SU1445184A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS ВСКК (П) N 62 D, используемый дл получени моноклональных антител к МYсовастеRIUм тUвеRсULоSIS - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  диагностики туберкулеза Целью изобретени   вл етс  полз генне штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные -антитела (МКА) к цельным микобактерн м чепопака штамма ,,. получают гнбр; :-- дизацией клеток селезенки, мыгаей BALB/C, иммунизированных авируленэ ным штаммом , с клетками мие- ломы PJ О. Секреци  МКА на 3-4 деш культивировани  составл ет 45 - - 55 мкг/мл культуральной среды и б - 8 мг/мл асцитической жидкости М5СА относ тс  к классу они специ - чески св зы1эаготс  с антигенами цель- ных микобактерий человека Hj7 Чр 1 табл.

Description

ш

йуют ллп получени  гибридн ли в астштной форме у мыгте нведением внутрибр птинно ( клеток NfbmaM, подготовленн брюпинной инъекцией 0,5 мл нового масла за 3-30 дней НИИ ттамма Асцит образует дней.

Пол гченный штамм хранит циализированной коллек1ши ьгых соматических клеток п Института цитологии АН ССС ром 621) и характеризуетс 

Изобретениё .относитс  к биотехно-. логии и мохет быть использовано дл  .диагностики туберкулеза.

Цель изобретени  - получение штамма гибридных куль.тивируемЫх клеток животных MUB mnsculuSj проду ирутоще г го специфические моноклональные ан- |титела (МКЛ) к цельным Mycobacterium tuberculosis а

OiTBMK получают следующим образом,

I-ibimett линии BALB/C иммунизируют авирулентным микобактерий туберкулеза Hj7 f q ° 4 инъекции по 0,2мг

полувлажной массы подкслно в -течение пими признаками. 5 месо Через 48 ч после трёх ежеднев-Культуральные признаки,

ньгх внутрибр  пинных буст-инъекций по 0,2 мг белка сониката (надосадок разрушенных ультраг-луковой обработкой Микобактерий) равном соотнош.ении берут селезеночные кЛет- ки дл  проведени  сли ни . Гибридн-. зацию селезеночных клеток й- клеток мышиной миеломы провод т в соот огаенйн 5:i с помощь 50-% полиэтилен-25 Фере 5% углекислоты. гликол  (мол, к о 3500). .1Слеточнук сме.сь разливают в 96-луночные плзстй- нь: по 210 спленоцитов на лунку,

Дп  культивировани  и селекции гибридов используют среду RPMI-1640 Q с добавлением 107 лошадиной и 10% те20

RPM1-1640 с 10% тел чьей ной сыноротки и 1П% лошади ротки 4.мМ L-глутамин , Пенициллина, 100 мкг/мл ст на, 10 мМ пирувата натри , лотами дл  базальной среды таминами ДПЯ среды Игла, 6 м ркаптоэтанола, при 37 С

л чьей эмбриональной сыворотки 0 М гппоксантина, 4 -lO М аминоптерина и ItS lO M тимидина, Культураль ую жидкость, гибридных клеток провер ют на содержание антител, специфически св зывающихс  с антигеном микобактерий человеческого вида штамма (надосадок разруиенных ультразвуком микобактерий) в твердофазной радиоиммунной реакции. Отобранный иэ 500 I гибридных клонов клон 502 продуцирует в культуральнувд жидкость ан титела, св зьгоающиес  в радиоиммун- ной и ш-1муноферментной ре кци-  х лишь с антигенами , - Клетки этого клона дважды клонируют методом конечных разведений по 2 клетки на лунку, содепжащун) в качества подложки 440 клеток , селезенки После второго клонировани  98% субклонов продуцирумт антител  указанной выше специфичности. Их продукци  сохран етс  в течение 8 пассажей в культуре клеток. Чисть тибридомнь х клеток 5G2 Замораживают в эмбриональной тел чьей сыворотке с добавлением 10% ДМСО в )шдком азоте дл  хранени  . Другую часть нспсхпьДп  выршцивани  штамма пластиковую посуду; посевн 100 тыс, клеток/МП, клетки 1 раз в 3-4 дн , кратность IJlO, Культура суспензионн

Дп  вьфащивани  опухоли ны мьши BALB/C, Свежим мьш 30 дней до инъекции штамма внутрибрюшинно по 0,5 мл в го маспа. Штамм инъецируют

брк пинно по (2-5) Ч О гшет

40

45

50

55

среды Игла, Асцит образует 12-16 дней. Штаммы не пере

Продуктивность татамма, моноклональных антител на культивировани  составл ет 55 мкг в 1 мл культурально и 6-8 мг в 1 МП асцитическ ти при определении методом ни  радиоиммуноадсорб1дии,,

Характеристика полезног та, МКА относ тс  к классу обладают избирательной спе к антигенам Mycobaoteriura sis. Стабильна  секреци  п сохран етс  до 8 пассажей ; Контаминаци . Контамина ри ми, грибами микоплазмой ружена,

Кркоконсервирование, (0 клеток штамма консервируют тел чьей эмбриональной сыв добавлением 10% диметилсул в пластиковых ампулах, Зам

йуют ллп получени  гибридной опухоли в астштной форме у мыгтей BAloR/c нведением внутрибр птинно (2- i) клеток NfbmaM, подготовленным внутри-: брюпинной инъекцией 0,5 мл вазели- , нового масла за 3-30 дней до инъек-| НИИ ттамма Асцит образуетс  через дней.

