SU1640156A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7. - Google Patents
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7. Download PDFInfo
- Publication number
- SU1640156A1 SU1640156A1 SU894685569A SU4685569A SU1640156A1 SU 1640156 A1 SU1640156 A1 SU 1640156A1 SU 894685569 A SU894685569 A SU 894685569A SU 4685569 A SU4685569 A SU 4685569A SU 1640156 A1 SU1640156 A1 SU 1640156A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- cells
- strain
- bacteriophage
- monoclonal antibodies
- dna
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к гибри- добной технологии и вирусологии и может быть использовано дл повышени качества выдел емого фермента эукариотической РНК-полимеразы. Целью изобретени вл етс получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела (Мои AT) к РНК-полимеразе бактериофага Т7. Штамм получают гибридизацией сплено- цитов мышей линии BALB/C, иммунизированных очищенным препаратом РНК- полимеразы бактрериофага Т7 с клетками мышиной миеломы линии Х63. АГ8.653. Клетки культивируют в среде ДМЕМ с эмбриональной сывороткой коров (10%), глютамином (2 ммоль), пируватом натри (1 ммоль), 2-меркаптоэтанолом
Description
Изобретение относитс к гибридной технологии и вирусологии и может быть использовано дл повышени качества выдел емого фермента эукариотической РНК-полимеразы.
Целью изобретени вл етс получение штамма гибридома, продуцирующего моноклональные антитела(Мои AT) к РНК-полимеразе бактериофага Т7.
Штамм получают следующим образом.
Восьминедельных мышей линии BALB/C иммунизируют в п тки задних
лап по 35 мкг антигена с полым адь- ювантом Фрейнда. Через 4 нед. мышей иммунизируют подкожно в несколько мест вдоль спины, шеи, туловища 50 мкг антигена в неполном адьюван- те Фрейнда. По истечении 4 нед. ввод т 50 мкг антигена внутрибрюшинно без адьюванта. Через 10 дней неиммунных мышей линии BALB/C летально облучают (750 рад) на рентгеновской установке, а через 24 ч после облучени им внутривенно ввод т лимфоел
05
иты, полученные из селезенки иммунной мыши. Одновременно мышам подкла- ывают по 30 мкг антигена внутрибрю- ганно. Четыре дн спуст после трансплантации лимфоцитов став т сли ние.
Титр антител, специфичных и ДНК - зависимой РНК-полимеразе б актериофа™ а Т7, составл ет в сыворотке под- пытной tMbrniH 1:2000 при определении с помощью твердофазного иммунофер- ентиого анализа.
Сли ние сштеноцитов с клетками ышиной миеломы лгшии Х63.АГ8.653 провод т с помощью ПЭГ фирмы Merk (ФРГ) с мол.массой 4000. Отношение числа клеток миеломы к числу сплено- итов составл ет 1:1. После сли ни летки внос т в лунки 96-луночных панелей . За 1 сут до сли ни в лунки 96-луночных панелей высаживают селезеночные клетки (1 млн.кл/мл, по 1000 мкл на 1 лунку). Селекцию гибридных клонов провод т на среде ГАТ (Litllefield, I.n. Science, 1964, v. 145, p. 709-710), приготовленной на среде ДМЕМ с добавлением 20%-ной эмбриональной тел чьей сыворотки и 40 мкг/мл антибиотика гентамицина. Клетки культивируют в инкубаторе с 6%-чым содержанием COg, в атмосфере. Клоны гибридных клеток по вл ютс через неделю в 60% лунок.
Через 14-17 дней тестируют куль- туральные жидкости из лунок с клонами на присутствие специальных антител методом непр мого твердофазного иммуноферментного анализ а.
Клонирование положительных культур провод т методом предельных разведений , внос 0,5 клетки на одну лунку 96-луночного плэйта с питающим слоем селезеночных клеток. Клон ИМБ-4СЗ отобран как лучший продуцент моноклональных антител повторно клонирован по описанной схеме. Один из реклонов, характеризующийс максимальной активностью и образованием асцитных опухолей у 100% привитых мышей BALB/C, назван ИМБ-4СЗ,
Штамм клеток ИМБ-4СЗ депонирован во 4 ВсеcoraaKoftf.коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(II) $ 850D. - Штамм характеризуетс следующими признаками.
