FI117136B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten erytropoietiinianalogien valmistamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten erytropc analogien valmistamiseksi Tämä on US-patenttihakemuksen sar 5 07/942 126, jätetty 8. syyskuuta 1992, osittainen kemus. Tämä keksintö koskee erytropoietiinianalogej sa on ainakin yksi lisätty glykosylaatiokohta tai yhden glykosylaatiokohdan uudelleenj ärjestyminen. koskee myös kyseisiä erytropoietiinianalogeja koe 10 DNA-sekvenssejä sekä rekombinanttiplasmideja ja isä ja analogien ekspressiota varten.

Keksinnön tausta

Erytropoietiini (EPO) on glykoproteiinihorm ka on mukana erytroidiesiastesolujen kypsymise 15 nasoluiksi. Se on olennainen verenkierrossa ole-* nasolumäärien säätelemisessä. Luonnossa esiintyvää poietiinia tuottaa maksa sikiöaikana ja munuainen a sa, ja se kulkee verenkierrossa ja stimuloi pun tuotantoa luuytimessä. Munuaisvajaatoiminnasta seur 20 väistämättä anemia munuaisen vähentyneen erytropo tuoton takia. Geeniteknologisilla menetelmillä, jo sältyy proteiinituotteen ekspressio isäntäsolusta,

• M

transformoitu erytropoietiinia koodittavalla geenil ψ tetun rekombinanttierytropoietiinin on havaittu oi * * » 25 hokasta, kun sitä käytetään kroonisesta munuaisvaja • * . . nasta johtuvan anemian hoitoon.

* ! * "*.* Pieniä määriä erytropoietiinia esiintyy • · » *·' ' virtsassa normaalisti, kun taas aplastisesta anemia sivillä henkilöillä nähdään kohonneita virtsan er * 30 etiinimääriä. Miyaken ym. ihmisen virtsan erytropo »I* ! I nuhdi st.nksftssa. arti lelfpl i .T Rinl fham 2

Erytropoietiinia koodittavien geenien t kloonaus ja ekspressio esitetään Linille my US-patentissa nro 4 703 008, jossa esitetty sisä tähän viitteeksi. Kuvaus rekombinanttierytrop 5 puhdistusmenetelmästä solujen elatusaineesta

Laille ym. myönnettyyn US-patenttiin nro 4 667 01 gisesti aktiivisen erytropoietiinin ekspressio ja otto nisäkässoluisännistä, jotka sisältävät erytr nigeenin rekombinanttiplasmideissa, on ensimmäis 10 tuonut saataville sellaisia määriä erytropoietiin soveltuvat terapeuttisiin käyttötarkoituksiin, geenisekvenssin tunteminen ja puhdistetun protei rempien määrien saatavuus on johtanut tämän p toimintatavan parempaan ymmärtämiseen.

15 Monia eukaryoottisolujen tuottamia solun olevia ja eritettäviä proteiineja muunnetaan yh useammalla oligosakkaridiryhmällä. Tämä muuntamir viitataan sanalla glykosylaatio, voi dramattisest taa proteiinien fysikaalisiin ominaisuuksiin ja 20 tärkeä proteiinin stabiilisuudelle, eritykselle j tumiselle solun sisällä. Oikeanlainen glykosyli ;*.J olla oleellinen biologiselle aktiivisuudelle. Its ♦ f joistakin eukaryoottieliöistä peräisin olevista » * · ;·, saadaan ekpressoitaessa bakteereissa (esim. E.

* * · * , 25 joilla ei ole soluissaan proteiinien glykosylaat • « . . seja, proteiineja, joilla talteen otettaessa on * * * *·· * häinen tai ei lainkaan aktiivisuutta, koska niist : glykosylaatio.

Glykosylaatio tapahtuu spesifisiin kohtiir m 30 tidin perusrakennetta, ja se on yleensä kahdent *·♦ : : O-sidoksellisia oliaosakkaridaia liit-etiään spt 3 sakkaridien rakenteet, ja näissä tyypeissä esiin keritähteet ovat erilaisia. Eräs sokerityyppi, jo tyy molemmissa, on N-asetyylineuramiinihappo (jo eteenpäin käytetään nimeä siaalihappo). Siaali 5 yleensä terminaalinen sokeritähde sekä N- että O-lisissä oligosakkarideissa, ja negatiivisen va ansiosta se voi antaa happamia ominaisuuksia glyk nille.

Sekä ihmisen virtasta saatu erytropoietd 10 rekombinanttierytropoietiini (nisäkässoluissa ek tu), joilla on ihmisen erytropoietiinin sekvenssi sisältävät kolme N-sidoksellista ja yhden 0-sido oligosakkaridiketjun, jotka yhdessä muodostavat glykoproteiinin koko molekyylipainosta. N-sido 15 glykosylaatio tapahtuu asparagiinitähteisiin ase; 38 ja 83, kun taas O-sidoksellinen glykosylaatio seriinitähteeseen asemassa 126 [Lai ym., J. Bi< 261. 3116 (1986), Broudy ym., Arch. Biochem. Biop 329 (1988)]. Oligosakkaridiketjujen on osoitt 20 muunnettuja terminaalisilla siaalihappotähteillä. loidun erytropoietiinin entsyymikäsittely, jolli I taan kaikki siaalihappotähteet, johtaa in vivo suuden menetykseen, mutta ei vaikuta in vitro -ak teen [Lowy ym.. Nature 185. 102 (1960), Goldwasse • # * 25 Biol. Chem. 249. 4202 (1974)]. Tämä käyttäytynein • · . . litetty asialoerytropoietiinin nopealla poistumal * * * kierrosta, kun se joutuu vuorovaikutukseen maksa: • * * *·* * glykoproteiineja sitovan proteiinin kanssa [Mor; J. Biol. Chem. 243. 155 (1968), Briggs ym., Am. 30 siol. 227. 1385 (1974), Ashwell ym., Methods Enz; • * ΟΟΠ / 1 mn V Ί O _» J . J ^ * I_ _r > _ Ί Ί *_ _ i _ 4 että osittain deglykosyloidulla erytropoietiinill mattavasti vähentynyt in vlvo -aktiivisuus verrat kosyloituun muotoon, mutta sillä säilyy in vitro suus (Dordal ym., Endocrinology 116. 2293 (198! 5 mainittu patentti). Kuitenkin toisessa tutkimul tai O-sidoksellisten oligosakkaridiketj uj en po yksittäin tai yhdessä glykosylaatiokohtina olevie giini- ja seriinitähteiden mutageneesillä alentaa nisäkässoluissa tuotetun muutetun erytropoietiini 10 ro -aktiivisuutta [Dube ym,, J, Biol, Chem. 2i (1988)].

Glykoproteiineja kuten erytropoietiini voi telia erivarauksellisiin muotoihin käyttäen sell netelmiä kuin isoelektrinen fokusointi (IEF). Ui 15 puolet ovat raportoineet epäpuhtaiden ja osittai tettujen erytropoietiinipreparaattien IEF-tu [Lukowsky ym., J. Biochem. 50, 909 (1972), She! Biochem. Med. 12, 45 (1975), Fuhr ym., Biochem. Res. Comm. 98, 930 (1981)]. Näissä tutkimuksiss 20 tettiin IEFrllä enintään kolme tai neljä fraktiot oli erytropoietiiniaktiivisuutta, eikä mitään n rakterisoitu hiilihydraattisisäilön suhteen. Lii * * tään korrelaatiota ei tehty fraktioiden isoelektr * teen ja niiden biologisen aktiivisuuden välillä. 25 Virtsan erytropoietiini n puhdistuksen aik • · . sen virtasta, kuten Miyaken ym. mainitussa art * * · *11/ pohditaan, kahdella hydroksyyliapatiittikromato ** ' saadulla erytropoietiinifraktiolla, joista käyte miä II ja IIIA, raportoitiin olevan samankaltain e.5.* 30 finen aktiivisuus. Fraktioiden II ja IIIA myöhem

: i _________ -! £______TT

5 11 joissa on määritelty siaalihapposisältö ja biolog. tiivisuus. Tällaisia molekyylejä sisältävillä farm silla koostumuksilla olisi terapeuttisia etuja. Keksinnön yhteenveto 5 Tämä keksintö koskee menetelmää terapeu käyttökelpoisen ihmisen erytropoietiinin analogin t seksi, jolloin (a) mainitussa analogissa on ainakin yksi N-glykosylaatiokohta asparagiinitähteessä ainakin 10 aminohappoasemista 30, 51, 57, 88, 89, 136 ja 138 kin yksi lisätty N-kytketty hiilihydraattiketju on ty mihin tahansa mainituista aminohappoasemista, t< (b) mainitussa analogissa on yhden tai aminohapon pidennys erytropoietiinin karboksyylipää 15 ka pidennys sisältää ainakin yhden glykosylaatiokoh (c) mainittu analogi käsittää yhden tai ihmisen erytropoietiinin glykosylaatiokohdan dele1 yhtä suuren lukumäärän ei-luonnollisten glykosylaat en lisäyksen, jolloin hiilihydraattiketjujen asemat 20 vat, tai (d) mainitussa analogissa on ylimääräinen sylaatiokohta aminohappoasemassa 123 ja ylimäärä • 9 kytketty hiilihydraattiket ju on liitetty mainittuu » happoasemaan, J ·· 25 jolle menetelmälle on tunnusomaista, että . . lään nisäkäsisäntäsolua, joka käsittää DNA-sekvens • 1 « f J • · « 11/ ka koodaa mainittua ihmisen erytropoietiinin anal' * » i *'1 1 eristetään näin tuotettu analogi.

Keksintö koskee lisäksi tällaisia erytropo 30 analogeja koodittavia DNA-sekvens se jä sekä analog: «·· S.· oressiota varten olevia ί säntäsoluia.

6 happamampiin (alempi pl) kaistalla 11. Myös puhdist kombinanttierytropoietiini, joka sisältää isoformie seoksen, nähdään geelin vasemman- ja oikeanpuolei kaistoilla.

5 Kuviossa 2 nähdään suhde siaalihappojen li erytropoietiini-isoformia kohti j a kunkin isoformir -ominaisaktiivisuuden, ilmaistuna yksiköinä mil] erytropoietiinipolypeptidiä kohti, välillä. Kuvi kunkin erytropoietiini-isoformin konsentraatio määi 10 Bradfordin proteiinimäärityksellä, 2B:ssä konse määritettiin absorbanssin aallonpituudella 280 nm 2C:ssä konsentraatio määritettiin RIArlla.

Kuviossa 3 nähdään sellaisten määriteltyjä binanttierytropoietiini-isoformiseosten analyyttir 15 elektrinen fokusointigeeli, jotka on valmistettu vaihtokromatografiällä eri olosuhteissa. Geelin 1-6 ovat vastaavasti erytropoietiini-isoformit, eluoitu korkealla suolavahvuudella sen jälkeen Sepharose fast flow -pylväs on pesty 150 mM etikkc 20 pH 4,7, 150 mM etikkahapolla (puskuroimattomalla) etikkahapolla, pH 4,7, 250 mM etikkahapolla, pH 4,] etikkahapolla, pH 4,7, tai 300 mM etikkahapolla (f • « ·*ϊ\ mattomalla). Geelin vasemmanpuoleisimmalla kaista dään myös Lain ym. mainitussa teoksen esimerkissä • *t 25 tuja menettelyjä käyttäen, paitsi että DEAE-£ • * • kromatografia on korvattu Q-Sepharose-kromatogi ***.· saatu puhdistettu rekombinanttierytropoietiini, jol· • * * *·* * tää seoksen isoformeja.

Kuviossa 4 nähdään erytropoietiinin isofor ^ * 30 12 erottaminen, joka saatiin aikaan panemalla solu ··« • ί kattu elatusaine. inka oli vietv Ω-Rpnharnfip-nvl , 11 paitsi että DEAE-agaroosikromatografia on korvattu rose-kromatografialla, saatu puhdistettu rekombinan ropoietiini, joka sisältää seoksen isoformeja.

Kuviossa 5 nähdään ihmisen erytropoietiinii 5 happosekvenssi. Neliöt ilmaisevat asparagiinitähte< hin N-sidokselliset hiilihydraattiketjut kiinnitti tähti ilmaisee seriinitähteen, jota on muunnettu sellisella hiilihydraattiketjulla.

Kuvioissa 6A, 6B ja 6C nähdään kloonausv 10 sarja, jota käytettiin muodostettaessa plasmidit erytropoietiinin analogien konstruktiota ja analyy: ten. Näissä analogeissa on muutettu kuvion 5 mu aminohappoja, jotka tuovat lisää glykosylaatiokohti;

Kuviossa 7 nähdään "Western blot" -analyy 15 solusupernatanteista, joissa on ihmissekvenssistä poietiinia ja ilmoitettuja erytropoietiinianalogeja git [Asn9, Sern]-EPO, [Asn69]-EPO, [Asn125, Ser127] [Pro124, Thr125]-EPO on konstruoitu kuten esimerkis kuvattu. Vielä eräitä analogeja, [Pro125, Thr127] 20 [Asn126, Ser128]-EPO, jotka eivät sisällä lisättyjä h raattiketjuja, esitetään vertailun vuoksi.

:\j Kuviossa 8 nähdään "Western blot" -analyy ·*·’. solusupernatanteista, joissa on ihmissekvenssistä poietiinia ja ilmoitettuja erytropoietiinianalogej; 25 kanaasikäsittelyn jälkeen. Analogit [Thr125]-EPO ja • · 125 . . Thr ]-EPO konstruoitiin kuten esimerkissä 6 on • · · *:*.* Analogit [Vai126]-EPO, [Pro124]-EPO, [Pro125]-EPO, *· ' EPO, [Pro125, Ser127] -EPO ja [Thr125, Ser127]-EPO e vertailun vuoksi.

30 Kuviossa 9 nähdään isoelektrinen fokusoi: ··« 5...: jaoksista 2, 3 ja 4, jotka oli saatu sellaisen soi 8 1 käyttäen, paitsi että DEAE-agaroosikromatografia on tu Q-Sepharose-kromatografiällä, saatu puhdistettu nanttierytropoietiini, joka sisältää seoksen isofor:

Kuviossa 10 nähdään "Western blot" -analy; 5 solusupernatanteista, joissa on ihmisen rekombinan ropoietiinia (rHuEPO) ja valittuja erytropoietiini ja. Analogien konstruointi on kuvattu esimerkissä 6 geilla N9, N14, N18, N19, N21, N24 ja N39 on aina hiilihydraattiketju enemmän, mistä osoituksena on 10 liikkuvuus geelillä.

Kuviossa 11 nähdään "Western blot" -analy; solusupernatanteista, joissa on ihmisen rekombinan ropoietiinia ja analogia EPO N14 N-glykanaasidiges kana. Aikapisteet otettiin hetkillä 0, 4, 12 ja 45 15 tia ja yön yli digestion jälkeen.

Kuviossa 12 nähdään analogin EPO N14 isofor raattien isoelektrinen fokusointigeeli. Alempi isof sisältää EPO N14 -analogeja, joissa on enimmäksee: siaalihappoa molekyyliä kohti, keski-isoformijaos 20 EPO N14 -analogeja, joissa on enimmäkseen 10 - 15 happoa molekyyliä kohti, ja ylempi isoformijaos EPO N14 -analogeja, joissa on enimmäkseen 12 - 17 happoa molekyyliä kohti.

:·. Kuviossa 13 nähdään ihmisen rekombinanttier I ·· ···.: 25 etiinin, eristetyn isoformin 14 ja EPO N14 -analog * · . . formit 15 - 17) farmakokinetiikka laskimonsisäisen i # » • · « ***/ on jälkeen rotissa.

* » ·

Kuviossa 14 nähdään 125I-leimatun ihmisen nanttierytropoietiinin erytropoietiinireseptoriin 30 misen ei-radioaktiivisen syrjäyttämisen määritys, k \..J na oli eri määriä leimaamatonta rHuEPO:a, eristet- , 1 EPO 177:n ylemmän isoformijaoksen (0,0712 pg) ja (0,071 pg) aktiivisuutta.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Puheena oleva keksintö tuo käytettäviksi me 5 erytropoietiinin analogin tuottamiseksi. Tämän k mukaisella menetelmällä saadut spesifiset erytropo isoformit voivat vaihdella riippuen lähtömateriaa! teestä. Esimerkiksi virtsasta saadun ihmisen erytro nin isoformit ovat erilaisia kuin rekombinanttier 10 etiinin isoformit. Keksinnön edullisessa suoritus keksinnön mukainen menetelmä koskee erytropoietii] formia, jossa on tietty lukumäärä (ts. nollaa kiinteä lukumäärä) siaalihappoja erytropoietiinimo kohti, kyseisen lukumäärän voidessa olla 1 - 14. Ed 15 ti kyseinen lukumäärä on 9, 10, 11, 12, 13 tai 14.

suoritusmuodossa kyseinen lukumäärä on yli 14, edu 16 - 23.

