ES2208798T3

ES2208798T3 - Eritropoyetina humana recombinante con un perfil de glicosilacion ventajoso.

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Publication number: ES2208798T3
Application number: ES97115081T
Authority: ES
Inventors: Mathias Dr. Fibi; Peter Dr. Hermentin
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1997-09-01
Filing date: 1997-09-01
Publication date: 2004-06-16
Anticipated expiration: 2017-09-01
Also published as: EP0902085A1; ATE255634T1; DE69726571D1; KR100563017B1; DK0902085T3; EP1007679A1; CA2303476A1; WO1999011781A1; JP4345077B2; US6673609B1; EP0902085B1; JP2001514851A; KR20010023500A; PT902085E; DE69726571T2; AU743833B2; AU9533798A

Abstract

SE DESCRIBEN POLIPEPTIDOS QUE FORMAN LA TOTALIDAD O PARTE DE LA CONFORMACION ESTRUCTURAL PRIMARIA Y DE LAS PROPIEDADES BIOLOGICAS DE LA ERITROPOYETINA, Y QUE TIENEN UNA SEMIVIDA IN VIVO Y UNA ACTIVIDAD BIOLOGICA PERFECCIONADAS, GRACIAS A UN PERFIL MODIFICADO DE LA GLUCOSILACION. SE PROPORCIONAN IGUALMENTE SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DEL CITADO POLIPEPTIDO, VINCULADO OPERATIVAMENTE A ELEMENTOS REGULADORES QUE PERMITEN LA EXPRESION DE DICHA SECUENCIA DE DNA EN LA CELULA HUESPED EUCARIOTICA, ASI COMO VECTORES QUE COMPRENDEN LAS CITADAS FRECUENCIAS DE DNA. ADEMAS, SE DESCRIBEN CELULAS HUESPEDES QUE COMPRENDEN LAS CITADAS SECUENCIAS Y VECTORES DE DNA, ASI COMO SU USO PARA LA PRODUCCION DEL POLIPEPTIDO ARRIBA DESCRITO. SE PROPORCIONAN COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Y DIAGNOSTICAS QUE COMPRENDEN LOS POLIPEPTIDOS, SECUENCIAS DNA O VECTORES DE LA INVENCION. TAMBIEN SE DESCRIBE EL USO DE LOS CITADOS POLIPEPTIDOS, SECUENCIAS Y VECTORES DEL DNA PARA LA PREPARACION DE COMPOSICIONES FARMACEUTICAS, PARA EL TRATAMIENTO DE TODO TIPO DE ANEMIAS PROVOCADAS POR UNA FALTA DE ERITROPOYETINA.

Description

Eritropoyetina humana recombinante con un perfil de glicosilación ventajoso.

La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen la conformación estructural primaria de eritropoyetina y que tienen in vivo una semivida y actividad biológica mejoradas debido a un perfil de glicosilación modificado. La presente invención proporciona, asimismo, secuencias de ADN que codifican la secuencia de aminoácidos de dichos polipéptidos unidos de forma operativa a elementos de regulación que permiten la expresión de dicha secuencia de ADN en células hospedadoras eucariotas, así como vectores que comprenden estas secuencias de ADN. La presente invención se refiere, también, a células hospedadoras que comprenden las secuencias de ADN y vectores anteriormente mencionados y a su uso para la producción de los polipéptidos anteriormente descritos. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas y diagnósticas que comprenden los polipéptidos, secuencias de ADN y vectores anteriormente mencionados. La presente invención se refiere, igualmente, al uso de los polipéptidos, secuencias de ADN y vectores anteriormente descritos para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de cualquier tipo de anemia causada por un déficit de eritropoyetina.

