SK282003B6 - Analóg humánneho erytropoietínu, sekvencia dna, eukaryotická hostiteľská bunka a farmaceutický prostriedok - Google Patents

Abstract

Je opísaný analóg humánneho erytropoetínu obsahujúci aspoň jedno prídavné miesto pre N-glykozyláaiu na asparagínovom zvyšku, v ktorejkoľvek z aminokyselinových polôh 30, 51, 57, 88, 89, 136 a 138. Sekvencia DNA kódujúca tento analóg a eukaryotická hostiteľská bunka transfekovaná touto sekvenciou DNA. Farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje terapeuticky účinné množstvo analógu erytropoetínu, uvedeného spolu s farmaceuticky vhodným riedidlom, adjuvantom alebo nosičom.ŕ

Description

Vynález sa týka analógov humánneho erytropoetínu, sekvencii DNA, ktoré kódujú tieto analógy, rekombinantných plazmidov a eukaryotických hostiteľských buniek transferovaných týmito sekvenciami DNA a farmceutického prostriedku, na báze uvedených analógov erytropoetínu.

Doterajší stav techniky

Erytropoetín (EPO) je glykoproteínový hormón, ktorý sa zúčastňuje maturácie erytroidných progenitorových buniek na erytrocyty. Ide o dôležitý hormón regulujúci hladinu červených krviniek v obehovom systéme. Prírodný erytropeietín je produkovaný v pečeni počas života plodu a v obličkách dospelých, cirkuluje krvou a stimuluje produkciu červených krviniek v kostnej dreni. Anémia je takmer vždy dôležitým dôsledkom zlyhania obličiek prejavujúceho sa zníženou produkciou erytropoetínu v obličkách. Zistilo sa, že rekombinantný erytropoetín vyrobený technikami genetického inžinierstva, t. j. expresiou proteínového produktu z hostiteľskej bunky transformovanej génom kódujúcim erytropoetín je účinný pri liečbe anémie vyvolanej chronickým zlyhaním obličiek.

V moči človeka je normálne prítomná nízka koncentrácia erytropoetínu, zatiaľ čo v moči pacientov trpiacich aplastickou anémiou je hladina erytropoetínu zvýšená. Pri purifikácii humánneho urinámeho erytropoetínu (Miyake et al., J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977)) bol ako východisková látka použitý moč pacientov trpiacich aplastickou anémiou. Až doteraz sa však urinámy erytropoetín nestal užitočným z terapeutického hľadiska.

Identifikácia, klonovanie a expresia génov kódujúcich erytropoetín je opísaná v US patente č. 4 703 008 (Lin). Opis spôsobu purifikácie rekombinantného erytropoetínu z bunkového média je opísaný v US patente č. 4 667 016 (Lai et al.). Uvedené dve citácie sú tu uvedené ako náhrada za prenesenie ich celého obsahu do opisu tohto vynálezu. Expresia a izolácia biologicky aktívneho rekombinantného erytropoetínu z cicavčích buniek obsahujúcich erytropoetínový gén v rekombinantnom plazmide umožnila prvýkrát získať množstvo erytropoetínu vhodné pre terapeutické aplikácie. Okrem toho, znalosť sekvencie génu a dostupnosť väčších množstiev purifikovaného proteínu viedla k porozumeniu účinku tohto proteínu.

Mnohé bunkové povrchové proteíny a sekretorové proteíny produkované eukaryotickými bunkami sú modifikované jednou alebo viacerými oligosacharidovými skupinami. Táto modifikácia, ktorá je označovaná názvom glykozylácia, môže dramaticky ovplyvniť fyzikálne vlastnosti proteínov a môže byť tiež dôležitá pre stabilitu, sekréciu a subcelulámu lokalizáciu. Vhodná glykozylácia môže mať rozhodujúci význam pre biologickú účinnosť. Je skutočnosťou, že niektoré gény z eukaryotických organizmov, ak sú exprimované v baktériách (napríklad E. coli), ktorým chýbajú bunkové procesy pre glykozyláciu proteínov, poskytujú proteíny, ktoré po izolácii majú len malú účinnosť alebo sú úplne neúčinné, v dôsledku toho, že nie sú glykozylované.

Ku glykozylácii dochádza na špecifických miestach hlavného reťazca polypeptidu a obvykle ide o dva rôzne typy: O-viazané oligosacharidy sú pripojené k serínovým alebo treonínovým zvyškom, zatiaľ čo N-viazané oligosacharidy sú pripojené k asparagínovým zvyškom, kde sú súčasťou sekvencie Asn-X-Ser/Thr, kde X predstavuje akúkoľvek aminokyselinu s výnimkou prolínu. Štruktúry N

-viazaných a O-viazaných oligosacharidov a cukomých zvyškov, ktoré sa vyskytujú pri obidvoch typoch, sú rôzne. Jeden typ cukru, ktorý sa obvykle vyskytuje pri obidvoch typoch, je kyselina N-acetylneuramínová (ďalej označovaná názvom kyselina sialová). Kyselina sialová tvorí obvykle terminálny zvyšok ako N-viazaného, tak aj Oviazaného oligosacharidu a vďaka spojenému negatívnemu náboju môže prepožičiavať glykoproteínu kyslé vlastnosti.

Ako humánny erytropoetín izolovaný z moču, tak aj rekombinantný (exprimovaný v cicavčích bunkách) s aminokyselinovou sekvenciou 1-165 humánneho erytropoetínu obsahuje tri N-viazané a jeden O-viazaný oligosacharidový reťazec, ktoré tvoria spolu asi 40 % celkovej molekulovej hmotnosti glykoproteínu. N-viazaná glykozylácia sa vyskytuje pri asparatínových zvyškoch umiestených v polohách 23, 38 a 83, zatiaľ čo O-viazaná glykozylácia je umiestená na serínovom zvyšku v polohe 126 (Lai et al., J. Biol Chem. 261, 3 116 (1986); Broudy et al., Árch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)]. Bolo ukázané, že oligosacharidové reťazce sú modifikované terminálnymi zvyškami kyseliny sialovej. Enzymatické spracovanie glykozylovaného erytropoetínu, s cieľom odstránenia všetkých zvyškov kyseliny sialovej, sa prejavuje stratou účinnosti in vivo, ale neovplyvní účinnosť in vitro (Lowy et al., Náture 185, 102 (1960); Goldwasser et al., J biol. Chem. 249, 4 202 (1974)]. Toto chovanie bolo vysvetlené rýchlym vymiznutím asialoerytropoetínu z obehu, pri interakcii s hepatickým proteínom, ktorý viaže asialoglykoproteín (Morrell et al., J. Biol. Chem. 243, 155 (1986); Briggs et al., Am J. Physiol. 227, 1 385 (1974); Aswell et al., Methods Enzymol 50, 287 (1987)]. Erytropoetín má teda biologickú účinnosť in vivo len v tom prípade, ak je sialylovaný, čím sa zabráni jeho väzbe na hepatický väzbový proteín.

Úloha iných zložiek v oligosacharidových reťazcoch erytropoetínu nie je dobre definovaná. Zistilo sa, že čiastočne deglykozylovaný erytropoetín vykazuje podstatne zníženú účinnosť in vivo, v porovnaní s glykozylovanou formou, ale zachováva si svoju účinnosť in vitro (Dordal et al., Endocrinology 116, 2293 (1985); lin, citovaný patent]. V inej štúdii však bolo konštatované, že odštiepenie N-viazaných alebo O-viazaných oligosacharidových reťazcov, jednotlivo alebo spolu, mutagenézou aspariginových alebo serínových zvyškov, ktoré predstavujú glykozylačné miesta, výrazne znižuje in vitro účinnosť modifikovaného eiytropoetínu produkovaného v cicavčích bunkách (Dube et al., J. Biol. Chem. 263,17516 (1988)].

Glykoproteíny, ako je erytropoetín, je možné rozdeľovať na formy s rôznym nábojom, použitím takých techník, ako je izoelektrická fokusácia (IEF). Niekoľko skupín vedcov publikovalo IEF štúdie vzťahujúce sa na surové alebo čiastočne purifikované erytropoetínové prípravky (Lukowski et al., J. Biochem 50, 909 (1972); Shelton et al., Bioche. Med. 12, 45 (1975). Fuhr et al., Bioche. Biophys. Res. Comm. 98, 930 1981). Pomocou IEF boli pri týchto štúdiách identifikované najviac tri alebo štyri frakcie s erytropoetínovou účinnosťou a žiadna z nich nebola charakterizovaná, pokiaľ ide o obsah uhľohydrátov. Okrem toho nebola uskutočnená žiadna korelácia medzi izoelektrickými bodmi týchto frakcií a ich biologickou účinnosťou.

Pri purifikácii erytropoetínu izolovaného z humánneho moču (Miyake et al., uvedená citácia) bolo zistené, že dve frakcie erytropoetínu izolovaného pomocou chromatografie na hydroxylapatite a označené symbolmi II a Illa, vykazujú podobnú špecifickú účinnosť. Nasledujúca analýza uhľohydrátov vo frakciách II a Illa ukázala, že frakcia II obsahuje vyšší priemerný obsah kyseliny sialovej, než ako frakcia Illa (Dordal et al., uvedená citácia).

Úlohou tohto vynálezu je získať oddelené a izolované izoformy erytropoetínu s definovaným obsahom kyseliny sialovej a s definovanou biologickou účinnosťou. Tieto izoformy by mali byť terapeuticky užitočné pri použití vo forme farmaceutických prostriedkov.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je analóg humánneho erytropoetínu obsahujúci aspoň jedno prídavné miesto na N-glykozyláciu na asparagínovom zvyšku, v ktorejkoľvek z aminokyselinových polôh 30, 51, 57, 88, 89, 136 a 138. Predmetom vynálezu je tiež sekvencia DNA kódujúca tento analóg a eukaryotická hostiteľská bunka transfekovaná touto sekvenciou DNA. Napokon je predmetom vynálezu tiež farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje terapeuticky účinné množstvo analógu erytropoetínu uvedeného spolu s farmaceutický vhodným riedidlom, adjuvantom alebo nosičom.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje analytický izoelektrický fokusačný gél, na ktorom je uskutočnená separácia izoforiem rekombinantného erytropoetínu. Gélové dráhy 1 až 11 ukazujú izoformy od menej kyslých (vyššia hodnota pi) v dráhe 1 ku kyslejším (nižšia hodnota pi) v dráhe 11. V dráhach ležiacich pri pravom a ľavom okraji je tiež obsiahnutý purifikovaný rekombinantný erytropoetín obsahujúci zmes izoforiem 9 až 14.

Na obr. 2 je znázornený vzťah medzi počtom zvyškov kyseliny sialovej v izoforme erytropoetínu a špecifickou účinnosťou tejto izoformy in vivo vyjadrenou v jednotkách/mg erytropoetínového polypeptidu. Na obr. 2A je znázornená koncentrácia každej izoformy erytropoetínu zistená Bradfordovým stanovením proteínu. Na obr. 2B je táto koncentrácia stanovená meraním obsorbancie pri 280 nm a na obr. 2C je táto koncentrácia stanovená metódou RIA.

Obr. 3 ukazuje analytický izoelektrický fokusačný gél s definovanými zmesami izoforiem rekombinantného erytropoetínu pripravenými chromatografiou na anexe pri rôznych podmienkach. Gélové dráhy 1 až 6 predstavujú (podľa poradia v ako sú uvedené) erytropoetínové izoformy eluované v premývacej kvapaline s vysokým obsahom solí po premytí stĺpca Q-Sepharose rýchíym prúdom 150mM kyseliny octovej s pH 4,7, 150mM kyseliny octovej, ktorá nie je pufiovaná, 200mM kyseliny octovej s pH 4,7, 300mM kyseliny octovej s pH 4,7 alebo 300mM kyseliny octovej, ktorá nie je pufiovaná. Na ľavej krajnej dráhe gélu je tiež obsiahnutý purifikovaný rekombinantný erytropoetín obsahujúci zmes izoforiem, získaný postupmi opísanými v príklade 2 uvedenej publikácie Lai et al., len s tým rozdielom, že namiesto chromatografie na DEAE-Agarose bola použitá chromatografia na Q-Sepharose.

Obr. 4 ukazuje delenie izoforiem erytropoetínu 8 až 12, ktoré sa uskutočňuje tak, že sa upravené bunkové médium nanesie na stĺpec Q-Sepharose a eluuje sa gradientom s klesajúcou hodnotou pH a stúpajúcou iónovou silou. Alikvóty párnych frakcií od frakcie 2 do frakcie 40 sa podrobia analytickej izoelektrickej fokusácii. Na ľavej krajnej dráhe gélu je tiež obsiahnutý purifikovaný rekombinantný erytropoetín obsahujúci zmes izoforiem, získaný postupmi opísanými v príklade 2 uvedenej publikácie Lai et al., len s tým rozdielom, že namiesto chromatografie na DEAE-Agarose bola použitá chromatografia na Q-Sepharose.

Na obr. 5 je znázornená sekvencia aminokyselín humánneho erytropoetínu. Štvorčeky označujú asparagínové zvyšky, ku ktorým sú pripojené N-viazané uhľohydrátové reťazce a hviezdička označuje zvyšok, ktorý je modifikovaný O-viazaným uhľohydrátovým reťazcom.

Na obr. 6A, 6B a 6C je znázornená séria klonovacích stupňov použitých na vytvorenie plazmidov pre konštrukciu a analýzu analógov humánneho erytropoetínu. Tieto analógy obsahujú aminokyseliny modifikované spôsobom znázorneným na obr. 5, ktorý im dodáva pridávané glykozylačné miesta.

Na obr. 7 je znázornená analýza Western blot COS bunkových supematantov erytropoetínu s humánnou sekvenciou a uvedených analógov erytropoetínu. Analógy (Asn⁹ Ser“)EPO, [Asn⁶⁹]EPO, [Asn^lis, Ser¹²⁷]EPO a [Pro¹²⁴, Thr^l25]EPO sú skonštruované spôsobom opísaným v príklade 6. Na porovnanie sú tu uvedené tiež prídavné analógy [Pro¹²⁵, Thr¹²⁷]EPO a [Asn¹²⁶, Ser¹²⁸]EPO, ktoré neobsahujú prídavné uhlohydrátové reťazce.

Na obr. 8 je znázornená analýza Western blot COS bunkových supematantov erytropoetínu s humánnou sekvenciou a charakterizovaných analógov erytropoetínu po spracovaní N-glykanázou. Analógy [Thr¹²⁵]EP0 a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO sú skonštruované spôsobom opísaným v príklade 6. Na porovnanie sú tu tiež uvedené prídavné analógy [Val¹²⁶]EPO, [Pro^l24]EPO, [Pro¹²⁵]EPO, Thr¹²⁷]EPO, [Pro¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO a [Thr¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO.

Obr. 9 ukazuje izoelektrický fokusačný gél z fokusácie frakcii 2, 3 a 4 získaných chromatografiou na Q-Sepharose s obrátenými fázami (C4) použitím bunkového média podporujúceho rast CHO buniek transferovaných erytropoetínovou cDNA obsahujúcou [Thr^l25]-mutáciu. Na ľavej a pravej krajnej dráhe gélu je tiež obsiahnutý purifikovaný rekombinantný erytropoetín obsahujúci zmes izoforiem, získaný postupmi opísanými v príklade 2 uvedenej publikácie Lai et al., len s tým rozdielom, že namiesto chromatografie na SEAE-Agarose bola použitá chromatografia na Q-Sepharose.

Na obr. 10 je znázornená analýza Western blot COS bunkových suepmatantov rekombinantného humánneho erytropoetínu :(rHuEPO) a zvolených analógov. Konštrukcia týchto analógov je opísaná v príklade 6. Analógy N9, N14, N18, N19, N21, N24 a N39 obsahujú prinajmenšom jeden prídavný uhľohydrátový reťazec, čo je dokumentované nižšou pohyblivosťou na géli.

Na obr. 11 je znázornená analýza Western blot COS bunkových supematantov rekombinantného humánneho erytropoetinu a analógu EPO N14 v priebehu štiepenia N-glykanázou. Časové intervaly, v ktorých bolo uskutočňované meranie, sú 0,4,12,45 minút a štiepenie cez noc.

Obr. 12 ukazuje izoelektrický fokusačný gél z fokusácie prípravkov obsahujúcich izoformy analógu EPO N14. Zmes označená ako nízke izoformy obsahuje analógy EPO N14 obsahujúce prevažne 6 až 12 zvyškov kyseliny sialovej v molekule, zmes označená ako stredné izoformy obsahuje analóg N14 obsahujúci prevažne 10 až 15 zvyškov kyseliny sialovej v molekule a zmes označená ako vysoké izoformy obsahuje analóg N14 obsahujúci prevažne 12 až 17 zvyškov kyseliny sialovej v molekule.

Obr. 13 ukazuje farmakokinetiku rekombinantného humánneho erytropoetínu, izolovanej izoformy 14 a analógu EPO N14 (izoformy 15 až 17) po intravenóznom injekčnom podaní potkanom.

Na obr. 14 je znázornená skúška vytcsňovania ¹²⁵I-značeného rekombinantného humánneho erytropoetínu z väzby k receptora erytropoetínu uskutočňovaná pri chlade

SK 282003 Β6 za prítomnosti rôzneho množstva neznačeného rHuEPO, izolovanej izoformy 14 alebo analógu EPO N14.

Obr. 15 ukazuje štúdiu myšacieho hematokritu (pomer plazmy ku krvinkám), pri ktorej sa porovnáva účinnosť vysokej izoformy EPO N14 (0,036 a 0,0712 pg), izolovanej izoformy 14 (0,036 a 0,0712 pg), nízkej izoformy EPO 177 (0,0712 pg) a rHuEPO (0,071 pg).

Nasleduje podrobný opis tohto vynálezu.

Predmetom vynálezu sú izoformy erytropoetínu. Špecifické izoformy erytropoetínu získané podľa vynálezu a ich vlastnosti sa môžu meniť v závislosti od zdroja východiskového materiálu. Tak napríklad izoformy humánneho erytropoetínu izolovaného z moču sa líšia od izoforiem rekombinantného erytropoetínu. V prednostnej realizácii sa vynález týka izoformy erytropoetínu so špecifickým počtom (t. j. s pevným počtom, ktoiý je vyšší než 0) zvyškov kyseliny sialvoej v molekule erytropoetínu, pričom toto číslo je zvolené zo súboru zahrnujúceho čísla 1 až 14. Výhodne je týmto číslom 9, 10, 11, 12, 13 alebo 14. V inej realizácii je toto číslo vyššie než 14 a výhodne leží v rozmedzí od 16 do 23.

