CZ291229B6 - Analog humánního erythropoietinu a jeho pouľití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek - Google Patents

Abstract

Analog hum nn ho erythropoietinu zahrnuj c alespo jedno p° davn m sto pro glykosylaci, kde jedno m sto je zvoleno z a) kter koliv z aminokyselinov²ch poloh 30, 51, 57, 88, 89, 136 a 138, p°i em ve kter koliv z t chto aminokyselinov²ch poloh je p°ipojen alespo jeden p° davn² N-v zan² sacharidov² °et zec nebo b) aminokyselinov polohy 123, p°i em v t to aminokyselinov poloze je p°ipojen p° davn² O-v zan² sacharidov² °et zec. Pou it tohoto analogu pro v²robu farmaceutick ho prost°edku pro zvy ov n hematokritu u pacienta a tento farmaceutick² prost°edek. Sekvence DNA k duj c tento analog a eukaryontn hostitelsk bu ka transfekovan touto sekvenc DNA zp sobem umo uj c m hostitelsk bu ce exprimovat v² e uveden² analog.\

Description

Vynález se týká analogů humánního erythropoietinu a jejich použití pro výrobu léčiv, sekvencí DNA, které kódují tyto analogy, eukaryotních hostitelských buněk transfekovaných těmito sekvencemi DNA a farmaceutického prostředku na bázi výše uvedených analogů erythropoietinu.

Dosavadní stav techniky

Erythropoietin (EPO) je glykoproteinový hormon, který se podílí na mutaci erythroidních 15 progenitorových buněk na erythrocyty. Jedná se důležitý hormon regulující hladinu červených krvinek v oběhovém systému. Přírodní erythropoietin je produkován v játrech během života plodu a v ledvinách dospělých, cirkuluje krví a stimuluje produkci červených krvinek v kostní dřeni. Anémie je téměř vždy důsledkem selhání ledvin projevujícího se sníženou produkcí erythropoietinu v ledvinách. Zjistilo se, že rekombinantní erythropoietin vyrobený technikami 20 genetického inženýrství, tj. expresí proteinového produktu z hostitelské buňky transformované genem kódujícím erythropoietin je účinný při léčbě anémie vyvolané chronickým selháním ledvin.

V moči člověka je normálně přítomna nízká koncentrace erythropoietinu, zatímco v moči 25 pacientů trpících aplistickou anémií je hladina erythropoietinu zvýšena. Při purifikaci humánního urinámího erythropoietinu (Myika et al., J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977)) bylo jako výchozí látky použito moči pacientů trpících aplastickou anémií. Až dosud se však urinální erythropoietin nestal užitečným z terapeutického hlediska.

Identifikace, klonování a exprese genů kódujících erythropoietin je popsána v patentu US 4 703 008 (Lin). Popis způsobu purifikace rekombinatního erythropoietinu z buněčného média je popsán v patentu US 4 667 016 (Lai et al.). Výše uvedené dvě citace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Exprese a izolace biologicky aktivního rekombinantního erythropoietinu ze savčích hostitelských buněk obsahují35 cích erythropoietinový gen v rekombinantním plazmidu umožnila poprvé získat větší množství erythropoietinu vhodného pro terapeutické aplikace. Kromě toho, znalost sekvence genu a dostupnost větších množství purifikovaného proteinu vedla k lepšímu porozumění mechanismu účinku tohoto proteinu.

Mnohé buněčné povrchové proteiny a sekretorové proteiny produkované eukaryotními buňkami jsou modifikovány jednou nebo více oligosacharidovými skupinami. Tato modifikace, která je označována názvem glykosylace, může dramaticky ovlivnit fyzikální vlastnosti proteinů a může být také důležitá pro stabilitu, sekreci a subcelulámí lokalizaci proteinů. Vhodná glykosylace může mít rozhodující význam pro biologickou účinnost. Je skutečností, že některé geny 45 z eukaryontních organismů, pokud jsou exprimovány v bakteriích (například E. coli), kterým chybí buněčné procesy pro glykosylaci proteinů, poskytují proteiny, které po izolaci vykazují jen malou účinnost nebojsou úplně neúčinné, v důsledku toho, že nejsou glykosylovány.

Ke glykosylaci dochází na specifických místech hlavního řetězce polypeptidu a obvykle se jedná 50 o dva různé typy: O-vázané oligosacharidy jsou připojeny k sereinovým nebo threoninovým zbytkům, zatímco N-vázané oligosacharidy jsou připojeny k asparaginovým zbytkům, kde jsou součástí sekvence Asn-X-Ser/Thr, kde X představuje jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou prolinu. Struktury N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a cukerných zbytků, které se vyskytují u obou typů, jsou různé. Jedním typem cukru, který se obvykle vyskytuje u obou těchto 55 typ, je kyselina N-acetylneuraminová (dále označovaná názvem kyselina sialová). Kyselina

-1 CZ 291229 B6 sialová tvoří obvykle terminální zbytek jak N-vázaného, tak O-vázaného oligosacharidu a díky svému negativnímu náboji může propůjčovat glykoproteinu kyselé vlastnosti.

Jak humánní erythropoietin izolovaný z moči, tak rekombinantní erythropoietin (exprimovaný v savčích buňkách), s aminokyselinovou sekvencí 1-165 humánního eiythropoietinu obsahuje tři N-vázané a jeden O-vázaný oligosacharidový řetězec, které dohromady činí asi 40 % celkové molekulové hmotnosti glykoproteinu. N-vázané glykosylace se vyskytuje u asparatinových zbytků umístěných v polohách 24, 38 a 83, zatímco O-vázané glykosylace je umístěna na serinovém zbytku v poloze 126 [Lai et al., J. Biol. Chem. 261, 3 1126(1986); Broudy et al., io Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)]. Bylo ukázáno, že oligosacharidové řetězce jsou modifikovány terminálními zbytky kyseliny sialové. Enzy matické zpracování glykosylovaného erythropoietinu za účelem odstranění všech zbytků kyseliny sialové, se projevuje ztrátou účinnosti in vivo, ale neovlivní účinnost in vitro [Lowy et al. Nátuře 1985, 102 (1960); Goldwasser et al., J. Biol. Chem. 249, 4 202 (1974)]. Toto chování bylo vysvětleno rychlým 15 vymizením asialoerythropoietinu z oběhu při interakci s hepatickým proteinem, který váže asialoglykoprotein [Morrell et al., J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Briggs et al., Am. J. Physiol. 227, 1 385 (1974); Ashwell et al., Methods Enzymol 50. 287 (1978)]. Erythropoietin vykazuje tedy biologickou účinnost in vivo pouze v tom případě, když je sialylován, čímž se zabrání jeho vazbě na hepatický vazebný protein.

²⁰

Úloha jiných složek v oligosacharidových řetězcích erythropoietinu není dobře definována. Zjistilo se, že částečně deglykosylovaný erythropoietin vykazuje podstatně sníženou účinnost in vivo ve srovnání s glykosylovanou formou, ale zachovává si svou účinnost in vitro [Dordal et al., Endocrinology 116, 2293 (1985); Lin, výše citovaný patent]. V jiné studii však bylo 25 konstatováno, že odštěpení N-vázaných nebo O-vázaných oligosacharidových řetězců, jednotlivě nebo dohromady, mutagenezí asparaginoxých nebo serinových zbytků, které představují glykosylační místa, výrazně snižuje in vitro účinnost modifikovaného erythropoietinu produkovaného v savčích buňkách [Dube et al.., J. Biol. Chem. 263,17516 (1988)].

Glykoproteiny, jako je erythropoietin, je možno rozdělovat na formy s různým nábojem za použití takových technik, jako je izoelektrická fokusace (IEF). Několik skupin vědců publikovalo IEF studie vztahující se k surovým nebo zčásti purifikováným erythropoietinovým přípravkům [Lukowski et al., J. Biochem. 50, 909 (1972); Shelton et al., Biochem. Med. 12, 45 (1975); Fuhr et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930 (1981)]. Pomocí IEF byly při těchto studiích 35 identifikovány nejvýše tři nebo čtyři frakce s erythropoietinovou účinností a žádné z nich nebyla charakterizována, pokud se týče obsahu uhlohydrátů. Kromě nebyla provedena žádná korelace mezi izoelektrickými body těchto frakcí a jejich biologickou účinností.

Při purifikaci erythropoietinu izolovaného z humánní moči (Miyake et al., výše uvedená citace) 40 bylo zjištěno, že dvě frakce erythropietinu izolované pomocí chromatografie na hydroxylapatitu a označené symboly II a lila, vykazují podobnou specifickou účinnost. Následující analýza uhlohydrátů ve frakcích II a lila ukázala, že frakce II obsahuje vyšší průměrný obsah kyseliny sialové, než frakce lila (Diordal et al., výše uvedená citace).

Úkolem tohoto vynálezu je získat oddělené a izolované izoformy erythropoietinu s definovaným obsahem kyseliny sialové a s definovanou biologickou účinností. Tyto izoformy by měly být terapeuticky užitečné při použití ve formě farmaceutických prostředků.

-2CZ 291229 B6

Podstata vynálezu

Předměte vynálezu je analog humánního erythropoietinu zahrnující alespoň jedno přídavné místo pro glykosylaci, kde jedno místo je zvoleno z

a) kterékoli z aminokyselinových poloh 30, 51, 57, 88, 89, 136 a 138, přičemž ve kterékoliv z těchto aminokyselinových poloh je připojen alespoň jeden přídavný N-vázaný sacharidový řetěze nebo

b) aminokyselinové polohy 123, přičemž v této aminokyselinové poloze je připojen přídavný O-vázaný sacharidový řetězec.

Ve výhodném provedení je analog humánního erythropoietinu podle vynálezu produktem exprese exogenní sekvence DNA a zvláště výhodně se jedná o Asn ³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO.

Jako konkrétní provedení analogu humánního erythropoietinu podle vynálezu je možno uvést provedení zvolené ze souboru sestávajícího z

Asn³⁰Thr³²EPO;

Asn⁵¹Thr⁵³EPO;

Asn⁵⁷Thr⁵⁹EPO;

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁹⁰Thr⁹²EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²EPO;

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO;

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr^9lEPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr^9IEPO;

Asn¹³⁶Thr¹³⁸EPO; a

Asn'³⁸Thr^l40EPO;

Předmětem vynálezu je také sekvence DNA kódující analog humánního erythropoietinu popsaný výše.

Dalším předmětem vynálezu je eukaryontní hostitelská buňka transfekovaná sekvencí DNA uvedeno výše způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat analog humánního erythropoietinu.

Předměte vynálezu je dále také farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá vtom, že obsahuje terapeuticky účinné množství uvedeného analogu erythropoietinu spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem, adjuvantem nebo nosičem.

Konečně je předmětem vynálezu také použití terapeuticky účinného množství výše uvedeného analogu erythropoietinu pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvyšování hematokritu u pacienta.

Alespoň jedno přídavné místo pro glykosylaci (glykosylační místo) v analogu humánního erythropoietrinu podle vynálezu s může projevit zvýšením počtu uhlohydrátových řetězců a vyšším obsahem kyseliny sialové ve srovnání s humánním erythropoietinem.

-3CZ 291229 B6

Přehled obr, na výkresech

Obr. 1 ukazuje analytický izoelektrický fokusační gel, na němž je provedena separace izoforem rekombinantního erythropoietinu. Gelové dráhy 1 až 11 ukazují izoformy od méně kyselých (vyšší hodnota pí) v dráze 1 ke kyselejším (nižší hodnota pí) v dráze 11. V drahách ležících u pravého a levého okraje je též obsažen purifikovaný rekombinaný erythropoietin obsahující směs izoforem 9 až 14.

Na obr. 2 je znázorněn vztah mezi počtem zbytků kyseliny sialové v izoformě erythropoietinu a specifickou účinností této izoformy in vivo vyjádřenou v jednotkách/mg erythropoietinového polypeptidu. Na obr. 2A je znázorněna koncentrace každé izoformy erythropoietinu zjištěná Bradfordovým stanovením proteinů. Na obr. 2B je tato koncentrace stanovena měřením absorbance při 280 nm a na obr. 2C je tato koncentrace stanovena metodou RIA.

Obr. 3 ukazuje analytický izoelektrický fokusační gel s definovanými směsmi izoforem rekombinantního erythropoietinu připravenými chromatografii na anexu za různých podmínek. Gelové dráhy 1 až 6 představují (podle pořadí v jakém jsou uvedeny) erythropietinové izoformy eluované v promývací kapalině s vysokým obsahem solí po promytí sloupce Q-Sepharose rychlým proudem 150mM kyseliny octové o pH 4,7, 150mM kyseliny octové, která není pufrována. Na levé krajní dráze gelu je také obsažen purifikovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem, získaný postupy popsanými v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al., pouze stím rozdílem, že místo chromatografie na DEAE-Agaróze bylo použito chromatografie na O-Sepharose.

Obr. 4 ukazuje dělení izoforem erythropoietinu 8 až 12, které se provádí tak, že se upravené buněčné médium nanese na sloupec Q-Sepharose a eluuje gradientem s klesající hodnotou pH a stoupající iontovou silou. Alikvoty sudých frakcí od frakce 2 do frakce 40 se podrobí analytické izoelektrické fokusaci. Na levé krajní dráze gelu je také obsažen purifikovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem, získaný postupy popsanými v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et alk., pouze s tím rozdílem, že místo chromatografie na DEAE-Agaróze bylo použito chromatografie na Q-Seiharose.

Na obr. 5 je znázorněna sekvence aminokyselin humánního erythropoietinu. Čtverečky označují asparaglnové zbytky, knimž jsou připojeny N-vázané uhlohydrátové řetězce a hvězdička označuje serinový zbytek, který je modifikován O-vázaným uhlohydrátovým řetězcem.

Na obr. 6A., 6B 6C je znázorněna série klonovacích stupňů použitých pro vytvoření plazmidů pro konstrukci a analýzu analogů humánního erythropoietinu. Tyto analogy obsahují aminokyseliny modifikované způsobem znázorněným na obr. 5, který jim dodává přídavná glykosylační místa.

Na obr. 7 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů erythropietinu s humánní sekvencí a uvedených analogů erythropietinu. Analogy [Asn⁹, Ser^ll]EPO, [Asn⁶⁹]EPO, [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO jsou zkonstruovány způsobem popsaným v příkladu 6. Pro srovnání jsou zde uvedeny též přídavné analogy [Pro¹²⁵, Thr¹²⁷]EPO a [Asn¹²⁶, Ser¹²⁸]EPO, které neobsahují přídavné uhlohydrátové řetězce.

Na obr. 8 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů erythropoietinu s humánní sekvencí a charakterizovaných analogů erythropoietinu po zpracování N-glykanázou. Analogy [Thr¹²⁵]EPO a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO jsou zkonstruovány popsaným v příkladu 6. Pro srovnání jsou zde uvedeny též přídavné analogy [Val¹²⁶]EPO, [Pro¹²⁴]EPO [Pro¹²⁵]EPO, [Thr¹²⁷]EPO, [Pro¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO a [Thr¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO.

-4CZ 291229 B6

Obr. 9 ukazuje izoelektrický fokusační gel z fokusace frakce 2, 3 a 4 získaných chromatografii na Q-Sepharose s obrácenými fázemi (C4) za použití buněčného média podporujícího růst CHO buněk transfekovaných erythropoietinovou cDNA obsahující [THR¹²⁵]-mutaci. Na levé a pravé krajní dráze gelu je také obsažen purifikovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem, získaný postupy popsanými v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al., pouze s tím rozdílem, že místo chromatografie na DEAE-Agaróze bylo použito chromatografie na Q-Sepharose.

Na obr. 10 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů rekombinantního humánního erythropoietinu (rHuEPO) a zvolených analogů. Konstrukce těchto analogů je popsána v příkladu 6. Analogy N9, N14, N18, N19, N21, N24 a N39 obsahují přinejmenším jeden přídavný uhlohydrátový řetězec, což je dokumentováno nižší pohyblivostí na gelu.

Na obr. 11 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů rekombinantního humánního erythropieitinu a analogu EPO NI4 v průběhu štěpení N-glykanázou. Časové intervaly, v nichž bylo prováděné měření, jsou 0,4,12,45 minut a štěpení přes noc.

Obr. 12 ukazuje izoelektrický fokusační gel z fokusace přípravků obsahujících izoformy analogu EPO NI4. Směs označená jako nízké izoformy obsahuje analog EPO N14 obsahující převážně 6 až 12 zbytků kyseliny sialové v molekule, směs označená jako střední izoformy obsahuje analog N14 obsahující převážně 10 až 15 zbytků kyseliny sialové v molekule a směs označená jako vysoké izoformy obsahuje analog NI4 obsahující převážně 12 až 17 zbytků kyseliny sialové v molekule.

Obr. 13 ukazuje farmakokinetiku rekombinantního humánního erythropoietinu, izolované izoformy 14 a analogu EPO N14 (izoformy 15 až 17) po intravenosním injekčním podání krysám.

Na obr. 14 je znázorněna zkouška vytěsňování ¹²⁵I-značeného rekombinančního humánního erythropoietinu z vazby k receptoru erythropoietinu prováděná za chladu za přítomnosti různého množství neznačeného rHuEPO, izolované izoformy 14 nebo analogu EPON14.

