RU2004589C1 - Штамм гибридных культивируемых клеток MUS MUSCULUS - продуцент моноклональных антител, используемых дл диагностики болезни Ибараки - Google Patents

Abstract

Использование: иммунологи , вирусологи . Сущность изобретени ; штамм гибридных клеток получают при сли нии перевиваемой мышиной мие- ломной линии Sp 2/0 - Ag 14 - 1 с лимфоцитами селезенки мыши линии BALB/c. иммунизированной очищенным вирусом болезни Ибараки (ВБИ). Штамм депонирован под номером ВСКК (П) 561 Д. Титр моноклинальных антител (МА) в культуральной жидкости (в ТФ ИФА) составл ет 1 : 128 - 1 :152. При внутрибрюшинном введении мышам линии BALB/c клетки индуцируют образование асцитных опухолей с титром МА в асцитической жидкости до 1 : 20000. Антигенна  специфичность к белку 146 кД ВБИ подтверждена методом радиоиммунопре- ципитации. МА про вл ют активность в непр мом и сэндвич - вариантах ИФА с антигеном ВБИ и не вступают в перекрестную реакцию с гетерологич- ными антигенами Моноклинальные антитела специфичны , позвол ют идентифицировать ВБИ от вируса катаральной лихорадки овец и могут быть использованы дл  изготовлени  диагностических препаратов. 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к штамму гибридных клеток, продуцируещему моноклональные антитела к вирусу болезни Ибараки (ВБИ), которые могут быть использованы в диагностических и научных исследовани х.

Известны штаммы гибридных клеток, секретирующие моноклональные антитела к вирусам эпизоотической геморрагической болезни оленей (ЭГБО) и катаральной лихорадки овец (КЛО). Полученные моноклональныеантителапозвол ют идентифицировать вирусы ЭГБО и КЛО, которые  вл ютс  антигенно родственными не только между собой, но и с ВБИ. Поэтому дл  окончательного решени  вопроса дифференциальной диагностики болезней, вызванных вышеуказанными вирусами, необходимо иметь моноклональные антитела к ВБИ, которые бы идентифицировали ВБИ от антигенно родственных вирусов.

Известны также гибридомы, секретирующие моноклональные антитела к ВБИ, которые получены путем сли ни  клеток миеломы РЗ х 63/Ад 8 с иммунными сплено- цитами мышей линии BALB/c. Иммунизацию мышей провод т очищенным препаратом вируса болезни Ибараки путем внутримышечного введени  с адъювантом Фрейнда и последующей трехкратной инт- раперитонеальной инъекцией с недельным интервалом. Скрининг гибридом на предмет продукции антител ведут в непр мом иммунопероксидазном методе. В результате были получены 5 гибридом, продуцирующих анти-ВБИ антитела изотипов lgG3, lgG2b и lgG2a к белкам с мол.м. 24 и 78 кД. Однако не даетс  полной характеристики штаммов гибридных клеток и секретируе- мых моноклональных антител за исключением изотипа и полипептидной специфичности. Не показана возможность использовани  полученных моноклональных антител дл  диагностики болезни Ибараки , а именно дл  вы влени  антигена в органах зараженных ВБИ животных, а также дл  обнаружени  антител в сыворотках крови больных животных.

Как видно из вышеизложенного отсутствуют данные по получению штамма гибридных клеток, секретирующего моноклональные антитела, которые бы использовались дл  диагностики болезни Ибараки,

Задачей изобретени   вл етс  получение штамма гибридных клеток животных, продуцирующего моноклональные антитела к вирусу болезни Ибараки. используемые в диагностических цел х

Предлагаемый штамм обозначен как ВБИ х Sp 2/0-2D1Q 90 и хранитс  во Всесоюзной специализированной коллекции клеточных культур (ВСКК (П)) института цитологии АН СССР под номером 561 Д.

Штамм гибридных клеток ВБИ х Sp 90 получают путем гибридизации мышиной миеломной линии Sp 2/0- Ag14.1 с лимфоцитами селезенки иммунных

мышей линии BALB/C. Дл  получени  попул ции иммунных лимфоцитов мышей иммунизируют очищенным на 25% (m/v) сахарозной подушке, препаратом вируса, который получают из культуральной жидкости зараженной ВБИ культуры клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК).

В первый день ввод т внутрибрюшинно 200 мкл очищенного вируса (109 вир.част./мл) с равным объемом полного

адъюванта Фрейнда. Через 10 дней инъекцию повтор ют. Спуст  три недели ввод т 250 мкл вирусного препарата внутривенно. Гибридизацию провод т на 4-й день после введени  бустер-дозы. Сли ние клеток миеломы с лимфоцитами осуществл ют в соотношении 1:10 в присутствии 50% полиэтиленгликол  с мол.м, 4000.Культивирование гибридных клеток ведут на среде, содержащей гижэксантин, аминоптерин, тимидин . Продукцию специфических антител определ ют в непр мом варианте твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с антигенами вирусов болезни Ибараки и КЛО. При этом используют очищенный

препарат вируса иммобилизованный на микропластины. Клоны, дающие положительную реакцию в ИФА только с ВБИ, отбирают и дважды клонируют в м гком агаре с целью получени  стабильных штаммов клеток. Клон считают стабильным, если при последующем клонировании не менее 90% субклонов сохран ют продукцию антител .

