RU2451071C1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека (варианты) - Google Patents
Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2451071C1 RU2451071C1 RU2010150675/10A RU2010150675A RU2451071C1 RU 2451071 C1 RU2451071 C1 RU 2451071C1 RU 2010150675/10 A RU2010150675/10 A RU 2010150675/10A RU 2010150675 A RU2010150675 A RU 2010150675A RU 2451071 C1 RU2451071 C1 RU 2451071C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- epo
- monoclonal antibodies
- vkpm
- strains
- produced
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
В изобретении описаны штаммы гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-117, ВКПМ Н-116, ВКПМ Н-115, ВКПМ Н-113 и ВКПМ Н-114 - продуценты моноклональных антител, обладающих различной специфичностью к рекомбинантному эритропоэтину (ЭПО) человека и позволяющих отличать гликозилированную форму ЭПО от сопутствующих гипо- и дегликозилированных примесей. Оценка продуктивности штаммов и специфичности продуцируемых антител проведена на основе иммуноферментного анализа с использованием нескольких маркеров специфичности: рекомбинантного белка ЭПО; гипогликозилированного ЭПО (о-ЭПО), полученного в результате периодатного окисления природного антигена; дегликозилированного ЭПО (de-ЭПО), полученного в результате ферментативной обработки рекомбинантного ЭПО (PNGasa). Продуцируемые гибридомами моноклональные с указанной специфичностью необходимы для выделения гликозилированной формы ЭПО, а также количественного и качественного анализа смесей ЭПО. 5 н.п. ф-лы, 2 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и касается получения моноклональных антител (МкАт) к рекомбинантному эритропоэтину (ЭПО) человека с помощью гибридных культивируемых клеток (гибридом) животных.
ЭПО - гормон, регулирующий пролиферацию и дифференциацию предшественников эритроцитов (Eur.J.Biochem. 210: 649, 1992).
В клинической практике при анемии применяют рекомбинантный ЭПО, полученный в результате клонирования гена ЭПО человека в клетках эукариот (Nephr.Dial.Transpl., 17 (Suppl.5): 42-47, 2002).
Известно, что полипептидная цепь ЭПО сильно гликозилирована, то есть содержит углеводные цепи (J.Biol.Chem. 261: 3116, 1986; Eur.J.Biochem. 213: 39, 1993). Эндогенный и рекомбинантный ЭПО имеют практически идентичную структуру (J.Biol.Chem. 262:12059-12076, 1987; Analit.Biochem. 311: 119-126, 2002). В то же время и для эндогенного, и для рекомбинантного ЭПО характерен полиморфизм, связанный со степенью гликозилирования белковой молекулы. Большинство исследователей находят взаимосвязь между степенью гликозилирования ЭПО и его биологическими свойствами (Analit.Biochem. 311: 119-126, 2002). Известен ряд моноклональных антител, чувствительных к конформационным изменением белковой молекулы (J.Biol.Chem. 262:1161-1165, 1987; J.Immunol.Method. 293:191-205, 2004; US 4558005). Однако вопросы, связанные с иммуноспецифическим распознаванием форм ЭПО с различной степенью гликозилирования остаются нерешенными (J.Immunol.Method. 293:191-205, 2004). В то же время для развития биотехнологии актуальным остается создание иммунохимических методов для определения количества и качества получаемого рекомбинантного ЭПО, а также разделение его форм с различной биологической активностью (Blood 74: 1415, 1989; J.Immunol.Method. 293:191-205, 2004).
Создание панели моноклональных антител, специфически распознающих формы ЭПО с различной степенью гликозилирования, является перспективным для качественного и количественного анализа ЭПО-содержащих жидкостей, а также для иммуноаффинного выделения ЭПО из белковых смесей.
Известны штаммы-продуценты гибридом № ВСКК/П/634D, № ВСКК/П/635D и № ВСКК/П/636D, продуцирующие, соответственно, моноклональные антитела PCE/D7, PCE/D10, PCE/F6, специфичные к эндогенному ЭПО (RU 2151184). Эти МкАт чувствительны к конформационным изменениям ЭПО и специфичны к независимым антигенным детерминантам эндогенного ЭПО с высокой биологической активностью.
Сведений о МкАт, обладающих специфической активностью к дегликозилированным и гипогликозилированным формам ЭПО в источниках информации не обнаружено.
