RU1778184C - Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к легким цеп м иммуноглобулинов кролика - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи  и медицинска  диагностика на основе им- муноферментного анализа. Сущность изобретени : получение штамма гибридных клеток мыши, продуцирующего моно- клональные антитела (МКА) к легким цеп м иммуноглобулинов кролика. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками мышиной миеломы Sp 2/0. Титр МКА в куль- туральной жидкости составл ет 1:64, а в асцитной - 1:2560. МКА относ тс  к IgO, они специфически взаимодействуют с антигенными детерминантами легких цепей X и А иммуноглобулинов кролика. Стабильна  продукци  МКА сохран етс  на прот жении 21 пассажа in vitro. 1 табл. сл

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к гибридомной технологии и касаетс  получени  гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела (МКА) к легким цеп м иммуноглобулинов кролика, которые могут быть использованы дл  создани  универсаль ного антиаидового кроличьего конъю- гата, необходимого при определении активности гипериммунных кроличьих сывороток в иммуноферментном анализе .

Аналогов в патентной и научно- технической литературе не обнаружено.

Штамм получают следующим образом. Белых мышей Balb/c (масса 14-16 г) иммунизируют иммунохимически чистыми легкими цеп ми IgG кролика еженедельно , ввод  внутрибрюшинно по 250 - 300 мкг антигена на мышь в смеси с адъювантом Орейнда. За 4 дн  до гибридизации мышам в течение трех дней подр д ввод т антиген внутривенно в той че дозе без адюъванта. Затем извлекают селезенку и используют ее дл  выделени  иммунных спленоцитов. Сли ние клеток миеломы и иммунных спленоцитов в соотношении 1:5 провод т с помощью 50%-ного полиэтиленгли- кол  с м.м. 1000. После сли ни  взвесь клеток в концентрации () х105 в 1 мл перенос т в 96-луночные панели по 200 мкл на фидерный слой перитонеальных макрофагов мыши, полученный в течение 1-2 суток, клетки инкубируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% -СОг.

Ч

XI

00

Јь

Селекцию гибридом осуществл ют на селективной среде ГАТ, содержащей ги- поксантин ( (Г М),аминоптерин (k x х1СГчМ), тимидин (1,6 10-5М), с последующим 3 кратным рекламированием методом лимитирующих разведений. Первичный скрининг гибридом провод т через 21-30 дней инкубации дл  определени  продукции специфических антител в иммуноеЬерментном анализе (ИФА) с использованием планшетов, активированных легкими цеп ми IgG кролика и меченных пероксидазой антител к белкам сыворотки мыши. В качестве контрол  используют сыворотки мышей, содержащие антитела к легким цеп м иммуноглобулинов кролика в высоких титрах. Отбирают и последовательно размножают клон гибридных клеток, наиболее стабильно продуцирующий МКА необходимой специфичности в луночных панел х, а затем в культу- ральных флаконах возрастающего объема .

Полученный штамм обозначают N15. Он депонирован 16.05.90 г. в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Все- союзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК(П) 489Л и характеризуетс  следующими признаками.

Культуральные признаки. Клетки штамма N15 культивируют в среде КГМ1-1б О с добавлением м; 1-глутамина и 10-15% сыворотки плода коровы. ЛРЯ селекции гибридных клеток в ростовую среду добавл ют

10

15

20

25

30

35

1 -10

-4

М гипоксантина, k

аминоПродуктипность штамма и характеристика полезною продукта. Штамм N15 продуцирует МКА к легким цеп м 7 и X иммуноглобулинов кролика. СпецисЬичность МКА подтверждаетс  методами ИОА и иммуноблотинга. Титр антител в культуральной жидкости сос тавл ет 1:6, в асцитной - 1:2560 (непр мой ИОА). Стабильность продукции антител сохран етс  на прот жении 21 пассажа in vitro (срок наблюдени ) .

Контаминаци  штамма. При исследовании клеток штамма N15 на наличие посторонних агентов микробиологическим и электронномикроскопическим методами бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены.

Криоконсервирование и реконсерва- ци . За сутки до криоконсервировани  провод т смену ростовой среды на све жую. Среда замораживани : 5% конди ционированной среды, 5% эмбриональной сыворотки, 10% диметилсульфокси- да. Режим замораживани  - с Ц°С до -25 С со скоростью 1 градус в минуту , затем - до 70°С по 5°С в минуту ампулы с клетками следует выдержать при такой температуре в течение 10 мин, хранить в жидком азоте при -196°С.

Реконсерваци  - на вод ной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживани  при окрашивании трипановым синим составл ет 88%. Спо собность продуцировать антитела сохран етс  на прежнем уровне.