Termi "erytropoietiinin isoformi", kuten si käytetään, viittaa erytropoietiinipreparaatteihin, 20 on vain yksi isoelektrinen piste (pl) ja sama amino kvenssi. Termi "erytropoietiini", kuten sitä täss; :\f tään, sisältää luonnossa esiintyvän erytropoietiini ;*·*; sasta saadun ihmisen erytropoietiinin sekä myös mi luonnossa esiintyvät polypeptidit, joilla on rii ,,,.· 25 luonnossa esiintyvää erytropoietiinia muistuttavat • *

. happosekvenssi ja glykosylaatio siihen, että niilJ

I * · *11/ vlvo biologiset ominaisuudet, jotka saavat luuydins *·* säämään retikulosyyttien ja punasolujen tuotantoa.

On keksitty, että yksittäiset rekombinantt *·:.· 30 poietiinin isoformit, joilla on virtsasta peräisii ihmisen erytropoietiinin aminohapposekvenssi, v ίο

Keksinnön mukaisen menetelmän edullisessa s muodossa erytropoietiini on tuote sellaisen eksc DNA-sekvenssin ekspressiosta, joka on transfektoit kuin ihmisestä olevaan eukaryootti-isäntäsoluun, t 5 lisessa suoritusmuodossa erytropoietiini on "rekc tierytropoietiini". Rekombinanttierytropoietiini t edullisesti niiden menettelyjen mukaisesti, jotka c tu yhteisessä omistuksessa olevassa Linin US^pa 4 703 008, joka sisällytetään tähän viitteeksi. 10 nanttierytropoietiini voidaan puhdistaa niiden ylei nettelyjen mukaisesti, jotka on kuvattu yhteisessä sessa olevan Lain ym. US-patentin 4 667 016, joka tetään tähän viitteeksi, esimerkissä 2, tai vaihtoa ti Lain ym. esimerkissä 2 kuvatun mukaisella menet 15 jossa DEAE-agaroosikromatografia korvataan Q-Sephai matografiällä.

Erytropoietiini, joka on puhdistettu Lain nitun teoksen esimerkin 2 mukaisesti, sisältää ρέ kuutta isoformia lEF:lla analysoituna. Lisäksi vie 20 kin yksi happamampi isoformi on havaittu esimerkis vatuilla kromatografiamenettelyillä. {Tämä happamap joka kulkeutuu >14 siaalihapon kohdalla IEF-geeli * · sisältää negatiivisia varauksia, jotka ovat muuta » :·. aalihappoa, mikä näkyy osan varausta vastustuskykyr « ··.«: 25 daasidigestiolle) . Nämä isoformit poikkeavat toisis • · • . aalihapposisältönsä suhteen. Kuten esimerkeissä ηέ • · · ***.· tämä osoitetaan eristämällä 10 näistä isoformeista • · · *·* tiivisella IEFrllä ja määrittämällä siaalihapposisc destä niistä. Siaalihapposisällön suhteen analys \5.: 30 isoformeista havaitaan, että nämä viisi isoformia SS “1 r\\r/~s. G 1 Π 11 1 O +- o ί 1 1 oliiriiInVi λ 11' 11 -14 on likimain sama suhteellinen in vivo spesif tiivisuus. Isoformeista 5-14 analysoitiin in vivc visuus hypoksiassa pidettyihin polysyteemisiin hii rustuvalla biologisella määrityksellä, ja kunkin i 5 määrä määritettiin Bradfordin proteiinimääritykse^ sorbanssilla aallonpituudella 280 nm tai erytropc radioimmunologisella määrityksellä (RIA:lla) . RIA-ir set [Egrie ym., Immunobiology 172, 213 (1986)] iin yksiköinä/ml jaetaan luvulla 212 770 yksikköä/mg ei 10 etiinipolypeptidiä, puhdistetun erytropoietiinin ]< räisellä spesifisellä aktiivisuudella RIA:11a mä mukaisesti, eristettyjen isoformien tai isoforn proteiinikonsentraatioiden saamiseksi milligrammois ropoietiinipolypeptidiä/ml. Kuten esimerkeissä 15 suhteelliset in vivo spesifiset aktiivisuudet lis portaittain isoformista 5 isoformiin 11 (ks. tauluk In vivo spesifiset aktiivisuudet, joihin ts tataan, ovat suhteellisten in vivo spesifisten akti sien mittauksia eivätkä absoluuttisten in vivo spe 20 aktiivisuuksien mittauksia. Tämän patenttihakemus koituksiin spesifisiä aktiivisuuksia käytetään vain :\j lemaan isoformien suhteellisia aktiivisuuksia, j ·***: määritetty samaa määritystä käyttäen, samoja ole i’· käyttäen, mukaan lukien sama sisäinen standardi, sa 25 piset eläimet, se, että tulokset analysoidaan sam • · • valla spesifisen aktiivisuuden laskemiseksi, sama * · · proteiinimäärän mittaamiseksi. Ei ole tarkoitus, j · · * * kään millekään isoformeista raportoitu in vivo sp aktiivisuuden arvo on sille isoformille luonnostaan ^ * 30 tai absoluuttinen arvo.

* * Tämä keksinnön mukaisella menetelmällä t ä 12 etiinimolekyyliä kohti, esim. yli 11 siaalihappoa poietiinimolekyyliä kohti tai yli 12 siaalihappoa poietiinimolekyyliä kohti, esim. isoformien 12, ] seos. Toisessa suoritusmuodossa keksinnön mukaisel 5 telmällä tuotettavat koostumukset käsittävät s seoksia isoformeja, joissa on jokin ennalta päätet määrä siaalihappoja erytropoietiinimolekyyliä koht alle 12 mutta yli 8 siaalihappoa erytropoietiinimc kohti, kuten esimerkiksi isoformien 9, 10 ja 11 se 10 sintö tuo myös käytettäviksi erytropoietiini-isofc tumuksia, joissa isoformien suhteelliset määrät ova tai erisuuruisia. Esimerkiksi isoformien 9, 10 ja sessa voisi olla isoformeja erilaisissa suhteiss 1:1:1, 2:3:1 tai 20:20:1.

15 Edullisesti koostumukset käsittävät alle isoformin seoksia, esimerkiksi isoformien 11, 12 jc tai 12:n ja 14:n seos tai 7:n ja 13:n seos.

Erytropoietiinin isoformien seosten tuott tämä keksintö tuo myös käytettäviksi menetelmiä ve 20 erytropoietiinin isoformien eristämiseksi samanail· Näihin menetelmiin kuuluvat yksittäisten isoformier minen sellaisilla menetelmillä kuin preparatiivii elektrinen fokusointi tai sellaisten isoformiseos niistäminen, joissa on ennalta päätetty määrä siaaJ 25 molekyyliä kohti (esimerkiksi yli 11), sellaisilla • * . millä kuin ioninvaihtokromatografia tai kromatofol· I · «

Kaikki nämä menetelmät pohjautuvat proteiinien erot t * · • varauksen perusteella.

Yleensä ioninvaihtokromatografiaan ja ki 5.:*: 30 kusointiin kuuluu joko epäpuhtaan ihmisen erytropc ··♦ • « * . .. .....

11 13 teillä proteiini voidaan viedä pylvääseen pH-arv( noin 4. Kun pylvästä on pesty puskurilla, jonka pH 4, ioninvaihtopylvääseen sitoutuneina pysyneet er etiinin isoformit eluoidaan nostamalla puskurin j 5 suolapitoisuutta tai käyttämällä gradienttia, jossa keva pH ja kasvava ionivahvuus pH-arvossa noin 4. fokusointia varten isoformit eluoidaan pylväästä tiliä, jossa on laskeva pH tai pesemällä pylväs k suolapitoisuudella.

10 Edullisessa suoritusmuodossa yksittäiset i eristetään ioninvaihtokromatografiaa käyttäen. Esi isoformi 14 eristettiin ioninvaihtokromatografiaa kuten esimerkissä 8 on kuvattu.

Keksinnön mukaisella menetelmällä tuotettav 15 logeihin sisältyvät myös tietyt ihmisen erytropc analogit. Kuten termiä tässä käytetään, "ihmisen er etiinin analogi" viittaa erytropoietiiniin, jossa tai useampi sellainen muutos ihmisen erytropoietii nohapposekvenssissä, joka johtaa lisäykseen siä 20 kiinnitymiskohtien lukumäärässä. Analogeja muod kohdennetulla mutageneesillä, jossa aminohappotäht ··. : sätään, poistetaan tai korvataan siten, että glykc * · oon tarjolla olevat kohdat lisääntyvät tai muuttuv • t · laisissa analogeissa voi olla suurempi lukumäärä h • * * 25 raattiketjuja kuin ihmisen erytropoietiinissa.

. / Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä tuo » * * ••j · erytropoietiinianalogit käsittävät aminohapposek • · * *·* * johon sisältyy ainakin yksi lisätty glykosylaat

Analogeja, joissa on korkeammat siaalihappomäärät 30 misen erytropoietiinissa tavatut, muodostetaan li : 1 rrl vlcnsvl nlfnhti a . nrvhlrp häi ri Ί-ςο hinlnrri > 14 taan asparagiinilla, josta saadaan sekvenssi Asn-j oka toimii neljäntenä N-glykosylaatiokohtana. Ί muutos voi usein tuoda neljä siaalihappoa lisää mc kohti. Esimerkkejä muutoksista, jotka muodostavat 5 glykosylaatiokohtia, ovat alaniinin asemassa 12' treoniiniksi ja alaniinien asemissa 124 ja 125 mui vastaavasti proliiniksi ja treoniiniksi. Voidaan n analogeja, joissa on yksi tai useampia uusia N sidoksellisia ketjuja, esimerkiksi taulukossa 5 10 analogit NOl ja N02. Kuten ammattimiehet ymmärtävc keksinnön mukaisella menetelmällä tuotettaviin am sisältyy monia muita ihmisen erytropoietiinin ar joihin on lisätty glykosylaatiokohtia.

Keksinnön mukaisella menetelmällä tuotetta 15 logit kattavat myös analogit, joissa on kohonnut l raatin kiinnittymisen taso glykosylaatiokohdassa. siin analogeihin yleensä liittyy yhden tai useammar sen aminohapon substituutio, jotka ovat erittäin li tai O-sidoksellista kohtaa. Näiden aminohappomuutc 20 loksena suuremmassa osassa erytropoietiinipolypept hiilihydraattimodifikaatio. Glykosylaatiokohdat voi luonnossa esiintyviä tai mutaatiolla aikaansaatuja, • * kiksi analogi N13 ei muodosta uutta hiilihydraatt l\ vaikka uusi glykosylaatiokohta tuotiin asemaan 88.

• ·* 25 kin analogeilla N14 ja N18, joilla on vastaavasti - * * . . nitähteet substituoituna aseinaan 87, on uusi hiili *l\/ tiketju asemassa 88.

• * # *·* * Keksinnön mukaisella menetelmällä tuotetaa geja, joissa on yksi tai useampia aminohappoja ei m 30 etiinin karboksipään jatkeena, ja joissa karboksit • · · 11 15 fragmentissa on neljä O-glykosylaatiokohtaa [Kess J. Biol. Chem. 254/ 7907 (1979)].

Taulukoissa 3, 4 ja 5 luetellaan erytropc analogit, joissa on lisättyjä N-sidoksellisten 5 O-sidoksellisten hiilihydraattiketjujen kohtia. Ane on sekvenssi Asn-X-Ser/Thr substituoituna eri asemi sen erytropoietiinin polypeptidiketjua N-sidoks kohtien luomiseksi tai niihin on tuotu seriini- t niinitähteita O-sidoksellisten kohtien luomiseksi.

10 Taulukossa 6 luetellaan ne analogit, jois tään ainakin yksi uusi N-sidoksellinen tai yl< O-sidoksellinen hiilihydraattiketju, tai lisätää N-sidoksellisia ja O-sidoksellisia hiilihydraatt samanaikaisesti, kuten osoittaa glykoproteiinien li 15 SDS-geeleissä (esimerkki 7) . Kuten taulukoista 3 daan ymmärtää, analogit, joissa on yksi tai useamp kohtia hiilihydraatin kiinnittymistä varten, eivät mättä johda erytropoietiinimolekyyleihin, joissa hiilihydraattiketjuja. Esimerkiksi treoniinin sub£ 20 asemiin 123 ja 125 johti O-sidoksellisen hiilihydra jun lisäämiseen, kun taas seriinin tai treoniinin ·'·,· tuutio muihin asemiin ei johtanut analogeihin, j # # uusia O-sidoksellisia ketjuja (ks. taulukko 4) . i 9 asparagiinitähteiden substituutio asemiin 30, 51, [βββ. 25 88, 89, 136 ja 138 ihmisen erytropoietiinin amine • · . . kvenssissä johti N-sidoksellisen ketjun lisäämisee « « · « · * kohtiin. HCG-polypeptidi fragmentin fuusioiminen • · * *·’ * erytropoietiinissa asemassa 166 olevaan arginiinitc johti erytropoietiini-HCG-fuusiomolekyyliin, jossa 30 kin kaksi uutta O-sidoksellista hiilihydraattiketju lii ! ! Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä tnr 16 n: toon ihmisen erytropoietiinissa ja yhden tai useamn nossa esiintymättömän glykosylaatiokohdan lisäämise logit Rl, R2 ja R3 ovat esimerkkejä tällaisista ui järjestymisistä, ja ne muodostettiin poistamalla 5 sellinen kohta vastaavasti asemissa 24, 38 tai 83 säämällä N-sidoksellinen kohta asemaan 88. Kuitenki sat muuntyyppiset hiilihydraattikohtien uudellenjäi set ovat mahdollisia, ja tuloksena saatavilla ane voi mahdollisesti olla suurempi määrä glykosylaat 10 ihmisen erytropoietiiniin verrattuna.

Analogeista Rl, R2 ja R3 analysoitiin in i loginen aktiivisuus, ja tulokset esitetään taulukos sidoksellisen ketjun tuominen asemaan 88 palautti sen aktiivisuuden erytropoietiinille, josta oli mills sa näistä kolmesta luonnossa esiintyvästä N-sidoks* kohdasta poistettu. Nämä tulokset osoittavat, ett hydraattiketjujen asemia erytropoietiinissa voidaar hyödyllisten analogien muodostamiseksi ilman, että seen aktiivisuuteen on merkitsevää vaikutusta.

20 Tämä keksintö kattaa myös DNA-sekvenssi1 koodittavat erytropoietiinianalogeja, joissa on ] :*·.· kohtia N-sidoksellisille ja/tai O-sidoksellisille « * .*:% le, analogeja, joissa on ainakin yhden hiilihydraat • kiinnittymiskohdan uudelleenjärjestyminen, ja ar 25 joissa on yksi tai useampia aminohappoja jatkeena • · . ^ poietiinin karboksipäälle. Menettelyt, joita käytet • * » tosten tuomiseksi ihmisen erytropoietiinin DNA-sel· « · « tarkoituksena luoda tai muuttaa hiilihydraattien kd miskohtia, esitetään esimerkissä 6.

\5.: 30 Nämä erytropoietiinianalogit voivat olla el· v · sen DNA-sekvenssin eksnression tuotetta, ts. vhr 11 17 isäntäsoluja tuodaan käytettäviksi. Ekspressiovel· kuuluu mikä tahansa vektori, joka kykenee ekspre kloonattuja DNÄ-sekvenssejä eukaryootti-isäntäsolus tyisesti ne vektorit, joita käytetään ekspressioon 5 CHO-soluissa. Esimerkkeihin tällaisista vektoreist vat plasmidit pEC ja pDECA, jotka on kuvattu pate kaisun esimerkissä 6. Erytropoietiinianalogeja eks vien COS- ja CHO-isäntäsolujen viljely suoritettii timiehen tuntemia menettelyjä käyttäen.

10 Erytropoietiininanalogeista peräisin olev: tettyjä isoformeja ja isoformiseoksia saadaan käyt netelmiä, jotka edellä on kuvattu ihmisen erytropc isof omien valmistamista varten. Näihin menetelr kuulua isoelektrinen fokusointi, ioninvaihtokromc 15 ja kromatofokusointi. Edullisesti ioninvaihtokromat käytetään erytropoietiininanalogeista peräisin eristettyjen isoformien ja isoformiseosten valmista Hiilihydraattiketjujen lukumäärän, ja siksi happojen lukumäärän erytropoietiinimolekyyliä kohti 20 minen erytropoietiiniin voi antaa edullisia ominai kuten lisääntyneen liukoisuuden, paremman vastus 1 proteolyysille, vähentyneen immunogeenisyyden, * * puoliintumisajan seerumissa ja lisääntyneen biolog tiivisuuden.

• *· 25 Muokatuista elatusaineista CHO-soluilta, jc * * . „ pressoivat erytropoietiinin analogeja, analysoitiin * * * biologista aktiivisuutta, ja tulokset esitetään ta • · * #·* * 6. Useilla testatuilla analogeilla oli aktiivisu' oli ainakin kolme kertaa korkeampi kuin ihmisen ei 30 etiinilla. Erityisesti analogeilla, joihin on li, Λ Λ «ti 1 1 « * t < -i ' Ί 1 ..'!<« i — • · 9 11 18

Kaksi erytropoietiinianalogia, joissa on hiilihydraattiketjuja, puhdistettiin, ja isoform joissa on erilaiset siaalihapposisällöt, eristett merkki 8). Analogit Thr125 ja Ser87Asn88Thr90 (EPO 5 tettiin kolmeen isoformifraktioon, ja kunkin fr vivo biologinen aktiivisuus määritettiin. Tau] esitetyt tulokset osoittavat, että niissä EPO N14 mifraktioissa, joissa on korkeampi siaalihappoi suurempi in vivo -aktiivisuus.