Морфологические признаки. Суспензионна культура, состо ща из круп- иых округлых клеток с крупными драми и тонким ободком цитоплазмы. Ядрышки крупные по 1-2 в дре. .
Культуральные признаки. Среда дл культивировани - среда ДМЕМ, сыворотка эмбриона коровы (10%), сыворотка новорожденных тел т (10%), глютамин (2 ммоль), пируват натри (1 ммоль), 2-меркаптоэтанол
(0,05 ммоль), пенициллин/стрептоци- мин (1000 ед./мл). Характер роста - стационарна суспензи . Метод сн ти - встр хивание. Частота пассировани - 2-3 раза в неделю. Посевна доза
,. 150 тыс. клеток на 1 мл. Кратность рассева 5-10 раз.
Контаминаци .Бактерии, грибы и ми- коплазмы не обнаружены.
Культивирование in vivo. Культура
прививаетс и растет в виде асциты в перитональной полости мышей BALB/C. За 7 дней до введени клеток мышам- реципиентам ввод т по 0,5 мл приста- на. Асцит образуетс через 10-14 сут
5 после введени 1-5 млн,клеток.
Продуктивность штамма. Первична культура моноклональна. Проведено два клонировани . Все клоны позитивны . На прот жении 30 пассажей клона
ЙМБ-4СЗ интенсивность продукции антител не изменилась (титр антител по SLISA в культуральной среде 10 , а в асцитической жидкости 3x1 ОО. Мон AT относитс к классу иммуноглобулинов G1.
Ь Консерваци клеток. Клетки ИМБ-4СЗ заморожены на 36-м пассаже. Общее ко- личество ампул 20, по 4 млн. клеток в ампуле. Криозащитна среда - рос- , това среда с 50-60%хэмбриональной
тел чьей сыворотки и 10% диметилсуль- фоксила. Выживаемость при размораживании 95%.
Приме р 1. Культивирование гибридомных клеток ИМБ-4СЗ.
Во флаконы дл культивировани клеток внос т гибридные клетки в концентрации 100-200 тыс. клеток в.1 мл среды ДМЕМ, содержащей эмбриональную сьгооротку коровы (10%), сыворотку
новорожденных тел т (10%), глютамин (2 ммоль), пируват натри (1 ммоль), 2-меркаптоэтанол (0,05 ммоль), пе- ницилин/стрептомицин 1000 ед. Клетки инкубируют 2-3 сут в стационарном
5 состо нии при 37°С в атмосфере 6% COg. Концентраци клеток, превышающа 1 млн. в 1 мл, неблагопри тна дл роста клеток и вызывает их ги
51
бель. Культуральную жидкость из флаконов с 3-дневной культурой тестируют на присутствие Мон AT. При посеве клетки встр хивают, разбавл ют ростовой средой до указанной концент- рации и разливают по флаконам.
Пример2. Культивирование гиб ридомных клеток ИМБ-4СЗ.
Клетки, растущие в культуральных флаконах, через 1-2 сут после пересева центрифугируют 10 мин при 800 об/мин. Клетки должны быть в концентрации , не превышающей 500 тыс./мл, т.е. находитьс в логарифмической фазе роста. Клеточный остаток после центрифугировани ресуспендируют в определенном объеме культуральной среды без сыворотки и подсчитывают число жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего. Довод т концентрацию клеток до 1-Ю млн/мл и ввод т в брюшную полость мышей BALB/c, предварительно обработанных пристанем. Обработку провод т однократно за 1- 3 недели до введени гибридомных клеток путем инъекции 0,5 мл пристава. Через 1-3 недели (в зависимости от числа введенных клеток) образуютс асцитные опухоли у 100% привитых мышей BALB/C. Количество асцитной жидкости, накапливающейс в брюшной полости мышей после введени им гибридомных клеток ИМБ-4СЗ (в среднем 20 животным), составл ет 5 мл. Содержание Мон AT в 1 мл асцитной жидкости составл ет 10-20 мг.
Приме р 3. Использование моно- клональных антител ИМБ-4СЗ в иммуно- ферментном анализе.
