NO323104B1

NO323104B1 - Analoger av humant erytropoietin, DNA-sekvenser som koder for disse, eukaryot vertscelle transfektert med DNA-sekvensene, preparat som omfatter analogene, anvendelse av analogene til okning av hematokritt, og fremgangsmate for fremstilling av analogene.

Info

Publication number: NO323104B1
Application number: NO19951445A
Authority: NO
Inventors: Steven G Elliott; Thomas E Byrne
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1995-04-12
Publication date: 2007-01-02
Also published as: ATE155796T1; LU90850I2; CN1105030A; WO1995005465A1; HK1001589A1; IL110669A0; EP0640619B2; JP2004331671A; LV10972A; NO2007008I2; JPH11155584A; LV10972B; SK282003B6; HU9501435D0; KR100328769B1; CZ91795A3; NZ273134A; NO2007008I1; RU95115239A; CA2147124C

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører erytropoietinanaloger med minst ett tilleggssete for glykosylering eller en omordning av minst ett glykosyleringssete. Oppfinnelsen ved-rører også DNA-sekvenser som koder for erytropoietinanalogene, vertsceller for analog ekspresjon, preparat av og anvendelse av analogene, samt fremgangsmåte for fremstilling av analogene.

Oppfinnelsens bakgrunn

Erytropoietin (EPO) er et glykoproteinhormon som er involvert i modningen av erytroidforløperceller til erytrocyt-ter. Det er av avgjørende betydning for regulering av nivåer av røde blodlegemer i omløp. Naturlig forekommende erytropoietin produseres av leveren under fosterlivet og av nyrene hos voksne og er i omløp i blodet og stimulerer produksjonen av røde blodlegemer i benmarg. Anemi er nesten uten unntak en følge av nyresvikt på grunn av nedsatt produksjon av erytropoietin fra nyren. Rekombinant erytropoietin fremstilt ved hjelp av genspleisingsteknikker som omfatter ekspresjon av et proteinprodukt fra en vertscelle transformert med genet som koder for erytropoietin, er blitt funnet å være effektivt når det anvendes ved behandlingen av anemi som skriver seg fra kronisk nyresvikt.

Lave nivåer av erytropoietin er normalt til stede i menneskeurin, mens individer som lider av aplastisk anemi, oppviser forhøyede nivåer av urinerytropoietin. Ved rensingen av humant urinerytropoietin ifølge Miyake et al. i J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977), ble det som utgangsmateriale anvendt urin fra individer med aplastisk anemi. Hittil er imidlertid urinerytropoietin ikke blitt påvist å være terapeutisk anvend-bart .

Identifikasjonen, kloningen og ekspresjonen av gener som koder for erytropoietin, er beskrevet i US patentskrift nr. 4 703 008. En beskrivelse av en fremgangsmåte for rensing av rekombinant erytropoietin fra cellemedium er tatt med i US patentskrift nr. 4 667 016. Ekspresjonen og utvinningen av biologisk aktivt, rekombinant erytropoietin fra pattedyrcel-leverter som inneholder erytropoietingenet på rekombinante plasmider, har for første gang gjort mengder av erytropoietin som er egnet for terapeutiske anvendelser, tilgjengelige. I tillegg har kunnskap om gensekvensen og tilgjengeligheten av store mengder av renset protein ført til en bedre forståelse av virkningsmåten til dette proteinet.

Mange celleoverflateproteiner og sekretoriske proteiner fremstilt ved hjelp av eukaryote celler, er modifisert med én eller flere oligosakkaridgrupper. Denne modifikasjonen, henvist til som glykosylering, kan påvirke de fysiske egen-skapene til proteiner dramatisk og kan også være viktig for proteinstabilitet, -sekresjon og subcellulær lokalisering av protein. Korrekt glykosylering kan være av avgjørende betydning for biologisk aktivitet. I virkeligheten gir noen gener fra eukaryote organismer, når de uttrykkes i bakterier (f.eks. E. coli) som mangler cellulære prosesser for glykosylerings-proteiner, proteiner som utvinnes med liten eller ingen aktivitet på grunn av deres mangel på glykosylering.

Glykosylering inntrer på bestemte steder på polypep-tidryggraden og er vanligvis av to typer: O-bundne oligosakkarider er festet til serin- eller treoninrester, mens N-bundne oligosakkarider er bundet til asparaginrester når de er en del av sekvensen Asn-X-Ser/Thr, hvor X kan være hvilken som helst aminosyre, bortsett fra prolin. Strukturene til N-bundne og O-bundne oligosakkarider og sukkerrestene som finnes i hver type, er forskjellige. Én type sukker som vanligvis finnes på begge, er N-acetylneuraminsyre (heretter henvist til som sialinsyre). Sialinsyre er vanligvis enderesten til både N-bundne og O-bundne oligosakkarider og kan gi sure egenskaper til glykoproteinet på grunn av dens negative ladning.

Både humant, urinavledet erytropoietin og rekombinant erytropoietin (uttrykt i pattedyrceller) med aminosyresekvensen 1-165 fra humant erytropoietin inneholder tre N-bundne oligosakkaridkjeder og én O-bundet oligosakkaridkjede som til sammen omfatter ca. 40% av den totale molekylvekt til glykoproteinet. N-bundet glykosylering inntrer i asparaginrester som befinner seg i 24-, 38- og 83-stillingene, mens O-bundet glykosylering inntrer i en serinrest som befinner seg i 126-stilling (Lai et al., J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al., Arch. Biochera. Biophys. 265, 329 (1988)). Oligo-sakJcaridkjedene er blitt påvist å være modifisert med ende-sialinsyrerester. Enzymatisk behandling av glykosylert erytropoietin for å fjerne alle sialinsyrerester resulterer i et tap av aktivitet in vivo, men påvirker ikke aktivitet in vitro (Lowry et al., Nature 185, 102 (1960); Goldwasser et al., J. Biol. Chem. 249, 4202 (1974)). Denne oppførsel er blitt for-klart med hurtig fjerning av asialoerytropoietin fra blodom-løpet etter interaksjon med det hepatiske asialoglykoprotein-bindende protein (Morrell et al., J. Biol. Chem. 243, 155

(1968); Briggs et al., Am. J. Physiol. 227, 1385 (1974); Ash-well et al., Methods Enzymol. 50, 287 (1978)). Erytropoietin har således biologisk aktivitet in vivo bare når det er sial-ylert for å unngå dets binding ved hjelp av det hepatiske bin-dingsprotein.

De andre komponentenes rolle i oligosakkaridkjedene i erytropoietin er ikke godt definert. Det er blitt påvist at delvis deglykosylert erytropoietin har svært redusert aktivitet in vivo sammenlignet med den glykosylerte form, men har i behold aktivitet in vitro (Dordal et al., Endocrinology 116, 2293 (1985); Lin patent, supra) . I. en annen undersøkelse red-userer imidlertid fjerningen av N-bundne eller O-bundne oligo-sakkaridkj eder alene eller sammen med mutagenese av asparagin-eller serinrester som er glykosyleringsseter, klart aktivitet in vitro av det endrede erytropoietin som fremstilles i pattedyrceller (Dube et al., J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988)).

Glykoproteiner, slik som erytropoietin, kan skilles i forskjellige ladede former under anvendelse av slike teknikker som isoelektrisk fokusering (IEF). Flere parter har rapportert IEF-undersøkelser av urensede og delvis rensede erytropoietinpreparater (Lukowsky et al., J. Biochem. 50, 909 (1972); Shel-ton et al., Biochem. Med. 12, 45 (1975); Fuhr et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930 (1981)). Maksimalt ble tre eller fire fraksjoner med erytropoietinaktivitet skjelnet fra hverandre ved hjelp av IEF i disse undersøkelsene, og ingen ble karakterisert med hensyn til karbohydratinnhold. I tillegg ble det ikke gjort noen korrelasjon mellom de isoelektriske

punktene til fraksjonene og deres biologiske aktivitet.

Under rensingen av urinerytropoietin fra humanurin omtalt i Miyake et al., supra, ble det rapportert to erytro-poietinfraksjoner fra hydroksylapatittkromatografi med lik spesifikk aktivitet, betegnet II og HIA. En etterfølgende karbohydratanalyse av fraksjonene II og HIA avslørte at fraksjon II hadde et høyere gjennomsnittlig sialinsyreinnhold enn fraksjon HIA (Dordal et al., supra). Det er et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe atskilte og isolerte isoformer av erytropoietin med et bestemt sialinsyreinnhold og en bestemt biologisk aktivitet. Farmasøytiske preparater som inneholder slike molekyler, ville være terapeutisk gunstige.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører analoger av humanerytropoietin som omfatter en aminosyresekvens som omfatter minst ett ytterligere glykosyleringssete. Tilleggssetene for glykosylering kan resultere i et større antall karbohydratkjeder og høyere sialinsyreinnhold enn i humanerytropoietin. Erytropoietinanaloger som omfatter aminosyresekvenser som omfatter omordningen av minst ett glykosyleringssete, er også tilveiebrakt. Analoger som omfatter et tillegg på én eller flere aminosyrer til den karboksyterminale ende av erytropoietin hvor tillegget gir minst ett glykosyleringssete, er også omfattet. Oppfinnelsen omfatter videre DNA-sekvenser som koder for slike erytropoietinanaloger, vertsceller for analog ekspresjon, preparat av og anvendelse av analogene, samt fremgangsmåte for fremstilling av analogene.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser en analytisk, isoelektrisk fokuseringsgel for de separate, rekombinante erytropoietinisoformer. Gelfeltene 1-11 viser isoformer som varierer fra mindre sure (høyere pl) i felt 1 til mer sure (lavere pl) i felt 11. Renset, rekombinant erytropoietin som inneholder en blanding av isoformene 9-14, er også vist i feltene lengst til venstre og lengst til høyre i gelen. Figur 2 viser forholdet mellom antallet sialinsyrer pr. erytropoietinisoform og den spesifikke aktivitet in vivo for hver isoform uttrykt som enheter pr. mg erytropoietinpolypeptid. I figur 2A ble konsentrasjonen av hver erytropoietinisoform bestemt ved hjelp av Bradford-proteinanalysen; i 2B ble konsentrasjonen bestemt ved hjelp av absorbans ved 280 nm, i 2C ble konsentrasjonen bestemt ved hjelp av RIA. Figur 3 viser en analytisk, isoelektrisk fokuseringsgel med definerte blandinger av rekombinante erytropoietinisoformer fremstilt ved hjelp av anionbytterkromatografi under forskjellige betingelser. Gelfeltene 1-6 viser henholdsvis erytropoietinisoformer eluert i en vaskeoppløsning med høyt saltinnhold etter vasking av "Q-Sepharose"-kolonnen med hurtig gjennomstrømning med 150 mM eddiksyre, pH 4,7, 150 mM eddiksyre (ubufret), 200 mM eddiksyre, pH 4,7, 250 mM eddiksyre, pH 4,7, 300 mM eddiksyre, pH 4,7, eller 300 mM eddiksyre (ubufret). Renset, rekombinant erytropoietin som inneholder en blanding av isoformer som oppnådd ved å bruke fremgangsmåter beskrevet i eksempel 2 i Lai et al., supra, bortsett fra at "DEAE-Agarose"-kromatografi er erstattet av "Q-Sepharose"-kromatografi, er også vist i feltet lengst til venstre i gelen. Figur 4 viser separasjonen av erytropoietinisoformene 8-12 oppnådd ved å underkaste cellekondisjonert medium en kolonne av "Q-Sepharose" til en gradient med avtakende pH og økende ionestyrke. Aliquoter av liketallsfraksjoner fra fraksjon 2 til fraksjon 40 ble underkastet analytisk, isoelektrisk fokusering. Renset, rekombinant erytropoietin som inneholder en blanding av isoformer erholdt ved å bruke fremgangsmåter beskrevet i eksempel 2 i Lai et al., supra, bortsett fra at "DEAE-Agarose"-kromatografi er erstattet av "Q-Sepharose"-kromatografi, er også vist i feltet lengst til venstre i gelen. Figur 5 viser aminosyresekvensen til humanerytropoietin. Kvadrater angir asparaginrester hvori N-bundne kar-bohydrat kjeder er festet, og en stjerne angir serinresten modifisert med en O-bundet karbohydratkjede. Figurene 6A, 6B og 6C viser serien av kloningstrinn som ble brukt for å frembringe plasmider for konstruksjon og analyse av analoger av humanerytropoietin. Disse analogene har aminosyrer endret som vist i figur 5, noe som gir ytterligere glykosyleringsseter. Figur 7 viser en "Western blot"-analyse av COS-cellesupernatanter av humansekvenserytropoietin og angitte erytropoietinanaloger. Analogene [Asn<9>, Ser<11>] EPO, [Asn<69>] EPO, [Asn12<5>, Ser<127>] EPO og [Pro<124>, Thr<125>] EPO er konstruert som beskrevet eksempel 6. Ytterligere analoger [Pro125, Thr<127>] EPO og [Asn12<6>, Ser<128>] EPO som ikke inneholder ytterligere karbohydratkjeder, er vist for sammenligning. Figur 8 viser en "Western blot"-analyse av COS-cellesupernatanter av humansekvenserytropoietin og angitte erytropoietinanaloger etter behandling med N-glykanase. Analogene [Thr<125>] EPO og [Pro<124>, Thr125] EPO ble konstruert som beskrevet i eksempel 6. Analogene [Val<126>] EPO, [Pro124]EPO, [Pro<125>] EPO, <[>Thr<127>] EPO, [Pro<1>25, Ser<127>] EPO og [Thr<125>, Ser<127>] EPO er vist for sammenligning. Figur 9 viser en isoelektrisk fokuseringsgel med blandingene 2, 3 og 4 erholdt ved hjelp av "Q-Sepharose"- og C4-reversfasekromatografi av cellemedium som understøttet veksten av CHO-celler transfektert med erytropoietin-cDNA inneholdende [Thr<125>]-mutasjonen. Renset, rekombinant erytropoietin som inneholder en blanding av isoformer, ble erholdt ved å bruke fremgangsmåter beskrevet i eksempel 2 i Lai et al., supra, bortsett fra at "DEAE-Agarose"-kromatografi er erstattet av "Q-Sepharose"-kromatografi, som også vist i feltene til venstre og høyre i gelen. Figur 10 viser en "Western blot"-analyse av COS-cellesupernatanter av rekombinant humanerytropoietin (rHuEPO) og utvalgte analoger. Konstruksjonen av analogene er beskrevet i eksempel 6. Analogene N9, N14, N18, N19, N21, N24 og N39 har minst én ytterligere karbohydratkjede slik det ses av lavere gelmobilitet. Figur 11 viser en "Western blot"-analyse av COS-cellesupernatanter av rekombinant humanerytropoietin og EPO N14-analog under N-glykanasefordøyelse. Tidspunkter var 0, 4, 12 og 45 minutter, og etter fordøyelse over natten. Figur 12 viser en gel med isoelektrisk fokusering med