10 EPO N14:n jaosta, jossa oli runsaasti siä sisältäviä isoformeja, ja ihmisen rekombinanttie etiinia (isoformit 9-14) tutkittiin reseptori! mismäärityksissä, farmakokineettisissä kokeissa J sa, joissa määritettiin hematokriitin nousua 15 Näiden määritysten tulokset osoittavat, että siä määrän, poistuman puoliintumisajan ja kyvyn nos teltyjen hiirten hematokriittiä välillä on suo Niinpä, kuten kuvioissa 13, 14 ja 15 nähdään, runsaasti siaalihappoa sisältävällä isoformijaok 20 merkitsevästi pidempi puoliintumisaika in vivo aikaan suuremman nousun hematokriitissä kuin eristetty isoformi 14 tai ihmisen rekombinanttie etiini, vaikka EPO N14:n runsaasti siaalihappoa • « « isoformi jaos ei sitoutunut yhtä voimakkaasti res • * . 25 Keksinnön eräs toinen suoritusmuoto liit / / käsperäisiin isäntäsoluihin (esim. kiinanhamste * f · sarjasolut, CHO), jotka syntetisoivat etupäässä : ihmisen erytropoietiinin tai erytropoietiinianalc formeja, joissa on enemmän kuin tietty määrä siaa * 30 molekyyliä kohti, esim. yli 10 siaalihappoa n • i* * * UnKf π öf ί ^ ηί ιϊιλΊ aWrtvl λλ M- -ΐ e 19 miselle, kun taas kaksi- ja kolmihaaraisissa olig diketjuissa, joita voi olla nelihaaraisen muodo asparagiiniin kiinnittyvissä kohdissa, on yleen enintään kaksi tai kolme siaalihappoa. O-sido 5 oligosakkaridit tarjoavat yleensä kaksi kohtaa si kiinnittymiselle. Siten erytropoietiinimolekyyle daan saada yhteensä 14 siaalihappoa sillä edelly että kaikki kolme N-sidoksellista oligosakkar: nelihaaraisia. Nisäkässoluviljelmistä seulotaan 10 luja, jotka lisäävät enimmäkseen nelihaaraisic rekombinanttierytropoietiiniin, jolloin maksimoic lihappojen kiinnittymispaikkojen lukumäärä.

Virtsan erytropoietiinin N-sidokselliset karidit sisältävät siaalihappoa sekä a2,3- että 15 doksessa galaktoosiin [Takeuchi ym., J. Biol. C 3657 (1988)]. Tyypillisesti a2,3-sidoksessa olev happo lisätään ai,6-mannoosihaarassa olevaan gal ja a2,6-sidoksessa oleva siaalihappo lisätään noosihaarassa olevaan galaktoosiin. Entsyymit, 20 säävät nämä siaalihapot (8-galaktosidi-a2,3-sialy feraasi ja B-galaktosidi-a2,6-sialyylitransfers. : tehokkaimpia lisättäessä siaalihappoa vastaavasta .···. ai, 3-mannoosihaaraan.

» » I

Kiinanhamsterin munasarj asoluj a (CHO-solu; • ** # . 25 ta puuttuu dihydrofolaattireduktaasi (DHFR), / / usein isäntäsoluna rekombinanttiglykoproteiiniei * < * ••j * toon, mukaan lukien rekombinanttierytropoietiii V ' solut eivät ekspressoi B-galaktosidi-a2,6-sialyyl raasientsyymiä, ja siksi eivät lisää siaalihap] 30 sidoksessa näiden solujen tuottamien glykopr ·** B , , m 11 7 20 galaktoosiin oleva siaalihappo [Sasaki ym. (1987), teos, Takeuchi ym. (1987) era. teos].

Toisessa tämän keksinnön mukaisessa suorita sa ihmisen erytropoietiinia tai erytropoietiind 5 tuotetaan CHO-soluissa, jotka on transfektoitu te (3-galaktosidi-a2, 6-sialyylitransferaasigeenillä, siaalihappoa saadaan liittymään a2,6-sidoksessa c siin. Tuloksena saatavat isoformit sisältävät siaa] jolla on sekä a2,3- että oc2, 6-sidoksia galaktoos 10 artikkelista Lee ym., J. Biol. Chem. 264, 13848 (15 ka liitetään tähän viitteeksi, esitystä menetelmist la luodaan muunnettuja CHO-soluja tai muita nisä täsoluja.

Farmaseuttiset koostumukset, jotka käsittää 15 peuttisesti tehokkaan määrän tiettyä isoformia tai miseosta yhdessä soveliaan laimennusaineen, a ja/tai kantajan kanssa ovat hyödyllisiä erytropoie rapiassa. Hyödyllisä ovat myös farmaseuttiset koost jotka käsittävät terapeuttisesti tehokkaan määrän 20 poietiinianalogia yhdessä soveliaan laimennusaineer neen ja/tai kantajan kanssa. "Terapeuttisesti teho rä", kuten termiä tässä käytetään, viittaa määrää 9 9 saadaan terapeuttinen vaikutus tiettyyn tilaan S*. hoito-ohjelmalla. Ihmisen erytropoietiinin is 25 tai erytropoietiinianalogeja annetaan edullisesti • * •. parenteraalista reittiä. Valittava spesifinen reit * * * puu hoidettavasta tilasta. Ihmisen erytropoietiii * · · • * formeja tai erytropoietiinianalogeja annetaan edi; osana formulaatiota, joka sisältää soveliaan l· 30 kuten ihmisen seerumin albumiinin, soveliaan lain ··· * · neen, kuten ouskuroidun suolaliuoksen ia/tai soveli 21 11 riippuen hoidettavan tilan vakavuudesta, käytety menetelmästä ja vastaavista.

Seuraavat esimerkit tarjotaan keksinnön h listamiseksi täydellisemmin, mutta niitä ei pidä 5 sen suoja-alaa rajoittaviksi. Esimerkeissä tehc vivo biologisissa määrityksissä käytetty erytrop standardi on rekombinanttierytropoietiinistandai oli standardisoitu osittain puhdistettua virtsai poietiinistandardia vastaan. Siten vain suhteel 10 vivo spesifisiä aktiivisuuksia mitataan. In vi\ fiset aktiivisuudet ilmaistaan myös yksiköissä köä/mlM, "yksikköä/mg” ja ”yksikköä/Α2β0”, eikä y "KY/ml", "KY/mg " ja "KY/A280", koska käytettyä e etiinistandardia ei ole suoraan korreloitu mihin 15 massa olevaan kansainväliseen standardiin.

Esimerkki 1

Rekombinanttierytropoietiinin isofonnien

Rekombinanttierytropoietiini on tuotettu kuvattu Linin mainitussa teoksessa. Rekombinant 20 poietiini, jota käytetään lähtömateriaalina ens ja kolmanteen isoformieristykseen, on puhdistett nettelyn mukaisesti, joka on kuvattu yhteisessä • * sessa olevan Lain ym. mainitun patentin esime] ··. Lähtömateriaali toiseen ja viidenteen isoformier t m | · 25 on puhdistettu Lain ym. mainitun teoksen mukaise • * f . täen Q-Sepharose-kromatografiamuunnosta* Nämä pr • · * ···/ sisältävät seoksen rekombinanttierytropoietiinin • · * ** * ja, joilla on sama aminohapposekvenssi kuin virt räisin olevalla ihmisen erytropoietiinilla, ja ne 30 vät pääasiassa isoformeja 9-14. Lähtömateriaal : ΐ teen isoformiDreoaraattiin on materiaali, inka 11 22 grafiällä, kuten on kuvattu Lain ym. esimerkissä käyttöä preparatiivisessa isoelektrisessä fokus* Kuudes isoformipreparaatti käytti lähtömateriaali distettua rekombinanttierytropoietiinipreparaatt: 5 oli 4-13 siaalihappotähdettä. Tämä materiaali pi tiin Lain ym. esimerkin 2 mukaisesti lukuun ottam tosta ioninvaihtopylväässä (rekombinanttierytro] eluoitiin natriumkloridigradientilla pH:ssa 8,4 j happo/ureapesu jätettiin pois), mikä johtaa useim 10 töaineessa olleiden isoformien säilymiseen.

Kuusi erilaista yksittäisten isoformien p: tia tehdään preparatiivisella isoelektrisellä foki la rakeisessa geelissä (Ultrodex, LKB) oleellises "LKB Application Note 198" mukaisesti. Pharmalj 15 -amfolyyttejä (Pharmacia) käytetään, ja geeli sis urean.

Ensimmäisessä preparaatissa noin 20 mg reki tierytropoietiinia 6,8 ml:ssa puskuria 20 mM na raatti/100 mM natriumkloridi, pH 7,0, pannaan ge< 20 fokusoidaan 8 watin teholla noin 16 tuntia. Isoe fokusoinnin jälkeen geelissä olevat isoformiy •**J visualisoidaan geelistä paperilla painamalla otet jellä. Jälki otetaan ja sitten kiinnitetään lii *·* * · ··. kolmesssa erässä (noin 10 minuuttia kussakin, hui 25 pötila) kiinnitysliuosta (40 % metanoli/10 % e . . po/10 % TCA/3,5 % sulfosalisyylihappo), yhdess * * *11/ (noin 10 minuuttia) liuosta 40 % metanoli/10 % et *** ‘ (30 - 60 °C), värjätään 15 minuuttia 60 °C:n läm] liuoksessa 0,125 % Coomassie Blue R-250/40 % meta 30 etikkahappo, ja sitten väriä poistetaan liuokses S.„5 metanoli/10 % etikkahappo erottuneiden isoformien 23 1 preparaatti fokusoidaan toisen kerran, ja geelist jälki paperille kuten edellä. Kunkin kuudesta ero sa olevasta isoformista sisältävä osa geelistä po Isoformien eluoimiseksi geelistä kuhunkii 5 miin lisätään liuosta 10 mM Tris-HCl, pH 7,0/5 lietteen saamiseksi. Lietteet pannaan pieniin p ja pestään Tris-Chaps-puskurilla. Läpi tulleet kerätään ja pannaan erikseen pieniin pylväisiin oleviin), joissa on Vydac-C4-käänteisfaasihartsis 10 tasapainotettu liuoksella 20 % etanoli/10 mM Tri 7.0. Pylväitä ajetaan portaittain liuoksilla 20 li/10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 35 % etanoli/10 mM Tri 7.0, ja 65 % etanoli/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. L 65 % etanoli/10 mM Tris eluoituva fraktio laimenn 15 liuoksella 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, ja pannaan kon tiin ja sitten sen puskuriksi vaihdetaan 10 mM pH 7,0, käyttäen Centricon-10 (Amicon) mikrokonse ria. Tämän preparaatin analyyttinen isoelektrii sointi suoritetaan oleellisesti kuten on kuvattu 20 "LKB technical note 250" käyttäen Servalyte 3-5 neja (Serva) polyakryyliamidigeelissä, joka sisl .·. : urean.

• M i #

Toisessa preparaatissa noin 26 mg rekom • · · erytropoietiinia 6,5 mlrssa deionisoitua vetti • ·* ] . 25 geeliin ja fokusoidaan 2,5 watin teholla 35 min . . 10 watin teholla noin 17 tuntia. Fokusoidun p • * · vyöhykkeet, jotka ovat näkyviä geelissä, poisl * * *· * " j aoksena. Jokainen j aos täytetään noin 7,5 ml: ks soidulla vedellä, ja 20 ml kustakin saadusta ja< 30 pernatantista pannaan analyyttiseen isoelektrisi i i sointiin, kuten edellä on kuvattu. Kuhunkin jaoks 11 24 tetään läpi tulleeseen. Eluaatit konsentroidaan . riksi vaihdetaan 20 mM natriumsitraatti/100 mM na ridi, pH 7,0, käyttäen Amiconin kertakäyttöisiä i datuslaitteita, joilla on molekyylipainon ekskli 5 10 000 Da. Konsentroidut liuokset (noin 0,5 mi; sitten selloloosa-asetaattisuodatinten läpi, joid huokoskoko on 0,22 pm. Analyyttisen isoelektris soinnin perusteella viiden jaoksen havaitaan s pääasiassa yksittäisiä isoformeja 10, 11, 12, 13 10 Kolmannessa preparaatissa noin 30 mg reki tierytropoietiinia 21,8 ml:ssa tislattua vettä geeliin ja fokusoidaan 2 watin teholla 25 minut watin teholla 20 tuntia ja 15 watin teholla 15 m. Yksittäisiä isoformeja vastaavan proteiinivyöhyJ 15 vaitaan visuaalisesti ja poistetaan geelistä. ' vettä lisätään geelissä eristettyihin isoformei) teen saamiseksi, ja saadut supernatantit analysoi lyyttisellä isoelektrisellä fokusoinnilla. Yhtä : lavuus liuosta 1 M Tris-HCl, pH 7,2, lisätään 20 lietteeseen, suspensiot pannaan erillisiin pienii siin, ja nestefaasin annetaan virrata pylvään läp mien eluoimiseksi. Kukin läpi tullut fraktio koi • * daan, ja puskuriksi vaihdetaan 20 mM natriui * * · ··, ti/100 mM natriumkloridi, pH 7,0, käyttäen Amicon • · * 25 käyttöisiä ultrasuodatuslaitteita, joilla on mole] , , non ekskluusioraja 10 000 Da. Analyyttinen isoe! * · ♦ fokusointi paljasti, että saatiin jaokset, jotka *·* * vät pääasiassa yksittäisiä isoformeja 9, 10, 11, 14.

* \i.: 30 Neljännessä isoformipreparaatissa käytett *«* : : töaineena erytropoietiinia, joka sisälsi isofornu 25 sen fokusoinnin Rotofor-nestefaasikennossa (Bio-R mond, Kalifornia, USA), jotta saadaan lähtöaineen le isoelektrisille pisteille paremmin sopiva am: alue. Esifraktiointi suoritettiin sekoittamalle 5 Pharmalyte 2,5-5 -amfolyyttiä 15 g:n ureaa kans säämällä puhdistettua vettä tilavuuden nos 50 ml:aan. Tämä seos fraktioitiin Rotoforissa teholla, 1 °C, 5,5 tuntia käyttäen 0,1 M fosfori] 0,1 M natriumhydroksidia vastaavasti anolyyttinä 10 lyyttinä. Amfolyyttifraktioita, joilla oli mite välillä 4,5 ja noin 6, käytettiin isoelektrises soinnissa vaakasuoralla geelillä.

Amfolyytit poistettiin isoformeista käytt. rieluter-laitetta (Amicon, Danvers, Massachussei 15 ja Centriconia (Amicon), jolla on molekyylipa^ kluusioraja 10 000, seuraavin parametrein: 0,18 kuri, pH 8,8, 100 volttia, 25 - 30 mA, 3 tuntii isoformien puskuriksi vaihdettiin 0,1 M natri geelisuodatuksella Sephadex G-25:ä (Pharmacia) : 20 Saatuj en viiden j aoksen analyyttinen isoelektrii sointi osoitti niiden sisältävän isoformeja 4, 5 ;*.J 8. Isoformi 4 kulkeutui useana juovana, mikä vii * i hen, että se on voinut hajota jonkin verran.

··. Viidennen isoformipreparaatin valmistusta * · 25 tiin lisäämällä esifokusointivaihe vaakasuoralla , . tapahtuvaan isoelektriseen fokusointiin. Tässä mu • · · ·;;/ sa proteiinia ei lisätty amfolyytti/urea/geeliseo * # *·* * nen elektroforeesia vaan se lisättiin isoelektris sointilaitteeseen sen jälkeen kun pH-gradientti * 30 dostettu geeliin. 75 minuutin (1 500 volttitunti ··· ! : kusoinnin iälkeen aioaeelistä Doistettiin katodi; 26 ultrasuodatuksella Centricon-10-laitteita (Amice täen.

Esifokusointimuunnokseen ryhdyttiin, jott siin isoformipreparaattien ultraviolettiabsorbans 5 suudet samankaltaisemmiksi lähtöaineena olevan nanttierytropoieti inin kanssa. Tämä parannus sp naispiirteissä voidaan nähdä eristettyjen isofo] sorbanssien suhteessa aallonpituuksilla 280 ja

Keskimääräinen absorbanssin aallonpituudella 280 10 260 nm:ssä mitattuun (A280/A260) preparaateista 2 man esifokusointia) saaduilla isoformeilla on 1,3 kun taas keskimääräinen A280/A260-suhde preparaate 6 (esifokusoitu) on 1,68 ± 0,20. Kun isoformi nrc tään pois laskuista, keskimääräiset A2eo/A2eo-suh' 15 1,39 + 0,11 ja 1,74 ± 0,09 vastaavasti preparaate 3 sekä 5 ja 6. (Isofonnilla 14 voi olla epäty spektri, koska sitä esiintyy vähiten, ja siten s tiimpi amfolyyttikomponenteista jääneistä vähäis puhtauksista aiheutuville häiriöille, tai koska 20 hinnä elektrodia vaakasuoralla geelillä tapahtuv elektrisessä fokusoinnissa). Keskimääräinen Azeo/ ·*· · rekombinanttierytropoietiinille, joka on valmist • yra. esimerkin 2 mukaisesti (muunnettuna kuten ai ### * :·. on kuvattu käyttäen Q-Sepharosea anioninvaihtoh 25 on 1,91 ± 0,04.