Obr. 15 ukazuje studii myšího hematokritu (poměr plazmy ke krvinkám), při níž se porovnává účinnost vysoké izoformy EPO N14 (0,036 a 0,0712 pg), izolované izoformy 14 (0,036 a 0,0712 pg), nízké izoformy EPO 177 (0,0712 pg) a rHuEPO (0,071 pg).

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

Předmětem vynálezu jsou izoformy erythropoietinu. Specifické izoformy erythropoietinu získané podle vynálezu a jejich vlastnosti se mohou měnit v závislosti na zdroji výchozího materiálu. Tak například izoformy humánního erythropoietinu izolovaného z moči se liší od izoforem rekombinantního erythropoietinu. V přednostním provedení se vynález týká izoformy erythropoietinu se specifickým počtem (tj. s pevným počtem, který je vyšší než 0) zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu, přičemž toto číslo je zvoleno ze souboru zahrnujícího čísla 1 až 14. S výhodou je tímto číslem 9, 10, 11, 12, 13 nebo 14. V jiném provedení je toto číslo vyšší než Mas výhodou leží v rozmezí od 16 do 23.

Pod označením „izoforma erythropoietinu“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí erythropoietinový přípravek vykazující jediný izoelektrický pod (pí) a mající stejnou sekvenci aminokyselin. Pod označením „erythropoietin“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí přírodní erythropoietin, humánní erythropoietin izolovaný z moči, jakož i polypeptidy, které se nevyskytují v přírodě a které mají sekvenci aminokyselin a které jsou glykosylovány způsobem dostatečně kopírujícím přírodní erythropoietin, aby jim to udělilo in vivo biologické vlastnosti spočívající ve stimulaci buněk kostní dřeně pro zvýšenou produkci retiulocytů a červených krvinek.

-5CZ 291229 B6

Zjistilo se, že oddělené izoformy rekombinantního erythropoietinu, které mají sekvenci aminokyselin humánního erythropoietinu izolované zmoci, odpovídají molekulám erythropoietinu obsahujícím 1 až 14 zbytků kyseliny sialové, přičemž každá z izoforem přítomných v purifikovaném rekombinantním erythropoietinu vykazuje účinnost in vivo mající vztah k počtu zbytků kyseliny sialové, které tato izoforma obsahuje.

V přednostním provedení je erythropoietin produktem exprese exogenní sekvence DNA, která byla transfekována do nehumánní eukaryontní hostitelské buňky. V přednostním provedení je tedy erythropoietin „rekombinantní erythropoietin“. Rekombinantní erythropoietin se s výhodou produkuje postupy popsanými v patentu US 4 703 008 (Lin; stejný majitel vlastní i práva k této přihlášce). Rekombinantní erythropoietin se může purifikovat obecnými postupy popsanými v příkladu 2 patentu US 4 667 016 (Lai et al.,; stejný majitel vlastní i práva k této přihlášce) nebo alternativně způsobem popsaným v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al.., při němž se však místo chromatografie na DEAE-Agaróze použije chromatografie na Q-Sepharose.

Erythropoietin purifikovaný podle příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. obsahuje podle analýzy IEF převážně 6 izoforem. Za použití chromatografíckých postupů popsaných v příkladu 4 byla kromě toho zjištěna přinejmenším jedna další izoforma s vyšší kyselostí. (Tato kyselejší forma migrující na IEF gelu při obsahu zbytků sialové kyseliny nad 14 může obsahovat záporné náboje nepocházející z sialové kyseliny, což dokládá resistence některých nábojů ke štěpení sialidasou.) Tyto izoformy se od sebe vzájemně liší obsahem kyseliny sialové. Tato skutečnost je v příkladech demonstrována na izolaci 10 takových izoforem preparativní IEF a stanovením obsahu kyseliny sialové v 5 z nich. Zjistilo se, že v izoformách zkoušených na obsah kyseliny sialové, je počet zbytků kyseliny sialové 9, 10, II, 12 nebo 13.

Existuje vztah mezi relativní specifickou účinností erythropoietinu in vivo a počtem zbytků kyseliny sialové v molekule extropoietinu z izoforem 5 až 11 (každá izoforma je zde označena počtem zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu), Izoformy 11 až 14 vykazují přibližně stejnou relativní specifickou účinnost in vivo. Izoformy 5 až 14 byly zkoušeny na účinnost in vivo pomocí exhypoxického polycythemického biologického stanovení na myších. Množství každé z přítomných izoforem se zjistí Bradfordovým stanovením proteinů, měřením absorbance při 280 nm nebo radioimunoesejem (RIA) pro erythropoietin. Výsledky stanovení RIA vyjádřené v jednotkách/ml se dělí hodnotou 212 770 jednotek/mg erythropoietinového polypeptidu, průměrnou specifickou účinností purifikovaného erythropoietinu stanovenou metodou RIA, a tím se získají hodnoty koncentrace proteinu v izolovaných izoformách nebo směsích izoforem, které jsou vyjádřeny v miligramech erythropoietinového polypeptidu na mililitr. Jak je to ukázáno v příkladech, relativní specifická účinnost in vivo stupňovitě stoupá od izoformy 5 k izoformě 11 (viz tabulka 2).

Hodnoty specifické účinnosti in vivo, které jsou v tomto popisu uváděny, představují hodnoty získané měřením relativní specifické účinnosti in vivo a nikoliv měřením absolutní specifické účinnosti in vivo. Hodnot specifické účinnosti se v tomto popisu používá pouze pro srovnávání relativní účinnosti izoforem zkoušených pomocí stejného stanovení za stejných podmínek, za použití stejného vnitřního standardu, stejného typu zvířete a za použití stejné analýzy dat použitých pro výpočet specifické účinnosti a za použití stejné zkoušky pro stanovení obsahu proteinu. Žádná z uvedených hodnot specifické účinnosti in vivo u kterékoliv z izoforem nepředstavuje inherentní nebo absolutní hodnotu charakteristickou pro tuto izoformu.

Předmětem vynálezu jsou také směsi obsahující dvě nebo více izoforem extropoietinu. Podle jednoho provedení obsahují tyto směsi izoformy obsahující vyšší počet zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu, než je předem určený počet, například vyšší počet než 11 nebo 12, a například se jedná o směs izoforem 12, 13 a 14. Podle jiného provedení obsahují tyto směsi izoformy s předem určeným počtem zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu, například sméně než 12, ale více než 8 zbytky kyseliny sialové v molekule, jako je tomu

-6CZ 291229 B6 například v případě směsi izoforem 9, 10a 11. Předmětem vynálezu jsou také směsi izoforem erythropoietinu, v nichž jsou vzájemná množství izoforem stejná nebo různá. Tak například směs izoforem 9, 10 a 11 může obsahovat jednotlivé izoformy v různých poměrech, jako například 1 : 1 : 1,2:3: 1 nebo 20 : 20 : 1.

S výhodou obsahují takové směsi méně než 4 izoformy a jedná se například o směsi izoforem 11, 12 a 13 nebo o směsi izoforem 12 a 14 nebo dále o směs izoforem 7 a 13.

Takové směsi izoforem erythropoietinu se podle vyrábějí podle vynálezu současnou izolací zvolených izoforem erythropoietinu. Tyto postupy zahrnují izolací jednotlivých izoforem takovými technikami, jako je preparativní izoelektrická fokusace nebo výrobě směsí izoforem obsahujících předem určený počet zbytků kyseliny sialové (například nad 11) takovými technikami, jako je ionexová chromatografie nebo chromatofokusace. Všechny tyto techniky jsou založeny na dělení proteinů podle náboje.

Ionexová chromatografie a chromatofokusace se obvykle provádí tak, že se buď surový humánní erythropoietin (médium zpracované buňkami), nebo purifikovaný materiál aplikuje na sloupec pryskyřice za podmínek umožňujících vazbu některých nebo všech izoforem erythropoietinu k pryskyřici. Pokud se používá surového erythropoietinu, přednostně se protein aplikuje na sloupec při hodnotě pH asi 7, zatímco purifikované proteinové přípravky se mohou aplikovat na sloupec při pH v rozmezí od 7 do asi 4. Po promytí sloupce pufrem o hodnotě pH asi 4 se izoformy erythropoietinu, které zůstanou navázány na sloupci ionexu, eluují zvýšením pH a koncentrace soli v promývacím pufru nebo aplikací gradientu se snižující se hodnotou pH a zvyšující se izoformy eluují ze sloupce gradientu se snižující se hodnotou pH nebo promytím sloupce roztokem s vysokou koncentrací soli.

V přednostním provedení se jednotlivé izoformy izolují za použití ionexové chromatografie. Tak například izoforma 14 se izoluje za použití ionexové chromatografie způsobem popsaným v příkladu 8.

Do rozsahu vynálezu spadají také určité analogy humánního erythropoietinu. Pod označením „analog humánního erythropoietinu“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí erythropoietin zahrnující jednu nebo více změn aminokyselinové sekvence humánního erythropoietinu, která má za následek zvýšení počtu míst připojení kyseliny sialové. Analogy se tvoří místně orientovanou mutagenezí zahrnující adice, delece nebo substituce aminokyselinových zbytků, kterými se zvyšuje nebo mění počet míst, která jsou k dispozici pro glykosylaci. Takové analogy mohou obsahovat větší počet uhlohydrátových řetězců než humánní erythropoietin.

Analogy erythropoietinu podle vynálezu obsahují sekvenci aminokyselin, která zahrnuje přinejmenším jedno přídavné glykosylační místo. Analogy obsahující vyšší koncentraci kyseliny sialové než její obsah v humánním erythropoietinu se získávají zavedením glykosylačních míst, které nezpůsobí zmatení sekundární nebo terciární konformace potřebné pro biologickou účinnost. Analog humánního erythropoietinu s výhodou obsahuje 1, 2 nebo 3 přídavná míst pro N-glykosylaci nebo O-glykosylaci, což se projeví zavedením 1, 2 nebo 3 přídavných N-vázaných nebo 0-vázaných uhlohydrátových řetězců. Tak například leucin v poloze 69 se nahradí asparaginem, za vzniku sekvence Asn-Leu-Ser, která slouží jako čtvrté místo pro N-glykosilaci. Taková změna může obvykle dodat až čtyři přídavné zbytky kyseliny sialové do molekuly. Jako příklady změn, kterými lze vytvořit přídavná O-glykosylační místa, je výměna alaninu v poloze 125 za threonin a alaninů v polohách 124 a 125 za prolin (v poloze 124) athreonin (v poloze 125). Je možno sestrojit analogy obsahující jeden nebo více přídavných N-vázaných a O-vázaných řetězců, jako jsou například analogy NO 1 aNO2 popsané v tabulce 5. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že do rozsahu tohoto vynálezu spadá i mnoho dalších analogů humánního erythropoietinu obsahujících přídavná místa pro glykosylaci.

Analogy se zvýšenou četností připojení uhlohydrátů v glykosylačních místech rovněž spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Tyto analogy obvykle zahrnují substituci jedné nebo více aminokyselin v těsném sousedství kN-vazebnému nebo O-vazebnému místu. Díky těmto změnám aminokyselin bude větší část erythropoietinových polypeptidů obsahovat uhlohydrátovou modifikaci. Glykosylační místa mohou být přirozená nebo mohou být vytvořena mutací. Tak například analog N13 neobsahuje přídavný uhlohydrátový řetězec, přestože do něj bylo zavedeno v poloze 88 glykosylační místo. Analogy N14 a N80, které obsahují v poloze 87 xýměnu za serin (N14) nebo za valin (NI 8), obsahují v poloze 88 přídavný uhlohydrátový řetězec.

Do rozsahu vynálezu spadají také analogy obsahující jednu nebo více aminokyselin, kterými je nastaven karboxylový konec erythropoietinu, přičemž toto nastavení karboxylového konce zajišťuje zavedení alespoň jednoho přídavného uhlohydrátového místa. Při jednom provedení se zkonstruuje analog fúzí 28 karboxy-terminálních aminokyselin humánního chorionického gonadotropinu (HCG) k argininovému zbytku v poloze 166 humánního erythropoietinu. HCG karboxyterminální fragment obsahuje čtyři místa pro O-glykosylaci (Kessler et al., J. Biol. Chem. 254, 7907 (1979)).

V tabulkách 3, 4 a 5 jsou uvedeny analogy erythropoietinu obsahující přídavná místa pro N-vázané a/nebo O-vázané uhlohydrátové řetězce. Tyto analog}' obsahují sekvenci Asn-X-Ser/Thr zavedenou substitucí do různých poloh řetězce humánního erythropoietinové polypeptidů, za vzniku N-vázaných míst nebo obsahují zavedené zbytky šeřinu nebo threoninu, za účelem vytvoření O-vazebných míst.

V tabulce 6 jsou uvedeny analogy, umožňujícím zavedení přinejmenším jednoho přídavného N-vázaného nebo jednoho přídavného O-vázanému uhlohydrátového řetězce nebo zavedení přídavného N-vázaného a O-vázaného řetězce současně, jak je to dokumentováno migrací těchto glykoproteinů na SDS gelech (příklad 7). Jak je zřejmé z tabulek 3 a 6, analogy obsahující jedno nebo více přídavných míst pro připojení uhlohydrátu nemusí nutně vést ke vzniku molekul erythropoietinu obsahujících přídavné uhlohydrátové řetězce. Tak například zavedení threoninové substituce do polohy 123 a 125 má za následek připojení O-vázaného uhlohydrátového řetězce, zatímco zavedení serinové nebo threoninové substituce do jiných poloh nevede k získání analogů s přídavnými O-vázanými řetězci (viz tabulka 4). Zavedení asparaginových substitucí do poloh 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 a 138 do sekvence humánního erythropoietinu se však projeví zavedením N-vázaného řetězce v těchto polohách. Fúze HCG polypeptidového fragmentu s argininovým zbytkem v poloze 166 humánního erythropoietinu vede k vzniku fúzované molekuly erythropoietin-HCG obsahující přinejmenším dva přídavné 0-vázané uhlohydrátové řetězce.

Analogy erythropoietinu podle vynálezu zahrnují též erythropoietin, jehož sekvence aminokyselin obsahuje přesmyk alespoň jednoho glykosylačního místa. Pod označením „přesmyk glykosylačního místa“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí delece jednoho nebo více glykosylačních míst v humánním erythropoietinu a zavedení jednoho nebo více nepřirozených glykosylačních míst. Jako příklady takových přesmyků je možno uvést analogy Rl, R2 a R3, které byly sestrojeny delecí N-vázaných míst v polohách 23 (Rl), 38 (R2) nebo 83 (R3) a zavedením N-vazebného místa do polohy 88. Jsou však možné i další četné typy přesmyků uhlohydrátových míst a vzniklé analogy mohou nebo nemusí mít vyšší počet glykosylačních míst ve srovnání s humánním erythropoietinem.

Analogy Rl, R2, a R3 byly analyzovány na biologickou účinnost in vivo a zjištěné výsledky jsou uvedeny v tabulce 7. Zavedení N-vázaného řetězce v poloze Asn88 vrací biologickou účinnost erythropoietinu, z něhož bylo delecí vypuštěno kterékoliv ze tří přirozených N-vazebných míst. Tyto výsledky ukazují, že polohy uhlohydrátových řetězců v erythropoietinu se mohou měnit za účelem získání užitečných analogů, aniž by se podstatně ovlivnila jejich biologická účinnost.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také sekvence DNA kódující analogy erythropoietinu obsahující přídavná míst pro N-vázané a/nebo O-vázané řetězce, analogy obsahující přesmyk

-8CZ 291229 B6 alespoň jednoho místa připojení pro uhlohydrátový řetězec a analogy obsahující jednu nebo více aminokyselin prodlužujících karboxylový konec erythropoietinu. Postupy, kterých se používá pro zavádění změn do sekvence DNA kódující humánní erythropoietin za účelem vytvoření nebo změnu vazebných míst pro uhlohydrátové řetězce jsou uvedeny v příkladu 6.

Tyto analogy erythropoietinu mohou být produktem exprese exogenní sekvence DNA, tj. sekvence DNA vytvořené technologií rekombinace DNA nebo se může jednat o syntetické produkty. Exogenní sekvence DNA zahrnuje cDNA, genomovou DNA nebo chemicky syntetizovanou DNA kódující analog erythropoietinu.

Do rozsahu vynálezu spadají také rekombinantní DNA plazmidy a eukaryontní hostitelské buňky, které jsou užitečné pro expresi takových analogů. Expresní vektory zahrnují jakékoliv vektoiy, které jsou schopny exprimovat klonované sekvence DNA v eukaryontní hostitelské buňce, zejména vektory používané pro expresi v buňkách COS a CHO. Jako příklady takových vektorů je možno uvést plazmidy pEC a pDECdelta popsaného v příkladu 6 dále. Kultivace hostitelských buněk COS a CHO exprimujících analog) erythropoietinu se provádí za použití postupů, které jsou odborníkům v tomto oboru známy.

Izolované izoformy a směsi izoforem odvozené od analogů erythropoietinu se získají výše popsanými metodami pro výrobu izoforem humánního erythropoietinu. Tyto metody mohou zahrnovat izoelektrickou fokusaci, ionexovou chromatografií a chromatofokulaci. Pro výrobu jednotlivých izoforem a směsí izoforem analogů erythropoietinu se přednostně používá ionexové chromatografíe.