El eritrocito es, con mucho, el tipo más frecuente de célula en la sangre. Cuando está maduro, está completamente lleno de hemoglobina y no contiene prácticamente ninguno de los orgánulos celulares habituales. En un eritrocito de un mamífero maduro están ausentes incluso el núcleo, retículo endoplásmico, mitocondrias y ribosomas, que han sido excluidos de la célula en el transcurso de su desarrollo. Por consiguiente, el eritrocito no puede crecer ni dividirse; la única forma posible de crear más eritrocitos es por medio de las células madre. Adicionalmente, los eritrocitos tienen un período de vida limitado de aproximadamente 120 días en el ser humano. Los eritrocitos agotados son fagocitados y digeridos por los macrófagos del hígado y bazo, que retiran más de 10^{11} eritrocitos senescentes en el ser humano al día. Una falta de oxígeno o un déficit de eritrocitos estimula a las células del riñón para sintetizar y segregar cantidades incrementadas de eritropoyetina al torrente sanguíneo. La eritropoyetina, a su vez, estimula la producción de más eritrocitos. Dado que la variación en el ritmo de liberación de nuevos eritrocitos al torrente sanguíneo se observa ya 1 ó 2 días después de un aumento de los niveles de eritropoyetina en el torrente sanguíneo, la hormona debe actuar sobre células que sean precursoras muy próximas de los eritrocitos maduros. Las células que responden a la eritropoyetina se pueden identificar cultivando células de médula ósea en una matriz semi-sólida, en presencia de eritropoyetina. Al cabo de pocos días, aparecen colonias de aproximadamente 60 eritrocitos, fundada cada una de ellas por una única célula progenitora de eritrocitos. Esta célula de conoce como célula formadora de colonias de eritrocitos, o CFC-E, y da lugar a eritrocitos maduros después de aproximadamente seis ciclos de división o menos. Las CFC-E no contienen todavía hemoglobina y proceden de un tipo precoz de célula progenitora cuya proliferación no depende de la eritropoyetina. Las propias CFC-E dependen de la eritropoyetina para su supervivencia así como para su proliferación: si se elimina la eritropoyetina de los cultivos, las células sufren rápidamente la muerte celular programada. La eritropoyetina como otro factor estimulante de colonias es una glicoproteína que actúa a concentraciones bajas (aproximadamente 10^{-12} M) por fijación a receptores específicos en la superficie celular. Estos receptores pertenecen a una gran familia de receptores, la llamada "familia de receptores de citoquinas", cuyos miembros están compuestos habitualmente por dos o más sub-unidades, una de las cuales se encuentra frecuentemente compartida entre varios tipos de receptores. La eritropoyetina humana madura es una glicoproteína con un peso molecular de 34 a 38 kD, y está compuesta por 166 aminoácidos (AS), representando el residuo glicosilo aproximadamente 40% del peso molecular. Dado que la eritropoyetina es necesaria para la renovación de los eritrocitos, esta hormona resulta esencial para la calidad de vida, especialmente de pacientes afectos de anemia e hipoxia debida a un número reducido de glóbulos rojos, que puede estar causado, por ejemplo, por diálisis o por una reducción de las células eritroides precursoras como consecuencia de terapias basadas en la supresión de la proliferación celular, o por una insuficiencia innata o adquirida de la producción de eritropoyetina. La identificación del gen humano que codifica eritropoyetina ha hecho posible expresar, de forma recombinante, esta proteína en células hospedadoras heterólogas, y proporcionar cantidades suficientes de eritropoyetina humana recombinante (rhuEpo) para el tratamiento de las citadas enfermedades.

Sin embargo, aparte de la estructura primaria de la proteína, la estructura de las cadenas laterales sacáridas de la molécula es especialmente importante para la interacción de Epo dentro del organismo. Por ejemplo, la Epo desialilada no muestra efecto alguno tras su administración en animales. No obstante, se fija al receptor y estimula las células precursoras. El descenso de actividad de asialo-Epo in vivo se puede explicar por el hecho de que es eliminada en el hígado mediante receptores con especificidad por residuos de galactosilo que son susceptibles en la Epo desialilada.

La Epo de tipo salvaje, que se ha utilizado terapéuticamente, tiene en algunos pacientes el efecto de aumentar la tensión arterial, lo que es un inconveniente del tratamiento. Se debe suponer que la Epo interviene también en la regulación de la tensión arterial. Por lo tanto, resulta deseable disponer de proteínas con el efecto fisiológico de la EPO que, sin embargo, no exhiban estas propiedades no deseadas, pero que, no obstante, estimulen la diferenciación y velocidad de división de las células precursoras en eritrocitos. Un efecto secundario adicional de la EPO, hallado en algunos pacientes, es la estimulación de los megacariocitos para la formación de trombocitos. Existe, por consiguiente, un riesgo potencial de trombosis durante el tratamiento con Epo, que se debe interrumpir de inmediato. En este caso, sería deseable una especificidad superior de la Epo.

El documento EP-A-0 411 678 se refiere a vector de plasmidio de ADN recombinante que contiene cADN que codifica Epo humana del clon lambda DEPOFL 13 (ATCC 40153), y a células de mamífero transformadas con este vector, o con un plasmidio que contiene el ADN completo del virus del papiloma bovino, y la secuencia de cADN de la Tabla 3 del documento EP-A-0 411 678, que codifica la Epo humana, y que son de utilidad en la preparación de eritropoyetina humana recombinante que se distingue por la presencia de una glicosilación enlazada a O.

Por lo tanto, el problema técnico subyacente de la presente invención es proporcionar rhuEpo que tenga una actividad biológica y una semivida in vivo mejoradas con respecto a la de origen natural y a la rhuEpo disponible hasta la fecha.