Pod označením „izoforma erytropoetínu“, ako sa tu používa v tomto opise, sa rozumie erytropoetínový prípravok vykazujúci jediný izoelektrický bod (pi) a majúci rovnakú sekvenciu aminokyselín. Pod označením „erytropoetín“, ako sa používa v tomto opise, sa rozumie prírodný erytropoetín, humánny erytropoetín izolovaný z moču, ako aj polypeptidy, ktoré sa nevyskytujú v prírode a ktoré majú sekvenciu aminokyselín a ktoré sú glykozylované spôsobom dostatočne kopírujúcim prírodný erytropoetín, aby im to dalo in vivo biologické vlastnosti spočívajúce v stimulácii buniek kostnej drene pre zvýšenú produkciu retikulocytov a červených krviniek.

Zistilo sa, že oddelené izoformy rekombinantného erytropoetínu, ktoré majú sekvenciu aminokyselín humánneho erytropoetínu izolovaného z moču, zodpovedajú molekulám erytropoetínu obsahujúcim 1 až 14 zvyškov kyseliny sialovej, pričom každá z izoforiem prítomných v purifikovanom rekombinantnom erytropoetíne vykazuje účinnosť in vivo majúcu vzťah k počtu zvyškov kyseliny sialovej, ktoré táto izoforma obsahuje.

V prednostnej realizácii je erytropoetín produktom expresie exogénnej sekvencie DNA, ktorá bola transfekovaná do nehumánnej eukaryotickej hostiteľskej bunky. V prednostnej realizácii je teda erytropoetínom „rekombinantný erytropoetín“. Rekombinantný erytropoetín sa výhodne produkuje pomocou postupov opísaných v US patente č. 4 703 008 (Lin; rovnaký majiteľ vlastní aj práva k tejto prihláške). Rekombinantný erytropoetín sa môže purifikovať pomocou všeobecných postupov opísaných v príklade 2 US patentu č. 4 667 016 (Lai et al.; rovnaký majiteľ vlastní aj práva k tejto prihláške) alebo alternatívne podľa spôsobu opísaného v príklade 2 vyššie uvedenej publikácie Lai et alk., pri ktorom sa však namiesto chromatografie na DEAE-Agarose použije chromatografía na Q-Sepharose.

Erytropoetín purifikovaný podľa príkladu 2 uvedenej publikácie Lai et al. obsahuje podľa analýzy IEF prevažne 6 izoforiem. Použitím chromatografických postupov opísaných v príklade 4 bola okrem toho zistená prinajmenšom ďalšia izoforma s vyššou kyslosťou. (Táto kyslejšia forma mimigrujúca na IEF géli pri obsahu zvyškov sialovej kyseliny nad 14 môže obsahovať záporné náboje nepochádzajúce zo sialovej kyseliny, čo dokladá rezistenciu niektorých nábojov voči štiepeniu sialidázou). Tieto izoformy sa do seba líšia obsahom kyseliny sialovej. Táto skutočnosť je v príkladoch demonštrovaná na izolácii 10 takýchto izofo riem preparatívnou IEF a stanovením obsahu kyseliny sialovej v 5 z nich. Zistilo sa, že v izoformách skúšaných na obsah kyseliny sialovej, je počet zvyškov kyseliny sialovej 9,10,11,12 alebo 13.

Existuje vzťah medzi relatívnou špecifickou účinnosťou erytropoetínu in vivo a počtom zvyškov kyseliny sialovej v molekule erytropoetínu i izoforiem 5 až 11 (každá izoforma je tu označená počtom zvyškov kyseliny sialovej v molekule erytropoetínu). Izoformy 11 až 14 majú približne rovnakú relatívnu špecifickú účinnosť in vivo. Izoformy 5 až 14 boli skúšané na účinnosť in vivo pomocou exhypoxického polycytemického biologického stanovenia na myšiach. Množstvo každej z prítomných izoforiem sa zistí Bradfordovým stanovením proteínov, meraním absorbancie pri 280 nm alebo rádioimunoesejom (RIA) pre erytropoetín. Výsledky stanovenia RIA vyjadrené v jednotkách /ml sa delia hodnotou 212 770 jednotiek/mg erytropoetínového polypeptidu, priemernou špecifickou účinnosťou purifikovaného erytropoetínu stanovenou metódou RIA, a tým sa získajú hodnoty koncentrácie proteínu v izolovaných izoformách alebo zmesiach izoforiem, ktoré sú vyjadrené v miligramoch erytropoetínového polypeptidu na mililiter. Ako je to ukázané v príkladoch, relatívna špecifická účinnosť in vivo stupňovito stúpa od izoformy 5 k izoforme 11 (pozri tabuľka 2).

Hodnoty špecifickej účinnosti in vivo, ktoré sú v tomto opise uvádzané, predstavujú hodnoty získané meraním relatívnej špecifickej účinnosti in vivo a nie meraním absolútnej špecifickej účinnosti in vivo. Hodnoty špecifickej účinnosti sa v tomto opise používajú na porovnávanie relatívnej účinnosti izoforiem skúšaných pomocou rovnakého stanovenia, pri rovnakých podmienkach, použitím rovnakého vnútorného štandardu, rovnakého typu zvieraťa a použitím rovnakej analýzy dát použitých na výpočet špecifickej účinnosti a použitím rovnakej skúšky na stanovenie obsahu proteínu. Žiadna z uvedených hodnôt špecifickej účinnosti in vivo pre ktorúkoľvek z izoforiem nepredstavuje inherentnú alebo absolútnu hodnotu charakteristickú pre túto hodnotu.

Predmetom vynálezu sú tiež zmesi obsahujúce dve alebo viac izoforiem erytropoetínu. Podľa jednej realizácie obsahujú tieto zmesi izoformy obsahujúce vyšší počet zvyškov kyseliny sialovej v molekule erytropoetínu, než ako je dopredu určený počet, napríklad vyšší počet než 11 alebo 12, a napríklad ide o zmes izoforiem 12,13 a 14. Podľa inej realizácie obsahujú tieto zmesi izoformy s dopredu určeným počtom zvyškov kyseliny sialovej v molekule erytropoetínu, napríklad s menej než 12, ale viac než 8 zvyškami kyseliny sialovej v molekule, ako je to napríklad v prípade zmesi izoforiem 9, 10 a 11. Predmetom vynálezu sú tiež zmesi izoforiem erytropoetínu, v ktorých sú vzájomné množstvá izoforiem rovnaké alebo rôzne. Tak napríklad zmes izoforiem 9, 10 a 11 môže obsahovať jednotlivé izoformy v rôznych pomeroch, ako naparíklad 1 : 1 : 1, 2 : 3 : : 1 alebo 20 : 20: L

Výhodne obsahujú také zmesi menej než 4 izoformy a ide napríklad o zmesi izoforiem 11, 12 a 13 alebo o zmesi izoforiem 12 a 14 alebo ďalej o zmes izoforiem 7 a 13.

Takéto zmesi izoforiem erytropoetínu sa podľa vynálezu vyrábajú súčasnou izoláciou izoforiem erytropoetínu. Tieto postupy zahrnujú izoláciu jednotlivých izoforiem takými technikami, ako je preparatívna izoelektrická fokusácia, alebo výrobu zmesi izoforiem obsahujúcich dopredu určený počet zvyškov kyseliny sialovej (napríklad nad 11) takými technikami, ako je ionexová chromatografía alebo chromatofokusácia. Všetky tieto techniky sú založené na delení proteínov podľa náboja.

SK 282003 Β6

Ionexová chromatografia a chromatofokusácia sa obvykle uskutočňujú tak, že sa buď surový humánny erytropoetin (médium spracované bunkami) alebo purifikovaný materiál aplikuje na stĺpec živice pri podmienkach umožňujúcich väzbu niektorých alebo všetkých izoforiem erytropoetínu k živici. Ak sa používa surový erytropoetín, prednostne sa proteín aplikuje na stĺpec pri hodnote pH asi 7, zatiaľ čo purifikované proteínové prípravky sa môžu aplikovať na stĺpec pri pH v rozmedzí od 7 do asi 4. Po premytí stĺpca s hodnotou pH asi 4 sa izoformy erytropoetinu, ktoré zostanú na stĺpci ionex, eluujú zvýšením pH a koncentrácie soli v premývacom pufri alebo aplikáciou gradientu so znižujúcou sa hodnotou pH a zvyšujúcou sa iónovou silou pri pH asi 4. V prípade chromatofokusácie sa izoformy eluujú zo stĺpca gradientom so znižujúcou sa hodnotou pH alebo premytím stĺpca roztokom s vysokou koncentráciou soli.

V prednostnej realizácii sa jednotlivé izoformy izolujú použitím ionexovej chromatografie. Tak napríklad izoforma 14 sa izoluje použitím ionexovej chromatografie spôsobom opísaným v príklade 8.

Do rozsahu vynálezu patria tiež určité analógy humánneho erytropoetinu. Pod označením „analóg humánneho erytropoetinu“, ako sa používa v tomto opise, sa rozumie erytropoetín zahrnujúci jednu alebo viac zmien aminokyselinovej sekvencie humánneho erytropoetinu, ktorá má za následok zvýšenie počtu miest pripojenia kyseliny sialovej. Analógy sa tvoria miestne orientovanou mutagenézou zahrnujúcou adície, delécie alebo substitúcie aminokyselinových zvyškov, pomocou ktorých sa zvyšuje alebo mení počet miesť ktoré sú k dispozícii pre glykozyláciu. Takéto analógy môžu obsahovať väčší počet uhľohydrátových reťazcov než humánny erytropoetín.

Analógy erytropoetinu podľa vynálezu obsahujú sekvenciu aminokyselín, ktorá zahrnuje prinajmenšom jedno prídavné glykozylačné miesto. Analógy obsahujúce vyššiu koncentráciu kyseliny sialovej než jej obsah v humánnom erytropoetíne sa získavajú zavedením glykozylačných miest, ktoré nespôsobujú porušenie sekundárnej alebo terciámej konformácie potrebnej pre biologickú účinnosť. Analóg humánneho erytropoetinu výhodne obsahuje 1,2 alebo 3 prídavné miesta pre N-glykozyláciu alebo O-glykozyláciu, čo sa prejaví zavedením 1, 2 alebo 3 prídavných miest N-viazaných alebo O-viazaných uhľohydrátových reťazcov. Tak napríklad leucín v polohe 69 sa nahrádza asparagínom, za vzniku sekvencie Asn-Leu-Ser, ktorá slúži ako štvrté miesto pre N-glykozyláciu. Takáto zmena môže obvykle dodať až štyri prídavné zvyšky kyseliny sialovej do molekuly. Ako príklady zmien, ktorými sa dajú vytvoriť prídavné O-glykozylačné miesta, je výmena alaninu v polohe 125 za treonín a alanínov v polohách 124 a 125 za prolín (v polohe 124) a treonín (v polohe 125). Je možné zostrojiť analógy obsahujúce jeden alebo viac prídavných N-viazaných a O-viazaných reťazcov, ako sú napríklad analógy N01 a N02 opísané v tabuľke 5. Odborníkom v tomto odbore je zrejmé, že do rozsahu tohto vynálezu patrí aj veľa ďalších analógov erytropoetinu obsahujúcich prídavné miesta pre glykozyláciu.

Analógy so zvýšenou početnosťou pripojenia uhľohydrátov v glykozylačných miestach takisto patria do rozsahu tohto vynálezu. Tieto analógy obvykle zahrnujú substitúciu jednej alebo viacerých aminokyselín v úzkom susedstve k N-väzbovému alebo O-väzbovému miestu. Vďaka týmto zmenám aminokyselín bude väčšia časť erytropoetínových polypeptidov obsahovať uhľohydrátovú modifikáciu. Glykozylačné miesta môžu byť prirodzené alebo môžu byť vytvorené mutáciou. Tak napríklad analóg N13 neobsahuje prídavný uhľohydrátový reťazec, napriek tomu, že do neho bolo zavedené v polohe 88 glykozylačné miesto. Analógy N14 a N80, ktoré obsahujú v polohe 87 výmenu sa serín (N14) alebo za valín (N18), obsahujú v polohe 88 prídavný uhľohydrátový reťazec.

Do rozsahu vynálezu spadajú tiež analógy obsahujúce jednu alebo viac aminokyselín, pomocou ktorých je nastavený karboxylový koniec erytropoetinu, pričom toto nastavenie karboxylového konca zaisťuje zavedenie aspoň jedného prídavného uhfohydrátového miesta. Pri jednej realizácii sa skonštruuje analóg fúzií 28 karboxy-termi-nálnych aminokyselín humánneho chorionického gonadotropínu (HCG) k arginínovému zvyšku v polohe 166 humánneho erytropoetínu. HCG karboxy-terminálny fragment obsahuje štyri miesta pre O-glykozyláciu (Kessler et al., J. Biol. Chem. 254,7907(1979)).

V tabuľkách 3, 4 a 5 sú uvedené analógy erytropoetinu obsahujúce prídavné miesta pre N-viazané a/alebo 0-viazané uhľohydrátové reťazce. Tieto analógy obsahujú sekvenciu Asn-X-Ser/Thr zavedenú substitúciou do rôznych polôh reťazca humánneho erytropoetínového polypeptidu, počas vzniku N-väzbových miest alebo obsahujú zvyšky serínu alebo treonínu, s cieľom vytvorenia 0-väzbových miest.

V tabuľke 6 sú uvedené analógy, umožňujúce zavedenie, prinajmenšom jedného prídavného N-väzbového alebo jedného prídavného O-väzbového uhľohydrátového reťazca, alebo zavedenie prídavného N-väzbového a Oviazaného reťazca súčasne, ako je to dokumentované migráciou týchto glykoproteínov na SDS géloch (príklad 7). Ako je zrejmé z tabuliek 3 a 6, analógy obsahujúce jedno alebo viac prídavných miest na pripojenie uhľohydrátu nemusia nutne viesť k vzniku molekúl erytropoetinu obsahujúcich prídavné uhľohydrátové reťazce. Tak napríklad zavedenie treonínovej substitúcie do polohy 123 a 125 má za následok pripojenie O-viazaného uhľohydrátového reťazca, zatiaľ čo zavedenie serínovej alebo treonínovej substitúcie do iných polôh nevedie k získaniu analógov s prídavnými O-viazanými reťazcami (pozri tabuľku 4). Zavedenie asparagínových substitúcií do polôh 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 a 138 do sekvencie humánneho erytropoetinu sa však prejaví zavedením N-viazaného reťazca v týchto polohách. Fúzia polypeptidového fragmentu s arginínovým zvyškom v polohe 166 humánneho erytropoetinu vedie k vzniku fúzovanej molekuly erytropoetín-HCG obsahujúcej prinajmenšom dva prídavné O-viazané uhľohydrátové reťazce.

Analógy erytropoetinu, podľa vynálezu, zahrnujú tiež erytropoetín, ktorého sekvencia aminokyselín obsahuje prešmyk aspoň jedného glykozylačného miesta. Pod označením „prešmyk glykozylačného miesta“, ako sa používa v tomto opise, sa rozumie delécia jedného alebo viacerých glykozylačných miest v humánnom erytropoetíne a zavedenie jedného alebo viacerých neprirodzených glykozylačných miest. Ako príklady takýchto prešmykov je možné uviesť analógy Rl, R2 a R3, ktoré boli zostrojené deléciou N-väzbových miest v polohách 23 (Rl), 38 (R2) alebo 83 (R3) a zavedením N-väzbového miesta do polohy 88. Sú však možné aj ďalšie početné typy prešmykov uhľohydrátových miest a vzniknuté analógy môžu alebo nemusia mať vyšší počet glykozylačných miest v porovnaní s humánnym erytropoetín.

Analógy Rl, R2 a R3 boli analyzované na biologickú účinnosť in vivo a zistené výsledky sú uvedené v tabuľke 7. Zavedenie N-viazaného reťazca v polohe Asn88 vráti biologickú účinnosť erytropoetinu, z ktorého bolo deléciou vypustené ktorékoľvek z troch prirodzených N-väzbových miest. Tieto výsledky ukazujú, že polohy uhľohydrátových

SK 282003 Β6 reťazcov v erytropoetíne sa môžu meniť s cieľom získania užitočných analógov, bez toho aby sa podstatne ovplyvnila ich biologická účinnosť.

Do rozsahu tohto vynálezu spadajú tiež sekvencie DNA kódujúce analógy erytropoetínu obsahujúce prídavné miesta pre N-viazané a/alebo O-viazané reťazce, analógy obsahujúce prešmyk aspoň jedného miesta pripojenia pre uhľohydrátový reťazec a analógy obsahujúce jednu alebo viac aminokyselín predlžujúcich karboxylový koniec erytropoetínu. Postupy, ktoré sa používajú na zavádzanie zmien do sekvencie DNA, kódujúcej humánny erytropoetín s cieľom vytvorenia alebo zmenu väzbových miest pre uhľohydrátové reťazce sú uvedené v príklade 6.

Tieto analógy erytropoetínu môžu byť produktom expresie exogénnej sekvencie DNA, t. j. sekvencie DNA vytvorenej technológiou rekombinácie DNA alebo môže ísť o syntetické produkty. Exogénna sekvencia DNA Zahrnuje cDNA, genómovú DNA alebo chemicky syntetizovanú DNA kódujúcu analóg erytropoetínu.

Do rozsahu vynálezu patria tiež rekombinantné DNA plazmidy a eukaryotické hostiteľské bunky, ktoré sú užitočné pre expresiu takýchto analógov. Expresné vektory zahrnujú akékoľvek vektory, ktoré, sú schopné exprimovať klonované sekvencie DNA v eukaryotickej hostiteľskej bunke, predovšetkým vektory používané na expresiu v bunkách COS a CHO. Ako príklady takýchto vektorov je možné uviesť plazmidy pEC a pDECdelta opísané v príklade 6 ďalej. Kultivácia hostiteľských buniek COS a CHO exprimujúcich analógy erytropoetínu sa uskutočňuje použitím postupov, ktoré sú odborníkom v tomto odbore známe.

Izolované izoformy a zmesi izoforiem odvodené od analógov erytropoetínu sa získajú pomocou vyššie opísaných metód na výrobu izoforiem humánneho erytropoetínu. Tieto metódy môžu zahrnovať izoelektrickú fokusáciu, ionexovú chromatografiu a chromatofokusáciu. Pri výrobe jednotlivých izoforiem a zmesi izoforiem analógov erytropoetinu sa prednostne používa ionexová chromatografia.

Zvýšením počtu uhľohydrátov reťazcov v erytropoetíne a teda zvýšením počtu zvyškov kyseliny sialovej, vztiahnuté na molekulu erytropoetínu, sa môžu výsledným produktom dodať výhodné vlastnosti, ako je napríklad zvýšená rozpustnosť, vyššia odolnosť proti proteolýze, znížená imunogenicita, zvýšený polčas životnosti v sére a zvýšená biologická účinnosť. Pod pojmom polčas životnosti sa rozumie doba, počas ktorej sa koncentrácia EPO v sére zvýši zníži na polovicu.