Zvýšením počtu uhlohydrátových řetězců v erythropoietinu, a tedy zvýšením počtu zbytků kyseliny sialové, vztaženo na molekulo erythropoietinu, se mohou výsledným produktům dodat výhodné vlastnosti, jako je zvýšená rozpustnost, vyšší odolnost vůči proteolýze, snížená imunogenicita, zvýšený poločas životnosti v séru a zvýšená biologická účinnost.

Média zpracovaná buňkami CHO exprimující analogy erythropoietinu byla analyzována na biologickou účinnost in vivo a zjištěné výsledky jsou uvedeny v tabulce 6. Několik z těchto zkoušených analogů vykazují účinnost, která je třikrát nebo vícekrát vyšší než účinnosti humánního erythropoietinu. Zejména analogy obsahující přídavné N-vázaný uhlohydrátový řetězec v některé z poloh 30 nebo 88 vykazují dvojnásobně až trojnásobně vyšší účinnost než humánní erythropoietin, zatímco analogy obsahující přídavné O-vázané řetězce díky fúzi humánního erythropoietinu s fragmentem HCG polypeptidů vykazují přinejmenším dvakrát vyšší účinnost.

Dva analogy erythropoietinu obsahující přídavné uhlohydrátové řetězce byly purifikovány a byly izolovány směsi s různým obsahem kyseliny sialové (příklad 8). Analogy Thg¹²⁵ a Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ (EPO NI4) byly rozděleny do tří separátních frakcí izoforem a byla stanovena biologická účinnost každé z těchto frakcí. Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce 8 ukazují, že izoformové frakce EPON14 s vyšším obsahem kyseliny sialové vykazují vyšší účinnost in vivo.

Frakce izoforem s vyšším obsahem kyseliny sialové z analogu EPO N14 a rekombinantní humánní erythropoietin (izoformy 9 až 14) byla studovány za použití zkoušky vazby k receptoru, farmakokinetických pokusů a pokusů zaměřených na stanovení zvýšení hematokritu u myší. Výsledky těchto zkoušek ukazují, že existuje přímý vztah mezi obsahem kyseliny sialové, poločasem životnosti a schopností zvýšit hematokrit ošetřených myší. Jak je zřejmé z obr. 13, 14 a 15, frakce izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové z EPO N14 vykazuje podstatně vyšší poločas in vivo a vyvolává vyšší nárůst hematorkritu než izolovaná izoforma 14 nebo rekombinantní humánní erythropoietin, přestože se frakce izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové z EPO N14 neváže k receptoru tak silně.

-9CZ 291229 B6

Předmětem vynálezu jsou také savčí hostitelské buňky [například buňky z ovarií čínského křečka (CHO)], které přednostně syntetizují izoformy humánního erythropoietinu nebo analogů erythropoietinu obsahující vyšší počet zbytků kyseliny sialové v molekule, než je počet specifický, například nad 10 zbytků kyseliny sialové v molekule. Molekuly erythropoietinu obsahují N-vázané a O-vázané oligosacharidové struktury, které mohou omezovat obsah kyseliny sialové v molekule. Tak například tetraantenámí (se čtyřmi rozvětveními) N-vázané oligosacharidy nejčastěji poskytují čtyři možná místa pro připojení kyseliny sialové, zatímco biantenámí a triantenámí oligosacharidové řetězce, kterými může být nahrazena tetraantenámí forma na asparaginových vazebných místech, obvykle obsahují nejvýše pouze 2 nebo 3 připojené zbytky kyseliny sialové. O-vázané oligosacharidy obvykle poskytují dvě místa pro připojení kyseliny sialové. Molekuly erythropoietinu tedy mohou přijmout celkem 14 zbjtků kyseliny sialové, za předpokladu, že jsou všechny tři N-vázané oligosacharidy tetraantenální. Kultury savčích buněk se podrobí screeningu na buňky, které přednostně zavádějí tetraantenámí řetězce do rekombinantního erythropoietinu, což má za následek maximalizaci počtu míst pro připojení zbytků kyseliny sialové.

N-vázané oligosacharidy erythropoietinu izolovaného z moči obsahují kyselinu sialovou jak s vazbou a 2,3, tak s vazbou a 2,6 ke galaktose (Takeuchi et al., J. biol. Chem. 263, 3 657 (1988)). Kyselina sialová s vazbo a 2,3 se obvykle aduje na galaktosu na mannosové větvi a 1,6 a kyselina sialová s vazbou a 2,6 se aduje na galaktosu na mannosové větvi a 1,3. Pro zavádění kyseliny sialové do mannosové a 1,6 a mannosové a 1,3 větve jsou nejůčinnější enzymy schopné vyvolávat adici sialové kyseliny (β-galaktosid a 2,3 sialyltranferáza a β-galaktosid a 2,6 sialyltransferáza).

Pro produkci rekombinantních glykoproteinů, včetně rekombinantního erythropoietinu, se jako hostitelských buněk obvykle používá buněk z ovarií čínského křečka (CHO), které jsou deficientní na dihydrofolát reduktázu (DHFR). Tyto buňky neexprimují enzym β-galaktosid a 2,6 sialyltransferázu, a proto neadují kyselinu sialovou s vazbou a 2,6 kN-vázaným oligosacharidům glykoproteinů produkovaných v těchto buňkách (Mutsaers et al., Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); Takeuchi et al.., J. Chromatogr. 400, 207 (1987)). V důsledku toho rekombinantní erythropoietin produkovaný v buňkách CHO neobsahuje kyselinu sialovou s vazbou 2,6 ke galaktose (Sasaki et al. (1987), výše uvedená citace; Takeuchi et al. (1987) výše uvedená citace)).

V dalším provedení tohoto vynálezu se humánní erythropoietin nebo analog erythropoietinu produkuje v buňkách CHO, které jsou transfekovány funkčním genem β-galaktosid a 2,6 sialyltransferázy, za účelem zavedení kyseliny sialové do galaktosy s vazbou a 2,6. Výsledné izoformy budou obsahovat kyselinu sialovou vázanou ke galaktose jak vazbou a 2,3, tak vazbou an 2,6. Popis technik, kterými se vytvářejí modifikované buňky CHO nebo jiné hostitelské savčí buňky je uveden v Lee et al., J. Biol. Chem. 264,13 848 (1989).

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství specifické izoformy nebo směsi izoforem v kombinaci s vhodným ředidlem, pomocnou látkou a/nebo nosičem užitečným při léčbě erythropoietinem. Do rozsahu vynálezu spadají též farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství analogu erythropoietinu spolu s vhodným ředidlem, pomocnou látkou a/nebo nosičem. Pod označením „terapeuticky účinné množství, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí množství, s nímž se za daných podmínek a při daném režimu podávání dosáhne terapeutického účinku. Izoformy humánního erythropoietinu nebo analogy erythropoietinu se přednostně podávají parenterální cestou. Konkrétní cesta podávání bude závist na léčené chorobě. Izoformy humánního erythropoietinu nebo analogy erythropoietinu se přednostně podávají ve formě prostředku obsahujícího vhodný nosič, jako je humánní sérový albumin, vhodné ředidlo, jako je pufrovaný roztok chloridu sodného a/nebo vhodný adjuvans. Za požadovanou dávku bude považována dávka postačující pro

-10CZ 291229 B6 zvýšení hematokritu léčených pacientů. Tato dávka se bude měnit v závislosti na závažnosti léčené choroby, použitém způsobu podávání apod.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter, a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. Jako erythropoietinového standardu se při biologických zkouškách in vivo popsaných v příkladech používá rekombinantního erythropoietinového standardu standardizovaného proti částečně purifikovanému erythropoietinovému standardu z moči. Měří se tedy pouze relativní specifická účinnost in vivo. Specifická účinnost in vivo je proto také vyjadřována v ..jednotkách/ml“, ,jednotkách/mg“ a jednotkách/A₂8o a nikoliv v jednotkách „IU/ml“, ..RJ/mg a „IU/A_2g0“, poněvadž použitý erythropoietinový standard nebyl přímo korelován s žádným existujícím mezinárodním standardem.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace izoforem rekombinantního erythropoietinu

Rekombinantní erythropoietin se vyrobí způsobem popsaným v publikaci Lin, uvedené výše. Rekombinantní erythropoietin použitý jako výchozí látka pro první a třetí izolaci izoformy se purifikuje způsobem popsaným v příkladu 2 publikace Lai et al., uvedené výše. Výchozí látka pro druhou a pátou izolaci izoformy se purifikuje způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Lai et al., který je modifikován tím, že se použije chromatografie na Q-Sepharose. Tyto přípravky obsahují směsi izoforem rekombinantního erythropoietinu se stejnou aminokyselinovou sekvencí, jako má humánní erythropoietin získaný z moči a převážně obsahují izoformy 9 až 14. Výchozí materiál pro čtvrtý preparativní postup pro získání izoformy představuje materiál eluovaný během promývání sloupce anexu z příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. 5mM kyselinou octovou/lmM elycerinem/6M močovinou. Tato frakce obsahuje izomery s počtem zbytků sialové kyseliny 9 nebo nižším a dále se před použitím na preparativní izoelektrickou fokusaci purifikuje gelovou filtrační chromatografií popsanou v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. Při šesté přípravě izoformy se jako výchozího materiálu používá purifikovaného rekombinantního erythropoietinu s obsahem 4 až 13 zbytků kyseliny sialové. Tento materiál se purifikuje způsobem popsaným v přikladu 2 publikace Lai et al., uvedené výše, pouze s tím rozdílem, že se modifikuje zpracování ionexového sloupce (eluce rekombinantního erythropoietinu se provádí gradientem chloridu sodného při pH 8,4 a vypustí se promývání kyselinou octovou/močovinou. Při tomto se dosáhne retence většiny izoforem obsažených ve výchozím materiálu.

Při šesti různých preparativních postupech pro získání jednotlivých izoforem se použije preparativní izoelektrické fokusace v granulovaném gelovém loži (Ultrodex LKB). Tyto postupy se provádějí v podstatě stejně jako je to uvedeno v poznámce LKB Application Notě 198. Používá se amfolytů Pharmalyte 2,5-5 (Pharmacia a použité gelové lože obsahuje 5M močovinu.

Při první přípravě se přibližně 20 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,8 ml 20mM citranu sodného/lOOmM chloridu sodného o pH 7,0 nanese na gel a přibližně 16 hodin fokusuje při výkonu 8 W. Po izoelektrické fokusaci se pásy izoforem na gelu vizualizují přetisknutím gelového lože na papír. Získaný otisk se fixuje máčením v fixačním roztoku (40% methanol/10% kyselina octová/10% TCA/3,5% kyselina sulfosalicylová) při celkem třech výměnách fixační lázně, přičemž zpracování v každé lázni se provádí 10 minut při teplotě místnosti, potom se provede jedna výměna za roztok o složení 40% methanol/10% kyselina octová (zpracování se provádí při teplotě 30 až 60 °C po dobu přibližně 10 minut), pásy se 15 minut barví při 60 °C 0,125% roztokem modři Coomassie Blue R-250/4% methanol/10% kyselina octová, načež se

-11 CZ 291229 B6 provede odbarvení v 7,5% methanolu/10% kyselině octové, aby se zviditelnily oddělené izoformy. Oblast granulovaného gelového lože obsahující izoformy (asi 50 % pryskyřice) se odstraní, smíchá s vodou (asi 16 ml) a suspenze se nalije na misku o rozměrech 14 x 62 cm a odpaří se na čistou hmotnost přibližně 40 g. Vzniklý přípravek se fokusuje podruhé a výše uvedeným způsobem se provede kontaktní otisk gelového lože. Část gelu obsahující každou ze 6 rozeznatelných izoforem se z gelového lože odstraní.

Eluce izoforem z gelu se provede přídavkem roztoku obsahujícího lOmM Tris-HCl o pH 7,0/5mM Chaps ke každé izoformě. Každá vzniklá suspenze se uvede do krátké kolony a eluuje pufrem Tris-Chaps. Eluáty se shromáždí a odděleně aplikují n krátké kolony (konfigurace s otevřenou kolonou) obsahující pryskyřici s obrácenou fází Vydac C4 ekvilibrovanou ve 20% ethanolu/lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Sloupce se postupně vyvíjejí 20% ethanolem/lOmM Tris-HCl o pH 7,0, 35% ethanolem/lOmM Tris-HCl o pH 7,0 a 65% ethanolem/lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Frakce eluovaná 65% ethanolem/lOmM Tris se zředí v poměru 1 : 1 lOmM Tris-HCl o pH 7,0, zkoncentruje a potom se provede výměna pufru (lOmM Tris-HCl o pH 7,0) v mikrokoncentrátoru Centricon-10 (Amicon). Analytická izoelektrická fokusace tohoto přípravu se provádí v podstatě způsobem popsaným v poznámce LKB Technical Notě 250 za použití Servalyte 3-5 amfolinů (Serva) na polyakrylamidovém gelu obsahujícím 5M močovinu.

Při druhém preparativním postupu se přibližně 26 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,5 ml deionizované vody nanese na gel a fokusuje při 2,5 W po dobu 35 minut a při 10 W po dobu asi 17 hodin. Pásy fokusovaného proteinu, které jsou viditelné v gelovém loži se odstraní, a tak se získá celkem 11 produktů. Objem každého z těchto produktů se upraví na 7,5 ml deionizovanou vodou a 20 ml každého z výsledných supematantů se podrobí analytické izoelektrické fokusaci popsané výše. Ke každému z produktů se přidá 5 ml 1,5M Tris-HCl o pH 8,8 a každá ze suspenzí se převede do malé kolony a sloupcem se nechá protéci kapalná fáze. Pryskyřice se promyje přibližně 3 objemy sloupce 0,5M Tris-HCl o pH 7 a promývací roztok se spojí s eluátem. Spojené eluáty se zkoncentrují a provede se výměna pufru za 20mM citran sodný/lOOmM chlorid sodný o pH 7,0 za použití ultrafiltračního zařízení pro jedno použití (Amicon) se vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton. Zkoncetrované roztoky (přibližně 0,5 ml) se potom nechají projít filtrem z acetátu celulózy s vylučovací mezí 0,22 pm. Pomocí analytické izoelektrické fokusace se zjistí, že 5 produktů obsahuje převážně vždy jedinou izoformu 10, 11, 12, 13 a 14.

Při třetím preparativním postupu se přibližně 30 mg rekombinantního erythropoietinu ve 21,8 ml destilované vody nanese na gel a provede se fokusace 25 minut při 2 W, 20 hodin při 10 W a 15 minut při 15 W. Pásy proteinu odpovídající jednotlivým izoformám se zjistí vizuálně a odstraní z gelového lože. K izoformám izolovaným na gelu se přidá destilovaná voda, čímž vznikne suspenze a výsledné supematanty se analyzují analytickou izoelektrickou fokusaci. Ke každé suspenzi se přidá stejný objem 1M Tris-HCl o pH 7,2, suspenze se převedou do separátních krátkých kolon a kapalná fáze se nechá protéci kolonou, aby se eluovaly izoformy. Každý eluát se zkoncentruje, provede se výměna pufru na 20mM citran sodný/lOOmM chlorid sodný o pH 7,0 za použití ultrafiltračního zařízení pro jedno použití (Amicon) s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton. Pomocí analytické izoelektrické fokusace se zjistí, že byly získány produkty obsahující převážně jednotlivé izoformy 9,10,11,12,13 a 14.

Při čtvrtém preparativním postupu pro získání izoforem se jako výchozího materiálu použije erythropoietinu obsahujícího izoformy 3 až 9 (vyrobeného výše popsaným způsobem). Před preparativní izoelektrickou fokusaci, která se provádí v podstatě způsobem popsaným v souvislosti s preparativními postupy 1 až 3, se amfolyty (Pharmalyte 2,5-5) prefrakcionující v izoelektrické fokusační cele s kapalnou fází Rotofor (Bio-Rad, Richmond, Kalifornie, USA), aby se získalo amfolytové rozmezí vhodnější pro nižší izoelektrické body výchozího materiálu. Prefrakcionace se provádí ta, že se 6,7 ml Pharmalyte 2,5-5 smíchá s 15 g močoviny a objem směsi se purifikovanou vodou doplní na 50 ml. Vzniklá směs se frakcionuje v zařízení Rotofor při 10 W, teplotě 1 °C po dobu 5,5 hodiny za použití 0,lM kyseliny fosforečné, jako anolytu

-12CZ 291229 B6 aO,lM hydroxidu sodného, jako katolytu. Amfolytové frakce s naměřenými hodnotami v rozmezí od 4,5 do asi 6 se použijí na izoelektrickou fokusaci v plochém loži.