La solución del problema técnico antes mencionado se alcanza proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

En consecuencia, la invención se refiere a un polipéptido que tiene la conformación estructural primaria de la eritropoyetina, que posee la propiedad biológica de determinar que las células de la médula ósea aumenten la producción de reticulocitos y glóbulos rojos, e incrementen la síntesis de hemoglobina o captación de hierro, siendo dicho polipéptido el producto de la expresión eucariota de una secuencia de ADN exógena, usando el sistema de expresión BPV-1, y que posee las siguientes propiedades físico-químicas:

(i): la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos que se ofrece en SEC ID Nº 2;

(ii): está glicosilada;

(iii): más de 5% de las estructuras N-glicano están sulfatadas; y

(iv): la relación Z* de la carga total de N-glicanos Z al número de sitios de N-glicosilación es mayor que 170.

La Epo humana tiene un residuo glicosilo unido a O (en Ser126 de SEC ID NO:1) y tres residuos glicosilo, unidos a N (en Asn24, Asn38 y Asn83 de SEC ID NO:1), que están sialilados^{1}. Se ha demostrado que la sialilación adecuada de estos residuos sacáridos es importante para la semivida in vivo y, por lo tanto, para la eficacia de Epo^{2}. Además, se ha demostrado que diferentes sitios de glicosilación de rhuEpo están diferentemente glicosilados en relación con la complejidad de las estructuras sacáridas y la sialilación^{7,8}. El análisis de glicomuteínas sometidas a ingeniería genética ha demostrado que la eliminación del sitio de glicosilación Asn24 de la molécula de rhuEpo (SEC ID NO:1), que da como resultado la glicomuteína rhuEpo (Gln24) (SEC ID NO:2) es ventajosa tanto para la expresión como para la eficacia in vivo^{4}. Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que rhuEpos que tienen un perfil de glicosilación modificado en términos de estructuras de N-glicanos y número de cargas de N-glicanos por sitio de glicosilación tienen una semivida in vivo y una actividad biológica mejoradas en comparación con rhuEpo o cualquier glicomuteína de rhuEpo descrita hasta el momento^{3,4}. La presente invención se basa en el hallazgo de que el perfil de glicosilación de la muteína rhuEpo (Gln24) (SEC ID NO:2) se puede mejorar aún más por la expresión de la correspondiente secuencia de ADN bajo el control de los elementos de regulación del vector pHOEBE 40-7 del Papilomavirus bovino-1 (BPV-1) en células CHO. Aunque carece de un sitio de N-glicosilación, el polipéptido (SEC ID NO:2) comprende un número de carga total superior al de rhuEpo(wt) e, incluso, superior al de rhuEpo(Gln24) anteriormente descrita^{4,5,6}, lo que tiene como consecuencia un valor Z* significativamente más alto; véase la Tabla II del Ejemplo 9. El polipéptido de la invención tiene una gran cantidad de estructuras sacáridas sialiladas/ sulfatadas por sitio de glicosilación, reduciendo así la eliminación de la molécula por parte de los receptores de asialogalactosilo específicos del hígado. Adicionalmente, se obtiene el mismo efecto biológico de una cierta dosis de rhuEpo(wt) con una dosis menor del polipéptido de la invención; véase la Fig. 1B. Además, al haberse encontrado que la Epo urinaria humana contiene cantidades significativas de oligosacáridos sulfatados^{8}, el polipéptido de la invención se asemeja más a la Epo urinaria humana que cualquier otra rhuEpo actualmente disponible.

El sitio de glicosilación de la posición del aminoácido 24 (Asn) de la secuencia de aminoácidos que se da en la SEC ID NO:1 resulta delecionado mediante la sustitución del aminoácido Asn en posición 24 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID NO:1, mostrándose, por ejemplo, el aminoácido Gln en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2.

Como se ha descrito anteriormente, el polipéptido de la invención tiene una relación Z* de la carga total de N-glicanos Z al número de sitios de N-glicosilación mayor que 170. En una realización preferida, Z* es mayor que 180, por ejemplo, 183, preferentemente, mayor que 190, por ejemplo, 194.

