RU2031117C1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к вирусу простого герпеса i типа - Google Patents
Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к вирусу простого герпеса i типа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2031117C1 RU2031117C1 SU4954734A RU2031117C1 RU 2031117 C1 RU2031117 C1 RU 2031117C1 SU 4954734 A SU4954734 A SU 4954734A RU 2031117 C1 RU2031117 C1 RU 2031117C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- cells
- herpes simplex
- simplex virus
- hybrid
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология, вирусология. Сущность изобретения: штамм получают путем слияния клетки селезенки мышей BALB/с, иммунизированных вирусом простого герпеса, с клетками миеломы X63-Ag 8.653. Штамм обозначен МАГ-1 и депонирован под номером ВСКК(П) N405Д. Штамм гибридных клеток продуцирует высокоспецифичные моноклональные антитела к вирусу простого герпеса 1 типа класса Ig G 2b. Титр антител в асцитической жидкости в реакции непрямой иммунофлюоресценции составляет 1:8000. 2 табл.
Description
Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано, например, для приготовления диагностических препаратов.
В настоящее время одной из актуальных задач приготовления диагностических препаратов к вирусу герпеса является получение моноклональных антител.
Известны различные штаммы гибридных клеток, для получения которых использовали спленоциты животных, иммунизированных различными вирусами и балками [1,2,3].
Также известны штамм гибридных клеток, продуцирующие моноклональные антитела к вирусу простого герпеса [2].
Однако продуцируемые этим штаммом моноклональные антитела используются в основном для изучения механизмов взаимодействия вируса с клеткой (влияние на проникновение вируса в клетку), для анализа взаимосвязей между различными представителями вирусов группы герпеса.
Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к вирусу простого герпеса 1 типа (ВПГ-1).
Это достигается тем, что штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus МАГ-1 - продуцент моноклональных антител к ВПГ-1 получают путем слияния мышиной миеломы Х-63Аg 8.653 с клетками селезенки мышей, иммунизированных ВПГ-1.
Штамм гибридных клеток МАГ-1 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР г. Ленинград (отделение Всесоюзной Коллекции клеточных культур) под N ВСКК/П/450Д. Справка о депонировании прилагается.
История получения штамма.
Мышиные миеломные клетки гибридизовали по методу Келера и Мильштейна с клетками селезенки мышей BALB/с, иммунизированных ВПГ, тип 1 (штамм Cl) [4] . Фибробласты эмбрионов кур инфицировали ВПГ. Через 4 сут при максимальном развитии цитодеструктивного эффекта культуральную жидкость собирали, освобождали от клеточного детрита дифференциальным центрифугированием при 3000 и 6000 об./мин по 30 мин. Из свободной от клеточного детрита культуральной жидкости центрифугированием при 40000 об./мин в течение 1 ч концентрировали ВПГ. Полученный осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере. Содержание белка в суспензии было 2,7 мг/мл. Перед иммунизацией животных ВПГ-содержащую суспензию шестикратно замораживали и оттаивали. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно по 0,1 мл 4 раза с интервалом 7 дней. Бустерную дозу антигена вводили непосредственно в селезенку. Через 4 сут. готовили спленоциты для слияния с мышиной миеломой Х63-Ag 8.653. Слияние иммунокомпетентных спленоцитов с миеломой в соотношении 4:1 проводили с использованием 50% полиэтиленгликоля 4000 фирмы Loda. Число сливаемых клеток определяли из расчета 150000 селезеночных клеток на лунку панели. Гибридные клетки культивировали на селективной среде ГАТ (среда Дальбекко с пируватом натрия, 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 г/л глюкозы, 2 мМ глютамина, 50 мкг/мл гептамицина, 10-4 М гипоксантина, 10-5 М аминоптерина и 4˙ 10-5 М тимидина) в увлажненной атмосфере с 5% СО2. Скрининг гибридом проводили в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). С этой целью предварительно выращивали монослойную культуру клеток и инфицировали ее ВПГ-1 Cl. Через 48 ч (до развития деструктивного эффекта) клетки фиксировали в охлажденном ацетоне 7 мин. Наличие антител к ВПГ определяли по образованию зеленого свечения на оболочке инфицированных клеток. Титры МКА в культуральной жидкости гибридом колебались от 1:8 до 1:128 в РНИФ. Путем серийных пассажей клетки наиболее продуктивного клона МАГ-1 выведены в массовую культуру. При прививке линейным мышам BALB/с клетками МАГ-1 в дозе 3-5 мин, индуцировали образование асцитных опухолей. Гибридные клетки МАГ-1 продуцируют МКА к ВПГ-1 в культуральную жидкость в большом объеме (сотни миллилитров) на протяжении 39 серийных пассажей (срок наблюдения). Продуцируемые штаммом МАГ-1 антитела охарактеризованы в РНИФ.