Задача заявляемого изобретения - расширить арсенал штаммов-продуцентов моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека.
Задача решена путем получения штаммов ЕРО 1-3, ЕРО 3-5, ЕРО 4-1, ЕРО 4-4, ЕРО 4-9 гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующих моноклональные антитела, обладающие различной специфичностью по отношению к гликозилированным, гипогликозилированным и дегликозилированным формам рекомбинантного эритропоэтина человека.
Штаммы депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) и имеют номера ВКПМ Н-117, ВКПМ Н-116, ВКПМ Н-115, ВКПМ Н-113 и ВКПМ Н-114 соответственно.
Штаммы получены путем гибридизации лимфоцитов иммунизированной мыши (Balb/c) с клетками миеломы (Sp2/0/Agl4) и применения подкожной схемы иммунизации с последующим выделением лимфоузельных В-лимфоцитов мыши. В качестве иммуногена применен рекомбинантный ЭПО человека (OOO «Фармапарк», ПУР №56882590-02-06).
Полученные штаммы гибридных клеток оценивали по специфичности вырабатываемых ими моноклональных антител методом иммуноферментного анализа (ИФА) (ELISA) (В кн. «Антитела», т.2// изд. «Мир», под ред. Д.Кэтти, 223-230, 1991) с использованием нескольких маркеров специфичности, а именно:
- рекомбинантного белка ЭПО (ООО «Фармапарк», ПУР №56882590-02-06);
- гипогликозилированного ЭПО (о-ЭПО), полученного в результате периодатного окисления природного антигена (J.Immunol. Methods: 78,143-153,1985);
- дегликозилированного ЭПО (de-ЭПО), полученного в результате ферментативной обработки рекомбинантного ЭПО (PNGasa) (J.Immunol.,293,191-205, 2004).
Очищенный рекомбинантный ЭПО имеет известную биологическую активность и использован как контроль при оценке взаимодействия моноклональных антител с менее гликозилированными антигенами. Дегликозилированный антиген (de-ЭПО) содержит не более 1% углеводных цепей, а о-ЭПО, полученный в результате более мягкого периодатного окисления, характеризуется слабым гликозилированием (гипогликозилированный антиген).
Способность МкАт связывать сорбированный или растворенный ЭПО характеризует их чувствительность к конформационным изменениям белковой молекулы. Для получения такой характеристики МкАт заявляемых штаммов использовали два формата ИФА (см. пример 4 (А) и (В)).
Культивирование заявляемых штаммов в питательной среде.
Для культивирования используют среду ДМЭМ (фирма Sigma), содержащую, мас.%:
фетальной сыворотки - 10, глутамина -1, пирувата - 1, раствора пенициллина и стрептомицина (5000 ед./мл) - 1. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5-7% CO2. Для культивирования используют пластиковые или стеклянные планшеты или флаконы объемом 50 мл (фирма Lux). Характер роста - стационарная суспензия. Частота пассирования 2-3 суток. Кратность рассева 1:3-1:4. Титр антител в культуральной жидкости 1:128 для всех заявляемых штаммов.
Культивирование заявляемых штаммов в организме животного.
Для получения асцитов мышам вводят внутриперитонеально 0,5 мл пристана (В кн. «Моноклональные антитела» // изд. Медицина. Под. ред. Р.Кеннета, 396-397). Подготовленные животные отдыхают 3 недели. Гибридомные клетки отмывают от содержащейся в среде сыворотки и вводят 4·106 клеток в растворе Хенкса (производитель - Московский завод бактериальных препаратов). Рост асцитной опухоли отмечают на 7-10 день. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:128, а в асцитической - 1: 10000 для всех заявляемых штаммов.
Продуктивность заявляемых штаммов.
Концентрация антител, продуцируемых штаммами ВКПМ Н-117, Н-116, Н-115, Н-113 и Н-114, составляет в культуральной жидкости 5-10 мкг/мл, в асцитной жидкости - 5-7 мг/мл. Стабильность продуцирования антител для всех заявляемых штаммов сохраняется на протяжении 20 пассажей в культуре и 7 пассажей на животных, если гибридома перевивается.
Контаминация заявляемых штаммов.
Бактерии и грибы в культурах заявляемых штаммов не обнаружены при посевах на стандартные питательные среды (МПА - для выявления бактерий и агар Сабуро - для грибов) (ГФ XI изд. // Вып.2, изм. №3, с.187-192, 1990).
