SU1640158A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7. - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к гибри- домной технологии и вирусологии и может быть использовано дл  повышени  качества выдел емого фермента эукариотической РНК-полимеразы. Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела (Мон AT) к РНК-полимеразе бактериофага Т7. Штамм получают гибридизацией силено- цитов мышей линии BALB/C, иммунизированных очищенным препаратом РНК- полимеразы, бактериофага Т7, с клетками мышиной миеломы линии X 63. АГ 8.653. Клетки культивируют в среде ДМЕМ с эмбриональной сывороткой коров (10%), глютамином (2 ммоль), пируватом натри  (1 ммоль), 2-мер- каптоэтанолом (0,05 ммоль), пенициллином/стрептомицином (1000 ед./мл). Частота пассировани  2-3 раза в неделю , посевна - доза 150 тыс. клеток на 1 мл, кратность посева 5-10 раз. Продуктивность штамма 10 (по ELISA) в культуральной среде и 3 х 10 в асцитической жидкости. Мон AT, секре- тируемые штаммом, специфически взаимодействуют с РНК-полимеразой бактериофага Т7. Штамм депонирован под номером BCKK(II)-3S2 D. Мон AT относ тс  к классу Jg G1. W

Description

о

Јъ

Изобретение относитс  к гибридной биотехнологии и вирусологии и может быть использовано дл  повышени  качества выдел емого фермента эукариотической РНК-полимеразы.

Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела (Мон AT) к РНК-полимеразе бактериофага Т7.

Штамм получают следующим образом.

Восьмйнедельпых мышей линии BALB/C иммунизируют в п тки задних

лап по 35 мкг антигена с полым адью- вантом Фрейнда. Через 4 недели мышей иммунизируют подкожно в несколько мест вдоль спины, шеи и туловища 50 мкг антигена в неполном адыованте Фрейнда. Через 4 недели ввод т 50 мкг антигена внутрибрюшинйо без адь- юванта. Через 10 дней неиммунные мыши линии BALB/C летально облучают (750 рад) на рентгеновской установке, которым через 24 ч после облучени  внутривенно ввод т лимфоциты, полусл

оо

ченные из селезенки иммунной мыши. Одновременно мышам подкалывают по 30 мкг антигена внутрибрюшинно. Четыре дн  спуст  после трансплантации лимфоцитов став т сли ние.

Титр антител, специфичны к ДНК- зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7, составл ет в сыворотке подопытной мыши 1:2000 при определении с помощью твердофазного иммунофер- ментного анализа.

Сли ние спленоцитов с клетками мышиной мнеломы линии Х63.АГ8.653 провод т с помощью ПЭГ фирмы Merk (ФРГ) с мол.массой 4000, Отношение числа клеток миеломы к числу спленоцитов составл ет 1:1. После сли ни  клетки внос т в лунки 96-луночных панелей. За сут до сли ни  в лунки 96-луночных панелей высаживают селезеночные клетки (2 млн кл,/мл по 100 мкл на 1 лунку). Селекцию гибридных клонов провод т на среде ГАТ (Litilefield, I.W., Science, 1964, v. 145, p. 709-710), приготовленной на среде ДМЕМ с добавлением 20% эмбриональной тел чьей сыворотки и 40 мкг/мл антибиотика гентамицина. Клетки культивируют в инкубаторе с 6%-ным содержанием COg в атмосфе ре,Клоны гибридных клеток по вл ютс  через неделю в 60% лунок.

Через 14-17 дней тестируют куль- туральные жидкости из лунок с клонами на присутствие специфических антител методом непр мого твердофазного иммуноферментного анализа.

Клонирование положительных культур провод т методом предельных разведений , внос  0,5 клетки на одну лунку 96-луночного плейта с питающим слоем селезеночных клеток. Клон ИМБ-7Сл отобран как лучший продуцент моноклональных антител и повторно клонирован по той же схеме, что и в первый раз. Один иэ реклонов, характеризующийс  максимальной активностью и образованием асцитных опухолей у 100% привитых мышей BALB/C, назван ИМБ-7С9.

Штамм клеток ИМБ-7С- депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером BCKK(II) № 352Д. .

Штамм характеризуетс  следующими признаками.

Морфологические признаки. Суспензионна  культура, состо ща  из круп

5

0

5

0

5

0

5

0

ных округлых клеток с крупными  драми и тонким ободком цитоплазмы. Ядрышки крупные, по 1-2 в  дре.

Культуральные признаки. Среда дл  культивировани  - среда ДМЕМ с сывороткой эмбриона коровы (10%), сывороткой новорожденных тел т (10%), глютамином (2 ммоль), пируватом натри  (1 ммоль), 2-меркаптоэтанолом (0,05 ммоль), пенцилин/стрептомици- ном (1000 ед/мл). Характер роста - стационарна  суспензи . Метод сн ти  - встр хивание. Частота пассировани  2-3 раза в неделю. Посевна  доза 150 тыс. клеток на 1 мл. Кратность рассева 5-10 раз.