Пол гченный штамм хранитс  в Специализированной коллек1ши перевивае- ьгых соматических клеток позвоночнь К Института цитологии АН СССР под номером 621) и характеризуетс  следугапими признаками. Культуральные признаки,

Среда

RPM1-1640 с 10% тел чьей эмбриональной сыноротки и 1П% лошадиной сыворотки 4.мМ L-глутамин , 100 мкг/мл Пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина , 10 мМ пирувата натри , аминркис- лотами дл  базальной среды Игла, витаминами ДПЯ среды Игла, 6,05-мМ м ркаптоэтанола, при 37 С и в атмосФере 5% углекислоты.

Дп  выршцивани  штамма используют пластиковую посуду; посевнай доза 100 тыс, клеток/МП, клетки пассируют 1 раз в 3-4 дн , кратность рассева IJlO, Культура суспензионна ,

Дп  вьфащивани  опухоли пригодны мьши BALB/C, Свежим мьшам за 3 - 30 дней до инъекции штамма вводит внутрибрюшинно по 0,5 мл вазелинового маспа. Штамм инъецируют внутри-

брк пинно по (2-5) Ч О гшеток в 1

МП

0

5

0

5

среды Игла, Асцит образуетс  через 12-16 дней. Штаммы не перевивали, .

Продуктивность татамма, Секрег1;и  моноклональных антител на 3-4 день культивировани  составл ет 45 - 55 мкг в 1 мл культуральной средь1| и 6-8 мг в 1 МП асцитической жидкос- ти при определении методом торможени  радиоиммуноадсорб1дии,,

Характеристика полезного продукта , МКА относ тс  к классу IgG, Они обладают избирательной специфичностью к антигенам Mycobaoteriura tuberculosis . Стабильна  секреци  продукта сохран етс  до 8 пассажей in vitro, ; Контаминаци . Контаминаци  бактери ми , грибами микоплазмой не обнаружена , . 6Кркоконсервирование , (0,7 - 1)10 клеток штамма консервируют в 1 мл тел чьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах, Заморато вание

3li

программном  л ;оражинапровод т в теле по с.ледумпей npnrpaNfMe: температуру снижают по А С в I м н до Д С и по I с в 1 мин до -40° . 1Слетки хран т в жидком а оте, Ра моракивание: 6t4CTpo при 37°С. Жизнеспособтюсть после размораживани  по включению трипанового синего 70-80%.

Пример, Гибридомные клетки, хран щиес  в жидком азоте, размораживают быстро при , отмывают средой 199 и высевают в среду дл  куль- тивировАни , котора  : состоит из НРМ1-16ДО с,добавлением 10% тел чьей эмбриональной сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, А мМ L-глютамина, 10 мМ пирувата а, 00 мкг/мл стрептомицина , 100 мкг/мл пeнициллинa., кислот дл  базальной среды Игла, витаминов дл  среды Игла и 0,05 мм мер- каптоэтанола и выраагивают при 37 С в атмосфере 5%-ной углекислоты. Посевна  доза 10 клеток в 1 мл. Через 3-4 дн  концентраци  антител в куль- туральной жидкости достигает 45 - 55 мкг/мл,

.Специфичность взаимодействи  антител с ми кoбaктepи  ш туберкулеза человеческого вида вы вл ют твердофазным иммуноферментнъп-1 ме°тодом. Дл  этого на полистироловую 96-луночнум панель дл  микротитровани  сорбируют убитые гамма-облучением микобак- терии: 100 мкг культуры на  чейку в 200 мкл карбонатно-бикарбонатного буфера (0,02 М, рН 9,6-) при в-течение ночи. После насыщени  панели 10%-ным раствором  ичного бел- ка в фосфатно-солевом буфере (0,02 М рН 7jA) дл  зтеньше га  неспецифш1ес- кого св зывани  антител пластиком в  чейки панели внос т 200 мкл культу- ральной среды штамма 502 на 1 ч,пос- ,ле чего панель трижды отг-1ывают водо

0

5

84

проводной водой, а потом водой с 0,05% твина 20 (процедуру oт fъrвки повтор ют трижды), пиос т конъюгат антител кролика против иммуноглобу-- линов мыши, ковалентно св занных с пероксидазой (1:1600, 37 С, ч) После окончани  инкубации несв завшиес  продукты реакции отмывают указанным способом, а св завшуюс  перок- сидазу (а значит, и антитела против микобактерий туберкулеза) определ  ют количественно по расщеплению субстрата ().

Штаммы микобактерий имеют следующие п бказатели оптической плотности

М. Н

bf. БЦЖ - М, bovinus-8 Клинические культуры (выделенные от больных) п 96 М. aviuTO f. serofulacctnn М. infracellu- larae

М. kansasii М. Smegmatid М. fortttituin

0,95± 0,05

0; П i 0,02

0, 1,37± 0,14

0 0

0 0 0 0

Эти результаты свидетельствзтс.т о том, что полученные MICA спе5Ц фичае- ки взй1П 1Одействук)т с Mycobacterixm tuberculosis, что позвол ет получить, на их основе эффективные дзтагности ческие препараты.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм гибридных кyльтив фye Ы t клеток животных T-fus musculus ВСКК (п) N 62 D иcпoльзye sый дл  получе ни  моноклональных антител к Мусо- oacterivtm tuberculosis.