Заражение микоплазмой у заявляемых штаммов не выявлено (тест-система Mycoplasma Stain Kit, фирмы Flow Lab.).
Консервация клеток заявляемых штаммов.
Клетки штаммов ВКПМ Н-117, ВКПМ Н-116, ВКПМ Н-115, ВКПМ Н-113 и ВКПМ Н-114 замораживают после 2 и 3-го клонирования на 10 и 15 пассажах в культуре и после роста в виде асцитной опухоли в мышах. Клетки в криозащитной среде следующего состава, мас.%: ДМЭМ - 50, фетальной сыворотки - 40 и диметилсульфоксида - 10, помещают в холодильник при при -70°С, после чего переносят в жидкий азот.Выживаемость после размораживания для всех заявляемых штаммов составляет 70% -80%.
Пример 1. Получение штаммов ВКПМ Н-117 и Н-116
Мышей линии Balb/c иммунизируют рекомбинантным ЭПО в полном адъюванте Фрейнда в подушечки задних лапок. Доза иммунизации составляет 20 мкг на мышь. На 13-й день мышей иммунизируют в подушечки задних лапок тем же количеством ЭПО в неполном адъюванте Фрейнда (В кн. «Моноклональные антитела» // изд. Медицина. Под. ред. Р.Кеннета, 371-382, 1983). На 16-й день мышей забивают, выделяют подколенные лимфоузлы и клетки лимфоузлов сливают с клетками миеломы Sp2/0/Agl4 с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ). Соотношение клеток лимфоузлов и клеток миеломы составляет 5:1. После слияния клетки рассевают в лунки 96-луночного планшета (фирма Nunc) в количестве 200 тыс. клеток на лунку, в которые предварительно высевают перитонеальные макрофаги мыши по 10 тыс. клеток на лунку. Селекцию гибридом ведут в среде ДМЭМ, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ) (В кн. «Моноклональные антитела»// изд.Медицина, под. ред. Р.Кеннета, 371-382, 1983). Рост гибридов в среде культивирования, содержащей 15% фетальной сыворотки, наблюдают на 3-7 день.
Отбор растущих клонов клеток, секретирующих антитела, проводят на 10-12 день на основе ИФА с использованием указанных ранее маркеров специфичности.
В результате получены штаммы гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-117 и ВКПМ Н-116 - продуценты моноклональных антител к рекомбинантному ЭПО человека.
Дважды проведенное клонирование штаммов Н-117 и Н-116 методом лимитирующих разведении путем рассева в лунки 96-луночного планшета из расчета 1 клетка на лунку в среде ДМЭМ и последующее тестирование на секрецию антител показало, что доля клонов, сохраняющих продукцию антител, составляет 100% для обоих штаммов.
Пример 2. Получение штаммов ВКПМ Н-115, Н-113 и Н-114
Получение штаммов осуществляют, как в примере 1, но доза иммунизации составляет 70 мкг на мышь. В результате получают штаммы гибридом ВКПМ Н-115, ВКПМ Н-113 и ВКПМ Н-114, доля клонов, сохраняющих продукцию антител, составляет для этих штаммов 100%.
Пример 3. Получение, выделение и очистка моноклональных антител, продуцируемых штаммами ВКПМ Н-117, Н-116, Н-115, Н-113 и Н-114
Для получения моноклональных антител клетки заявляемых штаммов выращивают в 24-луночных планшетах (фирма Nunc) на среде культивирования. При достижении концентрации клеток в лунке 106 собирают культуральную жидкость, содержащую клетки, центрифугируют 10 мин при 2000g и удаляют надосадочную жидкость. Собранные клетки переводят в бессывороточную среду (ДМЭМ) и вводят мышам внутрибрюшинно из расчета 4·106 клеток/мышь. Через 10 дней наблюдают визуальный рост асцитной опухоли, мышей забивают и шприцем собирают асциты из брюшной полости. Асцитную жидкость центрифугируют 10 мин при 2000 g, чтобы освободится от клеток, и надосадочную жидкость используют для выделения моноклональных антител каждого из заявляемых штаммов.