• # , , Kuten edellä on kuvattu, lähtöaine kuuden • · .

formipreparaattiin oli rekombinanttierytropoieti * · * raatti, joka sisälsi isoformeja 4-13. Amfolyyt kusoitiin Rotofor-laitteessa kuten neljättä pre 30 varten. Amfolyyttifraktiot, joilla oli mitattu p ! 5 3.7-4.8 kävtettiin vaakasuoralla oeelillä ta 27 11

Esimerkki 2

Rekombinanttierytropoietiinin iso form! en s posisältö

Isoformeille, jotka eristettiin kuten esim 5 on kuvattu, j a erytropoietiinille, j oka oli pu niiden menettelyjen mukaisesti, jotka on kuvattu mainitussa teoksessa (isoformien 9-14 seos), v puskuriksi 0,10 - 0,15 M natriumkloridi, ja niis soidaan siaalihapposisältö muunnoksella Jourdi 10 menetelmästä, J. Biol. Chem., 246, 430 (1971). S potähteet irrotetaan glykoproteiineista hydr 0,35 M rikkihapolla 80 °C:n lämpötilassa 30 minuu ja liuokset neutraloidaan natriumhydroksidilla e lyysiä. Mukana olevan erytropoietiiniproteiini 15 arvioimiseksi suoritetaan Bradfordin proteiin [Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976)] käytt dardina rekombinanttierytropoietiinia, jolla oi erytropoietiinin aminohapposekvenssi, käyttäen toimittamia määritysreagensseja ja mikromäärity 20 lyä. Tulokset, jotka ilmaistaan mooleina siaaliha lia erytropoietiinia kohti, esitetään taulukossa : formeista käytetään nimityksiä siaalihappojen 1 molekyyliä kohti mukaan, ja ne vaihtelevat vähit * · •I, masta (isoformi 9) happamimpaan (isoformi 13).

* . 25 9-13 nähdään kuvion 1 geelin kaistoilla 6-10 / / min 14 määrät eivät riitä siaalihapposisällön mit * * # : tarkasti. Tämän isoformin siaalihapposisältö p : sen liikkuvuudesta IEF-geeleillä suhteessa muihi meihin. Isoformien 5-8 (preparaatti nro 4) siä * :.·.ϊ 30 sisältöä ei ole mitattu, mutta se on samalla tav : **: tel tv niiden liikkuvuudesta IEF-aeeleillä.

28

Taulukko 1

Erytropoietiinin Moolia siaalihap isoformi mooli erytropoie 5 Isoformi 13 12,9 ±0,5

Isoformi 12 11,8 ± 0,2

Isoformi 11 11,0 ± 0,2

Isoformi 10 9,8 ± 0,3

Isoformi 9 8,9 ± 0,6 10 Isoformiseos (9 - 14) 11,3 ±0,2

Esimerkki 3

Rekombinanttierytropoietiinin isoformien suus 15 Esimerkissä 1 kuvatun mukaisesti eristet formeja mitataan absorbanssilla 280 nm aallonpi

Bradfordin proteiinimäärityksellä ja erytrop RIAilla niissä olevan rekombinanttierytropoietiir määrittämiseksi. Hypoksiässä pidettyihin polysy 20 hiiriin perustuvaa biologista määritystä [Co

Nature 191. 1065 (1961)] käytetään suhteelliset biologisen aktiivisuuden määrittämiseksi. Läsr erytropoietiiniproteiinin kvantitointi erytrop radioimmunologista määritystä käyttäen tuotti 4 . 25 joissa tiettyjen isoformien suhteellinen in vivo * * * nen aktiivisuus on korkeampi, koska isoformeii: * · # V ' sisältävät suuria määriä siaalihappoa, on ilmeise i « : ·· tunut immunoreaktiivisuus, mikä johtaa erytropoie '·**· sentraation aliarviointiin ja siten negatiivisiin 30 formien suhteellisen in vivo spesifisen aktiivisu :T: arviointiin. Biologisista määrityksistä saadut a rissä, ilmaistuna yksiköinä/ml, jaetaan vastaav • teiinikonsentraatioilla, jotta saadaan in vivo s 1 aktiivisuudet, jotka ilmaistaan yksiköinä/ma er 29 spesifisen aktiivisuuden arvoon. Useimmissa ta jokaisesta isoformipreparaatista tehtiin useita -määrityksiä. Samat In vivo -tulokset ovat mukana sen aktiivisuuden laskuissa kaikissa kolmessa sar 5 yksikköä/mg erytropoietiinipolypeptidiä määritel rustuen absorbanssiin aallonpituudella 280 nm, vo siin radioimmunologisessa määrityksessä tai B proteiinimäärityksen tuloksiin. Puhdistettua rek tierytropoietiinia, joka sisältää isoformeja 9 -10 tettiin standardina Bradfordin proteiinimäärityks voi olla vähemmän laskuissa, jotka tehtiin Bradfo teiinimääritystä käyttäen, koska joitakin prepara ollut enää saatavana, kun Bradfordin määritykset Erytropoietiinia, j oka oli puhdistettu 15 mainitussa teoksessa kuvattujen menettelyjen mu ja joka sisältää isoformien 9-14 seoksen, standardina RIA- ja in vlvo -määrityksissä.

Suhteelliset spesifiset aktiivisuudet, : maistaan yksiköinä/mg erytropoietiinipolypeptidiä 20 muuttaa yksiköiksi/A280 kertomalla luvulla 0,807 m poietiinipolypeptidiä/A280. Muunnoskerroin saadaan la erytropoietiinin absorptiviteetti [1,345 mg/A28< poietiiniglykoproteiinin proteiinipitoisuudella « t · :·. painoprosenttia, Davis ym., Biochemistry 26, 2633 • *.

25 Jolloin saadaan mg erytropoietiinipolypeptidiä, . . 1,345 mg erytropoietiinia/A2e0 x 0,60 mg polype • · · erytropoietiinia = 0,807 mg polypeptidiä/A280). Lis *** * sifiset aktiivisuudet, jotka on ilmaistu yks erytropoietiinipolypeptidiä, voidaan kertoa *.ί.: 30 0,60 mg polypeptidiä/mg erytropoietiiniglykopr ϊ : 1olioin saadaan soesifiset aktiivisuudet ilman s- 30

C} CSJLOlOVrOCMrHrH^H

3 o o o o o o rrt o o o o o o

H CTtrviVOr-LOLOOOO

4-> o o o ft moMNH^m^ru) S m v vd n m

Pj _ n in h A1 « -H Ή -H -H -H +1

o 4J +1 -H -H

ft w σοοοσο _ “ οοοοσοοοο S' ä r^cMC~*rOLVoooo < Ξ O CO m

^ ^ VO Γ* Γ' H H CO

vomcouor~«-i.H<sin

nn(N|(v)r4H\o^H

3 ojininvrnNHHH

tnj

H

o o o o o

4J(0 O O O O O O

ft -n r-mr-miooooo Φ w r* o o o ftg σι .-h r- h n oi (M ft1 r, ro lo ττ vo ro vo

o rt TP Tr VO rH

g r§ g S' g o o o o o

3 OOOOOOOOO

d oS οογ'^γοοποοοο < ^ VO vo ro ro E-< LO 00 ao m o ouomvnr-voooco

(MMNNHiiriOH

.. cj N rr rr o H «H «H

• * * • « « « ♦

• « I

• 9 9 9 • ♦♦ *

. . _ O O O

• ♦ · tn o o o o o ;.: : «o >1 o vo «> «h o o o o

... -H -P r-f m O O O

: ; : 'ö -rj o to rH oooor- • ί « n n * * _.

«cl -H -H -H -H +1 ' „„„ ft -H -rj Ή -H Ή . ίχτίεϊοοοοσ ::: -huhooooo o o o ... o o -h TT vo cg r- o o o o

O * <N (M LO

. : ^ is o avr-uoojco 31

Taulukon 2 tiedot on myös esitetty graafi vioissa 2A, 2B ja 2C. Näistä tuloksista nähdi erytropoietiinin suhteellinen in vivo -aktiivisu siaalihappomäärän funktiona isoformiin nro 11 a 5 formeilla 11 - 14 on oleellisesti sama suhtee! vivo -bioaktiivisuus. (Tämä näkyy selvimmin, kun 14 konsentraatio ilmaistaan käyttäen Bradfordin sen arvoa. Bradfordin arvo voi olla tarkempi is 14 johtuen yleensä saaduista pienistä määristä 10 j ohtuvasta vaikeudesta Α2Θ0: n mukaan määritykse erittäin negatiivisten muotojen ilmeisimmästä väh tä reaktiivisuudesta RlA:ssa, jota edellä käsi Erytropoietiinin isoformien, joissa on enemmän s poa, suurempi suhteellinen in vivo spesifinen ak 15 johtuu luultavimmin näiden muotojen pidemmästä p misajasta verenkierrossa. Isoformit 9 ja 13 1 radioaktiivisella jodilla (125I), ja niiden poist määritettiin rotissa. Puoliintumisaika verenkier merkitsevästi pidempi isoformille 13 kuin isofor 20 Esimerkki 4

Rekombinant t iery t ropoiet i inin i so f ormi se< : lektio Q-Sepharose-kromatografialla

Solujen muokattuja elatusaineita, jotka < *9* *

Linin ym. mainitun teoksen mukaisesta rekombina • · · 25 ropoietiinin tuotannosta, konsentroidaan ja diafi . puskuria 10 mM Tris, pH 7,2, vastaan. Proteiiniko • · · *l\m* tio määritetään Bradfordin mikroproteiinimäär • · .

*·* * käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina liuosta, joka sisältää 40 mg kokonaisproteiinia t 30 mikromolaariseksi CuS04:n suhteen, suodatetaan su S*’*! läDi. lonka suurin huokoskoko on 0.45 um. ia ' 32 Näytteen asettamisen jälkeen pylvästä pestään pylvään tilavuudella samaa puskuria. Pylvään virt on noin 1 ml minuutissa. Kuusi erillistä pylväst tetaan tätä menettelyä käyttäen erytropoietiinin 5 tyjen isoformiseosten selektoimiseksi.

Pylväitä pestään 6:11a - 9:llä pylvään til alhaisen pH:n puskuria, jonka koostumus on: pylv 150 mM etikkahappo, 1 mM glysiini, 20 μΜ CuS04, säädetty pH-arvoon 4,7 NaOHrlla, pylväs nro 2 10 etikkahappo, 1 mM glysiini, 20 μΜ CuS04, 6 M urea, pH-arvoon 4,7 NaOH:lla, pylväs nro 3, 250 mM eti 1 mM glysiini, 20 μΜ CuS04, 6 M urea, säädetty 4,7 NaOHrlla, pylväs nro 4, 300 mM etikkahappo, siini, 20 μΜ CuS04, 6 M urea, säädetty pH-ai 15 NaOHrlla, pylväs nro 5, 150 mM etikkahappo, 1 mM 20 μΜ CuS04, 6 M urea, pylväs nro 6, 300 mM eti 1 mM glysiini, 20 μΜ CuS04, 6 M urea. Pylväiden taan pH-arvoon noin 7 pesemällä kutakin 8:11a pylvään tilaavuudella liuosta 10 mM Tris-HCl, 55 20 20 μΜ CuS04, pH 7. Erytropoietiinin määritellyt seokset eluoidaan pylväistä pesemällä liuoksel Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 μΜ CuS04, pH 7,0.

·

Kustakin pylväästä eluoidut isoformijaol ;·. sentroidaan, ja niiden liuottimeksi vaihdetaan ve * I» 25 nin Centricon-10-mikrokonsentraattoria käyttäer , . konsentroitujen jaosten analyyttisen isoelektri * * * : soinnin tulokset esitetään kuiviossa 3. Geelii V ' 1-6 ovat vastaavasti pylväistä 1-6 eluoituj poietiinin määriteltyjä isoformiseoksia. Kuvion * 30 reunimmaisella kaistalla näkyvä "iso f or mi seos" o *♦« ! f ai a't-nee^ λδΊ-Ί-α ? r\l^a λπ tr·! λΊ-τ» A_CarskaTnc«Ä_rktfl TTääeι 33 puhdistetaan vielä Lain ym. mainitussa teoksessa jen menettelyjen mukaisesti ennen analyyttistä ristä fokusointia.

Esimerkki 5 5 Rekombinanttierytropoietiinin iso f onnien f: ti alhaisen pH:n gradienttia käyttäen Q-Sepharos< Toisessa menettelyssä erytropoietiinin i erotellaan käyttäen gradienttia, jossa pH laskee vahvuus kasvaa. Konsentroitua, diafiltroitua er 10 tiinia sisältävää elatusainetta viedään Q-Sepha vääseen suhteessa noin 40 mg kokonaisproteiinia/: Sitten pylvästä pestään noin kahdellä pylvään til liuosta 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, ja sitten noin 10 vään tilavuudella liuosta 2 mM etikkahappo/1 ml 15 ni/20 μΜ CuS04/6 M urea (pH noin 4,8) epäpuhtauspr ja alle noin 7 siaalihappoa sisältävien erytrop isoformien poistamiseksi. Noin 8-12 siaalihapp tävät isoformit eluoidaan pylväästä käyttäen gra joka alkaa pitoisuudella noin 2 mM etikkahappo 1 20 6 M urea/1 mM glysiini/20 μΜ CuS04 ja etenee pit 40 mM etikkahappo/6 M urea/1 mM glysiini/20 μΜ noin 4). Gradientin kokonaistilavuus on noin 4< • # tilavuutta, ja noin yhden pylvään tilavuuden fraktioita kerätään astioihin, joissa on Tr is • ·· I 25 riittävä määrä tuomaan pH:n alueelle 6,8 - 8,5, , . kerätyt fraktiot altistu pitkäksi ajaksi matalall • · * Näytteitä fraktioista pannaan analyyttiseen isoel fokusointiin erottumisen seuraamiseksi. Kuvio ^ isoformien 8-11 erottumisen, joka voidaan saavu 30 lä menettelyllä. Isoformit 12 - 14, jotka pysyvä » » » • I ______* J____J______t - *____3 J ______ ^ 1____t J ___ 34 keen geelisuodatuskromatografiällä kuten Lain ym. kissä 2 on kuvattu.

Esimerkki 6

Ihmisen erytropoietiinianalogien muodostan 5 Olemassa olevien hiilihydraatin kiinnittyne sijainti ihmisen erytropoietiinin aminohapposeta nähdään kuviossa 5 (SEQ ID nro 26). Menettelyist glykosylaatiokohtien muodostamiseksi esitetään yl kuviossa 6A - C, ja ne kuvataan edempänä.

10 Seuraavat oligonukleotidialukkeet syntel käytettäviksi in vitro -mutageneesissä: [Asn4, Ser6] EPO: 5' CGCCCACCAAACCTCAGqTGTGACAGCCGA ; (SEQ ID nro 1) [Asn9, Serll] EPO: 5' ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3' 15 (SEQ ID. nro 2) [Asn69] EPO: 5’ GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3' (SEQ ID.

[Aanl24] Ep0: 5' TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC 3' (SEQ : (Aanl25, Ser!27] EPO: 5' CAGATGCGA&CTCAICIGCTCCAC 3 (SEQ ID. nro 5) 20 [Asnl63, Ser165] EPO: 5* AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGAC< , e (SEQ ID. nro 6)

*· *· [Thrl2S] Epo: 5* TCCAGATGCGÄCCTCAGCTGCTC 3' (SEQ ID

• ** V ! [Prol24, Thrl25j EP0: 5' CCTCCAGATCCG&CCTCAGCTGC 3' ·* ί ’** „ (SEQ ID. nro 8) • 25 s * . . Alleviivatut kodonit osoittavat emäspariuti * i > ···,· alueet, joissa hakasuluissa ilmaistut aminohapot ] ii* ·* * villityypin aminohapot.

[Asn4, Ser6]-EP0 konstruoitiin N-glykosylaa 30 lisäämiseksi kohdalle Asn 4. [Asn94, Seru]-EP0 k< tiin N-glykosylaatiokohdan lisäämiseksi kohdall 35 [Thr125]-EPO ja [Pro124, Thr125]-EPO konstruoitiin 0-laatiokohdan lisäämiseksi kohdalle Thr 125.

Seuraavat oligonukleotidialukkeet syntet käytettäviksi in vitro -mutageneesissä:

5 [Asn69, Thr71] EPO: 5' GGGCCTGGCCMCCTGACAGAAGC

(SEQ ID. nro 9) [Ser68, Asn«9, Thr7i] EPO: 5* CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 31 10 (SEQ ID. nro 10)

[Asnl25, Thrl27] EPO: 5’ CAGATGCGAACTCAAQGQCTCC

(SEQ ID. nro 11) 15 [Asnl25, Thrl27f Thrl3l] EPO: 5 ' ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3 1 (SEQ ID. nro 12) [Proi24, Asn125, Serl27] EPO: 20 5* CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC 3' (SEQ ID. nro 13) « « ! • l< • # **· V : [Prol24, Asnl25, Thrl27] EPO: I**·· 5' CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3* • 25 (SEQ id. nro 14) 2 ··· ·«« s

[Thrl25, Thrl26] EPO: 5' CCAGATGCGACAACAGCTGCTC

(SEQ ID. nro 15) 30 [Pro124, Thr125, Thr126, Thr131]-EPO: Lähtien [Pro124, Thr125]-EPO:n cDNA: sta, oli< 36 (SEQ ID nro 17) käytetään muodostamaan [Pro12 Thr126, Thr131] -EPO.