Полученный штамм ВБИ х Sp 2/0-2Ою х

х 90 имеет следующие морфологическую и физиологическую характеристики.

Культура состоит из клеток округлой формы различной величины с  дром, занимающим большую часть клетки и расположенным эксцентрично. Каждое  дро содержит 2-4  дрышка. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Кариотип соответствует мышиному. Модальный класс 89 хромосом

(модальный класс дл  родительской миеломной линии Sp2/0-Ag 14,1 72 хромосомы). В кариотипе клеток идентифицированы 6-  и 12-  хромосомы, несущие структурные гены иммуноглобулинов.

Клетки обладают слабой адгезивной способностью. Тип роста -- стационарна  суспензи . Клетки легко снимаютс  при встр хивании или пипетировании, образу  мелкую однородную взвесь. Частота пасси- ровани  1 раз в 2-3 дн . Коэффициент пересева 1:2-1:3. Посевна  доза 200-250 тыс ч клеток в 1 мл.

Среда культивировани  - модифицированна  Дульбекко, среда Игла с содержани- ем 15% эмбриональной сыворотки теленка, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натри  и 50 мкг/мл гентамицинэ. Оптимальный рН среды 6,8-7,2.

При хранении в услови х низких темпе- ратур клетки сохран ют жизнеспособность в течение 6 мес при -70°С и неограниченно долго в жидком азоте (-196°С). Клетки хран т в пластиковых ампулах после 2-кратного клонировани  в м гком агаре и пассиро- вани  на мышах линии BALB/c. Концентраци  клеток при криоконсервировании составл ет 5-10 млн/мл. Криозащитна  среда - ростова  среда с добавлением 40% эмбриональной сыворотки теленка и 10% диметилсульфоксида. Жизнеспособность клеток после замораживани  70-72%.

Контаминации бактери ми, грибами и микоплазмами не обнаружено.

Гибридные клетки штамма ВБИ х Sp 2/0-2Dio 90, сохран ют стабильную продукцию моноклинальных антител в культу- ральной среде на прот жении 27 пассажей (срок наблюдени ). При введении предлагаемых клеток в брюшную полость мышам BALB/c в количестве 1-2 млн. на мышь, предварительно сенсибилизированных пристанем, образуютс  асцитные опухоли. Асцитические жидкости (3-7 мл на мышь) получают на 10-14 день после инокул ции клеток. Антитела, продуцируемые предлагаемым клоном, относ тс  к иммуноглобулинам класса G1. Иммуноглобулины выдел ют солевой преципитацией с последующей очисткой на протеин-А сефарозе.

Методом радиоиммунопреципитации определена полипептидна  специфичность к белку с мол.м. 46 кД.

Следовательно, штамм гибридных клеток ВБИх Sp2/0-2Dio 90. секретирующий

моноклональные антитела к ВБИ, отличаетс  от известного прототипа и обладает существенными преимуществами. Так предлагаемый штамм продуцирует иммуноглобулины изотипа G1 и обладает пол ипептидной специфичностью к ВП 46. Кроме того, данные моноклональные антитела могут быть использованы как дл  вы влени  антигена, так и дл  обнаружени  антител в сыворотках больных животных.

Дл  вы влени  специфического антигена в суспензи х из органов зараженных ла- бораторных животных, а также из культуральной жидкости зараженной культуры клеток используют сэндвич - вариант ИФА. При этом моноклинальными антителами сенсибилизируют 96-луночные пластины (1-2 мкл на лунку) в течение 16 ч при 4°С, а затем внос т исследуемые пробы. Вы вление антигена, св завшегос  с подложкой, провод т пероксидазным коньюгатом на основе этих же моноклональных антител.

С целью вы влени  антител в сыворотках крови больных животных примен ют двойной антительный сэндвич - вариант ИФА (ДАС-ИФА) методом ингибировани . Дл  этого к иммобилизованным монокло- нальным антителам добавл ют специфический антиген в рабочем разведении, а затем после инкубации и промывки внос т исследуемые сыворотки. По истечении времени инкубации (1 ч, 37°С) и последующей промывки внос т пероксидазный конъюгат с анти-ВБИ-моноклональными антителами. О наличии специфических антител в сыворотках суд т по подавлению свечени  субстратного раствора.

Таким образом, штамм гибридных клеток ВБИ х Sp 2/0-2Dio 90 может быть использован дл  наработки моноклональных антител, специфичных к вирусу болезни Ибараки. Продуцируемые штаммом моио- клональные антитела позвол ют идентифицировать ВБИ от КЛО и могут быть промышленно применимы дл  изготовлени  диагностических препаратов.

(56) Sugiyama M, et al. Res. In Vefer. Scl, 1989,46. 2, p 283-285.

Сравнительна  характеристика моноклональных антител, секретируемых предлагаемым

штаммом и прототипом

Характеристика

Предлагаемый штамм

Изотип иммуноглобулинов Полипептидна  специфичность

Активность в ИФА

а)культуральна  жидкость

б) асцитическа  жидкость

Использование дл 

диагностики в ИФА

а)дл  вы влени  антигена

б)дл  вы влени  антител в

сыворотках крови

Claims (1)

1. Формула изобретени  Штамм гибридных культивируемы кле- ток Mus musculus BCKK(II) N561 Д - продуПрототип

   lgG3, lgG2a, lgG2b

   78 кД, 24 кД

   центмоноклональныхантител,

   используемых дл  диагностики болезни Ибараки.