Amfolyty se odstraní z izoforem za použití zařízení Centrieluter (Amicon, Danvers, Massachusetts, USA) a za použití zařízení Centricon s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton (Amicon). Přitom se pracuje za těchto podmínek: 0,18 Tris-pufr o pH 8,8, 100 V, 25 až 30 mA, 3 použití zařízení Centrieluter (Amicon, Danvers, Massachusetts, USA) a za použití zařízení Centricon s vy lučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton (Amicon). Přitom se pracuje za těchto podmínek: 0,18 Tris-pufr o pH 8,8, 100 V, 25 až 30 mA, 3 hodiny. U izoforem se provede výměna pufru (0,lM chlorid sodný) pomocí gelové filtrace za použití náplně Sephadex G-25 (Pharmacia). Analytická izoelektrická fokusace 5 výsledných produktů ukazuje, že tyto produkty obsahují izoformy 4, 5, 6, 7 a 8. Izoforma 4 přechází ve formě několika pásů, což ukazuje, že u ní mohla proběhnout v určitém rozsahu degradace.

Pátý preparativní postup pro získání izoforem se modifikuje zařízením prefokusačního stupně do izoelektrického fokusačního postupu na plochém loži. Při této modifikaci se protein nepřidá ke směsi amfolytu, močoviny a gelu před elektroforézo, ale zavede se do izoelektrického fokusačního zařízení po vytvoření gradientu pH v gelovém loži. Po provedení prefokusace (75 minut, 1 500 Volt-hodin) se úsek gelového lože v rozmezí od 2,25 do 4,25 cm od katody vyjme, smíchá s roztokem erythropoietinu a vrátí zpět do gelového lože. Po izoelektrické fokusaci se z gelového lože izolují izoformy 10, 11, 12, 13 a 14 a oddělí se od amfolytů ultrafiltraci za použití zařízení Centricon-10 (Amicon).

Modifikace prefokusací se provádí z toho důvodu, aby se charakteristiky ultrafialové absorbance izoformových přípravků připodobnily charakteristikám výchozího rekombinantního erythropoietinu. Toto zlepšení spektrálních charakteristik je zřejmé z poměru absorbance izolovaných izoforem při 28 a 260 nm. Průměrný poměr absorbance při 280 nm k absorpci při 260 nm, (A280/A260) u izoforem z preparativních postupů 2 a 3 (bez prefokusace) je 1,36 ± 0,11, zatímco průměrný poměr A₂₈o/A26o u preparativních postupů 5 a 6 (s prefokusací) je 1,68 ± 0,20. Když se z výpočtu vyloučí izoforma č. 14, dosáhne se průměrného poměru A₂8o/A₂6o v případě preparativních postupů 5 a 6 hodnoty 1,74 ± 0,09 (izoforma 14 má možná nejvíce atypické spektrum, poněvadž je přítomna v nejmenším množství a je tedy náchylnější k interferencím stopovými nečistotami složek amfolytu nebo z toho důvodu, že je nejbližší elektrodě v průběhu izoelektrické fokusace na plochém loži. Průměrná hodnota poměru A₂8o/A₂6o pro rekombinantní erythrpoietin vyrobený podle příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. (za použití modifikace popsané výše, která spočívá v tom, že se jako anoxové pryskyřice použije 0-Sepharose) je 1,91 ±0,04.

Jak již bylo uvedeno výše, výchozím materiálem pro šestý preparativní postup pro výrobu izoforem je rekombinantní erythropoietinový přípravek obsahující izoformy 4 až 13. Amfolyty se prefokusují v zařízení Rotofor tak, jako v případě čtvrtého přípravku. Frakce amfolytu s naměřenými hodnotami pH v rozmezí 3,7 až 4,8 se podrobí izoelektrické fokusaci na plochém loži. Ploché lože se prefokusuje tak, jako v případě pátého preparativního postupu a po ultrafiltraci (Centricon 10) pro odstranění nosičových amfolyfů se získají izoformy č. 9, 10, 11, 12 a 13.

Příklad 2

Obsah kyseliny sialové v izoformách rekombinantního erythropoietinu

U izoforem izolovaných způsobem popsaným v příkladu 1 a erythropoietinu purifikovaného způsoby popsanými ve výše uvedené publikaci Lai et al. (směs izoforem 9 a 14) se provede výměna pufru za použití 0,10 až 0,15M chloridu sodného a provede se analýza na obsah kyseliny sialové za použití modifikovaného postupu popsaného v Jourdian et al., J. Biol. Chem. 246, 430

-13CZ 291229 B6 (1961). Zbytky kyseliny sialové se odštěpí od glykoproteinů hydrolýzou pomocí 0,3 5M kyseliny sírové (80 °C, 30 minut) a vzniklé roztoky se neutralizují před analýzou hydroxidem sodným. Za účelem odhadu množství přítomného erythropoietinového proteinu se provede Bradfordovo stanovení proteinů (Bradfor, Anal. Biochbem. 72, 248 (1976) za použití rekombinantního erythropoietinu s aminokyselinovou sekvencí humánního erythropoietinu, jako standardu. Použije se zkouškových činidel a mikrometody Bio-Rad. Výsledky vyjádřené v mol kyseliny sialové na mol erythropoietinu jsou zřejmé z tabulky 1. Izoformy se označí podle počtu zbytků sialové kyseliny na molekule a vykazují rozmezí od nejméně kyselých (izoforem 9) do nejkyselejšich (izoforma 13).

Izoformy 9 až 13 jsou přítomny v gelových druhách 6 až 10 (viz obr. 1). Množství izoformy 14 není dostatečné pro přesné změření obalu kyseliny sialové. Obsah kyseliny sialové v této izoformě se dedukuje na základě migrace této izoformy na IEF gelech vzhledem k ostatním izoformám. Obsah kyseliny sialové v izoformách 5 až 8 (přípravek č. 4) nebyl měřen, ale podobně se dedukuje na základě migrace na IEF gelech.

Tabulka 1

Izoforma erythropoietinu	Obsah ky selina sialové [mol/mol erythropoietinu]
izoforma 13 izoforma 12 izoforma 11 izoforma 10 izoforma 9 směs izoforem (9 až 14)	12,9 ±0,5 11,8 ±0,2 11,0 ±0,2 9.8 ± 0,3 8.9 ± 0,6 11,3 ±0,2

Příklad 3

Účinnost izoforem rekombinantního erythropoietinu

Izoformy izolované způsobem popsaným v příkladu 1 se zkoušejí postupem používajícím absorbanci při 280 nm, Bradfordovým stanovením proteinů a metodou RIA pro erythropoietin, aby se zjistilo množství přítomného rekombinantního erythropoietinu. Pro stanovení relativní biologické účinnosti in vivo se použije exhypoxického polycytochemického biostanovení na myších (Cotes et al., Nátuře, 1991, 1065 (1961)). Při kvantitativním stanovení množství přítomného erythropoietinového proteinu za použití radioimunoeseje pro erythropoietin se u některých izoforem naměří vyšší relativní specifické účinnosti in vivo v důsledku zřejmě snížené imunoreaktivity imunoforem obsahujících velké množství kyseliny sialové, což vede k podhodnocení koncentrace erythropoietinu, a tedy nadhodnocení relativní specifické účinnosti in vivo u většiny negativních izoforem. Výsledky biostanovení na myších, vyjádřené vjednotkách/ml, se dělí odpovídajícími koncentracemi proteinu, přičemž se získají specifické účinnosti in vivo vyjádřené v jednotkách/mg erythropietinového polypeptidů. Hodnoty specifické účinnosti jsou uvedeny v tabulce 2.

V tabulce 2 znamená index „n“ počet nezávislých izoformových přípravků jejichž výsledky přispívají k výsledné hodnotě specifické účinnosti. Ve většině případů bylo s každým izoformovým přípravkem provedeno několik stanovení in vivo. Stejná data in vivo přispívají k výpočtům specifické účinnosti ve všech třech sloupcích. Obsah erythropoietinového polypeptidů v jednotkách/mg se stanoví na základě absorbance při 280 nm, na základě potence při radioimunoseji nebo s výsledků Bradfordova stanovení proteinu. Jako standardu pro Bradfordovo stanovení proteinů se používá purifikovaného rekombinantního erythropoietinu obsahujícího izoformy 9 až 14. Hodnota indexu „n“ může být u výpočtů pořízených za použití

- 14CZ 291229 B6 dat z Bradfordova stanovení proteinů nižší, poněvadž některé přípravky již v době provádění Bradfordova stanovení nebyly k dispozici.

Jako standardu pro radioimunoeseje a po stanovení in vivo se používá erythropoietinu purifikovaného způsoby popsanými v Lai et al. (výše uvedená publikace), kteiý obsahuje směs izoforem 9 až 14.

Hodnoty relativní specifické účinnosti, které jsou vyjádřeny v jednotkách/mg (U/mg) erythropoietinového polypeptidu, je možno provést na jednotky/A₂₈₀ vynásobením hodnotou 0,807 mg erythropietinového polypeptidu/A₂₈₀. Tento převodní faktor se získá vynásobením extinkčního koeficientu pro erythropoietin (1,345 mg/A₂₈₀) obsahem proteinu v erythropietinovém glykoproteinu (přibližně 60% hmotnostních, Davis et al., Biochemistry, 26, 2633 (1987)) a tím se získá hodnota v mg erythropoietinového polypeptidu/A₂₈o (tj. 1,345 mg erythropietinu/A₂₈o x 0,60 A₂₈o). Kromě toho je možno hodnoty specifické účinnosti vyjádřené v jednotkách/mg erythropoietinového polypeptidu vynásobit faktorem 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinového glykoproteinu, a tím se získají hodnoty specifické účinnosti vyjádřené v jednotkách/mg erythropoietinového glykoproteinu.

Tabulka 2

Izoforma	Polypeptid (U/mg) Bradrordovo	Polypeptid (U/mg) (na základě A28o)
stanovení proterinu	n
14	289 400 ±3 100	2	205 800 ± 37 700
13	307 600 ± 30 600	4	258 700 ±59 500
12	275 200 ± 55 600	4	258 400 ±41 700
11	282 700 ±41 100	3	255 800 ±67 300
10	188 000 ± 1 900	1	170 300 ±34 500
9	-		96 600 ± 46 700
8	65 200 ± 3 800	1	70 600 ±4 100
7	46 200 ± 5 800	1	50 300 ±6 300
5	16 600 ± 1 700	1	18 300 ± 1 900

n

Polypeptid (na základě (U/mg)

366 700 ± 55 9002

337 200 ±40 2005

287 700 ± 42 6005

251 400 ±62 7004

171 900 ±31 6003

113 600 ±39 6002

61 000 ±3 5001

42 800 ± 5 4001

15 500± 1 6001

Data uvedená v tabulce 2 jsou také zpracována graficky na obr. 2A, 2B a 2C. Tato data ukazují, že relativní účinnost erythropoietinu in vivo stoupá v závislosti na obsahu kyseliny sialové až do izoformy č. 111. Izoformy 11 až 14 ukazují v podstatě stejnou relativní biologickou účinnost invivo (to je nejzjevnější, když se koncentrace izoformy 14 vyjádří za použití hodnoty z Bradfordova stanovení. Bradfordova hodnota může být pro izoformu 14 přesnější s ohledem na obecně nízkou dosažnou koncentraci a v důsledku toho na obtížnost stanovení A₂₈o a nejzjevněji sníženou reaktivitu při RIA u velmi negativních forem, viz výše uvedená diskuse.) Vyšší relativní specifická účinnost in vivo izoforem erythropoietinu s větším množstvím sialové kyseliny je nejpravděpodobněji způsobena delším poločasem životnosti těchto forem v oběhu. Izoformy 9 a 13 byly označeny radioaktivním jódem (¹²⁵I) a byla změřena jejich rychlost clearance u krysy. Poločas životnosti v oběhu je v případě izoformy 13 podstatně delší než v případě izoformy 9.

Příklad 4

Selekce směsí izoforem rekombinantního erythropoietinu chromatografií na Q-Sepharose

Média zpracovaná buňkami produkujícími rekombinantní erythropietin (získaná postupy popsanými ve výše uvedené publikaci Lin) se zkoncentrují a diafiltrují proti lOmM Tris o pH 7,2. Koncentrace proteinu se stanoví Bradfordovým proteinovým mikrostanovením za použití hovězího sérového albuminu jako standardu. K 19,6 ml roztoku obsahujícího 40 mg celkového

-15CZ 291229 B6 proteinu se přidá síran měďnatý do koncentrace 20μΜ, roztok se přefiltruje přes filtr s vylučovací mezí 0,45 pm a nanese na sloupec (1,05 cm - výška; 2,2 cm - průměr) obsahující 4ml lože náplně O sepharose Fast Flow (Pharmacia) ekvilibrované s lOmM Tris o pH 6,8 až 7,0 při 4 °C. Po nanesení vzorku se sloupec promyje dvěma objemy sloupce stejného pufru. Průtok sloupcem je přibližně 1 ml/min. Při tomto postupu se pro selekci definovaných směsí izoforem erythropoietinu použije 6 oddělených kolon.

Kolony se promyjí 6 až 9 objemy sloupce pufru s nízkým pH, který se v případě kolony 1 skládá z 150mM kyseliny octovém lmM glycinu, 20pM síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 2 z 200mM kyseliny octové, lmM glycinu, 20μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 3 z 250mM kyseliny octové, lmM glycinu, 20μΜ síranu měďnatého a6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 4 z 300mM kyseliny octové, lmM glycinu, 20μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 5 z 150mM kyseliny octové, lmM glycinu, 20μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny a v případě kolony 6 z 300mM kyseliny octové, lmM glycinu, 20μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny. Hodnota pH v kolonách se zvýší na asi pH 7 promytím každé kolony 8 až 11 objemy sloupce lOmM Tris-HCl, 55mM chloridu sodného, 20μΜ síranu měďnatého o pH 7. Definované směsi izoforem erythropoietinu se eluují ze sloupců promytím lOmM Tris-HCl, 140mM chloridem sodným a 20μΜ síranem měďnatým o pH 7,0.

Eluované izoformy produkty z každé kolony se zkoncentrují a rozpouštědlo se vymění za vodu za použití mikrokonentrátoru Centricon-10 (Amicon). Výsledky analytické izoelektrické fokusace těchto zkoncentrovaných produktů jsou uvedeny na obr. 3. V gelových drahách 1 až 6 jsou v uvedeném pořadí obsaženy definované směsi izoforem erythropoietinu eluované ze sloupců 1 až 6. Směs izoforem obsažená v gelové dráze u levého okraje obr. 3 představuje buněčné médium aplikované na sloupec Q-Sepharose popsaný výše, přičemž sloupec je promyt 5mM kyselinou octovou, lmM glycinem, 20μΜ síranem měďnatým, 6M močovinou a směs izoforem erythropoietinu je eluována ze sloupce za použití výše popsaných postupů. Tato eluovaná směs izoforem se dále purifikuje způsoby popsanými ve výše citované publikaci Lai et al. před prováděním analytické izoelektrické fokusace.

Příklad 5

Frakcionace izoforem rekombinantního erythropoietinu za použití gradientu s nízkou hodnotou pH na Q-Sepharose

Při dalším postupu se izoformy erythropoietinu dělí za použití gradientu s klesající hodnotou pH a stoupající iontovou silou. Koncentrované diafiltrované médium obsahující erythropoietin se nanese na sloupec Q-Sepharos v přibližném poměru 40 mg celkového proteinu na ml gelu. Potom se sloupec promyje přibližně 2 objemy sloupce 10 mM Tris-HCl o pH 7,0 a následně přibližně 10 objemy sloupce 2mM kyseliny octové/lmM glycinu/20pM síranu měďnatého/6M močoviny (o pH přibližně 4,8), aby se odstranily kontaminační proteiny a izoformy erythropoietinu obsahující méně než asi 7 zbytků kyseliny sialové. Izoformy obsahující přibližně 8 až 12 zbytků kyseliny sialové se eluují ze sloupce za použití gradientu od přibližně 2mM kyseliny octové v 6M močovině/lmM glycinu/20pM síranu měďnatém do 40mM kyseliny octové v 6M močovině/lmM glycinu/20pM síranu měďnatém (o pH přibližně 4). Celkový objem gradientu je přibližně 40 objemů sloupce a sbírají se frakce o přibližném objemu jednoho sloupce do nádob obsahujících Tris pufr v objemu postačujícím pro úpravu pH na hodnotu v rozmezí od 6 do 8,5, aby se zabránilo dlouhodobé expozici zachycených frakcí nízké hodnotě pH. Dělení se monitoruje analytickou izoelektrickou fokusací alikvotních vzorků frakcí. Na obr. 4 je znázorněno dělení izoforem 8 až 11, které lze tímto postupem provést. Izoformy 12 až 14, které

-16CZ 291229 B6 zůstanou po skončení gradientově eluce vázány ke sloupci, se eluují promytím pufrem obsahujícím lOmM Tris-HCl, 140mM chlorid sodný a 20mM síran měďnatý (o pH 7,0). Izoformy (oddělené gradientovou eluci nebo eluované roztokem chloridu sodného) se zbaví kontaminačních proteinů chromatografií na obrácených fázích a následnou gelovou chromatografií (viz příklad 2 výše uvedené publikace Lai et al.).

Příklad 6

Konstrukce analogů humánního erythropoietinu

Existující místa připojení uhlohydrátových zbytků v aminokyselinové sekvenci humánního erythropoietinu jsou uvedena na obr. 5 (SEQ ID. NO: 26). Postupy, kterými se vytvářejí přídavná glykosylační místa v erythropoietinu, jsou souhrnně uvedeny na obr. 6A až 6C a jsou popsány dále.

