였다. 동형 9-14 를 함유하는 정재된 재조합 에리스로포이에틴을 브라드포드 단백질 분석법의 표준으로서사용하였다. 브라드포드 단백질 분석법을 수행했을때 다소의 제조품이 더 이상 유용하지 않았으므로 "n"은 브라드포드 단백질 분석을 이용한 계산치보다 적을 수도 있다.

Lai 등의 상기문헌에 기술된 방법에 따라 정제한, 동형 9-14 의 혼합물을 함유하는 에리스로포이에틴을 RIA및 생체 내 측정을 위한 표준으로서 사용한다.

단위/mg 에리스로포이에틴 폴리펩티드로서 표현한 상대 고유활성도는 0.807 mg 에리스로포이에틴 폴리펩티드/A₂₈₀을 곱함으로써써 단위/A₂₈₀으로 전환될 수 있다. 에리스로포이에틴의 흡광 계수(1.345 mg/A₂₈₀)에 에리스로포이에틴 당단백질의 단백질 함량[약 60 중량 %, Davis 등의 Biochemistry 26, 2633 (1987)참조]을 곱하여 mg 에리스로포이에틴 폴리펩티드/A₂₈₀을 구함으로써 전환 인자를 유도한다(예를들어, 1.345 mg 에리스로포이에틴/A₂₈₀× 0.60 mg 폴리펩티드/mg 에리스로포이에틴 = 0.807 mg 폴리펩티드/A₂₈₀).

또한, 단위/mg 에리스로포이에틴 폴리펩티드로서 표현한 고유활성도에 인자 0.60 mg 폴리펩티드/mg 에리스로포이에틴 당단백질을 곱하여 단위/mg 에리스로포이에틴 당단백질로 표현한 고유활성도를 구할 수 있다.

[표 2]

표 2의 데이타는 제 2A,2B및 2C도에 그래프로 나타나 있다. 이들 데이타는 동형 #11 까지는 시알산 함량의 작용에 따라 에리스로포이에틴의 생체 내 상대 활성도가 증가함을 보여준다. 동형 11-14는 본질적으로 동일한 생체 내 상대 생물학적 활성도를 갖는다(이것은 주로 동형 14 의 농도를 브라드포드 분석값을 이용하여 나타낼때 분명하다.

동형 14는 일반적으로 저수준으로 수득되어 결과적으로 A₂₈₀으로 측정하기 곤란하며 예기한 바와 같이 매우 음성인 형태로서 RIA 에서의 반응성의 감소가 가장 명백하므로 브라드포드 값이 보다 더 정확할 수 있다. 더 많은 시알산을 갖는 에리스로포이에틴 동형의 더 큰 생체 내 상대 고유 활성도는 주로 이들 형태의 더 긴 순환 반감기에 기인하는 듯하다. 동형 9 와 13 을 방사성 요오드(¹²⁵I)로 표지하고 쥐(rat)에서의 정화값을 측정하였다. 순환 반감기는 동형 9 보다 동형 13 이 상당히 더 길었다.

실시예 4 : Q-세파로스 크로마토그래피에 의한 재조합 에리스로포이에틴 동형 혼합물의 선택

Lin 의 상기문헌에 기술된 방법에 따른 재조합 에리스로포이에틴의 생성에서 수득한 세포 조정배지를 10 mM 트리스, pH 7.2 에 대하여 농축시키고 격리여과한다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로 사용하여 브라드포드 미량단백질 분석법으로 측정한다. 40 mg 의 총 단백질을 함유하는 19.6 ml 의 용액을 20 μM CuSO₄로 제조하고, 0.45 미크론 차단 필터를 통하여 여과시킨 다음 4 ℃ 에서 10mM 트리스, pH 6.8-7.0 으로 평형화시켜 놓은 9 세파로스 고속 흐름(Q Sepharose Fast Flow)(파마시아)으로 채워진 4 ml 베드 부피(1.05 cm 높이 × 2.2 cm 직경)의 컬럼상에 적하한다.

시료를 가한후, 컬럼을 동일한 완충용액의 2개의 컬럼부피로 세척한다. 컬럼유속은 약 1 ml/min 이다.

6 개의 개별 컬럼을 이와 같은 방법으로 시작하여 규정 에리스로포이에틴 동형 혼합물을 선택한다.

다음과 같이 구성된 낮은 pH 완충용액의 6-9 컬럼부피로 컬럼을 세척한다: 컬럼 #1, 150 mM 아세트산, 1 mM 글리신, 20 μM CuSO₄, NaOH 로 pH 4.7 로 조정한 6 M 요소 ; 컬럼 #2, 200 mM 아세트산, 1 mM 글리신, 20 μM CuSO₄, NaO₄로 pH 4.7 로 조정한 6 M 요소 ; 컬럼 # 3, 250 mM 아세트산, 1 mM 글리신, 20 μM CuSO₄, NaOH 로 pH 4.7로 조정한 6 M 요소 ; 컬럼 #4, 300 mM 아세트산, 1 mM 글리신, 20 μM CuSO₄, NaOH 로 pH 4.7 로 조정한 6 M 요소 ; 컬럼 #5, 150 mM 아세트산, 1 mM 글리신, 20 μM CuSO₄, 6 M 요소 ; 컬럼 #6, 300 mM 아세트산, 1 mM 글리신, 20 μM CuSO₄, 6 M 요소. 10 mM 트리스-HC1, 55 mM NaCl, 20 μM CuSO₄, pH 7 로 된 8-11 컬럼부피로 각각의 컬럼을 세척함으로써 컬럼의 pH 는 약 pH 7 로 증가한다. 규정 에리스로포이에틴 동형 혼합물을 10 mM 트리스-HC1, 140 mM NaCl, 20 μM CuSO₄, pH 7.0 으로 세척하여 컬럼으로부터 용리시킨다.

각 컬럼에서 용리된 동형 풀을 아미콘 센트리콘-10 미량농축기를 사용하여 농축시키고 용매를 물로 교환한다.

이 농축풀의 분석 등전점전기이동의 결과는 제 3 도에 나타나있다. 겔 레일 1-6 은 각각 컬럼 1-6 에서 용리된 규정 에리스로포이에틴 동형 혼합물을 나타낸다. 제 3 도 겔 레인의 왼쪽 멀리에 보여지는 "동형 혼합물"은 상기한 바와 같이 Q-세파로스 컬럼에 적용시킨 세포배지를 의미하며, 이 컬럼을 5 mM 아세트산, 1 mM 글리신, 20 μM CuSO₄, 6 M 요소로 세척한뒤, 상기한 방법을 이용하여 컬럼으로부터 에리스로포이에틴 동형 혼합물을 용리한다. 이 용리된 동형 혼합물을 분석 등전점전기이동시키기 전에 Lai 등의 상기문헌에 기술된 방법에 따라 더 정제한다.

실시예 5: Q-세파로스상의 저 pH 기울기를 이용한 재조합 에리스로포이에틴 동형의 분획화

다른 방법에 있어서, 에리스로포이에틴 동형을 감소하는 pH와 증가하는 이온강도의 기울기를 이용하여 분리한다.

배지를 함유하는 농축되고 투석여과된 에리스로포이에틴을 대략 40 mg 총 단백질 /mL 겔의 비율로 Q-세파로스 컬럼에 적하한다.

칼럼을 대략 2 컬럼부피의 10mM 트리스-HC1, pH 7.0으로 이어, 대략 10 컬럼부피의 2mM 아세트산/1mM 글리신/ 20 μM CuSO₄/6M 우레아(pH 대략 4.8)로 세척하여 오염 단백질과 대략 7 시알산 잔기 이하를 함유하는 에리스로포이에틴 동형을 제거한다. 6M 요소/ 1mM 글리실/ 20 μM CuSO₄중의 약 2mM 아세트산을 시작으로 4OmM아세트산/ 6M 요소/ 1mM 글리실/ 20 μM CuSO₄(대략 pH 4)에 이르는 기울기를 이용하는 컬럼으로부터 약 8 내지 12 시알산을 함유하는 동형을 용리한다. 기울기의 총 부피는 대략 40 컬럼부피이며 대략 1 컬럼부피 각각의 분획을 수집된 분획이 저 pH 에 장기간 노출되는 것을 방지하도록 pH를 6-8.5 의 범위로 하기에 충분한 트리스 완충용액 부피를 함유하는 용기내로 수집한다. 분획의 분취량을 분석 등전점전기이동시켜 분리물을 모니터한다.