[ Asn69, Thr71] -EPO ja [Ser68, Asn69, Thr71 konstruoitu N-glykosylaatiokohdan lisäämiseksi 5 Asn 69 ja N-glykosylaation tehostamiseksi tässä [Asn125, Thr127] -EPO, [Asn125, Thr127, Thr131] -EPO,

Asn125, Ser127]-EPO ja [Pro124, Asn125, Thr127]-EPO < ruoitu N-glykosylaatiokohdan lisäämiseksi kohdall ja glykosylaation lisäämiseksi tässä kohdassa. 10 Thr126]-EPO ja [Pro124, Thr125, Thr126, Ser131]-EPO < ruoitu O-glykosylaatiokohdan lisäämiseksi kohdalJ ja glykosylaation lisäämiseksi tässä kohdassa.

Erytropoietiini-DNA:n lähde in vitro -muta oli plasmidi Hul3, ihmisen erytropoietiiniklooni 15 [Law ym., Proc. Natl. Acad. Sei. 83, 6920

Hul3:sta peräisin olevaa plasmidi-DNA:ta dig BstEII- ja Bglll-restriktioentsyymeillä, saadut mentit pantiin agaroosigeelielektroforeesiin, ja parin (bp) erytropoietiini-DNA-fragmentti eristet 20 listä käyttäen GeneCleanTW-tarvikesarjaa ja va (BIO 101, Inc.) toimittamia menettelyohjeita. pBRgHuEPO sisältää erytropoietiinin genomisen ge t * HI-fragmenttina, joka on sijoitettu pBR322-johda :·„ kuten on kuvattu yhteisessä omistuksessa olevai • Il ]βββ· 25 mainitussa patentissa. Myös pBRgHuEPO dig , . BstEII:11a ja Bglll:11a, ja 6517 bp:n vektorif otettiin talteen. Näiden kahden fragmentin li • m t

saadaan IGT1. pEC-l:n konstruoimiseksi pDVSL (ku teisessä omistuksessa olevassa Linin mainitussa p :.;#J 30 ja esitetty kuviossa 5B) digestoitiin BamHI

mmm • < ΤίΒΛί ___ —___J______! äJ_j _! _ J __ ___ J o *. i « 37 eristettiin. Se ligatoitiin ml3mpl8:n BamHI-kohi loksena ml3-EC-l. Yksijuosteinen DNA otettiin t< coli -kannan RZ1032, joka oli infektoitu ml3-supernatanteista, kuten on kuvattu artikkeleiss 5 ym., Methods in Enzymol. 154. 367 (1987) ja

Methods in Enzymol. 101. 20 (1983). In vitro -mut varten noin 1 pg yksijuosteista DNA:ta ja 0,2 ] edellä kuvatuista synteettisistä alukkeista sek 6 pl:aan puskuria (250 mM Tris, pH 7,8, 50 mM

10 50 mM ditiotreitoli). Alukkeen emäspariutumisen s aikaan templaatin kanssa reaktiotilavuus sääd€ piiksi vedellä, seos kuumennettiin 65 °C:seen 5 m ja sitten annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan, tioreaktiota varten lisättiin 2,5 μΐ kutakin 15 dATP:tä, dGTP:tä, dCTP:tä ja ATP-.tä (kaikki pito 10 μΜ), ja näiden jälkeen 1 μΐ (1 yksikkö) E. o polymeraasia (Klenowin fragmentti) ja 1 μΐ (1 T4:n DNA-ligaasia. Sitten seosta inkuboitiin 14 °C:n lämpötilassa ja käytettiin transformoimaa 20 JM 109 [Yanisch-Perron ym., Gene 33, 103 (1985) mukaisesti (Messing, mainittu teos).

Mutanttikloonien tunnistamiseksi different ·1 2}·; ridisaatiolla ravintoagarilla olevia plakkeja si ψ

Gene Screen -suodattimille (New England Nuclear) · 25 timet kuivattiin lämpölampun alla ja sitten in • · . tunnin ajan liuoksessa 6x SSC, joka sisälsi 1-pro IU1 SDS:n, 60 eC:n lämpötilassa. Hybridisaatiota var • · ·

tävä oligonukleotidialuke (8 pmol) leimattiin T4:n polynukleotidikinaasilla ja -32P-ATP:llä ja 30 tiin suodattimien kanssa yön yli liuoksessa 6x S

··· 2 SDS ia 100 ma/ml lohen siittiön DNA:ta ^7 βΠ:n 1« 38 timet pestiin kolmesti liuoksella 6x SSC huoneei lassa ja pantiin autoradiografiaan. Tarpeen mukaa: timia pestiin sitten liuoksella 6x SSC nousevissa loissa kunnes hybridisaatiota havaittiin vain väh 5 lainkaan plakeissa, joissa oli villityyppinen ei etiinin cDNA-sekvenssi. Näissä olosuhteissa pos: hybridisaatiosignaalin antavat kloonit tunniste transfektoitiin uudelleen JMl09:ään puhtaan klooi tämiseksi. Dideoksiketjunterminaatiosekvenssd 10 osoitti, että asparagiini-, seriini-, treoniini-liinitähteet muodostavat mutaatiot olivat läsnä.

Kaksijuosteiset ml3-EC-l-DNA:t, joissa oi: set [Asn4, Ser6], [Asn9, Ser11], [Asn69], [Asn124], [Ser127], [Asn163, Ser165], [Thr125] ja [Pro124, Thr12 15 tiin talteen transfektoiduista JM109-soluista ke: telmällä [Holmes ym., Anal. Biochem. 117. 193 DNA:t digestoitiin BstElIrlla ja Xhollrlla, ja erytropoietiini-DNA-fragraentit eristettiin. pEC-toitiin BstElIrlla ja sen jälkeen osittaisesti Bj 20 ja saatujen fragmenttien 5’-päät defosforyloidaai riperäisellä alkalisella fosfataasilla 10 mM 1 •\! pH 8, 60 °C:n lämpötilassa 60 minuutin ajan. 7 kb a · rifragmentti, josta puuttuu 810 bprn BstEII-Bg.

··. mentti, eristettiin ja ligatoitiin edeltäviin e: • ·· 25 etiinifragmentteihin. Saadut plasmidit (joista k; • 1 2 3 , . nimiä pEC-X, joissa X on analogin numero) s: • · · 11/ DNA:ta, joka koodittaa erytropoietiinianalogeja, 2 • ·'1 3 1 muutetut aminohappotähteet ilmoitetuissa kohdissa

Vaihtoehtoisesti erytropoietiinin analogi \;e: 30 konstruoitiin in vitro -mutageneesillä, jossa de! aminohappotähteet 41 - 55. Tämä johti pienempään 39 ryloitiin ja vektori eristettiin kuten edellä on Sitten 7 kb:n vektorifragmentti ligatoitiin er tiinifragmentteihin kuten edellä on kuvattu, kloonattaessa rekombinantit erotetaan helposti va 5 sin sulkeutuneista plasmideista. Takaisin sulkeu saadaan pienempi BstEII-Bglll-fragmentti kuin an ja nämä voidaan helposti erottaa agaroosigeeleii: Näitä yleisiä menettelyjä käytettiin taulu 4 ja 5 esitettyjen erytropoietiinianalogien kon 10 seksi. Kutakin analogia varten tehdyt DNA-sekvens; set on esitetty; muuten mutageneesiin käytetyin nukleotidialukkeilla oli sekvenssit, jotka oliva mentaariset ihmisen erytropoietiinille.

• ♦· • « i I « a « « m • » » I· * * I · I · f

• · I

*** * ««« * · · < · t 4 9

• · I

• « » ··· • ♦ • * 40

Taulukko 3

Erytropoietiinianalogeja, joissa on N-sidc ten hiilihydraattiketjujen kohtia Analogi nro Aminohapposubstituutio Sekvenssin 5 N1 Asn4Ser6 CGC—h ATC— N2 Asn^Ser11 AGC-4i GTC-^

N3 Asnl^Thr21 (»CC-K

10 GAG—λ N4 Asn30Thr32 GCT“* CAC— NS Asn42 CCA—>- N6 Ser42Asn43Thr45 CCA-> 15 GAC—* AAA—>.

N7 Ser« TAT“* N8 Asn5lThr53 TGG“* AGG—* 20 N9 Asn57Thr59 GGG~» CAG—> N10 Asn69 CTG—> nh Asn69Thr7i CTG"» i\. TCG-» * 25 :··: N12 Ser68Asn69Thr71 Nil f GCC-* * · * N13 Asn88Thr90 TGG-> CCC-»

. .·. N14 Ser87Asn8BThr90 N13 F

30 ccg—» • · • · ··· xn r . Cayfi7 Λ e· n fifiTK yQ y. Q? Ml Δ Γ 41

Taulukko 3 (jatkoa)

Erytropoietlinlanalogeja, joissa on N-sic ten hiilihydraattlketjujen kohtia Analogi nro Aminohapposubstituutio Sekvenssi

5 N18 Val87Asn88Thr90 CCG

TGG

CCC

N19 Ser07Asn8öGly89Thr5O CCG

TGG

10 " GAG

CCC

N20 Asn89lle50Thr91 GAG

CCC

CTG

15 N21 Ser87Asn89lle90Thr9i N20

CCG

N22 AsnH3Thrll5 GGi

CAC

N23 Asnlieval121 GCC

20 CC1 N24 Asni2iSerl22Thri23 CCl :N cc; 0: GAl

: **· 25 N25 Asnl24 GCC

*:·: N26 Seri22Asni24 CCi

: GCC

♦ ♦ * -*j*j N27 Asni25serl27 GC< gc: N28 Asnl25Thrl27 GC( 30 gc ♦ m ♦ · 42

Taulukko 3 (jatkoa)

Erytropoletiinianalogeja, joissa on N-sido ten hiilihydraattiketjujen kohtia Analogi nro Aminohapposubstituutlo Sekvenssin! 5 N30 Thr120Gly122Leul23Asn125Thrl27 N28 j TCC^ CGC—i GAT-i N31 Asnl26Serl28 TCA—; 10 GCT-i

N32 Asnl26Thrl28Vall29 TCAH

GCT—i

CCAH

N33 Leui2iSeri22Asni26Thri28Vali29 N32 j 15 CCT-i CC A— - N34 Thrl2lGlyl23Serl25Asnl26Thrl28Vall29 N32 j CCT^ GAT-

20 GCCH

N35 Serl29Asnl30 CCA- CTC- • ta .··.·[ N36 Asnl32 ACA- * N37 Asnl3«Thrl36 ACT- 25 <»c- N38 Asnl35 GCT- N39 Asnl36Thrl3B GAC- • · · V · TTC— N40 Asnl37Thrl39 ACT- : 30 CGC- N41 Asnl38Thrl40 TTC- 4 43

Taulukko 3 (jatkoa)

Erytropoietiinianalogeja, joissa on N-sid< ten hiilihydraattiketjujen kohtia Analogi nro Aminohapposubstituutio Sekvenssin 5 N44 Glyl48Thrl49 TTC-> CTC-> N45 Asnl55 CTG-> H46 Asnl63serl65 ACA— N47 Asn30Thr32vaie7Asne»Thr90 n4 ja ^ N48 Asn69Thr71Sere7Asn08Thr90 Nil ja * · • 1 2 3 · • ·· • 1 • · · * · « • · · « • m • · • ·« * • · • · » I f * 1 · * · » • · 1 • · · • · • · ♦ 2 *«· 3 • φ • I • · · 44

Taulukko 4

Erytropoietiinianalogeja, joissa on O-sidc ten hillihydraattiketjujen kohtia Analogi nro Amlnohapposubstltuutio Sekvenss 5 01 Ser6 ATC—»i 02 Ser7 TGT—»' 03 Ser8 GAC—Ki 04 Ser11 GTC— 05 Ser18 GAG— 10 06 Ser23 GAG— 07 Ser28 TGT—»j 08 Ser28 TGT-*' 09 Ser30 GC.T-*' 010 Ser33 TGC—»' !5 Oil Ser37 GAG—*' 012 Ser48 TAT—*' 013 Ser61 GTA-*' 014 Ser63 GTC—►' 015 Ser67 CTG->' 20 016 Ser68 GCC-*: 017 Ser70 CTG-»' :\j 018 Ser73 GCT->: :Ti 019 Ser74 GTC-*' j\. 020 Ser75 CTG—>' 25 021 Ser78 GCC-»: • » : .·. 022 Ser81 TTG—»: I « · “M 023 Ser88 CAG-v:

024 Ser87 CCG-K

025 Ser93 CTG-»: *···* 026 Ser98 GCC—»' # · « ·...· non GTO— 45

Taulukko 4 (jatkoa)

Erytropoietiinianalogeja, joissa on O-sldc ten hiilihydraattiketjujen kohtia Analogi nro Aminohapposubstltuutlo Sekvenss

5 032 Ser111· GCT-K

033 Ser112 CTG—>' 034 Ser11* GCC->' 035 Ser120 GCT->' 036 Ser159 TCG-* 10 037 Serl61 TGC—>’

038 pro125Ser127 GCC-M

GCT->'

039 Thr^2 GAA->J

040 Thr«* TGG—

15 041 Thr«5 CAG->J

042 Three TGG—Κί

043 Thr90 CCC-H

044 Thr92 CAG—h 045 ThrlOO AGT->j 20 o46 ThrllO CGG— 047 ThrllS CAG-fc 048 Thrl23 GAT-+, 049 Thrl24 GCG-», :\e 050 Thrl25 GCC— 25 051 ThriaSserlZT GCC-».

GCT-» • » » 052 Thrl25Thrl26 GCC->.

♦ · · * TCA—* . 053 Thr126 TCA->.

30 054 Thrl27 GCT—» * * · •___· λε rr φκ —1 C!TC—^ 46

Taulukko 4 (jatkoa)

Erytropoietiinianalogeja, joissa on O-sidc ten hiilihydraattiketjujen kohtia Analogi nro Aminohapposubstituutio Sekvenj 5 059 Pro124Thrl25 GCG—ΐ

GCC-H

060 Pro124Thrl25xhrl26 059 ϊ

TCA-H

061 Prol24Thri25Thrl26Thri3i 060 ϊ 10 CGA—3 062 KarboKsipään jatke HCG-.stä

Taulukko 5

Erytropoietiinianalogeja, joissa on N- ja 15 sellisten hiilihydraattiketjujen kohtia

Analogi nro Aminohapposubstituutio Sekveni

Ser87Asn88Thr90 N14 ja N01 Karboksipään jatke HCG:stä

Asn30Thr32val87Asn88Thr90 N47 ja 20 N02 Karboksipään jatke HCG:stä

Plasmidit, joista käytetään nimitystä pDEC .···] X on analogin numero), konstruoitiin sijoittaman • · t poietiini-cDNA pDECAran, joka on plasmidin pDSa^ • ·* ’ . 25 nainen. Ekspressiovektori pDSa2 kuvataan yleisest

/ / tenttihakemuksessa nro WO 90/14 363. pDECA

• · · '··'· · pDSa2:sta seuraavilla vaiheilla: ·«« V · 1) pDSa2:n Hindlll-kohta poistettiin dige: pDSa2:n DNA Hindlllilla, käsittelemällä Hindlll: 30 siivisia päitä E. colin DNA-polymeraasilla (Kleno :***: mentti) ja dNTP:illä ja ligatoimalla tasapäiner 47 on kiinnitetty silmukoitumissignaalin 3'-päähän, tisellä oligonukleotidilla oli seuraava sekvenssi nro 18): 5 ’ TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGT 5

CTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAAT

AAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTAC

10

AAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC

Saatu plasmidi oli wsilmukointi-pDSa2AH".

3) "silmukointi-pDSa2AH" digestoitiin Sai saatettiin tasapäiseksi käsittelemällä koheesiivis 15 T4:n polymeraasilla ja dNTP:illä. Ihmisen erytropc cDNA:n 820 bp:n BamHI-Bglll-fragmentti saatettiin seksi samalla menetelmällä ja ligatoitiin plasmidi tu plasmidi oli pDEC-1.

4) pDEC digestoitiin Kpnl:llä ja PvuIIilla 20 tettiin tasapäiseksi käsittelemällä koheesiivis mung-pavun nukleaasilla. Plasmidi ligatoitiin u : irti leikatun Kpnl-PvuII-fragmentin deletoimiseks:

* M

ly* sena plasmidi pDEC .

pDEC-X-plasmidit tehtiin pDECA:sta täyde • f : 25 BstEll-digestiolla, jota seurasi osittainen

BglII:lla. Vektorin fragmentti, jossa ei ollut er ...