Médiá spracované bunkami CHO exprimujúcimi analógy erytropoetínu boli analyzované na biologickú účinnosť in vivo a zistené výsledky sú uvedené v tabuľke 6. Niekoľko z týchto analógov má účinnosť, ktorá je trikrát alebo viackrát vyššia než účinnosť; humánneho erytropoetínu. Predovšetkým analógy obsahujúce prídavný N-viazaný uhľohydrátový reťazec, v niektorej z polôh 30 alebo 88 majú dvojnásobne až trojnásobne vyššiu účinnosť, ako humánny erytropoetín, zatiaľ čo analógy obsahujúce prídavné 0viazané reťazce vďaka fúzii humánneho erytropoetínu s fragmentom HCG polypeptidu vykazujú prinajmenšom dvakrát vyššiu účinnosť.

Dva analógy erytropoetínu obsahujúce prídavné uhľohydrátové reťazce boli purifikované a boli izolované zmesami s rôznym obsahom kyseliny sialovej (príklad 8). Analógy Thr¹²⁵ a Ser⁸⁷ Asn⁸⁸Thr’° (EPO N14) boli rozdelené do troch separátnych frakcií izoforiem a bola stanovená biologická účinnosť každej z týchto frakcií. Výsledky, ktoré sú uvedené v tabuľke 8 ukazujú, že izoformové frakcie

EPO N14 s vyšším obsahom kyseliny sialovej majú vyššiu účinnosť in vivo.

Frakcie izoforiem s vyšším obsahom kyseliny sialovej z analógu EPO N14 a rekombinantný humánny erytropoetín (izoformy 9 až 14) boli študované použitím skúšky väzby k receptoru, framakokinetických pokusov a pokusov zameraných na stanovenie zvýšenia hematokritu u myší. Výsledky týchto skúšok ukazujú, že existuje priamy vzťah medzi obsahom kyseliny sialovej, polčasom životnosti a schopnosťou zvýšiť hematokrit ošetrených myší. Ako je zrejmé z obr. 13,14 a 15, frakcia izoforiem s vysokým obsahom kyseliny sialovej z EPO N14 má podstatne vyšší polčas in vivo a vyvoláva vyšší nárast hematokritu než izolovaná izoforma 14 alebo rekombinantný humánny erytropoetín, napriek tomu, že sa frakcia izoforiem s vysokým obsahom kyseliny sialovej z EPO N14 neviaže k receptoru tak silno.

Predmetom vynálezu sú tiež cicavčie hostiteľské bunky [napríklad bunky z ovárií čínskeho chrčka (CHO)], ktoré prednostne syntetizujú izoformy humánneho erytropoetínu alebo analógov erytropoetínu obsahujúce vyšší počet zvyškov kyseliny sialovej v molekule, než je počet špecifický. Napríklad nad 10 zvyškov kyseliny sialovej v molekule. Molekuly erytropoetínu obsahujú N-viazané a O-viazané oligosacharidové štruktúry, ktoré môžu obmedzovať obsah kyseliny sialovej v molekule. Napríklad tetraantenáme (so štyrmi rozvetveniami) N-viazané oligosacharidy najčastejšie poskytujú štyri možné miesta na pripojenie kyseliny sialovej, zatiaľ čo biantenáme a triantenámc oligosacharidové reťazce, ktorými môže byť nahradená tetraantenáma forma na asparagínovcýh väzbových miestach, obvykle obsahujú najviac len 2 alebo 3 pripojené zvyšky kyseliny sialovej.

O-viazané oligosacharidy obvykle poskytujú dve miesta na pripojenie kyseliny sialovej. Molekuly erytropoetinu teda môžu prijať celkovo 14 zvyškov kyseliny sialovej, za predpokladu, že sú všetky tri N-viazané oligosacharidy tetraantenáme. Kultúry cicavčích buniek sa podrobia sreeningu na bunky, ktoré prednostne zavádzajú tetraantenáme reťazce do rekombinantného erytropoetínu, čo má za následok maximalizáciu počtu miest na pripojenie zvyškov kyseliny sialovej.

N-viazané oligosacharidy erytropoetínu izolovaného z moču obsahujú kyselinu sialovú ako s väzbou α 2,3, tak s väzbou α 2,6 ku galaktóze (Takeuchi et al., J. Biol. Chem. 263, 3 657 (1988)). Kyselina sialová s väzbou α 2,3 sa obvykle aduje na galaktózu na manózovej vetve α 1,6 a kyselina sialová s väzbou α 2,6 sa aduje na galaktózu na manózovej vetve α 1,3. Na zavádzanie kyseliny sialovej do manózovej α 1,6 a manózovej a 1,3 vetvy sú najúčinnejšie enzýmy schopné vyvolávať adíciu sialovej kyseliny (β-galaktozid α 2,3 sialyltransferáza a erytropoetín).

Na produkciu rekombinantných glykoproteínov, vrátane rekombinantného β-galaktozid α 2,6 sialyltransferázu u, sa ako hostiteľské bunky obvykle používajú bunky z ovárií čínskeho chrčka (CHO), ktoré sú deficientné na dihydrofolát reduktázu (DHFR). Tieto bunky neexprimujú enzým β-galaktozid α 2,6 sialyltransferázu a preto neadujú kyselinu sialovú s väzbou a 2,6 k N-viazaným oligosacharidom glykoproteínov produkovaných v týchto bunkách (Mutsaers et al., Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986) Takeuchi et al., J. Chromatogr. 400, 207 (1987)). V dôsledku toho, rekombinantný erytropoetín produkovaný v bunkách CHO neobsahuje kyselinu sialovú s väzbou 2,6 ku galaktóze (Sasaki et al. (1987), vyššie uvedená citáciaTakeuchi et al. (1987) uvedená citácia)).

V ďalšej realizácii tohto vynálezu sa humánny erytropoetín alebo analóg erytropoetínu produkuje v bunkách

SK 282003 Β6

CHO, ktoré sú transfekované funkčným génom β-galaktozid α 2,6 sialyltransferázy, s cieľom zavedenia kyseliny sialovej do galaktózy s väzbou α 2,6. Výsledné izoformy budú obsahovať kyselinu sialovú viazanú ku galaktóze ako väzbou α 2,3, tak aj väzbou α 2,6. Opis techník, ktorými sa vytvárajú modifikované bunky CHO alebo iné hostiteľské cicavčie bunky je uvedený v Lee et al., J. Biol. Chem. 264,13 848 (1989).

Do rozsahu tohto vynálezu spadajú tiež farmaceutické prostriedky obsahujúce terapeuticky účinné množstvo špecifickej izoformy alebo zmesi izoforiem v kombinácii s vhodným riedidlom, pomocnou látkou a/alebo nosičom užitočným pri liečbe erytropoetínom. Do rozsahu vynálezu spadajú tiež farmaceutické prostriedky obsahujúce terapeuticky účinné množstvo analógu erytropoetínu spolu s vhodným riedidlom, pomocnou látkou a/alebo nosičom. Pod označením „terapeuticky účinné množstvo“ ako sa používa v tomto opise, sa rozumie množstvo, s ktorým sa za daných podmienok a pri danom režime podávania dosiahne terapeutický účinok. Izoformy humánneho erytropoetínu alebo analógy erytropoetínu sa prednostne podávajú parenterálnou cestou. Konkrétna cesta podávania bude závisieť od liečby choroby. Izoformy humánneho erytropoetínu alebo analógy erytropoetínu sa prednostne podávajú vo forme prostriedku obsahujúceho vhodný nosič, ako je humánny sérový albbumín, vhodné riedidlo, ako je pufrovaný roztok chloridu sodného a/alebo vhodné adjuvans. Za požadovanú dávku bude považovaná dávka postačujúca na zvýšenie hematokritu liečených pacientov. Táto dávka sa bude meniť v závislosti od závažnosti liečenej choroby, použitého spôsobu podávania a pod.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch uskutočnenia. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú. Ako eiytropoetínový štandard sa pri biologických skúškach in vivo opísaných v príkladoch používa rekombinantný erytropoetínový štandard štandardizovaný oproti čiastočne purifikovanému erytropoetínovému štandardu z moču. Meria sa teda len relatívna špecifická účinnosť in vivo. Špecifická účinnosť in vivo je preto tiež vyjadrovaná v Jednotkách/ml“, Jednotkách/mg“ a .jednotkách/Ajgo' a nie v jednotkách „IU/ml“, „IU/mg“ a „IU/Aj₈₀“, keďže použitý erytropoetínový štandard nebol priamo korelovaný so žiadnym existujúcim medzinárodným štandardom.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia izoforiem rekombinantného erytropoetínu

Rekombinantný erytropoetín sa vyrobí spôsobom opísaným v uvedenej publikácii Lin. Rekombinantný erytropoetín použitý ako východisková látka pre prvú a tretiu izoláciu izoformy sa purifikuje spôsobom opísaným v príklade 2 uvedenej publikácie Lai et al., Východisková látka pre druhú a piatu izoláciu izoformy sa purifikuje spôsobom opísaným v uvedenej publikácii Lai et al., ktorý je modifikovaný tým, že sa použije chromatografia na Q-Sepharose. Tieto prípravky obsahujú zmesi izoforiem rekombinantného eiytropoetínu s rovnakou aminokyselinovou sekvenciou, akú má humánny erytropoetín získaný z moču a prevažne obsahujú izoformy 9 až 14. Východiskový materiál na štvrtý preparatívny postup na získanie izoformy predstavuje materiál eluovaný počas premývania stĺpca anexu z príkladu 2 uvedenej publikácie Lei et al. 5mM kyselinou octovou/lmM glycínom/6M močovinou. Táto frakcia obsahuje izoformy s počtom zvyškov sialovej kyseliny 9 alebo niž ším a ďalej sa pred použitím pre preparatívnu izoelektrickú fokusáciu purifikuje gélovou filtračnou chromatografiou opísanou v príklade 2 uvedenej publikácie Lai et al. Pri šiestej príprave izoformy sa ako východiskový materiál používa purifikovaný rekombinantný s obsahom 4 až 13 zvyškov kyseliny sialovej. Tento materiál sa purifikuje spôsobom opísaným v príklade 2 uvedenej publikácie Lai et al., len s tým rozdielom, že sa modifikuje spracovanie ionexového stĺpca (elúcia rekombinantného erytropoetínu sa uskutočňuje gradientom chloridu sodného pri pH 8,4 a vypustí sa premývanie kyselinou octovou/močovinou. Pritom sa dosiahne retencia väčšiny izoforiem obsiahnutých vo východiskovom materiáli.

Pri šiestich rôznych preparatívnych postupoch na získanie jednotlivých izoforiem sa použije preparatívna izoelektrická fokusácia v granulovanom gólovom lôžku (Ultrodex LKB). Tieto postupy sa uskutočňujú v podstate rovnako ako je to uvedené v poznámke LKB Application Note 198. Používajú sa amfolyty Phramalyte 2.5-5 (Pharmacia) a použité gélové lôžko obsahuje 5M močovinu.

Pri prvej príprave sa približne 20 mg rekombinantného erytropoetínu v 6,8 ml 20mM citrónu sodného/lOOmM chloridu sodného s pH 7,0 nanesie na gél a približne 16 hodín fokusuje pri výkone 8 W. Po izoclektrickej fokusácii sa pásy izoforiem na géli vižualizujú pretlačením gélového lôžka na papier. Získaný otlačok sa fixuje vo fixačnom roztoku (40 % metanol/10 % kyselina octová/10 % TCA/3,5 % kyselina sulfosalicylová) pri celkovo troch výmenách fixačného kúpeľa, pričom spracovanie v každom kúpeli sa uskutočňuje 10 minút pri teplote miestnosti, potom sa vykoná jedna výmena za roztok so zložením 40 % metanol/10 % kyselina octová (spracovanie sa uskutočňuje pri teplote 30 až 60 °C polčas približne 10 minút), pásy sa 15 minút farbia pri 60 °C 0,125% roztokom modrej Coomassie Blue R-250/4 % metanolu/10 % kyseliny octovej, a potom sa uskutoční odfarbenie v 7,5 % metranole/10 % kyseline octovej, aby sa zviditeľnili oddelené izoformy. Oblasť granulovaného gélového lôžka obsahujúca izoformy (asi 50 % živice) sa odstráni, zmieša s vodou (asi 16 ml) a suspenzia sa naleje na misku s rozmermi 14 x 62 cm a odparí sa na čistú hmotnosť približne 40 g. Vzniknutý prípravok sa fokusuje druhý raz a vyššie uvedeným spôsobom sa vykoná kontaktné otlačenie gélového lôžka. Časť gélu obsahujúca každú zo 6 rozoznateľných izoforiem sa z gélového lôžka odstráni.

Elúcia izoforiem z gélu sa uskutoční prídavkom roztoku obsahujúceho lOmM Tris-HCl s pH 7,0/5mM Chaps ku každej izoforme. Každá vzniknutá suspenzia sa uvedie do krátkej kolóny a eluuje pufrom Tris-Chaps. Eluáty sa zhromaždia a oddelene aplikujú na krátke kolóny (konfigurácia s otvorenou kolónou) obsahujúce živicu s otočenou fázou Vydac C4 ekvilibrovanou v 20 % etranolu/lOmM Tris-HCl s pH 7,0. Stĺpce sa postupne vyvíjajú 20 % etanolom/lOmM Trsi-HCl s pH 7,0, 35 % etanolom/lOmM Tris-HCl s pH 7,0 a 65 etanolom/lOmM Tris-HCl s pH 7,0. Frakcia eluovaná 65 etanolom/lOmM Tris sa zriedi v pomere 1 : 1 lOmM Tris-HCl s pH 7,0, skoncentruje a potom sa uskutoční výmena pufra (lOmM Tris-HCl s pH 7,0) v mikrokoncentrátori Centricon-10 (amicon). Analytická izoelektrická fokusácia tohto prípravku sa uskutočňuje v podstate podľa spôsobu opísaného v poznámke LKB Technical Note 250 pri použití Servalyte 3-5 amfolínov (Serva) na polyakrylamidovom géli obsahujúcom 5M močovinu.

Pri druhom preparativnom postupe sa približne 26 mg rekombinantného erytropoetínu v 6,5 ml deionizovanej vody nanesie na gél a fokusuje sa pri 2,5 W počas 35 minút a pri 10 W počas asi 17 hodín. Pásy fokusovaného proteínu,

SK 282003 Β6 ktoré sú viditeľné v gélovom lôžku sa odstránia a tak sa získa celkovo 11 produktov. Objem každého z týchto produktov sa upraví na 7,5 ml deionizovanou vodou a 20 ml každého z výsledných supematantov sa podrobí analytickej opísanej izoelektrickej fokusácii. Ku každému z produktov sa pridá 5 ml 1,5M Tris-HCl s pH 8,8 a každá zo suspenzií sa prevedie do malej kolóny a stĺpcom sa nechá pretiecť kvapalná fáza. Živica sa premyje približne 3 objemami stĺpca 0,5M Tris-HCl s pH 7 a premývací roztok sa spojí s eluátom. Spojené eluáty sa skoncentrujú a uskutočni sa výmena pufra za 20mM citran sodný/lOOmM chlorid sodný s pH 7,0 použitím ultrafiltračného zariadenia na jedno použitie (Amicon) s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 10 000 dalton. Skoncentrované roztoky (približne 0,5 ml) sa potom nechajú prejsť filtrom z acetátu celulózy s vylučovacou medzou 0,22 pm. Pomocou analytickej izoelektrickej fokusácie sa zistí, že 5 produktov obsahuje prevažne vždy jedinú izoformu 10,11,12,13 a 14.

Pri treťom preparatívnom postupe sa približne 30 mg rekombinantného erytropoetínu v 21,8 ml destilovanej vody nanesie na gél a uskutoční sa fokusácia 25 minút pri 2 W, 20 hodín pri 10 W a 15 minút pri 15 W. Pásy proteínu zodpovedajúce jednotlivým izoformám sa zistia vizuálne a odstránia sa z gélového lôžka. K izoformám izolovaným na géli sa pridá destilovaná voda, čím vznikne suspenzia a výsledné supematanty sa analyzujú analytickou izoelektrickou fokusáciou. Ku každej suspenzii sa pridá rovnaký objem IM Tris -HC1 s pH 7,2, suspenzie sa prevedú do separátnych krátkych kolón s kvapalnou fázou sa nechá pretiecť kolónou, aby sa eluovali izoformy. Každý eluát sa skoncentruje, uskutoční sa výmena pufra za 20mM citran sodný/ lOOmM chlorid sodný s pH 7,0 použitím ultrafiltračného zariadenia na jedno použitie (Amicon) s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 10 000 dalton. Pomocou analytickej izoelektrickej fokusácie sa zistí, že boli získané produkty obsahujúce prevažne jednotlivé izoformy 9, 10, 11,12,13 a 14.

Pri štvrtom preparatívnom postupe na získanie izoforiem sa ako východiskový materiál použije erytropoetín obsahujúci izoformy 3 až 9 (vyrobený pomocou vyššie opísaného spôsobu). Pred preparatívnou izoelektrickou fokusáciou, ktorá sa uskutočňuje v podstate spôsobom opísaným v súvislosti s preparatívnymi postupmi 1 až 3, sa amfolyty (Pharmalyte 2,5-5) prefrakcionizujú v izoelektrickej fokusočnej cele s kvapalnou fázou Rotofor (Bio-Rad. Richmond, Kalifornia, USA), aby sa získalo amfolytové rozmedzie vhodnejšie pre nižšie izoelektrické body východiskového materiálu. Prefrakcionizácia sa uskutočňuje tak, že sa 6,7 ml Pharmalyte 2,5-5 zmieša s 15 g močoviny a objem zmesi sa purifikovanou vodou doplní na 50 ml. Vzniknutá zmes sa frakcionizuje v zariadení Rotofor pri 10 W, teplote 1 °C počas 5,5 hodiny použitím 0,lM kyseliny fosforečnej, ako anolytu a 0,1 M hydroxidu sodného, ako katolytu. Amfolytové frakcie s nameranými hodnotami v rozmedzí od 4,5 do asi 6 sa použijú na izoelektrickú fokusáciu v plochom lôžku.

Amfolyty sa odstránia z izoforiem použitím zariadenia Centrieluter (Amicon, Danvers, Massachusetts, USA) a použitím zariadenia Centricon s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 10 000 dlaton (Amicon). Pritom sa pracuje pri týchto podmienkach: 0,18 Tris-pufer s pH 8,8, 100 V, 25 až 30 mA, 3 hodiny. U izoforiem sa uskutoční výmena pufra (0,lM chlorid sodný) pomocou gélovej filtrácie použitím náplne Sephadex G-25 (Pharmacia). Analytická izoelektrická fokusácia 5 výsledných produktov ukazuje, že tieto produkty obsahujú izoformy 4, 5, 6,7 a 8. Izoforma 4 prechádza vo forme niekoľkých pásov, čo ukazuje, že u nej mohla prebehnúť v určitom rozsahu degradácia.