제 4도는 이와 같은 방법으로 수득할 수 있는 동형 8-11의 분리물을 나타낸 것이다. 기울기의 끝에서 컬럼에 결합되어 남아있는 동형 12-14 를 10 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 20 mM CuSO₄(pH7.0)으로 이루어진 완충용액으로 세척하여 용리한다. 동형(기울기 동안에 분리되거나 염화나트륨 용액에 의해 용리됨)을 역상 크로마토그래피로써 오염단백질에서 제외하고 나서 Lai 등의 문헌 실시예 2에 기술된 대로 겔 여과 크로마토그래피한다.

실시예 6 : 인체 에리스로포이에틴 유사체의 구성

인체 에리스로포이에틴 아미노산 시퀸스 내의 탄수화물 부가 부위의 위치는 제 5도에 나타내었다 (SEQ ID. NO:26). 에리스로포이에틴의 부가 글리코실레이션 부위를 생성하는 과정은 제 6A-C 도에 요약하였고, 하기하였다.

다음의 올리고뉴클레모티드 프라이머는 시험관 내 돌연변이 유발에 사용하도록 합성한 것이다:

밑줄친 코돈은 야생형 아미노산을 괄호안에 나타낸 아미노산으로 데체시키는 잘못대응된 부위이다.

[Asn⁴, Ser⁶] EPO는 Asn4 에 N-글리코실레이션 부위를 가하여 구성하였다. [Asn⁹, Ser¹¹] EPO는 Asn9 에 N-글리코실레이션 부위를 가하여 구성하였다. [Asn⁶⁹] EPO 는 Asn69 에 N-글리코실레이션 부위를 가하여 구성하였다. [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO는 Asn125에 N-글리코실레이션 부위를 가하여 구성하였다.

[Thr¹²⁵] EPO 와 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO 는 Thr 125 에 O-글리코실레이션 부위를 가하여 구성하였다.

다음의 올리고뉴클레오티드 프라이미는 시험관 내 돌연변이유발에 사용하기위해 합성한 것이다.

[Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO cDNA 로부터 출발하여, 올리고뉴클레오티드프라이머인 5'3' (SEQ ID. NO: 16)은 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶] EPO를 생성하는 데에 사용한다.

다음으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머인 5'3'(SEQ ID. NO: 17)은 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹] EPO를 생성하는 데에 사용한다. [Asn⁶⁹, Thr⁷¹] EPO 와 [Ser⁶⁸, Asn⁶⁹, Thr⁷¹] EPO 는 Asn69 에 N-글리코실레이션 부위를 가하여 그 부위에 N-글리코실레이션이 증가 되도록 구성한다. [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO, [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷, Thr¹³¹] EPO, [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO 및 [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Thr¹²⁷] Epo 는 Asn125 에 N-글리코실레이션을 가하여 그 부위에 글리코실레이션이 증가하도록 구성한다. [Thr¹²⁵, Thr¹²⁶] EPO 와 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Ser¹³¹] EPO 는 Thr125 에 O-글리코실레이션 부위를 가하여 그 부위에 글리코실레이션이 증가하도록 구성한다.

시험관 내 돌연변이유발을 위한 에리스로포이에틴 DNA 원은 PUC 8 내의 인체 에리스로포이에틴 클론인 플라스미드 Hu13 이었다[Law 등의, Proc Nat1. Acad. Sci. 83, 6920 (1986)참조]. Hu13 으로부터 유도한 플라스미드 DNA 를 BstEII 와 Bg1II 제한 효소로 절단하여, 그 결과 생성된 DNA 단편을 아가로스 겔 전기이동시키고, 에리스로포이에틴 DNA 단편 810 염기쌍(bp)을 GensClean^TM키트를 사용하여 겔로부터 분리하며 그 방법은 제조업자(BI0101, 인코포레이티드)가 제공하였다. 공동 소유한 Lin 의 특허, 상기문헌에 기술된 바와 같이, 플라스미드 pBRgHuEPO는 pBR322 의 유도체내로 삽입시킨 BamHI 단편으로서 에리스로포이에틴 게놈 유전자를 함유한다. 또한, pBRgHuEPO 를 BstEII 와 Sg1II 로 절단하여 6517 bp 의 벡터 단편을 회수하였다. 이 두 단편을 결합시켜 IGT1 을 얻는다. pEC-1을 구성하기 위하여, pDSVL(공동 소유한 Lin 의 특허, 상기문헌에 기술되어 있으며 제 6B 도에 나타내었음)을 BamHI 으로 절단하고 에리스로포이에틴 cDNA를 함유하고 있는 IGT1 으로부터 분리한 2.8 킬로배이스(kb)의 BamHI 단편을 그 내로 결합시켰다.

시험관 내 돌연변이 유발을 위한 단일-가닥 DNA 를 생성하기 위해 pEC-1을 BamHI 과 Bg1II 로 절단하여 820 bp 의 에리스로포이에틴 cDNA 단편을 분리하였다. 그것을 m13mp18 [Yaniseh - Perron 등의 Gene 33, 103 (1985) 참조] 의 BamHI 부위 내로 결합시켜 m13-EC-1을 생성하였다.

kunkel 등의 Methods in Enzymol. 154, 367(1987) 및 Messing 의 Methods in Enzymol. 101, 20 (1983) 문헌에 기술된 바와 같이 m13-EC-1 로 감염시킨 E. coli 균주 RZ1032 의 상청액으로부터 단일 가닥 DNA를 회수하였다. 시험관 내 돌연변이 유발을 위해 대략 1 ㎍ 의 단일-가닥 DNA 와 상기 합성 프라이머 중 하나의 0.2 pmole 을 6 ㎕ 의 완충용액(250 mM 트리스, pH 7.8, 50 mM MgCl2, 및 50 mM 디티오트레이톨)과 혼합하였다. 주형에 프라이머를 어닐링시키기 위해, 물로 반응부피를 10 ㎕ 로 맞추고 이 혼합물을 5 분간 65 ℃ 로 가열한 다음 실온에서 식힌다. 반응이 진힝되는 동안 dTTP, dATP, dGTP, dCTP 및 ATP(모두 10 ㎛)를 각각 2.5 ㎕ 씩 가한 다음 1 ㎛ (1 단위)의 E. coli DNA 폴리머라제(클레노우 단편)와 1 ㎕ (1 단위)의 T4 DNA 리가제를 가하였다.

그런 다음, 혼합물을 14 ℃ 에서 밤새 배양하고 (Messing 의 상기 문헌)에 기술된 바와 같이 E. coli JM 109 [Yanisch-Perron 등의 Gene 33, 103 (1985)참조]를 형질 전환시키는데 사용 하였다.

분별 혼성화로 돌연변이체 클론을 확인하기 위해 영양 한천 상의 플라크를 진 스크린 필터즈(Gene Screen filters)(뉴 잉글랜드 뉴클리어)로 전이시켰다. 필터를 적외선등하에서 건조시키고 60 ℃ 에서 1 % SDS 를 함유한 6 × SSC 에서 1 시간동안 배양하였다. 혼성화를 위해 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머(8 pmoles)를 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 γ³²P-표지 ATP 로 말단 -표지시키고 [Asn¹²⁴] 돌연변이는 37 ℃, [Asn⁴, Ser⁶] 돌연변이는 55 ℃, [Thr¹²⁵] 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] 돌연변이는 65 ℃,[Asn⁹, Ser¹¹] 및 [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵] 돌연변이는 70 ℃ 에서 6 × SSC, 0.5 % SDS와 100 mg/ml 의 연어 정자 DNA 에서 필터와 함께 밤새 배양하였다.

다음날, 필터를 실온에서 6 × SSC 로 3회 세척하고 오토래디오그래피시켰다. 필요하다면, 야생형 에리스로포이에틴 cDNA 시퀀스를 갖는 플라크에 대한 혼성화가 거의 또는 완전히 검출되지 않을 때까지 온도를 높여가며 6 × SSC 로 필터를 세척하였다. 이러한 조건하에서 양성의 혼성화 시그널을 갖는 클론을 확인하여 JM109 내로 재형질감염시켜서 순수한 클론을 분리하였다. 디데옥시 사슬 종결 시퀸스 분석으로 아스파라긴, 세린, 트레오닌 및 프롤린 잔기에 대한 돌연변이가 존재함을 알 수 있다.

[Asn⁴, Ser⁶], [Asn⁹,Ser¹¹], [Asn⁶⁹], [Asn¹²⁴], [Asn¹²⁵], [Ser¹²⁷], [Asn¹⁶³,Ser¹⁶⁵], [Thr¹²⁵] 및 [Pro¹²⁴,Thr¹²⁵] 변화를 가지고 있는 이중 가닥 m13 EC-1DNA 를 보일링 방법[Holmes 등의 Anal.Biochem 117, 193 (1981)참조]에 의해 형질감염시킨 JM109 세포로 부터 회수하였다.

그 DNA를 BstEII 와 XhoII 로 절단하여 810 bp 의 에리스로포이에틴 DNA 단편을 분리하였다. pEC-1 을 BstEII 로 절단하고 Bg1II 로 연이어 부분 절단하여 그 결과 생성된 단편의 5' 말단을 60 분간 60 12, 10 mM 트리스, pH 8 에서 박테리아성 알칼리 포스파타아제로 탈인산하시켰다.

810 bp의 BstEII-Bg1II 단편이 결여된 7 kb 벡터 단편을 분리하여 상기 에리스로포이에틴 단편에 결합하였다.

그 결과 생성된 플라스미드(pEC-X 라 명명함. X 는 유사체 번호)는 지정된 위치에서 변형된 아미노산을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 암호화하는 DNA를 함유한다.

선택적으로, 에리스로포이에틴(유사체)(pEC34)를 아미노산 잔기 41-55 가 삭제되는 시험관 내 돌연변이유발로써 구성하였다. 이 결과 BstEII-BglII 단편을 함유하는 더 짧은 (775 bp) EPO 가 생성된다. 이 단편을 상기한 바와 같이 pEC1 내로 삽입시켰다. 에리스로포이에틴 유사체를 클로닝하기 위해 pEC34를 BstEII 로 전단하고 BglII 로 부분 전단하고 탈인산화시켜 이 벡터를 상기한 바와 같이 분리하였다. 상기한 바와 같이 7 kb의 벡터 단편을 에리스로포이에틴 단편에 결합하였다. pEC34 의 클로닝으로 제조합체와 단순한 레클로저(reslo6ure)간의 식별이 용이하게 된다.

레클로저는 유사체보다 더 작은 BbtEII-BglII 단편을 생성하며 이들은 아가로스 겔 상에서 쉽게 구별될 수 있다 ;

이러한 일반적인 방법은 표 3 , 4, 및 5에 나타낸 에리스로포이에틴 유사체를 구성하는데에 사용하였다. 각 유사체에 대한 DNA 시퀀스의 변화가 나타나 있다 :

한편 돌연변이유발에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 인체 에리스로포이에틴의 프라이머와 상보적인 시퀀스를 갖는다.

[표 3]

[표 4]

pDEC-X(X는 유사체 번호)라 명명한 플라스미드는 플라스미드 pDSα2 의 유도체인 pDEC△ 내로 에리스로포이에틴 cDNA 를 삽입하여 구성하였다. 발현벡터 pDSα2 는 PCT 출원 번호 재WO 90/14363호에 일반적으로 기술되어 있다. 다음 과정에 따라 pDSα2 로부터 pDES△ 를 유도하였다:

(1) pDSα2 DNA 를 HindIII 로 전달하고 E.coli DNA 폴리머라제(클레노우 단편)와 dNTPs로 HindIII 의 코히시브(cohesive)말단을 처리하고 블런트(blunt)말단 벡터를 재결합하여 pDSα2 의 HindIII 부위를 제거하였다. 그 결과 생성된 플라스미드는 pDSα2△H 였다.

(2) pDSα2△H를 SalI으로 절단하고 3'말단에 결합되어 있는 SalI 링커를 수반한 SV40 (Tooze, J. 의 ed. Molecular Biology of Tumor Viruses, 2nd edition : DNA Tumor Viruses, Part 2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.)

스플라이스 시그널을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드를 이 pDSα2△H에 결합하였다. 다음의 시퀸스가 합성 올리고뉴클레오티드이다(SEQ ID. NO:18):

그 결과로 생성된 플라스미드가 pDSα2△H 스플라이스였다.

(3) pDSα2△H 스플라이스를 SalI 으로 절단하고 이 코히시브 말단을 T4 DNA 폴리머라제와 dNTPs 로 처리하여 블런트-말단을 만들었다. 820 bp의 BamHI-BglII 인체 에리스로포이에틴 cDNA 단편을 같은 방법으로 블런트-만발화하여 상기 플라스미드에 결합시켰다. 그 결과 생성된 플라스미드가 pDEC-1 이었다.

(4) pDEC를 KpnI 및 PvuII 로 절단하고, 밍 빈 뉴클레아제 (mung bean nuclease)로 코히시브 말단을 처리하여 블런트-말단화하였다. 절제된 KpnI-PvuII 단편을 삭제하기 위해 그 플라스미드를 재결합시켜 플라스미드 pDEC△를 생성하였다.

BstEII 로 완전히 절단하고 연이어 BglII 로 부분 절단하여 pDEC△ 로부터 pDEC-X를 제조하였다. 에이스로포이에틴 암호화 시퀀스가 결여된 벡터 단편을 분리하여 원하는 플라스미드를 포함하는 810 bp 의 BstEII-BglII 단편에 결합시켰다.

다양한 아미노산의 변화를 갖는 몇몇 유사체들의 구성에 대한 세부 사항을 하기하였다.

pDES(N47) 및 pDEC(N48) 의 구성

asn30 thr32 Val87 asn88 및 thr90 돌연변이를 함유하는 pDEc(N47)를 pDEC(N18) 및 pDEC(N4)로부터 구성하였다. PDEC(N18)를 HindII 및 SglII 로 절단하여 445 bp의 단편을 분리하였다. pDEC(N4)를 BstEII 및 HindII 로 절단하여 377 bp의 단편을 분리하였다. 이러한 두 단편을 상기한 바와 같이 BstEII 및 BglII 로 절단한 pDEC△ 내로 결합시켜 pDEC(N47)을 생성하였다.

asn69 thr71 ser87 asn88 및 thr90 돌연변이를 함유하는 pDEC(N48)를 pDEC(N14) 및 pDEC(N11)로부터 구성하였다. pDSC(N14)를 HindII 및 BglII 로 절단하여 445 bP의 단편을 분리하였다. pDEC(N11)를 BstEII 및 HindII 로 절단하여 377 bp의 단편을 분리하였다. 이러한 두 단편을 상기한 바와 같이 BstII 및 BglII 로 절단한 PDEC△ 내로 결합시켜 pDEC(N48) 를 생성하였다.

pBEC(o62)의 구성 (HCG-애리스로포이에틴 융합)

pDES(o62)는 pEC1 및 인체 융모성 성선자극호르몬의 카르복시 말단의 28 개 아미노산 (ser-ser-ser-ser-lys-ala-pro-pro-pro--ser-leu-pro-ser-pro-ser-arg-leu-pro-gly-pro-ser-asp-thr-Pro--ile-leu-pro-gln) (SEQ ID. NO: 25) 을 함유하는 107 염기 쌍의 StuI-BglII 합성 DNA 링커로부터 제조하였다. [Pierce등의 Ann. Rev. Bioehem. 50, 465 (1981) 참조]. 링커의 시퀀스는 다음과 같다:

pEC1을 StuI과 BglII 로 절단하여 610 bp의 DNA 단편을 분리하였다. 합성 링커를 ATP 와 폴리뉴클레오티드키나아제로 인산화시키고, 미리 BstEII 로 절단하고 BglII 로 부분 절단해 둔 pDEC△ 내로 상기한 바와 같이 pEC1 단편을 결합시켰다.