Pro použití při in vitro mutagenezi se syntetizují následující oligonukleotidové příměry.

[Asn⁴, Ser⁶] EPO: 5' CGCCCACCAAAQCTCAGCTGTGACAGCCGA 3' (SEQ ID NO: 1) [Asn9, Sérii] EPO: 5' ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3’ (SEQ ID. NO: 2) [Ash69j _ep0; 5» GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3' (SEQ ID. NO: 3) [Asn¹²⁴] EPO: 5’ TCCCCTCCAGATAAZGCCTCAGCTGC 3’ (SEQ ID. NO: 4) [Asni25_z Serl27] EPO: 5' CAGATGCGAACTCAI£ZGCTCCAC 3’ (SEQ ID. NO: 5) [Asni^fi3, SerifiS] _EPO: 5' AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTG 3' (SEQ ID. NO: 6) [Thrl25] EPO: 5’ TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3’ (SEQ ID. NO: 7) [Prol²⁴, Thri25] _EPo_: 5‘ CCTCCAGATQCGACCTCAGCTGC 3' (SEQ ID. NO: 8)

Podtržené kodony ukazují chybně párované oblasti, v nichž aminokyseliny uvedené v závorkách nahrazují aminokyseliny divokého typu.

Produkt [Asn⁴, Ser⁶]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 4. Produkt [Asn⁹, Serⁿ]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 9. Produkt [Asn⁶⁹]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 69. Produkt [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 125. Produkty [Thr¹²⁵]EPO a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EO se zkonstruují za účelem zavedení přídavného O-glykosylačního místa do Thr125.

-17CZ 291229 B6

Pro použití při in vivo mutagenezi se syntetizují následující oligonukleotidové primery.

[Asn⁶⁹, Thr⁷¹] EPO: 5' GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3' (SEQ ID. NO: 9) [Ser⁶⁸, Asn⁶⁹, Thr⁷¹] EPO:

5' CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3' (SEQ ID. NO: 10) [Asn¹³⁵, Thr¹³⁷] EPO: 5' CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3' (SEQ ID. NO: 11) [Asn¹³⁵, Thr¹²⁷] EPO:

5' ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3' (SEQ ID. NO: 12) [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO:

5' CCAGATCCAAATTTCATCTGCTCCACTC 3' (SEQ ID. NO: 13) [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO:

5' CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3' (SEQ ID. NO: 14) [Thr¹²⁵, Thr¹²⁶] EPO: 5' CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3' (SEQ ID. NO: 15) [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹] EPO

Pomocí [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO cDNA, jako výchozí látky se oligonukleotidový primer 5-AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3' (SEQ ID: NO: 16) převed na [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶] EPO. Oligonukleotidového primeru 5' TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3' (SEQ ID. NO: 17) se potom použije pro vytvoření [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹]EPO.

Produkty [Asn⁶⁹, Thr⁷¹]EPO a [Ser⁶⁸, Asn⁶⁹, Thr⁷¹]EPO se zkonstruují za účelem zavedení N-glykosylaČního místa do Asn 69 a pro zvýšení stupně N-glykosylace v tomto místě. Produkty [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷]EPO, [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷, Thr¹³¹]EPO, [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷]Epo a [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Thr¹²⁷]EPO se zkonstruují za účelem zavedení N-glykosylačního místa do Asn 125 a pro zvýšení stupně glykosylace v tomto místě. Produkty [Thr¹²⁵, Thr¹²⁶]EPO a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Ser¹³¹] EPO se zkonstruují za účelem zavedení přídavného O-glykosylačního místa do Thr¹²⁵ a za účelem zvýšení glykosylace v tomto místě.

Zdrojem erythropoietinové DNA pro in vitro mutagenezi je plazmid Hul3, což je klon humánní erythropoietinové cDNA vpUC 8 (Law et al., Proč. Nalt. Acad. Sci. 83, 6920 (1986)). Plazmidová DNA získaná z Hul3 se štěpí restrikčními enzymy BstEII a BglII, vzniklé fragmenty DNA se podrobí elektroforéze na agarózovém gelu a fragment erythropoietinové DNA o délce 810 bázových párů (bp) se izoluje z gelu za použití soustavy GeneClean^(R) a postupů poskytnutých výrobcem (BIO 101, lne.). Plazmid pBRgHuEPO obsahuje genomový gen erythropoietinu, jakožto fragment BamHI vložený do derivátu pBR322 (použitý způsobem je popsán ve výše citovaném patentu, původce Lin). pBRgHuEPO se také štěpí BstEII a BglII a izoluje se vektorový fragment o délce 6 517 bp. Ligací těchto dvou fragmentů se získá IGT1. Při konstrukci pEC-1 se pDSVL (který je popsán ve výše uvedeném Línově patentu a který je znázorněn na obr. 5B) štěpí BamHI a liguje se do něj izolovaný 2,8kb fragment BamHI zIGTl obsahující erythropoietinovou cDNA.

-18CZ 291229 B6

Pro vytvoření jednořetězcové DNA pro in vitro mutagenezi se pEC-1 štěpí BamHI a BglII a izoluje se 820pb fragment erythropoietinové cDNA. Tento fragment se liguje do místa BamHI ml3mpl8 za vzniku ml3-EC-l. Jednořetězcová DNA se získá ze supernatantů E. coli kmene RZ1032, který byl infikován ml3-EC-l způsobem popsaným vKunkel et al., Methods in Enzymol. 154, 367 (1987) a Messing, Methods in Enzymol 101, 20 (1983). Pro in vitro mutagenezi se přibližně 1 pg jednořetězcová DNA a 0,2 pmol jednoho ze syntetických primerů popsaných výše smíchá se 6 μΐ pufru (250mM Tris o pH 7,8, 50mM chlorid hořečnatý a 50mM dithiothreiotol). Teplotní hybridizace primeru k teplotám se provede tak, že se reakční objem doplní vodou do 10 μΐ, smě se 5 minut zahřívá na 65 °C a potom se nechá zchladnout na teplotu místnosti. Prodlužovací reakce se provede přídavkem vždy 2,5 μΐ dTTP, dATP, dGTP, dCTP a ATP (vždy o koncentraci 10μΜ) a následným přídavkem 1 μΐ (1 jednotky) E. coli DNA polymerázy (Klenowův fragment) 1 1 μΐ (1 jednotky) T4 DNA ligasy. Směs se inkubuje přes noc při 14 °C a použije sejí pro transformaci E. coli kmene JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103 (1985)) způsobem popsaným ve výše uvedené Messingově publikaci.

Pro identifikaci mutantních klonů diferenciální hybridizací se plaky na živném agaru přenesou na fíty Gene Screen (New England Nuclear). Filtry se usuší pod infralampou a potom jednu hodinu inkubují v 6x SSC s obsahem 1% SDS při 60 °C. Pro hybridizací se výše uvedený oligonukleotidový primer (8 pmol) označí na konci T4 polynukleotid kinázou a gamma ³²P-značeným ATP a inkubuje s filtry přes noc v 6x SSC, 0,5% SDS a lOOmg/ml DNA lososího spermatu při 37 °C, a účelem mutace [Asn¹²⁴], při 55 °C, za účelem mutace [Asn⁴, Ser⁶], při 65 °C za účelem mutací [Thr¹²⁵] a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] a při 70 °C za účelem mutací [Asn⁹, Ser¹¹] a [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵]. Následující den se filtry třikrát promyjí 6x SSC při teplotě místnosti a provede se autoradiografie. Je-li to zapotřebí, promyjí se filtráty 6x SSC při postupně se zvyšující teplotě, až již není pozorována žádná, nebo je pozorována jen malá hybridizace k plakům se sekvencí erythropoietinové cDNA divokého typu. Klony poskytující pozitivní hybridizační signály za těchto podmínek se identifikují a retransfekují do JMI09, za účelem izolace čistého klonu. Dideoxy-analýza terminace řetězců ukazuje, že jsou přítomny mutace na asparaginový, serinový, threoninový a prolinový zbytek.

Vyvařovací metodou (Holmes et al., Anal. Biochem. 117, 193 (1981)) se z transfekovaných buněk JMI09 získají dvouřetězcové ml3 EC-1 DNA obsahující změny [Asn⁴, Ser⁶], [Asn⁹, Ser¹¹], [Asn⁶⁹], [Asn¹²⁴], [Asn¹²⁵], [Ser¹²⁷], [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵], [Thr¹²⁵] a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]. Tyto DNA se štěpí BstEII a XhoII a izolují se 810bp fragmenty erythropoietinové DNA. pEC-1 se štěpí BstEII a potom částečně BglII a 5'-konce výsledných fragmentů se defosforylují bakteriální alkalickou fosfatázou v lOmM tris o pH 8 při 60 °C v průběhu 60 minut. Vektorový fragment o délce 7 kb, který neobsahuje 810bp fragment BstEII—BglII, se izoluje a liguje k erythropoietinovým fragmentům popsaným výše. Výsledné plazmidy (označené pEC-X, kde X je číslo analogu) obsahují DNA kódující analogy erythropoietinu se změněnými aminokyselinovými zbytky v vedených polohách.

Alternativně se zkonstruuje analog erythropoietinu (pEC34) in vitro mutagenezi, při níž se deletují aminokyselinové zbytky 41 až 55. Přitom vznikne menší (775 bp) fragment BstEII-BglII obsahující EPO. Tento fragment se výše uvedeným způsobem vloží do pECl. Za účelem klonování analogů erythropoietinu se pEC34 štěpí bstEII, částečně štěpí BglII, defosforyluje a vektor se izoluje (tento způsobe je popsán výše). Vektorový fragment o délce 7 kb se potom liguje k fragmentům erythropoietinu, jak je to popsáno výše. Klonováni s pEC34 umožňuje snadné rozlišení mezi rekombinanty a jednoduchým novým uzavřením. Pouhým novým uzavřením vzniká menší fragment BstEII-BglII než jsou analogy, což lze snadno rozlišit na agarózovém gelu.

Těchto obecných postupů se použije pro konstrukci analogů erythropoietinu, které jsou uvedeny v tabulkách 3, 4 a 5. U každého analogu jsou uvedeny změny sekvence DNA; jinak mají

-19CZ 291229 B6 oligonukleotidové primery použité na mutagenezi sekvenci, která je komplementární k humánnímu erythropoietinu.

Tabulka 3

Analogy erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce

Analog číslo	Substituce aminokyselin	Změny v sekvenci
NI	Asn4Ser6	CGC-» AAC ATC—»AGC
N2	Asn^Ser11	AGC—»AAC GTC—»AGC
N3	Asnl»Thr21	GCC-» AAC GAG—»ACG
N4	Asn30Thr32	GCT—» AAT CAC-4ACG
N5	Asn42	CCA—» AAT
N6	Ser42Asn43Thr45	CCA—»TCA GAC—> AAC AAA—»ACA
N7	Ser4»	TAT—»TCT
N8	Asn»1 Thr 53	TGG—»AAT AGG—»ACG
N9	Asn5?Thr59	GGG—>AAC CAG—>A.CG
N10	Asn6»	CTG—» AAC
Nil	Asn69Thr7i	CTG—> AAC TCG—žACA
N12	Ser68Asn6»Thr71	Nil plus GCC—»TCC
NI 3	Asn88Thr90	TGG—»AAT CCC-4ACC
NI 4	Ser87Asn88Thr90	N13 plus CCG—»TCG
NI 5	Ser87Asn88Thr»0Thr92	N14 plus CAG-4ACG

-20CZ 291229 B6

Analog číslo	Substituce aminokyselin	Změny v sekvenci
NI 6	Ser87Asn88Thr90Alai62	N14 plus AGG—»GCG
N17	Asn88Ser90	TGG—» AAT CCC-žTCC
Ni 8	Val87Asn88Thr90	CCG-*GTG TGG—»AAT CCC—>ACC
NI 9	Ser87Asn88Gly89Thr90	CCG—>TCG TGG-4AAT GAG—> GGG CCC—»ACC
N20	Asn89lle90Thr5i	GAG—> AAC CCC—>ATC CTG—»ACG
N21	Ser87Asn89Ile9°Thr9i	N20 plus CCG—»TCG
N22	Asnii3Thrii5	GGA-4AAC CAG-žACG
N23	Asn118Val121	GCC—> AAC CCT—»GTT
N24	Asni21Ser122Thri23	CCT—> AAT CCA—»TCA GAT—»ACT
N25	Asn*2*	GCG—» AAT
N26	Serl22Asn124	CCA—>TCA GCG-4AAC
N27	Asnl25Ser127	GCC—> AAC GCT-4TCT
N28	Asn125Thr127	GCC—»AAC GCT—>ACG

-21 CZ 291229 B6

tnalog číslo	Substituce aminokyselin	Změny v sekvenci
N29	Leu121Ser122Asn125Thr127	N28 plus CCT-»CTT CCA—>TCA
N30	Thrl20Glyi22Leul23Asnl25Thri27	N28 plus TCC—>ACC CGC—»GGG GAT-3CTC
N31	Asni26seri28	TCA—>AAT GCT—>TCT
N32	Asni26Thrl28vali29	TCA—* AAT GCT—>ACT CCA-4GTA
N33	Leui2iSeri22Asni26Thri28Vali29	N32 plus CCT—K2TT CCA—>TCA
N34	Thr121Glyl23serl25Asnl26Thr128Val129	N32 plus CCT—>ACG GAT-4GGG GCC—>TCC
N35	Seri29Asni30	CCA—»AGC CTC—*AAC
N36	Asni32	ACA—»AAC
N37	Asnl34Thri36	ACT—>AAT GAC—>ACC
N38	Asnl35	GCT—>AAT
N39	Asni36Thr138	GAC—>AAC TTC-4ACC
N40	Asn137Thri39	ACT-4AAT CGC-4ACC
N41	Asn138Thr140	TTC—>AAC AAA—>ACA

-22CZ 291229 B6

Změny v sekvenci

Analog číslo

Substituce aminokyselin

N42

N43

N44

N45

N46

N47

N48

Asn¹⁴⁴

Ser¹⁴³Thr¹⁴⁹Val¹⁵⁰

Gly¹⁴⁸Thr¹⁴⁹

Asn¹⁵⁵

Asn¹⁶³Ser¹⁶⁵

Asn³⁸Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰

GTC—> AAC

TTC-4TCC

CTC-4ACC

CGG-4GTG TTC—>GGC CTC^ACC CTG—> AAT ACA—>AAT

N4 a N18

Nil a N14

-23CZ 291229 B6

Tabulka 4

Analogy erythropoietinu s místy pro O-vázané uhlohydrátové řetězce

Analog číslo	Substituce aminokyselin	Změny v sekvenci
01	Ser6	ATC—»AGC
02	Ser7	TGT—»TCC
03	Ser®	GAC-4AGC
04	Sérii	GTC—>TCT
05	Ser18	GAG-íTCG
06	Ser28	GAG—»TCG
07	Ser29	TGT—>AGC
08	Ser29	TGT-^TCT
09	Ser30	GCT-4TCT
010	Ser33	TGC—>TCA
011	Ser37	GAG—>TCG
012	Ser49	TAT->TCT
013	Ser61	GTA—>TCA
014	Ser63	GTC—>TCC
015	Ser67	CTG—>TCG
016	Ser68	GCC—>TCC
017	Ser70	CTG-4TCG
018	Ser73	GCT—>TCT
019	Ser74	GTC-*TCT
020	Ser75	CTG—>TCG
021	Ser79	GCC—»TCC
022	Ser81	TTG—>TCG
023	Ser86	CAG-4TCG
024	Ser87	CCG—>TCG
025	Ser93	CTG—>TCG
026	Ser98	GCC—>TCC
027	Ser	GTC-»TCC
028	Ser102	CTT—>TCT
029	Ser193	CGC—>AGT

-24CZ 291229 B6

Analog číslo

Substituce aminokyselin

Změny v sekvenci

030	Ser105	CTC—>AGC
031	Seri09	CTT-4TCT
032	Šerm	GCT—>TCT
033	Serii2	CTG—>TCG
034	Serin	GCC-»TCC
035	Ser128	GCT—>TCT
036	Seri59	TCG—> GAG
037	Serisi	TGC—»TCC
038	proi25seri27	GCC->CCC GCT-4TCT
039	Thr62	GAA—>ACA
040	Thr8*	TGG—»ACG
041	Thr88	CAG—>ACG
042	Thr88	TGG—> ACG
043	Thr90	CCC->ACC
044	Thr92	CAG—žACG
045	Thrioo	AGT—žACT
046	ThrliO	CGG—>ACG
047	Thr US	CAG—» ACG
048	Thrl23	GAT—> ACT
049	Thri24	GCG—>ACG
050	Thri25	GCC—>ACC
051	Thri25Serl27	GCC—>ACC GCT—>TCT
052	Thri25Thrl2«	GCC—>ACA TCA—>ACA
053	Thri26	TCA—>ACC
054	Thrl27	GCT-4ACT
055	Thriso	CTC—»ACC

-25CZ 291229 B6

Analog	Substituce	Změny
číslo	aminokyselin	v sekvenci
056	Thrl31	CGA—>ACA
057	Thrl36	GAC-*ACC
058	ThrHO	AAA—»ACA
059	Pro124Thr125	GCG—)CCG
		GCC—>ACC
060	pro124Thr125Thr125	059 plus TCA—>ACC
061		060 plus CGA—^ACA
062	HGG C-terminální prodloužení

Tabulka 5

Analogy erythropoietinu s místy pro N- a O-vázané uhlohydrátové řetězce

Analog číslo	Substituce aminokyselin	Změny v sekvenci
NO1	Ser87Asn88Thr90 HCG C-terminální prodloužení	N14 a 062
NO2	Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 HCG C-terminální prodloužení	N47 a 062

Plazmidy označené pDEC-X (kde X představuje číslo analogu) se zkonstruují insercí erythropoietinové cDNA do pDECdelta, který je derivátem plazmidu pDSa2. Expresní vektor pDSa2 je obecně popsán v mezinárodní přihlášce PCT WO90/14363. pDECdelta se získá z pDSa2 následujícím sledem stupňů:

1) Místo HindlII v pDESa2 se deletuje štěpením pDSa2 DNA HindlII, na lepivé konce

HindlII se působí E. coli DNA polymerázou (Klenowův fragment) a jednotlivými dNTP a provede se religace vektoru s tupými konci. Získá se plazmid pDSa2deltaH.