Además, la presente invención se refiere a una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos anteriormente descritos, unidos de manera operativa a elementos reguladores del Papilomavirus Bovino 1 (BPV-1), que permiten la expresión de dicho ADN en una célula hospedadora eucariota. Experimentos llevados a cabo dentro del alcance de la presente invención han revelado que cuando la muteína rhuEpo(Gln24) se expresa en células CHO a través de un sistema de expresión BPV-1, el modelo de glicosilación es significativamente diferente de la muteína rhuEpo(Gln24) expresada en células CHO a través del vector de expresión pABE-40-7; véase la Tabla II, C3 y C4/C5. Empleando el sistema de expresión BPV-1, rhuEpo(Gln24) comprende una mayor sialilación y una nueva calidad de carga a través de la sulfatación; véase la Tabla II. Además de la proteína recombinante esperada, los vectores de expresión BPV-1 son capaces de expresar otras varias actividades funcionales, por ejemplo, factores de actuación trans y otros, que pueden modular las actividades celulares del sistema hospedador. Sin embargo, resulta sorprendente que evidentemente pueden modular también el patrón de modificaciones de post-traducción, por ejemplo, la glicosilación o sulfatación de rhuEpo(Gln24) en células CHO.

La presente invención se refiere, también, a vectores, preferentemente, vectores de expresión, que comprenden una secuencia de ADN, como se ha descrito anteriormente.

En una realización preferida, el vector de expresión es el vector BPV-1 pHOEBE-40-7 descrito en los ejemplos posteriores.

La presente invención se refiere, además, a células hospedadoras que comprenden una secuencia de ADN o un vector de la invención. La secuencia de ADN o vector de la invención que se encuentra presente en la célula hospedadora puede estar integrada en el genoma de la célula hospedadora o se puede mantener de alguna forma extra-cromosómica. La célula hospedadora puede ser cualquier célula eucariota, tal como CHO, BHK, C127i y otras. Células hospedadoras preferidas son las células CHO.

Otro objeto de la invención es un método para la producción del polipéptido de la invención que tenga parte o la totalidad de la conformación estructural primaria de la eritropoyetina, con la capacidad biológica de provocar que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos, y aumenten la síntesis de hemoglobina o la captación de hierro, comprendiendo dicho método el cultivo de una célula hospedadora de la invención y, opcionalmente, aislar dicho polipéptido del cultivo.

Dependiendo de las construcciones y condiciones específicas utilizadas, el polipéptido se puede recuperar de las células, del medio de cultivo o de ambos. El experto en la técnica sabe bien que no sólo es posible expresar un polipéptido nativo, sino también expresar el polipéptido como una proteína de fusión, o añadir secuencias de señal que dirijan el polipéptido a compartimientos específicos de la célula hospedadora, asegurando, de esta forma, la secreción del polipéptido al medio de cultivo, etc. Preferentemente, el polipéptido de la invención se purifica por cromatografía de afinidad, utilizando un anticuerpo monoclonal específico para el sitio de fijación del receptor rhuEpo en la molécula de rhuEpo^{10}. Estos anticuerpos monoclonales se pueden obtener de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica.

Así, la presente invención se refiere también al polipéptido que se puede obtener por el método anteriormente mencionado. El polipéptido de la invención se distingue por su semivida y bioactividad incrementadas en comparación con el mismo polipéptido que tiene la conformación estructural primaria de eritropoyetina, que posee la propiedad biológica de aumentar en las células de la médula ósea la producción de reticulocitos y glóbulos rojos, y aumentar la síntesis de hemoglobina o la captación de hierro, pero que carece del perfil ventajoso de glicosilación, según se ha descrito anteriormente para los polipéptidos de la presente invención.

Figura 1 Actividad biológica de diferentes concentraciones de rhuEpo(WT) y rhuEpo(Gln24)

A.: Se ensayaron las actividades biológicas de diferentes concentraciones de rhuEpowt y rhuEpo(Gln24) en un ensayo de colonia roja de médula ósea humana. A modo de controles, se co-analizaron muestras de GM-CSF y de medio. El número de colonias rojas se evaluó después de dos semanas de cultivo para cada muestra.

Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión pHOEBE-40-7 (rhuEpo(Gln24))

Para la expresión de eritropoyetina en células CHO se utilizó un sistema de expresión derivado del vector de expresión pCES de BPV-1^{11}. Para optimizar el sitio de inicio de traducción según Kozak^{12}, se insertó un triplete ACC directamente aguas arriba del primer codón ATG de la secuencia que codifica Epo, por mutagénesis dirigida al sitio. A continuación, se intercambiaron secuencias codificadoras de rhuEpo(wt) del vector pCES (fragmento BamHI-BgIII) por las secuencias de Epo con el sitio de inicio de traducción óptimo, dando como resultado un vector de expresión pHOEBE-40-1. De manera alternativa, la secuencia que codifica la muteína rhuEpo(Gln24), que también incluye la secuencia de Kozak, se clonó en el vector de expresión, dando como resultado pHOEBE-40-7. En experimentos posteriores, se usó el sistema de vector de expresión pABE-40 para la expresión de células CHO. Las secuencias de muteína y la secuencia de Kozak se obtuvieron por mutagénesis dirigida al sitio^{13} y las secuencias se verificaron por análisis de secuencia. El sistema de expresión pHOEBE-40 de BPV-1 contiene fragmentos de ADN de diversos orígenes. Los diferentes elementos son