Piaty preparatívny postup na získanie izoforiem sa modifikuje zaradením prefokusačného stupňa do izoelektrického fokusačného postupu na plochom lôžku. Pri tejto modifikácii sa proteín nepridá k zmesi amfolytu, močoviny a gélu pred elektroforézou, ale zavedie sa do izoelektrického fokusačného zariadenia po vytvorení gradientu pH v gélovom lôžku. Po uskutočnení prefokusácie (75 minút, 1 500 Volthodín) sa úsek gélového lôžka v rozmedzí od 2,25 do 4,25 cm od katódy vyberie, zmieša sa s roztokom erytropoetinu a vráti sa späť do gélového lôžka. Po izoelektrickej fokusácii sa z gélového lôžka izolujú izoformy 10, 11, 12, 13 a 14 a oddelia sa od amfolytov ultrafiltráciou použitím zariadenia Centricon-10 (Amicon).

Modifikácia prefokusácie sa uskutočňuje z toho dôvodu, aby sa charakteristiky ultrafialovej absorbancie izoformových prípravkov pripodobnili charakteristikám východiskového rekombinantného erytropoetínu. Toto zlepšenie spektrálnychh charakteristík je zrejmé z pomeru absorbancie izolovaných izoforiem pri 280 a 260 nm. Priemerný pomer absorbancie pri 280 nm k absorbancii pri 260 nm (A280/A260) pri izoformách z preparatívnych postupov 2 a 3 (bez prefokusácie) je 1,36 ± 0,11, zatiaľ čo priemerný pomer Α₂₈ο/Α₂₆ο pri preparatívnych postupoch 5 a 6 (s prefokusáciou) je 1,68 ± 0,20. Keď sa z výpočtu vylúči izoforma č. 14, dosiahne sa priemerný pomer A_28C/A₂6o v prípade preparatívnych postupov 2 a 3 hodnoty 1,39 ± 0,11 a v prípade preparatívnych postupov 5 a 6 hodnoty 1,74 ± 0,09 (izoforma 14 má možno najviac atypické spektrum, keďže je prítomná v najmenšom množstve a je teda náchylnejšia k interferenciám stopovými nečistotami zložiek amofolytu alebo z toho dôvodu, že je najbližšie k elektróde v priebehu izoelektrickej fokusácie na plochom lôžku. Priemerná hodnota pomeru A₂₈₀/A₂₆o pre rekombinantný erytropoetín vyrobený podľa príkladu 2 uvedenej publikácie Lai et al. (použitím opísanej modifikácie, ktorá spočíva v tom, že sa ako anoxová živica použije O-Sepharose) je 1,91 ± 0,04.

Ako už bolo uvedené, východiskovým materiálom pre šiesty preparatívny postup na výrobu izoforiem je rekombinantný erytropoetínový prípravok obsahujúci izoformy 4 až 13. Amfolyty sa prefokusujú v zariadení Rotofor, tak ako v prípade štvrtého prípravku. Frakcie amfolytu s nameranými hodnotami pH v rozmedzí 3,7 až 4,8 sa podrobia izoelektrickej fokusácii na plochom lôžku. Ploché lôžko sa prefokusuje tak, ako v prípade piateho preparativneho postupu a po ultrafiltrácii (CentriconlO) na odstránenie nosičových amfolytov sa získajú izoformy č. 9,10,11,12 a 13.

Príklad 2

Obsah kyseliny sialovej v izoformách rekombinantného erytropoetínu

Pri izoformách izolovaných spôsobom opísaným v príklade 1 a erytropoetínu purifikovaného podľa spôsobov 0písaných v uvedenej publikácii Lai et al. (zmes izoforiem 9 a 14) sa uskutoční výmena pufra použitím 0,10 až 0,15M chloridu sodného a uskutoční sa analýza na obsah kyseliny sialovej použitím modifikovaného postupu opísaného v Jourdian et al., J. Biol. Chem. 246, 430 (1971). Zvyšky kyseliny sialovej sa odštiepia od glykoproteínnov hydrolýzou pomocou 0,35M kyseliny sírovej (80 °C, 30 minút) a vzniknuté roztoky sa neutralizujú pred analýzou hydroxidom sodným. S cieľom odhadu množstva prítomného erytropoetínového proteínu sa uskutoční Bradfordovo stanovenie proteínov (Bradford, Anál. Biochem. 72, 248 (1976) použitím rekombinantného erytropoetínu s aminokyselinovou sekvenciou humánneho erytropoetínu, ako štandardu.

SK 282003 Β6

Použijú sa skúškové činidlá a mikrometódy Bio-Rad. Výsledky vyjadrené v mol kyseliny sialovej na mol erytropoetínu sú zrejmé z tabuľky 1. Izoformy sa označia podľa počtu zvyškov sialovej kyseliny v molekule a majú rozmedzie od najmenej kyslých (izoforma 9) do najkyslejších (izoforma 13). Izoformy 9 až 13 sú prítomné v gélových dráhach 6 až 10 (pozri obr. 1). Množstvo izoformy nie je dostatočné na presné zmeranie obsahu kyseliny sialovej. Obsah kyseliny sialovej v tejto izoforme sa dedukuje na základe migrácie tejto izoformy na IEF géloch vzhľadom na ostatné izoformy. Obsah kyseliny sialovej v izoformách 5 až 8 (prípravok č. 4) nebol meraný, ale podobne sa dedukuje na základe migrácie na IEF géloch.

T abutka 1

Izoforma erytropoetínu	Obsah kyseliny sialovej [mol/moi erytropoetínu]
izoforma 13	12,9 ±	0,5
izoforma 12	11,8 ±	0,2
izoforma 11	11,0 ±	0,2
izoforma 10	9.8 ±	0,3
izoforma 9	8,9 ±	0,6
zmes izoforiem (9 až 14)	11,3 ±	0,2

Príklad 3

Účinnosť izoforiem rekombinantného erytropoetínu

Izoformy izolované spôsobom opísaným v príklade 1 sa skúšajú postupom využívajúcim absorbanciu pri 280 nm., Bradfordovým stanovením proteínov a metódou RIA pre erytropoetín, aby sa zistilo množstvo prítomného rekombinantného eiytropoetínu. Na stanovenie relatívnej biologickej účinnosti in vivo sa použije exhypoxické polycytochemické biostanovenie na myšiach (Cotes et al., Náture, 191, 1065 (1961)). Pri kvantitatívnom stanovení množstva prítomného erytropoietinového proteínu použitím rádioimunoeseje pre eiytropoetín sa pre niektoré izoformy namerá vyššia relatívna špecifická účionnosť in vivo v dôsledku zjavne zníženej imunoreaktivity imunoforiem obsahujúcich veľké množstvo kyseliny sialovej, čo vedie k podhodnoteniu koncentrácie erytropoetínu a teda nadhodnoteniu relatívnej špecifickej účinnosti in vivo vo väčšine negatívnych foriem. Výsledky biostanovenia na myšiach, vyjadrené v jednotkách/ml, sa delia zodpovedajúcimi koncentráciami proteínu, pričom sa získajú špecifické účinnosti in vivo vyjadrené v jednotkách/mg erytropoetínového polypeptidu. Hodnoty špecifickej účinnosti sú uvedené v tabuľke 2.

V tabuľke 2 znamená index „n“ počet nezávislých izoformových prípravkov ktorých výsledky prispievajú k výslednej hodnote špecifickej účinnosti. Vo väčšine prípadov bolo s každým izoformovaným prípravkom uskutočnených niekoľko stanovení in vivo. Rovnaké dáta in vivo prispievajú k výpočtom špecifickej účinnosti vo všetkých troch stĺpcoch. Obsah erytropoetínového polypeptidu v jednotkách/mg sa stanoví na základe absorbancie pri 280 nm, na základe potencie pri rádioimunoeseji alebo z výsledkov Bradfordovho stanovenia proteínu. Ako štandard pre Bradfordovo stanovenie sa používa purifikovaný rekombinantný erytropoetín obsahujúci izoformy 9 až 14. Hodnota indexu „n“ môže byť pri výpočtoch uskutočnených použitím dát z Bradfordovho stanovenia proteínov nižšia, keďže niektoré prípravky už v čase uskutočňovania Bradfordovho stanovenia neboli k dispozícii.

Ako štandard pre rádioimunoeseje a pre stanovenie in vivo sa používa erytropoetín purifikovaný spôsobmi opísanými v Laiet al. (uvedená publikácia), ktorý obsahuje zmes izoforiem 9 až 14.

Hodnoty relatívnej špecifickej účinnosti, ktoré sú vyjadrené v jednotkách/mg (U/mg) erytropoetínového polypeptidu, je možné previesť na jednotky/A₂₈₀ vynásobením hodnotou 0,807 mg erytropoetínového polypeptidu/A₂₈₀. Tento prevodný faktor sa získa vynásobením extinkčného koeficientu pre erytropoetín (1,345 mg/A₂₈₀) obsahom proteínu v erytropoetínovom glykoproteíne (približne 60 hmotnostných, Davis et al., Biochemistry, 26, 2633 (1987)) a tým sa získa hodnota v mg erytropoetínového polypeptidu/A₂₈o (t. j. 1,345 mg erytropoetínu/A₂₈₀ x 0,60 mg polypeptidu/mg eíytropoetínu = 0,807 mg polypeptidu/A₂₈₀). Okrem toho je možné hodnoty špecifickej účinnosti vyjadrenej v jednotkách/mg erytropoetínového polypeptidu vynásobiť faktorom 0,60 mg polypeptidu/mg erytropoetínového glykoproteínu, a tým sa získajú hodnoty špecifickej účinnosti vyjadrenej v jednotkách/mg erytropoetínového glykoproteínu.

Tabutka 2

katan* MypeettdfUta·)	Potyp«pM(Utag) (a anMte Ajiq)		(U ittlatt* RIA) 8
	Bndftxdovo naovcate
14	20*4001 3 IM 2	205800= 37000	2	3447001 55*00 2
13	3016001 30*00 4	238700= 59500	3	337300 1 40300 S
12	2752001 55400 4	258400 1 41700	5	2*71001 42600 5
tt	2827002 41100 3	253800: 67300	4	2514001 42700 4
to	1810001 1900 1	170 300 1 34500	3	171800 1 31400 3
»		94400144700	*	113 400 1 39 800 i
8	05200 13800 1	7000014100	1	41000 1 3 500 1
7	44 200 1 5 800 1	50 3001*300	l	43*0015400 1
5	1040011700 1	14 90011 m	1	1550011400 1

Dáta uvedené v tabuľke 2 sú tiež spracované graficky na obr. 2A, 2B a 2C. Tieto dáta ukazujú, že relatívna účinnosť erytropoetínu in vivo stúpa v závislosti od obsahu kyseliny sialovej až do izoformy č. 111. Izofromy 11 až 14 vykazujú v podstate rovnakú relatívnu biologickú účinnosť in vivo (to je najzreteľnejšie, keď sa koncentrácia izoformy 14 vyjadrí použitím hodnoty z Bradfordovho stanovenia. Bradfordova hodnota môže byť presnejšia s ohľadom na všeobecne nízku dosiahnutú koncentráciu a v dôsledku toho na obtiažnosť stanovenia A₂₈₀ a najzrejmejšie zníženú reaktivitu pri RIA, pri veľmi negatívnych formách; pozri vyššie uvedená diskusia). Vyššia relatívna účinnosť in vivo izoforiem erytropoetínu s väččším množstvom sialovej kyseliny je najpravdepodobnejšie spôsobená dlhším polčasom životnosti týchto foriem v obehu. Izoformy 9 a 13 boli označené rádioaktívnym jódom (¹²⁵I) a bola zmeraná ich rýchlosť clearance u potkanov. Polčas životnosti v obehu je v prípade izoformy 13 podstatne dlhší než v prípade izoformy 9.

Príklad 4 Selekcia zmesi izoforiem rekombinantného erytropoetínu chromatografiou na Q-Sepharose

Média spracované bunkami produkujúcimi rekombinantný erytropoetín (získané postupmi opísanými v uvedenej publikácii Lin) sa skoncentrujú a diafiltrujú proti lOmM Tris s pH 7,2. Koncentrácia proteínu sa stanoví Bradfordovým proteínovým mikrostanovením použitím hovädzieho sérového albumínu ako štandardu. K 19,6 ml roztoku obsahujúcemu 40 mg celkového proteínu sa pridá síran meďnatý do koncentrácie 20 μΜ, roztok sa prefiltruje cez filter s vylučovacou medzou 0,45 pm a nanesie na stĺpec (1,05 cm - výška; 2,2 cm - priemer) obsahujúci 4ml lôžka náplne O Sepharose Fast Flow (Pharmacia) ekvilibrovanej s lOmM Tris s pH 6,8 až 7,0 pri 4 °C. Po nanesení vzorky sa stĺpec premyje dvoma objemami stĺpca rovnakého pufra. Prietok stĺpcom je približne 1 ml/min. Pri tomto postupe sa na selekciu definovaných zmesí izoforiem erytropoetínu použije 6 oddelených kolón.

Kolóny sa premyjú 6 až 9 objemami stĺpca pufra s nízkym obsahom pH, ktorý je v prípade kolóny 1 zložený zo

SK 282003 Β6

150mM kyseliny octovej, lmM glycínu, 20 μΜ síranu meďnatého a 6M močoviny, pričom pH je hydroxidom sodným nastavené na 4,7; v prípade kolóny 2 z 200mM kyseliny octovej, lmM glycínu, 20 μΜ síranu mednatého a 6M močoviny, pričom pH je hydroxidom sodným nastavené na 4,7; v prípade kolóny 3 z 250mM kyseliny octovej, lmM glycínu, 20μΜ síranu meďnatého a 6M močoviny, pričom pH je hydroxidom sodným nastavené na 4,7; v prípade kolóny 4 z 300mM kyseliny octovej, lmM glycínu, 20 μΜ síranu meďnatého a 6M močoviny, pričom pH je hydroxidom sodným nastavené na 4,7; v prípade kolóny 5 z 150mM kyseliny octovej, lmM glycínu, 20 μΜ síranu meďnatého a 6M močoviny a v prípade kolóny 6 z 300mM kyseliny octovej, lmM glycínu, 20 μΜ síranu meďnatého a 6M močoviny. Hodnota pH v kolónach sa zvýši asi na pH 7 premytím každej kolóny 8 až 11 objemami stĺpca lOmM Tris-HCI, 55mM chloridu sodného. 20 μΜ síranu meďnatého s pH 7. Definované zmesi izoforiem erytropoetínu sa eluujú zo stĺpcov premytím lOmM Tris-HCI, 140mM chloridom sodným a 20μΜ síranom meďnatým s pH 7,0.

Eluované izoformové produkty z každej kolóny sa skoncentrujú a rozpúšťadlo sa vymení za vodu použitím mirkokoncentrátora Centricon-10 (Amicon). Výsledky analytickej izoelektrickej fokusácie týchto skoncentrovaných produktov sú uvedené na obr. 3. V gélových dráhach 1 až 6 sú v uvedenom poradí obsiahnuté zmesi izoforiem erytropoetínu eluované zo stĺpcov 1 až 6. Zmes izoforiem obsiahnutá v gélovej dráhe pri ľavom okraji obr. 3 predstavuje bunkové médium aplikované na opísaný stĺpec Q-Sepharose, pričom stĺpec je premytý 5mM kyselinou octovou, lmM glycinom, 20μΜ síranom meďnatým, 6M močovinou a zmes izoforiem erytropoetínu je eluovaná zo stĺpca použitím opísaných postupov. Táto zmes izoforiem sa ďalej purifikuje spôsobmi opísanými v citovanej publikácii Lai et al. pred uskutočňovaním analytickej izoelektrickej fokusácie.

Príklad 5

Frakcionizácia izoforiem rekombinantného erytropoetínu použitím gradientu s nízkou hodnotou pH na Q-Sepharose

Pri ďalšom postupe sa izoformy erytropoetínu delia použitím gradientu s klesajúcou hodnotou pH a stúpajúcou iónovou silou. Koncentrované diafiltrované médium obsahujúce erytropoetín sa nanesie na stĺpec Q-Sepharose v približnom pomere 40 mg celkového proteínu na ml gélu. Potom sa stĺpec premyje približne 2 objemami stĺpca lOmM Tris-HCI s pH 7,0 a potom približne 10 objemami stĺpca 2mM kyseliny octovej/lmM glycínu/20gM síranu meďnatého/6M močoviny (s pH približne 4,8), aby sa odstránili kontaminačné proteíny a izoformy erytropoetínu obsahujúce menej než asi 7 zvyškov kyseliny sialovej. Izoformy obsahujúce približne 8 až 12 zvyškov kyseliny sialovej sa eluujú zo stĺpca použitím gradientu od približne 2mM kyseliny octovej v 6M močovine/lmM glycíne/20pM sírane meďnatom do 40mM kyseliny octovej v 6M močovine/lmM glycíne/20pM síranu meďantom (s pH približne 4). Celkový objem gradientu je približne 40 objemov stĺpca a zbierajú sa frakcie s približným objemom jedného stĺpca do nádob obsahujúcich Tris pufer v objeme postačujúcom na úpravu pH na hodnotu v rozmedzí od 6 do 8,5, aby sa zabránilo dlhodobej expozícii zachytených frakcií nízkej hodnote pH. Delenie sa monitoruje analytickou izoelektrickou fokusáciou alikvótnych vzoriek frakcií. Na obr. 4 je znázornené delenie izoforiem 8 až 11, ktoré sa dá týmto postupom uskutočniť. Izoformy 12 až 14, ktoré zostanú po skončení gradientovej elúcie viazané k stĺpcu, sa eluujú premytím pufrom obsahujúcim lOmM Tris-HCI, 140mM chlorid sodný a 20mM síran meďnatý ( s pH 7,0). Izoformy (oddelené gradientovou elúciiou alebo eíuované roztokom chloridu sodného) sa zbavia kontaminačných proteínov chromatografiou na obrátených fázach a následnou gélovou chromatografiou (pozri príklad 2 uvedenej publikácie Lai et al.).

Príklad 6

Konštrukcia analógov humánneho erytropoetínu

Existujúce miesta pripojenia uhľohydrátových zvyškov v aminokyselinovej sekvencií humánneho erytropoetínu sú uvedené na obr. 5 (SEQ ID. NO: 26). Postupmi, ktorými sa vytvárajú prídavné glykozylačné miesta v erytropoetíne, sú súhrnne uvedené na obr. 6A až 6C a sú opísané ďalej.

Na použite pri in vitro mutagenéze sa syntetizujú nasledujúce oligonikleotidové priméry.

[Asn⁴, Ser⁶J EPO:

5’ CGCCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA 3’ (SEQIDNO: 1) [Asn®, Šeril] EPO:

5’ ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3’ (SEQ ID. NO: 2) [Asn®®] EPO: 5’ GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3’ (SEQ ID. NO: 3) [Asnl24] EPO: 5’ TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC 3’ (SEQ ID. NO: 4) [Asnl25] EPO: 5’ CAGATGCGAACTCATCTGCrCCAC 3’ (SEQ ID. NO: 5) [Asnl63] EPO: 5’

AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTG 3' (SEQ ID. NO: 6) [Thrl25] EPO: 5' TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3’ (SEQ ID. NO: 7) [ProlM, Thrl25] EPO: 5’ CCTCCAG AT£CGACCTCAGCTGC 3’ (SEQ ID. NO:8)

Podčiarknuté kodóny ukazujú chybne párované oblasti, v ktorých aminokyseliny, uvedené v zátvorkách, nahrádzajú aminokyseliny divokého typu.