Дл определени активности взаимодействи ИМБ-4СЗ с антигенными детер
10
15
20
01
5
0
5
0
566
минантами ДНК-зависимой РКК-полиме- разы бактериофага Т7 примен ют метод непр мого твердофазного анализа. В качестве твердой фазы используют 96-луночные пластинь., сенсибилизированные РНК-полимеразой фага Т7 (2,5 мкг/мл белка, по 100 мкл (раствора на лунку). Далее в лунки пластин внос т по 100 мкл раствора ас- тической жидкости в необходимом разведении - в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 150 мМ NaCl, pH 7,4 (ЗФР). Дл снижени неспецифического взаимодействи в ЗФР добавл ют до 0,1% детергента Твин-20 и до 0,2% бычьего сывороточного альбумина (ЭФР-АТ). Пластины инкубируют 1 ч при 37°С и трижды промывают буфером ЗФР, содержащим 0,05% детергента Твин-20 (ЗФР-Т). После этого в лунки внос т по 100 мкл коньюгата кроличьих антител против иммуноглобулина мыши с пероксидазой хрена и инкубируют 1 ч при 37°С. После шестикратной промывки ЗФР-Т в лунки внос т хромагенный субстрат 0,005 М 2,2-азиноди-(13-этилбензтиазолин-6- сульфонат) (Н)й и 0,01%-ный HЈ02 в 0,05 М цитратном буфере (.рН 4,0). Оптическую плотность субстратной смеси в лунках регистрируют при 405 нм с помощью восьмиканального фотометра.
Claims (1)
- Формула изобретениШтамм гибридных культивируемых клеток животных mus .tnusculus L, BCKK(lI)-350D, используемый дл получени моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага 17.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU894685569A SU1640156A1 (ru) | 1989-04-25 | 1989-04-25 | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU894685569A SU1640156A1 (ru) | 1989-04-25 | 1989-04-25 | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7. |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1640156A1 true SU1640156A1 (ru) | 1991-04-07 |
Family
ID=21444881
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU894685569A SU1640156A1 (ru) | 1989-04-25 | 1989-04-25 | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7. |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1640156A1 (ru) |
-
1989
- 1989-04-25 SU SU894685569A patent/SU1640156A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Carrol S.B., Stollar B.D. Proc. NatvAcad. Sci,OSA V. 79, 1982, p. 7233-7237. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7070960B2 (en) | Method of increasing product expression through solute stress | |
EP0014519B1 (en) | Cell lines, process for preparing them and process for producing antibodies | |
CN101466828B (zh) | 融合伴侣细胞 | |
SU1640156A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7. | |
SU1640158A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7. | |
SU1640157A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7 | |
RU2265658C2 (ru) | Штамм гибридных клеток животного mus musculus l. 9e2, используемый для получения моноклональных антител к белку e вируса западного нила штамм wnv/leiv-vig99-27889 | |
RU2012594C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l - продуцент моноклональных антител к 146s-компоненту вируса ящура азия-1 | |
McCullough et al. | Hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies against foot-and-mouth disease virus. 1. Cell culturing requirements | |
SU1445184A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS ВСКК (П) N 62 D, используемый дл получени моноклональных антител к МYсовастеRIUм тUвеRсULоSIS | |
SU1416509A1 (ru) | Способ получени моноклональных антител к легким @ -Цеп м иммуноглобулинов человека | |
SU1541254A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к термостабильному О-антигену холерного вибриона серовара Огава | |
RU2116344C1 (ru) | Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus. musculus - продуцент моноклонального антитела к термостабильному поверхностному антигену возбудителя мелиоидоза | |
RU2092554C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. - продуцент моноклональных антител к вирусу болезни ауески штамм унииэв 18 в | |
SU1631072A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к гликопротеидному структурному белку вируса бешенства | |
RU2117043C1 (ru) | Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus musculus - продуцент моноклонального антитела к термостабильному антигену, общему для возбудителей сапа и мелиоидоза | |
SU1402617A1 (ru) | Способ получени моноклональных антител к легким @ -Цеп м иммуноглобулинов человека | |
SU1595902A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к антигену СД38 кортикальных тимоцитов | |
SU1744107A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных мUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител против эритроцитарного антигена V F-системы крупного рогатого скота и родственных ему видов | |
SU1742326A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к МYсовастеRIUм воVIS | |
SU1395668A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS дл получени моноклональных антител к щелочной фосфатазе из кишечника теленка | |
SU1433977A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к пероксидазе хрена | |
SU1604849A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к бактери м рода BRUceLLa | |
SU1446156A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к гемагглютинину вируса гриппа А /Краснодар/ 101/59(Н @ N @ ) | |
SU1751202A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к 146 S-компоненту вируса щура А @ (Алье) |