EPO Nl4-analogisoformpreparater. Den nedre isoformblanding inneholder EPO Nl4-analog med hovedsakelig 6-12 sialinsyrer pr. molekyl, den midtre isoformblanding inneholder analog N14 med hovedsakelig 10-15 sialinsyrer pr. molekyl, og den øvre isoformblanding inneholder EPO N14-analog med hovedsakelig 12-17 sialinsyrer pr. molekyl. Figur 13 viser farmakokinetikken til rekombinant humanerytropoietin, isolert isoform 14 og EPO N14-analog (isoformene 15-17) etter intravenøs injeksjon i rotter. Figur 14 viser en kald fortrengningsanalyse av <1>25I-merket, rekombinant humanerytropoietinbinding til erytropoietinreseptoren i nærvær av varierende mengder umerket rHuEPO, isolert isoform 14 eller EPO N14-analog. Figur 15 viser en musehematokritstudie hvor aktiviteten av EPO N14 øvre isoformblanding (0,036 og 0,0712 ug), isolert isoform 14 (0,036 og 0,0712 ug), EPO 177 nedre isoformblanding (0,0712 ug) og rHuEPO (0,071 ug) er sammenlignet.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer erytro-poietinisof ormer . De bestemte isoformene av erytropoietin oppnådd i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse og deres egenskaper, kan variere avhengig av kilden for utgangsmaterialet. For eksempel er isoformene fra urinavledet humanerytropoietin forskjellige fra isoformene av rekombinant erytropoietin. Ved en foretrukket utførelsesform vedrører oppfinnelsen en erytropoietinisoform med et bestemt antall (dvs. et bestemt antall høyere enn 0) sialinsyrer pr. erytropoietinmolekyl, hvor antallet er valgt fra gruppen bestående av 1-14. Antallet er fordelaktig 9, 10, 11, 12, 13 eller 14. Ved en annen utførelsesform er antallet høyere enn 14, fordelaktig 16-23.

Uttrykket "erytropoietinisoform" er her brukt for å henvise til erytropoietinpreparater med et eneste isoelektrisk punkt (pl) og som har den samme aminosyresekvens. Uttrykket "erytropoietin" omfatter, slik det her er brukt, naturlig forekommende erytropoietin, urinavledet humanerytropoietin samt ikke-naturlig forekommende polypeptider med en aminosyresekvens og glykosylering som er tilstrekkelig duplikativ til naturlig forekommende erytropoietin til at det foreligger biologiske egenskaper in vivo som forårsaker at benmargsceller øker produksjon av retikulocytter og røde blodlegemer.

Det er blitt funnet at klare isoformer av "rekombinant erytropoietin med aminosyresekvensen til urinavledet humanerytropoietin tilsvarer erytropoietinmolekyler med fra 1-14 sialinsyrer, og hver isoform som er til stede i renset, rekombinant erytropoietin, har en aktivitet in vivo som står i forhold til antallet sialinsyrer som isoformen har.

Ved en foretrukket utførelsesform er erytropoietin produktet av ekspresjonen av en eksogen DNA-sekvens som er blitt transfektert inn i en ikke-human eukaryot vertscelle, dvs. at erytropoietinet ved en foretrukket utførelsesform er "rekombinant erytropoietin". Rekombinant erytropoietin fremstilles fordelaktig i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i US patentskrift nr. 4 703 008. Rekombinant erytropoietin kan renses i henhold til de generelle fremgangsmåtene som er beskrevet i eksempel 2 i US patentskrift nr. 4 667 016, eller alternativt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2 i patentskriftet hvor ,'DEAE-Agarose"-kromatografi er erstattet av "Q-Sepharose"-kromatografi.

Erytropoietin renset i henhold til eksempel 2 i patentskriftet ovenfor, inneholder hovedsakelig seks isoformer når det analyseres ved hjelp av IEF. I tillegg er det blitt påvist minst én ytterligere isoform med høyere aciditet under anvendelse av de kromatografiske fremgangsmåtene som er beskrevet i eksempel 4. (Denne surere formen som migrerer ved

>14 sialinsyrer på en IEF-gel, kan inneholde ikke-sialinsyre-negative ladninger som vist ved noe av ladningens resistens overfor sialidasefordøyelse). Disse isoformene atskiller seg fra hverandre ved et sialinsyreinnhold. Som vist i eksemplene, er dette påvist ved å isolere ti av disse isoformene ved hjelp av preparativ IEF og bestemme sialinsyreinnholdet i fem av dem. Blant isoformene analysert med hensyn på sialinsyreinnhold, ble det funnet at de fem isoformene inneholdt enten 9, 10, 11, 12 eller 13 sialinsyrerester.

Det er et forhold mellom den relative spesifikke aktivitet av erytropoietin in vivo og antallet sialinsyrerester pr. erytropoietinmolekyl fra isoformene 5-11 (hver isoform er her betegnet ved hjelp av antallet sialinsyrer pr. erytropoietinmolekyl) . Isoformene 11-14 har omtrent den samme relative spesifikke aktivitet in vivo. Isoformene 5-14 ble analysert med hensyn på aktivitet in vivo ved hjelp av den ekshypoksiske, polycytemiske, biologiske analyse av mus, og mengden av hver isoform til stede bestemmes ved hjelp av Bradford proteinanalyse, absorbans ved 280 nm eller ved hjelp av radioimmunologisk analyse (RIA) for erytropoietin. RIA-bestemmelser (Egrie et al., Immunobiology 172, 213, (1986)), uttrykt som enheter/ml, er dividert med 212.770 enheter/mg erytropoietinpolypeptid, den gjennomsnittlige spesifikke aktivitet for renset erytropoietin bestemt ved hjelp av RIA, hvorved man får proteinkonsentrasjoner for isolerte isoformer eller isoformblandinger uttrykt som mg erytropoietinpolypeptid/ml. Som vist i eksemplene, øker de relative spesifikke aktiviteter in vivo trinnvis fra isoform 5 til isoform 11 (se tabell 2).

De spesifikke aktivitetene in vivo som det er henvist til her, er målinger av relative spesifikke aktiviteter in vivo og er ikke målinger av absolutte spesifikke aktiviteter in vivo. For formålene ved denne oppfinnelse anvendes de spesifikke aktivitetene bare for å sammenligne relative aktiviteter av isoformer som er blitt analysert ved anvendelse av den samme analyse, idet de samme betingelser inkludert den samme inerte standard, den samme type dyr, med den samme analyse av data brukt til å beregne spesifikk aktivitet, og den samme analyse for bestemmelse av proteininnhold, anvendes. Det er ikke ment at noen bestemt verdi for aktivitet in vivo rapportert for en isoform, utgjør en iboende eller absolutt verdi for den isoformen.

Oppfinnelsen gjelder dermed en analog av humant erytropoietin, kjennetegnet ved at den omfatter minst ett ytterligere sete for N-glykosylering på en asparaginrest på hvilken som helst av aminosyreposisjonene 30, 51, 57, 88, 89, 136 eller 138, og der minst én ytterligere N-bundet karbohydratkjede er bundet til en hvilken som helst av nevnte aminosyreposisj oner.

Oppfinnelsen gjelder også en analog av humant erytropoietin, kjennetegnet ved at den omfatter minst ett ytterligere sete for O-glykosylering på en serinrest eller treoninrest på aminosyreposisjonen 123, og der en ytterligere O-bundet karbohydratkjede er bundet til nevnte aminosyreposisjon.

Oppfinnelsen omfatter videre en analog av humant erytropoietin, kjennetegnet ved at den er valgt fra:

Oppfinnelsen omfatter også en analog av humant erytropoietin kjennetegnet ved at den omfatter Asn<30>Thr<32>Val<87>Asn<88>Thr<90>EPO.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en analog av humant erytropoietin, kjennetegnet ved at den omfatter et tillegg på én eller flere aminosyrer på karboksyterminalen til erytropoietin, der tillegget omfatter minst ett glykosyleringssete.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en analog av humant erytropoietin, kjennetegnet ved at den omfatter en delesjon av ett eller flere glykosyleringsseter i humant erytropoietin og en addisjon av et likt antall ikke-naturlig forekommende glykosyleringsseter, hvorved posisjonene til karbohydratkjedene blir endret.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer også preparater som omfatter to eller flere erytropoietinisoformer. Ved én utfør-elsesform omfatter preparatene en blanding av isoformer med mer enn et forutbestemt antall sialinsyrer pr. erytropoietinmolekyl, f.eks. mer enn 11 sialinsyrer pr. erytropoietinmolekyl, eller mer enn 12 sialinsyrer pr. molekyl, f.eks. en blanding av isoformene 12, 13 og 14. Ved en annen utførelses-form omfatter preparatene blandinger av isoformer med et forutbestemt antall sialinsyrer pr. erytropoietinmolekyl, f.eks. mindre enn 12, men mer enn 8 sialinsyrer pr. molekyl, som f.eks. i en blanding av isoformene 9, 10 og 11. Oppfinnelsen sørger også for preparater av erytropoietinisoformer hvor de relative mengdene av isoformene er like eller forskjellige. For eksempel vil en blanding av isoformene 9, 10 og 11 kunne ha isoformene til stede i mange forskjellige forhold, slik som 1:1:1, 2:3:1 eller 20:20:1.

Preparatene omfatter fordelaktig blandinger av mindre enn fire isoformer, f.eks. en blanding av isoformene 11, 12 og 13, eller en blanding av 12 og 14, eller en blanding av 7 og 13.

Oppfinnelsen gjelder dermed et preparat, kjennetegnet ved at det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en erytropoietinanalog ifølge oppfinnelsen sammen med et farma-søytisk akseptabelt fortynningsmiddel, adjuvans eller bærer.

For å fremstille blandinger av erytropoietinisoformer sørger denne oppfinnelsen også for fremgangsmåter for isolering av utvalgte erytropoietinisoformer samtidig. Disse fremgangsmåtene omfatter isolering av individuelle isoformer ved hjelp av slike teknikker som preparativ isoelektrisk fokusering, eller fremstilling av blandinger av isoformer som har et forutbestemt antall sialinsyrer pr. molekyl {f.eks. mer enn 11) ved hjelp av slike teknikker som ionebytterkromatografi eller kromatofokusering. Alle disse teknikkene har som grunn-lag separasjonen av proteiner etter ladning.

Generelt omfatter ionebytterkromatografi og kromatofokusering anvendelse av enten urenset humanerytropoietin (cellekondisjonerte medier) eller renset materiale på en kol-onneharpiks under betingelser som muliggjør binding av noen av eller alle erytropoietinisoformene til harpiksen. For urensede erytropoietinpreparater er det fordelaktig å tilføre proteinet til kolonnen ved ca. pH 7, mens det for rensede preparater kan tilføres til kolonnen ved pH 7 ned til ca. pH 4. Etter vasking av kolonnen med buffer ved ca. pH 4 elueres de erytropoietinisoformene som forblir bundet på ionebytterkolonnen, ved å øke pH-verdien og saltkonsentrasjonen av bufferen, eller ved å påføre en gradient av avtakende pH og økende ionestyrke ved ca. pH 4. For kromatofokusering elueres isoformene fra kolonnen ved hjelp av en gradient av avtakende pH, eller ved å vaske kolonnen med en høy konsentrasjon av salt.

Ved en foretrukket utførelsesform isoleres individuelle isoformer ved å bruke ionebytterkromatografi. Som et eksempel ble isoform 14 isolert under anvendelse av ionebytterkromatografi som beskrevet i eksempel 8.

Oppfinnelsen gjelder dermed en fremgangsmåte for fremstilling av en analog av humant erytropoietin, kjennetegnet ved at den omfatter å dyrke en pattedyrvertscelle som omfatter en DNA-sekvens som koder for en analog av humant erytropoietin ifølge oppfinnelsen, og isolere analogen som blir fremstilt på denne måten.

Også omfattet av oppfinnelsen er visse analoger av humanerytropoietin. Slik det her er brukt, henviser uttrykket "analog av humanerytropoietin" til erytropoietin med én eller flere endringer i aminosyresekvensen til humanerytropoietin som resulterer i en økning i antallet seter for sialinsyrefesting. Analoger frembringes ved hjelp av seterettet mutagenese med addisjoner, delesjoner eller utbyttinger av aminosyre-rester som øker eller endrer seter som er tilgjengelige for glykosylering. Slike analoger kan ha et større antall karbohydratkjeder enn humanerytropoietin.

Erytropoietinanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en aminosyresekvens som omfatter minst ett ytterligere glykosyleringssete. Analoger med sialinsyrenivåer som er høyere enn de som finnes i humanerytropoietin, frembringes ved å tilføye glykosyleringsseter som ikke forstyrrer sekundær- eller tertiærkonformasjonen som er påkrevet for biologisk aktivitet. Analogen av humanerytropoietin har fordelaktig 1, 2 eller 3 ytterligere seter for N-glykosylering eller O-glykosylering, noe som resulterer i tilføyelsen av 1, 2 eller 3 ytterligere N-bundne eller O-bundne karbohydratkjeder. For eksempel erstattes leucin i 69-stilling av asparagin for å få sekvensen Asn-Leu-Ser som tjener som et fjerde sete for N-glykosylering. En slik endring kan vanligvis tilveiebringe opptil fire ytterligere sialinsyrer pr. molekyl. Eksempler på endringer som frembringer ytterligere O-glykosyleringsseter, er alanin i 125-stilling til treonin og aniliner i 124- og 125-stillingene til henholdsvis prolin og treonin. Det kan konstrueres analoger som har én eller flere ytterligere N-bundne og O-bundne kjeder, f.eks. analogene NOI og N02 beskrevet i tabell 5. Som det vil forstås av fagfolk innen teknikken, omfatter foreliggende oppfinnelse mange andre analoger av humanerytropoietin som har ytterligere glykosyleringsseter.