a): un fragmento SalI-EcoRI de 2317 pb derivado del plasmidio pJYM^{14}, que contiene secuencias del plasmidio bacteriano pML-1, incluido el gen de resistencia a la ampicilina (Amp) y el origen bacteriano de replicación (E. coli ORI);

b): un fragmento EcoRI-BamHi de 2801 pb, que contiene el promotor de la metalo-tioneína 1 de ratón (MT-1) y la región 3' no codificadora del gen MT-1 de ratón, en orientación inversa. Debido a la estrategia de clonación, las dos partes del gen MT-1 están separadas por una breve secuencia derivada de pBR322 de 31 pb (HindIII-EcoRI) del vector pJYM^{14};

\newpage

c): un fragmento BamHI-BglII de 766 pb, que contiene el c-ADN de rhuEpo(Gln24) (E40-7)^{4} y el sitio de inicio de la traducción optimizado;

d): un fragmento BglII-BamHI de 242 pb que contiene la señal de poliadenilación tardía de SV 40^{15};

e): un fragmento BamHI-SalI de 7953 pb que contiene la totalidad de la secuencia genómica del papilomavirus bovino BPV-1 (correspondiente a 100% del fragmento BPV-1 genoma BamHI)^{16}. Esta secuencia contiene un origen eucariota de replicación, localizado en un fragmento de aproximadamente 100 pb (7900 pb-52 pb del genoma de BPV-1, adyacente al sitio HpaI en posición 1). Adicionalmente, la secuencia comprende marcos de lectura abierta que codifican factores de replicación específicos para BPV-1, factores de trascripción y factores de transformación. Se sugiere que estos factores son capaces de modular los procesos de modificación post-traducción.

Ejemplo 2 Transfección de células CHO dhfr' y detección de niveles de expresión transitorios

Se cultivaron células CHO dhfr' en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10% (FCS). Las transfecciones de las células CHO dhfr' se llevaron a cabo utilizando el método según Graham y Van der Erb^{17}. La expresión y secreción transitorias se analizaron 24, 48 y 72 horas después de la transfección de 10 \mug/ml de ADN del vector de expresión de rhuEpo (pABE-40-7)^{4}. En cada experimento de expresión transitoria, se co-transfectó un vector p4EGD^{18} portador de la secuencia de codificación de una IgG_{1}Fc humana truncada (rhu IgG_{1} Fc) bajo el control de un promotor SV40^{19,20}, y se determinaron las velocidades de expresión de rhuEpo y rhu IgG_{1} Fc usando ELISAs específicos^{21,10}, respectivamente. Las secreciones relativas de las muteínas rhuEpo se estandarizaron sobre las velocidades de secreción de rhuEpo(wt) y rhu IgG_{1} Fc (véase la Tabla I).

TABLA I Secreción transitoria de muteínas de rhuEpo derivadas de CHO

1

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Se ensayó la expresión de transfectantes transitorios de rhuEpo(wt) y rhuEpo(Gln24) en relación con la proteína de fusión IgG_{1} Fc como proteína de referencia segregada después de la transfección (p.t.) a las 24, 48 y 72 horas, respectivamente. Se promediaron los valores medios de determinaciones triplicadas (n=3) de los niveles de secreción absoluta de cada conjunto de transfección. Las variaciones de los valores triplicados fueron menores que 5% para la secreción de rhuEpo/muteína rhuEpo o la secreción de rhuEpoRFc (columna 2). A partir de estos datos, se calcularon los niveles de expresión de rhuEpo en relación con la expresión de IgG_{1}Fc (Fc, 100%) sobre una base porcentual para cada experimento (columna 3). A partir de estos valores, se determinaron los niveles de secreción de rhuEpo(Gln24) con respecto a rhuEpo(wt) sobre una base porcentual para cada experimento (columna 4).