-26CZ 291229 B6

2) pDSa2deltaH se rozštěpí Sáli a liguje se kněmu syntetický oligonukleotid obsahující sestřižený signál SV40 s Sáli linkerem připojeným k 3'-konci sestřiženého signálu. Syntetický oligonukleotid má následující sekvence (SEW ID. NO: 18):

’ TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGT

CTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCA

AAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGG

AAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3 ’

Výsledným plazmidem se sestřih pDSalIdeltaH.

3) Sestřih pDSalIdeltaH se štěpí Sáli a jeho konce se otupí tím, že se na lepivé konce působí T4 DNA polymerázou a jednotlivými dNTP. Stejnou metodou se otupí konce 820 bp fragmentu BamHI-BglII erythropoietinové cDNA a provede se ligace k plazmidu. Získá se plazmid pDEC-1.

4) Plazmid pDEC se rozštěpí KpnI a PvuII a jeho konce se otupí tím, že se na lepivé konce působí nukleasou z bobu „Mung“. Plazmid se religuje za účelem delece vyštípnutého fragmentu Kpnl-PVuII, čímž vznikne plazmid pDECdelta.

Plazmidy pDEC-X se získají z pDECdelta úplným rozštěpením BstEII a potom částečným rozštěpením BglII. Vektorový fragment neobsahující erythropoietinové kódující sekvence se izoluje a liguje k 810bp fragmentům BstEII—BglII obsahujícím požadovaný plazmid.

Podrobnosti konstrukce některých analogů obsahujících několik aminokyselinových změn jsou popsány dále.

Konstrukce pDEC(N47) a pDEC(N48) pDEC(N47), který obsahuje mutace Asn30 Thr32 Valí87 Asn88 a Thr90 se zkonstruuje z pDEC(N18) a pDEC(N4). pDEC(N18) se rozštěpí HindlI a BglII a izoluje se 445bp fragment. pDEc(N4) se rozštěpí BstEII a HindlII a izoluje se 377bp fragment. Tyto dva fragmenty se ligují do pDECdelta rozštěpeného BstEII a GblII způsobem popsaným výše za vzniku pDEC(N47).

pDEC(N487), který obsahuje mutace Asn69 Thr71 Ser87 Asn88 a Thr90 se zkonstruuje z pDEC(N14) a pDEC(Nl 1). pDEC(N14) se rozštěpí HindlI a BglII a izoluje se 445bp fragment. pDECc(Nll) se rozštěpí BstEII a HindlII a izoluje se 377bp fragment. Tyto dva fragmenty se ligují do pDECdelta rozštěpeného BstEII a BglII způsobem popsaným výše za vzniku pDEC(N48).

Konstrukce pDEC(062) (fůze HCG-erythropoietin) pDEC (062) se složí zpECI a 107bp Stul—BglII linkeru ze syntetické DNA, který obsahuje 28 karboxy-terminálních aminokyselin z humánního chorionického gonatropinu (Ser-Ser-Ser-SerLys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Ser-Asp-Thr-Pro-IleLeu-Pro-Gln (SEQ ID. NO: 25) (Pierce et al. Ann. Rew. Biochem. 50, 465 (1981)). Tento linker má následující sekvenci

-27CZ 291229 B6 ’ CCTGTAGGACAGGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTTC3' GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGAGGGGGGTCGGAAG5' CAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAATGA (SEQ ID. NO: 19)

3' GTTCAGGTAGGGCTGAGGGCCCCGGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGTGTTACTCTAG (SEQ ID. NO: 20) pECI se rozštěpí Stul a BglII a izoluje se 610 bp fragment DNA. Tento syntetický linker se fosforyluje ATP a polynukleotidkinázou a liguje s fragmentem pECI do pDECdelta před tím 5 rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.

Konstrukce pDEC(NOl) pDEC(NOl) se zkonstruuje složením pDEC(062) (HCG-EPO) a pDEC(N14) (Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰). ío pDEC177 se rozštěpí Stul a BglII a pomocí óeneClean^(R) se izoluje 610bp fragment DNA obsahující mutace Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰. pDEC(062) se rozštěpí Stul a BglII a izoluje se fragment o délce 107 bp. Tyto dva fragmenty DNA se ligují do pDECdelta předtím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.

Konstrukce pDEC (NO2) pEC(NO2) se zkonstruuje složením pDEC(062) (HCG-EPO) a pDEC(N47) (Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰). pDEC(N47) se rozštěpí Stul a BglII a pomocí GeneClean^(R) se izoluje 610bp fragment DNA obsahující mutace Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰. pDEC(062) se 20 rozštěpí Stul a BglII a izoluje se fragment o délce 107 bp. Tyto dva fragmenty DNA se ligují do pDECdelta předtím rozštěpeného bstEII a částečně rozštěpeného BG1II způsobem popsaným výše.

Konstrukce pDEC(NO16) Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶² pDEC(N16) se zkonstruuje složením pDEC(N14) (Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰) a pDEC258 (Ala¹⁶²). pDEC258 se zkonstruuje za použití výše popsaných způsobů mutageneze in vitro a v poloze 162 se kodon AGG vymění za kodon GCG. pDEC(N14) se rozštěpí Stul a BglII a pomocí GeneClean^(R) se izoluje 610bp fragment DNA obsahující mutace Ser^Asn^Thr⁹⁰. pDEC(258) se 30 rozštěpí Stul a BglII a izoluje se fragment o délce 210 bp. Tyto dva fragmenty DNA se ligují do pDECdelta předtím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.

-28CZ 291229 B6

Konstrukce pDEC(Rl), (R2) a (R3)

Pro odstranění glykosylačních míst zpDEC(N14) se ml3-EPO(N14) obsahující mutace Ser87, Asn88 a Thr90 podrobí in vitro mutagenezi popsané výše za použití následujících primerů

5’GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3’	GLN24
(SEQ ID. NO: 21)
5' CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC3’	GLN 3 8
(SEQ ID. NO: 22)
5’CTGTTGGTCCAGTCTTCCCAG3’	GLN83
(SEQ ID. NO: 23)

Výsledné plazmidy se označí pDEC(Rl) (Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰, pDEC(R2) (Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰) a pDEC(R3) (Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰). ml3EC-l se také podrobí in vitro mutagenezi za použití výše uvedených oligonukleotidových primerů, a získají se tak pEClO (Gin²⁴) a pEC8 (Gin³⁸). pEC9 (Gin⁸³) se zkonstruuje za použití následujícího primerů

5' CCTGTTGGTCQAQÍCTTCCCAGC3' GLN 8 3 (SEQ ID. NO: 24)

Klony cDNA humánního erythropoietinu a analogy odpovídající [Asn⁴, Ser⁶]EPO, [Asn⁹,SerΙΕΡΟ, [Asn⁶⁹]EPO, [Asn¹²⁴]EPO, [Asn¹²⁵,Ser¹²⁷]EPO, [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵]EPO, [Thr¹²⁵]Epo a [Pro¹²⁴,Thr¹²⁵]Epo a klony cDNA analogů popsaných v tabulkách 3, 4 a 5 se elektroporací přenesou do buněk COS-1 (ATCC č. CRL-1650). Buňky COS-1 se sklidí z semi-onfluentních misek, promyjí médiem (Dulbeccovo modifikované esenciální médium obsahující 5 % fetálního telecího séra a 1 % L-glutaminu/penicilinu/streptomycinu (Irvine Scientific) a resuspendují na koncentraci 4 x 10⁶ buněk/ml. Jeden ml buněk se přenese do elektroporační kyvety (Bio-Rad). Elektroporace se provádí pomocí zařízení Bio-Rad Gene Pulser při kapacitě 25 pF a napětí 1 600 V za přítomnosti 100 až 200 pg nosičové DNA a 2 až 20 pg plazmidové DNA kódující erythropoietinový analog. Elektroporové buňky se přenesou do misek v množství 2 x 10⁶ buněk na misku pro kultivaci tkání o průměru 60 mm s 5 ml média. 2 až 4 hodiny po přenesení do misek se médium nahradí 5 ml čerstvého média. Médium upravené buňkami se oddělí 3 až 5 dnů po elektroporaci.

Příklad 7

Charakterizace analogů erythropoietinu

A. Stanovení adice uhlohydrátu

Objem supematantu obsahující 5 až 21 jednotek z buněk COS tranfekovaných jednotlivými cDNA erythropoietinových analogů popsanými v příkladu 6 se přes noc při teplotě místnosti imunoprecipituje králičí protierythropoietinovou polyklonální protilátkou. 20 až 80 pg 1:1 Protein A-Sepharose v fosfátem pufrovaném roztoku chloridu sodného (PBS) se přidá k imunoprecipitátu a směs se 1 hodinu inkubuje při teplotě místnosti. Vzorky se odstředí, promyjí PBS

-29CZ 291229 B6 a tam, kde je to uvedeno, se peleta zpracuje N-glykanázou, aby se odstranily N-vázané uhlohydrátové řetězce. Vzorky se analyzují elektroforézou na 15% SDS-polyakrylamidovém gelu, provede se přenos na nitrocelulasu a analýza Westerm popsaná v Bumette et al., Anal. Biochem. 112, 195 až 203 (1981) a Elliott et al., Gene 79, 167 až 180 (1989) za použití směsi myších anti-erythropoietinových monoklonálních protilátek. Jedna z takových protilátek, 9G8A, je popsána v Elliott et al. (1989) za použití směsi myších anti-erythropoietinových monoklonálních protilátek. Jedna z takových protilátek, 9G8A, je popsána v Elliott et al. (1989) Bood 74, Supp. 1, A. 1228.

Analýza supematantů buněk COS transfekovaných [Asn⁶⁹]EPO cDNA a [Asn¹²⁵,Ser¹²⁷]Epo cDNA ukazuje, že proteiny mají větší velikost než erythropoietin s humánní sekvencí. Tato zvětšená velikost ukazuje na přítomnost přídavného N-vázaného uhlohydrátového řetězce (obr. 7). Zpracování supematantů buněk COS transfekovaných cDNA [Thr¹²⁵]EPO a cDNA [Pro¹²⁴,Thr¹²⁵]EPO N-glykanázou ukazuje, že proteiny mají větší velikost ve srovnání s erythropoietinem s humánní sekvencí. Tato zvětšená velikost ukazuje, že je přítomen přídavný O-vázaný uhlohydrátový řetězec (obr. 8). Analýza Western blot jiných vybraných analogů je uvedena na obr. 10.

Pro stanovení počtu N-vázaných uhlohydrátových řetězců, které jsou připojeny kEPO, se provede částečně rozštěpení N-glykanázou. Analogy rHuEPO se exprimují v buňkách CHO a oddělí se zpracované médium neobsahující sérum. Zkumavky obsahují 40 jednotek EPO (objem je nastaven vodou na 15 μΐ). Do každé zkumavky se přidá 10 μΐ 0,5% SDS a vzorky se 3 hodiny vaří. Potom se ke každému vzorku přidají tyto složky: 10,8 μΐ 0,5 fosforečnanu sodného o pH 8,6, 5 μΐ 7,5% Nonidetu P40 a 1,5 μΐ roztoku N-glykanázy (Genzyme) o koncentraci 250 jednotek/ml. Vzorky se inkubují uvedenou dobu při 37 °C. Reakce se zastaví přídavkem vzorkového pufru SDS-PAGE (viz výše) a potom podrobí analýze Western na SDS-PAGE (10% akrylamidu) za použití anti-EPO polyklonální protilátky a anti—králičí soupravy Westastain^<R) (Vector Laboratories) a 4-chlomaftolu, jako substrátu. Analýza N-vázaných řetězců za použití této metody je pro humánní erythropoietin a analog N14 znázorněna na obr. 11.

B. Stanovení účinnosti analogů erythropoietinu

Provedou se radioimunoeseje (RIA) způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Egrie et al. Stanovení EIA se provádějí za použití soupravy EIA Clinigen^(R) (Systémy R a D), přičemž se pracuje podle postupů dodaných výrobcem. Biologická účinnost in vivo analogů erythropoietinu se stanovuje na supernatantech získaných z buněk CHO exprimujících analog erythropoietinu nebo na purifikovaném erythropoietinu získaném z média zpracovaného buňkami CHO způsobem popsaným dále za použití exhypoxického polythemického myšího biologického stanovení (Cotex et al., výše uvedená citace).

Účinnost erythropoietinu in vitro se stanoví zkouškou tvorby erythroidní kolonie, kterou erythroidní kolonie, kterou popsali Iscove et al., J. Cell. Physiol. 83, 309 až 320 (1974); zkouška je modifikována. Mononukleované buňky z buněk humánní kostní dřeně se částečně purifikují na „ficoll-pague cushion“, promyjí se Iscoveho médiem, aby se odstranily ulpěné buňky, a potom se nanesou na misky. Kultivační médium obsahuje 0,9 % methylcelulózy a neobsahuje žádný hovězí sérový albumin. Erythroidní kolonie se zjišťují po 8 až 10 dnech kultivace.

Analogy erythropoietinu transfekované a exprimované v buňkách COS způsobem popsaným v příkladu 6 se analyzují v surových supernatantech buněk COS za použití RIA, EIA a stanovení s tvorbou erythroidní kolonie. Purifikovaný erythropoietin s humánní sekvencí vykazuje in vitro účinnost, která je srovnatelná s účinností podle RIA stanovenou při výše uvedených zkouškách. Analogy [Asn⁶⁹]EO, [Thr^I25]EPO a [Pro¹²⁴,Thr¹²⁵]EPO vykazují in vitro účinnost, která je srovnatelná s účinností podle RI a poskytují důkaz, že obsahují přídavné uhlohydrátové řetězce

-30CZ 291229 B6 (podle stanovení uvedeného v části A). [Thr¹²⁵]EPO a analogy N4, NI 1, N14, NI6, NI8, N47, N48, 062, NO1 a NO2 se dále analyzují tak, že se klon cDNA kódující analog erythropoietinu trasfekuje do buněk CHO a supematanty buněk CHO se podrobí stanovení RIA nebo EIA a biologického stanovení in vivo. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6. Účinnosti in vivo analogů 5 Rl, R2 a R3 exprimovaných v supematantech buněk CHO jsou vedeny v tabulce 7.

Tabulka 6 ío Analogy erythropoietinu obsahující přídavné uhlohydrátové řetězce

Sekvence EPO	N-vázané řetězce^	O-vázané řetězce	Účinnost in vivo RIA nebo EIA
	3C	ld	0,6
Asn30Thr32	3 až 4C	n.t.	1,1
Asn5ÍThr53	4	n.t.	n.t.
Asn57ulr59	4	n.t.	n.t.
Asn®9	4	sniž.mn.e	n.t.
Asn59Thr71	4	n.t.	0,25-0,7
SerE8ft3n69Thr71	4	n.t.	n.t.
Val87A3n88Thr90	4C	n.t.	1,8
Ser87Asn88Thr80	3 až 4C	normální	1,0
Ser87Asne8Glya9Thr90	4	n.t.	n.t.
Ser87Asn88Thr90Thr92	4	sniž.mn.e	n.t.
Asn89Ile90Thr91	4	n.t.	n.t.
Ser87A3n89Ile90Thr91	4	n.t.	n.t.
Ser87A3n88Thr9®Alal62	4	n.t.	1,8
A3nl36Thrl38	3 až 4	n.t.	n.t.
Asn138Thr140	3 až 4	n.t.	n.t.
A3n89Thr7lSer87x3n88Thr90	4 až 5	n.t.	0,025-0,25
A3n30Thr32val87x3n8Biiir90	4 až 5C	normální	1,8
Thrl23	3	1 a 2f	n.t.
Thrl25	3	1 a 2f	0,7
Prol24Thrl25	3	1 a 2f	n.t.
HCG c- terminální prodloučení	3	alespoň 39	1,0-1,3
Ser87xan8 0
hcg prodloužení	4	alespoň 39	1,5
A3n30Thx32val87Asn8®Thr98
HCG prodloužení	4 až 5	alespoň 39	0,8

-31 CZ 291229 B6

Poznámka k tabulce 6.