Analoger med økte nivåer av karbohydratfesting i et glykosyleringssete er også omfattet av oppfinnelsen. Slike analoger omfatter vanligvis utbyttingen av én eller flere aminosyrer som ligger nært opp til et N-bundet eller O-bundet sete. Som et resultat av disse aminosyreendringene vil en større andel av erytropoietinpolypeptider ha en karbohydrat-modifikasjon. Glykosyleringssetene kan opptre naturlig eller være frembrakt ved mutasjon. For eksempel frembringer analog N13 ikke en ytterligere karbohydratkjede selv om et glykosyleringssete ble innført i 88-stilling. Analogene N14 og N18 som har henholdsvis serin- og valinrester byttet inn i 87-stilling, har imidlertid en ytterligere karbohydratkjede i 88-stilling .

Ved oppfinnelsen er det også tilveiebrakt analoger som har én eller flere aminosyrer som går ut fra erytro-poietinets karboksyende, og hvor karboksyendeforlengelsen gir minst ett ytterligere karbohydratsete. Ved én utførelsesform ble det konstruert en analog ved å fusjonere de 28 karboksy-endeaminosyrene i humant, koriont gonadotropin (HCG) til argininresten i 166-stilling i humant erytropoietin. HCG-karbok-syendefragmentet har fire seter for O-glykosylering (Kessler et al., J. Biol. Chem. 254, 7907 (1979)).

Tabellene 3, 4 og 5 angir erytropoietinanaloger som har ytterligere seter for N-bundne og/eller O-bundne karbohydratkjeder. Analogene har sekvensen Asn-X-Ser/Thr byttet inn i forskjellige stillinger i humanerytropoietinpolypeptidkjeden for å skape N-bundne seter eller for å få serin- eller treoninrester innført for å skape O-bundne seter.

Tabell 6 angir de analogene som tilfører minst én ytterligere N-bundet eller én ytterligere O-bundet karbohydratkjede, eller tilfører ytterligere N-bundne og O-bundne kjeder samtidig, slik det fremgår av migreringen av glykoproteinene på SDS-geler (eksempel 7). Som det kan forstås av tabellene 3-6, resulterer analoger med ett eller flere ytterligere seter for karbohydratfesting ikke nødvendigvis i erytropoietinmolekyler med ytterligere karbohydratkjeder. For eksempel resulterte utbytting av treoninrester i 123- og 125-stillingene i tilføyelsen av en O-bundet karbohydratkjede, mens utbytting av serin eller treonin i andre stillinger ikke resulterte i analoger med ytterligere O-bundne kjeder {se tabell 4). Utbytting av asparaginrester i stillingene 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 og 138 i humanerytropoietinaminosyresekvensen resulterte imidlertid i tilføyelsen av en N-bundet kjede i disse setene. Fusjonen av et HCG-polypeptidfragment til argininresten i 166-stilling i humanerytropoietin resulterte i et erytropoietin-HCG-fusjonsmolekyl med minst to ytterligere O-bundne karbohydratkjeder.

Erytropoietinanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også erytropoietin med en aminosyresekvens som omfatter en omordning av minst ett glykosyleringssete. En omordning av et glykosyleringssete henviser, slik det her er brukt, til delesjonen av ett eller flere glykosyleringsseter i humanerytropoietin og addisjonen av ett eller flere ikke-naturlig forekommende glykosyleringsseter. Analogene RI, R2 og R3 er eksempler på slike omordninger og ble konstruert ved delesjon av de N-bundne setene i henholdsvis 24-, 38- og 83-stillingen, og addisjonen av et N-bundet sete i 88-stilling. Et stort antall andre typer av karbohydratseteomordninger er imidlertid mulig, og de resulterende analoger kan, eller be-høver ikke, ha et større antall glykosyleringsseter sammenlignet med humanerytropoietin.

Analogene RI, R2 og R3 ble analysert med hensyn på biologisk aktivitet in vivo, og resultatene er vist i tabell 7. Innføringen av en N-bundet kjede i Asn 88 gjenopprettet biologisk aktivitet i erytropoietin med hvilket som helst av de tre naturlig forekommende N-bundne setene delert. Disse resultatene indikerer at stillingene til karbohydratkjedene i erytropoietin kan endres for å frembringe nyttige analoger uten i betydelig grad å påvirke den biologiske aktivitet.

Også omfattet av foreliggende oppfinnelse er DNA-sekvenser som koder for erytropoietinanaloger med ytterligere seter for N-bundne og/eller O-bundne kjeder, analoger med en omordning av minst ett festesete for en karbohydratkjede, og analoger med én eller flere aminosyrer som går ut fra karbok-syenden til erytropoietin. Fremgangsmåter anvendt for å inn-føre endringer i humanerytropoietin-DNA-sekvensen for det formål å skape og endre festeseter for karbohydrater, er beskrevet i eksempel 6.

Oppfinnelsen gjelder dermed en DNA-sekvens, kjennetegnet ved at den koder for en analog av et humant erytropoietin ifølge oppfinnelsen.

Disse erytropoietinanalogene kan være produktet av ekspresjon av en eksogen DNA-sekvens, dvs. fremstilt gjennom teknologi med rekombinant DNA, eller kan være syntetiserte produkter. En eksogen DNA-sekvens omfatter cDNA, genom-DNA eller kjemisk syntetisert DNA som koder for en erytropoietinanalog. Rekombinante DNA-plasmider og eukaryote vertsceller som kan anvendes for ekspresjonen av analogene, er også tilveiebrakt. Ekspresjonsvektorer omfatter enhver vektor som er i stand til å uttrykke klonede DNA-sekvenser i en eukaryot vertscelle, særlig de vektorene som brukes for ekspresjon i COS- og CHO-celler. Eksempler på slike vektorer omfatter plas-midene pED og pDECA beskrevet i eksempel 6 i beskrivelsen. Dyrkingen av COS- og CHO-vertceller som uttrykker erytropoietinanaloger, ble utført ved å bruke fremgangsmåter som er kjent for fagfolk innen teknikken.

Isolerte isoformer og blandinger av isofomer avledet fra erytropoietinanaloger, oppnås ved å bruke fremgangsmåtene beskrevet ovenfor for fremstilling av isoformer av humanerytropoietin. Disse fremgangsmåtene kan omfatte isoelektrisk fokusering, ionebytterkromatografi og kromatofokusering. Ionebytterkromatografi anvendes fortrinnsvis for å fremstille individuelle isoformer og blandinger av isoformer avledet fra erytropoietinanaloger.

Ved å øke antallet karbohydratkjeder på erytropoietin og derved antallet sialinsyrer pr. erytropoietinmolekyl, kan det fås fordelaktige egenskaper, slik som forøkt oppløselig-het, større resistens overfor proetolyse, redusert immunogeni-sitet, forøkt serumhalveringstid og forøkt biologisk aktivitet.

Kondisjonerte medier fra CHO-celler som uttrykker erytropoietinanaloger, ble analysert med hensyn på biologisk aktivitet in vivo, og resultatene er vist i tabell 6. Flere analoger som ble testet, hadde aktivitet som var tre ganger eller mer høyere enn aktiviteten av humanerytropoietin. Særlig oppviser analoger med en ytterligere N-bundet karbohydratkjede i enten 30- eller 88-stilling to til tre ganger høyere aktivitet enn humanerytropoietin, mens analoger med ytterligere 0-bundne kjeder som et resultat av fusjon av humanerytropoietin til HCG-polypeptidfragmentet, har minst to ganger høyere aktivitet .

To erytropoietinanaloger med ytterligere karbohydratkjeder ble renset, og isoformblandinger med forskjellig sialinsyreinnhold ble isolert (eksempel 8). Thr125 og Ser<87>Asn88Thr<90-> (EPO N14) analoger ble atskilt i tre separate isoformfraksjoner, og de biologiske aktivitetene in vivo for hver av fraksjonene ble bestemt. Resultatene presentert i tabell 8, viser at EPO N14-isoformfraksjoner med høyere sialinsyreinnhold har en større aktivitet in vivo.

En blanding av isoformer av EPO N14-analog med høyt sialinsyreinnhold og rekombinant humanerytropoietin (isoformene 9-14) ble undersøkt i reseptorbindingsanalyser, ved farmakokinetiske forsøk og forsøk på å bestemme økning i hematokrit hos mus. Resultater av disse analysene indikerer at det er et direkte forhold mellom sialinsyreinnhold, halveringstid og evne til å øke hematokriten hos behandlede mus. Som vist i figurene 13, 14 og 15, hadde således blandingen av EPO N14-isoform med høyt sialinsyreinnhold en signifikant lengre halveringstid in vivo og fremmet en større økning i hematokrit enn det som både isolert isoform 14 og rekombinant humanerytropoietin gjorde, selv om blandingen av N14-isoformen med høyt sialinsyreinnhold ikke ble bundet like sterkt til reseptoren.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen vedrører pattedyrvertsceller (f.eks. ovarie fra kinesisk hamster, CHO) som fortrinnsvis syntetiserer isoformer av humanerytropoietin eller erytropoietinanaloger med mer enn et bestemt antall sialinsyrer pr. molekyl, f.eks. mer enn 10 sialinsyrer pr. molekyl. Erytropoietinmolekyler har N-bundne og O-bundne oligosakkaridstrukturer som kan begrense sialinsyreinnholdet i molekylet. For eksempel gir tetraforgrenede (fire-forgrenede), N-bundne oligosakkarider vanligvis fire mulige seter for sialinsyrefesting, mens bi- og triforgrenede oligosakkaridkjeder som kan erstatte den tetraforgrenede form i asparagin-bundne seter, vanligvis har maksimalt bare to eller tre sialinsyrer festet. O-bundne oligosakkarider gir vanligvis to seter for sialinsyrefesting. Erytropoietinmolekyler kan således være behjelpelig med i alt 14 sialinsyrerester, forut-satt at alle tre N-bundne oligosakkarider er tetraforgrenede. Pattedyrcellekulturer screenes med hensyn på de cellene som fortrinnsvis tilfører tetraforgrenede kjeder til rekombinant erytropoietin, hvorved antallet seter for sialinsyrefesting maksimaliseres.

De N-bundne oligosakkaridene i urinerytropoietin inneholder sialinsyre både i en a-2,3- og en a-2,6-binding til galaktose (Takeuchi et al., J. Biol. Chem. 263, 3657 (1988)). Vanligvis adderes sialinsyren i a-2,3-bindingen til galaktose på mannose-a-1,6-grenen, og sialinsyren i a-2,6-bindingen adderes til galaktosen på mannose-a-1,3-grenen. Enzymene som adderer disse sialinsyrene ((l-galaktosid-a-2, 3-sialyltrans-ferase og p-galaktosid-a-2,6-sialyltransferase) , er mest ef-fektive for addering av sialinsyre til henholdsvis mannose-a-1,6- og mannose-a-1,3-grenene.

Ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO) som er fat-tige på dihydrofolatreduktase (DHFR), er en vanlig brukt vertscelle for fremstillingen av rekombinante glykoproteiner, inkludert rekombinant erytropoietin. Disse cellene uttrykker ikke enzymet (3-galaktosid-a-2,6-sialyltransferase og adderer derfor ikke sialinsyre i a-2,6-bindingen til N-bundne oligosakkarider i glykoproteiner fremstilt i disse cellene.

(Mutsaers et al., Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); Takeuchi et al., J. Chromatogr. 400, 207 (1987)). Rekombinant erytropoietin fremstilt i CHO-celler, mangler følgelig sialinsyre i 2,6-bindingen til galaktose (Sasaki et al. (1987), supra; Takeuchi et al. (1987), supra).

Oppfinnelsen gjelder slik en eukaryot vertscelle, kjennetegnet ved at den er transfektert med en DNA-sekvens som koder for en analog av et humant erytropoietin ifølge foreliggende oppfinnelse, på en måte som tillater vertscellen å uttrykke analogen.

Ved en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse fremstilles humanerytropoietin eller en erytropoietinanalog i CHO-celler som er transfektert med et funksjonelt (3-galaktosid-a-2,6-sialyltransferasegen, hvorved man får inkor-porering av sialinsyre i a-2,6-binding til galaktose. De resulterende isoformer vil inneholde sialinsyre med både a-2,3-og a-2,6-bindinger til galaktose. Se Lee et al., J. Biol. Chem. 264, 13848 (1989) for en beskrivelse av teknikker for å skape modifiserte CHO-celler eller andre pattedyrvertsceller.

Også omfattet av oppfinnelsen er farmasøytiske preparater som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en bestemt isoform eller blanding av isoformer sammen med et egnet fortynningsmiddel, adjuvans og/eller en bærer, som kan anvendes i erytropoietinterapi. Farmasøytiske preparater som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en erytropoietinanalog sammen med et egnet fortynningsmiddel, adjuvans og/eller en egnet bærer, er også omfattet. En "terapeutisk effektiv mengde" henviser slik det her er brukt, til den mengden som gir terapeutisk effekt for en bestemt tilstand og en bestemt administreringsplan. Administreringen av isoformer av humanerytropoietin eller erytropoietinanaloger skjer fortrinnsvis via parenterale veier. Den bestemte vei som velges, vil av-henge av tilstanden som behandles. Administreringen av isoformer av humanerytropoietin eller erytropoietinanaloger gjøres fortrinnsvis som en del av en formulering som inneholder en egnet bærer, slik som humant serumalbumin, et egnet fortynningsmiddel, slik som en bufret, fysiologisk saltoppløs-ning, og/eller et egnet adjuvans. Den påkrevde dosering vil være i tilstrekkelige mengder til å øke hematokriten til pasi-enter og vil variere avhengig av alvorligheten av tilstanden som behandles, administreringsmetoden som anvendes, og lign-ende .