Пример 1. Планшеты /дл  ИФА

птерина и 1,6 -10 М тимидина. Гибри- активируют препаратом иммунохимичес- дому культивируют как в пластиковых, кичистых легких цепей иммуноглобулицепей иммуноглобулинов кролика, режим активации: концентраци  белка - 0 мкг/мл, наслаивающий буферный раствор - карбонат- бикарбонатный буфер рН , врем  ин кубации - 18 ч при 4°С. После отмыва ни  планшетов от несв завшегос  белка (6 рал поочередно водопроводной водой и дистиллированной водой с 0,05% твина-20) в лунки внос т иссле дуемые пробы культуральной жидкости с продуктами жизнеде тельности гибридного клона N15, а также положительный (сыворотка мышей, иммунизиро ванных легкими цеп ми иммуноглобулинов i„ролика) и отрицательный (куль- туральна  жидкость, не содержаща  продуктов жизнеде тельности гибридом контроли (К+ и К- соответственно).

так и в стекл нных сосудах, оптимальна  посевна  доза 100-200 тыс. клеток в 1 мл, кратность рассева 1:2 - 1:7 интервалы между пассажами 2-3 суток. Культура суспензионна , стационарна . Клетки обладают хорошей адгезивной способностью, легко снимаютс  со стенок сосуда встр хиванием и пипетиро- ваиием без применени  растворов трипсина либо версена. Гибридому N15 культивируют в брюшной полости мышей линии Balb/c, предварительно прайми- рованных неполным адъювантом Фрейн- да. Образуютс  асцитные или солидные опухоли. Асцитные опухоли продуцируют асцит в течение 8-18 дней, начина  с дн  после инокул ции 1- 10 млн. клеток на животное.

5

0

5

0

5

Продуктипность штамма и характеристика полезною продукта. Штамм N15 продуцирует МКА к легким цеп м 7 и X иммуноглобулинов кролика. СпецисЬичность МКА подтверждаетс  методами ИОА и иммуноблотинга. Титр антител в культуральной жидкости составл ет 1:6, в асцитной - 1:2560 (непр мой ИОА). Стабильность продукции антител сохран етс  на прот жении 21 пассажа in vitro (срок наблюдени ) .

Контаминаци  штамма. При исследовании клеток штамма N15 на наличие посторонних агентов микробиологическим и электронномикроскопическим методами бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены.

Криоконсервирование и реконсерва- ци . За сутки до криоконсервировани  провод т смену ростовой среды на свежую . Среда замораживани : 5% кондиционированной среды, 5% эмбриональной сыворотки, 10% диметилсульфокси- да. Режим замораживани  - с Ц°С до -25 С со скоростью 1 градус в минуту , затем - до 70°С по 5°С в минуту, ампулы с клетками следует выдержать при такой температуре в течение 10 мин, хранить в жидком азоте при -196°С.

Реконсерваци  - на вод ной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживани  при окрашивании трипановым синим составл ет 88%. Способность продуцировать антитела сохран етс  на прежнем уровне.

активируют препаратом иммунохимичес- кичистых легких цепей иммуноглобули0

5

цепей иммуноглобулинов кролика, режим активации: концентраци  белка - 0 мкг/мл, наслаивающий буферный раствор - карбонат- бикарбонатный буфер рН , врем  инкубации - 18 ч при 4°С. После отмывани  планшетов от несв завшегос  белка (6 рал поочередно водопроводной водой и дистиллированной водой с 0,05% твина-20) в лунки внос т исследуемые пробы культуральной жидкости с продуктами жизнеде тельности гибридного клона N15, а также положительный (сыворотка мышей, иммунизированных легкими цеп ми иммуноглобулинов i„ролика) и отрицательный (куль- туральна  жидкость, не содержаща  продуктов жизнеде тельности гибридом) контроли (К+ и К- соответственно).

Пропол т инкубацию п течение 3 ч при 37°С, отмывают несв завшиес  белки как описано выше и про вл ют образовавшиес  иммунные комплексы с помощью иммунойерментного конъюгата, представл ющего собой меченные перокси- дазой кроличьи антитела к иммуноглобулинам мьими (рабочее разведение конъюгата - 1:1000, врем  инкубации - 1 ч при 37°С). После окончани  инкубации в лунки планшета внос т субстратную смесь, представл ющую собой 0,0 t% раствор ортосЬенилендиамина на цитратном буфере рИ ,,1 с добавлением 0,03% перекиси водорода: реакцию останавливают путем добавлени  в каждую лунку 60 мкл 50% серной кислоты посте достаточно выраженного (визуальный контроль) изменени  окраски в лунках с испытуемыми пробами.и К+, оптическую плотность продуктов ферментативной реакции измер ют с помощью спектрофотометра с вертикальным ходом луча типа Uniscan.

