SE460907B - Humanmyelomcellinje, komposition innehaallande saadana celler, samt foerfarande foer cellinjens framstaellning - Google Patents

Description

460 907 2 måste bevara båda de mänskliga kromosomer, som bär de om- lagrade generna för de mänskliga lätta och tunga immuno- globulinkedjorna, för att vara effektiva. Det är därför svårt att få arthybridomer, som avsöndrar mänskliga anti- kroppar.

Det är fördelaktigt att tillhandahålla en hybridom- cell bildad genom hopsmältning av en människomyelomcell med en människolymfocyt. En sådan hybridomcell kan producera mänskliga antikroppar med mindre risk för chock vid upprepad injektion i en människa. Mänskliga myelomceller smälter vanligen inte väl ihop med mänskliga lymfocyter.

Det är ett syfte med föreliggande uppfinning att erbjuda en mänsklig myelomcellinje, som är stabil, kan kulti- veras och subkultiveras i obegränsad omfattning samt är i stånd till hybridisering med mänskliga lymfocyter och med lymfocyter från andra djur för bildning av stabila hop- smälta cellhybrider.

Det är ett annat syfte med föreliggande uppfin- ning att erbjuda ett förfarande för framställning av hybrid- om av mänskliga myelomceller, vilka hybridom är i stånd att utsöndra användbara antikroppar, som kan accepteras av det mänskliga immunsystemet.

Det är också ett syfte med föreliggande uppfin- ning att erbjuda ett förfarande för framställning av anti- kroppar för användning vid behandling av sjukdomar hos män- niskor, vilka antikroppar är acceptabla för det mänskliga immunsystemet.

I enlighet med uppfinningen avses en komposition innefattande en stabil kontinuerlig mänsklig myelomcell- linje, vilken är i stånd till hybridflxnfing med antikropps- producerande celler från människor och andra djur, vilken är en mutant av mänskliga B-celler GM 1500 samt vilken har brist pà hypoxantin-fosforibosyltransferas (HPRT).

I en utföringsform av uppfinningen erbjuds förfar- anden för framställning av hybridceller under användning av den stabila, HPRT-deficienta mänskliga myelomcellinjen en- ligt uppfinningen. 460 907 3 En annan utföringsform avser förfaranden för fram- ställning av antikroppar under användning av dessa hybrid- celler.

Uppfinningen avser bl.a. förfaranden för framställ- ning av nya cellinjer, vilka är genetiskt stabila, kan kulti- veras och subkultiveras i obegränsad omfattning samt produ- cerar stora mängder antikroppar mot virus, tumörer och främ- mande ämnen och deras antigeniska determinanter. Dessa cellinjer är hopsmälta cellhybrider av (a) en stabil, HPRT- deficient mänsklig myelomcellinje, d.v.s. en malign cellinje härrörande fràn en primär tumör i benmärgen, och (b) antikroppsproducerande lymfocyter, såsom sådana frán mjälten eller lymfnoderna, eller periferíella lymfocyter.

En särskilt föredragen cellinje är en hopsmält cellhybríd mellan mänskliga periferiella lymfocyter eller mjältceller och mänskliga myelomceller. Dessa cellinjer kan bibehàllas i huvudsak obegränsat i ett kulturmedium, såsom hypoxantin- aminopterin-tymidin-(HAT)-selektivt medium, och kan fort- sätta under obegränsad tid att producera antikroppar speci- fika för antigeniska determinanter.

De enligt uppfinningen använda myelomcellerna häntk- de fråiden mänskliga B-cellinjen GM 1500, vilken togs från en patient med multipelt myelom. Den mänskliga B-cellinjen GM 1500 är tillgänglig från Human Genetic Mutant Cell Repository, Institute for Medical Research, Camden, New Jersey.

Myelomcellerna GM 1500 behandlades med etylmetyl- sulfonat för främjande av mutation därav och selekterades för brist på HPRT (hypoxantinfosforibosyltransferas) i medium innehållande 6-tioguanin med en koncentration av ca 30 ug/ml (den principiella selektionstekniken beskrivs i Nature, vol. 256, H95 - H97 (1975)). Denna process dödar de flesta av myelomcellerna; mänskliga B-celler dör normalt i 6-tioguaminhaltigt medium. Vidare är bland de överlevande cellerna de flesta inta kapabla till hybridi- sering med lymfocyter.

Två publikationer har beskrivit hybridisering av 460 907 H mänskliga B-myelomceller GM 1500 med icke mänskliga myelom- celler. GM 1500-cellerna utsattes inte för mutagenbehand- ling eller för någon selektionsprocess före hopsmältningen i de i dessa artiklar beskrivna processerna. Dessa artiklar är Croce et al i Prcc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., vol. 76, 3H16 - 3419 (197ß) och Croce et al i Eur. J. Immunol., vol.

, N86 - H88 (1980).

Ehuru etylmetylsulfonat med fördel kan användas som mutagen i det ovan beskrivna förfarandet, är det givet att varje annan känd mutagen kan användas för mutering av mänsk- liga B-celler GM 1500 så länge som detta medel inte ogynnsamt påverkar cellerna.

Mutagenbehandlings- och selektionsprocessen gav två "överlevare" som möjliggjorde fortplantning av modifierade stabila HPRT-deficienta myelomcellinjer. De båda överlev- arna betecknades GM 1500 BTG-A1-1 och GM 1500 6TG-A1-2. De båda överlevarna, som tycks vara funktionellt ömsesidigt utbytbara, bildar kontinuerliga cellinjer, som är deponer- ade vid American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, under accessnumren CRL-8032 och CRL-8038, respektive. Dessa myelomcellinjer har det utmär- kande kännetecknet, att de är kapabla till hybridisering med mänskliga lymfocyter såväl som med lymfocyter från andra djur.

Dessa celler avsöndrar IgG modercellerna GM 1500, och (Y-2,K-immunoglobulin) liksom de är positiva för Epstein-Barrs viruskärnantigen. Cellerna vidmakthölls i Eagles minimala essentiella medium (HEM) (medium 16H0 från Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) skulle alternativt kunna användas) innehållande 10 % fosterkalvserum. Myelomcellernas tillväxt inhiberas av selektivt hypoxantin-aminopterin-tymidin- medium. Detta medium beskrivs i Science, vol. 145, 709 - 710 (1964). Denna diskussion hänför sig i fortsättningen till cellerna GM 1500 6TG-A1-2; cellinjen GM 1500 BTG-A1-1 skulle alternativt kunna användas.

De använda lymfocyterna kan vara vilka som helst lymfocyter från en mänsklig individ som har befunnits ut- trycka de önskade antikropparna. Det är också möjligt att 460 907 stimulera mänskliga lymfocyter in vitro att uttrycka de önskade antikropparna. Exempelvis en patient smittad med ett aktivt fluensa, mässling, vaccinia eller kan lymfocyter tas från virus,,såsom rabies, in- polio. Det är emellertid klart, att dessa är endast exempel; lymfocyter uttryckande antikroppar, som angriper andra virus, eller icke virala antigener, såsom pollen, kan också användas. Företrädesvis består lymfocyterna av periferiella lymfocyter separerade från en patients blod, eller mjältceller.

I en utföringsform av uppfinningen användes hepari- niserad blodplasma från en mänsklig patient lidande av subakut skleroserande panencefalit (SSPE), en mässlings- virusinfektion i hjärnan, som lymfocytkälla. För att veri- fiera förekomsten av anti-SSPE-lymfocyter i denna blodplasma spädde man ett serumprov 1:10 000 000 med fosfatbuffert och konstaterade med hjälp av radioimmunoanalys (RIA), att detta bands vid mässlingsinfekterade målceller. Dessa data såväl som indicier på histologiska lesioner i hjärnan, typiska för sjukdomen, bekräftade den kliniska diagnosen av SSPE.

Ett 10 ml prov av hepariniserad blodplasma från denna patient togs, och en suspension av Ficoll-renade lymfocytceller bereddes på det av Gerhard et al, Eur. Immu- nol., 5, 720 - 725 (1975) angivna sättet. Röda blodkroppar lyserades genom inkubation av blodprovet under 15 minuter vid HOC i NHQCI (0,82 %). Den erhållna cellsuspensionen tvätta- des genom en centrifugering (800Xg) genom värmeinaktiverat kalvserum och en centrifugering i proteinfritt medium (RPMI 1640, buffrat med 7,5 mM HEPES, pH 7,2).

Produktion av hybrider âstadkommes genom blandning av ca 10 000 000 modifierade HPRT-deficienta myelomceller enligt uppfinningen med 1 000 000 til 10 000 000 lymfocyter.

Cellblandningen centrifugerades med 800Xg, och cellerna omsuspenderades för fusion i en 50-procentig lösning (vikt/vo- lym) av polyetylenglykol 1000 (PEG) spädd i minimalt essen- tiellt medium (MBM) utan serum. I enligthet med fusions- procedurerna enligt Davidson et al, Somat. Cell Genet. 2, 175 - 176, späddes polyetylenglykolen först med HEM utan 460 907 6 serum och sedan med MEM med serum innan cellerna inympades i fördjupningar i Linbro-plattor i selektivt hypoxantin- aminopterin-tymidin-medium. Kulturerna inkuberades vid 37°C i en atmosfär av 95 % luft och 5 % C02, och vart sjunde till tionde dygn utbyttes kulturmediet delvis mot färskt HAT-medium (1/2 - 1/3).

Femton till tjugoett dygn efter inkubationen av kulturer producerade genom fusion av lymfocyter med myelom- celler iakttogs celltillväxt i tjugo av tjugofyra fördjup- § ningar. All tillväxt i HAT-medium är tecken på framgångs- rik hybridisering mellan lymfocyter och myelomceller.

Dessa celler fortplantades kontinuerligt i HAT-medium och klonades i mikroplattor (Linbro) genom limiterande späd- ning. Varje oberoende klon (härrörande från en oberoende fördjupning) provades på uttryckande av mänskliga immuno- globulinkedjan och på förmåga att immunoprecipitera mäs- slingsvirusprotein. Hybridomen befanns utsöndra IgM speci- fikt för mässlingsvirusnukleokapsider, såsom visas nedan.

Antikropparnas specificitet för mässlingsvirus be- stämdes medelst de välkända metoderna för immunoprecipita- NaDS-polyakrylamid (NaDS betyder natriumdodecylsulfat). Generellt märktes cellkul- tion och gelelektmfores på 10 °ø turerna med 100 uCi 3H-leucin (70 Ci/mmol) per milliliter lösning genom att utsättes därför under 12 h. De mänskliga immunoglobulinkedjorna immunoprecipiterades sedan med anti- humanimmunoglobulinantisera från kanin i enlighet med vedertagna metoder. De immunoprecipiterade märkta mänskliga immunoglobulinkedjorna separerades sedan med konventionell gelehfldrofixes på 10 % NaDS-polyakrylamíd.

En jämförelse gjordes mellan (1) immunoprecipitat av det av GM 1500 BTG-A1-2-cellerna producerade immunoglo- bulinet efter reaktion med ett antihuman-Y-antiserum, (2) immunoprecipitat av immunoglobulinkedjor utsöndrade av human-human-hybridom (erhållna i den ovan beskrivna fu- sionsprocessen) efter reaktion med antihuman-u-antiserum, och (3) immunoprecipitat av immunoglobulinkedjor utsöndrade av ett human-human-hybridom efter reaktion med antihuman-u- 460 907 7 och Y-kedjespecifika antisera, under användning av den ovan 'beskrivna elektroforetiska separationstekniken. Syftet med denna jämförelse var att visa, att de enligt uppfinningen framställda human-human-hybridomen uttrycker både Y- och u-humanimmunoglobulinkedjor.

Sex prov av hybridcellskloner undersöktes genom immunoprecipüatàmi av de av hybriderna utsöndrade immuno- globulinerna med kanin-anti-u-antiserum (IgG1). Alla hybriderna uttryckte den mänskliga u-immunoglobulinkedjan.

Några av dessa hybridom uttryckte också en lätt immuno- globulinkedja, som migrerade annorlunda än den av myelom- klonen GM 1500 BTG-A1-2 uttryckta lätta kedjan. En av dessa hybridomkloner hade inte förmåga att producera den av cel- lerna GM 1500 6TG-A1-2 uttryckta lätta immunoglobulin- kedjan. Hybridomkulturvätskan, som immunoprecipiterades med både antihuman-u- och antihuman-Y-kedjekaninantiserum, uttryckte två tunga immunoglobulinkedjor, nämligen för- äldracellens GM 1500 6TG-A1-2 Y-kedja och föräldracellens SSPE-B u-kedja.

En annan jämförelse gjordes med hjälp av poly- akrylamidgelelektrofores för bestämning av de av hybridom enligt uppfinningen uttryckta antikropparnas specificitet för mässlingsvirusantigen. Två prov av hybridomkultur- medier jämfördes med tvâ kontroller. Kontrollerna var (1) serum erhållet från en mänsklig patient under tillfrisk- nande från en infektion av atypisk mässling, och (2) kultur- vätska från den mänskliga cellinjen GM 1500 6TG-A1-2. Serum frán en patient som hade haft atypisk mässling valdes för provning av mässlingsvirusantikropparnas korseffektivitet.

Jämförelseresultaten erhölls med konventionella analytiska metoder. De vid immunoprecipiteringen använda procedurerna var följande: (1) lysat av med mässlingsvirus infekterade CV1-celler märkta med 358-metionin användes som antigen; (2) alikvoter (25 ul) av antigenet blandades med alikvoter (100 ul) av koncentrerad kulturvätska och inkuberades vid ca 37oC under 90 min och sedan vid ROC under ca H hg (3) alikvoter (25 ul) av totalantihumanantikropp från kanin till- 460 907 8 sattes; (U) inkuberingen upprepades; (5) de precipiterade polypeptiderna uppsamlades genom centrifugering i en Eppen- dorf-centrifug under 20 min vid 10 000 r/min; (6) den ut- vunna synliga pärlan omsuspenderades i fosfatbuffert och tvättades tre gånger; (7) pärlan suspenderades i lysisbuffert och kokades 3 min; (8) de bildade lösningarna elektrofor- erades pâ 10 % NaDS-polyakrylamidgel under betingelser en- ligt Hall et al, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., vol. 76, 20N7 - 2051 (1979). ade gelen mol Cronex-röntgenfilm.

Efter fluorografi exponerades den tork- Kulturvätshnna från hybridomkulturerna precipi- terade virus-NP-polypeptiden och varierande mängder av dess spjälkningsfragment. Antikropparna i kulturvätshnwa är så- ledes specifika för en enda polypeptid, NP, som är den vik- tigaste strukturella polypeptiden i virusnukleokapsiden och det primära mässlingsvirusantigenet.

En annan jämförelse gjordes med hjälp av NaDS-poly- akrylamidgelelektroforetisk analys mellan (1) mässlings- viruspolypeptider precipiterade med kulturvätska (okoncen- trerad) från en hybridomsubklon erhàllen genom limiterande spädníng och (2) viruspolypeptider precipiterade med samma atypiska mässlingsserum som ovan. Resultaten bekräftar specificiteten av antikropparna i kulturvätska fràn hybrid- omklonen, enär subklonen därav precipiterar NP-polypeptiden med en aktivitet jämförlig med föräldrahybridomklonens.

Den cellinje, som bildas genom fusion av den stabila HPRT-deficienta mänskliga myelomcellinjen enligt uppfin- ningen med mänskliga antikroppsproducerande lymfocyter, såsom exemplifieras av de i ovanstående utföringsform av uppfinningen använda anti-SSPE-lymfocyterna, är en hybrid- kultur, som visar kännetecken för både de normala lymfo- cyterna och föräldramyelomcellerna, och synes härröra från en enda fusionshändelse. Cellerna är hybrider till sin natur av följande skäl: (a) Hybridcellinjen har odlats flera månader i selektivt HAT-medium, som inhiberar tillväxt av föräldra- myelomcellerna, men inte av normala lymfocyter, vilka i sin 460 907 9 tur troligen inte skulle överleva mer än N eller 5 veckor in vitro. (b) Antalet kromosomer i hybridcellerna är nära summan av antalet i normala lymfocyter och i föräldra- mycelomcellerna. (c) Hybridomet producerar nya immunoglobulinkedjor, såsom u-kedjor, och lätta kedjor. (d) Hybriden producerar specifika antikroppar, medan föräldramyelomcellerna inte producerar sådana anti- kroppar. Dessutom är produktionen av dessa antikroppar större än den man observerar i kulturer av icke hybridi- serade lymfocyter.

Liknande procedurer kan utföras av fackmannen med hjälp av andra lymfocyter, inklusive mänskliga lymfocyter, som uttrycker andra antikroppar, och lymfocyter från andra djur. Som alternativ till odling av hybridom in vitro kan man injicera hybridomceller i ett immunosupprimerat djur, såsom en naken mus för kultur in vivo.

De av hybriderna producerade antikropparna kan ut- vinnas med hjälp av standardmetoder och kan användas i ana- lytisk medicinsk forskning för identifikation av antigener i blodprov och kulturmedier. Antíkropparna är i huvudsak homogena och är högeligen specifika mot målantígenet. Ett förråd av diverse homogena antikroppar, vardera synnerligen specifik för ett speciellt antigen, ger forskarna möjlighet att snabbt bestämma ett antigens specificitet och/eller karakterisera antigener. Dessutom kan antikropparna admini- streras till sjuka människor för att bidra till bekämpning av sjukdomar.

Claims (20)

460 10 15 20 25 '50 10 907 PATENTKRAV

1. Komposition innehållande en stabil kontinuerlig human- myelomcellinje, som är i stånd till hybridisering med anti- kroppsproducerande celler för människor eller andra djur, för att bilda en stabil, fusionerad cellhyorid som kan pro- ducera antikroppen, k ä n n e t e c k n a t av att denna cellinje är en mutant av mänskliga 8-celler GM 1500 och är deficient i hypoxantinfosforibosyltransferas.

2. Komposition enligt patentkrav 1, vari cellinjen mot- svarar den som ATCC nr CRL"80}2 deponerade cellinjen.

3. Komposition enligt patentkrav 1,'vari cellinjen mot- svarar den som ATCC nr CRL-8038 deponerade cellinjen.

4. Förfarande för framställning av en hybridcellinje genom fusion av en antikroppsproducerande cell och en mvelomcell för bildning av en antikroppsproducerande fusionerad cell- hybrid, k ä n n e t'e c k n a.t av att man använder en myelomcell, som är en hypoxantinfosforibosyltransferasdefi- cient mutant av en mänsklig B-cell GM 1500.

5. Förfarande enligt patentkravet 4, vari myelomcellen tas från en kontinuerlig cellinje, som produceras genom behand- ling av mänskliga B-celler GM 1500 med etylmetylsulfonat för att befordra cellernas mutationsfrekvens och selektering av cellerna med 6-tioguanin för hypoxantinfosforibosyltrans- ferasdeficiens.

6. förfarande enligt patentkravet G, vari myelomcellen er- hålls från den vid AICC under accessnumret CRL-8032 depone- rade kontinuerliga cellinjen.

7. Förfarande enligt patentkravet 4, vari myelomcellen er- hålls från den vid ATCC under accessnumret CRL-8038 depo- nerade kontinuerliga cellinjen.

8. Färfarande enligt patenikravc! Q, vari den fnzioneradv ccllhybriden odlas och av cellhybriden producerade anli- kroppar uppsamlas.

9. förfarande enligt patentkravet 8, vari hybriden odlas in vitro.

10. förfarande enligt patentkravet 8, vari hybriden odlas i vivo på ett djur. 10 15 20 25 1” É 460 907

11. förfarande enligt patentkravet 8, vari hybriden odlas i ett medium innehållande hypoxantin-aminopterintymidin.

12. producerande cellen är en lymfocyt vald bland mjältceller, förfarande enligt patentkravet A, vari den antikropps- lymfnodceller och periferiella lymfocyter.

13. kroppsproducerande cellen är en periferiell lymfocyt.

10. förfarande enligt patentkravet 12, vari den anti- förfarande enligt patentkravet 4, vari den antikropps- producerande cellen erhålls från en med ett virus infekterad människa.

15. Förfarande enligt patentkravet 14, vari viruset är valt i den av rabies-, mässlings-, influensa-, vaccinia- och policvirus bestående gruppen.

16. förfarande enligt patentkravet 15, vari viruset är mäss- lingsvirus.

17. från en fusionerad cellhybrid av (a) en cell från en för Cellinje, k ä n n e L e c k n a d av att den härrör hypoxantin-aminopterin-tymidinmedium känslig humanmyelom- cellinje GM 1500 och (b) en antikroppsproducerande lymfocyt.

18. Cellinje enligt patentkravet 17, vari myelomcellinjen motsvarar den

19. som ATCC nr CRL-8032 deponerade cellinjen. Cellinje enligt patentkravet 17, vari myelomcellinjen motsvarar den

20. som ATCC nr CRL-8038 deponerade cellinjen. Cellinje enligt patentkravet 17, vari den antikropps- producerande lymfocyten är en human lymfocyt.