De følgende eksempler er gitt for mer fullstendig å illustrere oppfinnelsen, men skal ikke betraktes som begren-sende for omfanget derav. Erytropoietinstandarden som anvendes 1 de biologiske analysene in vivo brukt i eksemplene, er en rekombinant erytropoietinstandard som ble standardisert mot en delvis renset urinerytropoietinstandard. Således måles bare relative spesifikke aktiviteter in vivo. Også de spesifikke aktivitetene in vivo uttrykkes i "enheter/ml", "enheter/mg" og "enheter/A2eo", og ikke som "IU/ml", "IU/mg" og "IU/A2eo,,f ettersom den anvendte erytropoietinstandard ikke er blitt direkte korrelert til noen eksisterende internasjonal standard.

Eksempel 1: Isolering av rekombinante erytropoietinisoformer

Rekombinant erytropoietin fremstilles som beskrevet i Lin, supra. Rekombinant erytropoietin anvendt som utgangsmaterialer for den første og den tredje isoformisolering, renses i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2 i Lai et al., supra. Utgangsmaterialer for den andre og femte iso-formisoleringen renses i henhold til Lai et al., supra, under anvendelse av modifikasjonen med <n>Q-Sepharose"-kromatografi. Disse preparatene inneholder en blanding av isoformer av rekombinant erytropoietin med den samme aminosyresekvens som urinavledet humanerytropoietin, og inneholder hovedsakelig isoformene 9-14. Utgangsmaterialer for det fjerde isoformpreparatet er materialet som eluerer under vaskingen med 5 mM eddiksyre/1 mM glysin/6 M urea i anionbytterkolonnen i eksempel 2 i Lai et al. Denne fraksjonen inneholder isoformer med mindre enn eller lik 9 sialinsyrer og ble ytterligere renset ved hjelp av gelfiltreringskromatografi som beskrevet i eksempel 2 i Lai et al. før bruk i fremgangsmåten med preparativ, isoelektrisk fokusering. For det sjette isoformpreparatet ble det som utgangsmateriale anvendt et renset preparat av rekombinant erytropoietin med fra 4 til 13 sialinsyrerester. Dette materiale ble renset som ifølge eksempel 2 i Lai et al., bortsett fra en modifikasjon til ionebytterkolonnen (eluering av det rekombinante erytropoietin med en natriumkloridgradient ved pH 8,4 og utelatelse av vaskingen med eddiksyre/urea), noe som resulterer i at de fleste isoformene som er til stede i utgangsmaterialet, holdes tilbake.

Seks forskjellige fremstillinger av individuelle isoformer utføres ved hjelp av preparativ, isoelektrisk fokusering i et lag med granulert gel ("Ultrodex", LKB), hovedsakelig sorti ifølge LKB applikasjonsanmerkning 198. "Pharmalyte"

(Pharmacia) 2,5-5 amfolytter (Pharmacia) anvendes, og gellaget inneholder 5 M urea.

Ved den første fremstillingen tilføres omtrent 20 mg rekombinant erytropoietin i 6,8 ml 20 mM natriumsitrat/100 mM natriumklorid, pH 7,0, til gelen og fokuseres ved 8 watt i omtrent 16 timer. Etter isoelektrisk fokusering synliggjøres isoformbåndene i gelen ved hjelp av et papirkontakttrykk av gellaget. Trykket lages og fikseres så ved bløtlegging i fik-seroppløsning (40% metanol/10% eddiksyre/10% TCA/3,5% sulfo-salisylsyre) som ble byttet ut tre ganger (omtrent 10 minutter hver gang, romtemperatur), underkastes én utbytting (omtrent 10 minutter) med 40% metanol/10% eddiksyre {30-60°C), farget i 15 minutter ved 60°C i 0,125% Coomassie Blue R-250/40% metanol/10% eddiksyre, og så avfarget i 7,5% metanol/10% eddiksyre for å synliggjøre de atskilte isoformer. Området i det granul-erte gellag som inneholdt isoformene (ca. 50% av harpiksen), fjernes, vann tilsettes (ca. 16 ml), og oppslemmingen helles over i et kar med størrelse 14,0 x 62,2 cm og inndampes til ca. 40 g nettovekt. Dette preparatet fokuseres for andre gang, og et kontakttrykk av gellaget lages som tidligere. Den delen av gelen som inneholder hver av de seks isoformene som kunne skjelnes fra hverandre, fjernes fra gellaget.

For å eluere isoformene fra gelen tilsettes en opp-løsning inneholdende 10 mM Tris-HCl, pH 7,0/5 mM Chaps til hver isoform for å frembringe en oppslemming. Oppslemmingene plasseres i små kolonner og vaskes med Tris-Chaps-bufferen. Gjennomstrømningene samles opp og tilføres separat til små kolonner (åpen kolonnekonfigurasjon) inneholdende "Vydac C4" reversfaseharpiks ekvilibrert i 20% etanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kolonnene fremkalles trinnvis med 20% etanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 35% etanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0, og 65% etanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Fraksjonen som eluerer ved 65% etanol/10 mM Tris, fortynnes i forholdet 1:1 med 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, og underkastes konsentrering, og så endres bufferen til 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, under anvendelse av et "Centricon-10" (Amicon) mikrokonsentreringsapparat. Analytisk, isoelektrisk fokusering av dette preparatet utføres hovedsakelig som beskrevet i LKB teknisk anmerkning 250 under anvendelse av "Servalyte 3-5 ampholines" (Serva) i en polyakryl-amidgel som inneholder 5 M urea.

Ved en andre fremstilling tilføres omtrent 26 mg rekombinant erytropoietin i 6,5 ml avionisert vann til gelen, og det fokuseres ved 2,5 watt i 35 minutter og 10 watt i omtrent 17 timer. Båndene for det fokuserte protein som er syn-lige i gellaget, fjernes som 11 forskjellige blandinger. Hver blanding bringes til ca. 7,5 ml med avionisert vann, og 20 ml av hver av de resulterende blandingssupernatantene underkastes analytisk, isoelektrisk fokusering som beskrevet ovenfor. Til hver av blandingene tilsettes 5 ml 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, og oppslemmingene plasseres hver i små kolonner, og væskefasen får strømme igjennom. Harpiksen vaskes med omtrent tre volumer av 0,5 M Tris-HCl, pH 7, og skylleoppløsningen slås sammen med gjennomstrømningen. Eluantene konsentreres og bufferbyttes til 20 mM natriumsitrat/100 mM natriumklorid, pH 7,0, under anvendelse av Amicon engangsultrafiltreringsanordninger med en molekylvektgrenseverdi på 10.0000 dalton. De konsentrerte opp-løsninger (omtrent 0,5 ml) sendes så gjennom et celluloseace-tatfilter med 0,22 ug grenseverdi. Basert på analytisk, isoelektrisk fokusering, finner man at fem blandinger inneholder hovedsakelig enkeltisoformene 10, 11, 12, 13 og 14.

Ved en tredje fremstilling tilføres omtrent 30 mg rekombinant erytropoietin i 21,8 ml destillert vann til gelen, og det fokuseres ved 2 watt i 25 minutter, 10 watt i 20 timer og 15 watt i 15 minutter. Proteinbånd som tilsvarer de enkelte isoformene, observeres visuelt og fjernes fra gellaget. Destillert vann tilsettes til gelisolerte isoformer for å frembringe en oppslemming, og de resulterende supernatanter analyseres ved hjelp av analytisk, isoelektrisk fokusering. Et like stort volum med 1 M Tris-HCl, pH 7,2, tilsettes til hver oppslemming, suspensjonene plasseres i separate, små kolonner, og væskefasen får strømme gjennom kolonnen for å eluere isoformene. Hver gjennomstrømning konsentreres, og bufferen byttes til 20 mM natriumsitrat/100 mM natriumklorid, pH 7,0, under anvendelse av "Amicon" engangsultrafiltreringsanordninger med en molekylvektgrenseverdi på 10.000 dalton. En analytisk, isoelektrisk fokuseiringsgel avslørte at det ble oppnådd blandinger inneholdende hovedsakelig enkeltisoformene 9, 10, 11, 12, 13 og 14.

Ved en fjerde isoformfremstilling ble det som utgangsmateriale anvendt erytropoietin inneholdende isoformene 3-9 (fremstilt som beskrevet ovenfor). Før preparativ, isoelektrisk fokusering utført hovedsakelig som beskrevet for fremstillingene 1-3 ovenfor, ble amfolyttene ("Pharmalyte" 2,5-5) forfraksjonert i en "Rotofor" (Bio-Rad, Richmond, CA) isoelektrisk fokuseringscelle med væskefase, hvorved man fikk et amfolyttområde som var mer egnet for de lavere, isoelektriske punktene til utgangsmaterialet. Forfraksjoneringen ble utført ved å blande 6,7 ml "Pharmalyte" 2,5-5 med 15 g urea og tilsette renset vann for å bringe volumet til 50 ml. Denne blandingen ble fraksjonert i Rotoforen ved 10 watt, 1<*>C, i 5 1/2 time under anvendelse av 0,1 M fosforsyre og 0,1 M natriumhydroksid som henholdsvis anolytt og katolytt. Amfo-lyttfraksjonene med målte pH-verdier mellom 4,5 og omtrent 6 ble brukt ved den isoelektriske fokusering med flatt lag.

Amfolytter ble fjernet fra isoformene under anvendelse av "Centrieluter" (Amicon, Danvers, MA} og "Centricon"

(Amicon) med grenseverdi for molekylvekt på 10.000, under anvendelse av de følgende parametrer: 0,18 Tris-buffer, pH 8,8, 100 volt, 25-30 mA, i 3 timer. Isoformene ble så bufferbyttet over i 0,1 M natriumklorid ved gelfiltrering under anvendelse av "Sephadex" G-25 (Pharmacia). Analytisk, isoelektrisk fokus-

ering av de fem resulterende blandinger viste at de inneholdt isoformene 4, 5, 6, 7 og 8. Isoform 4 forflyttet seg som flere bånd, noe som indikerer at den kan ha gjennomgått en viss ned-brytning .

Fremstillingen av den femte isoform ble modifisert ved tilsetning av et forfokuseringstrinn til den isoelektriske fokuseringsfremgangsmåte med flatt lag. Ved denne modifikasjonen ble proteinet ikke tilsatt til blandingen av amfolytt, urea og gel før elektroforese, men ble tilsatt til det isoelektriske fokuseringsapparat etter frembringelse av pH-gradienten i gellaget. Etter forfokusering i 75 minutter (1500 volt-timer) ble avsnittet av gellaget fra 2,25 til 4,25 cm fra katoden fjernet, blandet med erytropoietinoppløs-ningen og igjen tilsatt til gellaget. Etter isoelektrisk fokusering ble isoformene 10, 11, 12, 13 og 14 eluert fra gellaget og separert fra amfolyttene ved ultrafiltrering under anvendelse av "Centricon-10"-apparater (Amicon).

Forfokuseringsmodifikasjonen ble gjennomført for å gjøre isoformpreparatenes ultrafiolette absorbanskarakteris-tika mer like karakteristikaene til det rekombinante utgangs-erytropoietin. Denne forbedringen i spektralkarakteristika kan ses i forholdet mellom absorbans ved 280 og 260 nm for de isolerte isoformene. Gjennomsnittsforholdet mellom absorbans ved 280 nm og den ved 260 nm (A280/A260) for isoformer fra fremstillingene 2 og 3 (ikke-forfokusert) er 1,36 ± 0,11, mens gjennomsnittsforholdet A280/A260 for fremstillingene 5 og 6 (forfokusert) er 1,68 ± 0,20. Når isoform nr. 14 holdes utenfor beregningen, er de gjennomsnittlige A28o/A26o-forhold 1,39 ± 0,11 og 1,74 ± 0,09 for henholdsvis fremstillingene 2 & 3 og 5 & 6. (Isoform 14 kan ha det mest atypiske spektrum fordi den er til stede i de minste mengdene og således er mer gjenstand for interferenser med sporforurensning av amfolyttkomponenter, eller fordi den er nærmest elektroden under den isoelektriske fokuseringsfremgangsmåte i flatt lag). Gjennomsnittsforholdet A280/A260 for rekombinant erytropoietin fremstilt i henhold til eksempel 2 i Lai et al. (modifisert som beskrevet tidligere ved å bruke "Q-Sepharose" som anionbytterharpiks), er 1,91 0,04.

Som beskrevet ovenfor, var utgangsmaterialet for isoformfremstilling nr. 6 et rekombinant erytropoietinpreparat inneholdende isoformene 4-13. Amfolyttene ble forfokusert i "Rotofor"-preparatet som ved den fjerde fremstilling. Amfo-lyttfraksjoner med målte pH-verdier mellom 3,7 og 4,8 ble brukt til den isoelektriske fokusering i flatt lag. Det flate laget ble forfokusert som i forsøk nr. 5, og isoformene 9, 10, 11, 12 og 13 ble erholdt etter ultrafiltrering ("Centricon-10") for å fjerne bæreramfolytter.

Eksempel 2: Sialinsyreinnhold i rekombinante erytropoietinisoformer

Isoformene isolert som beskrevet i eksempel 1 og erytropoietin renset i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i Lai et al., supra (blanding av isoformene 9 til 14), bufferbyttes i 0,10-0,15 M natriumklorid og analyseres med hensyn på sialinsyreinnhold ved en modifikasjon av fremgangsmåten til Jourdian et al., J. Biol. Chem. 246, 430 (1971). Sialinsyre-restene spaltes fra glykoproteinene ved hydrolyse med 0,35 M svovelsyre ved 80°C i 30 minutter, og oppløsningene nøytralis-eres med natriumhydroksid før analyse. For å beregne mengden av erytropoietinprotein som er til stede, utføres en Bradford proteinanalyse (Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) under anvendelse av rekombinant erytropoietin med aminosyresekvensen til humanerytropoietin som standard under anvendelse av ana-lysereagensene og mikrometodefremgangsmåten levert av Bio-Rad. Resultatene, uttrykt som mol sialinsyrer pr. mol erytropoietin, er vist i tabell 1. Isoformer betegnes i henhold til antallet sialinsyrer pr. molekyl og variere fra minst sur (isoform 9) til mest sur (isoform 13). Isoformene 9-13 er vist i genfeltene 6-10 i figur 1. Mengder av isoform 14 er utilstrek-kelige til å måle sialinsyreinnholdet nøyaktig. Sialinsyreinnholdet av denne isoformen utledes fra dens migrering på IEF-geler i forhold til andre isoformer. Sialinsyreinnholdet i isoformene 5-8 (fremstilling nr. 4) er ikke blitt målt, men utledes likeledes av deres migrering på IEF-geler.