Produkt (Asn⁴, Ser⁶] EPO sa skonštruuje s cieľom zavedenia prídavného N-glykozylačného miesta do Asn4. Produkt (Asn⁹, Ser¹¹] EPO sa skonštruuje s cieľom zavedenia prídavného N-glykozylačného miesta do Asn 9. Produkt [Asn⁶⁹] EPO sa skonštruuje s cieľom zavedenia prídavného N-glykozylačného miesta do Asn 69. Produkt (Asn^l25Ser¹²⁷] EPO sa skonštruuje s cieľom zavedenia prídavného N-glykozylačného miesta do Asn 125. Produkty [Thr¹²⁵] EPO a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO sa skonštruujú s cieľom zavedenia prídavného O-glykozylačného miesta do Thr 125.

Na použite pri in vitro mutagenéze sa syntetizujú nasledujúce oligonikleotidové priméiy.

{Asn® Thfll] EPO:

5· GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3’ (SEQ ID. NO: 9) [Ser® A_sn®, Thr71] EPO:

5’ CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3’ (SEQ [D. NO: 10) [Asnl25,Thrl27] EPO: 5’ CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3’ (SEQIDNO: 11) [Asn 125,Thr l²⁷,Thr 131] EPO:

5· ATGCGAACrCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3’ (SEQ ID. NO: 12) [ProlMAsnlZS se_r127] _EPo_:

5’ CCAGATCCAAA1TCATCTGCTCCACTC 3’ (SEQ ID. NO: 13) [Prol24,Asnl²⁵,Thrl27] EPO:

5’ CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3’ (SEQ ID. NO: 14) ΠΊιγ125,Πιτ126] EPO: 5’ CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3' (SEQ ID. NO: 15) [Prol24,Thrl²⁵,Thrl26,Thrl311 EPO

Pomocou [Pro¹²⁴,Thr¹²⁵] EPO cDNA, ako východiskovej látky sa oligonukleotidový primér

SK 282003 Β6

5'-AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3' (SEQ ID. NO: 16) prevedie na [Pro¹²⁴,Thr¹²⁵,Thr¹²⁶] EPO. Oligonukleotidový primér 5' TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3' (SEQ ID. NO: 17) sa potom použije na vytvorenie [Pro¹²⁴,Thr¹²⁵,Thr¹²⁶,Thr¹³¹] EPO.

Produkty [Asn⁶⁹,Thr⁷¹] EPO a [Ser⁶⁸,Asn⁶⁹,Thr⁷¹] EPO sa skonštrujú s cieľom zavedenia N-glykozylačného miesta do Asn 69 a na zvýšenie stupňa N-glykozylácie v tomto mieste.

Produkty [Asn¹²⁵,Thr¹²⁷] EPO, [Asn¹²⁵,Thr¹²⁷,Thr¹³¹] EPO, [Pro¹²⁴,Asn¹²⁵,Ser¹²⁷] EPO a [Pro'²⁴,Asn¹²⁵,Thr¹²⁷] EPO sa skonštrujú s cieľom zavedenia N-glykozylačného miesta do Asn 125 a na zvýšenie stupňa glykozylácie v tomto mieste. Produkty [Thr¹²⁵, Thr¹²⁶] EPO a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵,Thr¹²⁶, Thr¹³¹] EPO sa skonštrujú s cieľom zavedenia prídavného O-glykozylačného miesta do Thr¹²⁵ a s cieľom zvýšenia glykozylácie v tomto mieste.

Zdrojom erytropoetínovej DNA pre in vitro mutagenézu je plazmid Hul3, čo je kloň humánnej erytropoetínovej cDNA v pUC (Law et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 6920 (1986)). Plazmidová DNA sa štiepi reštrikčnými enzýmami BstEII a BglII, vzniknuté fragmenty DNA sa podrobia elektroforéze na agarozovom géli a fragment erytropoetínovej DNA s dĺžkou 810 bázových párov (bp) sa izoluje z gélu použitím súpravy GeneClean® a postupov poskytnutých výrobcom (B1O 101, Inc.). Plazmid pBRgHuEPO obsahuje genómový gén erytropoetínu, ako fragment BamHI vložený do derivátu pBR322 (použitý spôsob je opísaný v citovanom patente, pôvodca Lin). pBRgHuEPO sa tiež štiepi BstEII a BglII a izoluje sa vektorový fragment s dĺžkou 6 517 bp. Ligáciou týchto dvoch fragmentov sa získa IGT1. Pri konštrukcii pEC-1 sa pDSVL (ktorý je opísaný v uvedenom Linovom patente a ktorý je znázornený na obr. 5B) štiepi BamHI a liguje sa do neho izolovaný 2,8kb fragment BamHI z IGT1 obsahujúci erytropoetínovú cDNA:

Na vytvorenie jednoreťazcovej DNA pre in vitro mutagenézu sa pEC-1 štiepi BamHI a BGIII a izoluje sa 820pb fragment erytropoetínovej cDNA: Tento fragment sa liguje do miesta BamHI ml3mpl8 za vzniku ml3-EC-l. Jednoreťazcová DNA sa získa zo supematantov E. coli kmeňa RZ1032, ktorý bol infikovaný ml3-EC-l spôsobom opísaným v Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154, 367 (1987) a Messing, Methods in Enzymol 101,20 (1983). Pre in vitro mutagenézu sa približne 1 pg jednoreťazcovej DNA a 0,2 pmoi jedného z opísaných syntetických primérov zmieša so 6 pl pufra (250mM Tris s pH 7,8, 50mM chlorid horečnatý a 50mM ditiotreitol). Teplotná hybridizácia priméru k templátu sa uskutoční tak, že sa reakčný objem doplní vodou do 10 pl, zmes sa 5 minút zahrieva na 65 ⁰ C a potom sa nechá vychladnúť na teplotu miestnosti. Predlžovacia reakcia sa uskutočni prídavkom vždy 2,5 pl dTTP, dATP, dGTP, dCTP a ATP (vždy s koncentráciou lOpM) a následným prídavkom 1 pl (1 jednotky) E. coli DNa polymerázy (Klenowov fragment) a 1 pl (1 jednotky) T4 DNA ligázy. Zmes sa inkubuje cez noc pri 14 °C a použije sa pre transformáciu E. coli kmeňa JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene'33, 103 (1985)) spôsobom opísaným v uvedenej Messingovej publikácii.

Na identifikáciu mutagénnych kolonov diferenciálnou hybridizáciou sa plaky na živom agare prenesú na filtre Gene Sreen (New England Nuclear). Filtre sa usušia pod infralampou a potom jednu hodinu inkubujú v 6x SSC s obsahom 1% SDS pri 60 “C. Na hybridizáciu sa uvedený oligonukleotidový primér (8 pmol) označí na konci T4 polynukleotidkinázou a gama ³²P-označeným ATP a inkubuje sa s filtrami cez noc v 6 x SSC, 0,5 % SDS a lOOmg/ml

DNA lososieho spermatu pri 37 °C, s cieľom mutácie [Asn¹²⁴], pri 55 °C, s cieľom mutácie [Asn⁴, Ser⁶], pri 65 °C s cielom mutácií [Thr¹²⁵] a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] a pri 70 °C s cieľom mutácií [Asn⁹, Ser¹¹] a [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵]. Ďalší deň sa filtre trikrát premyjú 6x SSC pri teplote miestnosti a uskutoční sa autorádiografia. Ak to je potrebné, premyjú sa fíltráty 6x SSC pri postupne sa zvyšujúcej teplote, až dokiaľ nie je dosiahnutý stav, že nie je pozorovaná žiadna, alebo len malá hybridizácia k plakom so sekvenciou erytropoetínovej cDNA divokého typu. Klony poskytujúce pozitívne hybridizačné signály pri týchto podmienkach sa identifikujú a retransfekujú do JM109, s cieľom izolácie čistého klonu. Dideoxy-analýza terminácie reťazcov ukazuje, že sú prítomné mutácie na asparagínový, serínový, treonínový a prolínový zvyšok.

Vytvarovacou metódou (Holmes et al., Anál. Bioche. 117, 193 (1981)) sa z transfekovaných buniek JM109 získajú dvojreťazcové ml3 EC-1 DNA obsahujúce zmeny [Asn⁴, Ser⁶], [Asn⁹, Ser¹¹], [Asn¹²⁵], [Ser¹²⁷], [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵], [Thr¹²⁵ a Pro¹²⁴,Thr¹²⁵]. Tieto DNA sa štiepia BstEII a XhoII a izolujú sa 8 lObp fragmetnmi erytropoetínovej DNA. pEC-1 sa štiepi BstEII a potom čiastočne BGIII a 5'-konce výsledných fragmetnov sa defosforylujú bakteriálnou alkalickou fosfatázou v lOmM Tris s pH 8 pri 60 °C v priebehu 60 minút. Vektorový fragment s dĺžkou 7 kb, ktorý neobsahuje 810bp fragment BstEII-BglII, sa izoluje a liguje k opísaným erytropoetínovým fragmentom. Výsledné plazmidy (označené pEC-X, kde X je číslo analógu) obsahujú DNA kódujúcu analógy erytropoetínu so zmenenými aminokyselinovými zvyškami v uvedených polohách.

Alternatívne sa skonštruuje analóg erytropoetínu (pEC34) in vitro mutagenézou, pri ktorej sa deletujú aminokyselinové zvyšky 41 až 55. Pritom vznikne menší (775 bp) fragment BstEII-BglII obsahujúci EPO. Tento fragment sa uvedeným spôsobom vloží do pECl. S cieľom klonovania analógov erytropoetínu sa pEC34 štiepi BstEII, čiastočne štiepi BglII, defosforyluje a vektor sa izoluje (tento spôsob je opísaný). Vektorový fragment s dĺžkou 7 kb sa potom liguje k fragmentom erytropoetínu, ako to je opísané vyššie. Klonovanie s pEC34 umožňuje ľahké rozlíšenie medzi rekombinantmi a jednoduchým novým uzatvorením. Len novým uzatvorením vzniká menší fragment BstEII-BglII než ako sú analógy, čo sa dá ľahko rozlíšiť na agarozovom géli.

Tabulka 3

Analógy erytropoetínu s miestami pre N-viazané uhlohydritové reťazce

Analóg Číslo	Substitúcia aminokyselín	Zmeny v sekvencii
N1	Asn^Ser^	CGC-+AAC ATC-+AGC
N2	Asn^Ser1!	AGC-žAAC GTC-žAGC
N3	Asnl^Thr2!	GCC-+AAC GAG-»ACG
N4	Asn^Thr·^2	GCT-žAAT CAC->ACG
N5	An«	CCA->AAT
N6	S«H2Asn43Tlir<S	CCA-+TCA GAC-bAAC
N7	S«49	TAT-yrcr
N8	Asn51Thr53	TGG->AAT AGG->ACG

SK 282003 Β6

Tabuľka 3 (pokračovanie)

Analógy erytropoetínu s miestami pre N-viazané uhľohydrátové reťazce

Analóg číslo	Substitúcia aminokyselín	Zmeny v sekvencii
N9	W’Tta-M	GGG-fAAC CAG—►ACG
N10	Asn®	CTG-»AAC
Nll	Asn®Thr7l	CTG-»AAC TCG-fACA
N12	Ser^Asn^^Thr71	Nll plus GCC^TCC
N13	Asn^Thr^	TGG-»ATT CCC->ACC
N14	SerS'Asn^BThr^	N13 plus CCG-/TCG
N15	Ser^1* Asn8®Thiyi7Thr^2	N14plus CAG-fACG
N16	Ser^AsníSíThr^Ala16^	N14 plus AGG-OCG
N17	Asn^Ser^O	TGG-sAAT

	CCC-»TCC
N18	Val^ÄsnBSľhr^	CCG-»GTG TGG->AAT CCC-»ACC
N19	Ser87 Asn^SGly^rhr^O	CCG-»TCG TGG-»AAT GAG-»GGG CCC->ACC
N20	Αβη®Πε9(>Πιτ91	GAG-fAAC CCC-»ATC CTG-*ACG

T a b u I k a 3 (pokračovanie)

Analógy erytropoetínu < miestami pre N-viažané uhľohydrátové reťazce

Analóg číslo	Substitúcia aminokyselín	Zmeny v sekvencii
N21	SerBTAsn^IleWThryí	N20 plus CCG-»TCG
N22	Asnľl^ThrlľS	GGA-»AAC ACG-+ACG
N23	AsnllSVallZl	GCC->AAC CCT-*GTT
N24	AMlZlScr’^lWZ’	CCT-+AAT CCA-»TCA
N25	W»	GCG-žAAT
N26	Serl22AsťJ24	CCA-»TCA GCG-»AAC
N27	Asnl25serl27	GCC—>AAC GCT-»TCT
N28	Asn'25rinl27	GCC-»AAC GCT-rACG
N29	Leu^Serl^Asní^Thr1^7	N28 plus CCT-»CTT CCA-+TCA
N30	Thrl20GI,l22Ij„123A.n«5Tk,12’	N28plus TCC-»ACC CGC-*GGG GAT-+CTC
N31	Asnt^Sert^	TCA-4AAT GCT-tTCT
N32	AsnL^Thr^ValLťy	TCA-+AAT GCT~*ACT CCA-*GTA

Tabuľka 3 (pokračovanie)

Analógy erytropoetínu $ miestami pre N-viazané uhľohydrátové reťazce

Analóg číslo	Substitúcia aminokyselín	Zmeny v sekvencii
N33	Leu^lSerl22Asnl2ÓThrl2BVí|129	N32plus CCT-sCTT
N34 Thfl21Olyl23Serl25Asnl26Thrl28VaH29	N32 plus CCT->ACG GAT->GGG GCC->TCC
N35	Ser^Asn1·*0	CCA-6AGC CTC-*AAC
N36	Ajo'32	ACA-*AAC
N37	A, „1^136	ACT-»AAT GAC->ACC
N38	Asn135	GCT+AAT

N39	Asnl^ÔThr^	GAC-+AAC TTC-*ACC
N40	^„137^139	ACT-tAAT CGC-»ACC
N41	Asn13shr140	TTC-sAAC AAA->ACA
N42	Asn^	GTC-»AAC
N43	SeTl*5Thrl49vall50	TTC->TCC CTC—»ACC CGG-+GTG
N44	Glyl^ThrUS	TTC-»GGC CTC-sACC
N45	AsnlSÓ	CTG->AAT
N46	AsnltfSerlóS	aca-»aat
N47	.Asn^ÚThr^Val^Asn^Thr^O	N4 a N18
N48	Asn®Thr71 Ser87 Asn^Thr^O	Nll a N14

Tabuľka 4

Analógy erytropoetínu s miestami pre O-viazané uhľohydrátové reťazce

Analóg číslo	Substitúcia aminokyselín	Zmeny v sekvencii
01	Ser<>	ATC-»AGC
02	Ser’	TGT->TCC
03	Ser8	GAC->AGC
04	Šeril	GTOTCT
05	Ser18	GAG-vTCG
06	Ser»	GAG-4TCG
0?	Ser»	TGT->AGC
08	Ser»	TGT->TCT
09	Ser»	GCT->TCT
010	SerM	TGC-»TCA
011	Ser’’	GAG-tTCG
012	Ser»»	TAT-tTCT
013	Ser«l	GTA-»TCA
014	Ser®	GTC-»TCC
015	Ser8’	CTG-*TCG
016	Ser68	GCC-»TCC
017	Ser’»	CTG-»TCG
018	Ser73	GCT-»TCT
019	Ser’»	GTC-»TCT
020	Ser’S	CTG->TCG
021	Ser»	GCC->TCC
022	Ser8!	TTG-KTCG
023	Ser88	CAG->TCG
024	Ser8»	CCG-+TCG
025	Ser®	CTG-+TCG
026	Ser»8	GCC^TCC
027	Ser»»	GTC-+TCC
028	SerlE	CTT-tTCT

Tabuľka 4 (pokračovanie)

Analógy erytropoetínu s miestami pre O-viazané uhľohydrátové retazce

Analóg číslo	Substitúcia aminokyselín	Zmeny v sekvencii
029	Ser™	CGG-»AGT
030	SerlOS	CTC->AGC
031	Ser™	CTT-tTCT
032	Šerili	GCT-+TCT
033	SerlU	CTG-+TCG
034	Šeril»	OCC-aTCC
035	Ser!»	GCT-kTCT
036	Sérii»	TCG-KJAG
037	Serlil	TGC->TCC

038	fro^Serin	GCC-*CCC GCT-»TCT
039	Thré2	GAA-+ACA
040	Tliré4	TGG-*ACG
041	Thr<5	CAG-»ACG
042	Thr®	TGG-»ACG
043	Thr90	CCC-*ACC
044	Ttir«	CAG-*ACG
045	Tliľ«»	AGT-»ACT
046	TtelW	CGG-»ACG
047	ThrllS	CAG-fACG
048	Thrl23	OAT->ACT
049	ThrlW	GCG—»ACG
050	T1ul25	GCC-+ACC
051	TkrUSSerlľ	GCC-»ACC GCT-+TCT
052	^125-^126	GCC-+ACA TCA->ACA
053	Thrl26	TCA-»ACC

Tabuľka 4 (pokračovanie)

Analógy erytropoetínu s miestami pre O-viazané uhľohydrátové

reťazce
Analóg číslo	Substitúcia aminokyselín	Zmeny v sekvencii
054	Thrl27	GCT-»ACT
05$	Thrl30	CTC-+ACC
056	ThľWl	CGA-»ACA
057	ThrlM	GAC-tACC
OSÍ	TV40	AAA-»ACA
059	Pro124Thrl25	GCG-»CCG GCC-+ACC

SK 282003 Β6

060	ProlMThrl25Tlrl26	059 plus TCA-fACC
061	ftol24Ttol2SThr12STlirl31	060 plus
062	HGG C-terminálne predĺženie	COA->ACA

Tabuľka 5

Analógy erytropoetínu s miestami pre N- a O-viazané uhlohydrátové reťazce

Analóg	Substitúcia	Zmeny
číslo	aminokyselín	v sekvencii
	Ser^AsneSThrW	N14a 062
NO1	HCG C-terminálne predĺženie
	Asn^nir^Val®^Asn®®Thr^	N47a062
NO1	HCG C-termmílne predĺženie

Plazmidy označené pDEC-X (kde X predstavuje číslo analógu) sa skonštruujú inzerciou erytropoetínovej cDNA do pDECdelta, ktorý je derivátom plazmidu pDSa2. Expresný vektor pDSa2 je všeobecne opísaný v medzinárodnej prihláške PCT W090/14363. pDECdelta sa získa z pDSa2 pomocou tohto poradia stupňov:

1. Namiesto HindlII v pDSa2 sa deletuje štiepením pDSa2 DNA HindlII, na lepivé konce HindlII sa pôsobí E. coli DNA polymerázou (Klenowov fragment) a jednotlivými dTNP a uskutoční sa religácia vektora s tupými koncami. Získa sa plazmid pDSa2deltaH.