Ejemplo 3 Detección de los niveles de expresión de rhuEpo(wt) transitoria, muteína rhuEpo(gln24)y rhuIgG_{1}Fc

En sobrenadantes de cultivos transitoria o establemente transfectados se analizó el contenido en rhuEpo(wt) o muteína rhuEpo por medio de un ELISA específico para rhuEpo^{21,10}. Basado en un antisuero de conejo policlonal, este ensayo se llevó a cabo de la forma siguiente: se recubrieron placas de microtitulación durante la noche con 500 ng por ml de una fracción de inmunoglobulina anti-rhuEpo de conejo. A continuación, las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía 0,01% de Tween20 y se secaron al aire a 37ºC. Antes de utilizarlas, las placas se saturaron con PBS que contenía 0,05% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA). Seguidamente, las placas se lavaron tres veces con PBS-Tween20 y se incubaron con las muestras de sobrenadante durante 30 minutos. Después de lavar tres veces con PBS que contenía 0,05% (p/v) de BSA, se detectaron rhuEpo y muteínas rhuEpo por la fracción de inmunoglobulina anti-rhuEpo de conejo marcada con peroxidasa (Ig-POD). Después de 30 min de incubación, las placas de microtitulación se lavaron y se reveló la actividad de peroxidasa remanente, correspondiente a rhuEpo capturada, utilizando como sustrato tetrametil-bencidina (TMB). Entonces, se detuvo la reacción por adición de H_{2}SO_{4} y se midieron las placas en un Procesador II de ELISA de Behring (Behringwerke AG, Marburgo, Alemania Federal).

Se analizó en los sobrenadantes de cultivos celulares transitoriamente transfectados la secreción de IgG_{1}Fc para determinar la secreción relativa de las diferentes muteínas de rhuEpo. Para esto, se recubrieron placas de microtitulación con una fracción de inmunoglobulina policlonal de Fc anti-humana de cabra. Después de lavar y de saturar (véase antes), las placas se incubaron con los sobrenadantes durante 1 hora. A continuación, se detectaron las moléculas de IgG_{1}Fc capturadas mediante anticuerpos de Fc anti-humanos de cabra, marcados con peroxidasa (POD) como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 4 Producción de clones celulares que expresan muteína rhuEpo(Gln24) estable

Se obtuvieron clones celulares que segregan muteína rhuEpo(Gln24) por co-transfección del vector pSV2 dhfr que expresa el gen dihidrofolato-reductasa, que confiere resistencia contra metotrexato^{18}, junto con vectores de expresión pABE-40-1, pABE-40-7, pHOEBE-40-1 o pHOEBE-40-7, respectivamente. Después de la transfección, se seleccionaron los cultivos en presencia de metotrexato. Tras un período de dos a tres semanas, crecieron colonias celulares y clones celulares únicos se clonaron usando cilindros de clonación, o de acuerdo con el método de dilución limitante. La producción de rhuEpo(Gln24) se analizó de la forma descrita en el Ejemplo 2.

Ejemplo 5 Incremento de clones celulares de producción

Clones celulares adecuados para la producción se cultivaron adicionalmente y, por último, se expandieron para formar cultivos de frascos rodantes. Para producir eritropoyetinas, células de los correspondientes lotes de siembra se expandieron en frascos rodantes hasta confluencia. A continuación, se sustituyó el medio de crecimiento por DMEM exento de suero, que se cosechó al final de la fase de producción.

Ejemplo 6 Purificación de rhuEpo(Gln24)

Se obtuvieron rhuEpo y glicomuteínas purificadas por cromatografía de afinidad, usando el anticuerpo monoclonal 146/0056^{10}. Este anticuerpo se acopló de forma covalente con sefarosa CL4B (Pharmacia, Uppsala, Suecia), según Fibi^{10}. Tras la elución a pH 2,5 en 1 ml de Tris-HCl 1M, pH 9,5, las muestras se dializaron frente a PBS pH 7,0. Se calculó la concentración de proteínas a partir de la D.O. 280 nm y la pureza de la preparación se controló visualmente después de la separación en un gel de poliacrilamida y subsiguiente tinción con plata (Phast System, Pharmacia).

Ejemplo 7 SDS-Page y tinción con plata

Se llevaron a cabo procedimientos de SDS-Page y de transferencia de Western del modo recientemente descrito^{10}, utilizando el Phast System, con la excepción de que se utilizaron proteínas marcadoras de arco iris y un procedimiento de anticuerpo marcado con oro (ambos de Amersham-Buchler, Braunschweig, Alemania Federal).

Ejemplo 8 Ensayo de colonia de precursores de eritroides humanos

Se prepararon suspensiones de células de médula ósea humana a partir de muestras de médula ósea en solución salina fisiológica tamponada con fosfato. Se cosecharon células de interfase purificadas por gradiente de la suspensiones tras la centrifugación a 2.200 revoluciones por minuto, durante 25 min a 12ºC. Las células se lavaron tres veces, se volvieron a suspender en medio MEM-alfa con suplementos y certomicina como antibiótico. El número de células se ajustó a 1,1 x 10^{6}/ml y las células se mezclaron con 4 ml de Medio de rhuEpo (19,1 ml de FCS / 15,2 ml de Transferrina / BSA / FeCl_{3} / 13,7 ml de medio MEM-alfa), y 0,7 ml de agar (aproximadamente a 70ºC). Se añadieron 200 \mul de la suspensión celular en agar por pocillo a placas de cultivo tisular de 24 pocillos, que contenían diluciones de las muestras de ensayo. Los cultivos se mezclaron con las muestras de ensayo y se incubaron durante 14 días a 37ºC en una atmósfera que contenía 7% de CO_{2} y 10% de O_{2}.