pDEC(NO1) 의 구성

pDEC(NO1)를 PDEC(o62) (HCG-EPO) 및 pDEC(N14) (Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰) 으로부터 제조하였다. pDEC177를 stuI 및 BglII 로 절단하여 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰돌연변이를 포함하는 610 bp 의 DNA 단편을 진-클린(gene-clean)으로 분리하였다.

pDEC(o62)를 StuI 과 BglII 로 절단하여 107 염기쌍의 단편을 분리하였다. 이러한 두 DNA 단편을 미리 BstEII 로 절단하고 BglII 로 부분 절단해 둔 pDEC△ 내로 상기한 바와 같이 결합시켰다.

pDEC(NO2) 의 구성

pDEC(NO2) 를 pDEC(o62) (HCG-EPO) 및 pDEC(N47) (Asn³⁰Thr³²val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰) 으로부터 제조하였다. pDEC(N47) 를 StuI 및 BglII 로 절단하여 Asn³⁰Thr³²val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰돌연변이를 포함하는 610 bp의 DNA 단편을 GeneCleanTM으로 분리하였다. pDEC(o62) 를 Stul 과 BglII 로 절단하여 107 염기쌍의 단편을 분리하였다. 이러한 두 DNA 단편을 미리 BstEII 로 절단하고 BglII 로 추격 절단해 둔 pDEC△ 내로 상기한 바와 같이 결합시켰다.

pDEC(N16) 의 구성(Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²)

pDEC(N16) 를 pDEC(N14) (Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰) 및 pDEC258 (Ala¹⁶²) 로부터 제조하였다. pBEC258을 상기 시험관내 돌연변이 유발 방법을 사용하여 위치 162의 AGG 코돈을 GCG로 변화시켜서 구성하였다. pDEC(N14)를 StuI 및 BglII 로 절단하여 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰돌연변이를 포함하는 610 bp의 DNA 단편을 GeneClean^TM으로 분리하였다. pDEC258 을 StuI 및 BglII 로 분리하여 210 염기쌍 단편을 분리하였다.

이러한 두 DNA 단편을 미리 BstEII 로 절단하고 BglII 로 부분 절단해 둔 pDEC△ 내로 상기한 바와 같이 결합시켰다.

pDEC(R1), (R2) 및 (R3)의 구성

pDEC(N14)로부터 글리코실레이션 부위를 제거하기 위해 Ser87asn88 및 thr90 돌연변이를 함유하고 있는 m13-EPO(N14)를 다음의 프라이머를 사용하여 상기한 바와 같이 시험관내 돌연변이 유발을 실시하였다:

그 결과 생성된 플라스미드를 pDEC(R1) (gln²⁴ser⁸⁷asn⁸⁸thr⁹⁰)pDEC(R2) (gln³⁸ser⁸⁷asn⁸⁸thr⁹⁰) 및 pDEC(R3) (gln⁸³ser⁸⁷asn⁸⁸thr⁹⁰) 이라 명명하였다. m13EC-1도 역시 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머로 시험관내 돌연변이 유발시켜 pEC10(gln²⁴) 및 pEC8 (gln³⁸)을 생성하였다. pEC9 (gln⁸³) 은 다음의 프라이머를 사용하여 구성하였다.

인체 에리스로포이에틴 및 [Asn⁴, Ser⁶] EPO, [Asn⁹, Ser¹¹] EPO, [Asn⁶⁹] EPO, [Asn¹²⁴] EPO, [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO, [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵] EPO, [Thr¹²⁵] EPO 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO 에 상응하는 유사체의 cDNA 클론과 표 3, 4 및 5에 기술한 유사체의 cDNA 클론을 일렉트로포레이션을 통해 COS-1 세포 (ATCC기탁번호 제 CRL-1650호) 내로 전이시켰다. 이 세포를 배지 (5 % 태아 송아지 혈청과 1 % L-글루타민/페니실린/스트렙토마이신(이르빈 사이언티픽)을 함유하고 있는 둘베코의 변형된 필수 배지)로 세척하고 4 × 10⁶세포/ml 로 재현탁시켜 반 - 전면 접시 (semi-eonfluent dishes)에서 COS-1 세포를 수득하였다. 세포 중 1 ml 를 인렉트로포레이션 크벳(바이오-레드)에 옮겨 담고, 100 내지 200㎍ 의 운반 DNA와 에리스로포이에틴 유사체를 암호화하는 2 내지 20㎍ 의 플라스미드 존재하의 25μfd 및 1600 럭트에시 바이오-레드 진 풀서(Gene Pulser) 로 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션된 세포를 5 ㎕ 배지에서 조직 배양 접시 60 mm 당 2 × 106 세포로 펑판화시켰다. 2 내지 4 시간 후 평판화된 배지를 5 ml 의 신선한 배지로 대체했다. 일렉트로포레이션 후 3 내지 5 일에 조정배지를 수집하였다.

실시예 7: 에리스로포이에틴 유사체의 특정화

A. 탄수화물 부가의 측정

실시예 6에서 기술한 바와 같이 에리스로포이에틴 유사체 cDNA 로 형질간염시킨 COS 세포에서 수득한 5-20 단위를 함유하는 상청액 부피를 실온에서 토끼의 항-에리스로포이에틴폴리클론 항체로 밤새 면역침강시켰다. 20-80 ㎕ 의 1 : 1 단백질 A-세파로스가 함유된 인산염-완충 식염수 (PBS) 를 면역 침강물에 가하고 실온에서 1 시간 동안 방치해 둔다. 이 시료를 원심분리하여 PBS 로 세척하고, N - 결합 탄수화물 사슬을 제거하기 위해 N-글리카나제로 펠릿을 처리하였다. 시료를 15 % SDS-폴리아크린아미드 겔 전기 영동법으로 분석하고, 니트로셀룰로스에 옮긴 다음 쥐(mouse) 의 항-에리스로포이애틴 모노클론 항체 혼합물을 사용하여Burnette 등의 Anal. Bioehem. 112, 195-203 (1981): Elliott 등의 Gene 79, 167-180 (1989) 문헌에 기술된 바와 같이 웨스턴 분석을 실시하였다. 상기 항체 중 하나는 9G8A 이고 Elliott등의 (1989) Blood 74, Supp. 1, A. 1228 문헌에 기술되어있다.

[Asn⁶⁹] EPO 및 [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO cDNA로 형질감염시킨 COS 세포의 상청액을 분석하여 인체 시퀸스 에리스로포이에틴에 비해 단백질의 크기가 증가하였음을 알 수 있다.

이러한 크기의 증가는 N-결합 탄수화물 사슬이 첨가되었음을 말해 준다(제 7 도). [Thr¹²⁵] EPO 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO cDNA로 형질감염시킨 COS 세포의 상청액을 N-글리카나제로 처리한 결과 인체 시퀸스 에리스로포이에틴에 비해 증가된 단백질 크기를 나타냈다. 이러한 크기의 증가는 O -결합 탄수화물 사슬이 첨가되었음을 말해 준다(제 8도). 다른 선택된 유사체의 웨스턴 블롯 분석은 제 10도에 나타나있다.