2. pDSa2deltaH sa rozštiepi Sali a liguje sa k nemu syntetický oligonukleotid obsahujúci zostrihnutý signál SV40 s Sali linkérompripojeným k 3-koncu zostrihnutého signálu. Syntetický oligonukleotid má tieto sekvencie (SEQ ID. NO: 18):

5’

TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTT AGTCmTTGTCmTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTG GTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCnT ACTTCrAGGCCTGTACGGAAGTGTrACTTCTGCTCTAAAAG CTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3’

Výsledným plazmidom je zostrih pDSa,IIdeltaH.

3. Zostrih pDSalIdeltaH sa štiepi Sali a jeho konce sa otupia tým, že sa na lepivé konce pôsobí t4 DNA polymerázou a jednotlivými dTNP. Rovnakou metódou sa otupia konce 820 bp fragmetnu BamHI-BglII erytropoetínovej cDNA a uskutoční sa ligácia k plazmidu. Získa sa plazmid pDEC-1.

4. Plazmid pDEC sa rozštiepi kPnl a PvuII a jeho konce sa otupia tým, že sa na lepivé konce pôsobí nukleázou z bôbu „Mung“. Plazmid sa religuje s cieľom delécie vyštipnutého fragmentu Kpnl-PvuII, čim vznikne pDECdelta.

Plazmidy pDEC-X sa získajú z pDECdelta úplným rozštiepením BstEII a potom čiastočným rozštiepením BglII. Vektorový fragment neobsahujúci erytropoetínové kódujúce sekvencie sa izoluje a liguje k 810bp fragmentom BstEII-BglII obsahujúcim požadovaný plazmid.

Podrobnosti konštrukcie niektorých analógov obsahujúcich niekoiko aminokyselinových zmien sú opísané ďalej.

Konštrukcia pDEC(n47) a pDEC(N48) pDEC(N47), ktorý obsahuje mutácie Asn30 Thr32 Val 187 Asn88 a Thr90 sa skonštruuje z pDEC(N18) a pDEC(N4). pDEC(N18) sa rozštiepi HindlI a BglII a izoluje sa 445bp fragment. pDEC(N4) sa rozšitiepi BstEII a HindlII a izoluje sa 377bp fragment. Tieto dva fragmetny sa ligujú do pDECdelta rozštiepeného BstEII a BG1II spôsobom opísaným počas vzniku pDEC(N47).

pDEC(N48), ktorý obsahuje mutácie Asn69 Thr71 Ser87 Asn88 a Thr90 sa skonštruuje z pDEC(N14) a pDEC(Nl 1). pDEC(N14) sa rozštiepi HindlI a BglII a izoluje sa 445bp fragment. pDEC(Nll) sa rozšitiepi BstEII a HindlII a izoluje sa 377bp fragment. Tieto dva fragmetny sa ligujú do pDECdelta rozštiepeného BstEII a BG1II spôsobom opísaným vyššie za vzniku pDEC(N48).

Konštrukcia pDEC(062) (fúzia HCG-erytropoetín) pDEC (062) sa zloží z pECI a 107bp StuI-BglII linkéra zo syntetickej DNA, ktorý obsahuje 28 karboxyterminálnych aminokyselín z humánneho chorionického gonadotropínu (Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln) (SEQ ID. NO: 25) (Pierce et al. Ann. Rew- Biochem. 50, 465 (1981)). Tento linkér má túto sekvenciu:

5’ CCTGTAGGACAGGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCC TCCCCCCAGCCTTC3’ GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGG AGGGGGGTCGGAAG5’ CAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGACACCCCGATCCT CCCACAATGA (SEQ ID. NO: 19) 3’

GTTCAGGTAGOGCTGAGGGCCCCGGGAGCCTGTGGGGCT AGGAGGGTGTTACTCTAG (SEQ ID. NO: 20) pCEI sa rozštiepi Stul a BglII a izolujhe sa 610 bp fragment DNA. Tento synteteický linkér sa fosforyluje ATP a polynukelotidkinázou a liguje s fragmentom PECI do pDECdelta pred tým rozštiepeného BstEII a čiastočne rozštiepeného BglII opísaným spôsobom.

Konštrukcia pDEC(NO 1) pDEC(N01 sa skonštruuje z pDEC(062) (HCG-EPO) a DEC(N14) (Seú’Asn^Thr⁹⁰). pDEC177 sa rozštiepi Stul a BglII a pomocou GeneClean® sa izoluje 610bp fragment DNA obsahujúci mutácie Ser87Asn88Thr90. pDEC(062) sa rozštiepi Stul a BglII a izoluje sa fragment s dĺžkou 107 bp. Tieto dva fragmenty DNA sa ligujú do pDECdelta predtým rozštiepeného BstEII a čiastočne rozštiepeného BglII opísaným spôsobom.

Konštrukcia pDEC(NO2) pDEC(N02) sa skonštruuje zložením pDEC(062) (HCG-EPO) a pDEC(N47) (Asn^3OThr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr^M). pDEC(N47) sa rozštiepi Stul a BglII a pomocou GeneClean© sa izoluje 610bp fragment DNA obsahujúci mutácie Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr90. pDEC(062) sa rozštiepi Stul a BglII a izoluje sa fragment s dĺžkou 107 bp. Tieto dva fragmenty DNA sa ligujú do pDECdelta predtým rozštiepeného BstEII a čiastočne rozštiepeného BglII opísaným spôsobom.

Konštrukcia pDEC(NO16) Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²

DEC(N16) sa skonštruuje zložením pDEC(N14) (Serg⁸⁷Asn⁸⁸Thr^9fl) a pDEC258 (Ala¹⁶²). pDEC258 sa skonštruuje použitím opísaných spôbov mutagenézy in vitro a v polohe 162 sa kodón AGG vymení za kodón GCG. pDEC(N14) sa rozštiepi Stul a BglII a pomocou GeneClean® sa izoluje 610bp fragment DNA obsahujúci mutácie Scr⁸⁷Asn⁸⁸Thr^<’⁰. pDEC(258) sa rozštiepi Stul a BglII a izoluje sa fragment s dĺžkou 210 bp. Tieto dva fragmenty DNA sa ligujú do pDECdelta predtým rozštiepeného BstEII a čiastočne rozštiepeného BglII opísaným spôsobom.

SK 282003 Β6

GLN24

GLN38

GLN83

Konštrukcia pDEC(Rl), (R2) a (R3)

Na odstránenie glykozylačných miest z pDEC(N14) sa ml3-EPO(N14) obsahujúci mutácie Ser⁸⁷, Asn⁸⁸ a Thr⁹⁰ podrobí in vitro opísanej mutagenéze použitím týchto primárov

5’ GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3(SEQ ID. NO: 21) 5' CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC3’ (SEQ ID. NO: 22) 5’ CTGTTGGTCCAGTCTTCCCAG3' (SEQ ID. NO: 23)

Výsledné plazmidy sa označia pDEC(Rl) (Gln^Se/’As^’Thr⁹⁰, pDEC(R2) (Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr’^fl) a pDEC(R3) (Gln⁸³Ser^S7Asn⁸⁸Thr^9C). ml3EC-l sa tiež podrobí in vitro mutagenéze použitím uvedených oligonukleotidových primérov, a získajú sa tak pEClO (Gin²⁴) a pEC8 (Gin³⁸). pEC9 (Gin⁸³) sa skonštruuje použitím tohto priméru

5' CCTGTTGGTCCAGTCTTCCCAGCA3' GLN83 (SEQ ID. NO: 24)

Klony cDNA humánneho erytropoetínu a analógy zodpovedajcúe [Asn⁴, Ser⁶]EPO, [Asn⁹, Ser¹¹] EPO, [Asn⁶⁹]EPO, [Asn¹²⁴]EPO, [Asn¹²⁵,Ser¹²⁷lEPO, [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵]EPO, [Thr¹²⁵]EPO a [Pro¹²⁴, Thr^I25]EPO a klony cDNA analógov opísaných v tabuľkách 3, 4 a 5 sa elektroporáciou prenesú do buniek COS-1 (ATTC č. CRL-1650). Bunky COS-1 sa zozbierajú zo semikonfluentných misiek, premyjú sa médiom (Dulbeccovo modifikované esenciálne médium obsahujúce 5 % fetálneho teľacieho séra a 1 % L-glutamínu/penicilínu/streptomycínu (Irvine Scientific)) a resuspendujú na koncentráciu 4 x 10⁶ buniek/ml. Jeden ml buniek sa prenesie do elektroporačnej kyvety (Bio-Rad). Elektroporácia sa uskutočňuje pomocou zariadenia BioRad Gene Pulser pri kapacite 25 gF a napätí 1 600 V za prítomnosti 100 až 200 pg nosičovej DNA a 2 až 20 pg plazmidovej DNA kódujúcej erytropoetínový analóg. Elektropórované bunky sa prenesú do misiek v množstve 2 x 10⁶ buniek na misku na kultiváciu tkanív s priemerom 60 mm s 5 ml média. 2 až 4 hodiny po prenesení do misiek sa médium nahradí 5 ml čerstvého média. Médium upravené bunkami sa oddelí 3 až 5 dní po elektroporácii.

Príklad 7 Charakterizácia analógov erytropoetínu

A. Stanovenie adície uhľohydrátov

Objem supematantu obsahujúci 5 až 21 jednotiek z buniek COS transfekovaných jednotlivými cDNA erytropoetínových analógov opísanými v príklade 6 sa cez noc pri teplote miestnosti imunoprecipituje králičiou protierytropoetínovou polyklonálnou protilátkou. 20 až 80 pl 1 : 1 Proteín A-Sepharose vo fosfátovom pufrovanom roztoku chloridu sodného (PBS) sa pridá k imunoprecipitátu a zmes sa 1 hodinu inkubuje pri teplote miestnosti. Vzorky sa odstredia, premyjú PBS a tam, kde je to uvedené, sa peleta spracuje N-glykanázou, aby sa odstránili N-viazané uhľohydrátové reťazce. Vzorky sa analyzujú elektroforézou na 15% SDS-polyakrylamidovom géli, vykoná sa prenos na nitrocelulózu a analýza Westem opísaná v Bumette et al., Anál. Biochem. 112, 195 až 203 (1981) a Elliott et al., Gene 79, 167 až 180 (1989) použitím zmesi myšacích antierytropoetínových monoklonálnych protilátok. Jedna z takýchto protilátok, 9G8A, je opísaná v Elliott et al. (1989) Bood 74, Supp. 1, A. 1228.

Analýza supematantov buniek COS transfekovaných [Asn^6,]EPO cDNA a [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO cDNA ukazuje, že proteíny majú väčšiu veľkosť než erytropoetín s humán nou sekvenciou. Táto zväčšená veľkosť ukazuje na prítomnosť prídavného N-viazaného uhľohydrátového reťazca (obr. 7). Spracovanie Supematantov buniek COS transfekovaných cDNA [Thr¹²⁵]EPO a cDNA [Pro¹²⁴,Thr¹²⁵]EPO N-glykanázou ukazuje, že proteíny majú väčšiu veľkosť v porovnaní s erytropoetínom s humánnou sekvenciou. Táto zväčšená veľkosť ukazuje, že je prítomný prídavný O-viazaný uhľohydrátový reťazec (obr. 8). Analýza Westem blot iných vybraných analógov je uvedená na obr. 10.

Na stanovenie počtu N-viazaných uhľohydrátových reťazcov, ktoré sú pripojené k EPO, vykoná čiastočné rozštiepenie Nglykanázou. Analógy rHuEPO sa exprimujú v bunkách CHO a oddelí sa spracované médium neobsahujúce sérum. Skúmavky obsahujú 40 jednotiek EPO (objem je nastavený vodou na 15 pl). Do každej skúmavky sa pridá 10 pl 0,5 % SDS a vzorky sa 3 hodiny varia. Potom sa ku každej vzorke pridajú tieto zložky: 10,8 pl 0,5M fosforečnanu sodného s pH 8,6, 5 pl 7,5 % Nonidetu P40 a 1,5 pl roztoku N-glykanázy (Genzyme) s koncentráciou 250 jednotiek/ml. Vzorky sa inkubujú uvedený čas pri 37°C. Reakcia sa zastaví prídavkom vzorkového pufra SDS-PAGE (pozri vyššie)a potom sa podrobí analýze Westem na SDS-PAGE (10 % akrylamidu) použitím anti-EPO polyklonálnej protilátky a anti-králičej súpravy Westastain© (Vector Laboratories) a 4-chlómaftolu, ako substrátu. Analýza N-viazaných reťazcov použitím tejto metódy je pre humánny erytropoetín a analóg N14 znázornená na obr. 11.

B. Stanovenie účinnosti erytropoetínu

Uskutočnia sa rádioimunoeseje (RIA) spôsobom opísaným v uvedenej publikácii Egrie et al. Stanovenie EIA sa vykonávajú použitím súpravy EIA Clinigen® (Systémy R a D), pričom sa pracuje podľa postupov dodaných výrobcom. Biologická účinnosť in vivo analógov erytropoetínu sa stanovuje na supematantoch získaných z buniek CHO exprimujúcich analóg erytropoetínu alebo na purifikovanom erytropoetíne získanom z média spracovaného bunkami CHO opísaným ďalej použitím exhypoxického polycytemického myšacieho biologického stanovenia (Cotes et al., uvedená citácia).

Účinnosť erytropoetínu in vitro sa stanoví skúškou tvorby erytroidnej kolónie, ktorú opísali Iscove et al., J. Celí. Physiol. 83, 309 až 320 (1974); skúška je modifikovaná. Mononukleované bunky z buniek humánnej kostnej drene sa čiastočne purifikujú na „ficoll-paque cushion“, premyjú sa Iscovým médiom, aby sa odstránili pilipnuté bunky, a potom sa nanesú na misky. Kultivačné médium obsahuje 0,9 % metylcelulózy a neobsahuje žiadny hovädzí sérový albumín. Erytroidné kolónie sa zisťujú po 8 až 10 dňoch kultivácie.

Analógy erytropoetínu transfekované a exprimované v bunkách COS spôsobom opísaným v príklade 6 sa analyzujú v surových supematantoch buniek COS použitím RIA, EIA a stanovenia s tvorbou erytroidnej kolónie. Purifikovaný erytropoetín s humánnou sekvenciou vykazuje in vitro účinnosť, ktorá je provnateľná s účinnosťou podľa RIA stanovenou pri uvedených skúškach. Analógy [Asn⁶⁹]EPO, [Thr¹²⁵]EPO a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO majú in vitro účinnosť, ktorá je porovnateľná s účinnosťou RIA a poskytujú dôkaz, že obsahujú prídavné uhľohydrátové reťazce (podľa stanovenia uvedeného v časti A). [Thr¹²⁵]EPO a analógy N4, N11, N14, N16, N18, N47, N48, 062, NOla NO2 sa ďalej analyzujú tak, že sa kloň cDNA kódujúci analóg erytropoetínu transfekuje do buniek CHO a supematanty buniek CHO sa podrobia stanoveniu RIA alebo EIA a biologickému stanoveniu in vivo. Výsledky sú uvedené v tabuľke 6.

SK 282003 Β6

Účinnosť in vivo analógov Rl, R2 a R3 exprimovaných v supematantoch buniek CHO sú uvedené v tabuľke 7.

Tabuľka 6

Analógy erytropoetínu obsahujúce prídavné uhľohydrátové reťazce

Sekvencie EPO	N-viazané retazce	O-viazané retazce	Účinnosť in vivo RIA alebo EIA
	ť	T--	0,6
A«»“rhrn	3 až 4’	n.t.	1.1
	4	n.t.	n.L
Aí+’Thr”	4	n.t.	n.L
a™	4	znilmn.*	Q.L
Α.Λν	4	n.t.	045-0,7
S-“A.n*^hr’‘	4	n.L	n.t.
	4'	n.L	14
SereTA»wTTw*)	3 až 4'	normál.	1.0
5«τ·’Α»>“θΙν,*ΠιΙ’“	4	n.t.	n.t.
Set,7A«>“Thr’Grta	4	zniimn.*	n.t.
Α»“η«“η·Γ’'	4		n.t.
ΙΓαΛΛι,	4	n.L	n.t.
S«rA»>“Thr’l’Ala1“	4	n.L	1.3
A^’tolr”	3až4	n.l.	a.t.
Aia'3íThr,í0	3až4	n.t.	n.t.
Ain,“Tbr’,Ser',A«,“Thr”	4až5	n.t.	0,025-045
AraIaHir11Val,7AsnMThrw	4až5*	normál.	1.3
Hr1“	3	la 2'	n.t.
Thr1“	3	la ť	0,7
*o‘“Thr‘“	3	la ť	n.L
HCG C-terminálne predĺženie SeTrAin“Thr*°	3	aspoň 3*	1.0-13
HCG predĺženie A*a30Thr”Val”AsnwThr,°	4	aspoň 3f	13
HCG predĺženie	4«Ž5	aspoň 3*	0,8

Poznámky k tabuľke 6:

‘ počet prídavných N-viazaných reťazcov sa odhaduje na základe mobility peptidových analógov v SDS géloch spôsobom opísaným v príklade 7A.

^b pomer účinnosti analógu in vivo k množstvu analógu erytropoetínu. Merania účinnosti sa uskutočňujú na supematantoch buniek CHO s analógmi, použitím myšacieho polycytemického biologického stanovenia. Množstvo analógu erytropoetínu v supematantoch buniek CHO sa stanovuje skúškou RIA alebo EIA opísanou v texte.

^c počet prídavných uhľohydrátových reťazcov sa potvrdí skúškou migrácie gylkoproteínu v SDS-géloch po čiastočnom rozštiepení N-glykázou spôsobom opísaným v príklade 7A.

^d O-viazaný reťazec v Serl26 je prítomný na 70% molekúl humánneho erytropoetínu.

‘ analógy so zníženým stupňom O-glykozylácie, ktoré obsahujú uhľohydrátový reťazec v Serl26 na menej než 70 % molekúl.

^f Thr¹²³EP0 obsahuje dva O-viazané reťazce na viac než 60 % molekúl. Thr¹²⁵EPO obsahuje dva O-viazané reťazce na približne 40 % molekúl. Pro¹²⁴Thr¹²⁵EPO obsahuje dva O-viazané reťazce na viac než 80 % molekúl.

⁸ Tieto analógy obsahujú tri O-viazané reťazce a môžu mať aj štyri alebo päť reťazcov. O samom HCG je známe, že obsahuje štyri O-viazané reťazce.

n.t. znamená, že skúšanie nebolo uskutočnené.