Ejemplo 9 Glicoanálisis

La liberación de PNGasa F de los N-glicanos de rhuEpo se llevó a cabo de la forma descrita por Nimtz^{7}. Las combinaciones de N-glicanos liberadas se midieron por cromatografía de intercambio aniónico de pH elevado con detección amperométrica pulsada (HPAE-PAD), utilizando el gradiente establecido y estándar optimizado "S" para glicanos sialilados anteriormente descritos^{22}. La carga Z de N-glicanos hipotética se determinó de la forma descrita por Hermentin^{23,24}. En pocas palabras, la carga hipotética de N-glicanos para las muestras de rhuEpo se obtuvo:

i): liberando la combinación de N-glicanos de la glicoproteína mediante PNGasa F;

ii): midiendo la combinación de N-glicanos por HPAE-PAD;

iii): calculando el porcentaje de las áreas (A) de los grupos de picos, separados por carga;

iv): multiplicando el % de área de los grupos de pico en la región neutra (asialo-, as), monosialo- (MS), disialo- (DiS), trisialo- (TriS), tetrasialo- (TetraS) y pentasialo (PentaS) por cero (asialo), 1 (MS), 2 (DiS), 3 (TriS), 4 (TetraS), y 5 (Sulfatado), respectivamente, y

v): resumiendo los productos respectivos.

De esta forma, Z se definió como la suma de los productos de las correspondientes áreas (A) en la región asialo (as), monosialo (MS), disialo (DiS), trisialo (TriS), tetrasialo (TetraS) y sulfatada, calculándose cada uno de ellos como el porcentaje del área de pico total establecido igual a 100%, y multiplicando cada uno de ellos por la carga correspondiente:

Z = A_{(as)} * 0 + 1 + A_{(DiS)} * 2 + A_{(TriS)} * 3 + A_{(TetraS)} * 4 + A_{(pentaS \ o \ sulfatada)} * 5.

vi): dividiendo Z por el número de sitios de glicosilación para crear Z*. Z* proporciona una estimación del número de cargas por sitio de N-glicosilación y, por lo tanto, del grado de carga de un sitio de glicosilación.

Los resultados del glicoanálisis de rhuEpo disponible hasta ahora en el comercio y de la rhuEpo según la invención (columna C4 y C5) se comparan en la Tabla II.

TABLA II Comparación de los perfiles de glicosilación de diferentes eritropoyetinas humanas recombinantes

2

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3

a) calculado a partir de Hokke^{25}

b) calculado a partir de Watson^{26}

c) promedio de 4 lotes diferentes; 1 ciclo de HPAE-PAD cada uno;

d) calculado a partir de Nimtz^{7}

Z* número de carga total de N-glicanos / número de sitios de glicosilación.