EPO 에 가해진 N - 결합 탄수화물 사슬의 수를 결정하기 위해 N-글리카나제의 부분 절단을 실시하였다. 유사체나 rHuEPO를 CHO 세포에서 발현시키고, 혈청이 없도록 조절한 배지를 모았다. 40 단위의 EPO (H2O 로 부피가 15㎕ 가 되게 맞춤)를 함유하는 각 시함관에 10㎕ 의 0.5 % SDS 를 가하고, 각 시료를 3 분간 가열했다. 그런다음 10.8㎕ 의 0.5 M NaPO₄pH 8.6, 5 ㎕ 의 7.5 % 노니테트 (nonidet) P40 및 1.5 ㎕ 의 250단위/ml N-글리카나제(겐자임)를 가하였다. 시료를 37℃ 에서지정 시간동안 배양하였다. SDS-PAGE시료 완충용액 (상기 참조)을 가하여 반응을 정지시키고, 기질로서 4 - 클로로나프톨을 사용하고 항-EPO 폴리클론 항체 및 항-토끼 vectastain^TM키트 (벡터 라보라토리스)를 사용하여 SDS-PAGE 웨스턴 분석 (10 % 아크린아미드)을 실시하였다. 인체 에리스로포이에틴 및 유사체 N14 에 대해 이러한 방법을 사용한 N-결합 사슬의 분석은 제 11 도에 나타나 있다.

B. 에리스로포에이틴 유사체의 활성도 분석

Egrie 등의 상기문헌에 따라 RIA를 실시하였다. 제조자에 의해 제공된 방법에 따라 CLINIGENTM EIA 키트 (R 및 D시스템) 로 EIA를 실시하였다. 익스하이폭식(exhypoxic) 다혈구증 쥐(mouse) 생물검정(Cotes 등의 상기문헌) 을 이용하여 하기한바와 같이 CHO 세포의 조정배지로부터 수득한 정제된 에리스로포이에틴 또는 에리스로포이에틴 유사체를 발현하는 CHO 세포로부터 얻은 상청액에서 에리스로포이에틴 유사체의 생체내 생물학적 활성도를 측정하였다.

Iscove 등의 J. Cell physill. 83, 309-320 (1974) 문헌에 기술된 방법을 변형하여 에리스로이드 콜로니 형성 측정법으로 시험관내의 에리스로포이에틴 활성도를 측정하였다. 인체골수 세포로부터 단핵성 세포를 피콜-파크 쿠션에서 부분 정제하였고, 핑판화시키기 전에 점착성 세포를 제거하기 위해 이스코브 배지에서 세척하였다. 이 배지는 0.9 % 메틸셀룰로오스는 함유하고 있으나 소의 혈청 알부민은 함유하지 않았다. 배양한 지 8 내지 10 일 후에 에리스로이드콜로너의 수를 기록하였다.

실시예 6 에서 기술한 바와 같이 COS 세포에서 형질감염되고 발현된 에리스로포이에틴 유사체를 RIA, EIA 및 에리스로드콜로니 형성 측정법을 사용하여 COS 세포의 조상청액에서 분석하였다. 정제된 인제 시퀀스 에리스로포이애틴은 상기 -언급한 분석법에 의해 측정한 바와같이 RIA 활성도와 비교할 수 있는 시험관내 활성도를 가진다. [Asn⁶⁹] EPO, [Thr¹²⁵] EPO 및 [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO 유사체는 RIA 활싱도에 필적할만한 시험관내 활성도를 보였고, 부가 탄수화물 사슬을 가지고 있다는 증거를 제공하였다(A항에 기술한 바와 같음). 에리스로포이에틴 유사체를 암호화하는 cDNA블론을 CHO 세포내로 형질감염시켜 [Thr¹²⁵] EPO 및 N4, N11, N14, N16, N18, N47, N48, o62, NO1 및 NO2 유사체를 더 분석하고 CHO 세포의 상청액에 대해 RIA 또는 EIA 및 생채내 생물학적 분석을 실시하였다. 그 결과는 표 6 에 나타나 있다. CHO 세포의 상청액에서 발현된 R1, R2 및 R3 유사체에 대한 생채내 활성도는 표 7 에 나타나 있다.

표 6 의 각주

^a실시예 7A 에 기술된 바와같이 SDS 겔 상에서 유사체 폴리펩티드의 이동성에 근거하여 부가 N-결랍 사슬의 수를 측정하였다.

^b유사체의 생채내 활성도와 에리스로포이에틴 유사체 양의 비율. 활성도 측정은 쥐(mouse)의 다혈구혈증 생물검정법을 사용하여 유사체의 CHO 세포 상청액에 대해 실시한다. 본문에 기술된 바와 같이 RIA 또는 EIA에 의해 CHO 세포의 상청액내 에리스로포이에틴 유사체의 양을 측정하였다.

^c실시예 7A 에 기술된 바와 같이 N -글러카나제 부분 절단 후에 SDS-겔 상에서 당단백질의 이동을 검사하여 부가 탄수화물 사슬의 수를 확인하였다.

^dSer¹²⁶에서의 O-결합 사슬이 인체 에리스로포이에틴 분자의 70 % 를 차지한다.

^e환원된 O-글리코실레이션을 갖는 유사체는 Ser¹²⁶에 분자의 70 % 이하로 탄수화물 사슬을 갖는다.

^fThr¹²³EPO는 분자의 60 % 이상으로 두개의 O-결합 사슬을 갖는다. Thr¹²³EPO는 분자의 약 40 % 로 두개의 O-결합 사슬을 갖는다. Pro¹²⁴Thr¹²⁵EPO는 분자의 80 % 이상으로 두개의 O-결합 사슬을 갖는다.

^g이러한 유사체들은 적어도 3개의 O-결합 사슬을 가지며, 4개 또는 5개일 수도 있다. HCG 만이 4개의 O-결합사슬을 갖는 것으로 공지되어 있다.

N.T. 시험되지 않음.

RIA 또는 EIA의 생체내 활성도의 비는 표 6 의 각주에 기술한 바와 같이 측정하였다.

C. 에리스로포이에틴 유사체로부터 유도한 동형 혼합물의 제조방법.

[Thr¹²⁵]EPO(EPO 050)

에리스로포이에틴 유사체인 [Thr¹²⁵] EPO 를 실시예 S 의 [A항] 에 기술한 바와 같이 구성하였다. [Thr¹²⁵] 돌연변이를 가지는 810 bp의 에리스로포이에틴 cDNA 단편을, [Thr¹²⁵] 돌연변이를 함유하고 있는 플라스미드 pEC를 BstEII 및 BglII 로 절단하고 이 단편을 pEC△, [pDSα2 의 유도체] (실시예 6에 기술하였음) 에 결합시킴으로써 분리하였다.

[Thr¹²⁵] 에리스로포이에틴 CDNA 를 함유하고 있는 플라스미드 pDEC△ 를 DHFR-결핍 CHO 세포(Urlaub 와 Chasin 의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216(1980) 참조) 내로 형질감염시켰다. 770 ml 의 CHO 세포 조정배지를 10,000 단톤 분자량의 차단막을 사용하여 농축하고, pH 8.6 의 10 mM 트리스-HC1 로 투석여과하여 최종 부피가 34 ml 가 되게 하였다. 농축액의 17 ml 분취량을 동일 완충용액으로 펑형화시킨 Q-세파로스 고속 흐름 컬럼(5 ml 배드 부피) 상에 적하하고 O-250 mM NaCl 이 함유된 10 mM 트리스-HC1, pH 8.6 으로 선형 기울기식으로 용리하였다. N-글리카나제로 소화시키거나 아니면 처리하지 않은 컬럼분획의 분취량을 SDS-PAGE나 IEF로 분석하고, 동형 및/또는 이 분획의 탄수화물 조성물에 기초하여 풀(2, 3 및 4로 명명함)을 제조하였다. 각각의 풀을 비닥 C4 컬럼 (214TPB 2030; 1 cm의 지름: 1.8-2.5 ml 의 배드 부피: 0.34 ml/min)에 적하하고, 20 % 에탄올이 함유된 pH 7.0 의 10 mM 트리스 - HCl 의 2 컬럼 부피로 세척하였다. 컬림을 10 mM 트리스-HCl, pH 7.0, 20-94 % 에탄올로 선형 기울기식으로 용리하였다. 풀을 제조하여 pH 7.0의 10 mM 트리스-HC1 로 희석하고, Q-세파로스 고속 흐름 컬럼에 적하하였다. pH 7.0 의 10 mM 트리스-HC1 로 세척한 다음, 시료를 20 mM 시트르산 나트륨, pH 7.0 의 250 mM NaCl 로 용리하였다.