Морфология культуры.
Культура состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток различной величины с ядрами, занимающими большую часть клетки. Ядрышки крупные, встречаются двуядерные клетки. Цитоплазма обычно имеет вид тонкого ободка или ядро смещено к одной стороне клетки.
Культуральные характеристики штамма.
Среда для культивирования - среда Дальбекко с пируватом натрия, 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 г/л глюкозы, 2 мМ глютамина, 50 мкг/мл гентамицина (ростовая среда). Характер роста - стационарная суспензия. Метод снятия - встряхивание. Частота пассирования - через 3-4 сут. Посевная доза - 200000 клеток/мл. Кратность рассева 1:3 - 1:4.
Клонирование гибридных клеток.
Клетки дважды клонированы методом предельных разведений. Выход субклонов, продуцирующих МКА к ВПГ-1, составил 87%.
Кариология культуры.
Кариотип соответствует мышиному виду. С помощью метода С-окраски выявлены маркеры родительской линии миеломы Х63. Модальный класс хромосом гибридомы - 116 (модальный класс родительской миеломной линии Х63 - 51 хромосома).
Изоферменты.
Подвижность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в клетках клона МАГ-1 характерна для мышиных клеток.
Сведения о контаминантах линии.
Бактерии не обнаружены, грибы и дрожжи не обнаружены, микоплазмы не обнаружены, вирусы - обнаружены частицы типа А и С, аналогичные частицы родительского штамма клеток Х63-Ag 8.653.
Консервация клеток.
Клетки МАГ-1 заморожены на 21, 27 и 30 пассажах. Общее количество ампул 45 по 5-7 млн.клеток в ампуле. Криозащитная среда - ростовая среда с 50% эмбриональной телячьей сывороткой и 10% глицерина. Выживаемость при размораживании - не менее 50%.
Класс продуцируемых иммуноглобулинов - IgG 2b.
П р и м е р 1. Культивирование гибридных клеток и накопление МКА в культуральных (КЖ) и асцитических жидкостях (АЖ).
В культуральные матрасы объемом 250-500 мл засевают гибридные клетки МАГ-1 в концентрации 200 тыс./мл в ростовой среде. Культуры инкубируют при 37оС в стационарном состоянии 3-4 сут. Клетки отделяют центрифугированием. Надосадок хранят при -20оС и используют как образцы КЖ. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл среды без сыворотки и вводят в полость мышей BALB/с. Через 14-15 сут. образуется асцитическая опухоль, которую используют как образец АЖ.
П р и м е р 2. Определение активности МКА в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).
РНИФ ставили на препаратах, инфицированных ВПГ, КЖ и АЖ разводили физиологическим раствором, наносили каждое разведение на фиксированную суспензию клеток и инкубировали 30 мин при 37оС. После контакта во влажной камере тщательно отмывали от несвязавшейся сыворотки в двух порциях фосфатного буфера рН 7,2-7,4 по 10 мин, подсушивали на воздухе, а затем наносили меченную ФИТЦ антимышиную сыворотку в смеси с контрастирующим бычьим альбумином, меченным фторидом сульфародамина Б. После контакта во влажной камере при 37оС в течение 30 мин клетки отмывали так же, как в первом случае, подсушивали и просматривали в люминесцентном микроскопе. Титром считали то последнее разведение КЖ и АЖ, которое вызывало отчетливое специфическое свечение на +3 в культуре клеток, зараженных ВПГ, но дающих отрицательный результат в незараженной контрольной культуре клеток. Для выявления перекрестной реактивности МКА использовали культуры клеток ФЭК, зараженные вирусом осповакцины (штамм "серый клон"). Результаты исследований представлены в табл.1 и 2.
Результаты исследований, полученные в РНИФ, показывают, что моноклональные антитела специфически реагируют с вирусом простого герпеса, но не с вирусом осповакцины.
Полученный штамм гибридных клеток МАГ-1 синтезирует высокоспецифичные МКА к ВПГ-1 класса IgG 2b с титром в реакции непрямой иммунофлюоресценции 1:8000 (АЖ).