·· ϊ etiinia koodittavia sekvenssejä, eristettiin ja ··· i tiin halutun plasmidin sisältäviin 810 bp:n BstEl fragmentteihin.

30 Joidenkin analogien, joissa on useampia ami s”*: muutoksia, konstruktion yksityiskohtia kuvataan se 48 pDEC(N4):stä. pDEC(N18) digestoitiin Hindll: BglII:lla, ja 445 bp:n fragmentti eristettiin, digestoitiin BstEII:lla ja HindiII:11a, ja 377 bp mentti eristettiin. Nämä kaksi fragmenttia lig 5 pDECA:an, joka oli katkaistu BstEII:lla ja Bglllrl edellä on kuvattu, tuloksena pDEC(N47).

pDEC(N48), joka sisältää mutaatiot asn69, ser87, asn88 ja thr90, konstruoitiin pDEC(N14) pDEC(Nil):stä. pDEC(N14) digestoitiin Hindll: 10 Bglll:11a, ja 445 bp:n fragmentti eristettiin, p digestoitiin BstEII:11a ja Hindu:11a, ja 377 bp mentti eristettiin. Nämä kaksi fragmenttia lig pDECA:an, joka oli katkaistu BstEII:lla ja BglII:l edellä on kuvattu, tuloksena pDEC(N48).

15 pDEC(062):n konstruktio (HCG-erytropoieti sio) pDEC(062) koottiin pEClistä ja 107 emäspä: teettisestä StuI-Bglll-DNA-linkkeristä, joka sisäl sen korionigonadotropiinin karboksiterminaaliset 2 20 happoa (ser-ser-ser-ser-lys-ala-pro-pro-pro-ser- ser-pro-ser-arg-leu-pro-gly-pro-ser-asp-thr-pro-: •\J pro-gln) (SEQ ID nro 25) [Pierce ym., Ann. Rev.

• · 50, 465 (1981)]. Linkkerin sekvenssi on seuraava: e I I »

f*·· ^ 51CCTGTAGGACAGGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAC

• 25

:*·: 31GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGAGGGGGGTC

• · • * * • K *

Hl • « Φ # * 5 1CAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCAC1 . on (SEQ ID. nro 19) 31 GTTCAGGTAGGGCTGAGGGCCCCGGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGTG, B · ··· 49 gatoitiin yhdessä pECl-fragmentin kanssa pDECA; oli ennalta digestoitu BstEIIrlla ja osittain dj BglII:lla, kuten edellä on kuvattu. pDEC(N01):n konstruktio 5 pDEC(NOl) koottiin pDEC(062):sta (HCG-EPO) (Nl4):stä (Ser87Asn8aThr90). pDEC177 digestoitiin St BglII:lla, ja 610 bp:n DNA-fragmentti, joka sisäl! tiot Ser87Asn88Thr90, eristettiin GeneCleanilla. i digestoitiin Stulrllä ja BglII:lla, ja 107 emäspä: 10 mentti eristettiin. Nämä kaksi DNA-fragmenttia lit pDECAran, joka oli ennalta digestoitu BstEII:lla tain digestoitu Bglllrlla, kuten edellä on kuvatl pDEC(NO2):n konstruktio pDEC(NO2) koottiin pDEC(062):sta (HCG-EPO) 15 (N47 ): stä (Asn30Thr32Val87Asn88Thr90). pDEC(N47) dig<

Stulrllä ja BglII:lla, ja 610 bp:n DNA-fragment sisälsi mutaatiot Asn30Thr32Val87Asn88Thr90, eristett Cleanilla™. pDEC(062) digestoitiin Stul:llä ja B< ja 107 emäsparin fragmentti eristettiin. Nämä ke 20 fragmenttia ligatoitiin pDECAran, joka oli ennall toitu BstEII:lla ja osittain digestoitu BglllrlJ edellä on kuvattu.

* · .*}; pDEC(Nl6):n (Ser^Asn^hr^Ala162) konstrukt pDEC( N16 ) koottiin pDEC(N14); stä (Ser87Asn8 25 pDEC258:sta (Ala162). pDEC258 konstruoitiin käyttää « * ; . kuvattuja in vitro -mutageneesimenettelyjä ja AGG-kodoni GCG:ksi asemassa 162. pDEC(N14) dig< *·* * Stulrllä ja Bglllrlla, ja 610 bp:n DNA-fragment sisälsi mutaatiot Ser87Asne8Thr90, eristettiin Gen< * \S.: 30 la™. pDEC258 digestoitiin Stulrllä ja BglII:lla • « ** , r , J . J , t , _ _ „ il I 1 j ***** 50 pDEC(Rl):n, (R2):n ja (R3):n konstruktio

Glykosylaatiokohtien poistamiseksi pDEC(N m!3-EPO(Nl4), joka sisälsi mutaatiot Ser87, ί Thr90, pantiin in vitro -mutageneesiin edellä kuv 5 kaisesti seuraavia alukkeita käyttäen: 5 ' GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3 · GLN2 4 (SEQ ID. nro 21} 51CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC31 GLN38 ^ (SEQ ID. nro 22) 51CTGTTGGTCCAGTCTTCCCAG31 GLN83 (SEQ ID. nro 23)

Saaduista plasmideista käytettiin nimiä pDEC(Rl Ser87 Asn88 Thr90), pDEC(R2) (Gin38 Ser87 Asn88 Ί 15 pDEC(R3) (Gin83 Ser87 Asn88 Thr90). Myös ml3EC-l pa vitro -mutageneesiin em. oligonukleotidialukkeillc sena pECIO (gin24) ja pEC8 (gin38). pEC9 (gin83) kc tiin käyttäen aluketta 51CCTGTTGGTCCASTCTTCCCAGC3' GUJ83 20 (SEQ ID. nro 24) : Ihmisen erytropoietiinin ja analogien, jo • ·· taavat [Asn4, Ser6]-EPO: a, [Asn9, Ser11]-EPO: a, EPO:a, [Asn124] -EPO:a, [Asn125, Serl27]-EPO:a, [Asn183, | *1 25 EPO:a, [Thr125]-EPO:a ja [Pro124, Thr125]-EPO:a, sek koissa 3, 4 ja 5 kuvattujen analogien cDNA-kloon ·· · rettiin COS-l-soluihin (ATCC nro CRL-1650) elekt ·*· *·* i tiolla. COS-l-solut kerättiin talteen lähes täyte neilta maljoilta, pestiin elatusaineella [Dulbecc 30 nettu essentiaalinen elatusaine, joka sisälsi 5 sikiön seerumia ja 1 % L-glutamiini/penisilliini/ 51 silla ja 1600 voltin jännitteellä siten, että mi 100 - 200 ]ig kantaja-DNA:ta ja 2 - 20 pg erytropc analogia koodittavaa plasmidi-DNA:ta. Elektropc solut maljattiin tiheydessä 2 x 106 solua/60 mm kuc 5 lymalja 5 ml:ssa elatusainetta. 2-4 tuntia m< jälkeen elatusaine korvattiin 5 ml:11a tuoretta < netta. Muokattu elatusaine kerättiin talteen 3 -elektroporaation jälkeen.

Esimerkki 7 10 Erytropoietiinianalogien karakterisointi A. Hiilihydraatin lisäyksen määrittäminen 5-20 yksikköä sisältävä tilavuus supen esimerkissä 6 kuvatun mukaisesti erytropoietiin: cDNA:illa transfektoiduista COS-soluista immunopri 15 tiin yön yli huoneenlämpötilassa kanissa tuotetut ropoietiinin vastaisella polyklonaalisella vasta-; 20 - 80 μΐ proteiini A -Sepharosea l:l-suspens: faattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) lisätt: nopresipitaattiin ja annettiin inkuboitua tunnin .

20 neenlämpötilassa. Näytteet sentrifugoitiin, PBS:llä, ja ilmoitetuissa tapauksissa pohjasakka tiin N-glykanaasilla N-sidoksellisten hiilihydraa- /··* jen irrottamiseksi. Näytteet analysoitiin 15-pros< * * * j»( la SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, si: 1 . 25 nitroselluloosalle ja pantiin "Western"-analyysi! / / mukaisesti [Burnette ym., Anal. Biochem. 112. 1 (1981), Elliott ym.. Gene, 79, 167 - 180 ¢1989)] V * seosta hiiressä tuotettuja erytropoietiinin vast.

noklonaalisia vasta-aineita. Eräs tällainen vai 30 9G8A, on kuvattu artikkelissa Elliott ym. (1989) ]

Supp. 1, A. 1228.

11 52 taa lisättyyn N-sidokselliseen hiilihydraattiket; vio 7). Käsiteltäessä N-glykanaasilla supern< [Thr125]-EPO:n ja [Pro124, Thr125]-EPO:n cDNA:lla 1 toiduista COS-soluista, nähtiin suurempi prot* 5 verrattuna ihmissekvenssiseen erytropoietiiniin.

sääntynyt koko viittaa lisättyyn 0-sidokseni see hydraattiketjuun (kuvio 8). "Western-blot"-analyy valituista analogeista esitetään kuviossa 10* EPO:in kiinnittyneiden N-sidoksellisten 1 10 raattiketjujen lukumäärän määrittämiseksi suo: osittaisia N-glykanaasidigestioita. Analogeja tai ekspressöitiin CHO-soluissa, ja muokattua see; elatusainetta kerättiin talteen. Putket sisälsiv< sikköä EP0:a (tilavuus säädetty 15 piiksi H20illa

15 kin putkeen lisättiin 10 μΐ 0,5-prosenttista S

kutakin näytettä keitettiin 3 minuuttia. Sitten ; seuraavat komponentit: 10,8 μΐ 0,5 M NaP04, pH f 7,5 % Nonidet P40 ja 1,5 μΐ liuosta, jossa oli 2! köä/ml N-glykanaasia (Genzyme). Näytteitä inkubo: 20 moitetut ajat 37 °C:n lämpötilassa. Reaktio pys; lisäämällä SDS-näytepuskuria (ks. edellä), ja si ·/·/. tiin "Western"-analyysiin SDS-PAGE:lta (10-pro; • * akryyliamidi) käyttäen EP0:n vastaista polykl< ··, vasta-ainetta ja kaniinin vasta-aineiden vastais • ** 25 stain™-tarvikesarjaa (Vector laboratories) 4-kloo: , . substraattina. Tällä menetelmällä tehty N-sidok: • * * ketjujen analyysi esitetään kuviossa 11 ihmiser V * poietiinille ja analogille N14.

B. Erytropoietiinianalogien aktilvisuusmäj :e·.5 30 Rl A: t suoritettiin Egrien ym. mainitun te< : *** kaisesti. EIA:t suoritettiin CLINIGEN™-EIA-tarviki 11 53 tai puhdistetusta erytropoietiinista, joka oli se solujen muokatusta elatusaineesta, kuten seuraavai taan, käyttäen hypoksiassa pidettyihin polysyt* hiiriin perustuvaa biologista määritystä (Cotes 3 5 nittu teos).

Erytropoietiinin in vitro -aktiivisuus määi erytroidikantasoluryhmien muodostumismäärityksell ym., J. Cell Physiol. 83, 309-320 (1974) kuvaame sesti, muunnoksin. Mononukleaariset solut puhdd 10 osittain Ficoll-paque-kerroksella ja pestiin Iscc tusaineella ennen maljaarnista tarttuvien solujen j seksi. Elatusaine sisälsi 0,9 % metyyliseiluloo sisältänyt naudan seerumin albumiinia. Erytroidiki ryhmät laskettiin 8-10 päivää viljelyn jälkeen.

15 Erytropoietiinianalogit, jotka oli trani COS-soluihin ja ekspressoitu niissä kuten esimerk kuvattu, analysoitiin epäpuhtaissa COS-solusupernt sa käyttäen RIA:a, EIA:a ja erytroidikantasoluryhi dostusmääritystä. Puhdistetulla ihmissekvenssiseJ 20 ropoietiinilla on in vitro -aktiivisuus, joka on 1 kelpoinen edellä mainituilla määrityksillä mitati •\$ aktiivisuuteen. Analogeilla [Asn69]-EPO, [Thr125 [Pro124, Thr125]-EPO nähtiin in vitro -aktiivisuus, • · * ··, vertailukelpoinen RIA-aktiivisuuden kanssa, ja ne 25 todisteita lisätyistä hiilihydraattiketjuista (ki , / dassa A määritettiin). [Thr125]-EP0:a ja analogeja « · N14, N16, N18, N47, N48, 062, N01 ja N02 analysoi- • · · '·* ’ lä transfektoimalla erytropoietiinianalogia kt cDNA-klooni CHO-soluihin ja panemalla CHO-solusuj !.;,J 30 tit RIA-, EIA- ja in vivo biologisiin määrityksiä ·«« : : set esitetään taulukossa 6. CHO-solusunernatantej 11 54

Taulukko 6

Erytropoietiinianalogeja, joissa on lisätt lihydraattiketjuja EPO-sekvenssi N-sidoksellisia* O-sidoksellisia In 5 ketjuja ketjuja

RIJ

Ihminen 3C id 0

Asn30xhr32 3 - 4C n.t. 1

Asn5lThr53 4 n.t, n ^ Aan57Thi:59 4 n.t. n

Asn*>9 4 vähentynyt n

Asn69Thr71 4 n.t. 0,2.

Ser^ÖAsnfi^xhr^1 4 n.t. n

Val87Asn00Thr9O 4c n.t. 1 15

Ser87Aen08Thr90 3 - 4C normaali 1

Ser87Aan88Gly89Thr®° 4 n.t. n

Ser87Asn8Bxhr90Thr92 4 vähentynyt6 n

Asn89ile90xhr91 4 n.t. n

Ser87Aan09lle9OThr®l 4 n.t. n 20

SerB7Asne8Thr90Alal82 4 n.t. 1

Aanl36xhrl38 3-4 n.t, n ,·β ; Aan138xhr1<8 3-4 n.t. n I..* A3n69Thr71Ser87Aen88Thr80 4-5 n.t. 0,02: « · »

Asn3Oxhr32val07Asn88xhr90 4 - 5C normaali 1 * * 25 ’ . Thr123 3 1 ja 2f n

/ / Thrl25 3 1 ja 2f C

··· · Prol2<Thr125 3 1 ja 2i n • «4 * * σ

*·* * C-terminaalinen jatke HCGistä 3 ainakin 1,C

. 30 Ser87Aan88xhr90 jatke HCG: s ta 4 ainakin 39 1 A3n30Thr32val87Aan88xhr90 11 55

Taulukon 6 alaviitteet “Lisättyjen N-sidoksellisten ketjujen luku vioitiin perustuen analogipolypeptidien liikkuvuu geeleissä, kuten esimerkissä 7 A on kuvattu.

5 bAnalogin in vivo -aktiivisuuden suhde e: etiinianalogin määrään. Aktiivisuusmittaukset teh logien CHO-solusupernatanteista käyttäen polysy hiirten biologista määritystä. Erytropoietiini< määrät CHO-solusupernatanteissä määritettiin Ri; 10 EIA:lla kuten tekstissä on kuvattu.

cLisättyjen hiilihydraattiketjujen määrä v< ti in tutkimalla glykoproteiinien migraatiota SDS-< osittaisen N-glykanaasidigestion jälkeen, kuten e sä 7A on kuvattu.

15 dO-sidoksel linen ketju asemassa Ser126 70 %:ssa ihmisen erytropoietiinimolekyylejä.

“Analogeissa, joissa on vähentynyt 0-glyko: on hiilihydraattiketju asemassa Ser126 alle 70 %:; tyyleistä.

20 fThr123-EPO: ssa on kaksi O-sidoksellista k< 60 %:ssa molekyylejä. Thr125-EPO:ssa on kaksi 0-sid< ta ketjua noin 40 %:ssa molekyylejä. Pro124Thr125-E kaksi O-sidoksellista ketjua yli 80 %:ssa moleky; 9Näissä analogeissa on ainakin kolme 0-sido! • 1 ♦ 25 ketjua ja saattaa olla neljä tai viisi. HCG:ssä . . tiedetään olevan neljä O-sidoksellista ketjua.

• . · ··· · n.t. ei testattu ··« • · · • ♦ · * ♦ · * » i ···

Il • · • 1 11 56

Taulukko 7

Ihmisen erytropoietiinln ja sellaisten ar joissa on uudelleenjärjestettyjä hiilihydri tia, aktiivisuus 5 EPO-sekvenssi N-sidokselli- In \ siä ketjuja -akt

RIA

Ihminen ^ q

Gin24 2 0 10 Gln38 2 0

Gln83 2 0,

Gln24SerB7Asn88thr90 (Rl) 3 0,

Gln3öSer87Asne8Thr90 (*2> 3 0

Gln83ser87Asn8BThr90 (R3) 3 <), 15 Ser87Asn88Thr90 3-4 1(

In vivo -aktiivisuuden suhde RIA:an tai Eli ritettiin kuten taulukon 6 alaviitteessä a kuvat< C. Ihmisen erytropoietiinianalogeista perä 20 vien isoformiseosten valmistus [Thr125]-EPO (EPO 050) • Erytropoietiinianalogi [Thr125]-EPO konsl * * kuten on kuvattu esimerkin 6 jaksossa A. 810 bp:i • f 1 ·. poietiini-cDNA:n fragmentti, jossa oli [Thr125J-r • «9 25 eristettiin katkaisemalla [Thr125]-mutaation sisäl • · . . plasmidi BstEII:lla ja Bglllrlla ja ligatoima • « · ·;;/ fragmentti pDECA:aan (pDSa2-johdannainen, kuvatti : kissä 6).