Определение титров МКА в культу- ральных и асцитных жидкост х в ИФА проводили по методике, аналогичной вышеописанной,но исследуемые пробы в этом случае вносили в различных разведени х (от 1:2 до 1:256 или от 1:20 до 1:2560) и параллельно растит- ровывали положительный и отрицательный контроли. За титр исследуемой пробы принимали то ее последнее разведение , значение оптической плотности (ОП) в котором не менее, чем в два раза превышало величину ОП соответствующего рпвведени  отрицательного контрол  (при непрерывном условии: абсолютна  величина ОП в этом разведении не должна быть меньше 100).

Результаты исследований представлены в таблице.

Пример 2. Провод т электрофорез в 10%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) иммунохимически чистого кроличьего IgG, предварительно прокип тив его в течение 3 мин в буфере, содержащем 0,1% додецилсульфата натри  и 2% бета-меркаптоэтанола. Така  обработка приводит к разрыву межцепочечных св зей в молекуле IgG с разведением ее на т желые и легкие цепи. Параллельно с IRG кролика электрофорезу в ПАЛГ подвергают смесь белков с известной мол. массой (маркеры с мол. массой от до D) ,

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

что позвол ет точно определить после завершени  электрофореза положение легких цепей If G.

После электрофореза белки перенос т на нитроцеллюлозный фильтр с помощью прибора дл  электропереноса: на регулировочные винты горизонтально расположенного основани  камеры помещают нижнюю титановую пластину,

наливают в камеру 1,5 л буфера дл  электропереноса (трис-глициновый буфер , рН 8,6, смешанный в равных час- т х с метанолом и разведенный дистиллированной водой в 5 раз) затем последовательно собирают сэндвич - нижн   м гка  прокладка, прокладка из Фильтровальной бумаги, пластинка полиакриламидного гел  с электрофс/т ретически разделенными молекулами т желых и легких цепей иммуноглобулинов кролика, мембрана, на которую производитс  перенос (нитроцеллюлозный фильтр), верхн   прокладка из Фильтровальной бумаги, верхн   м |- ка  прокладка, верхн   титанова  пластина. Каждый слой укладывают осторожно , след  за тем, чтобы между сло ми не попали пузырьки воздуха. После того, как сэндвич готов, камеру герметично закрывают, став т вертикально и подключают источник питани : отрицательный полюс со стороны гел , положительный - со стороны мембраны. Перенос провод т в течение при напр жении 20-30 В.

После окончани  переноса сэндвич осторожно разбирает в обратной последовательности и мембрану с перенесенными на нее белками помещают в 0,02М трис-HCl буфер рН 7,5 с 0,15 М NaCl и 2% бычьего сывороточного альбумина (буфер 1) на 30 мин. Затем мембрану высушивают и разрезают на узкие полоски (примерно 0,5 см), которые помещают в буфер 2 (буфер 1 с добавлением 0,05% твина-20) на 30-60-мин, после чего полоски мембраны погружают в раствор исследуемых монокло аль- ных а нтител (последние предварительно развод т буфером 2 до концентрации белка 50 мкг/мл), провод т инкубацию в течение 18-2 ч при 4°С, далее полоски мембраны отмывают 5 раз буфером 2 и заливают рабочим раствором иммуноферментного конъюгата (меченные пероксидазой антитела к IgG мыши в разведении 1:500) -на b часа при комнатной температуре. После

7177818

окончани  инкубации пластин с конъю- гатом их отмывают 5 раз по 5 мин буфером 2 и 3 раза по 5 мин 0,02 М трис НС1-буфером рН /,5. Про вление образовавшихс  иммунных комплексов провод т с помощью раствора -хлор- нафтола и диаминобензидина в метаноле с добавлением перекиси водорода (0 мин). В зоне взаимодействи  МКА и легких цепей про вл етс  полоса коричневого цвета.

Таким образом, полученные МКА могут быть эффективно использованы дл 

8

получени  универсальных ангивидовых кроличьих конъюгатоа, необходимых при тестировании активности гипериммунных кроличьих сывороток в иммуно - Ферментном анализе.

Оормула изобретени 

10

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus nusculus L. ВСКК (П) № kQS Д, используемый дл  получени  моноклональных антител к легким цеп м иммуноглобулинов кролика.

Определение титров МКЛ в культуральной и асцитной жидкост х

8

получени  универсальных ангивидовых кроличьих конъюгатоа, необходимых при тестировании активности гипериммунных кроличьих сывороток в иммуно - Ферментном анализе.

Оормула изобретени