С этой целью к асцитной жидкости мыши, содержащей моноклональные антитела каждого из заявляемых штаммов, добавляют равный объем насыщенного (4 М) раствора сульфата аммония и центрифугируют при 5000 g 20 мин. Осадок растворяют, тщательно диализуют против 0,5 М фосфатного буфера рН 7,2 и очищают на колонке с DEAE целлюлозой (DE-5) (Иммунология: 4, 40-44, 1980) Из 1 мл асцитной жидкости получают:
- 7 мг моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-117;
- 8 мг моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-116;
- 9 мг моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-115;
- 10 мг моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-113;
- 8 мг моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-114.
При помощи электрофореза полученные моноклональные антитела каждого из заявляемых штаммов охарактеризованы по молекулярным весам (130 кД) и степени чистоты, которая составляет:
- 92% для моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-117;
- 95% для моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-116;
- 95% для моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-115;
- 95% для моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-113;
- 90% для моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-114.
При помощи иммуноферментной системы фирмы Sigma (Iso 2-1К-Т) установлена принадлежность моноклональных антител заявляемых штаммов к классу IgG 1 с изотипом легких цепей К.
Проведено изоэлектрофокусирование (ИЭФ) полученных моноклональных антител в диапазоне рI 5-8 (ReadyStrip IEF, BioRad) (J.Immunol.Methods: 345,60-69,2009). В качестве стандарта для ИЭФ использована смесь белков (Serva Liquid mix) с pI 5,2; 6,9; 7,8; 8,0. По результатам ИЭФ полученные моноклональные антитела имеют следующие характеристики:
- МкАт, продуцируемое штаммом ВКПМ Н-117, имеет 8 изоформ IgG 1 с рI в диапазоне 6,5-7,4 с максимумами в изоточках 6,7 и 7,4;
- МкАт, продуцируемое штаммом ВКПМ Н-116, имеет 7 изоформ IgG 1 с рI в диапазоне 6,6-7,7 с максимумом в изоточке 7,7;
-МкАт, продуцируемое штаммом ВКПМ Н-115, имеет 6 изоформ IgG 1 с рI в диапазоне 6,5-7,6;
- МкАт, продуцируемое штаммом ВКПМ Н-113, имеет 6 изоформ IgG 1 с рI в диапазоне 6,7-7,6;
- МкАт, продуцируемое штаммом ВКПМ Н-114, имеет 5 изоформ IgG 1 с рI в диапазоне 6,0-7,2 с максимумами в изоточках 6,3; 6,7 и 7,0.
Пример 4. Определение методом ИФА способности моноклональных антител, продуцируемых штаммами ВКПМ Н-117, Н-116, Н-115, Н-113 и Н-114, связывать рекомбинантный ЭПО.
А) с твердой фазы
В лунки 96-луночного планшета вносят по 100 мкл раствора ЭПО антигена с концентрацией 10 мкг/мл и инкубируют 2 ч при 37°С. После 4-кратной отмывки планшета от избытка антигена в лунки вносят рабочий буфер, фосфатный буфер с рН 7,2, содержащий 0,05% бычьего сывороточного альбумина и твина 20 (В кн. "Антитела", т.2 // Под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991). Инкубируют 30 мин. Готовят серию 10-кратных разведении культуральной или асцитной жидкостей заявляемых штаммов в рабочем буфере. Анализируемые пробы в объеме 50 мкл с 2-кратным повтором вносят в лунки планшета с антигеном и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После инкубации удаляют содержимое лунок, промывают планшет и вносят по 50 мкл на лунку раствора конъюгата кроличьих антител к иммуноглобулину мыши с пероксидазой в разведении 1:3000. Планшеты инкубируют еще 2 ч, отмывают и в лунки вносят по 100 мкл субстратного буфера (фосфатно-цитратный буфер с рН 4,5) (В кн. "Антитела", т.2 // Под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991), содержащего 4 мг/10 мл 0-фенилендиамина и 0,03% перикиси водорода. Планшеты инкубируют 10-15 мин и в останавливают реакцию добавлением 10% серной кислоты по 100 мкл на лунку. Планшеты сканируют на ридере для микропланшетов (фирма Labsystems) при длине волны 492 нм. Концентрацию антител определяют по калибровочной кривой, которую получают одновременно с проведением теста. Для построения калибровочной кривой вместо образцов в лунки планшета вносят разведения стандартных препаратов очищенных антител в известной концентрации.