정제된 [Thr¹²⁵] 풀을 IEF 로 분석하여 제 9도에 나타내었다. 이러한 풀의 생체내 생물학적 활성도를 상기한 바와같이 (Cotes등의 상기 문헌) 분석하여 그 결과를 표 8 에 나타내었다.

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO (EPO N14)

제조방법 1

이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피의 3단계 과정을 통해 EPO N14 유사체를 정제하였다. 이온 교환 크로마토그래피 단계 중 고수준의 시알산을 갖는 동형 혼합물을 제공하도록 분획을 풀로 만들었다. 응집물을 찾기나 갖지 않는 유사체를 포함하는 역상 크로마토그래피를 실시하는 동안 두개의 풀을 부가적으로 만들었다. 정제 방법의 세부 사항은 하기되어 있다.

1. EPO N14 유사체를 발현하는 CHO 세포로부터 조정배지를 수득하고 YM10 막 (아미콘)을 지닌 교반 셀을 사용하여 약 2.5 배 농축시키고 pH 8.5의 10 mM 트리스에 대하여 투석 여과하였다.

2. pH 8.5의 10 mM 트리스로 정형화시킨 Q-세파로스 FF (파마시아) 컬럼의 ∼12 A₂₈₀/ml 수지에서 유속 0.2 cm/min 으로 농축된 배지를 적하하였다.

3. 적하한 후, 3 컬럼 부피(CV) 의 10 mM 트리스, pH 8.5 로 컬럼을 세척하고, 50 CV의 0 - 0.5 M NaCl/10 mM 트리스, pH 8.5로 기울기식 용리하였다. 1 CV의 분획으로 모았다.

4. 각 분획의 시료를 pH 3 - 5의 IEF 겔 상에서 런닝시켰다. IEF상의 동형 분포에 기초하여 대량으로 동형 11 - 18 을 함유하는 풀 분획을 제조하였다. 풀의 최종 농도가 1 mM이 되도록 EDTA를 가하였다.

5. 20 % 에탄올/10 mM 트리스 pH 7.0으로 평형화시킨 역상 C4 컬럼 (비닥)의 ∼5 A280/ml 수지에서 2.5 cm/min의 유속으로 동형 풀을 적하하였다. 컬럼을 1 CV 의 20 % 에탄올/10 mM 트리스 pH 7.0 으로 세척하고, 1 cm/min 의 유속으로 30 CV 의 20 - 94 % 에탄올/10 mM 트리스 pH 7.0 으로 기울기식 용리하였다. 0.2 CV의 분획으로 모았다.

6. 각 분획의 시료를 비 - 환원 12 % SDS - PAGE 로 분석하였다. SDS 겔 상에서 관찰되는 응집물의 존재여부에 따라 2개의 개별 풀을 제조하였다. 풀 #1 은 EPO 유사체는 함유하고 있으나 응집물은 함유하지 않았다. 풀 #2 는 EPO 유사체와 응집물 모두를 함유하였다.

7. 센트리콘 10'S (아미콘) 를 사용하여 풀 #1 을 약 65 배로 농축하고 풀 #2 를 약 250 배로 농축하였다.

각각의 풀을 20mM NaCitrate/ 100mM NaCl로 완충교환시켰다.

8. 각 풀을 20 mM NaCitrate/100 mM NaCl pH 7.0으로 평행화시킨 HPLC 바이오실(Siosil) SEC-250 (바이오레드) 컬럼에서 개별적으로 정제하였다.

2.26 cm/min 의 유속으로 < 6 A280/ml 수지에서 풀을 적하하였다. 단위 유사체에 상응하는 피크를 각 런으로부터 모았다.

9. 각 풀의 흡광도를 측정하고 각 풀의 일부를 SDS - PAGE 및 IEF 겔로써 분석하기 위해 농축하였다. 풀 #1 은 동형 15-17 의 분포를 가지며 약동력마 및 수용체 결합 실험용으로 사용하였다.

제조방법 2

이온 교환 크로마토그래피, 역상 HPLC 및 수산화인회석 크로마토그래피의 3단게 과정을 통해 EPO N14 유사체를 정재하였다. 이온 교환 크로마토그래피 단계 중에 유사체를 서로 다른 동형 혼합물을 함유하고 있는 3 개의 풀로 나누었다. 정제에 관한 세부 사항은 하기되어 있다.

1. EPO N14를 발현하는 CHO세포 상청액을 수득하고, 필트론 미니-울트라세테(Filtron Mini-Ultrasette) 접선유동 장치를 사용하여 대략 10 배로 농축하고 10 mM 트리스 pH 8.5 에 대하여 투석여과하였다.

2. 10 mM트리스 pH 8.5로 평현화시킨 Q-세파로스 FF (파마시야) 컬럼의 ∼10 A280/ml 수지에서 유속 0.2 cm/min으로 농축배지를 적하하였다.

3. 적하한 후, 3 컬럼 부피(CV) 의 10 mM 트리스 pH 8.5 로 세척하고 50 CV의 0-0.5M NaCl/10 mM 트리스 pH 8.5로 기울기식 용리하였다. 1 CV의 분획으로 모았다.

4. 각 분획의 시료를 pH 3-5의 IEF 겔 상에서 런닝시켰다. IEF애 의해 측정된 동형의 분포에 근거하여 3개의 개별 분획 풀을 제조하였다. 저동형 풀 (동형 4 - 12), 중간동형 풀 (동형 5-15), 고동형 풀 (동형 6-18)을 제조하였다.

5. 각 동형 풀을 개별적으로 비닥 C4 역상 HPLC 컬럼 상에서 정제하였다. 0.1 % TFA/H2O 에서부터 0.1 % TFA/75 % 아세토니트릴까지 분당 아세토니트릴을 1 % 씩 증가시키는 속도로 기울기식 전개하였다.

6. 각 풀의 유사체 피크를 모아 80 mM 트리스 HC1/2O mM 트리스 염기로 4 부피로 희석한 다음, 용매 내성 센트리콘 3'S 를 사용하여 10mM 트리스 pH 7.2로 농축 및 완충교환하였다.

7. 각 시료를 10 mM 트리스 pH 7.2로 2 A₂₈₀/ml 까지 희석한 다음, 동부피의 4 M 구아니딘 HCl(GuHCl), 10 mM CHAPS, 10 mM 트리스 pH 7.2 를 가하여 최종 시료 농도가 1 A₂₈₀/ml 가 되게 하였다. 2 M GuHCl, 5mM CHAPS, 10 mM 트리스 pH 7.2 로 핑형화시킨 수산화인회석 미니컬럼에 각 시료를 적하하였다. 평형화시킨 완충용액으로 컬럼을 세척하고 흘러내리는 것을 1 CV의 분획으로 모았다.

8. 분획의 흡광도를 측정하고 풀을 제조한 다음, 센트리콘 10'S 를 사용하여 10 mM 트리스 pH 7.2 로 완충용액을 교환하였다. 각 풀의 흡광도를 측정하였다.

SDS-PAGE 및 IEF 겔을 통해 최종 풀을 분석하였다. IEF 겔은 제 12도에 나타나 있다. 실시예 7 A 에 기술한 바와 같이 RIA 및 생체내 활성도를 측정하였다. 최종동형 풀의 생체내 활성도는 표 8에 기록되어 있다. 쥐의 헤마토크리트 증가를 측정하기 위하여 고시알산 동형 풀을 실험에 사용하였다.

^a1 mg/ml 용액애 대한 흡광 계수를 0.93으로 하여 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO 동형 풀의 A₂₈₀으로부터 에리스로포이에틴 펩티드좌 밀리그램을 계산하였다.

^b활성도 측정을 1회 또는 2회 실시하였으므로 Thr¹²⁵EPO 동형풀에 대한 표준 편차는 기록하지 않는다.

실시예 8: EPO N14 유사체의 생물학적 특성

EPO N14 유사제의 통형 풀, 제조합 인체 에리스로포이에틴(rHuEPO) 및 분리된 rHuEPO 동형 14 의 활성도를 정맥내 약 동력학적 분석, 수용체 결합 분석 및 해마토크리트 연구면에서 비교하였다. SPO N14 동형 풀을 실시예 7C 에 기술한 바와 같이 제조하였다. rHuEPO를 Lai 등의 상기 문헌 방법에 따라 제조하였다. rHuEPO 동형 14 를 다음과 같이 정제하였다: 동형 10, 11, 12, 13, 14 및 15의 혼합물로구성된 rHuEPO 를 10 mM 트리스 pH 7.2로 평헝화시킨 9-세파로스 고속 흐름 컬럼 (단면적 = 2.2 cm 지름 × 3.4 cm 높이)에 적하하였다. 적하시킨 컬럼을 2 mM 아세트산/6 M 요소 (이하 완충용액 "A"라 함)로 평형화시킨 다음 동형 13 및 14의 정제에 가장 효율적이도록 고안된 다단계식 기울기를 실시한다. 기울기는 750 mL의 0 % 내지 7.3 % 의 800 mM 아세트산/6 M 토소 (이하 완충용액 "B" 라 함), 750 mL 의 7.3 % 내지 11.4 % 의 완충용액 "B", 1250 mL 와 11.4 % 내지 26.8 % 의 완충용액 "B", 1250 mL 의 26.8 % 내지 62.4 % 의 완충용액 "B", 700 mL 의 62.4 % 내지 100 % 의 완충용액 "B"로 한다. 12.5 mL 의 분획을 모아 수산화암모늄으로 중화하고 폴리아크린아미드 겔 상에서 등전점전기이동으로써 분석하였다. 순수한 동형 14를 함유하는 이러한 분획을 함께 풀링하여 YM-10 막이 구비된 아미콘 교반 셀로 농축시킨 다음 물로 완충교환하였다.

A. IV 약동력학

EPO N14 유사체 (동형 15-17) 및 분리된 동형 14의 약동리학적 변수를 rHuEPO와 비교하기 위해 2가지 개별실험을 실시하였다.

310-378 g 체중의 숫컷 스프레그-돌레이 쥐(rat) 의 경동맥관 내로¹²⁵I - 분리된 동형 14,¹²⁵I - EPO N14 유사체 또는¹²⁵I-재조합 인체 에리스로포이에틴(애머샴) 1μCi 를 선택적으로 정맥내 주사하였다. 주사 후, 매 시간마다 혈액 0.3 ml 를 체취하여 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 각 혈청 시료 0.1 ml 내¹²⁵I-EPO (재조합 인체, 분리된 동형 14, 또는 EPO N14 유사체 중에서 선택함) 농도를 측정하고나서 90 % 에탄올과 함께 4℃ 에서 밤새 항온하였다.

각 혈청 시료내 에탄올-침강된¹²⁵I-EPO 를 감마 카운터로 계산하여 결과적인 약동력학적 곡선을 제 13도에 나타냈다. PCNONLIN 4.0 비 1 차 회귀 분석법(nonlinear regression analysis)(스터티스티컬 컨설턴트, 1992)을 이용하여 각 쥐에 대한 약동력학적 변수를 결정하고 각 그룹의 결과의 평균치를 구하였다. EPO N14 유사체 및 분리된 동형 14의 약동력학적 실험의 결과는 표 9 에 요약되어 있다.

표 9 에 제시된 바와 같이, 재조합 인체 에리스로포이에틴의 계산된 정화값과 EPO N14 유사체의 혈청 정화값을 비교하면 큰 차이가 있다. 분리된 동형 14의 배타 반감기가 3.97 시간 및 EPO N14 유사체가 4.36 시간인 것에 비해 재조합 인체 에리스로포이에틴은 3.10 시간으로 가장 빠른 반감기를 나타냈다. 재조합 인체 에리스로포이에틴 그룹은 정화값 반감기에서도 분리된 동형 14 및 EPO N14 유사체가 각각 2.40 시간 및 3.03 시간인 것에 비해 1.78 시간으로 가장 빠른 정화값 반감기를 가졌다.

B. 수용체 결합 분석

인체 에리스로류케미아의 OCIM1 세포 [Papayannopoulou 등의 Blood 64 (supp. 1), 116α (1984) 참조]를 사용하여 콜드 치환 분석을 통해 EPO N14 유사체 (동형 15-17) 와 에리스로포이에틴 수용체의 상호작용을 연구하였다. 수용체와 결합하기 위하여¹²⁵I-rHuEPO와 경쟁하는데 요구되는 EPO N14 의 양을 결정하기 위해, 증가하는 농도의 비표지 EPO N14 를 일정농도의¹²⁵I-rHuEPO를 수반한 OCIMl 세포와 함께 배양하였다. 비교한 바와 같이, 증가하는 농도의 비표지 rHuEPO 도 일정 농도의¹²⁵I-rHuEPO와 경쟁시켰다.

비표지 EPO N14를 분석용 완충용액으로 희석하고 0.03 ng, 0.1 ng, 0.3 ng, 1.0 ng, 3.0 ng, 10.0 ng 및 30.0 ng (펩티드 질량에 기초함)씩 가하였다. 0.5 ng의¹²⁵I - 재조합 인체 EPO 를 모든 분석 시험관에 가한 다음 약 0.5 × 10⁶OCIMl 세포를 가하였다. 분석 시험관을 37℃ 의 진탕 수조에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 후, OCIM1 세포에 결합한¹²⁵I-rHuEPO로부터 결합하지 않은¹²⁵I-rHuEPO 를 분리하기 위하여 디부틸 프탈레이트/바이-프탈레이트 오일용액으로 원심분리하였다. 세포 펠릿을 분리하여 세포에 결합한¹²⁵I-rHuEPO의 양을 감마 카운트법으로 측정하였다. 세포에 특이적으로 결합한 수를 계산하고 경쟁자 부재시에 결합하는 50 %를¹²⁵I-rHuEPO의 경쟁시키는데 요구되는 비표지 단백질의 농도를 1차 회귀 분석으로써 측정하였다.

3 가지 분석의 결과 2.67 ± 0.73 ng 평균치의 비표지 EPO N14 펩티드가 OCIM1 세포에 결합하는¹²⁵I - rHuEPO 를 50 % 까지 감소시키는데 필요함을 알 수 있었다. 동일한 3가지 분석에서, 0.5 ng의¹²⁵I-rHuEPO 의 결합과 경쟁하는데에 0.51 ± 0.15 ng 평균치의 비표지 rHuEPO가 필요하였다. 이러한 결과에 근거하여, 비표지 r-HuEPO에 비하여 EPO 수용체에¹²⁵I-rHuEPO 의 결합을 경쟁시키는 데에 EPO N14 의 5.25 배의 과량이 필요하였다 (P < 0.01).

부가적인 실험으로 EPO N14 유사체, 분리된 동형 14 및 재조합 에리스로포이에틴간의 에리스로포이에틴 수용체에 대한 결합을 직접 비교하였다. 이러한 실험의 결과는 EPO N14 유사체가 분리된 동형 14 보다 수용체에 대해 더 낮은 친화도를 가졌음을 나타냈다. 비표지 동행 14 에 비해 수용체에¹²⁵I-rHuEPO 가 결합하려면 EPO N14 유사체의 약 2 배의 과량이 필요하였다(제 14도).

C. 헤마토크리트 연구

처리한 쥐(mouse)의 헤마토크리트를 증가시키는, EPO N14 고동형 풀과 EPO N14 저동형 풀(실시에 7C 의 제조방법 2로부터 수득), 분리된 동형 14 및 제조합 인체 EPO 의 능력을 비교하기 위해 생체내 연구를 실시하였다.

이러한 연구에 사용된 EPO N14 고동형 풀과 저동형 풀의 동형 분포는 제 12도에 나타나 있다.