Plasmidi pDECA, joka sisälsi [Thr125]-er] 30 tiinin cDNA:n, transfektoitiin DHFR-vajäisiin Cl ··· ! _ » hin. 770 ml CH0-solu1en muokattua elatusainetta 57

täytteen tilavuus 5 ml), joka oli tasapainoteta puskurilla, ja eluoitiin lineaarisella gradientil oli 0 * 250 mM NaCl liuoksessa 10 mM Tris-HCl, Näytteitä pylvään fraktioista, joko käsittelemätt 5 N-glykanaasilla digestoituina, analysoidaan SDS-tai IEF:llä, ja fraktiot yhdistettiin (jaoksiksd käytetään nimiä 2, 3 ja 4) perustuen fraktioidei mi- ja/tai hiilihydraattikoostumukseen. Kukin jao Vydac-C4-pylvääseen (214TPB 2030, halkaisija 1 < 10 teen tilavuus 1,8 - 2,2 ml, 0,34 ml minuutissa) j kahdella pylvään tilavuudella 20-prosenttista puskurissa 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Pylväät eluoit aarisella gradientilla 20 - 94 % etanolia puskuri Tris-HCl, pH 7,0. Halutut fraktiot yhdistettiin, 15 nettiin puskurilla 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, js Q-Sepharose fast flow -pylväisiin. Sen jälkeen pesty puskurilla 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, näytte* tiin puskurilla 20 mM natriumsitraatti, 250 mM

7,0. Puhdistetut [Thr125]-jaokset analysoitiin II 20 esitetään kuviossa 9. Näistä jaoksista analysoii in vivo biologinen aktiivisuus kuten edellä or (Cotes ym., mainittu teos), ja tulokset esitetä; * · kossa 8.

* · ·

Ser^Asn^hr^-EPO (EPO N14) • ·· 25 Preparaatti 1 . . Analogi EPO N14 puhdistettiin käyttäen ] • · · » · » *·*/ heistä menettelyä, johon kuului ioninvaihtokroma • · * käänteisfaasikromatografia ja geelisuodatuskroma Ioninvaihtovaiheen aikana fraktiot yhdistettiin n 30 saatiin isoformiseos, jossa oli runsaasti siaal *** • * Käänteisfaasikromatnrrrafian aikana mundnstpiti 11 58 1. Muokattua elatusainetta CHO-soluista, j< pres^oivat analogia EPO N14, kerättiin talteen ja roitiin noin 2,5-kertaisesti käyttäen sekoittajali tettua kammiota, jossa oli YMlO-kalvo (Amicon) ja 5 roitiin puskuria 10 mM Tris, pH 8,5, vastaan.

2. Konsentroitu elatusaine ladattiin suhte< 12 A280-yksikkÖä/ml hartsia Q-Sepharose FF -p^ (Pharmacia), joka oli tasapainotettu puskurin Tris, pH 8,5, virtausnopeudella 0,2 cm minuutissc 10 3. Näyteen lataamisen jälkeen pylvästä pesi

mella pylvään tilavuudella (PT) puskuria 10 mM

8,5, ja eluoitiin gradientilla 0 - 0,5 M NaCl/10 pH 8,5, 50 PT:ssa. 1 PT:n fraktioita kerättiin.

4. Näyte kustakin fraktiosta ajettiin IEF-15 pH 3 - 5. Perustuen isoformien jakautumiseen 1EF:i tioista yhdistettiin jaos, joka sisälsi etupäässä meja 11 - 18. EDTArta lisättiin jaokseen 1 mM loi pitoisuuteen.

5. Isoformijaos ladattiin suhteessa noin ! 20 sikköä/ml hartsia käänteisfaasi-C4-pylvääseen joka oli tasapainotettu liuoksella 20-prosenttint • li/10 mM Tris, pH 7,0, virtaunopeudella 2,5 cm mii * ·

Pylvästä pestiin yhdellä PT: 11a liuosta 20-pros ;·, etanoli/10 mM Tris, pH 7,0, ja eluoitiin gradient: • ·.

25 94 % etanoli/10 mM Tris, pH 7,0, 30 PT:ssa virtc , . della 1 cm minuutissa. 0,2 PT:n fraktioita kerätt ·”/ 6. Näyte jokaisesta fraktioista analysoi * * · * pelkistävässä 12-prosenttisessa SDS-PAGE:ssa. Kal· listä jaosta tehtiin perustuen SDS-geeleissä h£ ♦ 30 aggregaattien esiintymiseen. Jaos nro 1 sisälsi El gia, mutta ei aggregaattia. Jaos nro 2 sisälsi e 59

V

-laitteita (Amicon). Kummankin jaoksen puskuriksi tiin 20 mM natriumsitraatti/100 mM NaCl, pH 7,0.

8. Kumpikin jaos puhdistettiin eriksee SEC-250 (BioRad) HPLC-pylväällä, joka oli tasap 5 puskurilla 20 mM natriumsitraatti/100 mM NaCl, Jaokset ladattiin suhteessa alle 6 A2eo-yksikköä/ml virtausnopeudella 2,26 cm minuutissa. Monomeeri vastaavat huiput kerättiin talteen kummastakin a, 9. Kummankin jaoksen absorbanssi mitattii 10 kumpaakin jaosta konsentroitiin SDS-PAGE- ja IEF- analyysiä varten. Jaoksessa nro 1 oli seos isofor 17, ja sitä käytettiin farmakokineettisiin ja res sitoutumistutkimuksiin.

Preparaatti 2 15 Analogi EPO N14 puhdistettiin käyttäen : heistä menettelyä, johon kuului ioninvaihtokroma käänteisfaasi-HPLC ja hydroksyyliapatiittikroma Ioninvaihtovaiheen aikana analogi jaettiin kolm< seen, jotka sisälsivät erilaiset isoformiseokset 20 tuksen yksityiskohdat esitetään seuraavassa.

1. Supernatannttia CHO-soluista, jotka ek .\e: vat analogia EPO N14, kerättiin talteen ja konse

noin 10-kertaisesti käyttäen Filtron Mini-U

* · t -tangentiaalivirtauslaitetta ja diafiltroitiin 25 10 mM Tris, pH 8,5, vastaan.

, , 2. Konsentroitu elatusaine ladattiin suhte # * * 10 A280-yksikköä/ml hartsia Q-Sepharose FF -p; * * V · (Pharmacia), joka oli tasapainotettu puskuril]

Tris, pH 8,5, virtausnopeudella 0,2 cm minuutiss· 30 3. Näyteen lataamisen jälkeen pylvästä pes

ί'*’: mella pylvään tilavuudella (PT) puskuria 10 mM

60 ritetyn mukaisesti, kolme erillistä fraktiojaosts tettiin. Tehtiin alempi isoformijaos (isoformit keski-isoformijaos (isoformit 5 - 15) ja ylempi d jaos (isoformit 6 - 18).

5 5. Kukin isoformijaos puhdistettiin erikse* C4-käänteisfaasi-HPLC-pylväällä. Pylvästä ajett dientilla 0,1 % TFA/H20 * 0,1 % TFA/75 % asetonitr: tosnopeudella 1 prosenttiyksikön lisäys asetoi minuutissa.

10 6. Analogihuippu kustakin jaoksesta kerätl teen ja laimennettiin nelinkertaisella tilavuudet ria 80 mM Tris-HCl/20 mM Tris-emäs, sitten konsez ja puskuriksi vaihdettiin 10 mM Tris, pH 7,2, liuottimia kestäviä Centricon 3 -laitteita.

15 7. Kukin jaos laimennettiin, pitoisuuteei A280-yksikköä/ml, puskuriin 10 mM Tris, pH 7,2, ja : ri tilavuus liuosta 4 M guanidiini-HCl (GuHCi; CHAPS, 10 mM Tris, pH 7,2, lisättiin, jolloin lopulliseksi pitoisuudeksi tuli 1 A280-yksikkö/m 20 näyte vietiin pieneen hydroksyyliapatiittipylvääs» oli tasapainotettu liuoksella 2 M GuHCi, 5 mM CHA: : Tris, pH 7,2. Pylvästä pestiin tasapainotuspuskui ,*;·) yhden PT:n fraktioita kerättiin läpi tulevasta t • · t .lm lista.

] ; 25 8. Fraktioiden absorbanssi mitattiin, fral· , .* disteltiin, ja puskuriksi vaihdettiin 10 mM Tris • « * * käyttäen Centricon 10 -laitteita. Kunkin jaokse • · · V · banssi mitattiin.

Lopulliset jaokset analysoitiin SDS-PAGE- •J.s 30 geeleillä. XEF-geelit esitetään kuviossa 12. RIA-r set ja in vivo -aktiivisuuden määritykset suoi 61

Taulukko 8

Erytropoietiinlanalogien isofonnien aktiii EPO-sekvenssi isoformijaos In vivo -akti yks/mg peptid 5

Thr125 Isoformit 8 - 12 147 000b

Isofonnit 9 - 15 215 000b

Isoformit 13-15 111 000b

Ser87Asn88Thr90 Isoformit 7 - 12 132 000 ± 10 Isoformit 10 - 14 233 000 ±

Isoformit 12 - 17 272 000 + “Erytropoietiinipeptidin milligrammamäärä li Ser87Asn88Thr90-EPO:n isoformijaos ten A2B0:stä käyt 15 sorptiviteettia 0,93 1 mg/ml liuokselle.

bThr125-EP0:n isoformijaoksille ei ilmoiteta dipoikkeamia, koska aktiivisuusmääritykset teht kerran tai kahdesti.

Esimerkki 8 20 Analogin EPO N14 biologiset ominaisuudet

Analogin EPO N14 isoformijaosten, ihmisen nanttierytropoietiinin (rHuEPO) ja eristetyn rHi formin 14 aktiivisuuksia vertailtiin i.v. farmakoi sissä määrityksissä, reseptoriinsitoutumismäärity , , 25 hematokriittitutkimuksissa. EPO N14:n isoformi jao: * · '· ** mistettiin esimerkissä 7C kuvatun mukaisesti. rHi *«·

I « I

mistettiin Lain ym. mainitun teoksen mukaisesti.

: isoformi 14 puhdistettiin seuraavasti: rHuEPO, j< * '·’*· tui isoformien 10, 11, 12, 13, 14 ja 15 seoksesti je; : 30 tiin Q-Sepharose Fast Flow -pylvääseen (mitat: hi :T: 2,2 cm x korkeus 3,4 cm), joka oli tasapainotetl rilla 10 mM Tris, pH 7,2. Ladattu pylväs tasapaii . puskuriin 2 mM etikkahappo/6 M urea ( "A-puskuri" • * · ,*··, ajettiin monivaiheinen gradientti, joka oli sut * ± m. m.* 62 26,8 - 62,4 % "B-puskuria" 1 250 ml:n aikana 62,4 - 100 % "B-puskuria" 700 ml:n aikana. 12,5 m: tiota kerättiin, neutraloitiin ammoniumhydroksicLL ten tutkittiin isoelektrisellä fokusoinnilla pol^ 5 amidigeeleissä. Puhdasta isoformia 14 sisältävät yhdistettiin, konsentroitiin Amiconin sekoittajal! tetussa kammiossa, jossa oli YM-10-kalvo, sitter vaihdettiin vedeksi.

A. l.v. farmakokinetilkka 10 Kaksi erillistä tutkimusta tehtiin analogi) (isoformit 15 - 17) ja rHuEPOtn eristetyn isof farmakokineettisten parametrien vertailemiseksi.

Kummassakin tutkimuksessa 1 pCi joko 125l-] eristettyä isoformia 14, 1251-leimattua analogia EP

15 125I-leimattua ihmisen rekombinanttierytropoietiin: sham) injektoitiin laskimonsisäisesti 310 - 378 vissa Sprague-Dawley-urosrotissa isossa päänvi olevaan kanyyliin. Eri aikapisteissä antamisen otettiin 0,3 ml verta, ja seerumi erotettiin sen1 20 maila. Sitten 125I-EP0:n (joko ihmisen rekombinant: tetyn isoformin 14 tai analogin EPO N14) pitoi •\* ml:ssa kutakin seeruminäytettä määritettiin sen » * /:*. kun oli inkuboitu yön yli 4 eC:n lämpötilassa 90- ··, tisessa etanolissa. Etanolin saostama 125I-EPO kust • * * 25 ruminäytteestä laskettiin gamma-laskijassa, ja sa< * * . , makokineettiset käyrät esitetään kuviossa 13. F« i * · ··*,* neettiset parametrit määritettiin jokaiselle rota! * · » täen PC0NLIN 4.0 epälineaarista regressioanalyys tistical Consultants, 1992), ja kunkin ryhmän ti * 30 laskettiin keskiarvo. Analogin EPO N14 ja eriste formin 14 farmakokineettisten tutkimusten tuloksi 11 63 binanttierytropoietiinilla nähtiin nopein β-puoli aika 3,10 tuntia verrattuna 3,97 tuntiin eristetä formille 14 ja 4,36 tuntiin analogille EPO N14. rekombinanttierytropoietiinilla oli myös nopein i 5 puoliintumisaika 1,78 tuntia verrattuna 2,40 tunti tetylle isoformille 14 ja 3,03 tuntiin analogille • · • » » • t «o • * » • · * ·«

• I

• ·· • m • · ♦ · · * * « ··« « • « · • · · • ♦ · · • · « ··· « * • * 64 G Ο ιϊ I ϋ ^ g π ·η d car' ο to η Γ'

3 -H ft -H fc. fj «3» r-< Ο (N

I 0 £ 3 rH O (NO no I β I

0 O 3 3 P *H >« 0 5 cneu-p"' p p μ

(fl P Φ P

a Φ -μ >i Q a] co μ (0 c -Η φ *** ι Λ vo o cn r·· r- *d i{! Tj

^ S' D H n CD iH VO rH nWiJ

K. I s *w ^ ^ u (Tl /*<

H "e^C10^ 010 Ν ° « ’I S

. 0 3 6 3 E ^ C

1 a, +j — +j ^ m *H

» J> H § H H n +> e S x n ·· 1 ® i-H O O' CO O OH 5 ^ O Cl ^ o VO CD CN n <N ^ .-I c 'S -i-SSoi O e g

» ^ « as S OO O o o o S -H -H

H rHföOrt-P 4->5 "> ω c c > *-- djrtjx:

fl rj .S

β I—I Q

" M O, N

^ e n il H β ~ i S Ö Ä <D S' σ»η ion νσ» j>i p ^ O 11 ^ * * |-J >i 5, X Ό Ή ^ CO to (N Γ'-ιΗ *H P ™

m h > G ^ n n C <y P

«Ö "" -j Ή “ ta -n ri p ® n nj £ P 2 _ β -h ® C -¾

^ φ P -H (ö D

” I § Hl' o O ·—I tO 0,5 -H

d 2 d p o o cn n n n η ^ 5 •H S 3 -—· cn ^ n to cn n H-95 S 5 V p 8 etn fo «no

S 3 oli , s» 5" 2- $ | S

o 8^0 3 S S

• *· 5 > μ c to I.. * · -μ φ φ

• · » ö,r* nj o ^j· f" O VO VO fl5-H

·· ö « Ί“1 c g £ j’” g m «<n°mo«ro2lci .·..; ϊ ·η I o £ φ *· aaP Hl -H CN tn CD VO CN ID S75

· Ij H -H UI P rniO CO VO CN VO ·* - "H

:.:: . ΐ §1^15 ^3. £ “ o ... fl 1 SB-SiS OO OO OO g « {j ^ O u . . . , s · 6 · w ft ε Q. ε “ ε “ : .·; S * s « s « a « | a e • * · Li P M M tft C N1 X.

··· M ,Λ <U(U4) (3 _, T* ... _ _ W M * 2 0 H ^

;* O* O *H sv M

„ t: « h „ _ cic-H

65 1 B. Reseptoriinsitoutumismääritykset Analogin EPO N14 (isoformit 15 - 17) inti erytropoietiinireseptorin kanssa tutkittiin ei-rai visen syrjäyttämisen määrityksellä käyttäen ihmi 5 roleukeemisia OCIMl-soluja [Papayannopoulou ym., (supp. 1), 116A (1984)]. Kasvavia pitoisuuksia tonta EPO N14:ä inkuboitiin OCIMl-solujen kanssa vakiopitoisuuden l25I-rHuEPO:a kanssa, jotta mää siin se määrä EPO N14:ä, joka tarvitaan kil 10 125I-rHuEPO:n kanssa reseptoriin sitoutumisesta.

kohdaksi myös kasvavia pitoisuuksia leimaamatonta pantiin kilpailemaan vakiopitoisuuden 125I-rHuEPO: Leimaamaton EPO N14 laimennettiin määri riin, ja sitä lisättiin määrät 0,03 ng, 0,1 ng, 15 1,0 ng, 3,0 ng, 10,0 ng ja 30,0 ng (peptidin im kaan), 0,5 ng 125l-leimattua ihmisen rekombinant poietiinia lisättiin kaikkiin määritysputkiin ja keen lisättiin noin 0,5 x 106 OCIMl-solua. Sitten putkia inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa ravis 20 varustetussa vesihauteessa 2 tuntia. Inkubaatioi liuokset sentrifugoitiin dibutyyliftalaatti/bif öljyliuoksen läpi sitoutumattoman 125I-rHuEPO:n ero si 125I-rHuEPO:sta, joka on sitoutunut OCIMl-soluih « · * napit eristettiin, ja 125I-rHuEPO:n soluihin sitout * ** ^ 25 rä määritettiin gamma-laskennalla. Soluihin spe ** · , 4 sitoutuneet impulssimäärät laskettiin, ja se kons « * · *··/ leimaamatonta proteiinia, joka tarvittiin kil 50 % 125I-rHuEPO:n sitoutumisesta määritettiin line regressioanalyysillä.