Контаминаци . Бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены.

Культивирование in vivo. Культура прививаетс  и растет в виде асцита в перитонеальной полости мышей BALB/C. За 7 дней введени  клеток мышам-реципиентам ввод т по 0,5 мл пристана. Асцит образуетс  через 10-14 сут после введени  1-5млн клеток .

Продуктивность штамма. Первична  культура моноклональна. Проведено два клонировани . Все клоны позитивны . На прот жении 30 пассажей клона ИМВ-7С интенсивность продукции антител не измен лась (титр антител по ELISA в культуральной среде 10 , а в асцитической жидкости 2x10). Мои AT относ тс  к классу иммуноглобулинов G1.

Консерваци  клеток. Клетки ИМБ-7С заморожены на 36-м пассаже. Общее количество ампул 20, по 4 млн клеток в ампуле. Криозащитна  среда - ростова ,

П р и м е р 1. Кулътивироаание гибридных клеток ИМБ-7С9.

Во флаконы дл  культивировани  клеток внос т гибридные клетки в концентрации 100-200тыс клеток в 1 мл среды ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки коровы, 10% сыворотки новорожденных тел т, 2 ммоль глютамина, 1 ммоль пирувата натри , 0,05 ммоль 2-меркаптоэтанола, 1000 пенициллина/стрептомицина . Клетки инкубируют 2-3 сут в стационарном состо нии при 37РС в атмосфере 6% С0а, Концентраци  клеток, превышающа  1 млн в 1 мл, неблагопри тна дл  роста клеток и вызывает их гибель, Культуральнущ

51

жидкость из флаконов с трехдневной; культурой тестируют на присутствие Мои AT. При посеве клетки встр хивают , разбавл ют ростовой средой до указанной концентрации ч разливают по флаконам.

П р и м е р 2, Культивирование ги ридомных клеток ИМБ-7С.

Клетки, растущие в культуралышх флаконах, через 1-2 сут после пересева центрифугируют 10 мин при 800 об/мин. Клетки должны быть в концентрации , не превышающей 500 тыс/мл т.е.находитьс  в логарифмической фазе роста. Клеточный осадок после ценрифугировани  ресуспендируют в определенном объеме культуральной среды без сыворотки и подсчитывают число жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего. Довод т концентрацию клеток до 1-10 млг/мл и ввод т в брюшную полость мышей BALB/C, предварительно обработанных пристанем. Обработку провод т однократно за 1- 3 недели до введени  гибридомных клеток путем инъекции 0,5 мл приста- на. Через 1-3 недели (зависимости от числа введенных клеток) образуютс  асцктные опухоли у 100% привитых мышей BALB/C, Количество асциткой жидкости, накапливающейс  в брюшной полости мышей после введени  им гибридомных клеток ШБ-7Сд (в среднем по 20 животным), составл ет 5 мл. Содержание Мои AT в 1 мл асцитной жидкости составл ет 10-20 мг.

П р и м е р 3. Использование мо- ноклональных антител ИМБ-7С иммуно- ферментном анализе.

Дл  определени  активности взаимодействи  ИМБ-7С9 с антигенными детерминантами ДНК-зависимой РНК-по

10

15

0

01

5

0

5

0

586

лимеразы бактериофага Т7 примен ют метод непр мого твердофазного анализа . В качестве твердой фазы используют 96-луночные пластины, сенсибилизированные РНК-полимераэой фага Т7 (2,5 мкг/мл белка, по 100 мкл раствора на 1 лунку). Далее в лунки пластин внос т по 100 мкл раствора ас- тической жидкости в необходимом разведении в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 150 мы NaCl, pH 7,4 (ЗФР). Дл  снижени  неспецифического взаимодействи  в ЗФР добавл ют до 0,1% детергена Твин-20 (ЗФР-Т) и до 0,2% бычьего сывороточного альбумина. Пластины инкубируют 1 ч при 37°С и трижды промывают буфером ЗФР, содержащим 0,05% ЗФР-Т. После этого в лунки внос т по 100 мкл коньюгата кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена и инкубируют л ч при 37°С. После шестикратной промывки ЗФР-Т в лунки внос т хромагенный субстрат (0,005М 2,2-азино-ди-(3-этилбензтиа- золик-6-сульфонат) (Нп) и 0,01%-ную s 055 M цитратном буфере (рН 4,0). Оптическую плотность субстратной смеси в лунках регистрируют при 405 нм с помощью восьмиканального фотометра .

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой, специфически обнаруживают ДНК-зависимую РНК-полиме- разу бактериофага Т7.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм гибридных культивируемых кле- .. ток животных Mus musculus L BCKK(ll)- -352 Д,используемый дг  получени  моно- клональных антител к ДНК-зависимой РНК- полимеразе бактериофага Т7.