0.25 % 쥐(mouse) 혈청 알부민에서 제조한 상기 제조물 중의 하나, 또는 위약(爲藥) (0.25 % 쥐(mouse) 혈청 알부민을 가한 PBS)을 일주일에 3 회씩 총 6 주 동안 CD1 쥐(mouse) (약 30g) 에 복강내주사하였다. 에리스로포이에틴 제조물의 투여량은 펩티드 질량에 따르므로, 30 g의 쥐는 EPO N14 고 풀, EPO N14 저 풀, 통행 14및 r-HuEPO 표준에 대한 1회 투여량으로 0.071㎍ 의 펩티드를 투여받게 된다. 0.036㎍ 의 펩티드의 부가적 투여 그룹/1회 투여량에는 EPO N14 고 풀 및 동형 14 가 포함되어 있다. 모든 쥐와 해마토크리트를 역궤도적 출혈 후 매주 2 회씩 측정하였다. 실험의 결과에서 모든 동물의 헐청을 모아 주임된 산물에 대한 항체를 분석하였다. 30 g 의 쥐(mouse) 에게 EPO N14 고 풀, EPO N14 저 풀, 동행 14 및 r-HuEPO 표준에 대한 0.071㎍ 의 펩티드/투여량을 주입하였다. EPO N14 고 풀 및 동형 14 에 있어서는 0.036㎍ 의 펩티드/투여량의 부가 투여량 그룹이 포함되었다. 모든 쥐의 헤마토크리트를 기본량에서 측정한 후 매주 2 회씩 안와후(眼窩後) 사혈하였다. 중화항체에 대해 음성이라고 판단된 동물의 데이타를 후속적인 분석을 위해 사용하였다.

제 15도에 나타난 바와 같이, EPO N14 고동형 풀로 처리한 동물은 다른 제조물에 비하여 최고 그룹의 평균 해마토크리트에 도달하였다. 동형 14, 재조합 인체 EPO와 EPO N14 저동형 풀은 보다 적은 양으로 헤라토크리트가 증가되었다.

추가 정량 방식으로 상이한 에리스로포이에틴 제조물을 비교하기 위해, 평균 초기 헤마토크리트 증가율 (0-11 일), 곡선 아래의 면적 (0-39 일) 및 헤마토크리트 총 증가량을 계산하였다 (표 10). 이들 기준 중 어느 것에 따르든지, EPO N14 고동형 풀이 다른 제조물로 시험한 것 보다 펩티드 질량 기준에 대해 보다 활성적일 것으로 보인다.

EPO N14 고동형 풀과 동형 14 둘다 재조합 인체 EPO 보다 더 활성적이었다. EPO N14 저 풀은 어느 분석으로 비교하든지 최저 활성도를 지녔다.

본 발명을 바람직한 구체예로 기술하였으나, 이는 첨부된 특허청구 범위의 의도 및 범위내의 다양한 변형과 대응을 포함하고자 함이지 밝혀진 구체예로 제한하려는 것은 아니며, 상기 범위는 상기 모든 변명과 대응을 포함하는 가장 광범위한 해석을 의미한다.

시퀀스 목록

(1) 일반적인 정보 :

(i) 출원인 : 엘리어트, 스티븐 지.

바이른, 토마스 이.

(ii) 발명의 명칭 : 에리스로포이에틴 유사체

(iii) 시퀀스 번호 : 26

(iv) 통신 주소 :

(A) 수신인 : 안젠 인코포레이티드, 미국 특허 본부＼rbw

(B) 가(街) : 디하빌랜드 드라이브 1840

(C) 시 : 사우전드 오크스

(D) 주 : 캘리포니아

(E) 국명 : 미국

(F) 우편번호 : 91320 - 1789

(V) 컴퓨터 입력 형태 :

(A) 매제형 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : 범용 IBM PC

(C) 운용 시스템 : PC - DOS / MS - DOS

(D) 소프트웨어 : 패턴트인 릴리스 # 1.0, 버전 # 1.25

(vi) 커런트 출원 데이타 :

(A) 출원 번호 : 제 US 08/108,016 호

(B) 제출 일자 : 1993년 8월 17일

(C) 분류:

(2) SEQ ID NO : 1 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 30 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 1 :

(2) SEQ ID NO : 2에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 2 :

(2) SEQ ID NO : 3 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 23 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 ; 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 3 :

(2) SEQ ID NO : 4 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 26 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 4 :

(2) SEQ ID NO : 5 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 24 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 5 :

(2) SEQ ID NO : 6 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 33 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 6 :

(2) SEQ ID NO : 7 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 23 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 7 :

(2) SEQ ID NO : 8 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 23 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 8 :

(2) SEQ ID NO : 9 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 ; 28 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 9 :

(2) SEQ ID NO : 10 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 30 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 10 :

(2) SEQ ID NO : 11 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길 이 : 24 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형테 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 11 :

(2) SEQ ID NO : 12에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 35 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 12 :

(2) SEQ ID NO : 13에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 윤형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 13 :

(2) SEQ ID NO : 14에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 14 :

(2) SEQ ID NO : 15에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 24 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 15 :

(2) SEQ ID NO : 16에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 23 염기 쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 16 :

(2) SEQ ID NO : 17 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 23 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 17 :

(2) SEQ ID NO : 18 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길 이 : 184 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 ; SEQ ID NO : 18 :

(2) SEQ ID NO : 19 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 107 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 이중

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 19 :

2) SEQ ID NO : 20 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 108 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 이중

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 20 :

(2) SEQ ID NO : 21 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 23 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 21 :

(2) SEQ ID NO : 22 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 23 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직신형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 22 :

(2) SEQ ID NO : 23 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 ; SEQ ID NO : 23 :

(2) SEQ ID NO : 24에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 23 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : cDNA

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 24 :

(2) SEQ ID NO : 25 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 28 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 25 :

(2) SEQ ID NO : 26 에 대한 정보 :

(i) 시퀀스 특성 :

(A) 길이 : 193 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥 형태 : 단일

(D) 위상 수학 : 직선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 시퀀스 기술 : SEQ ID NO : 26 :

Claims (7)

1. 인체 에리스로포이에틴의 아미노산 시퀸스중 위치 88의 트립토판이 아스파라긴으로 치환된 적어도 하나의 부가적 글리코실레이션 부위를 포함하고, 상기 부위에 탄수화물 사슬이 결합되어 있는 에리스로포이에틴 활성을 갖는 인체 에리스로포이에틴 유사체에 있어서, 상기 유사체가 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 아미노산 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 에리스로포이에틴 유사체:

   a) 위치 87의 프롤린이 발린으로 치환되고 또 위치 90의 프롤린이 트레오닌으로 치환되며;

   b) 위치 87의 프롤린이 세린으로 치환되고 또 위치 90의 프롤린이 트레오닌으로 치환되며;

   c) 위치 87의 프롤린이 세린으로 치환되고, 위치 90의 프롤린이 트레오닌으로 치환되며 또 위치 162의 아르기닌이 알라닌으로 치환되고;

   d) 위치 30의 아라닌이 아스라파긴으로 치환되고, 위치 32의 히스티딘이 트레오닌으로 치환되며, 위치 87의 프롤린이 발린으로 치환되고 또 위치 90의 프로린이 트레오닌으로 치환됨.
2. 제1항에 있어서, 인체 에리스로포이에틴의 아미노산 시퀸스중 위치 30에 있는 알라닌이 아스파라긴으로 치환된 유사체.
3. 제1항에 있어서, 유사체가 [Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰]EPO인 유사체.
4. 제1항 내지3항중 어는 하나에 따른 인체 에리스로포이에틴 유사체를 암호화하는 DNA.
5. 제4항의 DNA를 포함하는 벡터로 형질감염시킨 진핵 숙주 세포.
6. 제5항의 진핵 숙주 세포를 배양시켜 얻은 에리스로포이에틴 활성을 가진 당단백질.
7. 제약학적으로 용인가능한 희석제, 보조제 또는 담체와 함께 치료 유효량의 제1항, 제2항 또는 제3항에 따른 인체 에리스로포이에틴 유사체 또는 제6항의 에리스로포이에틴 활성을 갖는 당단백질을 포함하는 적혈구 생성을 증가시키기 위한 제약학적 조성물.