* !.:V 30 Kolmen määrityksen tulokset osoittivat, et ··· • · « O £n j. Λ Π-1 Ί J____* J-__if1 A ____i- 66 perusteella EPO N14:ä tarvittiin 5,25-kertainen kilpailemaan 125l-rHuEPO:n sitoutumisesta EPO-re: verrattuna r-HuEPO:in (p < 0*01).

Vielä yksi koe tehtiin analogin EPO N14, < 5 isoformin 14 ja rekombinanttierytropoietiinin er tiinireseptoriin sitoutumisen vertailemiseksi Tämän kokeen tulokset osoittavat, että analogill; oli alempi affiniteetti reseptoriin kuin eristet; formilla 14. Noin kaksinkertainen ylimäärä 10 EPO N14 tarvittiin kilpailemaan 125I-rHuEPO:n sitou reseptoriin verrattuna leimaamattomaan isoformiii vio 14).

C. Hematokriittitutkimus in vivo -tutkimus suoritettiin sen vertail· 15 miten EPO N14:n ylempi ja alempi isoformijaos (e sä 7C kuvatusta preparaatti 2:sta), eristetty is ja ihmisen rekombinantti-EPO kykenevät nostamaan tyjen hiirten hematokriittiä. Isoformien jakauti tutkimuksessa käytetyissä EPO N14:n ylemmässä ja 20 isoformijaoksessa nähdään kuviossa 12.

CDl-hiirille (noin 30 g) injektoitiin int neaalisesti kolmesti viikossa yhteensä kuuden vi « i /;·. jotakin edellä mainituista preparaateista 0,25-p * * « ·*, seen hiiren seerumin albumiiniin valmistettuna [ ", 25 lääkettä (PBS, jossa oli 0,25-prosenttinen hiiren , . albumiini). Erytropoietiinin annostus perustui * * * massaan siten, että 30-grammainen hiiri sai 0,07 ** * tidiä/annos joko EPO N14:n ylempää jaosta, EPO N1 paa jaosta, isoformia 14 tai r-HuEP0-standardi 9 30 toinen annosryhmä 0,036 pg peptidiä/annos otetti

««I

• i pnn mi 4 «« -.1 -a - A j r____ Λ j__i a 4 67 eläimistä, joiden katsottiin olevan negatiivisic loivien vasta-aineiden suhteen, käytettiin myi analyysissä.

Kuten kuviosta 15 nähdään, EPO N14:n ylemmi 5 formijaoksella käsitellyt eläimet saavuttivat k< ryhmän hematokrIittien keskiarvot muihin prepare verrattuna1 Isoformi 14, ihmisen rekombinantti-E] N14:n alempi isoformijaos nostivat hematokriitt: män.

10 Eri erytropoietiinipreparaattien vertai! kvantitatiivisemmin laskettiin hematokriitin nous määräinen alkunopeus (0 - 11 päivää), käyrän a] pinta-ala (0-39 päivää) ja hematokriitin kokoi (taulukko 10). Minkä tahansa näistä kriteereistä ι 15 ti EPO N14:n ylempi isoformijaos vaikuttaa olevan massan mukaan aktiivisempi kuin mikään muista te: preparaateista. Sekä EPO N14:n ylempi isoformij isoformi 14 olivat aktiivisempia kuin ihmisen reki ti-EPO. EPO N14;n alemmalla jaoksella oli alhais: 20 visuus millä tahansa näistä analyyseistä verratte • · » » » • ·♦ • 4 w · · • · · • 4 4 44 4 4 4 « t 4 4 4 4 4 4 « 444 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 « 44 4 4 68 m c i G cr> S 3 A "

3 S g j, Ä fe 5 S

*H μ g +j S'0?

> Ϊ j C S ^ ^ H W fi "H

ti {[ fi J Jj li) N oi O ^ (ί £ ^ o,

O Φ o ö .* (U ·η S

fc k S a > midg h A * w ^ -h .* g

3 U X S

S Se® * „ * S I | •i-> <0 pH *H 3 J5

rH (0 «H to S

3 7 ,- σ> ό oo ^ ^ cn i H [rt 5 H »f N CO (S H n ö

-μμ ^oin^oi^iCM ^ § -H

H 5 i I Q. ij S Λ ._| g A * o £ μ O <*> x 'S *0,0 O +J l +j

“ — H (0 tO

H <0 *H O g H

C > > Φ H

- -H ^ -H -H *0 £ O

C* -μ w i xo so -μ «

g -H 3 *H a Oi-HCtO

S -H CL μ \ -H^+J

S μα-μχα^οΦοο^ο e > ε w •s ^OCO^-H^c^Om -H -H £! 3 g o G <v x.......h xo >ι μ <0 4J3tnj*Hr-ioc>HO p a μ o) ·7(θσιο*Η +j ^ a ΐ ε 3 μ n ai e e S φ o a .* .« -h o g s e ~ >< m+j-H> O Λ jj ·Ρ μ

tj h ® +; H

O ^ X Φ .μ .·. : S 05 ω to -¾ x ·. ·· *H a 3 (o 2 ω ^ φ h 7 φ

. . C iH <H lO r-l Ή Q. H X

.' · JS to C^t^COCOC^Cv o (0 :\ I 9 o o o o o o Sh £ e » · · H S * λ!1 * _v ' 11 3 (0 -j Ή ····: rj . < ° ° ° h i 9 -h S * £ s ΐ : : \· AS S * - 5

··· * ij S °* e S

··· -i \\ to n ί ί 5 S rn m „ 3 Φ 8 g

* χρ·μ toto Wq>*±E

Sm 9° ο§φ9φ b X to to to u % * & h2 -ot-> ^ e o c • · * >1 £ ·Η*μ Μ Γ] (0 rj X0 ;·* o w s ή a ^ a o· a £ ® ij e

• - Η Φ-μ E rH g rH £ Ij 3 ^ X

\..· CjS+J φ φ Φ τί ^ Tl >1 69

Vaikkakin keksintö on kuvattu sen suhte pidetään sen edullisina suoritusmuotoina, sen ei koitus rajoittua esitettyihin suoritusmuotoihin, vastoin, sen on tarkoitus kattaa erilaisia muuni 5 ekvivalentteja, jotka sisältyvät mukana olevien vaatimusten henkeen ja suoja-alaan, jolle suo täytyy antaa laajin tulkinta niin, että se sisält tällaiset muunnokset ja ekvivalentit.

♦ · ·

• Il • i IM

• 9 ·

t I I

9 99 • »

• M

+ * • f • · 9 9 9 9 <«« · 9 9 9 9 9 · 9 m • m 9 •99

Mf 99· 9 9 70

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Elliott, Steven G.

Byrne, Thomas E.

(ii> TITLE OF INVENTION: Erythropoietin Analogs (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 26 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: <A) ADDRESSEE: Amgen Inc., U.S. Patent Operations\rb (B) STREET: 1840 DeHavilland Drive (C) CITY: Thousand Oaks (D) STATE: California (ΕΪ COUNTRY: U.S.A.

(F) ZIP: 91320-1789 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk <B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARES Patentin Release #1.0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 00/108,016 (B) FILING DATE: 17-AUG-1993 (C) CLASSIFICATION: {2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: : (A) LENGTH: 30 base pairs *· *· (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear • a

iii) MOLECULE TYPE: CDNA

• m * · a * · • · » ··· · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l: CGCCCACCAA ACCTCAGCTG TGACAGCCGA ::: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: * · e ··· ,1 1 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: ATCTGTACAA CCGAAGCCTG GAGAGGT (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:

GGGCCTGGCC AACCTGTCGG AAG

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NOl4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 26 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

, . (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: 9 9 m • I·

TCCCCTCCAG ATAATGCCTC AGCTGC

9·9 a fl * ;·. (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: • a * • ....: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs • (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single V : (D> TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

s • a a I a a an 72 1 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: {i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid <C) STRANDEDNESS: single <D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:

AGGCCTGCAG GAATGGGAGC AGATGACCAG GTG

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: t (A) LENGTH: 23 base pairs (ΒΪ TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: CDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:

TCCAGATGCG ACCTCAGCTG CTC

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: * , (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: !/»· (A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleic acid : (C) STRANDEDNESS: single <D) TOPOLOGY: linear a *« e

·;·*; (ii) MOLECULE TYPE: cDNA

• a • a « • # ♦ «·« ♦ »·· : (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8:

CCTCCAGATC CGACCTCAGC TGC

• · · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9: • βι * (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: 73 GGGCCTGGCC AACCTGACAG AAGCTGTC (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(iiJ MOLECULE TYPE: CDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10: CAGGGCCTGT CCAACCTGAC AGAAGCTGTC (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO;11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

, (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:ll: * * I a a *

'* CAGATGCGAA CTCAACGGCT CCAC

*** ! * · » ,] ’ (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12: * · • ·* (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 base pairs : (B) TYPE: nucleic acid · (C> STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear e

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

• • e ·

» I I

IM

4 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: 74 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: CDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l3:

CCAGATCCAA ATTCATCTGC TCCACTC

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: {A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:

I CCAGATCCAA ATTCAACAGC TCCACTC

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: • \ : (A) LENGTH: 24 base pairs '· (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 1 · • ·«

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

« · • t • · m I i » tea · ;*·*: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15: CCAGATGCGA CAACAGCTGC TCCA \,V (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16: a* a (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16: 75 AGATCCGACC ACCGCTGCTC CAC (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICSt (A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17:

TGCTCCACTC ACAACAATCA CTG

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 164 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

f . (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18: a * a a ·*

TCGAGGAACT GAAAAACCAG AAAGTTAACT GGTAAGTTTA GTCTTTTTGT CTTTTAT

i I · a a a

AGGTCCCGGA TCCGGTGGTG GTGCAAATCA AAGAACTGCT CCTCAGTGGA TGTTGCC

I aa

·;··· ACTTCTAGGC CTGTACGGAA GTGTTACTTC TGCTCTAAAA GCTGCTGCAA CAAGCTG

: :#; gacc a a·· a · a • as € • a a a • a a »aa # a a 76 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 107 base pairs <B> TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19: CCTGTAGGAC AGGGGACAGA TCCTCTTCCT CAAAGGCCCC TCCCCCCAGC CTTCCAAC CATCCCGACT CCCGGGGCCC TCGGACACCC CGATCCTCCC ACAATGA (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 108 base pairs (B) TYPE: nucleic acid |C) STRANDEDNESS: double <D> TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20:

I GATCTCATTG TGGGAGGATC GGGGTGTCCG AGGGCCCCGG GAGTCGGGAT GGACTTGC

, . GGCTGGGGGG AGGGGCCGAG GAAGAGGATC TGTCCCCTGT CCTACAGG

• e ♦ • «· «·* (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21: • · · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: S 1 (A) LENGTH: 23 base pairs ·*··* (B) TYPE: nucleic acid # / (C) STRANDEDNESS: single : (D) TOPOLOGY: linear ··« * • *e

V 1 (ii) MOLECULE TYPE: cDNA

* * » « (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0;21; (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22: 77 {i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 23 base pairs (B> TYPE: nucleic acid (C> STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22:

CTTGAATGAG CAGATCACTO TCC

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:23: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid <C) STRANDEDNESS: single <D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: CDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23:

CTGTTGGTCC AGTCTTCCCA G

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:24: . # (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: :/.: (A) LENGTH: 23 base pairs !..* (B) TYPE: nucleic acid v ϊ (C) STRANDEDNESS: single S*. (D) TOPOLOGY: linear • ee

....: (ii) MOLECULE TYPE: cDNA

* ...

• · · ··· · V : (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24:

CCTGTTGGTC CAGTCTTCCC AGC

^ * 1 2 ϊ·* (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25: 2

A A

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25: 78 11

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro £ 15 10 1

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro He Leu Pro Gin 20 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26: <i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 193 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iii MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26:

Met Gly Vai Kis Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu S 15 10 1

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro A 20 25 30

He Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala L 35 40 45

Ala Glu Asn He Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu A ,·, : 50 55 60 \ *:

;*·*· Asn He Thr Val Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Trp L

.I 65 70 75

* I

; "

• Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp Gin Gly Leu A

85 90 9 : ···

! Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu Leu Vai Asn S

loo ios no • · ·

Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Vai Asp Lys Ala Vai S

. 115 120 125 • · « * e #

.«··, Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gin L

• * 1U i a Λ 79 ' 1

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Vai Tyr Ser Asn : 165 170

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr < 180 185 190

Arg ft ft ft · ft • Il • e « «e « I t • ft ft Φ ·· • * • ·· ft e t » · ft « # ft ft ft ft·· · ftftft ft ft · ft·· • « · · • 4 ft • ft ft •ft* ft ft

Claims (11)

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpois sen erytropoietiinin analogin tuottamiseksi, jolloii 5 (a) mainitussa analogissa on ainakin yksi N-glykosylaatiokohta asparagiinitähteessä ainakin aminohappoasemista 30, 51, 57, 88, 89, 136 ja 138 kin yksi lisätty N-kytketty hiilihydraattiketju on ty mihin tahansa mainituista aminohappoasemista, t, 10 (b) mainitussa analogissa on yhden tai aminohapon pidennys erytropoietiinin karboksyylipää ka pidennys sisältää ainakin yhden glykosylaatiokoh< (c) mainittu analogi käsittää yhden tai ihmisen erytropoietiinin glykosylaatiokohdan dele< 15 yhtä suuren lukumäärän ei-luonnollisten glykosylaat en lisäyksen, jolloin hiilihydraattiketjujen asemat vat, tai (d) mainitussa analogissa on ylimäärä: glykosylaatiokohta aminohappoasemassa 123 ja ylim

20 O-kytketty hiilihydraattiketju on liitetty mainitt nohappoasemaan, * « ·.**: tunnettu siitä, että viljellään * V 2 sisäntäsolua, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka j**·. mainittua ihmisen erytropoietiinin analogia, ja er ··*·· 25 näin tuotettu analogi» ί ·*. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen me f « « ·«· 4 tunnettu siitä, että ihmisen erytropoietii * * * logi on: . Asn1 2Thr3Val87Asn88ThrS0EPO. * * *

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen me 2 • * 3 iai -h n r> r\ ä +- ^ n oi i f ä ä+- f ä i Ktni e? λ rs ö i λ Ser87Asn88Thr90 EPO; Ser87Asn88Gly89Thr90 EPO; Ser87Asn88Thr90Thr92 EPO; Ser87Asn88Thr90Ala162 EPO;

5 Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90 EPO; Asn89Ile90Thr91 EPO; Ser87Asn89Ile90Thr91 EPO; Asn135Thr138 EPO; ja Asn138Thr140 EPO.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen mei tunnettu siitä, että pidennys käsittää pept: mentin, joka on peräisin ihmisen koriongonadot; karboksipäästä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen mei 15 tunnettu siitä, että analogi valitaan r] joka koostuu seuraavista: (a) ihmisen erytropoietiini, jolla on ai posekvenssi Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-J Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Prc

20 Leu-Pro-Gln lisäkkeenä karboksipäässä; (b) kohdan (a) mukainen analogi, joka lis£ V*! sittää Ser87Asn88Thr90 EPO:n; ja ί (c) kohdan (a) mukainen analogi, joka Iisa Γ*.. sittää Asn1 2Thr3Val87Asn88Thr90 EPO:n. e ··*·· 25 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen mei tunnettu siitä, että ei-luonnollinen gly] ·>· · tiokohta on N-kytketty hiilihydraatti kohta ihmisen * · « poietiinin aminohappoasemassa 88. . 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen mei ♦ · * tunnettu siitä, että analogi valitaan ri 2 * · 3 ***** ioka koostun seuraavista r 11

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukain< telmä, tunnettu siitä, että analogi on eki sen DNA-sekvenssin ekspressiotuote.

9. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, 5 koodaa ihmisen erytropoietiinin analogia, joka or telty missä tahansa patenttivaatimuksista 1-8.

10. Eukaryoottinen isäntäsolu, t u n n siitä, että se on transfektoitu patenttivaatimukse kaisella DNA-sekvenssillä tavalla, joka sallii isäi 10 ekspressoida analogia.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen isäi tunnettu siitä, että se on CHO-solu. e * s · * • «· • · ·«· • · » • · * i · • « * ·« e » • * • e * « « * · » ··· # • •I • · « • · « I « « • · · «·· ··· • · • · o» 11