“Počet přídavných N-vázaných řetězců se odhaduje na základě mobility peptidových analogů v SDS gelech způsobem popsaným v příkladu 7A.

^bPoměr účinnosti analogu in vivo k množství analogu erythropoietinu. Měření účinnosti se provádějí na supematantech buněk CHO s analogy za použití myšího polycythemického biologického stanovení. Množství analogu erythropoietinu v supematantech buněk CHO se stanovuje zkouškou RIA nebo EIA popsanou v textu.

'Počet přídavných uhlohydrátových řetězců se potvrdí zkouškou migrace glykoproteinu v SDS-gelech po částečném rozštěpení N-glykanázou způsobem popsaným v příkladu 7A.

^dO-vázaný řetězec v Ser¹²⁶ je přítomen na 70 % molekul humánního erythropoietinu.

'Analogy se sníženým stupněm O-glykosylace, které obsahují uhlohydrátový řetězec v Ser¹²⁶ na méně než 70 % molekul.

^fThf*²³EPO obsahuje dva O-vázané řetězce na více než 60 % molekul. Thr^,25EPO obsahuje dva O-vázané řetězce na přibližně 40 % molekul. Pro¹²⁴Thr¹²⁵EPO obsahuje dva O-vázané řetězce na více než 80 % molekul.

^gTyto analogy obsahují alespoň tři O-vázané řetězce a mohou mít i čtyři nebo pět řetězců. O samotném HCG je známo, že obsahuje čtyři O-vázané řetězce.

n.t. znamená, že zkoušení nebylo prováděno.

Tabulka 7

Účinnost humánního erythropoietinu a analogů obsahujících přesmyky uhlohydrátových míst

Účinnost

Sekvence EPO		N-vázané řetězce	in vivo RIA nebo EIA
		3	0,69
Gin24		2	0,16
Gin38		2	0,16
Gin83		2	0,23
Gln24Ser87Asn88Thr90	(Rl)	3	0,69
Gln38Ser87Asn88Thr50	(R2)	3	0,41
Gln83Ser87Asn88Thr90	(R3)	3	0,50
Ser87Asn88Thr9°		3 až 4	1,48

Poměr účinnosti in vivo kRIA nebo EIA se stanovuje způsobem popsaným v poznámce ^a k tabulce 6.

-32CZ 291229 B6

C. Výroba izoformních směsí získaných z analogů erythropoietinu [Thr¹²⁵]EPO (EPO 050)

Analog erythropoietinu, [Thr¹²⁵]EPO, se zkonstruuje způsobem popsaným v části A. příkladu 6. 810bp fragment erythropoietinové cDNA nesoucí [Thr¹²⁵]mutaci se izoluje rozštěpením plazmidu pEC obsahujícího [Thr¹²⁵]mutaci pomocí BstEII a BglII a ligací vzniklého fragmentu k pDECdelta (derivát pDSa2) (viz příklad 6).

Plazmid pDECdelta obsahující [Thr¹²⁵] eryhropoietinovou cDNA se transfekuje do DHFR-deficientních buněk CHO. 770 ml média zpracovaného buňkami CHO se zkoncentruje za použití membrány s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton a diafiltruje proti lOmM Tris-HCl o pH 8,6 do dosažení konečného objemu 34 ml. Alikvot vzniklého koncentrátu o objemu 17 ml se nanese na sloupec Q-Sepharose s rychlým průtokem (objem lože 5 ml), který je ekvilibrován ve stejném pufru. Eluce se provádí lineárním gradientem od 0 do 250mM chloridu sodného v lOmM Tris-HCl o pH 8,6. Alikvoty frakcí eluovaných ze sloupce, buď neupravené, nebo štěpené N-glykanázou se analyzují SDS-PAGE nebo IEF a spojí se příslušné frakce podle obsahu izoforem a/nebo uhlohydrátu, přičemž vzniklé směsi se označí čísly 2, 3 a 4. Každá směs se nanese na sloupec Vydac D4 (214TPB 2030; průměr 1 cm; objem lože 1,8 až 2,5 ml; průtok 0,34 ml/min). Sloupec se promyje vždy 2 objemy sloupce 20% ethanolu v lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Sloupce se eluují lineárními gradienty 20 až 94% ethanolu v lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Vyrobí se směsi 2, 3 a 4, tyto směsi se zředí lOmM Tris-HCl o pH 7,0 a nanesou na sloupec Q-Sepharose s rychlým průtokem. Po promytí lOmM Tris-HCl o pH 7,0 se vzorky eluují 20mM citranem sodným/250mM chloridem sodným o pH 7,0. Purifikované [Thr¹²⁵] směsi se analyzují pomocí IEF (viz obr. 9). Tyto směsi se také analyzují výše uvedeným způsobem (Cotes et al.) na biologickou účinnost. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.

[Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰]EPO (EPO NI 4)

Preparativní postup 1

Analog EPO NI4 se purifikuje třístupňovým postupem, který zahrnuje ionexovou chromatografíi, chromatografii na obrácených fázích a gelovou filtrační chromatografií. Během stupně ionexové chromatografie se spojí vhodné frakce za účelem získání směsi izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové. Dvě další směsi se vyrobí při chromatografii na obrácených fázích s obsahem analogu s agregátem nebo bez něho. Podrobnosti tohoto purifikovaného stupně jsou uvedeny dále.

1. Médium upravené buňkami CHO exprimujícími analog EPO N14 se sklidí a přibližně 2,5násobně koncentruje za použití míchané kyvety s membránou YM10 (Amicon) a diafiltruje proti lOmM Tris o pH 8,5.

2. Zkoncentrované médium se nanese při asi 12 A₂8o/ml pryskyřice na sloupec Q-Sepharose FF (Pharmacia) ekvilibrovaný v lOmM tris o pH 8,5 při průtoku 0,2 cm/min.

3. Po nanesení média se sloupec promyje třemi objemy sloupce lOmM Tris o pH 8,5 a eluuje 50 objemy sloupce gradientu od 0 do 0,5M chloridu sodného v lOmM Tris o pH 8,5. Sbírají se frakce, jejichž objem odpovídá objemu sloupce.

4. Vzorek každé frakce se zkouší na IEF genu při pH 3 až 5. Na základě rozdělení izoforem zjištěného metodou IEF se spojí takové frakce, aby vzniklá směs obsahovala převážně izoformy 11 až 18. K této směsi se přidá EDTA do lmM výsledné koncentrace.

-33CZ 291229 B6

5. Směs izoforem se nanese při asi 5 A₂go/ml pryskyřice na sloupec s obrácenými fázemi C4 (Vydac) ekvilibrovaný ve 20% ethanolu v lOmM Tris o pH 7,0 při průtokové rychlosti 2,5 cm/min. Sloupec se promyje jedním objemem sloupce 20% ethanolu v lOmM Tris o pH 7,0 a eluuje 30 objemy sloupce gradientu od 20 do 94% ethanolu lOmM Tris o pH 7,0 při průtokové rychlosti 1 cm/cm. Sbírají se frakce o objemu odpovídajícím 0,2 objemu sloupce.

6. Vzorek každé frakce se analyzuje pomocí neredukujícího 12% SDS-PAGE. Na základě přítomnosti agregátu pozorovaného na SDS-gelu se vytvoří dvě oddělené směsi. Směs č. 1 obsahuje analog EPO, ale žádný agregát, a směs č. 2 obsahuje jak analog EPO, tak agregát.

7. Směs č. 1 se přibližně 65násobně zkoncentruje směs č. 2 se přibližně 250násobně zkoncentruje za použití zařízeni Centricon 10 (Amicon). U každé směsi se provede výměna pufru za 20mM citran sodný/lOOmM chlorid sodný o pH 7,0.

8. Každá směs se individuální purifikuje na sloupci PHCL BioSil SEC-250 (BioRad) ekvilibrovaném ve 20mM citranu sodném/lOOmM chloridu sodného o pH 7,0. Směsi se nanesou při hodnotě nižší než 6 A_2g0/ml pryskyřice při průtokové rychlosti 2,26 cm/min. Při každé zkoušce se sbírají píkové frakce odpovídající monomemím analogům.

9. Změří se absorbance každé směsi a část každé směsi se zkoncentruje pro analýzu gelu SDS-PAGE a IEF. Směs č. 1 obsahuje izoformy 15 až 17 a použije seji pro farmakokinetické studie a studie vazby k receptorů.

Preparativní postup 2

Podobně se purifikuje analog EPO N14 třístupňovým postupem, který zahrnuje ionexovou chromatografii, vysoce účinnou chromatografii na obrácených fázích a chromatografii na hydroxylapatitu. Během stupně ionexové chromatografie se analog rozdělí do tří směsí obsahujících podle obsahu izoforem. Podrobnosti tohoto purifikačního stupně jsou uvedeny dále.

1. Supematant buněk CHO exprimujících analog EPO N14 se oddělí a přibližně lOx zkoncentruje za použití zařízení Filtron Mini-Ultrasette s tangenciálním tokem a potom diafiltruje proti lOmM Tris o pH 8,5.

2. Zkoncentrované médium se nanese při asi 10 A₂go/ml pryskyřice na sloupec Q-Sepharose FF (Pharmacia) ekvilibrovaný v lOmM Tris o pH 8,5 při průtoku 0,2 cm/min.

3. Po nanesení média na sloupec promyje třemi objemy sloupce lOmM Tris o pH 8,5 a eluuje 50 objemy sloupce gradientu od 0 do 0,5M chloridu sodného v lOmM Tris o pH 8,5. Sbírají se frakce, jejichž objem odpovídá objemu sloupce.

4. Vzorek každé frakce se zkouší na IEF gelu při pH 3 až 5. Na základě rozdělení izoforem zjištěného metodou IEF se jednotlivé frakce rozdělí do tří směsí. Směs označená názvem „nízké izoformy“ obsahuje 4 až 12, směs označená názvem „střední izoformy“ obsahuje izoformy 5 až 15 a směs označená názvem „vysoké izoformy“ obsahuje izoformy 6 až 18.

5. Každá směs izoforem se individuálně purifikuje na sloupci pro HPLC s obrácenými fázemi C4 (Vydac). Sloupec se vyvíjí gradientem od 0,1% kyseliny trifluoroctové ve vodě do 0,1% kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu, přičemž zvyšování koncentrace acetonitrilu probíhá rychlostí 1 %/min.

6. Píková frakce analogu z každé směsi se shromáždí a zředí 4 objemy 80 mM Tris-HCl/20mM Tris-báze a potom zkoncentruje. Provede se výměna pufru za lOmM Tris o pH 7,2 za použití zařízení Centricon 3, která je odolná proti rozpouštědlům.

-34CZ 291229 B6

7. Každý vzorek se zředí na hodnotu 2 A2₈o/ml v lOmM Tris o pH 7,2 a přidá se stejný objem 4M hydrochloridu quanidinu (GuHCl, lOmM CHAPS, lOmM Tris o pH 7,2 do koncentrace výsledného vzorce 1 A2₈o/ml). Každý vzorek se nanese na hydroxylapatitový minisloupec ekvilibrovaný 2m GuHCl, 5mM ChAPS, lOmM Tris o pH 7,2. Sloupec se promyje ekvilibračním pufrem a shromažďují se frakce o objemu jednoho sloupce.

8. Změří se absorbance frakcí, vyrobí se směsi a provede se výměna pufru za lOmM Tris o pH 7,2 za použití zařízení Centricon 10. Změří se absorbance každé směsi.

Výsledné směsi se analyzují na SDS-PAG a IEF gelech. IEF gely jsou znázorněny na obr. 12. Zkoušky RIA a zkoušky účinnosti in vivo se provádějí způsoby popsaným v příkladu 7A. Účinnost výsledných směsí izoforem in vivo je uvedena v tabulce 8. Směsi izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové se použije při experimentech zaměřených na zjištění zvýšení hematokritu u myší.

Tabulka 8

Účinnost izoforem analogů erythropoietinu

Sekvence EPO	Směs izoforem	Účinnost in vivo (U/mg peptidu)3
Thr125	izoformy 8 až 12	147 000b
	izoformy 9 až 12	215 000b
Ser87Asn88Thr90	izoformy 13 až 15	111 000b
izoformy 7 až 12	132 000 ± 17 000
	izoformy 10 až 14	233 000 ± 39 000
	izoformy 12 až 12	272 000 ± 14 000

³ Množství erythropoietinového peptidu v mg se vypočítá z hodnot A2₈o směsí izoforem Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO s použitím extinkčního koeficientu 0,93 pro 1 mg/ml roztoku.

^b Směrodatná odchylka u směsí izoforem Tht¹²⁵EPO není uvedena, poněvadž stanovení účinnosti bylo prováděno jednou nebo dvakrát.

Příklad 8

Biologické vlastnosti analogu EPO N14

Účinnost směsí izoforem analogu EPO NI4, rekombinantního humánního erythropoietinu (rHuEPO) a izolované izoformy rHuEPO 14 se srovnávají při i.v. farmakokinetických zkouškách, zkouškách vazby kreceptoru a studiích hematokritu. Směsi izoforem EPO N14 se vyrobí způsobem popsaným v příkladu 7C. rHuEPO se vyrobí způsobem popsaným výše uvedené publikaci Lei et al. Izoforma 14 rHuEPO se purifikuje následujícím způsobem: rHuEPO, který se skládá ze směsi izoforem 10, 11, 12, 13, 14 a 15 se nanese na sloupec Q-Sepharose s rychlým průtokem (průměr 2,2 cm, výška 3,4 cm) ekvilibrovaný v lOmM Tris o pH 7,2. Sloupec s rHuEPO se ekvilibruje s 2mM kyselinou octovou/6mM močovinou (pufr A) a potom se provede eluce vícefázovým gradientem navrženým pro optimální purifikaci izoforem 13 a 14. Gradient zahrnuje 0 až 7,3 % 800mM kyseliny octové/6M močoviny (pufr B) v 750 ml, 7,3 až 11,4 % pufru B v 750 ml, 11,4 až 26,8 pufru B ve 1 250 ml 26,8 až 62,4 % pufru B ve 1 250 ml a potom 62,4 až 100% pufru B v 700 ml. Sbírají se frakce o objemu 12,5 ml. Frakce se neutralizují hydroxidem amonným a zkouší izoelektrickou fokusací na polyakrylamidových gelech. Frakce obsahující čistou izoformu 14 se spojí, zkoncentrují vmíchané kyvetě Amicon vybavené membránou YM-10 a potom s provede výměna pufru za vodu.

-35CZ 291229 B6

A. i.v. farmakokinetické studie

Provedou se dvě oddělené studie pro srovnání farmakokinetických parametrů analogu EPO N14 (izoformy 15 až 17) a izolované izoformy 14 s rHuEPO.

Při každé studii se 1 pCi buď ¹²⁵I-izolované izoformy 14, analogu ¹²⁵I-EPO N14, nebo ¹²⁵I-rekombinantního humánního erythropoietinu (Amersham) intravenosně vstříkne do kanyly zavedené do krční tepny samce krysy Sprague-Dawley o hmotnosti v rozmezí od 310 do 378 g. V různých dobách po podání se odebírají krevní vzorky o objemu 0,3 ml, které se centrifugací zpracují na sérum. Každý vzorek séra o objemu 0,1 ml se inkubuje přes noc při 4 ^PC z 90% ethanolem a potom se v něm stanoví koncentrace ¹²⁵I-EPO (buď rekombinantního humánního erythropoietinu, izolované izoformy 14, nebo analogu EPON14). Ethanolem vysrážený ^l2’I-EPO v každém vzorku séra se spočítá v počítači gamma-rozpadů. Výsledné farmakokinetické křivky jsou uvedeny na obr. 13. Pro každou krysu se stanoví farmakokinetické parametry' za použití nelineární regerézní analýzy PCNONLIN 4.0 Statistical Consultants, 1992 a výsledky pro každou skupinu se zprůměrují. Výsledky farmakokinetických studií získané za použití analogu EPO N14 a izolované izoformy 14 jsou souhrnně uvedeny v tabulce 9.

Jak je zřejmé z tabulky 9, existuje podstatný rozdíl mezi hodnotou sérové clearance analogu EPO N14 a hodnotou vypočtenou pro rekombinantní humánní erythropoietin. Rekombinantní humánní erythropoietin vykazuje nejrychlejší beta poločas 3,10 hodiny ve srovnání s 3,97 hodiny pro izolovanou izoformu 14 a 4,36 hodiny pro analog EPO NI4. Skupina s rekombinantním humánním erythropoietinem vykazuje také nejrychlejší poločas clearance 1,78 hodiny ve srovnání se 2,40 hodiny pro izolovanou izoformu 14 a 3,03 hodiny pro analog EPO N14.