Tabuľka 7

Účinnosť humánneho erytropoetínu a analógov obsahujúcich prešmyky uhľohydrátových miest

Sekvende EPO	N-viazané retazce	Účinnosť in vivo RIA alebo EIA
	3	0,69
Gin“	2	0.16
Gin3*	2	0,16
Gin”	2	043
Gln“SerlnAsn“Thr’a (Rl)	3	0,69
Gln“Ser',AínThr (R2)	3	0.41
Gln”SereŤAsnwThr’° (R2)	3	0.50
SCT”Asn“Thr”	3 až 4	1.48

Pomer účinnosti in vivo k RIA alebo EIA sa stanovuje spôsobom opísaným v poznámke^a k tabuľke 6

C. Výroba izomorfných zmesí získaných z analógov erytropoetínu [Thr ¹²⁵]EPO (EPO 050)

Analóg erytropoetínu, [Thr ¹²³]EPO, sa skonštruuje spôsobom opísaným v časti A. príkladu 6. 810bp fragment erytropoetínovej cDNA s [Thr ¹²⁵] mutáciou sa izoluje rozštiepením plazmidu pEC obsahujúceho [Thr ^I23] mutáciu pomocou BstEII a BglII a ligáciou vzniknutého fragmetnu k pDECdelta (derivát pDSa2) (pozri príklad 6).

Plazmid pDECdelta obsahujúci [Thr ¹²⁵j erytropoetínovú cDNA sa transfekuje do DHFR-deficientných buniek CHO. 770 ml média spracovaného bunkami CHO sa skoncentruje použitím membrány s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 10 000 dalton a diafiltruje proti lOmM Tris-HCl s pH 8,6 do dosiahnutia konečného objemu 34 ml. Alikvóty vzniknutého koncentrátu s objemom 17 ml sa nanesie na stĺpce Q-Sepharose s rýchlym prietokom (objem lôžka 5 ml), ktorý je ekvilibrovaný v rovnakom pufri. Elúcia sa uskutočňuje lineárnym gradientom od 0 do 250mM chloridu sodného v lOmM Tris-HCl s pH 8,6. Alikvóty frakcií eluovaných zo stĺpca, buď neupravené alebo štiepené N-glykanázou sa analyzujú SDS-PAGE alebo IEF a spoja sa príslušné frakcie podľa obsahu izoforiem a/alebo uhľohydrátu, pričom vzniknuté zmesi sa označia číslami 2, 3 a 4. Každá zmes sa nanesie na stĺpec Vydac C4 (214TPB 2030; priemer 1 cm; objem lôžka 1,8 až 2,5 ml; prietok 0,34 ml/min). Stĺpec sa premyje vždy 2 objemami stĺpca 20% etanolu v Tris-HCl s pH 7,0. Stĺpce sa eluujú lineárnymi gradientmi 20 až 94 % etanolu v lOmM Tris-HCl s pH 7,0. Vyrobia sa zmesi 2, 3 a 4, tieto zmesi sa zriedia lOmM Tris-HCl s pH 7,0 a nanesú na stĺpce Q-Sepharose s rýchlym prietokom. Po premytí lOmM Tris-HCl s pH 7,0 sa vzorky eluujú 20mM citrónom sodným/250mM chloridom sodným s pH 7,0. Purifikované [Thr¹²³] zmesi sa analyzujú pomocou IEF (pozri obrázok 9.) Tieto zmesi sa tiež analyzujú vyššie uvedeným spôsobom (Cotes et al.) na biologickú účinnosť. Výsledky sú uvedené v tabuľke 8. [Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr^M]EP0 (EPO N14)

Preparatívny postup 1

Analóg EPO N14 sa purifikuje pomocou trojstupňového postupu, ktorý zahrnuje ionexovú chromatografiu, chromatografiu na obrátených fázach a gélovú filtračnú chromatografiu. Počas stupňa ionexovej chromatografie sa spoja vhodné frakcie s cieľom získania zmesi izoforiem s vysokým obsahom kyseliny sialovej. Dve ďalšie zmesi sa vyrobia pri chromatografii na obrátených fázach s obsahom analógu s agregátom alebo bez neho. Podrobnosti tohto purifikačného stupňa sú uvedené ďalej.

1. Médium upravené bunkami CHO exprimujúcimi analóg EPO N14 sa zozbiera a približne 2,5-násobne skoncentruje pri použití miešanej kyvety s membránou YM10 (Amicon) a diafiltruje proti Tris s pH 8,5.

2. Skoncentrované médium sa nanesie pri asi 12 A₂8o/ml živice na stĺpec Q-Sepharose FF (Pharmacia) ekvilibrovaný v lOmM Tris s pH 8,5 pri prietoku 0,2 cm/min.

3. Po nanesení média sa stĺpec premyje tromi objemami stĺpca lOmM Tris s pH 8,5 a eluuje 50 objemami stĺpca gradietnu od 0 do 0,5M chloridu sodného v lOmM Tris s pH 8,5. Zbierajú sa frakcie, ktorých objem zodpovedá objemu stĺpca.

4. Vzorka každej frakcie sa skúša na IEF géli pri pH 3 až 5. Na základe rozdelenia izoforiem zisteného metódou IEF sa spoja také frakcie, aby vzniknutá zmes obsahovala prevaž

SK 282003 Β6 ne izoformy 11 až 18. K tejto zmesi sa pridá EDTA do lmM výslednej koncentrácie.

5. Zmes izoforiem sa nanesie pri asi 5 A_28a/ml živice na stĺpec s obrátenými fázami C4 (Vydac) ekvilibrovaný v 20 % etanole v lOmM Tris s pH 7,0 pri prietokovej rýchlosti 2,5 cm/min. Stĺpec sa premyje jedným objemom stĺpca 20 % etanolu v lOmM Tris s pH 7,0 a eluuje sa 30 objemami stĺpca od 20 do 94 % etanolu v lOmM Tris s pH 7,0 pri prietokovej rýchlosti 1 cm/min. Zbierajú sa frakcie s objemom zodpovedajúcim 0,2 objemu stĺpca.

6. Vzorka každej frakcie sa analyzuje pomocou neredukujúceho 12 % SDS-PAGE. Na základe prítomnosti agregátu pozorovaného na SDS-géli sa vytvoria dve oddelené zmesi. Zmes č. 1 obsahuje analóg EPO, ale žiadny agregát, a zmes č. 2 obsahuje ako analóg EPO tak aj agregát.

7. Zmes č. 1 sa približne 65-násobne skoncentruje a zmes č.

sa približne 250-násobne skoncentruje použitím zariadenia Centricon 10 (Amicon). Pre každú zmes sa uskutoční výmena pufra za 20mM citran sodný/lOOmM chlorid sodný s pH 7,0.

8. Každá zmes sa individuálne purifikuje na stĺpci HPLC SEC-250 (Bio-Rad) ekvilibrovanom v 20mM citrane sodnom/lOOmM chloride sodnom s pH 7,0. Zmesi sa nanesú pri hodnote nižšej než 6 A_28O/ml živice pri prietokovej rýchlosti 2,26 cm/min. Pri každej skúške sa zbierajú pikové frakcie zodpovedajúce monomémym analógom.

9. Zmeria sa obsorbancia každej zmesi a časť každej zmesi sa skoncentruje pre analýzu gélu SDS-PAGE a IEF. Zmes č. 1 obsahuje izoformy 15 až 17 a použije sa na farmakokinetické štúdie a štúdie väzby k receptoru.

Preparatívny postup 2

Podobne sa purifikuje analóg EPO N14 trojstupňovým postupom, ktorý zahrnuje ionexovú chromatografiu, vysoko účinnú chromatografiu na obrátených fázach a chromatografiu na hydroxylapatite. Počas stupňa ionexovej chromatografie sa analóg rozdelí do troch zmesí podľa obsahu izoforiem. Podrobnosti tohto purifikačného stupňa sú uvedené ďalej.

1. Supematant buniek CHo exprimujúcich analóg EPO N14 sa oddelí a približne lOx skoncentruje použitím zariadenia Filtrov Mini-Ultrasette s tangenciálnym tokom a potom diafiltruje proti lOmM Tris s pH 8,5.

2. Po nanesení média sa stĺpec premyje tromi objemami stĺpca lOmM Tris s pH 8,5 a eluuje 50 objemami stĺpca gradientu od 0 do 0,5M chloridu sodného v lOmM Tris s pH 8,5. Zbierajú sa frakcie, ktorých objem zodpovedá objemu stĺpca.

4. Vzorka každej frakcie sa skúša na IEF géli pri pH 3 až 5. Na základe rozdelenia izoforiem zisteného metódou IEF sa jednotlivé frakcie rozdelia do troch zmesí. Zmes označená názvom „nízke izoformy“ obsahuje izoformy 4 až 12, zmes označená názvom „stredné izoformy“ obsahuje izoformy 5 až 15 a zmes označená názvom „vysoké izoformy“ obsahuje izoformy 6 až 18.

5. Každá zmes izoforiem sa individuálne purifikuje na stĺpci pre HPLC s obrátenými fázami C4 (Vydac). Stĺpec sa vyvíja gradientom od 0,1 % kyseliny trifluóroctovej vo vode do 0,1 % kyseliny trifluóroctovej v acetonitrile, pričom zvyšovanie koncentrácie acetonitrilu prebieha rýchlosťou 1 %/min.

6. Piková frakcia analógu z každej zmesi sa zhromaždí a zriedi 4 objemami 80mM Tris-HCl/20mM Tris-bázy a potom skoncentruje. Uskutoční sa výmena pufra za lOmM Tris s pH 7,2 pri použití zariadenia Centricon 3, ktoré sú odolné proti rozpúšťadlám.

7. Každá vzorka sa zriedi na hodnotu 2 A₂₈₀/ml v lOmM Tris s pH 7,2 a pridá sa rovnaký objem 4M hydrochloridu do guanidínu (GuHCI, lOmM CHAPS, lOmM Tris s pH 7,2 do koncentrácie výslednej vzorky 1 A₂₈o/ml). Každá vzorka sa nanesie na hydroylapatitový ministlpec ekvilibrovaný 2M GuHCI, 5mM CHAPS, lOmM Tris s pH 7,2. Stĺpec sa premyje ekvilibračným pufŕom a zhromaždia sa frakcie s objemom jedného stĺpca.

8. Zmeria sa absorbancia frakcií, vyrobia sa zmesi a uskutoční sa výmena pufra za lOmM Tris s pH 7,2 použitím zariadenia Centricon 10. Zmeria sa absorbancia každej zmesi.

Výsledné zmesi sa analyzujú na SDS-PAGE a IEF géloch. IEF gély sú znázornené na obr. 12. Skúšky RIA a skúšky účinnosti in vivo sa uskutočňujú opísanými spôsobmi v príklade 7A. Účinnosť výsledných izoforiem in vivo je uvedená v tabuľke 8. Zmes izoforiem s vysokým obsahom kyseliny sialovej sa použije pri experimentoch zameraných na zistenie zvýšenia hematokritu u myší.

Tabuľka 8

Účinnosť izoforiem analógov erytropoetínu

Sekvencie EPO	Zmes izoforiem	Účinnosť in vivo (U/mg peptidu)3
ThrlZS	izoformy 8 až 12	147 000b
	izoformy 9 až 12	215 000b
Ser^Asn^^r90	izoformy 13 až 15	111 000b
izoformy Ί až 12	132 000±17 000
	izoformy 10 až 14	233 000 ± 39 000
	izoformy 12 až 12	272000114 000

* Množstvo erytropoetínového peptidu v mg sa vypočíta z hodnôt A₂₈₀ zmesí izoforiem Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr° EPO pri použití existenčného koeficientu 0,93 pre 1 mg/ml roztoku.

^b Smerodajná odchýlka pre zmesi izoforiem Tht¹²⁵EPO nie je uvedená, keďže stanovenie účinnosti bolo uskutočňované raz alebo dvakrát.

Príklad 8

Biologické vlastnosti analógu EPO N14

Účinnosti zmesí izoforiem analógu EPO N14, rekombinantného humánneho erytropoetínu (rHuEPO) a izolovanej izoformy rHuEPO 14 sa porovnávajú pri i.v. farmakokinetických skúškach, skúškach väzby k receptoru a štúdiách hematokritu. Zmesi izoforiem EPO N14 sa vyrobia spôsobom opísaným v príklade 7C. rHuEPO sa vyrobí spôsobom opísaným v uvedenej publikácii Lei et al. Izoforma 14 rHuEPO sa purifikuje týmto spôsobom: rHuEPO, ktorý sa skladá zo zmesi izoforiem 10,11,12,13, 14 a 15 sa nanesie na stĺpec Q-Sepharose s rýchlym prietokom (priemer 2,2 cm, výška 3,4 cm) ekvilibrovaný v lOmM Tris s pH 7,2. Stĺpec s rHuEPO sa ekvilibruje s 2mM kyselinou octovou/6mM močovinou (pufer A) a potom sa uskutoční elúcia vaicfázovým gradientom navrhnutým pre optimálnu purifikáciu izoforiem 13 a 14. Gradient zahrnuje 0 až 7,3 0 800mM kyseliny octovej/6M močoviny (pufer B) v 750 ml, 7,3 až 11,4 % pufra B v 750 ml, 11,4 až 26,8 pufra B v 1 250 ml, 26,8 až 62,4 % pufra B v 1 250 ml a potom 6,4 až 100 % pufra v 700 ml. Zbierajú sa frakcie s objemom 12,5 ml. Frakcie sa neutralizujú hydroxidom amónnym a skúšajú sa izoelektrickou fokusáciou na polyakrylamidových géloch. Frakcie obsahujúce čistú izoformu 14 sa spoja, skoncentrujú v miešanej kyvete Amicon vybavenej membránou YM-10 a potom sa uskutoční výmena pufra za vodu.

SK 282003 Β6

A. i.v. farmakokinetická štúdia

Uskutočnia sa dve oddelené štúdie na porovnanie farmakokinetických parametrov analúgu EPO N14 (izoformy 15 až 17) a izolovanej izoformy 14 s rHuEPO.

Pri každej štúdii sa 1 pCi buď ^l25I-izolovanej izoformy 14, analógu ^l23I-EPO N14 alebo ^I23I-rekombinantného humánneho erytropoetínu (Amersham) intravenózne vstriekne do kanyly zavedenej do krčnej tepny samca potkana Sprague-Dawley s hmotnosťou v rozmedzí od 310 do 378 g. V rôznych časoch po podaní sa odoberajú krvné vzorky s objemom 0,3 ml, ktoré sa centrifugáciou spracujú na sérum. Každá vzorka s objemom 0,1 ml sa inkubuje cez noc pri 4 °C s 90 % etanolom a potom sa v nej stanoví koncentrácia ¹²⁵I-EPO (buď rekombinantného humánneho erytropoetínu, izolovanej izoformy 14, ale analógu EPO N14). Etanolom vyzrážaný ¹²³I-EPO v každej vzorke séra sa spočíta v počítači gamarozpadov. Výsledné farmakokinetické krivky sú uvedené na obr. 13. Pre každého potkana sa stanovia farmakokinetické parametre použitím nelineárnej regresnej analýzy PCNONLIN 4.0 Statistical Consultants, 1992 a výsledky pre každú skupinu sa spriemerujú. Výsledky farmakokinetických štúdií získané použitím analógu EPO N14 a izolovanej izoformy 14 sú súhrnne uvedené v tabuľke 9.

Ako je zrejmé z tabuľky 9, existuje podstatný rozdiel medzi hodnotou sérovej clearance analógu EPO N14 a hodnotou vypočítanou pre rekombinantný humánny erytropoetín. Rekombinantný humánny erytropoetín má najrýchlejší beta polčas 3,10 hodiny v porovnaní s 3,97 hodiny pre izolovanú izoformu 14 a 4,36 hodiny pre analóg EPO N14. Skupina s rekombinantným humánnym erytropoetínom vykazuje tiež najrýchlejší polčas clearance 1,78 hodiny v porovnaní s 2,40 hodiny pre izolačnú izoformu 14 a 3,03 hodiny pre analóg EPO N14.

Tabuľka 9

Preklad farmakokinetkkých paraiwtrov rHuEPO, iiofonny 14 rHuEPO a EPO N14 (izofomiy 15 až 17) po i.v. podaní

Prípravok	Poteužl Alfa	vdností (h) Beta	AUC (cpm.h/ml) 0 -« hodín	VD ml/lcj	Rýchlostná Clearance	Polčas clearance (h)
konfanta eliminácie (h-l)	(mUk|.h)
rHuEPO	stred (032	3,10		44,9	0,400	6.14	138
*ns6	S.O. 0,155	«34	69187	83	0,069	136	037
Izoforma 14	stred OJNX	3.97	483329	363	0388	3.XO	2,40
n=4	S.O. 0,066	«,40	53638	2,2	0,020	0,12	(1,15
EPO NM	stred 0,422	4,36	692231	37.4	0330	W	3,03
n=4	S.O. 0,165	036	40355	13	0,021	0,17	037

+1 Priemerná hodnota pre skupiny. ktorým bol podávaný rekombinantný humánny erytropoetín pri fannakokinetlckej itddii s EPO N14 (n=4, v prípade skupiny, ktorej bol podávaný rekotnbinaMný humánny erytropoetín) a pri farmakoklnetickej Štúdii * izolovanou hoformoa 14 (n=2, v prípade skupiny, ktorej bol podávaný rekomblaantný humánny erytropoetín).

S.O. = imerodatní odchýlka

B. Stanovenie väzby k receptoru

Interakcie analógu EPO N14 (izoformy 15 až 17) s receptorom erytropoetínu sa študujú vytesňovacou skúškou pri chlade použitím erytroleukemických buniek OCIM1 (Papayannopoulou et al., Blood 64 (supp. 1), 116a (1984)). Zvyšujúce sa koncentrácie neznačeného EPO N14 sa inkubujú s bunkami OCM1 spolu s konštantnou koncentráciou ¹²³I-rHuEPO, s cieľom stanovenia množstva EPO N14 potrebného pre súťaž s ¹²³I-rHuEPO o väzbu k receptoru. Na porovnanie sa nechá s konštantnou koncentrácioiu ¹²³I-rHuEPO súťažiť tiež postupne sa zvyšujúca koncentrácia neznačeného rHuEPO.

Neznačený EPO N14 sa zriedi skúškovým pufrom a pridá v množstve 0,03 ng, 0,1 ng, 0,3 ng, 1,0 ng, 3,0 ng, 10,0 ng a 30,0 ng (vztiahnuté na hmotnosť peptidu). Do všetkých skúmaviek sa pridá 0,5 ng ¹²³I-rekombinantného humánnneho EPO a potom sa pridá vždy približne 0,5 x x 10⁶ buniek OCIM1. Skúmavky sa inkubujú pri 37 °C v pretrepávanom vodnom kúpeli počas 2 hodín. Po inkubácii sa roztoky odstredia cez dibutylftalátový/biftalátový olejový roztok, aby sa oddelil nenaviazaný ¹²⁵I-rHuEPO od ^l23I-rHuEPO viazaného k bunkám OCIM1. Izolujú sa bunkové pelety a množstvo ^,23I-rHuEPO viazaného k bunkám sa stanoví spočítaním gamarozpadov. Vypočíta sa údaj charakterizujúci špecifickú väzbu k bunkám a lineárnou regresnou analýzou sa stanoví koncentrácia neznačeného proteínu, ktorá je potrebná na to, aby bolo 50 % ’²⁵I-rHuEPO viazaného za neprítomnosti kompetitora vyradených zo súťaže.