n.d. no determinado

El análisis de carbohidratos de rhuEpo, originalmente descrito por Sasaki et al.^{1} y Takeuchi^{27} para rhuEpo (CHO), y por Tsuda^{28} para rhuEpo (BHK), se ha extendido recientemente mediante los estudios de Hokke^{25}, Watson^{26} (para rhuEpo de CHO) y Nimtz^{7} (para rhuEpo de BHK). De acuerdo con un nuevo método, la carga Z hipotética de N-glicanos se puede determinar según la descripción de Hermentin^{23,24}. Se ha demostrado que este parámetro proporciona una excelente estimación de la cantidad de N-glicanos sub-sialilados con respecto a N-glicanos adecuadamente sialilados. Dado que se sabe que los glicanos de rhuEpo están formados principalmente por estructuras tetra-antenarias con 0-3 repeticiones LacNAc, Z debería ascender a un número hipotético de carga de N-glicanos entre 300 y 400. De hecho, la carga de N-glicanos de rhuEpo de CHO (Boehringer Mannheim) se ha determinado como Z = 364 +/- 2 (CV = 0,6%) (n=6; tres experimentos diferentes con 2 ciclos de HPAE-PAD cada uno), y la carga de N-glicanos de rhuEpo de BHK (Merckle) se ha determinado como Z = 323 +/- 2 (CV = 0,7%) (n=4; cuatro lotes diferentes; 4 experimentos diferentes; 1 ciclo de HPAE-PAD cada uno); véase la Tabla II^{24}. De esta forma, el valor Z más reducido de rhuEpo de BHK de Merckle reflejó claramente la mayor cuota de N-glicanos sub-sialilados: 34% de los N-glicanos mostraron la ausencia de un residuo de ácido siálico terminal y 12% de los N-glicanos mostraron la ausencia de los dos residuos citados; las estructuras consistieron en 40.9% de estructuras tetrasialiladas, 35,0% de estructuras trisialiladas y 21,1% de estructuras disialiladas (Nimtz^{7}). Estos datos de la bibliografía permitieron calcular la carga de N-glicanos como Z = 311, que concuerda perfectamente (desviación <4%) con la carga de N-glicanos determinada según la Ec.1 anterior, es decir, Z = 323, usando la misma rhuEpo (BHK) de Merckle (véase la Tabla II). En rhuEpo de CHO de Amgen, las principales estructuras (>95%) di-, tri- y tetra-antenarias estuvieron completamente sialiladas^{26}. Esta separación según la carga de los N-glicanos liberados por PNGasa-F (utilizando una columna DEAE rellena con Glycopak) permitió calcular la carga de N-glicanos como Z = 367, que concuerda de manera excelente con la carga de glicanos de rhuEpo (CHO) de Boehringer Mannheim), usada en este estudio (Z = 364, véase la Tabla II). Por el contrario, el estudio de Hokke et al.^{25}, que investigaron rhuEpo de CHO de Organon Teknika, demostró que 18-20% de los N-glicanos mostraban la ausencia de uno de los residuos de ácido siálico y 3% de los N-glicanos mostraban la ausencia de los dos residuos citados. Su análisis estructural permitió calcular la carga de N-glicanos como Z = 286, que es significativamente menor que la rhuEpo de CHO de Amgen (Z = 367) o Boehringer (Z = 364); véase la Tabla II)^{24}.

Bibliografía

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23. Documento J09705490

24. Hermentin, Glycobiology 6 (1996)

25. Hokke, Eur. J. Biochem. 228 (1995), 981

26. Watson, Glycobiology 4 (1994), 227

27. Takeuchi, J. Biol. Chem. 263 (1988), 3657

28. Tsuda, Biochemistry 27 (1988), 5646

29. Documento EP-A 0.411.678

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Hoechst Marion Roussel Alemania GMBH

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(B): CALLE: -

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(C): CIUDAD: Frankfurt

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(D): ESTADO: -

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(E): PAÍS: Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 65926

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(G): TELÉFONO: 069-305-3005

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(H): TELEFAX: 069-35-7175

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(I): TÉLEX: -

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Eritropoyetina humana recombinante con un perfil ventajoso de glicosilación

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): FORMA INFORMÁTICA:

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(A): TIPO MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Versión # 1.30 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 166 aminoácidos

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(B): TIPO: Aminoácido

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(C): NÚMERO DE CADENAS: Sencillo

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: Péptido

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(iii): HIPOTÉTICA: No

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(iv): ANTI-SENTIDO: No

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

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4

40

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(2)INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID NO: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 166 aminoácidos

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(B): TIPO: Aminoácido

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(C): NÚMERO DE CADENAS: Sencillo

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(D): TOPOLOGÍA; Lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: Péptido

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(iii): HIPOTÉTICA: Sí

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(iv): ANTI-SENTIDO: No

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

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5

Claims

1. Un polipéptido que tiene la conformación estructural primaria de eritropoyetina, siendo dicho polipéptido el producto de la expresión eucariota de una secuencia de ADN exógena, usando el sistema de expresión BPV-1 y que tiene las siguientes propiedades físico-químicas:

(i): la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos que se ofrece en SEC ID NO: 2;

(ii): está glicosilado;

(iii): más de 5% de las estructuras de N-glicanos están sulfatadas; y

(iv): la relación Z* de la carga Z total de N-glicanos al número de sitios de N-glicosilación es mayor que 170.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que Z* es mayor que 180.

3. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que Z* es mayor que 190.

4. Una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, unida de forma operativa a elementos de regulación del Papilomavirus bovino-1 (BPV-1), que permite la expresión de dicho ADN en una célula hospedadora eucariota.

5. La secuencia de ADN de la reivindicación 4, que comprende, adicionalmente, elementos de regulación del gen de la metalo-tioneína 1 (MT-1).

6. Un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 4 ó 5.

7. Una célula hospedadora eucariota que comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 4 ó 5, o el vector de la reivindicación 6.

8. La célula hospedadora de la reivindicación 7, que es una célula CHO.

9. Un método para la producción de un polipéptido según se le ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicho método cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 8 y, opcionalmente, aislar dicho polipéptido del cultivo.