-36CZ 291229 B6

00		o	lO	CO
b-	CM		w	o	CM
		*	A	•k	*»
rd	o	CM	o	co	O

Přehled farmakokinetických parametrů rHuEPO, isoformy 14 rHuEPO a EPO N14 (isoformy 15 až 17) po i.v. podání a> o C ce cd o

O já ώ 44

E

bJ)

r-t Z3 E < š ⁸ a i o —· o

w cd >υ o o dl

	O	O	CM		b-
rd	CO	00	iH	to	rd
CD	rd	co	O	CM	O

o o	ςθ O	,288	,020	o co CM	,021
o	O	O	O	O	O

o	co	LO	CM		O
·*			->	*	*
	co	CD	CM	b-	rd
		CO		co

rd	o	o	00	rd	ΙΛ
O	co	CM	co	CO	uo
o	rd	CO	CD	CM	co
co	O	eo	CO	CM	o
o	co	00	LD	O
co				CD

o rd		o	o	,36	CD CO
CO	o	co	o	Tl*	o

CM	LtO	00	CD	CM	LO
CO	in	co	CD	CM	CD
co	rd	co	O		rd
«*	««	»	Fl	*	*
o	O	o	o	O	O
Ό			»	Ό
>řd	Ó	0)	o	o	Ó
+-»	•	+->	•	4-i	•
C0	U1	CD	ω	(0	w

&

>?-<

	rd cd
O		E
Ph
M 2 S	v> II β	<2 O CO
řH	+

	rd Z
•cr II	o ΊΓ
d	Ph Č W

Průměrná hodnota pro skupiny, kterým byl podáván rekombinantní humánní erythropoietin při farmakokinetické studii s EPO N14 (n = 4, v případě skupiny, které byl podáván rekombinantní humánní erythropoietin) a při farmakokinetické studii s izolovanou isoformou 14 (n = 2, v případě skupiny, které byl podáván rekombinantní humánní erythropoietin).

37CZ 291229 B6

B. Stanovení vazby k receptoru

Interakce analogu EPO N14 (izoformy 15 až 17) sreceptorem erythropoietinu se studují vytěsňovací zkoušky za chladu za použití erythroleukemických buněk OCIM1 (Papayannopoulou et al., Blood 64 (supp. 1), 116a (1984)). Zvyšující se koncentrace neznačeného EPO N14 se inkubují s buňkami o OCIM1 spolu s konstantní koncentrací ¹²⁵I-rHuEP9, za účelem stanovení množství EPO N14 potřebného pro soutěž s ¹²⁵I rHuEPO o vazbu k receptoru. Pro srovnání se nechá s konstantní koncentrací ¹²⁵I-rHuEPO soutěžit také postupně se zvyšující koncentrace neznačeného rHuEPO.

Neznačený EPO N14 se zředí zkouškovým pufrem a přidá se množství 0,03 ng, 0,1 ng, 0,3 ng, 1,0 ng, 3,0 ng, 10,0 ng a 30,0 ng (vztaženo na hmotnost peptidu). Do všech zkumavek se přidá 0,5 ng ¹²⁵I-rekombinantního humánního EPO a potom se přidá vždy přibližně 0,5 x 10⁶ buněk OCIM1. Zkumavky se inkubují při 37 °C ve třepané vodní lázni po dobu 2 hodin. Po inkubaci se roztoky odstředí přes dibutylftalátový/biftalátový olejový roztok, aby se oddělil nenavázaný ¹²⁵I-rHuEPO od ¹²⁵I-rHuEPO vázaného k buňkám OCIM1. Izolují se buněčné pelety a množství ¹²⁵I-rHuEPo vázaného k buňkám se stanoví spočítáním gamma-rozpadů. Vypočítá se údaj charakterizující specifickou vazbu k buňkám a lineární regresní analýzou se stanoví koncentrace neznačeného proteinu, které je zapotřebí pro to, aby bylo 50 % ¹²⁵I-rHuEPO vázaného za nepřítomnosti kompetitoru vyřazeného ze soutěže.

Z výsledků tří zkoušek vyplývá, že v průměru je zapotřebí 2,67 ± 0,73 ng neznačeného peptidu EPO N14 pro snížení vazby ¹²⁵-rHuEPO k buňkám OCIM1 o 50 %. Při stejných třech zkouškách je zapotřebí v průměru 0,51 ± 0,15 ng neznačeného rHuEPO pro soutěž s vazbou 0,5 ng ¹²⁵I-rHuEPO. Na základě těchto výsledků je zapotřebí 5,25násobného nadbytku EPO N14 pro soutěž s vazbou ¹²⁵I-rHuEPO k receptoru EPO ve srovnání s neznačeným rHuEPO (p < 0,01).

Také se provede přídavný experiment přímého srovnání vazby analogu EPO N14, izolované izoformy 14 a rekombinantního erythropoietinu k receptoru erythropoietinu. Výsledky tohoto experimentu ukazují, že analog EPO N14 má k receptoru nižší afinitu než izolovaná izoforma 14. Ve srovnání s neznačenou izoformou 14 je při soutěži s ^I25I-rHuEPO o vazbu k receptoru zapotřebí přibližně dvojnásobného nadbytku analogu EPO N14 (obr. 14).

C. Studie hematokritu

Provede se in vivo studie pro srovnání schopnosti vysokých a nízkých izoforem EPO N14 (z preparativního postupu 2 popsaného v příkladu 7C), izolované izoformy 14 a rekombinantního humánního EPO zvýšit hematokrit ošetřených myší. Rozdělení izoforem ve směsích izoforem EPO N14 označených názvy „vysoké izoformy“ a „nízké izoformy“, kterých se používá při této studii, je uvedeno na obr. 12.

Myším CD1 (o hmotnosti asi 30 g) se po dobu celkem 6 týdnů 3 x za týden intraperitoneálně injikuje jeden zvýše uvedených přípravků v 0,25% myším sérovém albuminu nebo placebo (PBS s 0,25% myším sérovým albuminem). Dávkování erythropoietinových přípravků je vztaženo na hmotnost peptidu a je upraveno tak, aby 30g myš obdržela 0,071 pg peptidu/dávka, a to buď vysokých frakcí EPO NI4, nízkých frakcí EPO NI4, izoformy 14, nebo standardního rHuEPO. Při zkoušení vysokých frakcí EPO N14 a izoformy N14 se použije též přídavné skupiny, které se podává 0,036 pg peptidu/dávka. Hematokrity všech myší se stanoví před zahájením pokusu a potom se zjišťují dvakrát týdně retroorbitálním odběrem krve. Na závěr pokusu se shromáždí sérum všech zvířat a zkouší se na protilátky proti vstříknutému produktu. Dat získaných u zvířat, která jsou charakterizována jako negativní s ohledem na neutralizaci protilátek, se použije při následné analýze.

-38CZ 291229 B6

Jak ukazuje obr. 15, zvířata, kterým byly podány vysoké izoformy EPO N14, vykazují nejvyšší průměrnou hodnotu hematokritu ve skupině ve srovnání se zvířaty kterým byly podány ostatní přípravky. Izoforma 14, rekombinantního humánního EPO a nízké izoformy EPO N14 zvyšují hematokrit v menším rozsahu.

Za účelem porovnání různých erythropoietinových přípravků kvantitativnějším způsobem se vypočítá průměrná počáteční rychlost vzrůstu hematokritu (0 až 11 dnů), změří se plocha pod křivkou (0 až 39 dnů) a vypočítá se celkové zvýšení hematokritu (tabulka 10). Ať již se použije kteréhokoliv z těchto kriterií, zdá se být směs „vysoké izoformy“ EPO N14 účinnější (vztaženo io na hmotnost peptidu) než kterýkoliv z ostatních zkoušených přípravků. Jak směs „vysoké izoformy“ EPO N14, tak izoformy 14 je účinnější než rekombinantní humánní EPO. Směs „nízké izoformy“ EPO N14 vykazuje nejnižší účinnost při srovnání za použití kterékoliv z těchto analýz.

-39CZ 291229 B6

O 44

O tn

H	M
	Xll	>W
	44	E
O	N
	M	4J
r—4	c	•H
	-	Id
	OJ	44 O
<3		+>
	s	<3
44	>1	E
	e	QJ
rd	u	X
3	o 44	<3
	o	C
Λ	w
	H	O
HJ		Pí
	XU	M
	44	3
	0	K
	to	υ
	>t >	«3

Ή W >Φ xr r—t z

O Pí w

0) β •H >o o fO t 3

Φ	+>
>ω	Ή
'>1	M
>	44 —·
N	0 >1 X Ό
xu	(3 0
>	E Λ
0	Φ —
44	X!
rd
tu	M
o	C

Ό 004 CU 3

O (3 44 x > □ -rd o >n rd 44 Cd sd C > O >co

>	3
N	44 — •h q
P	14 Φ
tn	44 Ό
o	0 \
rd	X >1
x	<3 Ό
0	E 0
>1	Φ Λ
P4	x —

r3 > x3 Q

	kO	<-4	Γ	in	Ol
*	ta	ta	ta	ta	ta
m	CM		o	r*	(Ti
CM	CM	t~4		i-4

cn	k£>	co	XT		CM
r—1		04	co	CM	i—i
KO	u*>	xl·	Ol		CM

KO	σ\	CO	x>
	t-Η	cn	r-	o	in
ta	ta.		•w	ta	ta
r4	rH	o	o	f~4	O

r—i	r—I	kO	<x>	r-4	rd
Γ	r-	m	o>	(*	θ'
o	o	o	o	O	O
ta	ta	·.	K	ta
O	O	o	O	o	O

xf xr

I

I o

	ui xi·	w xj·	O	xi*
44	rd rd	»3	•rd rd	<3		W	rd
Φ	Z	E	Z	E		•rí	Z
>	XP	14	XU	M	O
<3	44 >i	0	44	O	Pí	XD
M	0 E	44	0 E	4d	H	44	E
Oí	tn M	o	W P	0	3	N	14
Y4	>i O	to	>i 0	w	K	M	O
>14	> dd	H	> dd	H	M	Z	44
Pí

Počáteční rychlost zvyšování hematokritu se vypočítá metodou lineární regrese z výsledků od dne 0 do dne 11.

Plocha pod křivkou se vypočítá trapezoidní sumací z výsledků od dne 0 do dne 39.

Celkové zvýšení hematokritu se vypočítá jako rozdíl průměrné hodnoty hematokritu u skupiny v den 39 a průměrné hodnoty heraatokrytu u skupiny při zahájení pokusu.

rd cd m

-40CZ 291229 B6

Vynález byl sice popsán za použití přednostních provedení, odborníkům v tomto oboru je však zřejmé, že jej lze různým způsobem obměňovat a modifikovat, přičemž všechny takové variace spadají do rozsahu tohoto vynálezu, pokud jsou kryty následujícími patentovými nároky. Tyto patentové nároky je třeba vykládat na podkladě ekvivalentů.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Eliott, Steven G.

Byme, Thomas E.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Analogy erythropoietinu (iii) POČET SEKVENCÍ: 26 (iv) ADRESE PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: Amgen lne., U.S. Patent

Operations/rbw (B) ULICE: 1840 DeHavilland Drive (C) MĚSTO: Thousand Oaks (D) STÁT: Kalifornie (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 91320-1789 (ZIP) (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patention Release #1.0, verze # 1.25 (vi) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/108,016 (B) DATUM PODÁNÍ: 17. srpna 1993 (C) ZATŘÍDĚNÍ:

-41 CZ 291229 B6

(2)	INFORMACE O SEQ ID NO: 1:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1: CGCCCACCAA ACCTCAGCTG TGACAGCCGA	30
(2)	INFORMACE O SEQ ID NO: 2:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2: ATCTGTACAA CCGAAGCCTG GAGAGGT	27
(2)	INFORMACE O SEQ ID NO: 3:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3: GGGCCTGGCC AACCTGTCGG AAG	23

-42CZ 291229 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

TCCCCTCCAG ATAATGCCTC AGCTGC (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

CAGATGCGAA CTCATCTGCT CCAC (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

AGGCCTGCAG GAATGGGAGC AGATGACCAG GTG

-43CZ 291229 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

TCCAGATGCG ACCTCAGCTG CTC 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

CCTCCAGATC CGACCTCAGC TGC 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:

GGGCCTGGCC AACCTGACAG AAGCTGTC 28

-44CZ 291229 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

CAGGGCCTGT CCAACCTGAC AGAAGCTGTC 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

CAGATGCGAA CTCAACGGCT CCAC 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 35:

ATGCGAACTC AACGGCTCCA CTCACAACAA TCACT 35

-45CZ 291229 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:

CCAGATCCAA ATTCATCTGC TCCACTC 27 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

CCACATCCAA ATTCAACAGC TCCACTC 27 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 24:

CCAGATGCGA CAACAGCTGC TCCA 24

-46CZ 291229 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

AGATCCGACC ACCGCTGCTC CAC 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:

TGCTCCATC ACAACAATCA CTG 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 184 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

TCGAGGAACT GAAAAACCAG AAAGTTAACT GGTAAGTTTA GTCTTTTTGT CTTTTATTTC

AGGTCCCGGA TCCGGTGGTG GTGCAAATCA AAGAACTGCT CCTCAGTGGA TGTTGCCTTT

120

ACTTCTAGGC CTGTACGGAA GTGTTACTTC

TGCTCTAAAA GCTGCTGCAA CAAGCTGGTC

180

GACC

134

-47CZ 291229 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 107 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

CCTGTAGGAC AGGGGACAGA TCCTCTTCCT CAAAGGCCCC TCCCCCCAGC CTTCCAAGTC

CATCCCGACT CCCGGGGCCC TCGGACACCC CGATCCTCCC ACAATGA

107 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 108 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 20:

GATCTCATTG TGGGAGGATC GGGGTGTCCG AGGGCCCCGG GAGTCGGGAT GGACTTGGAA 60

GGCTGGGGGG AGGGGCCGAG GAAGAGGATC TGTCCCCTGT CCTACAGG 108 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 21:

GGAGGCCGAG CAGATCACGA CGG 23

-48CZ 291229 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 22:

CTTGAATGAG CAGATCACTG TCC 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová ky selina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 23:

CTGTTGGTCC AGTCTTCCCA G 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 24:

CCTGTTGGTC CAGTCTTCCC AGC 23

-49CZ 291229 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 25:

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 15 10 15

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin

25

-50CZ 291229 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 193 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 26:

Met

Gly

Val

His

Glu

Cys

Pro

Ala

Trp

Leu

Trp

Leu

Leu

Leu

Ser

Leu

1

5

10

15

Leu

Ser

Leu

Pro

Leu

Gly

Leu

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Pro

Arg

Leu

20

25

30

Ile

Cys

Asp

Ser

Arg

Val

Leu

Glu

Arg

Tyr

Leu

Leu

Glu

Ala

Lys

Glu

35

40

45

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Thr

Gly

Cys

Ala

Glu

His

CV3

Ser

Leu

Asn

Glu

50

55

6*0

Asn

Ile

Thr

Val

Pro

ASP

Thr

Lys

Val

Asn

Phe

Tyr

Ala

Trp

Lys

Arg

65

70

75

80

Met

Glu

Val

Gly

Gin

Gin

Ala

Val

Glu

Val

Trp

Gin

Gly

Leu

Ala

Leu

85

90

95

Leu

Ser

Glu

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu

Leu

Val

Asn

Ser

Ser

100

105

110

Gin

Pro

Trp

Glu

Pro

Leu

Gin

Leu

His

Val

Asp

Lys

Ala

Val

Ser

Gly

115

120

125

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Thr

Leu

Leu

Arg

Ala

Leu

Gly

Ala

Gin

Lys

Glu

130

135

140

Ala

Ile

Ser

Pro

Pro

Asp

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

Pro

Leu

Arg

Thr

Ile

145

150

155

160

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg

Val

Tyr

Ser

Asn

Phe

Leu

165

170

175

Arg

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala

Cys

Arg

Thr

Gly

Asp

180

185

190

Arg

Claims (8)

1. Analog humánního erythropoietinu zahrnující alespoň jedno přídavné místo pro glykosylaci, kde jedno místo je zvoleno z

a) kterékoliv z aminokyselinových poloh 30, 51, 57, 88, 89, 136 a 138, přičemž ve kterékoliv z těchto aminokyselinových poloh je připojen alespoň jeden přídavný N-vázaný sacharidový řetězec nebo

b) aminokyselinové polohy 123, přičemž v této aminokyselinové poloze je připojen přídavný O-vázaný sacharidový řetězec.

2. Analog humánního erythropoietinu podle nároku 1, který je produktem exprese exogenní sekvence DNA.

3.

4.

Analog humánního erythropoietinu, kterým je Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO.

Analog humánního erythropoietinu zvolený ze souboru sestávajícího z

Asn³⁰Thr³²EPO;

Asn⁵¹Thr⁵³EPO;

Asn⁵⁷Thr³⁹EPO;

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁹⁰Thr⁹²EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²EPO;

Asn⁶⁹Thr⁷¹ Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO;

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr^9lEPO;

Asn'³⁶Thr’³⁸EPO; a

Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰EPO;

5. Sekvence DNA kódující analog humánního erythropoietinu podle některého z nároků 1 až 4.

6. Eukaryontní hostitelská buňka transfekovaná sekvencí DNA podle nároku 5 způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat analog humánního erythropoietinu.

7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství analogu erythropoietinu podle některého z nároků 1 až 4, spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem, adjuvantem nebo nosičem.

8. Použití terapeuticky účinného množství analogu erythropoietinu podle některého z nároků 1 až 4 pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvyšování hematorkritu u pacienta.