Eksempel 3: Aktivitet av rekombinartte erytropoietinisoformer

Isoformene isolert som beskrevet i eksempel 1, analyseres ved hjelp av absorbans ved 280 nm, ved hjelp av Bradford proteinanalyse og ved hjelp av RIA for erytropoietin for å bestemme mengden av rekombinant erytropoietin som er til stede. Den biologiske analyse av ekshypoksiske, polycytemiske mus (Cotes et al., Nature 191, 1065 (1961)) anvendes for å bestemme den relative biologiske aktivitet in vivo. Kvantifis-ering av mengden av erytropoietin som er til stede, under anvendelse av en radioimmunologisk analyse for erytropoietin, ga resultater med høyere relativ spesifikk aktivitet in vivo for visse isoformer på grunn av en tilsynelatende redusert, immunologisk reaktivitet av isoformer som inneholder store mengder sialinsyre, noe som fører til en underestimering av erytropoietinkonsentrasjonen og således en overestimering av den relative spesifikke aktivitet in vivo for de fleste negative isoformene. Biologiske analysebestemmelser på mus, uttrykt som enheter/ml, divideres med de tilsvarende proteinkonsentrasjoner, hvorved man får spesifikke aktiviteter in vivo uttrykt som enheter/mg erytropoietinpolypeptid. Disse spesifikke aktivitetene er vist i tabell 2.

I tabell 2 er "n" antallet uavhengige isoformprepar-ater som bidrar til verdien for den spesifikke aktivitet. I de fleste tilfeller ble det utført flere analyser in vivo på hvert isoformpreparat. De samme in vivo-data bidrar til bereg-ningene av spesifikk aktivitet for alle tre kolonnene, enheter/mg erytropoietinpolypeptid ble bestemt ved hjelp av absorbansen ved 280 nm, fra styrker målt ved radioimmunologisk analyse, eller fra resultater av Bradford proteinanalyse. Renset, rekombinant erytropoietin som inneholder isoformene 9-14, ble brukt som standarden i Bradford-proteinanalysen. "n" kan være mindre for beregningen gjort under anvendelse av Bradford-proteinanalysen ettersom noen preparater ikke lenger var tilgjengelige på det tidspunktet Bradford-analysene ble ut-ført.

Erytropoietin renset i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i Lai et al., supra, og som inneholdt en blanding av isoformene 9-14, anvendes som en standard for RIA-ene og in vivo-analysene.

De relative, spesifikke aktiviteter uttrykt som enheter/mg erytropoietinpolypeptid, kan omdannes til enheter/A280 ved å multiplisere med 0,807 mg erytropoietinpolypeptid/A2so. Omdannelsesfaktoren utledes ved å multiplisere ekstinksjons-koeffisienten til erytropoietin (1,345 mg/A28o) med protein-innholdet i erytropoietinglykoproteinet (ca. 60 vekt%, Davis et al., Biochemistry 26, 2633 (1987)), hvorved man får mg erytropoietinpolypeptid/A2so (dvs. 1,345 mg erytropoietin/A2ao x 0,60 mg polypeptid/mg erytropoietin = 0,807 mg polypep-tid/A28o) • I tillegg kan spesifikke aktiviteter uttrykt som enheter/mg erytropoietinpolypeptid, multipliseres med faktoren 0,60 mg polypeptid/mg erytropoietinglykoprotein, hvorved man får spesifikke aktiviteter uttrykt som enheter/mg erytropoietinglykoprotein .

Dataene i tabell 2 er også presentert grafisk i figurene 2A, 2B og 2C. Disse dataene viser at den relative aktivitet in vivo av erytropoietin øker som funksjon av sialinsyreinnhold opptil isoform nr. 11. Isoformene 11-14 har hovedsakelig den samme relative bioaktivitet in vivo. (Dette er mest åpenbart når konsentrasjonen av isoform 14 uttrykkes under anvendelse av Bradford-analyseverdien. Bradford-verdien kan være mer nøyaktig for isoform 14 på grunn av de generelt lave verdier som ble oppnådd, og den resulterende vanskelighet ved bestemmelse av A28o og den svært påfallende, reduserte aktivitet i RIA-en for svært negative former, omtalt tidligere). Den større, relative, spesifikke aktivitet in vivo for erytropoietinisoformer med sialinsyre skyldes mest sannsynlig en mer langvarig halveringstid i blodomløpet for disse formene. Isoformene 9 og 13 ble merket med radioaktivt jod (125I) , og f jer-ningshastigheten i rotter ble bestemt. Halveringstiden i blod-omløpet var signifikant lenger for isoform 13 enn for isoform 9.

Eksempel 4: Utvelgelse av isoformblandinger av rekombinant erytropoietin ved hjelp av " Q- Sepharose"- kromatografi

Cellekondisjonerte medier fra fremstilling av rekombinant erytropoietin i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i Lin, supra, konsentreres og diafiltreres mot 10 mM Tris, pH 7,2. Proteinkonsentrasjon bestemmes ved hjelp av Bradford-mikroproteinanalysen under anvendelse av bovint serumalbumin som standard. 19,6 ml av oppløsningen inneholdende 40 mg totalprotein, gjøres 20 pM i CuS04, filtreres gjennom et filter med grenseverdi 0,45 uM og fylles på et 4 ml lagvolum (1,05 cm høyde x 2,2 cm diameter) kolonne pakket med "Q Sepharose Fast Flow" (Pharmacia) som er blitt ekvilibrert med 10 mM Tris, pH 6,8, til 7,0 ved 4°C. Etter prøvetilførsel vaskes kolonnen med to kolonnevolumer av den samme buffer. Kolonnestrømningshastigheten er ca. 1 ml/minutt. 6 separate kolonner oppstilles under anvendelse av denne fremgangsmåten for å velge ut definerte erytropoietinisoformblandinger.

Kolonner vaskes med 6 til 9 kolonnevolumer av en buffer med lav pH bestående av: kolonne nr. 1, 150 mM eddiksyre, 1 mM glysin, 20 uM CuS04, 6 M urea regulert til pH 4,7 med NaOH; kolonne nr. 2, 200 mM eddiksyre, 1 mM glysin, 20 uM CuS04, 6 M urea regulert til pH 4,7 med NaOH; kolonne nr. 3, 250 mM eddiksyre, 1 mM glysin, 20 uM CUSO4, 6 M urea regulert til pH 4,7 med NaOH; kolonne nr. 4, 300 mM eddiksyre, 1 mM glysin, 20 uM CuS04, 6 M urea regulert til pH 4,7 med NaOH; kolonne nr. 5, 150 mM eddiksyre, 1 mM glysin, 20 uM CuS04, 6 M urea; kolonne nr. 6, 300 mM eddiksyre, 1 mM glysin, 20 uM CuS04, 6 M urea. pH-verdien i kolonnene økes til omtrent pH 7 ved vasking av hver med 8 til 11 kolonnevolumer 10 mM Tris-HCl, 55 mM NaCl, 20 uM CuS04, pH 7. De definerte erytropoie-tinisof ormblandinger elueres fra kolonnene ved å vaske med 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 uM CuS04, pH 7,0.

De eluerte isoformblandinger fra hver kolonne konsentreres, og oppløsningsmidlet byttes i vann under anvendelse av en "Amicon Centricon-10" mikrokonsentrator. Resultatene av analytisk, isoelektrisk fokusering av disse konsentrerte blandinger er vist i figur 3. Gelfeltene 1-6 representerer definerte erytropoietinisoformblandinger eluert fra henholdsvis kolonnene 1-6. "Isoformblandingen" vist i gelfeltet lengst til høyre i figur 3, utgjør cellemedium som påføres en "Q-Sepharose"-kolonne som beskrevet ovenfor, kolonnen vaskes med 5 mM eddiksyre, 1 mM glysin, 20 uM CuS04, 6 M urea og erytropoie-tinisoformblandingen elueres fra kolonnen under anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor. Denne eluerte blanding av isoformer renses videre i henhold til fremgangsmåter beskrevet i Lai et al., supra, før analytisk, isoelektrisk fokusering.

Eksempel 5: Fraksjonering av rekombinante erytropoietinisoformer under anvendelse av en lav pH- gradient på " Q- Sepharose"

Ved en annen fremgangsmåte separeres erytropoietinisoformer ved å bruke en gradient av økende pH og økende ionestyrke. Det konsentrerte, diafiltrerte, erytropoietinholdige medium fylles på en kolonne med "Q-Sepharose" ved et forhold på omtrent 4 0 mg totalprotein/ml gel. Kolonnen vaskes så med omtrent to kolonnevolumer 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 og så omtrent 10 kolonnevolumer 2 mM eddiksyre/1 mM glysin/20 uM CuS04/6 M urea (pH omtrent 4,8) for å fjerne forurensende proteiner og erytropoietinisoformer som inneholder mindre enn omtrent 7 sialinsyrerester. Isoformer inneholdende fra omtrent 8 til omtrent 12 sialinsyrer, elueres fra kolonnen under anvendelse av en gradient som starter ved omtrent 2 mM eddiksyre i 6 M urea/l mM glysin/20 uM CuS04 og løper til 40 mM eddiksyre/6 M urea/l mM glysin/20 uM CuS04 (pH omtrent 4). Totalvolumet av gradienten er omtrent 40 kolonnevolumer, og fraksjoner å omtrent ett kolonnevolum hver samles opp i beholdere som inneholder et volum av Tris-buffer som er tilstrekkelig til å bringe til området 6-8,5 for å unngå langvarig eksponering av de oppsamlede fraksjoner mot lav pH. Aliquoter av fraksjonene underkastes analytisk, isoelektrisk fokusering for å overvåke separasjonen. Figur 4 viser separasjonen av isoformene 8-11 som kan oppnås ved hjelp av denne fremgangsmåten. Isoformene 12-14 som forblir bundet til kolonnen ved slutten av gradienten, elueres ved å vaske med en buffer bestående av 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 mM CuS04 (pH 7,0). Isoformene (separert i løpet av gradienten eller eluert ved hjelp av natrium-kloridoppløsningen) befris for forurensende proteiner ved hjelp av reversfasekromatografi etterfulgt av gelfiltreringskromatografi som beskrevet i eksempel 2 i Lai et al.

Eksempel 6: Konstruksjon av humanerytropoietinanaloqer

Lokaliseringene av eksisterende karbohydratfesteseter i humanerytropoietinaminosyresekvensen er vist i figur 5 (sekvensidentitet nr. 26). Fremgangsmåter for frembringelse av ytterligere glykosyleringsseter for erytropoietin er oppsummert i figurene 6A-C og beskrevet nedenunder.

De følgende oligonukleotidprimere ble syntetisert for anvendelse ved mutagenese in vitro:

De understrekede kodoner viser de umake regioner hvor aminosyrene angitt i hakeparenteser, erstatter villtypeamino-syrene.

[Asn<4>, Ser<6>] EPO ble konstruert for å addere et N-glykosyleringssete i Asn 4. [Asn<9>, Ser11] EPO ble konstruert for å addere et N-glykosyleringssete i Asn 9. [Asn<69>] ble konstruert for å addere et N-glykosyleringssete i Asn 69. [Asn<125>, Ser<127>] EPO ble konstruert for å addere et N-glykosyleringssete i Asn 125. [Thr125] EPO og [Pro124, Thr125]EPO ble konstruert for å addere et O-glykosyleringssete i Thr 125.

Ved å starte fra [Pro124, Thr125] anvendes oligonukleo-tidprimeren 5' AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3' (sekvensidentitet nr. 16) til å frembringe [Pro1<24>, Thr12<5>, Thr12<6>] EPO. Oligonuk-leotidprimeren 5'TGCTCCACTC ACAACAATCACTG 3' (sekvensidentitet nr. 17) brukes så til å frembringe [Pro124, Thr<125>, Thr126, Thr<131>]

EPO.

[Asn<69>, Thr<71>] EPO og [Ser<68>, Asn<69>, Thr<71>] EPO konstrueres for å addere et N-glykosyleringssete i Asn 69 og for å øke N-glykosylering på det stedet. [Asn12<5>, Thr12<7>] EPO, [Asn<125>, Thr<127>, Thr<131>] EPO, [Pro124, Asn125, Ser127] EPO og [Pro124, Asn<125>, Thr<127>] EPO konstrueres for å addere et N-glykosyleringssete i Asn 125 og for å øke glykosylering på det stedet. [Thr<125>, Thr<126>] EPO og [Pro124, Thr125, Thr126, Ser131] EPO konstrueres for å addere et O-glykosyleringssete i Thr 125 og for å øke glykosylering på det stedet.

Kilden for erytropoietin-DNA for mutagenese in vitro var plasmid Hul3, en humanerytropoietin-cDNA-klon i pUC 8 (Law et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 83, 6920 (1986)). Plasmid-DNA avledet fra Hul3, ble fordøyd med BstEII- og Bglll-restrik-sjonsenzymer, de resulterende DNA-fragmenter ble underkastet agarosegelelektroforese, og det 810 basepar (bp) store erytropoietin-DNA- fragment ble isolert fra gelen under anvendelse av et "GeneClean"-sett og fremgangsmåter tilveiebrakt av produsenten (BIO 101, Inc.). Plasmid pBRgHuEPO inneholder erytro-poietingenomgenet som et BamHI-fragment innføyd i et derivat av pBR322, som beskrevet i det ovennevnte patent. pBRgHuEPO ble også fordøyd med BstEII og Bglll, og det 6517 bp store vektorfragment ble utvunnet. Ligering av de to fragmentene resulterer i IGT1. For å konstruere pEC-1 ble pDSVL (beskrevet i det ovennevnte patent, og vist i figur 5B), fordøyd med BamHI, og det isolerte, 2,8 kilobase (kb) store BamHI-fragment fra IGT1 inneholdende erytropoietin-cDNA, ble ligert inn i det.

