SU1416509A1 - Способ получени моноклональных антител к легким @ -Цеп м иммуноглобулинов человека - Google Patents

Description

О) ел

Изобретение относитс  к биотехно- логин и может быть использовано дл  диагностики аутоиммунных заболеваний Человека,

Целью изобретени   вл етс  повы- ;шение чистоты целевого продукта.

Дл  осуществлени  способа используют штамм гибридных клеток 1G5G7 или 5B4D6-I.

Штамм IG5G7 получают следующим образом.

Мышей линии BALE /с иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг легких 7i цепей человека, выделенных из мочи (белки Бенс Джонса), в 0,5 м физиологического раствора, забуферен него фосфатами (ЗФР), 5 мм Na-фосфат ный буфер, рН 7,2-7,4, 150 мМ NaCl, без адъюванта. Иммунизацию повтор ют через 40 дней, ввод  внутрибрюшинно 100 мкг легких цепей (препарат LAHT) в ЗФР без адъюванта. Через три дн  после этого 11 О клеток селезенки иммунных гибридизи™ руют с 6-10 клеток миеломы мыши X63 Ag8-653 с помощью 0,4 мл 4,5% ного раствора полиэтиленгликол  (ПЭГ) мол.массы 2000, содержащего 10% диметилсульфоксида, в течение 1 мин. После гибридизации и отмьшки клеток от ПЭГа, клетки высевают в 96 луноч- ные панели по 2-10 клеток в лунку. Дл  культивировани  и селекции гибридов используют среду RP KI-1640 с добавлением 10% лошадиной и 1 ей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксантина, 41 О М аминоптерина 10

тел ч-4

и содержащую 410 клеток селезенки. После двух клонирований практически 100% субклонов-продуцируют антитела к легким -цеп м человека. Наиболее продуктивный штамм вывод т в массовую культуру и обозначают IG5G7.

s

0

на  доза 100 тыс. кл/мл, клетки пас сируют один раз в 3-4 дн , кратность рассева 1:10, культура суспензионна . с Дл  выращивани  асцита пригодны мыши BALB/C. Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма ввод т внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъе.цируют внутрибрюшинно по 2- 0 510 кл/мл среды Игла. Асцит формируетс  через 12-14 дней.

Продуктивность штамма.

Секреци  моноклональнык антител (МА) на 3-4-и день культивировани  составл ет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 5 мг/мл асцитической жидкости при определении методом торможени  радиоиммуноадсорбции. К моменту депонировани  штамм прошел более 20 пассажей in vitro. Продукци  МА сохран етс  как минимум до 20 пассажей in vitro и до 3 пассажей в асцитной форме. I Характеристика полезного продукта.

МА относ тс  к классу IgGI.Oни специфически взаимодействуют с легкими Х-цеп ми иммуноглобулинов человека.

Контаминаци . Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микроплазмой не вы влено при окрашивании красител ми на ДНК и по характеру включени  тими- диновой метки, Криоконсервирование. Дл  длительного хранени  клетки штамма замораживают в эмбриональной тел чьей сьшоротке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживани : 4°С/мин до +4°С, затем 1 С/мин до -40°С. После замораживани  клетки перенос т в жидкий азот. Размораживание провод т на вод ной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток после размораживани  70-80% по окрашиванию три5

0

5

0

Штамм IG5G7 хранитс  в Специализи

рованной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института ЦИТОЛОГИИ- АН СССР под номером ВСКК (njf 75D и характеризуетс  следющими признаками.

Культуральные признаки.

Среда культивировани : среда RPMI 1640 с добавлением 10% тел чьей эмбриональной сьшоротки, 4 мМ глютамина 100 мгк/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 мМ меркаптозта- нола при 37°С в атмосфере 5% углекислоты . Дл  выращивани  штамма используют пластиковую посуду; посев

Пановым синим.

Штамм 5B4D6-I получают следующим образом.

Мьш1ей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг легких А -цепей человека, вьщеленных из мочи -(белки Бенс-Джонса), в 0,5 мл физиологического раствора, за- буференного фосфатами, 5 мМ Na-фосфат- ный буфер, рН 7,2-7,4, 150 мМ NaCl, без адъюванта. Иммунизацию повтор ют через 40 дней, ввод  внутрибрюшинно 100 мкг легких 2 -цепей (препарат ТАИТ) в ЗФР без адъюванта. Через три

- Л

дн  после этого 1.10. клеток селезенки иммунных мышей гибридизируют с 6-10 клеток миеломы мьши X63 Ag8-653 с п6моп;ью 0,4 мл раствора полиэтиленгликол  (ПЭГ) мол.массы 2000, содержащего 10% диметилсульфок- сида, в течение 1 мик. После гибридизации и отмьшки клеток от ПЭГа клетки высевают в 96-луночные панели по к 10 клеток в лунку. .Дл  культивиро- вани  и селекции гибридов используют среду RPMI-1640 с добавлением 10% лошадиной и 10% тел чьей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксантина, , 4-10 М аминоптерина и 1,6-10 М ти

высева  по

щую 4-10 клеток

мидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений,

1 клетке в лунку, содержа

селезенки. После

двух клонирований практически 100% 20 субклонов продуцируют антитела к легким Л -цеп м человека. Наиболее продуктивный клон вьгоод т в массовую культуру и обозначают 5B4D6 -.

Штамм 5B4D6-I хранитс  в Специали- 25 зированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 73D и характеризуетс  следующими признаками., 3Q

Культуральные признаки.

Среда культивировани :.среда RPMI- 1640 с добавлением 10% тел чьей эмбриональной сьгооротки, 4 мМ Ь-глутами на, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5% углекислоты. Дл  выращивани  штамма используют пластиковую посуду, посевна  доза 100 тыс. кл/мл; клетки дО пассируют 1 раз в 3-4 дн , кратность рассева 1:10, культура суспензионна .

Дл  выращивани  асцита пригодны мьш1и BALB/C. Кыгаам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма ввод т внут 45 рибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5 10 кл/мл среды Игла. Асцит формиру- , етс  через 12-14 дней.

Продуктивность штамма.

Секреци  моноклональных антител на 3-4-и день культивировани  составл ет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 5 мг/мл асцитической жидкости при определении методом торможени  радио- иммуноадсорбции. К моменту депонировани  штамм прошел более 20 пассажей in vitro. Продукци  MA сохран етс 

15

16509

как минимум до 20 пассажей in vitro и до 3 пассажей в асцитной форме. Характеристика полезного продукта. с МА относ тс  к классу Ip.GI. Они специфически взашчодейств тот с легкими Л -цеп ми иммуноглобулинов человека . Контаминаци . Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительQ НОМ наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микроплазмой . не вы влено при окрашивании красител ми на ДНК и по характеру включени  тимидиновой метки. Кркоконсервирова5 ние. Дл  длительного хранени  клетки штамма замораживают в эмбриональной тел чьей сьшоротке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживани : 4 С/мин до +4 С, затем 1 С/мин - до -40°С. После замораживани  клетки перенос т в жидкий азот. Размораживание провод т на вод ной бане при Жизнеспособность клеток после размораживани  70-80% по окрашиванию трипановым синим.

I

Пример. Гибридные клетки штаммов 1G5G7 и 5B4D6-I помещают в

rt

пластиковые флаконы площадью 25 см по 5-10 клеток в 5 мл среды RPMI- 1640 с 10% эмбриональной тел чьей сывороткой,4 мМ глютамина,100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина , 0,05 мМ меркаптоэтанола. Клетки культивирут т 2-3 дн  при 37 С в атмосфере 5% COj. Полученные супернатан- ты используют в качестве реагентов в иммунохимических реакци х (как препараты МА) .

На полистирольные 96- чеечные пагс нели дл  микротитровани  сорбируют антиген - 2 мкг на  чейку в 100 мкл ЗФР при 4°С в течение ночи. После насыщени  панелей 0,05%-ным раствором Твин-20 в дл  уменьшени  неспеци фического св зьшани  антител с плас тиком в  чейки внос т по 100 мкл , культуральной среды штамма 1G5G7 и инкубируют 1 ч при 2Q С. После этого .панель отмьгоают три раза по 250 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 и внос т кроличьи антимьшзиные антитела, меченые 1 (препарат с удельной активностью 0,8-10 срм на мкг, 0, на  чейку в 100 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20). После инкубации в течение 1 ч при 20°С панель трижды промывают ЗФР с 0,05%-ным и просчитьтают на счетчике.

1А16509

Результаты исследований представлены в таблице (цифры в таблице при ведены за вычетом фона неспецифичес кой сорбции, определ емой по сорбции меченных антител после инкубацииантиге- на с нормальными иммуноглобулинами мьгаш.

Результаты, представленные в таё лице, свидетельствуют о высокой специфичности полученных МА по отношению 0 с   тем, что, с целью повышени  чиск легким Т( -цеп м иммуноглобулинов человека. Повышение чистоты моноклональных антител достигаетс  тем, что дл  получени  гибридов используют непродуцирутощую иммуноглобулины миеломную линию Х63-Ag8-653,

рмула и

6

3 о

бретени 

Способ получени  моноклональных антител к легким Л -цеп м иммуноглобулинов человека путем выращивани  гибридомы в питательной среде с по следующим выделением и очисткой целевого продукта, отличающий

тоты целевого продукта, в качестве гибридомы используют гатамм гибридных культивируемых клеток животных MuSt musculus ВСКК (П) N 75D или штамм

.... - -1

гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus ВСКК (П) N 73D.

Claims (1)

1. Формула изобретения

   Способ получения моноклональных антител к легким Ά -цепям иммуноглобулинов человека путем выращивания гибридомы в питательной среде с последующим выделением и очисткой целе вого продукта, отличающийс я тем, что, с целью повышения чис тоты целевого продукта, в качестве гибриДомы используют штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus ВСКК (Π) N 75D или штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus ВСКК (Π) N 73D.

   Антигены человека Культуральная среда штамма IG5G7, срм Культуральная среда штамма 5B4D6-I Культуральная среда штамма МРС-П, срм 1 1 2 IgG норм 7500 20000 300 800 IgGI^ БЕЛ 14200 13000 450 1300 IgGT^RCn 15700 18000 350 1250 IgMk БОБ 100 500 300 350 IgM^, Mauch + * НО - - Ig Aik - НО - - Ig A2k НО - - L .д ЛУК 9000 9500 450' 500 ВОЛ 7900 10000 200 500 L_k POD 250 1300 300 500 L_k РОЗ 350 1000 150 300

   Качественные данные получены методом EZISA с применением конъюгата пероксидазы с кроличьими антимышиными антителами