Z výsledkov troch skúšok vyplýva, že v priemere je potrebné množstvo 2,67 ± 0,73 ng neznačeného peptidu EPO N14 na zníženie väzby ¹²³I-rHuEPO k bunkám OCIM1 o 50 %. Pri rovnakých troch skúškach je potrebné množstvo v priemere 0,51 ± 0,15 ng neznačeného rHuEPO pre súťaž s väzbou 0,5 ng ’²³I-rHuEPO. Na základe týchto výsledkov je potrebný 5,25-násobný nadbytok EPO N14 pre súťaž s väzbou ¹²³I-rHuEPO k receptoru EPO v porovnaní s neznačeným rHuEPO (p < 0,01).

Tiež sa uskutoční prídavný experiment priameho porovnania väzby analógu EPO N14, izolovanej izoformy 14 a rekombinantného erytropoetínu k receptoru erytropoetínu. Výsledky tohto experimentu ukazujú, že analóg EPO N14 má k receptoru nižšiu afinitu než izolovaná izoforma 14. V porovnaní s neznačenou izoformou 14 je pri súťaži so ^I23I-rHuEPO o väzbu k receptoru potrebný približne dvojnásobný nadbytok analógu EPO N14 (obr. 14).

C. Štúdia hematokritu

Uskutočni sa in vivo štúdia na porovnanie schopnosti vysokých a nízkych izoforiem EPO N14 (z preparatívneho postupu 2 opísaného v príklade 7C(, izolovanej izoformy 14 a rekombinantného humánneho erytropoetínu zvýšiť hematokrit ošetrených myší. Rozdelenie izoforiem v zmesiach izoforiem EPO N14 označených názvami „vysoké izoformy“ a „nízke izoformy“, ktoré sa používajú pri tejto súťaži, je uvedené na obr. 12.

Myšiam CD1 (s hmotnosťou asi 30 g) sa počas celkovo 6 týždňov 3 x za týždeň intraperitoneálne injekuje jeden z uvedených prípravkov v 0,25 % myšacom sérovom albumíne alebo placebo (PBS s 0,25 % myšacím sérovým albumínom). Dávkovanie erytropoetínových prípravkov je vztiahnuté na hmotnosť peptidu aje upravené tak, aby 30g myš obdržala 0,071 pg peptidu/dávka, a to buď vysoké frakcie EPO N14, nízke frakcie EPO N14, izoformu 14 alebo štandardný rHuEPO. Pri skúšaní vysokých frakcií EPO N14 a izoformy N14 sa použije tiež prídavná skupina, ktorá sa podáva 0,036 pg peptidu/dávka. Hematokrity všetkých myší sa stanovia pred začatim pokusu a potom sa zisťujú dvakrát týždenne retroorbitálnym odberom krvi. Na záver pokusu sa zhromaždi sérum všetkých zvierat a skúša sa na protilátky proti vstreknutému produktu. Dáta získané od zvierat, ktoré sú charakterizované ako negatívne s ohľadom na neutralizáciu protilátok, sa použijú pri následnej analýze.

Ako ukazuje obr. 15, zvieratá, ktorým boli podané vysoké izoformy EPO N14, vykazujú najvyššiu priemernú hodnotu hematokritu v skupine v porovnaní so zvieratmi ktorým boli podané ostatné prípravky. Izoforma 14, rekombinantného humánneho EPO a nízke izoformy EPO N14 zvyšujú hematokrit v menšom rozsahu.

S cieľom porovnania rôznych erytropoetínových prípravkov kvantitatívnejším spôsobom sa vypočíta priemerná počiatočná rýchlosť vzrastu hematokritu (0 až 11 dní), zmeria sa plocha pod krivkou (0 až 39 dní) a vypočíta sa celkové zvýšenie hematokritu (tabuľka 10). Nech sa už použije ktorékoľvek z týchto kritérií, zdá sa byť zmes „vysokej izo17

SK 282003 Β6 formy“ EPO N14 účinnejšia (vztiahnuté na hmotnosť peptidu) než ktorýkoľvek z ostatných skúšaných prípravkov. Ako zmes vysokej izoformy EPO N14, tak aj izoforma 14 je účinnejšia než rekombinantný humánny erytropoetín. Zmes „nízkej izoformy“ EPO N14 má najnižšiu účinnosť pri porovnávaní použitím niektorých z týchto analýz.

Tabufka 10

Účinok EPO N14 (zmesi vysokej izoformy a nízkej izoformy), iwfonay 14 a rHuEPO na hcmalokrít mytí (A) DĹŽKA:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA:

(U) TYP MOLEKULY:

(xi) POPIS SEKVENCIE:

AGGCCTGCAG GAATGGGAGC AGATGACCAG GTG 33 bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárna cDNA SEQIDNO: 6:

Prípravok	Dávka ta)	Rýchlosť zvyiovanla hematokritu1 (body/deťí)	Plocha pod krivkou'	Celkové zvýieaic hematokritu3 (body)
Vysoké izoformy N14	0,071	1,46	«19	25,4
Izoforma 14	0,071	1.14	546	22,6
Vysoké izoformy N14	0,036	0,98	428	19,1
Izoforma 14	0,(06	0.7«	284	10,7
rHuEPO		1,0	424	17,5
Nízke izoformy N14	(1,071	03	212	9.3

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA:

(ii) TYP MOLEKULY: (xi) POPIS SEKVENCIE:

TCCAGATGCG ACCTCAGCTG CTC bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárna cDNA SEQIDNO: 7:

Začiatočná rýchlosť zvyiovatila hematokrtta ia vypoCftl metódou lineárnej regrezte t výsledkov odo dáalldodfti 12.

plocha pod krivkou ia vypočíta Irapezoidnou aumáctou z výiledkov odo diía 0 do dňa 39.

Celkové zvýfenk bentatokrttu sa vypočíta ako rozdiel priemernej hodnoty hematokrita v ekuplne 30 deft a priemernej hodnoty hematrokrilu * skupine pri začatí pokusu.

Vynález bol síce opísaný použitím prednostných realizácií, odborníkom v tomto obore je však zrejmé, že sa dá rôznym spôsobom obmieňať a modifikovať, pričom všetky takéto variácie spadajú do rozsahu tohto vynálezu, ak sú kryté nasledujúcimi patentovými nárokmi. Tieto patentové nároky je potrebné vykladať na podklade ekvivalentov.

ZOZNAM SEKVENClf (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) ------------(H) (Ui) (N)

E liet, Stereu O. Byme, Thomas E. Analógy erytropoetínu ________________ 26 ADRESA PRE KOREŠPONDENCIU: (A) ADRESÁT: .....

PRIHLASOVATEĽNÁZOV VYNÁLEZU! POČET SEKVENCII:

(»)

Affigen Iac., US. Patent Operatťoailrbw 1840 DeHxviUand Drive Thousand Oska Kalifornia

USA _v,___ 91320-1789(21?)

STROJNE ČITTATELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA!

(B) POČÍTAČ:

(C) OPERAČNÝ SYS.:

(D) SOPTWARE:

(B) ULICA:

(C) MESTO:

(D) ŠTÁT:

(E) KRAJINA (F) PSČ:

Duketa (BM PC kompatibilný PC-DOSZMS-DOS Patentín ReleaaeM.O. verzia 4125 (vi) DÁTA VZŤAHUJÚJCE SA K TEJTO PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/108,016 (B) DÁTUM PODANIA: 17. augusta 1993 (C) ZATREIDENIE;

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE! ··'-'»·· jQ bázových párov nukleová kyúltna jeden reťazec lineárna cDNA SEQIDNO:!:

(A) DĹŽKA (B) TYP:

(C) REtAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA: (ii)TYPMOLEKULY: (d) POPIS SEKVENCIE:

CGCCCACCA ACCTCAGCTG TGACAGCCGA 30 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 2:

(l) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 27 bázových párov nukleoví kyselina jeden reťazec lineárna cDNA

SEQ IDNO:2:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA (ii) TYP MOLEKULY:

(d) POPIS SEKVENCIE: ATCTGTACAA CCGAAGCCTG GAGAGOT (2) INFORMÁCIE O SEQ IDNO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

r x... j3 Mzcvých párov nukleoví kyselina jeden reťazec lineárna cDNA

SEQ (D NO: 3:

(A) DĹŽKA (B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ (D) TOPOLÓGIA (ii) TYP MOLEKULY: (d) POPIS SEKVENCIE: _____

OGGCCTGGCC AACCTGTCGG AAG (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE;

• - · 26 bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárna cDNA

SEQ ID NO: 4:

(A) DĹŽKA (B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA:

(1) TYP MOLEKULY:

(d) POPIS SEKVENCIE: TCCCCTCCAG ATAATGCCTC AGCTGC (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: S:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE;

bázových párov nukleová kyrelina jeden reťazec lineárna cDNA SEQIDNO: 5:

(A) DĹŽKA (B) TYP.

(O REŤAZCOVOSŤ: (D) TOPOLÓGIA: (ii) TYP MOLEKULY: (d) POPIS SEKVENCIE: ______

CAOATOCOAA CTCATCTGCT CCAC (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 6:

(I) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA:

(ii) TYP MOLEKULY: (ti) POPIS SEKVENCIE:

CCTCCAGATC CGACCTCAGC TGC bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárna cDNA SEQIDNO: 8:

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA: (H) TYP MOLEKULY: (xi) POPIS SEKVENCIE:

GGGCCTGGCC AACCTGACAG AAGCTGTC (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 10:

bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárna cDNA SEQ ID NO:

(I) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA:

(ii) TYP MOLEKULY:

(xi) POPIS SEKVENCIE:

VAGGGCCTGT CCAACCTGAC AOAAGCTGTC 30 bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárna cDNA

SEQID NO: 10.

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE;

bázových párov nukleoví kyselina jeden reťazec lineárna cDNA SEQIDNO: 11:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA: (ii) TYP MOLEKULY: (xi) POPIS SEKVENCIE:

CAGATGCGAA CTCAACGGCT CCAC (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE;

bázových párov nukleová kyselina jede» reiauc lineárna cDNA

SEQ ÍD NO: 35:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP:

(C) REtAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA:

(ii) TYP MOLEKULY:

(xi) POPIS SEKVENCIE:

ATGCGAACTC AACGGCTCCA CTCACAACAA TCACT 35 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 27 bázových párov (B) TYP nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQID NO: 13:

CCACATCCA ATTCATCTGA TCCACTC 27 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE: 2} bázových párov nukleoví kyselina jeden reťazec lineárna cDNA SEQIDNO: 14:

(A) dLŽKA:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA: (ii) TYP MOLEKULY: (d) POPIS SEKVENCIE:

CCAGATCAA ATTCAACAGC TCCACTC (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 15:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE: ... i a jQ bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec JineáTM cDNA

SEQID NO: 24:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP;

(Q REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA: (ii) TYP MOLEKULY: (ri) POPIS SEKVENCIE:

CCAGATGCGA CAACAGCTGCTCCA (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE;

^e ‘ 23 bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárna cDNA

SEQ ID NO: 16:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA: («) TYP MOLEKULY, (xi) POPIS SEKVENCIE:

AGATCCGACC ACCGCTGCTC CAC (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 17:

(I) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

231 bázových páro» nukleoví kyselina jeden refazec lineárna cDNA SEQ IDNOtl:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA: (ti) TYP MOLEKULY: (xi) POPIS SEKVENCIE:

TGCTCCACTC ACAACAATCA CTG

SK 282003 Β6 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA:

(ii) TYP MOLEKULY: (xi) POPIS SEKVENCIE:

184 bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárna cDNA . __________ SEQ ID NO: 18:

TCMMMCTOMAAAiXMAAACTŤAACT«ΟΤΛΛΦΙΤΤΑWCII1IIUI CmTATTTC MKmxOMlA TOCOOTOGW OTUCAAATC* AAOAACTOCTCCTCAOTOO* wnvu.111 ACrrcTAPOC CWtACOOAA OTOTTACnc tocktaaaa octuctocaa caaoctmtc (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP. (Q REŤAZCOVOSŤ: (D) TOPOLÓGIA:

(ii) TYP MOLEKULY: (xi) POPIS SEKVENCIE:

107 bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárna

CDNA SEQ ID NO: 19:

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA:

(ii) TYP MOLEKULY: (xi) POPIS SEKVENCIE:

108 bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárna cDNA

SEQ ID NO: 20: aATCTCATTo-rocxiMMATCMOOTonco Aoooccccoa oagtcoqoat aoAcrraaAA mcmocmoo aogooccmo OAAaAoaATeioreeccraTccTAGU» (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP (C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA:

(ii) TYP MOLEKULY:

(xi) POPIS SEKVENCIE;

bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárna cDNA

SEQ1D NO: 21:

GGAGGCCGAG CAGATCACGA CGG (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: -·· (C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA:

(U) TYP MOLEKULY: (xi) POPIS SEKVENCIE: CTTGAATGAG CAGATCACTG TCC bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárni

CDNA

SEQ ID NO: 22:

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 23:

(I) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: ---- (B) TYP.

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA; (ii) TYP MOLEKULY: (xi) POPIS SEKVENCIE:

CTGTTOGTCC AGTCTTCCCÄ G bázových párov nukleová kyselina jeden reťizec lineárna cDNA

SEQ ID NO: 23:

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE;

(A) DĹŽKA: -·· (B) TYP (C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA:

(ii) TYP MOLEKULY: (xi) POPIS SEKVENCIE:

CCTQTTGGTC CAGTCTTCCČ AGC bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárni cDNA

SEQ ID NO: 24;

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP:

(C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA:

(H) TYP MOLEKULY:

bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárni cDNA

SEQ ID NO: 25:

(xi) POPIS SEKVENCIE:

Ser Ser Ser Ser Ly» Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 1 S 10 15

Leu Pro Gly Po Ser Asp Thr Pro lle Leu Pro Gin

25 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

.. _ j jl__ 193 bázových párov nukleová kyselina jeden reťazec lineárna cDNA

SEQ ID NO: 26:

(A) DĹŽKA:

(B) TYP (C) REŤAZCOVOSŤ:

(D) TOPOLÓGIA;

(ii) TYP MOLEKULY:

(xi) POPIS SEKVENCIE:

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 1015

Leu Ser Leu Po Leu Gly Leu po Val Leu Gly Alá Po Pro Arg Leu 20 2530 íle Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 4045

Ala Glu Asn Tie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 5560

Asn íle Thr Val Po Asp Thr Lys val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 7580

Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu 85 9095

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105110

Gin Po Ττρ Glu Po Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gta Lys Glu 130 135140

Ala íle Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Po Leu Arg Thr tie 145 150 155160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

180 185190

Claims (15)

1. Analóg humánneho erytropoetínu obsahujúci aspoň jedno prídavné miesto pre N-glykozyláciu na asparagínovom zvyšku, v ktorejkoľvek z aminokyselinových polôh 30,51,57,88, 89,136 a 138.

2. Analóg humánneho erytropoetínu podľa nároku 1, ktorý je produktom expresie exogénnej sekvencie DNA.

3. Analóg humánneho erytropoetínu podľa nároku 1 obsahujúc i ako prídavné miesto pre glykozyláciu miesto pre N-viazaný uhľohydrátový reťazec.

4. Analóg humánneho erytropoetínu, ktorým je Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO.

5. Analóg humánneho erytropoetínu zvolený zo súboru zloženého z

Asn3Orta32EPO; Ambite⁵³ EPO; A^ltaSSEPO; VaJ⁸⁷Asn⁸⁸Ttir⁹⁰ EPO; Ser⁸⁷ Asn⁸⁸™⁹⁰ EPO; Ser⁸⁷ Asn⁸⁸Oly⁸⁹Thr⁹⁰ EPO; S«®⁷Asn⁸⁸Thr®®Thr⁹2 EPO; Ser⁸W⁸Thr«)Al»l«2EPO; Atn®Thr⁷ls«⁸⁷Ain⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; AM⁸⁹De⁹⁽>rhr⁹¹ EPO; Ser⁸⁷Asn⁸⁹ne⁹^Thr⁹^ EPO; Asnt^Thp³⁸ EPO; a Asn^l38Tlirl*)EPO;

6. Analóg humánneho erytropoetínu zahrnujúci predĺženie o jednu alebo viac aminokyselín pri karboxylovom konci erytropoetínu, pričom v tomto predĺžení je obsiahnuté aspoň jedno miesto pre glykozyláciu.

7. Analóg humánneho erytropoetínu podľa nároku 6, kde predĺženie zahrnuje peptidový fragment získaný z karboxyterminálnej časti humánneho chorionického gonadotropínu.

8. Analóg humánneho erytropoetínu podľa nároku 7 zvolený zo súboru obsahujúceho

a) humánny erytropoetín, ku ktorého karboxylovému koncu je pripojená aminokyselinová sekvencia Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp- -Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln;

b) analóg charakterizovaný v odstavci a), ktorý ďalej obsahuje Ser⁷Asn⁸⁸'Ilir^í'⁰EPO: a

c) analóg charakterizovaný v odstavci a), ktorý ďalej obsahuje Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO.

9. Analóg humánneho erytropoetínu zahrnujúci deléciu aspoň jedného glykozylačného miesta humánneho erytropoetínu a adíciu rovnakého počtu v prírode sa nevyskytujúcich glykozylačných miest, čím sú zmenené polohy uhľohydrátových reťazcov.

10. Analóg humánneho erytropoetínu podľa nároku 9, kde v prírode sa nevyskytujúcim glykozylačným miestom je miesto N-viazaného uhľohydrátu v aminokyselinovej polohe 88 humánneho erytropoetínu.

11. Analóg humánneho erytropoetínu podľa nároku 10 zvolený zo súboru zloženého z

Gln²⁴S«r^B7Asn«’Thr’°EP0

Gln³²S»r«⁷Asn«²Thr’°EPO a

Gln*³Ser²⁷ABn««Thr’°EPO.

12. Analóg humánneho erytropoetínu obsahujúci prídavné miesto pre O-glykozyláciu v aminokyselinovej polohe 123, pričom v tejto aminokyselinovej polohe je pripojený prídavný O-viazaný uhľohydrátový reťazec.

13. Sekvencia DNA kódujúca analóg humánneho erytropoetínu podľa niektorého z nárokov 1 až 12.

SK 282003 Β6

14. Eukaryotická hostiteľská bunka transfekovaná sekvenciou DNA podľa nároku 12 spôsobom umožňujúcim hostiteľskej bunke exprimovať analóg humánneho erytropoetínu.

15. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje terapeuticky účinné množstvo analógu eiytropoetínu podľa niektorého z nárokov 1 až 12, spolu s farmaceutický vhodným riedidlom, adjuvantom alebo nosičom.