SU1652339A1

SU1652339A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклональных антител к мембранному антигену МYсорLаSма aRGININI

Info

Publication number: SU1652339A1
Application number: SU894700424A
Authority: SU
Inventors: Лев Петрович Дьяконов; Юрий Николаевич Федоров; Ирина Львовна Куликова; Татьяна Андреевна Феоктистова
Original assignee: Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии Им.Я.Р.Коваленко
Priority date: 1989-06-20
Filing date: 1989-06-20
Publication date: 1991-05-30

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано дл диагностики микоплазм-контаминантов в культурах клеток. Штамм получают сли нием клеток миеломы мышей SP2/0-Ag с клетками селезенки мышей BALB/C, иммунизированных мембранным антигеном M.arglnini. Клетки растут на среде ДМЭМ с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ пирувата натри , 2% глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина, частота пассировани 1-2 сут, индекс рассева V2-V3. Клетки продуцируют Мои AT, специфичные к антигену Mycoplasma arginini, титр Мои AT в иммуноферментном тесте составл ет 1-128-1 256

Description

сл

с

14

Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано дл диагностики микоплазм-контаминантов в культурах клеток

Штамм получают следующим образом

Клетки миеломы мышей SP2/0-Ag сливают с клетками селезенки мышей BALB/C иммунизированных четырехкратно (100 мкг) мембранным антигеном M.arginmi, выделенным из культур клеток.

Сливание клеток провод т через 3 дн после последней внутривенной иммунизации с помощью ПЭГ-4 000. Клетки миеломы и спленоциты смешивают в соотношении 1:5-1:10 по общеприн той методике

Селекцию гибридом провод т на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и ти- мидин.

Гибридомы выращивают на 96-луноч- ных плашках на среде ДМЭМ с 10% феталь14

й тм

аы и

е, и-

ч- ьной сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере с 5% СОг.

Тестирование гибридом на продукцию антител провод т методом ИФА с использованием антимышиных конъюгатов, а также. мембранного антигена препаратом микбгТ- лазм М arginini.

Реклонирование провод т на плашках по общеприн той методике. В результате отбирают и размножают клон, продуцирующий моноклональные антитела, которые реагируют с антигеном М.arginini.

В иммуноферментном тесте перекрестные реакции с другими штаммами микоп- лазм отсутствуют.

Положительный клон клеток последовательно размножают в 96, 24, 12-луночных плашках, а затем в чашках Петри.

Культуральную жидкость исследуют на содержание специфических антител Титр

о. сл

N) 00 СО Ю

специфических антител в иммунофермент- ном тесте составл ет 1:128-1:256.

Препараты моноклональных антител получают 3-кратным осаждением раствором сульфата аммони 50%-ного насыще- ни с последующим диализом. Определ ют классовую принадлежность и специфичность моноклональных антител.

Штамм клеток обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Клетки ок- руглой формы с большим дром, слабо прикрепл ютс к субстрату, размножаютс в суспензии.

Культуральные свойства. Клетки растут на среде ДМЭМ с добавлением 10% фетэль- ной сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ пирувата натри , 2% глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина . Характер роста - стандартна сус- пензи .

Частота пассировани 1-2 сут, индекс рассева 1:2-1:3.

Контаминаци . Контаминантов - бактерий , грибов, дрожжей и микоплазм - не об- наружено.

Моноклональные антитела определены как иммуноглобулины М-класса.

Хранение культур. Суспензию клеток в концентрации не менее 5 « 106 в ампуле за- мораживают в среде, содержащей 10% ди- метилсульфоксида, 45% среды ДМЭМ инактивированной фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Режим замораживани - снижение температуры на 1 град в 1 мин. Выживаемость клеток после размораживани 60%.

Штамм получил название ШГК. МрА. А-1 и депонирован в Институте цитокологии АН СССР под номером ВСКК(П) № 329D.

П р и м е р 1. Клетки клона пассируют на среде ДМ ЭМ с 10% сыворотки эмбриона коровы, 1 мМ пирувата натри в атмосфере с 5% С02.

Титр специфических антител в культу- ральной жидкости в ИФА состав т 1.128- 1:256.

П р и м е р 2. Клетки продуцирующего клона ввод т о брюшную полость мышам линии BALB/c, предварительно за 10 сут праймированным 0,5 мл пристана, по 2«10б клеток в 0,5 миллилитровом фосфатно-соле- вом растворе.

На 14 сут получена асцитнап жидкость титр специфических антител в ИФА 0,5-1,0- 106.

П р и м е р 3. Препараты моноклональных антител, полученных из асцитной и культуральной жидкостей высаливанием сульфатом аммони 50%-ного насыщени , коньюгируют с пероксидазой из хрена пе- рийодатным методом в соотношении 1 1 (вес/вес). Рабочее разведение конъюгата в ИФА с использованием в качестве мембранного антигена M.arginini (100 мкг/лунку) составл ет 1:6400. Реакци на другие штаммы микоплазм в ИФА соответствует уровню контрол с неспецифическим белком.

Claims

Формула изобретени

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musQulus 1,ВСКК(П) № 329D - продуцент моноклональных антител к мембранному антигену Mycoplasma argininl.