Б) Из раствора
Одновременно в лунки 96-луночного планшеты вносят по 100 мкл раствора крысиных антител к иммуноглобулину мыши с концентрацией 10 мкг/мл и инкубируют 2 ч при 37°С. После 4-кратной отмывки планшета от избытка антител в лунки вносят рабочий буфер, фосфатный буфер с рН 7,2, содержащий 0,05% бычьего сывороточного альбумина и твина 20 (В кн. "Антитела", т.2 // Под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991). Инкубируют 30 мин. В лунки подготовленных таким образом планшет вносят те же 10-кратные разведения асцитных и культуральных жидкостей в объеме 50 мкл и инкубируют 2 ч при 37°С. После инкубации удаляют содержимое лунок, промывают планшет и вносят по 50 мкл на лунку раствора конъюгата ЭПО с пероксидазой в разведении 1:1500. Планшеты инкубируют еще 2 ч, отмывают и в лунки вносят по 100 мкл субстратного буфера (фосфатно-цитратный буфер с рН 4,5) (В кн. "Антитела", т.2 // Под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991), содержащего 4 мг/10 мл 0-фенилендиамина и 0,03% перикиси водорода. Планшеты инкубируют 10-15 мин и останавливают реакцию добавлением 10% серной кислоты по 100 мкл на лунку. Планшеты сканируют на ридере для микропланшетов (фирма Labsystems) при длине волны 492 нм. Интенсивность взаимодействия моноклональных антител с ЭПО оценивают по величине оптической плотности.
В табл. 1 представлены данные о специфичности полученных моноклональных антител к рекомбинантному ЭПО. Интенсивность взаимодействия моноклональных антител с ЭПО в таблице указана следующим образом:
- «-» - отсутствие взаимодействия антиген-антитело;
- «+» - слабое связывание;
- «++» - среднее связывание;
- «+++» - сильное связывание.
Все полученные моноклональные антитела слабо взаимодейтсвуют или не взаимодействуют с сорбированным рекомбинантным ЭПО, то есть чувствительны к конформационным изменениям молекулы ЭПО.
При этом моноклональные антитела, продуцируемые всеми заявляемыми штаммами, способны к связыванию растворенного ЭПО, то есть могут быть использованы для выделения ЭПО из смешанных белковых растворов.
Моноклональные антитела штамма ВКПМ Н-116 практически одинаково распознают ЭПО антиген как в сорбированном, так и растворенном виде, что позволяет использовать его для качественного анализа антигена с использованием твердых носителей, в частности при сорбции антигена ЭПО на нитроцеллюлозе.
| Таблица 1 | ||
| Способность полученных моноклональных антител связывать рекомбинантный ЭПО с твердой фазы и из раствора. | ||
| Название штаммов-продуцентов МкАт | Сорбированный ЭПО | ЭПО в растворе |
| ВКПМ Н-117 | - | ++ |
| ВКПМ Н-116 | ++ | +++ |
| ВКПМ Н-115 | + | +++ |
| ВКПМ Н-113 | + | +++ |
| ВКПМ Н-114 | - | +++ |
Пример 5. Определение методом ИФА специфичности моноклональных антител, продуцируемых штаммами ВКПМ Н-117, Н-116, Н-115, Н-113 и Н-114, к рекомбинантному ЭПО при гипо- и дегликозилировании.
В лунки 96-луночного планшета вносят по 100 мкл раствора крысиных антител к иммуноглобулину мыши с концентрацией 10 мкг/мл и инкубируют 2 ч при 37°С. После 4-кратной отмывки планшета от избытка антител в лунки вносят рабочий буфер, фосфатный буфер с рН 7,2, содержащий 0,05% бычьего сывороточного альбумина и твина 20 (В кн. "Антитела", т.2 // Под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991). Инкубируют 30 мин. Готовят серию 10-кратных разведений культуральной или асцитной жидкостей в рабочем буфере. Полученные разведения в объеме 50 мкл вносят в лунки планшета и инкубируют 2 ч при 37°С. После инкубации удаляют содержимое лунок, промывают планшет и вносят по 50 мкл на лунку раствора конъюгатов ЭПО, о-ЭПО или de-ЭПО с пероксидазой в разведении 1:1500. Планшеты инкубируют еще 2 ч, отмывают и в лунки вносят по 100 мкл субстратного буфера (фосфатно-цитратный буфер с рН 4,5) (В кн. "Антитела", т.2 // Под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991), содержащего 4 мг/10 мл о-фенилендиамина и 0,03% перекиси водорода. Планшеты инкубируют 10-15 мин и останавливают реакцию добавлением 10% серной кислоты по 100 мкл на лунку. Планшеты сканируют на ридере для микропланшетов (фирма Labsystems) при длине волны 492 нм. Способность моноклональных антител взаимодействовать с рекомбинантным ЭПО после частичного или полного дегликозилирования оценивают по величине оптической плотности.