МКА, полученные в препаративных количествах, служат сырьем для получения диагностических препаратов, которые невозможно получить из поликлональных антисывороток. МКА незаменимы при получении высокоочищенных антигенов ВПГ-1, для исследования антигенных взаимоотношений между вирусами группы герпеса. Они могут оказаться полезными при исследовании закономерностей взаимодействия вирусов с клетками, а также для анализа деталей репликации и созревания вирусов.
Claims (1)
- ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА I ТИПА.Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (П) N 450Д - продуцент моноклональных антител к вирусу простого герпеса I типа.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4954734 RU2031117C1 (ru) | 1991-05-22 | 1991-05-22 | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к вирусу простого герпеса i типа |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4954734 RU2031117C1 (ru) | 1991-05-22 | 1991-05-22 | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к вирусу простого герпеса i типа |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2031117C1 true RU2031117C1 (ru) | 1995-03-20 |
Family
ID=21584127
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU4954734 RU2031117C1 (ru) | 1991-05-22 | 1991-05-22 | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к вирусу простого герпеса i типа |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2031117C1 (ru) |
-
1991
- 1991-05-22 RU SU4954734 patent/RU2031117C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Showalter S.D. et al. Infest. Immunol., 1981, v.34, p.684-692. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI83538C (fi) | Foerfarande foer produktion av en hybridomcellinje. | |
JPS5942397A (ja) | モノクロ−ナルIgM抗体及びその製法 | |
SE460907B (sv) | Humanmyelomcellinje, komposition innehaallande saadana celler, samt foerfarande foer cellinjens framstaellning | |
US7871621B2 (en) | Anti-HBs monoclonal antibody | |
RU2031117C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к вирусу простого герпеса i типа | |
RU1836421C (ru) | Способ получени гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к фикомицетам рода РнYторнтоRа, штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к фикомицетам рода РнYторнтоRа, способ получени моноклональных антител к фикомицетам рода РнYторнтоRа | |
RU2012594C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l - продуцент моноклональных антител к 146s-компоненту вируса ящура азия-1 | |
RU2092554C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. - продуцент моноклональных антител к вирусу болезни ауески штамм унииэв 18 в | |
RU2395575C1 (ru) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L. - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP40 ВИРУСА МАРБУРГ (ШТАММ Рорр) (ВАРИАНТЫ), МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ПРОДУЦИРУЕМОЕ ШТАММОМ (ВАРИАНТЫ), НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ФОРМАТА "СЭНДВИЧ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МАТРИКСНОГО БЕЛКА VP40 ВИРУСА МАРБУРГ (ШТАММ Рорр) | |
RU2535982C1 (ru) | Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus musculus l. cchfv vd-1-продуцент моноклонального антитела 4g4/b6 к вирусу крым-конго геморрагической лихорадки | |
SU1631072A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к гликопротеидному структурному белку вируса бешенства | |
JPH06153979A (ja) | 魚類イリドウイルスに対するモノクローナル抗体並びに該抗体を製造するためのハイブリドーマ及び方法 | |
RU2117700C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. - продуцент моноклональных антител к вирусу везикулярной болезни свиней штамм т-75 | |
SU1640158A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7. | |
RU1835848C (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l - продуцент моноклональных антител к холерному энтеротоксину | |
RU2265658C2 (ru) | Штамм гибридных клеток животного mus musculus l. 9e2, используемый для получения моноклональных антител к белку e вируса западного нила штамм wnv/leiv-vig99-27889 | |
RU2257414C1 (ru) | Штамм гибридных клеток с3/s-3e5 животных mus musculus l., продуцирующих моноклональные антитела к коксиеллам бернета | |
RU2186106C1 (ru) | Штамм гибридных клеток э4/n-6g5 животных mus musculus l., продуцирующих моноклональные антитела к вирусу эбола | |
RU2004589C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток MUS MUSCULUS - продуцент моноклональных антител, используемых дл диагностики болезни Ибараки | |
JP2525569B2 (ja) | カンジタ菌の同定方法 | |
RU1791453C (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к мембраносв занной и растворимой формам Н-антигена человека | |
SU1640157A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7 | |
RU2186107C1 (ru) | Штамм гибридных клеток м1/n-10g9 животных mus musculus l., продуцирующих моноклональные антитела к вирусу марбург | |
SU1395668A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS дл получени моноклональных антител к щелочной фосфатазе из кишечника теленка | |
RU2007452C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, используемых для диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов |