JPS6133125A - ヒト単クロ−ン性抗肺ガン細胞抗体 - Google Patents
ヒト単クロ−ン性抗肺ガン細胞抗体Info
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- JPS6133125A JPS6133125A JP15422084A JP15422084A JPS6133125A JP S6133125 A JPS6133125 A JP S6133125A JP 15422084 A JP15422084 A JP 15422084A JP 15422084 A JP15422084 A JP 15422084A JP S6133125 A JPS6133125 A JP S6133125A
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- Japan
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- cells
- human
- cancer
- cell
- antibody
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明者らは、ヒト肺ガン細胞に特異的なヒト単クロー
ン性抗体を産生ずるヒトーヒトハイプリドーマを作成し
、更にその抗体を大量に且つ高純度で得ることが出来だ
。新規のハイプリドーマは、安定に継代培養され、肺ガ
ン細胞に対して特異的な抗体を産生ずる。
ン性抗体を産生ずるヒトーヒトハイプリドーマを作成し
、更にその抗体を大量に且つ高純度で得ることが出来だ
。新規のハイプリドーマは、安定に継代培養され、肺ガ
ン細胞に対して特異的な抗体を産生ずる。
この肺ガン特異的抗体は、ガンの免疫学的研究、臨床診
断および免疫治療等の医学的分野での応用やガン特異抗
原の精製手段としての利用が出来る。
断および免疫治療等の医学的分野での応用やガン特異抗
原の精製手段としての利用が出来る。
従来の技術
Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ、およびＭｉ １ｓｔｅｉｎ、に、は
、マウス牌細胞とマウス骨髄腫細胞との細胞融合により
マウスの単クローン性抗体を産生じた（ Ｎａｔｕｒｅ
、２５６巻、４９５−４９７頁、１９７５年及びＥｕｒ
。
、マウス牌細胞とマウス骨髄腫細胞との細胞融合により
マウスの単クローン性抗体を産生じた（ Ｎａｔｕｒｅ
、２５６巻、４９５−４９７頁、１９７５年及びＥｕｒ
。
Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、５巻、５１１−５１９頁、１９
７６年）。ハイプリドーマによる単クローン性抗体の産
生法の特徴は、単一の抗原決定基にのみ反応する抗体を
生体外で大量に且つ繰シ返し得ることが出来ることにあ
る。従って、この方法を用い腫瘍、ウィルス等の抗原に
対する単クロー性抗体を産生じ、その抗体を生物・医学
研究に応用する試みがなされ、数多くの報告がなされて
いるが、殆んどがマウスの単クローン性抗体についてで
ある。
７６年）。ハイプリドーマによる単クローン性抗体の産
生法の特徴は、単一の抗原決定基にのみ反応する抗体を
生体外で大量に且つ繰シ返し得ることが出来ることにあ
る。従って、この方法を用い腫瘍、ウィルス等の抗原に
対する単クロー性抗体を産生じ、その抗体を生物・医学
研究に応用する試みがなされ、数多くの報告がなされて
いるが、殆んどがマウスの単クローン性抗体についてで
ある。
５ｔｅｉｎｉｔｙ、Ｍ、はＢｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウ
イルステノ形質転換によって得られる抗体産生ヒ）Ｂ−
！ｊンパ球の培養によシ抗体を産生じた（ Ｎａｔｕｒ
ｅ ＋２６９巻、４２０−４２２頁、１９７７年）。
イルステノ形質転換によって得られる抗体産生ヒ）Ｂ−
！ｊンパ球の培養によシ抗体を産生じた（ Ｎａｔｕｒ
ｅ ＋２６９巻、４２０−４２２頁、１９７７年）。
発明が解決しようとする問題点
Ａ、 Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの基本的な
細胞融合の技術の提示以来、種々のハイプリドーマの作
成およびこれらのハイプリドーマによシ産生される単ク
ローン性抗体の基礎的または応用的研究について多くの
努力がされてきた（例えばＡｎｎｕａｌ Ｒｅｖ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、 、 ５０巻、６５７−６８０頁、１９８
１）。この文献ならびにこの文献に引用されている文献
は【ハイプリドーマから単クローン性抗体を産生ずるこ
とによシ得られる多くの利点と同時にその操作及びその
結果の複雑さを示している。
細胞融合の技術の提示以来、種々のハイプリドーマの作
成およびこれらのハイプリドーマによシ産生される単ク
ローン性抗体の基礎的または応用的研究について多くの
努力がされてきた（例えばＡｎｎｕａｌ Ｒｅｖ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、 、 ５０巻、６５７−６８０頁、１９８
１）。この文献ならびにこの文献に引用されている文献
は【ハイプリドーマから単クローン性抗体を産生ずるこ
とによシ得られる多くの利点と同時にその操作及びその
結果の複雑さを示している。
一般的技術は、概念的にはよく理解されているが各特定
の場合に多くの困難があシ、従ってそれを解決するため
の変更が要求されるとともに不確定の要素が存在する。
の場合に多くの困難があシ、従ってそれを解決するため
の変更が要求されるとともに不確定の要素が存在する。
事実、一定のハイプリドーマを作成する場合には、所望
のハイプリドーマが得られるかどうか、仮シにそれが得
られた場合抗体を産生ずるかどうか、あるいはまたその
ように産生された抗体が所望の特異性をもつかどうかは
全く予測し難い。成功の程度は、主としていかに多くの
生きのよい抗体産生リンパ球細胞を得るかおよび融合に
用いる親細胞としての腫瘍細胞の選択とその細胞の生き
のよさによシ影響を受ける。
のハイプリドーマが得られるかどうか、仮シにそれが得
られた場合抗体を産生ずるかどうか、あるいはまたその
ように産生された抗体が所望の特異性をもつかどうかは
全く予測し難い。成功の程度は、主としていかに多くの
生きのよい抗体産生リンパ球細胞を得るかおよび融合に
用いる親細胞としての腫瘍細胞の選択とその細胞の生き
のよさによシ影響を受ける。
しかし、それでも成功を左右する未知の不確定の要素が
多くあると考えられ、所望の特異性をもつ単クローン性
抗体を産生ずるハイプリドーマの作成は非常に難し層。
多くあると考えられ、所望の特異性をもつ単クローン性
抗体を産生ずるハイプリドーマの作成は非常に難し層。
特にヒト−ヒトハイプリドーマの場合には、ヒト抗体産
生融合細胞を得ることすら難しく、所望の特異性をもつ
単クローン性抗体を産生ずるヒト−ヒトハイプリドーマ
の作成は困難を極めるといってよい。
生融合細胞を得ることすら難しく、所望の特異性をもつ
単クローン性抗体を産生ずるヒト−ヒトハイプリドーマ
の作成は困難を極めるといってよい。
Ｂ、生体外でヒトのガンに対するヒト単クローン性抗体
を製造するためのアプローチがいくつか試みられたが、
それらは、現在のところ大きく成功していない。これら
には例えば次のことが挙げられる。
を製造するためのアプローチがいくつか試みられたが、
それらは、現在のところ大きく成功していない。これら
には例えば次のことが挙げられる。
（ａ） Ｂｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ウィルスによ
るガン患者の抗体産生リンパ球の形質転換による方法。
るガン患者の抗体産生リンパ球の形質転換による方法。
この形質転換細胞を確立するには長く冗長な過程を必要
とし、またクローン化が非常に困難であるので、この方
法はほとんど成功の例がない。
とし、またクローン化が非常に困難であるので、この方
法はほとんど成功の例がない。
Φ） マウス骨髄腫とガン患者の抗体産生リンパ球細胞
との細胞融合による方法。この方法はマウス−マウスハ
イプリドーマと同様に優れた増殖性を有するマウス−ヒ
トハイプリドーマを製造するが、それはまた、この雑種
細胞が固有の遺伝学的不安定性を有するという大きな不
利な点をも持ち合わせている。すなわち、抗体にとって
重要な意味をもつカッパー鎖を形成するための遺伝子が
位置するヒトの染色体をマウス骨髄腫が融合細胞外へ放
出してしまうということである。従って、ヒト単クロー
ン性抗体を産生ずるハイプリドーマの出来る可能性は非
常に低い。
との細胞融合による方法。この方法はマウス−マウスハ
イプリドーマと同様に優れた増殖性を有するマウス−ヒ
トハイプリドーマを製造するが、それはまた、この雑種
細胞が固有の遺伝学的不安定性を有するという大きな不
利な点をも持ち合わせている。すなわち、抗体にとって
重要な意味をもつカッパー鎖を形成するための遺伝子が
位置するヒトの染色体をマウス骨髄腫が融合細胞外へ放
出してしまうということである。従って、ヒト単クロー
ン性抗体を産生ずるハイプリドーマの出来る可能性は非
常に低い。
Ｃ，マウス−マウスのハイプリドーマによシ産生された
ヒトのガンに対するマウス単クローン性抗体は数多く作
成されているが、これらはヒトにとっては異物であるた
め、例えば、ヒトに反復注射した場合ショックを起こす
危険性がある。従って、ヒトの腫瘍細胞とヒトのガンに
対する抗体を産生ずる細胞とを融合して形成されたヒト
−ヒトハイプリドーマを用いることは有効である。すな
わち、このハイプリドーマはショックの危険の少ないヒ
トのガンに対する単クローン性抗体を産生ずることが出
来るからである。
ヒトのガンに対するマウス単クローン性抗体は数多く作
成されているが、これらはヒトにとっては異物であるた
め、例えば、ヒトに反復注射した場合ショックを起こす
危険性がある。従って、ヒトの腫瘍細胞とヒトのガンに
対する抗体を産生ずる細胞とを融合して形成されたヒト
−ヒトハイプリドーマを用いることは有効である。すな
わち、このハイプリドーマはショックの危険の少ないヒ
トのガンに対する単クローン性抗体を産生ずることが出
来るからである。
Ｄ、ハイプリドーマを生体外で大量培養し、単クローン
性抗体を産生ずる場合、培地として牛胎児血清（以下、
Ｆｅ２という）等の血清添加培地（以下、血清培地とい
う）を一般的に使用している。
性抗体を産生ずる場合、培地として牛胎児血清（以下、
Ｆｅ２という）等の血清添加培地（以下、血清培地とい
う）を一般的に使用している。
しかし、血清は高価であること及びロット間のばらつき
があることから、血清培地は大量培養に適さない。更に
、血清は数十以上の成分から成シ且つ多量に添加される
ため、培地中に分泌された抗体の精製は非常に困難であ
る。
があることから、血清培地は大量培養に適さない。更に
、血清は数十以上の成分から成シ且つ多量に添加される
ため、培地中に分泌された抗体の精製は非常に困難であ
る。
問題点を解決するだめの手段と作用
Ａ０問題点Ａについて。
（ａ） 多くの生きのよい所望のヒト抗体産生リンパ
球細胞を得るために、肺ガン患者から摘出したリンパ節
の中で特にガン細胞が混入しているものを選びそれから
リンパ球細胞を調製した。そのリンパ球細胞をすばやく
その患者のガン細胞及びリンパ球幼若化因子等とともに
培養し、芽球化させた。
球細胞を得るために、肺ガン患者から摘出したリンパ節
の中で特にガン細胞が混入しているものを選びそれから
リンパ球細胞を調製した。そのリンパ球細胞をすばやく
その患者のガン細胞及びリンパ球幼若化因子等とともに
培養し、芽球化させた。
（ｂ） 融合に用いる親細胞としての腫瘍細胞として
融合効率の高いＮＡＴ−３０（特願昭５８−２４７７７
２号、「ヒト・・イブリドーマ作成用親細胞株」）及び
その亜株を用いた。
融合効率の高いＮＡＴ−３０（特願昭５８−２４７７７
２号、「ヒト・・イブリドーマ作成用親細胞株」）及び
その亜株を用いた。
ＮＡＴ−３０及びその亜株とは、ヒトバーキットリンパ
腫細胞であるナマルバ細胞のヒポキサンまた、その細胞
を生きのよい状態にするために、その継代培養用培地（
３０μｌ／ｍ）６−チオグアニン入シ培地）から６−チ
オグアニンを除き１０日間培養、そして融合２日前から
毎日培地を半分ずつ新しい培地と交換した。
腫細胞であるナマルバ細胞のヒポキサンまた、その細胞
を生きのよい状態にするために、その継代培養用培地（
３０μｌ／ｍ）６−チオグアニン入シ培地）から６−チ
オグアニンを除き１０日間培養、そして融合２日前から
毎日培地を半分ずつ新しい培地と交換した。
（ａ）、Φ）等によシ所望の肺ガン細胞に特異なヒト単
クローン性抗体を産生ずるヒト−ヒトハイブリドーマが
作成された。
クローン性抗体を産生ずるヒト−ヒトハイブリドーマが
作成された。
Ｂ０問題点Ｂについて。
本発明者らは、ＨＧＰＲＴ欠損の安定なヒトの腫瘍細胞
株からの細胞で特に融合効率の高い、ＮＡＴ−３０及び
その亜株を用いヒト−ヒトハイブリドーマを作成し、そ
の問題点を解決した。
株からの細胞で特に融合効率の高い、ＮＡＴ−３０及び
その亜株を用いヒト−ヒトハイブリドーマを作成し、そ
の問題点を解決した。
Ｃ０問題点Ｃについて。
本発明者らは、ヒト−ヒトハイブリドーマを作成するこ
ととし、（ａ）肺ガン患者の抗体産生細胞と（ｂ） Ｈ
Ｇ Ｐ ＲＴ欠損の安定なヒトの腫瘍細胞株からの細胞
との融合によシ、ヒトの肺ガンに対するヒト単クローン
性抗体を安定に産生ずるヒト−ヒトハイブリドーマを作
成し、その問題点を解決した。
ととし、（ａ）肺ガン患者の抗体産生細胞と（ｂ） Ｈ
Ｇ Ｐ ＲＴ欠損の安定なヒトの腫瘍細胞株からの細胞
との融合によシ、ヒトの肺ガンに対するヒト単クローン
性抗体を安定に産生ずるヒト−ヒトハイブリドーマを作
成し、その問題点を解決した。
Ｄ１問題点りについて。
本発明者らは血清を添加しない培地（以下、無血清培地
という）でもハイプリドーマが増殖し且つそれが単クロ
ーン性抗体を産生ずる系を作成するために、無血清培地
でも増殖するヒトの腫瘍細胞ＮＡＴ−３０およびその亜
株を親細胞とじて用いた。この親細胞を用いたハイプリ
ドーマは親細胞と同様に無血清培地で増殖した。且つそ
のハイプリドーマは無血清培地中で単クローン性抗体を
産生じた。
という）でもハイプリドーマが増殖し且つそれが単クロ
ーン性抗体を産生ずる系を作成するために、無血清培地
でも増殖するヒトの腫瘍細胞ＮＡＴ−３０およびその亜
株を親細胞とじて用いた。この親細胞を用いたハイプリ
ドーマは親細胞と同様に無血清培地で増殖した。且つそ
のハイプリドーマは無血清培地中で単クローン性抗体を
産生じた。
なお、無血清培地としては、例えば、（ａ）インシーリ
ン、ラクトフェリン、エタノールアミン及びセレニウム
の４成分を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改質培地（以下、Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ改質培地のことをＤＭＥというがある。
ン、ラクトフェリン、エタノールアミン及びセレニウム
の４成分を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改質培地（以下、Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ改質培地のことをＤＭＥというがある。
無血清培地を用いることにより、ハイプリドーマの培養
が安価に出来るようになり、更に精製も非常に簡単に出
来るようになった。
が安価に出来るようになり、更に精製も非常に簡単に出
来るようになった。
実施例１
ヒト抗体産生リンパ球細胞の調製
ヒトリンパ球細胞は、肺ガン患者から摘出したリンパ節
のうち特にガン細胞の混入しているリンパ節を選び、す
みやかにこれを１０％ＦＣ８添加ＤＭＥ中で細切し、更
に２枚のスライドグラスでこの細切した組織を紘さみ押
しつけることによりリンパ球細胞およびガン細胞等を浮
遊させた。
のうち特にガン細胞の混入しているリンパ節を選び、す
みやかにこれを１０％ＦＣ８添加ＤＭＥ中で細切し、更
に２枚のスライドグラスでこの細切した組織を紘さみ押
しつけることによりリンパ球細胞およびガン細胞等を浮
遊させた。
このようにして浮遊させた細胞を、１Ｍ上上記培地クシ
１〜２×１０個リンパ球細胞になるように調製し、これ
に１０μＰ／ｍｌのｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ
を添加した。これをシャーレ中で２〜 （以下余白） ３日間、３７°Ｃの５％炭酸ガスインキ−ベーター内で
培養した。培養後、通常の方法でリンノく球細胞を調製
し、これをヒト抗体産生りンノ（球細胞画分とした。
１〜２×１０個リンパ球細胞になるように調製し、これ
に１０μＰ／ｍｌのｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ
を添加した。これをシャーレ中で２〜 （以下余白） ３日間、３７°Ｃの５％炭酸ガスインキ−ベーター内で
培養した。培養後、通常の方法でリンノく球細胞を調製
し、これをヒト抗体産生りンノ（球細胞画分とした。
ＮＡＴ−３０細胞およびその亜株の調製ＮＡＴ−３０細
胞を調製するには、以下のようにした。
胞を調製するには、以下のようにした。
まずナマルバ細胞（大日本製薬）を４５°Ｃで、０．２
５％寒天を含むＤＭＥ＋１０％ＦＣ８添加血清培地に１
×１０３個／プの細胞濃度で浮遊させ、５ｃｒｒＩシヤ
ーレにその５ ｍｌを取シ、３７°Ｃで５％炭酸ガス及
び９５％空気のインキュベーター内で３週間培養した。
５％寒天を含むＤＭＥ＋１０％ＦＣ８添加血清培地に１
×１０３個／プの細胞濃度で浮遊させ、５ｃｒｒＩシヤ
ーレにその５ ｍｌを取シ、３７°Ｃで５％炭酸ガス及
び９５％空気のインキュベーター内で３週間培養した。
その後生育したクローン９０個を１つずつ９６ウエルプ
レート（ヌンク社）（１ウエルにつき２００μｔの培地
）に取シ出し、寒天を含まない上記血清培地中で、同様
にして２週間培養した。抗体産生能のない株を選択する
目的から、各ウェルの培養上清をとりエンザイムイムノ
アツセイ（カッベル社）によシその上清中の抗体量の測
定を行った。その結果抗体の全く検出されなかっだ細胞
株７株を選び、９６ウエル中で十分に増殖させた。増殖
した細胞株をそれぞれ２４ウエル（１ウエルにつき１．
５）の培地）、５ｃｒｎシヤーレ（１枚につき５ｄの培
地）の順に用いて培養液量を増加していき、約５ Ｘ
１０６細胞ずつを得た。それぞれの株について３ Ｘ
１０’細胞を残し、他の細胞を、新しく調製した上記血
清培地１５ゴに浮遊させ、−５°Ｃで凍結後室温で融解
するという凍結・融解操作を２回縁シ返し細胞を死滅さ
せた。この生き残った細胞を遠心によシ集めそれぞれの
株について、９６ウエルプレート３０ウエルに移植した
。４〜６日ごとに培地を交換しつつ３週間培養した結果
、増殖のみられた株は上記７株中２株についてであった
。２株について、増殖速度の速い５個ずつのウェルの細
胞を上記の順に培養液量を増加し、それぞれ約１×１０
細胞を得た。それぞれの細胞を別々に遠沈によシ集め、
１回ＤＭＥで洗い、無血清培地（ＩＴＥＳ培地、ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａ ｔ ｌ。
レート（ヌンク社）（１ウエルにつき２００μｔの培地
）に取シ出し、寒天を含まない上記血清培地中で、同様
にして２週間培養した。抗体産生能のない株を選択する
目的から、各ウェルの培養上清をとりエンザイムイムノ
アツセイ（カッベル社）によシその上清中の抗体量の測
定を行った。その結果抗体の全く検出されなかっだ細胞
株７株を選び、９６ウエル中で十分に増殖させた。増殖
した細胞株をそれぞれ２４ウエル（１ウエルにつき１．
５）の培地）、５ｃｒｎシヤーレ（１枚につき５ｄの培
地）の順に用いて培養液量を増加していき、約５ Ｘ
１０６細胞ずつを得た。それぞれの株について３ Ｘ
１０’細胞を残し、他の細胞を、新しく調製した上記血
清培地１５ゴに浮遊させ、−５°Ｃで凍結後室温で融解
するという凍結・融解操作を２回縁シ返し細胞を死滅さ
せた。この生き残った細胞を遠心によシ集めそれぞれの
株について、９６ウエルプレート３０ウエルに移植した
。４〜６日ごとに培地を交換しつつ３週間培養した結果
、増殖のみられた株は上記７株中２株についてであった
。２株について、増殖速度の速い５個ずつのウェルの細
胞を上記の順に培養液量を増加し、それぞれ約１×１０
細胞を得た。それぞれの細胞を別々に遠沈によシ集め、
１回ＤＭＥで洗い、無血清培地（ＩＴＥＳ培地、ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａ ｔ ｌ。
Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ 、 ７９巻、１１
５８−１１６２頁、１９８２年）５ゴにそれぞれ浮遊さ
せた。上記と同様に４週間、４〜６日ごとに培地を換え
培養した。この無血清培地での培養で増殖速度の早いも
のから３種類の細胞を選び、十分に増殖させて約１×１
０個ずつの細胞を得た。これらをそれぞれ３μｌ” ／
ｍｌの６−チオグアニンを含む上記血清３０μｌ／Ｉ
ｄの６−チオグアニンを含む同一培地に１×１０個／ｄ
濃度となるように浮遊させ、上記と同様に４週間培養し
た。このようにして６−チオグアニン耐性株を得た。こ
の株をＮＡＴ−３０と命名した。
５８−１１６２頁、１９８２年）５ゴにそれぞれ浮遊さ
せた。上記と同様に４週間、４〜６日ごとに培地を換え
培養した。この無血清培地での培養で増殖速度の早いも
のから３種類の細胞を選び、十分に増殖させて約１×１
０個ずつの細胞を得た。これらをそれぞれ３μｌ” ／
ｍｌの６−チオグアニンを含む上記血清３０μｌ／Ｉ
ｄの６−チオグアニンを含む同一培地に１×１０個／ｄ
濃度となるように浮遊させ、上記と同様に４週間培養し
た。このようにして６−チオグアニン耐性株を得た。こ
の株をＮＡＴ−３０と命名した。
ＮＡＴ−３０細胞の亜株は、ＮＡＴ−３０細胞を０．２
５％寒天を含む培地（３０μＩ／ｍｌの６−チオグアニ
ンおよび１０％ＦＣ８添加ＤＭＥ）に１０３個／ｄの細
胞濃度で浮遊させ、３７°Ｃの５％炭酸ガスインキエベ
ーター内で３週間培養した。その間に増殖したクローン
のうち生育の一番よかったクローンを選びこれをＮＡＴ
３０−８と命名した。
５％寒天を含む培地（３０μＩ／ｍｌの６−チオグアニ
ンおよび１０％ＦＣ８添加ＤＭＥ）に１０３個／ｄの細
胞濃度で浮遊させ、３７°Ｃの５％炭酸ガスインキエベ
ーター内で３週間培養した。その間に増殖したクローン
のうち生育の一番よかったクローンを選びこれをＮＡＴ
３０−８と命名した。
ＮＡＴ−３０およびＮＡＴ ３０−８は３０μｔ／ゴの
６−チオグアニンを含む上記血清培地で継代培養をする
。融合に用いる１０日前から培地を６−チオグアニン無
添加の血清培地に換え更に融合２ハイプリドーマの作成 上記ＮＡＴ−３０またはＮＡＴ３０−８細胞の３ Ｘ
１０７個と上記ヒト抗体産生リンパ球細胞３〜１０ Ｘ
１０７個とを細胞融合に用いた。各細胞をＤＭＥで２
回洗浄し、５０ゴの遠心管中で混合し、１．２０ Ｏｒ
ｐｍで７分間遠沈した。上清を完全に除去し、得られた
細胞ペレットに、あらかじめ３７゜Ｃに加温した４２．
５％ポリエチレングリコール（平均分子量１，５００）
及び１５％ジメチルスルホキシド添加ＤＭ’ＨのＩＭを
１分間かけ少しずつ加えた。更に、１分間３７°Ｃで放
置した後、あらかじめ３７°Ｃに加温しておいたＤＭＥ
を５分間かけ徐々に９ｄ加えた。１．５０Ｏｒｐｍで１
０分間遠沈し、上清を除去した。得られた細胞ベレット
に１５％ＦＣ８添加ＤＭＢ１００＋１１／を加えて、９
６ウエルプレートに夫々１００μｌずつ分注した。２４
時間後、２倍濃度のＨＡＴ培地（上記１５％ＦＣ８培地
にヒボキサンチン２Ｘ１０ Ｍ、アミノブチ日ごとに培
地の半分を捨て、ＨＡＴ培地１００μｌを各ウェルに加
える操作を繰り返し、４−６週間７％酸素、５％炭酸ガ
スを含むインキュベーター内で３７°Ｃで培養した。こ
の間に増殖した）・イブリドーマについては、更に１週
間ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培
地）で培養した後、無血清及び血清培地で培養した。
６−チオグアニンを含む上記血清培地で継代培養をする
。融合に用いる１０日前から培地を６−チオグアニン無
添加の血清培地に換え更に融合２ハイプリドーマの作成 上記ＮＡＴ−３０またはＮＡＴ３０−８細胞の３ Ｘ
１０７個と上記ヒト抗体産生リンパ球細胞３〜１０ Ｘ
１０７個とを細胞融合に用いた。各細胞をＤＭＥで２
回洗浄し、５０ゴの遠心管中で混合し、１．２０ Ｏｒ
ｐｍで７分間遠沈した。上清を完全に除去し、得られた
細胞ペレットに、あらかじめ３７゜Ｃに加温した４２．
５％ポリエチレングリコール（平均分子量１，５００）
及び１５％ジメチルスルホキシド添加ＤＭ’ＨのＩＭを
１分間かけ少しずつ加えた。更に、１分間３７°Ｃで放
置した後、あらかじめ３７°Ｃに加温しておいたＤＭＥ
を５分間かけ徐々に９ｄ加えた。１．５０Ｏｒｐｍで１
０分間遠沈し、上清を除去した。得られた細胞ベレット
に１５％ＦＣ８添加ＤＭＢ１００＋１１／を加えて、９
６ウエルプレートに夫々１００μｌずつ分注した。２４
時間後、２倍濃度のＨＡＴ培地（上記１５％ＦＣ８培地
にヒボキサンチン２Ｘ１０ Ｍ、アミノブチ日ごとに培
地の半分を捨て、ＨＡＴ培地１００μｌを各ウェルに加
える操作を繰り返し、４−６週間７％酸素、５％炭酸ガ
スを含むインキュベーター内で３７°Ｃで培養した。こ
の間に増殖した）・イブリドーマについては、更に１週
間ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培
地）で培養した後、無血清及び血清培地で培養した。
なお、ハイプリドーマは、現在７か月を経ているが、依
然として安定に抗体を産生じている。
然として安定に抗体を産生じている。
間接螢光抗体法
特異性の判定は以下のような方法を用いた。
９６ウエルプレート又は組織培養用チェンバー（ラブー
チック社）にガン細胞及び正常二倍体細胞を１〜５日間
３７°Ｃの５％炭酸ガスインキスベーター中で培養し付
着させた。培養後、０．０５％グルタルアルデヒド又は
４％ホルムアルデヒドで固定する。固定後、リン酸緩衝
化生理食塩水（以下、ＰＢＳという）で３回洗浄し、３
％牛血清アルブミンを誉むＰＢＳを加え室温で３０分間
放置する。放置後、ＰＢＳで５回洗浄し、バイブリドで
３０分間放置する。この後、ＰＢＳで５回洗浄し、螢光
標識（ＦＩＴＣ）したヤギのヒト抗体に対する抗体（例
えば和光純薬社、タボ社）を２０〜５０倍にＰＢＳで希
釈し加え、３７°Ｃ１５％炭酸ガスインキ−ベーター中
で３０分間放置する。
チック社）にガン細胞及び正常二倍体細胞を１〜５日間
３７°Ｃの５％炭酸ガスインキスベーター中で培養し付
着させた。培養後、０．０５％グルタルアルデヒド又は
４％ホルムアルデヒドで固定する。固定後、リン酸緩衝
化生理食塩水（以下、ＰＢＳという）で３回洗浄し、３
％牛血清アルブミンを誉むＰＢＳを加え室温で３０分間
放置する。放置後、ＰＢＳで５回洗浄し、バイブリドで
３０分間放置する。この後、ＰＢＳで５回洗浄し、螢光
標識（ＦＩＴＣ）したヤギのヒト抗体に対する抗体（例
えば和光純薬社、タボ社）を２０〜５０倍にＰＢＳで希
釈し加え、３７°Ｃ１５％炭酸ガスインキ−ベーター中
で３０分間放置する。
放置後、ＰＢＳで５回洗浄し、直に螢光顕微鏡で観察し
た。判定としては、特異的な螢光が５０％以上の細胞に
認められる場合が併とし、２５−５０％の場合が廿とし
、２５％以下の場合が十とし、特異的な螢光が認められ
ない場合及びほとんど見当らない場合が−とした。
た。判定としては、特異的な螢光が５０％以上の細胞に
認められる場合が併とし、２５−５０％の場合が廿とし
、２５％以下の場合が十とし、特異的な螢光が認められ
ない場合及びほとんど見当らない場合が−とした。
表−１はハイプリドーマを血清培地中で培養し、産生さ
れた単クローン性抗体の特異性を調べたものである。表
−１に示したようにＨｙｂ−１０−７は肺ガン細胞株で
あるＰＣ−８と特に強く反応し、他の肺ガン細胞株であ
るＱＧ−５６及びＱＧ−９０とも反応した。その他のガ
ン細胞株とはほとんど反応しなかった。正常２倍体細胞
とは反応しな培養細胞とも反応した。
れた単クローン性抗体の特異性を調べたものである。表
−１に示したようにＨｙｂ−１０−７は肺ガン細胞株で
あるＰＣ−８と特に強く反応し、他の肺ガン細胞株であ
るＱＧ−５６及びＱＧ−９０とも反応した。その他のガ
ン細胞株とはほとんど反応しなかった。正常２倍体細胞
とは反応しな培養細胞とも反応した。
Ｈｙｂ−８６０、Ｈｙｂ −７及びＨｙｂ−９について
はすべての細胞について全く反応しなかった。
はすべての細胞について全く反応しなかった。
実施例２
実施例１のハイプリドーマを無血清培地で培養しその培
地について実施例１に記載した特異性の判定を行った〇 なお、無血清培地の組成は、インシュリン１０μＰ／Ｉ
ｄ 、ラクトフェリン２５μＰ／ ｍＡ！ ％ エタノ
ールアミン１０μＭ及びセレニウム２．５Ｘ１０Ｍの４
成分を含むＤ Ｍ Ｂでおる。
地について実施例１に記載した特異性の判定を行った〇 なお、無血清培地の組成は、インシュリン１０μＰ／Ｉ
ｄ 、ラクトフェリン２５μＰ／ ｍＡ！ ％ エタノ
ールアミン１０μＭ及びセレニウム２．５Ｘ１０Ｍの４
成分を含むＤ Ｍ Ｂでおる。
表−２から明らかなように無血清培地で培養してもそれ
ぞれの単クローン性抗体の特異性は何ら変化しない。
ぞれの単クローン性抗体の特異性は何ら変化しない。
（以下余白）
実施例３
Ｈｙｂ−１０−７を血清及び無血清培地でそれぞれ１ｔ
ずつ培養し、その単クローン性抗体の精製を行った。
ずつ培養し、その単クローン性抗体の精製を行った。
表−３に示したように、無血清培地で培養した場合には
０−５０％飽和硫安分画及び５ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−
４Ｂ（ファルマシア社）によるゲル濾過のみによシ高純
度の単クローン性抗体が製造出来た。
０−５０％飽和硫安分画及び５ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−
４Ｂ（ファルマシア社）によるゲル濾過のみによシ高純
度の単クローン性抗体が製造出来た。
培 地 ６５ １４
２２無血清培地 硫 安 画 分 １６
７ ４４８ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ画分
５ ５ １００培 地 ３
．７９０ ４１ １血清培地 硫安画
分 ５４０ １６ ２８ｅｐｈａｒｏｓｅ４
Ｂ画分 ３７０ １６ ４発明の効果 肺ガン細胞に特異的に反応するヒト単クローン性抗体を
産生するヒトーヒトノ１イブリドーマを作成することが
出来た。また、このハイプリドーマは、無血清培地中で
抗体を産生じ得ることから、容易に安価で高純度の抗体
を得ることが出来た。
２２無血清培地 硫 安 画 分 １６
７ ４４８ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ画分
５ ５ １００培 地 ３
．７９０ ４１ １血清培地 硫安画
分 ５４０ １６ ２８ｅｐｈａｒｏｓｅ４
Ｂ画分 ３７０ １６ ４発明の効果 肺ガン細胞に特異的に反応するヒト単クローン性抗体を
産生するヒトーヒトノ１イブリドーマを作成することが
出来た。また、このハイプリドーマは、無血清培地中で
抗体を産生じ得ることから、容易に安価で高純度の抗体
を得ることが出来た。
このような肺ガン特異ヒト単クローン性抗体の製造は、
ガンの免疫学的研究、臨床診断、免疫治療等の医学的分
野での応用やガン特異抗原の精製手段としての利用に役
立つものと思われる。
ガンの免疫学的研究、臨床診断、免疫治療等の医学的分
野での応用やガン特異抗原の精製手段としての利用に役
立つものと思われる。
Claims (5)
- （１）肺ガン患者の抗体産生細胞と、ヒト腫瘍細胞株か
らの細胞との融合によって形成されたハイブリドーマに
よって産生され、次の特徴を有するヒト単クローン性抗
肺ガン細胞抗体。 （イ）肺ガン細胞と強く反応する。 （ロ）胃ガン、腎臓ガン、メラノーマおよび膀胱ガンな
どの細胞とはほとんど反応しない。 （ハ）正常細胞とは反応しない。 - （２）ヒト腫瘍細胞株からの細胞が、ヒトバーキットリ
ンパ腫細胞であるナマルバ細胞のヒポキサンチン−グア
ニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損突然変異
細胞である特許請求の範囲第１項記載のヒト単クローン
性抗肺ガン細胞抗体。 - （３）肺ガン患者の抗体産生細胞と、ヒト腫瘍細胞株か
らの細胞との融合によって形成され、次の特徴を有する
ヒト単クローン性抗肺ガン細胞抗体を産生するハイブリ
ドーマ。 （イ）肺ガン細胞と強く反応する。 （ロ）胃ガン、腎臓ガン、メラノーマおよび膀胱ガンな
どの細胞とはほとんど反応しない。 （ハ）正常細胞とは反応しない。 - （４）ヒト腫瘍細胞株からの細胞が、ヒトバーキットリ
ンパ腫細胞であるナマルバ細胞のヒポキサンチン−グア
ニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損突然変異
細胞である特許請求の範囲第３項記載のハイブリドーマ
。 - （５）肺ガン患者の抗体産生細胞と、ヒト腫瘍細胞株か
らの細胞との融合によって形成されたハイブリドーマの
産生する単クローン性抗体の製造方法において、無血清
培地または牛胎児血清添加培地で培養することを特徴と
するヒト単クローン性抗肺ガン細胞抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15422084A JPS6133125A (ja) | 1984-07-25 | 1984-07-25 | ヒト単クロ−ン性抗肺ガン細胞抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15422084A JPS6133125A (ja) | 1984-07-25 | 1984-07-25 | ヒト単クロ−ン性抗肺ガン細胞抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6133125A true JPS6133125A (ja) | 1986-02-17 |
| JPH0429357B2 JPH0429357B2 (ja) | 1992-05-18 |
Family
ID=15579468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15422084A Granted JPS6133125A (ja) | 1984-07-25 | 1984-07-25 | ヒト単クロ−ン性抗肺ガン細胞抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6133125A (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57126424A (en) * | 1980-11-07 | 1982-08-06 | Wistar Inst | Production of human monoclonal antibody by human hybridoma |
| JPS58201994A (ja) * | 1982-05-21 | 1983-11-25 | Hideaki Hagiwara | 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法 |
| JPS58216125A (ja) * | 1982-06-09 | 1983-12-15 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ヒト抗体の産生方法 |
-
1984
- 1984-07-25 JP JP15422084A patent/JPS6133125A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57126424A (en) * | 1980-11-07 | 1982-08-06 | Wistar Inst | Production of human monoclonal antibody by human hybridoma |
| JPS58201994A (ja) * | 1982-05-21 | 1983-11-25 | Hideaki Hagiwara | 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法 |
| JPS58216125A (ja) * | 1982-06-09 | 1983-12-15 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ヒト抗体の産生方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0429357B2 (ja) | 1992-05-18 |
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