For å frembringe enkelttrådet DNA for mutagenese in vitro ble pEC-1 fordøyd med BamHI og Bglll, og det 820 bp store erytropoietin-cDNA-fragment ble isolert. Det ble ligert inn i BamHI-setet i ml3mpl8, hvorved man fikk ml3-EC-l. Enkelttrådet DNA ble utvunnet fra supernatanter av E. coli stamme RZ1032 infisert med ml3-EC-l som beskrevet av Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154, 367 (1987) og Messing, Methods in Enzymol. 101, 20 (1983). For mutagenese in vitro ble omtrent 1 ug enkelttrådet DNA og 0,2 pmol av én av de syntetiske primerne beskrevet ovenfor, blandet med 6 ul buffer (250 mM Tris, pH 7,8, 50 mM MgCl2 og 50 mM ditiotreitol). For annealering av primeren til templatet ble reaksjonsvolumet regulert til 10 ul vann, blandingen ble varmet opp til 65°C i 5 minutter og fikk så avkjøles til romtemperatur. For forlengelsesreaksjonen ble 2,5 ul av hver av dTTP, dATP, dGTP, dCTP og ATP (alle ved 10 uM) tilsatt, etterfulgt av 1 ul (1 enhet) E. coli-DNA-polymerase (Klenow-fragment) og 1 pl (1 enhet) T4-DNA-ligase. Blandingen ble så inkubert over natten ved 14°C og brukt til å transformere E. coli JM 109 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103 (1985)) som beskrevet (Messing, supra) .

For å identifisere mutantkloner ved hjelp av differ-ensiell hybridisering ble plakker på næringsagar overført til "Gene Screen"-filtere (New England Nuclear). Filtrene ble tørket under en varmelampe og så inkubert i 1 time i 6x SSC inneholdende 1% SDS ved 60°C. For hybridiseringen ble oligo-nukleotidprimeren ovenfor (8 pmol) endemerket med T4-polynukleotidkinase og y <32>P-merket ATP, og inkubert med filtrene over natten i 6x SSC, 0,5% SDS og 100 mg/ml laksesperma-DNA ved 37°C for [Asn<124>]-mutasjonen, 55°C for [Asn4, Ser6]-mutasjonen, 65°C for [Thr<125>]- og [Pro12<4>, Thr<125>]-mutasjonene, og 70°C for [Asn<9>, Ser<11>]- og [Asn<163>, Ser165]-mutas j onene. Den neste dag ble filtrene vasket tre ganger med 6x SSC ved romtemperatur og underkastet autoradiografi. Om nødvendig, ble filtrene så vasket med 6x SSC ved økende temperaturer inntil lite eller ingen hybridisering ble påvist på plakker med villtypeerytropoietin-cDNA-sekvensen. Kloner som ga positive hybridiseringssignaler under disse betingelsene, ble identifisert og på nytt transfektert inn i JM109 for å isolere en ren klon. Dideoksykjede-termineringssekvensanalyse indikerte at mutasjonene til asparagin-, serin-, treonin- og prolinrestene var til stede.

Dobbelttrådet ml3-EC-l-DNA-er som bærer [Asn<4>, Ser<6>]-, [Asn<9>, Ser<11>]-, [Asn<69>]-, [Asn124]-, [Asn125]-, [Ser<127>]-, [Asn16<3>, Ser165]-, [Thr125]- og [Pro<1>2<4>, Thr<125>]-endringene, ble utvunnet fra JM109-transfekterte celler ved hjelp av koke-metoden (Holmes et al., Anal. Biochem. 117, 193 (1981)). DNA-ene ble fordøyd med BstEII og XhoII, og de 810 bp store erytropoietin-DNA-fragmentene ble isolert. pEC-1 ble fordøyd med BstEII.etterfulgt av en partiell fordøyelse med Bglll, og 5<1->endene til de resulterende fragmenter defosforyleres med bakteriell, alkalisk fosfatase i 10 mM Tris, pH 8, ved 60°C i 60 minutter. Det 7 kb store vektorfragment som mangler det 810 bp store BstEII-BglII-fragment, ble isolert og ligert til erytropoietinfragmentene ovenfor. De resulterende plasmider (betegnet pEC-X, hvor X er det analoge nummeret) inneholder DNA som koder for erytropoietinanaloger med endrede aminosyre-rester i de angitte stillinger.

Alternativt ble det konstruert en analog av erytropoietin (pEC34) ved hjelp av mutagenese in vitro hvor amino-syrerestene 41-55 var fjernet. Dette resulterte i et mindre (775 bp) EPO inneholdende BstEII-BglII-fragment. Fragmentet ble innføyd i pECl som beskrevet ovenfor. For kloningsanaloger av erytropoietin ble pEC34 fordøyd med BstEII, delvis fordøyd med Bglll, defosforylert og vektoren isolert som beskrevet ovenfor. Det 7 kb store vektorfragment ble så ligert til erytropoietinfragmenter som beskrevet ovenfor. Kloning med pEC34 muliggjør lett skjelning mellom rekombinanter og enkle nyinnkoblinger. Nyinnkoblinger resulterer i et mindre BstEII-BglII-fragment enn analoger, og disse kan lett differensieres på agarosegeler.

Disse generelle fremgangsmåtene ble brukt til å konstruere erytropoietinanalogene vist i tabellene 3, 4 og 5. DNA-sekvensendringene for hver av analogene er vist; ellers hadde oligonukleotidprimerne som ble anvendt for mutagenese, sekvenser som er komplementære til sekvensene til humanerytropoietin.

Plasmider betegnet pDEC-X (hvor X er analognummeret) ble konstruert ved innføyelse av erytropoietin-cDNA i pDECA, som er et derivat av plasmid pDSa2. Ekspresjonsvektoren pDSa2 er generelt beskrevet i PCT-søknad nr. HO 90/14363. pDECA ble utvunnet fra pDSa2 ved hjelp av de følgende trinn: (1) HindiII-setet i pDSa2 ble delert ved fordøyelse av pDSa2-DNA med HindiII, behandling av de kohesive Hindlll-ender med E. coli-DNA-polymerase (Klenow-fragment) og dNTP-er, og religering av den buttendete vektor. Oet resulterende plasmid var pDSa2AH. (2) pDSa2AH ble fordøyd med Sali og et syntetisk oligonukleotid med et SV40-spleisesignal med en Sali-linker festet til 3'-enden av spleisesignalet, ble ligert til det.

Det syntetiske oligonukleotid hadde den følgende sekvens (sekvensidentitet nr. 18).

Det resulterende plasmid var pDSa2AH-spleising.

3) pDSa2AH-spleis ble fordøyd med Sali og gjort buttendet ved behandling av de kohesive endene med T4-DNA-polymerase og dNTP-er. Et 820 bp stort BamHI-Bglll humant erytropoietin-cDNA-fragment ble gjort buttendet ved hjelp av den samme

fremgangsmåte og ligert til plasmidet. Det resulterende plasmid var pDEC-1. 4) pDEC ble fordøyd med Kpnl og PvuII og gjort buttendet ved behandling av de kohesive ender med mangobønne-nuklease. Plasmidet ble religert for å delere det utskårede Kpnl-PvuII-fragment, noe som resulterte i plasmidet pDECA.

pDEC-X-plasmider ble laget fra pDECA ved komplett fordøyelse med BstEII etterfulgt av en delvis fordøyelse med Bglll. Vektorfragmentet som mangler erytropoietinkodende sekvenser, ble isolert og ligert til de 810 bp store BstEII-BglII-fragmenter inneholdende det ønskede plasmid.

Detaljer vedrørende konstruksjonen av noen analoger med multiple aminosyreendringer, er beskrevet nedenunder.

Konstruksjon av pDEC( N47) og pDEC( N48)

pDEC(N47) som inneholder asn30-, thr32-, val87-, asn88- og thr90-mutasjoner, ble konstruert fra pDEC(N18) og pDEC(N4). pDEC(N18) ble fordøyd med Hindll og Bglll, og et 445 bp stort fragment ble isolert. pDEC(N4) ble fordøyd med BstEII og Hindlll, og et 377 bp stort fragment ble isolert. Disse to fragmentene ble ligert inn i pDECA kuttet med BstEII og Bglll som beskrevet ovenfor, noe som resulterte i pDEC(N47).

pDEC(N48) som inneholder asn69-, thr71-, ser87-, asn88- og thr90-mutasjoner, ble konstruert fra pDEC(N14) og pDEC(Nll). pDEC(N14) ble fordøyd med Hindll og Bglll, og et 445 bp stort fragment ble isolert. pDEC(Nll) ble fordøyd med BstEII og Hindll, og et 377 bp stort fragment ble isolert. Disse to fragmentene ble ligert inn i pDECA kuttet med BstEII og Bglll som beskrevet ovenfor, noe som resulterte i pDEC(N48).

Konstruksjon av pDEC( 062) ( HCG- erytropoietinfusjon)

pDEC(062) ble satt sammen fra pECl, og en 107 basepar

stor syntetisk StuI-Bglll-DNA-linker inneholdende de karboksyterminale 28 aminosyrene fra humant, koriont gonadotropin (ser-ser-ser-ser-lys-ala-pro-pro-pro-ser-leu-pro-ser-pro-ser-arg-leu-pro-gly-pro-ser-asp-thr-pro-ile-leu-pro-gln) (sekvensidentitet nr. 25) (Pierce et al., Ann. Rev. Biochem. 50, 465 (1981)). Sekvensen til linkeren er som følger:

pECl ble fordøyd med Stul og Bglll, og det 610 bp store DNA-fragment ble isolert. Den syntetiske linker ble fos-forylert med ATP og polynukleotidkinase og ligert med pECl-fragmentet inn i pDECA før den ble fordøyd med BstEII og delvis fordøyd med Bglll som beskrevet ovenfor.

Konstruksjon av pDEC( NOl)

pDEC(NOl) ble satt sammen fra pDEC(062)(HCG-EPO) og pDEC(N14) (Ser87Asn88Thr90) . pDEC177 ble fordøyd med Stul og Bglll, og det 610 bp store DNA-fragment som inneholdt Ser<87>Asn88Thr<90->mutasjonene, ble isolert med "GeneClean". pDEC(062) ble fordøyd med Stul og Bglll, og det 107 basepar store fragment ble isolert. Disse to DNA-fragmentene ble ligert inn i pDECA som på forhånd var fordøyd med BstEII og delvis fordøyd med Bglll som beskrevet ovenfor.

Konstruksjon av pDEC( N02)

pDEC(N02) ble satt sammen fra pDEC(062)(HCG-EPO) og pDEC(N47) (Asn30Thr32Val87Asn88Thr90) . pDEC(N47) ble fordøyd med Stul og Bglll, og det 610 bp store DNA-fragment inneholdende Asn<30>Thr<32>Val<87>Asn<88>Thr<90->mutasjonene, ble isolert med

"GeneClean". pDEC(062) ble fordøyd med Stul og Bglll, og det 107 basepar store fragment ble isolert. Disse to DNA-fragmentene ble ligert inn i pDECA som på forhånd var fordøyd med BstEII og delvis fordøyd med Bglll, som beskrevet ovenfor.

Konstruksjon av pDEC( N16) ( Ser87Asn88Thr90Ala162)

pDEC(N16) ble satt sammen fra

pDEC(N14) (Ser<87>Asn<88>Thr<90>) og pDEC258 (Ala162) . pDEC258 ble konstruert ved å bruke fremgangsmåter for mutagenese in vitro som er beskrevet ovenfor, og endre AGG-kodonet til GCG i stilling 162. pDEC(N14) ble fordøyd med Stul og Bglll, og det 610 bp store DNA-f ragment inneholdende Ser87Asn88Thr90-mutas jonene, ble isolert med "GeneClean". pDEC258 ble fordøyd med Stul og Bglll, og et 210 basepar stort fragment ble isolert. Disse to DNA-fragmentene ble ligert inn i pDECA som på forhånd var for-døyd med BstEII, og delvis fordøyd med Bglll som beskrevet ovenfor.

Konstruksjon av pDEC( Rl), -( R2) og -( R3)

For å fjerne glykosyleringsseter fra pDEC(N14) ble ml3-EPO(N14) inneholdende ser87-, asn88- og thr90-mutasjoner, underkastet mutagenese in vitro som beskrevet ovenfor under anvendelse av de følgende primere:

De resulterende plasmider ble betegnet pDEC(Rl) (gin24ser<87 >asn<88> thr<90>) pDEC(R2) (gin38 ser<87> asn<88> thr<90>) og pDEC(R3) (gin<83 >ser<87> asn8<8> thr90) . ml3EC-l ble også underkastet mutagenese in vitro med de ovenfor nevnte oligonukleotidprimere, noe som resulterte i pECIO (gin<24>) og pEC8 (gin38) . pEC9 (gin<83>) ble konstruert under anvendelse av primeren

cDNA-kloner av humanerytropoietin og analoger svar-ende til [Asn<4>, Ser<6>]EPO, [Asn<9>, Ser11]EPO, [Asn<69>] EPO, [Asn<124>] EPO, [Asn<1>25, Ser<127>] EPO, [Asn163, Ser<165>] EPO, [Thr125] EPO og [Pro<124>, Thr<125>] EPO og cDNA-kloner av analoger beskrevet i tabellene 3, 4 og 5, ble overført i COS-l-celler (ATCC nr. CRL-1650) ved elektroporasjon. COS-l-celler ble innhøstet fra halvsammenflytende skåler, vasket med medium (Dulbeccos modifiserte, essensielle medium inneholdende 5% kalvefosterserum og 1% L-glutamin/penicillin/streptomycin (Irvine Scientific)) og på nytt oppslemmet ved 4 x IO<6> celler/ml. 1 ml celler ble overført til en elektroporasjonskyvette (Bio-Rad) og elektro-porert med en "Bio-Rad Gene Pulser" ved 25 ufarad og 1600 volt i nærvær av 100-200 ug bærer-DNA og 2-20 ug plasmid-DNA som koder for erytropoietinanalogen. De elektroporerte celler ble platet ut ved 2 x IO<6> celler pr. 60 mm vevskulturskål i 5 ml medium. 2 til 4 timer etter utplating ble mediet erstattet med 5 ml nytt medium. Det kondisjonerte medium ble samlet opp 3 til 5 dager etter elektroporasjon.

Eksempel 7: Karakterisering av erytropoietinanaloger

A. Bestemmelse av karbohydrataddisjon

Et volum supernatant inneholdende 5-20 enheter fra COS-celler transfektert med erytropoietinanalog-cDNA-er som beskrevet i eksempel 6, ble utfelt immunologisk over natten ved romtemperatur med polyklonalt kanin-antierytropoietin-antistoff. 20-80 ul 1:1 protein A-"Sepharose" i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) ble tilsatt til den immunologiske utfel-ling og fikk inkuberes i 1 time ved romtemperatur. Prøvene ble sentrifugert, vasket med PBS, og der det er angitt, ble pel-leten behandlet med N-glykanase for å fjerne N-bundne karbohydratkjeder. Prøvene ble analysert ved hjelp av 15% SDS-poly-akrylamidgelelektroforese, overført til nitrocellulose og underkastet Western-analyse som beskrevet (Burnette et al., Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981); Elliott et al., Gene 79, 167-180 (1989)) under anvendelse av en blanding av monoklonale muse-antierytropoietin-antistoffer. Ett slikt antistoff, 9G8A, er beskrevet i Elliott et al. (1989), Blood 74, Supp. 1, A. 1228.

Analyse av COS-cellesupernatanter transfektert med [Asn<69>] EPO- og [Asn125, Ser127] EPO-cDNA, avslørte forøkt pro-teinstørrelse sammenlignet med humansekvenserytropoietin. Denne forøkte størrelse er indikasjon på en ytterligere N-bundet karbohydratkjede (figur 7). Behandling av supernatanter fra COS-celler transfektert med [Thr<125>] EPO- og [Pro<1>24, Thr<125>] EPO-cDNA med N-glykanase avslørte en forøkt proteinstørrelse sammenlignet med humansekvenserytropoietin. Denne forøkte størrelse er indikasjon på en ytterligere O-bundet karbohydratkjede (figur 8). "Western blot"-analyse av andre utvalgte analoger er vist i figur 10.

For å bestemme antallet N-bundne karbohydratkjeder festet til EPO, ble det utført partielle N-glykanasefordøyel-ser. Analoger eller rHuEPO ble uttrykt i CHO-celler, og kondi-sjonert, serumfritt medium ble samlet opp. Rør inneholdt 40 enheter EPO (volum regulert til 15 pl med H20) . Til hvert rør ble det tilsatt 10 ul 0,5% SDS, og hver prøve ble kokt i 3 minutter. Så ble de følgende komponenter tilsatt: 10,8 pl 0,5 M NaP04, pH 8,6, 5 pl 7,5% nonidet P40 og 1,5 pl 250 enheter/ml N-glykanase (Genzyme). Prøver ble inkubert i de angitte tidsrom ved 37°C. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av SDS-PAGE-prøvebuffer (se ovenfor) og så underkastet SDS-PAGE-western-analyse (10% akrylamid) under anvendelse av et polyklonalt anti-EPO-antistoff og et anti-kanin-"Vectastain"-sett (Vector laboratories) med 4-klornaftol som substrat. En analyse av N-bundne kjeder under anvendelse av denne metoden er vist i figur 11 for humanerytropoietin og analog N14.

B. Analyser med hensyn på erytropoietinanalogaktivitet

RIA-er ble utført i henhold til Egrie et al., supra. EIA-er ble utført med "Clinigen" EIA-sett (R- og D-systemer) under anvendelse av fremgangsmåter fra produsenten. Den biologiske aktivitet in vivo av erytropoietinanaloger ble bestemt på supernatanter fra CHO-celler som uttrykker en erytropoietinanalog, eller på renset erytropoietin erholdt fra CHO-cellekondisjonert medium som beskrevet nedenunder under anvendelse av den ekshypoksiske, polycytemiske, biologiske museana-lyse (Cotes et al., supra).

Erytropoietinaktivitet in vitro ble bestemt ved hjelp av analysen med erytroidkolonidannelse som beskrevet av Iscove et al., J. Cell Physiol. 83, 309-320 (1974) med modifika-sjoner. De enkjernedannende celler fra humane benmargsceller ble delvis renset på en ficoll-paque-pute og vasket i Iscove-medium før utplating for å fjerne de adherente celler. Dyrk-ningsmediet inneholdt 0,9% metylcellulose og omfattet ikke noe bovint serumalbumin. Erytroidkoloniene ble bedømt etter 8 til 10 dager med dyrkning.

Erytropoietinanalogene transfektert og uttrykt i COS-celler som beskrevet i eksempel 6, ble analysert i urensede COS-cellesupernatanter under anvendelse av RIA, EIA og en analyse av erytroidkolonidannelse. Renset humansekvenserytropoietin har en aktivitet in vitro som var sammenlignbar med RIA-aktiviteten som bestemt ved hjelp av de ovenfor nevnte analyser. Analogene [Asn<69>] EPO, (Thr<125>) EPO og [Pro<1>24, Thr<125>] EPO oppviste en aktivitet in vitro som var sammenlignbar med RIA-aktiviteten og ga bevis på at de hadde ytterligere karbohydratkjeder (som bestemt i avsnitt A) . [Thr<125>] EPO og analogene N4, Nil, N14, N16, N18, N47, N48, 062, NOI og N02 ble analysert videre ved å transfektere en cDNA-klon som koder for erytropoietinanalogen, inn i CHO-celler, og underkaste CHO-cellesupernatantene RIA eller EIA og biologiske analyser in vivo. Resultatene er vist i tabell 6. Aktiviteter in vivo for analogene Ri, R2 og R3 uttrykt i CHO-cellesupernatanter, er vist i tabell 7. Forhold mellom aktivitet in vivo for RIA eller EIA ble bestemt som beskrevet i fotnote a i tabell 6.

C. Fremstilling av isoformblandinger avledet fra erytropoietinanaloger

f Thr125! EPO ( EPO 050)

Erytropoietinanalogen [Thr<125>] EPO ble konstruert som beskrevet i [avsnitt A] i eksempel 6. Et 810 bp stort erytropoietin-cDNA-fragment som bærer [Thr<125>]-mutasjonen, ble isolert ved spalting av plasmidet pEC inneholdende [Thr<125>]-muta-sjonen med BstEII og Bglll og ligering av fragmentet til pDECA, [et derivat av pDSa2] (beskrevet i eksempel 6).

Plasmid pDECA inneholdende [Thr125] -erytropoietin-cDNA, ble transfektert inn i DHFR-manglende CHO-celler. 770 ml CHO-cellekondisjonert medium ble konsentrert under anvendelse av en membran med 10.000 dalton molekylvektgrense og diafiltrert mot 10 mM Tris-HCl, pH 8,6, inntil et sluttvolum på 34 ml. En 17 ml stor aliguot av konsentratet ble fylt på en Q-"Sepharose"-kolonne med hurtig gjennomstrømning (5 ml lagvolum) ekvilibrert i den samme buffer og eluert med en lineær gradient på 0-250 mM NaCl i 10 mM Tris-HCl, pH 8,6. Aliquoter av kolonnefraksjoner, enten ubehandlede eller fordøyd med N-glykanase, ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE eller IEF, og blandinger (betegnet 2, 3 og 4) ble laget basert på isoformen og/eller karbohydratsammensetningen av fraksjonene. Hver blanding ble fylt på en "Vydac C4"-kolonne (214TPB 2030; 1 cm i diameter; 1,8-2,5 ml lagvolum; 0,34 ml/min.) og vasket med to kolonnevolumer 20% etanol i 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kolonnene ble eluert med lineære gradienter av 20-94% etanol, 10 mM Tris, pH 7,0. Blandinger ble laget, fortynnet i 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, og fylt på Q-"Sepharose"-kolonner med hurtig gjennomstrømning. Etter en vasking i 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, ble prøvene eluert med 20 mM natriumsitrat, 250 mM NaCl, pH 7,0. De rensede blandinger [Thr<125>] ble analysert ved hjelp av IEF og er vist i figur 9. Disse blandingene ble også analysert med hensyn på biologisk aktivitet in vivo som beskrevet ovenfor (Cotes et al., supra), og resultatene er vist i tabell 8.

Ser<87>Asn88Thr<90> EPO ( EPO N14)

Fremstilling 1

EP0-N14-analogen ble renset ved å bruke en tretrinns-fremgangsmåte bestående av ionebytterkromatografi, reversfasekromatografi og gelfiltreringskromatografi. Under ionebyttertrinnet ble fraksjonene slått sammen, hvorved man fikk en blanding av isoformer med høye nivåer av sialinsyre. To ytterligere blandinger ble laget under reversfasekromatografi inneholdende analogen med eller uten aggregat. Detaljene ved rensingen er angitt nedenunder. 1. Kondisjonsmedium fra CHO-celler som uttrykker EPO-N14-analogen, ble innhøstet og konsentrert omtrent 2,5 ganger under anvendelse av en omrørt celle med YMIO-membran (Amicon) og diafiltrert mot 10 mM Tris, pH 8,5. 2. Det konsentrerte medium ble fylt ved ca. 12 A280MI harpiks på Q-"Sepharose" FF- (Pharmacia) kolonne ekvilibrert i 10 mM Tris, pH 8,5, ved en strømningshastighet på 0,2 cm/min. 3. Etter påfyllingen ble kolonnen vasket med 3 kolonnevolumer (CV) 10 mM Tris, pH 8,5, og eluert med en gradient på 0-0,5 M NaCl/10 mM Tris, pH 8,5, i 50 CV. 1 CV-fraksjoner ble samlet opp. 4. En prøve av hver fraksjon ble kjørt på en IEF-gel, pH 3-5. Basert på isoformfordelingen på IEF, ble det laget en fraksjonsblanding inneholdende stort sett isoformene 11-18. EDTA ble tilsatt til blandingen inntil 1 mM sluttkonsentra-s jon. 5. Isoformblandingen ble fylt ved ca. 5 A28o/ml harpiks på en reversfase C4-kolonne (Vydac) ekvilibrert i 20% etanol/10 mM Tris, pH 7,0, ved en strømningshastighet på 2,5 cm/min. Kolonnen ble vasket med 1 CV 20% etanol/10 mM Tris, pH 7,0, og eluert med en gradient på 20-94% etanol/10 mM Tris, pH 7,0, i 30 CV ved en strømningshastighet på 1 cm/min. 0,2 CV-fraksjoner ble samlet opp. 6. En prøve av hver fraksjon ble analysert ved hjelp av ikke-reduserende 12% SDS-PAGE. To separate blandinger ble laget basert på tilstedeværelsen av aggregat observert på SDS-geler. Blanding nr. 1 inneholdt EPO-analog, men ikke noe aggregat. Blanding nr. 2 inneholdt både EPO-analog og aggregat. 7. Blanding nr. 1 ble konsentrert omtrent 65 ganger og blanding nr. 2 omtrent 250 ganger under anvendelse av "Centricon 10"-er (Amicon). Hver blanding ble bufferbyttet til 20 mM Na-sitrat/100 mM NaCl, pH 7,0. 8. Hver blanding ble hver for seg renset på HPLC "Biosil SEC-250"- (BioRad) kolonne ekvilibrert i 20 mM Na-sitrat/100 mM NaCl, pH 7,0. Blandinger ble fylt ved <6 A280/ml harpiks ved en strømningshastighet på 2,26 cm/min. Topper tilsvarende monomere analoger, ble samlet opp fra hver kjøring. 9. Absorbansen i hver blanding ble målt, og en por-sjon av hver blanding ble konsentrert for analyse ved hjelp av SDS-PAGE og IEF-geler. Blanding nr. 1 hadde en fordeling av isoformene 15-17 og ble brukt til farmakokinetiske og resep-torbindingsundersøkelser.

Fremstilling 2

EP0-N14-analog ble renset ved å bruke en tretrinns-fremgangsmåte bestående av ionebytterkromatografi, reversfase-

HPLC og hydroksylapatittkromatografi. Under ionebyttertrinnet ble analogen delt i tre porsjoner inneholdende forskjellige blandinger av isoformer. Detaljene vedrørende rensingen er angitt nedenunder. 1. Supernatant fra CHO-celler som uttrykker EP0-N14, ble innhøstet og konsentrert omtrent 10 ganger under anvendelse av en "Filtron Mini-Ultrasette"-anordning med tangensial gjennomstrømning og diafiltrert mot 10 mM Tris, pH 8,5. 2. Det konsentrerte medium ble fylt ved ca. 10 A280/ml harpiks på "Q-Sepharose" FF- (Pharmacia) kolonne ekvilibrert i 10 mM Tris, pH 8,5, ved en strømningshastighet på 0,2 cm/min. 3. Etter påfyllingen ble kolonnen vasket med tre kolonnevolumer (CV) 10 mM Tris, pH 8,5, og eluert med en gradient på 0-0,5 M NaCl/10 mM Tris, pH 8,5, i 50 CV. 1 CV-fraksjoner ble samlet opp. 4. En prøve av hver fraksjon ble kjørt på en IEF-gel, pH 3-5. Tre separate fraksjonsblandinger ble fremstilt basert på isoformfordelingen som bestemt ved hjelp av IEF. En lav-isoformblanding (isoform 4-12), en middels isoformblanding (isoform 5-15) og høyisoformblanding (isoform 6-18) ble laget. 5. Hver isoformblanding ble hver for seg renset på en "Vydac C4" reversfase-HPLC-kolonne. Kolonnen ble fremkalt med en gradient fra 0,1% TFA/H20 til 0,1% TFA/75% acetonitril ved en hastighet på 1% økning i acetonitril pr. minutt. 6. Analogtoppen fra hver blanding ble samlet opp og fortynnet med 4 volumer 80 mM Tris HC1/20 mM Tris-base, så konsentrert og bufferbyttet i 10 mM Tris, pH 7,2, under anvendelse av oppløsningsmiddelresistente "Centricon 3"-er. 7. Hver prøve ble fortynnet til 2 A280/ml i 10 mM Tris, pH 7,2, og et likt volum 4 M guanidin-HCl (GuHCl), 10 mM CHAPS, 10 mM Tris, pH 7,2, ble tilsatt for en sluttprøvekon-sentrasjon av 1 A28o/ml. Hver prøve ble fylt på en hydroksyl-apatittminikolonne ekvilibrert med 2 M GuHCl, 5 mM CHAPS, 10 mM Tris, pH 7,2. Kolonnen ble vasket med ekvilibreringsbuf-fer, og 1 CV-fraksjoner med gjennomstrømning ble samlet opp. 8. Absorbansen til fraksjonene ble målt, og blandinger ble laget og bufferbyttet i 10 mM Tris, pH 7,2, under anvendelse av "Centricon 10"-er. Absorbansen til hver blanding

ble målt.

Sluttblandingene ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og IEF-geler. IEF-gelene er vist i figur 12. RIA- og in vivo aktivitetsanalysene ble utført som beskrevet i eksempel 7A. Aktiviteten in vivo til sluttisoformblandingene er rapportert i tabell 8. Høysialinsyreisoformblandingen ble brukt i forsøk for å bestemme økningen i hematokriten til mus.

Eksempel 8: Biologiske egenskaper til EP0- Nl4- analog

Aktivitetene til isoformblandinger av EPO-N14-analog, rekombinant humanerytropoietin (rHuEPO) og isolert rHuEPO-isoform 14 ble sammenlignet i farmakokinetiske analyser i.v., reseptorbindingsanalyser og hematokritundersøkelser. EP0-N14-isoformblandinger ble fremstilt som beskrevet i eksempel 7C. rHuEPO ble fremstilt i henhold til Lai et al., supra. rHuEPO-isoform 14 ble renset på følgende måte: rHuEPO bestående av en blanding av isoformene 10, 11, 12, 13, 14 og 15, ble fylt på en "Q-Sepharose"-kolonne med hurtig gjennomstrømning (dimen-sjoner = 2,2 cm i diameter x 3,4 cm i høyde) ekvilibrert i 10 mM Tris, pH 7,2. Den fylte kolonne ble ekvilibrert i 2 mM eddiksyre/6 M urea ("A"-buffer), så ble det kjørt en flerfase-gradient utformet for å optimalisere rensing av isoformene 13 og 14. Gradienten var 0%-7,3% 800 mM eddiksyre/6 M urea ("B"-buffer) i 750 ml, 7,3%-ll,4% "B"-buffer i 750 ml, ll,4%-26,8% "B"-buffer i 1250 ml, 26,8%-62,4% "B"-buffer i 1250 ml, så 62,4%-100% "B"-buffer i 700 ml. Fraksjoner å 12,5 ml ble samlet opp, nøytralisert med ammoniumhydroksid og så analysert ved hjelp av isoelektrisk fokusering i polyakrylamidgeler. De fraksjonene som inneholdt ren isoform 14, ble slått sammen, konsentrert med en "Amicon" omrørt celle utstyrt med en YM-10-membran og så bufferbyttet til vann.

A. Farmakokinetikk IV

To separate undersøkelser ble utført for å sammenligne farmakokinetikkparametrene til EPO-N14-analog (isoformene 15-17) og isolert isoform 14 med rHuEPO.

I hver undersøkelse ble 1 uCi av enten 125I-isolert isoform 14, <125>I-EPO-N14-analog eller <125>I-rekombinant humanerytropoietin (Amersham) injisert intravenøst i en karotid-kanyle i Sprague-Dawley-rotter av hannkjønn som veide mellom 310 og 378 g. På forskjellige tidspunkter etter administrering ble 0,3 ml blod tatt ut, og serum ble fremstilt ved sentrifu-gering. Konsentrasjonen av 12<5>I-EPO (enten rekombinant human, isolert isoform 14 eller EP0-N14-analog) i 0,1 ml av hver serumprøve ble så bestemt etter en inkubasjon ved 4°C over natten med 90% etanol. Den etanolutfelte 12<5>I-EPO i hver serum-prøve ble tellet i en gammateller, og de resulterende farmakokinetiske kurver er vist i figur 13. De farmakokinetiske para-metrene ble bestemt for hver rotte under anvendelse av PCNON-LIN 4,0 ikke-lineær regresjonsanalyse (Statistical Consul-tants, 1992), og det ble regnet ut gjennomsnitt av resultatene for hver gruppe. Resultatene fra EP0-N14-analogen og de farmakokinetiske undersøkelsene av den isolerte isoform 14 er oppsummert i tabell 9.

Som det ses i tabell 9, er det en signifikant for-skjell i serumuttømmingen av EPO-N14-analog når man sammenlig-ner den med den som er beregnet for rekombinant humanerytropoietin. Det rekombinante humanerytropoietin oppviste den hurtigste beta-halveringstid på 3,10 timer sammenlignet med 3,97 timer for isolert isoform 14, og 4,36 timer for EPO-N14-analog. Gruppen med rekombinant humanerytropoietin hadde også den hurtigste uttømmingshalveringstid på 1,78 timer sammenlignet med 2,40 timer for isolert isoform 14, og 3,03 timer for EPO-N14-analog.

B. Reseptorbindingsanalyser

Interaksjonen mellom EPO-Nl4-analog (isoformene 15-17) og erytropoietinreseptoren ble undersøkt ved hjelp av en analyse med kald fortrengning under anvendelse av humanerytro-leukemi-OCIMl-celler (Papayannopoulou et al., Blood 64 (supp. 1), 116a (1984)). Økende konsentrasjoner av umerket EP0-N14 ble inkubert med OCIMl-celler sammen med en konstant konsentrasjon av <125>I-rHuEPO for å bestemme mengden av EP0-N14 som er påkrevet for å konkurrere med 12<5>I-rHuEPO for binding til reseptoren. Som en sammenligning fikk også økende konsentrasjoner av umerket rHuEPO konkurrere med en konstant konsentrasjon av <125>I-rHuEPO.

Umerket EP0-N14 ble fortynnet i analysebuffer og tilsatt i mengder på 0,03 ng, 0,1 ng, 0,3 ng, 1,0 ng, 3,0 ng, 10,0 ng og 30,0 ng (basert på peptidmasse) . 0,5 ng <125>I-rekombinant human-EPO ble tilsatt til alle analyserør etterfulgt av tilsetning av omtrent 0,5xl0<6> OCIMl-celler. Analyserørene ble så inkubert ved 37°C i et vannbad med risting i 2 timer. Etter inkubasjonen ble oppløsningene sentrifugert gjennom en di-butylftalat/biftalat-oljeoppløsning for å separere ubundet <125>I-rHuEPO fra <125>I-rHuEPO bundet til OCIMl-celler. Cellepellets ble isolert, og mengden av <125>I-rHuEPO bundet til cellene, ble bestemt ved hjelp av gammatelling. Tellinger spesifikt bundet til cellene, ble beregnet, og konsentrasjonen av umerket protein som er påkrevet for å konkurrere ut 50% av <125>I-rHuEPO-bindingen i fravær av konkurrent, ble bestemt ved hjelp av lineær regresjonsanalyse.

Resultatene av tre analyser indikerte at et gjennomsnitt på 2,67 + 0,73 ng umerket EPO-N14-peptid var påkrevet for å redusere 125I-rHuEPO-binding til OCIMl-celler med 50%. I de samme tre analysene krevde umerket rHuEPO et gjennomsnitt på 0,51 + 0,15 ng for å konkurrere med bindingen av 0,5 ng av <125>I-rHuEPO. Basert på disse resultatene, var det påkrevet med et 5,25 gangers overskudd av EP0-N14 for å konkurrere med bindingen av <125>I-rHuEPO til EPO-reseptoren sammenlignet med umerket r-HuEPO (p<0,01).

Et ytterligere forsøk ble utført for å lage en direkte sammenligning mellom EPO-N14-analog, isolert isoform 14 og rekombinant erytropoietin for binding til erytropoietinreseptoren. Resultatene av dette forsøket indikerer at EPO-N14-analog hadde en lavere affinitet for reseptoren enn isolert isoform 14. Et omtrentlig to gangers overskudd av EP0-N14-analog var påkrevet for å konkurrere ut bindingen av <1>25I-rHuEPO til reseptoren sammenlignet med umerket isoform 14 (figur 14).

C. Hematokritundersøkelse

En undersøkelse in vivo ble utført for å sammenligne evnen til EP0-N14 høy- og lavisoformblandinger (fra fremstilling 2 beskrevet i eksempel 7C), isolert isoform 14 og rekombinant human-EPO når det gjelder å øke hematokriten til behandlede mus. Isoformfordelingen til EP0-N14 høy- og lav-isof ormblandinger brukt ved denne undersøkelsen, er vist i figur 12.

CDl-mus (ca. 30 g) ble injisert intraperitonealt tre ganger pr. uke i i alt 6 uker med ett av de ovenfor nevnte preparater fremstilt i 0,25% museserumalbumin, eller med placebo (PBS med 0,25% museserumalbumin). Doseringen av erytropoietinpreparater var basert på peptidmasse slik at en 30 g mus fikk enten 0,071 ug peptid/dose for EP0-N14-høyblan-ding, EPO Nl4-lavblanding, isoform 14 og r-HuEPO-standard. En ytterligere doseringsgruppe med 0,036 ug peptid/dose ble tatt med for EP0-N14-høyblanding og isoform 14. Hematokritene til alle musene ble bestemt ved grunnlinje og to ganger ukentlig deretter ved hjelp av retroorbitale blodprøver. Ved avslutnin-gen av forsøket ble serum fra alle dyrene samlet opp og analysert med hensyn på antistoffer mot det injiserte produkt. Data fra dyr som var bedømt til å være negative for nøytralis-erende antistoffer, ble brukt for etterfølgende analyse.

Som vist i figur 15, oppnådde dyr behandlet med EPO-Nl4-høyisoformblandingen, de høyeste gruppegjennomsnitts-hematokritene sammenlignet med de øvrige preparater. Isoform 14, rekombinant human-EPO og EPO-N14-lavisoformblandingen økte hematokrit i et mindre omfang.

For å sammenligne de forskjellige erytropoietinpre-paratene på en mer kvantitativ måte ble den gjennomsnittlige, initielle hastighet for hematokritøkning (0-11 dager), arealet under kurven (0-39 dager) og den totale hematokritøkning beregnet (tabell 10). Ved alle disse kriteriene synes EPO-N14-høyisoformblandingen å være mer aktiv på en peptidmassebasis enn noe annet preparat som ble testet. Både EPO-N14-høyiso-formblandingen og isoform 14 var mer aktive enn rekombinant human-EPO. EPO-N14-lavblandingen hadde den laveste aktivitet når hvilken som helst av analysene ble brukt for sammenligning .

Claims

1. Analog av humant erytropoietin, karakterisert ved at den omfatter minst ett ytterligere sete for N-glykosylering på en asparaginrest på hvilken som helst av aminosyreposisjonene 30, 51, 57, 88, 89,

136 eller 138, og der minst én ytterligere N-bundet karbohydratkjede er bundet til en hvilken som helst av nevnte aminosyreposisj oner.

2. Analog av humant erytropoietin, karakterisert ved at den omfatter minst ett ytterligere sete for 0-glykosylering på en serinrest eller treoninrest på aminosyreposisjonen 123, og der en ytterligere O-bundet karbohydratkjede er bundet til nevnte aminosyreposisj on.

3. Analog av humant erytropoietin, karakterisert ved at den er valgt fra:

4. Analog av humant erytropoietin, karakterisert ved at den omfatter Asn<30>Th<r32>Val<87>Asn<88>Thr<90>EPO.

5. Analog av humant erytropoietin, karakterisert ved at den omfatter et tillegg på én eller flere aminosyrer på karboksyterminalen til erytropoietin, der tillegget omfatter minst ett glykosyleringssete.

6. Analog ifølge krav 5, karakterisert ved at tillegget omfatter et peptidfragment som er avledet fra den karboksyterminale enden til humant koriongonadotropin.

7. Analog ifølge krav 6, karakterisert ved at tillegget omfatter et polypeptidfragment som har aminosyresekvensen Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln.

8. Analog ifølge krav 6, karakterisert ved at den er valgt fra Ser<87>Asn<88>Thr<90>EPO og Asn<30>Thr<32>Val<87>Asn<88>Thr<90>EPO.

9. Analog av humant erytropoietin, karakterisert ved at den omfatter en delesjon av ett eller flere glykosyleringsseter i humant erytropoietin og en addisjon av et likt antall ikke-naturlig forekommende glykosyleringsseter, hvorved posisjonene til karbohydratkjedene blir endret.

10. Analog ifølge krav 9, karakterisert ved at det ikke-naturlig forekommende glykosyleringssetet er et N-bundet glykosyleringssete på aminosyreposisjon 88 på humant erytropoietin.

11. Analog ifølge krav 10, karakterisert ved at den er valgt fra:

12. Analog ifølge krav 1-11, karakterisert ved at den er produktet av uttrykking av en eksogen DNA-sekvens.

13. DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for en analog av et humant erytropoietin ifølge hvilket som helst av krav 1-11.

14. Eukaryot vertscelle, karakterisert ved at den er transfektert med en DNA-sekvens som koder for en analog av et humant erytropoietin ifølge hvilket som helst.av krav 1-11, på en måte som tillater vertscellen å uttrykke analogen.

15. Preparat, karakterisert ved at det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en erytropoietinanalog ifølge hvilket som helst av krav 1-11 sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, adjuvans eller bærer.

16. Anvendelse av en erytropoietinanalog ifølge hvilket som helst av krav 1-11 for å øke hematokritt i et pattedyr.

17. Fremgangsmåte for fremstilling av en analog av humant erytropoietin, karakterisert ved at den omfatter å dyrke en pattedyrvertscelle som omfatter en DNA-sekvens som koder for en analog av humant erytropoietin ifølge et hvilket som helst av krav 1-11, og isolere analogen som blir fremstilt på denne måten.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at vertscellen er en CHO-celle.