В табл.2 представлены данные о специфичности полученных моноклональных антител к рекомбинатному ЭПО, а также его гипо- (о-ЭПО) и дегликозилированной форме (de-ЭПО). Условные обозначения в таблице 2 аналогичны условным обозначениям для таблицы 1.
| Таблица 2 | |||
| Иммуноспецифическая активность полученных моноклональных антител к гипо- и дегликозилированному ЭПО. | |||
| Название штаммов-продуцентов МкАт | ЭПО | О-ЭПО | De-ЭПО |
| ВКПМН-П7 | ++ | + | - |
| ВКПМН-116 | +++ | +++ | +++ |
| ВКПМН-115 | +++ | ++ | + |
| ВКПМН-113 | +++ | ++ | + |
| ВКПМН-114 | +++ | + | - |
Как следует из представленных в табл.2 данных, моноклональные антитела заявляемых штаммов ВКПМ Н-117 и ВКПМ Н-114 утрачивают способность взаимодействовать с полностью дегликозилированным рекомбинантным ЭПО. Моноклональные антитела штаммов ВКПМ Н-115 и ВКПМ Н-113 имеют низкую специфичность к de-ЭПО, но способны взаимодействовать в о-ЭПО. МкАт штамма ВКПМ Н-116 специфичны к рекомбинантному ЭПО независимо от степени гликозилирования. Эти данные свидетельствуют о высоком сродстве моноклональных антител заявляемых штаммов ВКПМ Н-117, ВКПМ Н-115, ВКПМ Н-113 и ВКПМ Н-114 к гликозилированным участкам молекулы ЭПО. При этом существуют различия между полученными моноклональными антителами в специфичности к гипо- и дегликозилированному ЭПО.
Таким образом, получены штаммы гибридных культивируемых клеток животных Mus museums ВКПМ Н-117, ВКПМ Н-116, ВКПМ Н-115, ВКПМ Н-113 и ВКПМ Н-114 - продуценты моноклональных антител, позволяющих отличать гликозилированную форму ЭПО от сопутствующих гипо- и дегликозилированных примесей, что необходимо для выделения гликозилированной формы ЭПО, а также количественного и качественного анализа смесей ЭПО.
Claims (5)
1. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-117 - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека, характеризующихся 8 изоформами IgG 1 с pI в диапазоне 6,5-7,4 с максимумами в изоточках 6,7 и 7,4.
2. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-116 - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека, характеризующихся 7 изоформами IgG 1 с pI в диапазоне 6,6-7,7 с максимумом в изоточке 7,7.
3. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-115 - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека, характеризующихся 6 изоформами IgG 1 с pI в диапазоне 6,5-7,6.
4. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-113 - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека, характеризующихся 6 изоформами IgG 1 с pI в диапазоне 6,7-7,6.
5. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-114 - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека, характеризующихся 5 изоформами IgG 1 с pI в диапазоне 6,0-7,2 с максимумами в изоточках 6,3; 6,7 и 7,0.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010150675/10A RU2451071C1 (ru) | 2010-12-10 | 2010-12-10 | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека (варианты) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010150675/10A RU2451071C1 (ru) | 2010-12-10 | 2010-12-10 | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека (варианты) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2451071C1 true RU2451071C1 (ru) | 2012-05-20 |
Family
ID=46230737
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010150675/10A RU2451071C1 (ru) | 2010-12-10 | 2010-12-10 | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека (варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2451071C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2717038C1 (ru) * | 2019-01-29 | 2020-03-17 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | Штамм клеток cho-se-9/4 - продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4558005A (en) * | 1982-09-13 | 1985-12-10 | University Patents, Inc. | Monoclonal anti-erythropoietin |
| EP0116446B1 (en) * | 1983-02-04 | 1990-08-22 | Kirin-Amgen, Inc. | Hybridoma cell line and its monoclonal antibody to erythropoletin |
| RU2145610C1 (ru) * | 1998-12-09 | 2000-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" | Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека |
| RU2151184C1 (ru) * | 1998-12-09 | 2000-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" | Штаммы культивируемых гибридом мышей - продуценты моноклональных антител к человеческому эритропоэтину и антитела, ими продуцируемые |
| RU2159814C2 (ru) * | 1993-08-17 | 2000-11-27 | Кирин-Амген, Инк. | Аналог эритропоэтина |
-
2010
- 2010-12-10 RU RU2010150675/10A patent/RU2451071C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4558005A (en) * | 1982-09-13 | 1985-12-10 | University Patents, Inc. | Monoclonal anti-erythropoietin |
| EP0116446B1 (en) * | 1983-02-04 | 1990-08-22 | Kirin-Amgen, Inc. | Hybridoma cell line and its monoclonal antibody to erythropoletin |
| RU2159814C2 (ru) * | 1993-08-17 | 2000-11-27 | Кирин-Амген, Инк. | Аналог эритропоэтина |
| RU2145610C1 (ru) * | 1998-12-09 | 2000-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" | Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека |
| RU2151184C1 (ru) * | 1998-12-09 | 2000-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" | Штаммы культивируемых гибридом мышей - продуценты моноклональных антител к человеческому эритропоэтину и антитела, ими продуцируемые |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2717038C1 (ru) * | 2019-01-29 | 2020-03-17 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | Штамм клеток cho-se-9/4 - продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4589756B2 (ja) | Ｄダイマー測定用キット | |
| JPS63126898A (ja) | コロニー刺激因子に対するモノクローナル抗体 | |
| RU2451071C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека (варианты) | |
| Bártek et al. | Monoclonal antibodies against transferrin. Precipitating mixtures and lack of inter-species cross-reactivity | |
| RU2319743C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к гипогликозилированным и дегликозилированным изоформам опухоль-ассоциированного антигена muc i человека | |
| RU2342428C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных - продуцент моноклональных антител крысы к гипогликозилированным и дегликозилированным изоформам опухоль-ассоциированного антигена человека muci | |
| RU2319742C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к конформационно-зависимым детерминантам опухоль-ассоциированного антигена muc i человека | |
| RU2768838C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus 365e11, продуцирующий моноклональные антитела к шигаподобному токсину ii типа | |
| RU2535982C1 (ru) | Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus musculus l. cchfv vd-1-продуцент моноклонального антитела 4g4/b6 к вирусу крым-конго геморрагической лихорадки | |
| RU2584582C1 (ru) | Моноклональное антитело сс3-4 к конформационному эпитопу с3 человека, штамм гибридной днк мыши рккк(п)764д - продуцент моноклонального антитела сс3-4 | |
| RU2783897C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток Homo sapiens/Mus musculus 1B9C7 - продуцент человеческих моноклональных антител, специфичных к протеолитическому домену ботулинического токсина типа A | |
| SU1710577A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к инсулину человека | |
| CN102827279B (zh) | 一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用 | |
| RU2525663C1 (ru) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 2F9-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ЛИЗОСТАФИНУ И ИНГИБИРУЮЩИХ ЕГО ЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ | |
| SU1604849A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к бактери м рода BRUceLLa | |
| RU2377299C1 (ru) | ШТАММ 5А10 ПОСТОЯННОЙ ГИБРИДОМНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К IgG КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | |
| SU1315473A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека | |
| SU1312097A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензин-превращающему ферменту легких человека | |
| RU2445365C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину с человека (варианты) | |
| RU1778184C (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к легким цеп м иммуноглобулинов кролика | |
| RU1776691C (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, - продуцент моноклональных антител против J @ Е человека | |
| SU1710576A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. -продуцент моноклональных антител к инсулину человека | |
| RU2460788C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus 13f8 - продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному f1 антигену yersinia pestis | |
| RU2012594C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l - продуцент моноклональных антител к 146s-компоненту вируса ящура азия-1 | |
| RU2265051C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. pkkk (п) 679d-продуцент моноклональных антител, специфичных к белково-полисахаридному антигену yersinia enterocolitica о3 и о9 сероваров |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20170327 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201211 |