SU1513030A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к липопротеидам низкой плотности плазмы крови человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к области гибридной технологии и может быть использовано в медицине дл  удалени  липопротеидов низкой плотности (ЛНП) из плазмы крови человека. Цель изобретени  - создание штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные мышиные антитела (монАТ) к ЛНП плазмы крови человека, сохран ющие в иммобилизованном состо нии высокую св зывающую активность по отношению к антигену. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 179Д. Продуцирует монАТ, относ щиес  к JGG₁. Продукци  антител сохран етс  в течение 8 пассажей. Секреци  монАТ на 3-4 день культивировани  ин витро 30-50 мкг/мл среды и ин виво 5-10 мкг/мл асцита. 10 мг монАТ, иммобилизованных на агарозном носителе, св зывает 8,43 мг ЛНП. 2 табл.

Description

(21) (22) (46) (71)

1

4363021/28-13

12.01.88

07.10.. № 37

Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) И.Ю.Адамова, Т.Н.Власик, Е,А,Ковалева, С.Н.Покровский, И.Н.Трахт и Е.В.Янушевска 

(53)578.085.23(088.В)

(56) Cole T.G.Schonfeld G. J. Lipid Ressarch. .1983, 24, p.1494-1499.

Patton J.G. Alley M.C. Mao S.I. Unmunology Methods. 1982, 55, p.193- 203.

Koren E, et al. BBA, 1986, 876, p. 101-107.

(54)ИТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS, ИСПОЛЬ- ЗУЕМЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЛИПОПРОТЕИДАМ НИЗКОЙ ПЛОТ- , нести ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА .

(57) Изобретение относитс  к области гибридной технологии и может быть использовано в медицине дл  удалени  липопротеидов низкой плотности (ЛНП)

i из плазмы крови человека. Цель изобретени  - создание штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные мьш1иные антитела (монАТ) к ЛНП плазмы крови человека, сохран ющие в иммобилизованном состо нии высокую св зывающую активность по отношению к антй . гену.Штамм , депонирован под номером ВСКК (П) № 179D. Продуцирует монАТ, относ щиес  к JfgG,. Продукци  антител сохран етс  в течение 8 пассажей,Секреци  монАТ на 3-4 день культивировани  ин витро 30-50 мкг/мл среды и ин виво 5-10 мкг/мл асцита. 10 мг монАТ, иммобилизованных на агарозном носителе, св зывает 8,43 мг ЛНП. 2 табл.

а S

(Л

Изобретение относитс  к гибридной технологии и может быть использовано в медицине дл  удалени  антигена - липопротеидов низкой плотности (ЛНП) из плазмы крови человека при заболевани х , св занных с нарушением липид- ного обмена, дл  вы влени  и определени  ЛНП в плазме крови и биологических жидкост х.

Целью изобретени   вл етс  создание штамма гибридных клеток продуцирующих моноклональные мьш1инные антитела к ЛНП плазмы крови человека, сохран ющие в иммобилизованном состо нии высокую св зывающую активность по отношению к антигену.

Штамм получают следующим образом.

Мьш1ей линии BALB/C имк унизирЗ тот внутрибрюшинно введением белка ЛНП, вьщеленные из плазмы крови человека, в 0,2 мл забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР), содержащего 30% полного адъю- ванта Фрейнда. Через 5-7 дней 510 клеток селезенки иммунных мьш1ей гиб- ридизуют с 510 клеток миеломы мыши X63-Ag8-653 в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 45% (об,/об,/) полиэтиленгликол  (ПЭГ) мол.м. 3350 и 15% диметилсульфоксида, в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГ клетки высевают в

Q1

Сдд

О

00

96-луночные панели по клеток в лунку. Дл  культивировани , и селекции гибридов используют среду RPMI-1640 с добавлением 10% лошадиной и 10% тел чьей эмбриональной сыворотки , 10 М гипоксантина, 4 10 М ами- ноптерина и 1,6-10 М тимидина.Гибриды-продуценты клонируют дна раза методом конечных разведений, высева  по 1 клетке в лунку, содержащую клеток селезенки. После второго клонировани  практически 100% субклонов п родуцирзтат антитела к ЛНП плазмы крови человека. Полученный штамм обозначен как-A-LDL-5F8, депонирован в Банке клеточных культур Института цитологии под номером ВСКК (II) R 179D и характеризуетс  следующими

признаками.

.Стандартные услови  культивировани  - среда RPMI-1640 с добавлением 10% тел чьей эмбриональной сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, 4 мкМ L-глютамина, 10 мкМ пирувата натри , 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл cтpeптo шцинa,аминокислоты дл  ба- запьной среды Игла, витамины дл  среды Игла и 0,05 меркаптоэтанола, при в атмосфере 5%-ной углекислоты. Дл  вьфащивани  используют пласти- ковую посуду.

Посевна  доза 10 клеток в 1 мл. Клетки пассируют один раз в 3-4 дн . Кратность рассева 1:10. Культура по- луприкрепленна . Культивирование в организме животных. Дл  выращивани  гибридомы в асцитной форме клетки ввод т в брюшнзто полость мышей BALB/C, обработанных пристаном, в ко личестве (2-5)-10 клеток на мышь. Опухоли развиваютс  у мьш1ей в течение 12-16 дней. Штамм перевиваем.

Продуктивность щтамма. Секреци  монАТ на 3-4-й день культивирова- ни  составл ет 30-50 мкг/мл культу- ральной среды и 5-10 мг/мл асцити- ческой жидкости.

Характеристика полученного продукта ..

Штамм продуцирует монАТ, относ щиес  к gG классу (). Метод оценки специфичности: тест на св зывание антителами иммобилизованных лиПОПрОТеИДОВ низкой плотности, ИММУ-

ноферментньй метод.

Стабильность продукции. Продукци  антител сохран етс  как минимум в течение 8 пассажей в культуре и при

0 5

0

0

5 0

5

0

С

культивировании в виде асцитной опухоли .

Криоконсервирование. Дл  длительного хранени  гибридные клетки могут быть заморожены в эмбриональной тел чьей сыворотке с добавлением 10% ди- метилсульфоксидэ. Режим замораживани : 4 С/мин до 4°С,затем 1°С/мин до-40°С, затем клетки перенос т в жидкий азот. - Размораживают клетки,перенос  ампулу из жидкого азота в вод ную баню на 37°С..

Контаминаци  бактери ми, грибками и микоплазмой не обнаружена.

Пример 1. Моноклональные антитела вьщел ют из асцитной жидкости ионообменной хроматографией на люлозе. Полученные антитела иммобилизуют на сефарозу, активированную BrCN, в количестве 10 мг AT. на 1 мл гел  сефарозы. 100 мкл полученного таким образом препарата иммобилизованных на носителе антител помещают в пробирку и добавл ют ЛНП, выделенные из плазмы крови нормальных доноров. Смесь инкубируют в течение ночи при 4°С, затем центрифугируют в течение 1 мин при 2000 g. Раствор, содержащий несв завшиес  ЛНП, отбирают, сефарозу с иммобилизованными AT промывают 2 раза 1 мл фосфатного буфера. Затем добавл ют 1 мл глицинового буфера содержащего 0,2 М глицина, 0,15 М NaCl, рН 2,5. По методу Лоури определ ют количество белка ЛНП в растворе.

Результаты опыта по определению количества ЛНП, св зываемых монАТ, иммобилизованными на сефарозе CL-4B,приведены в табл.1.

Результаты примера демонстрируют в 60 раз более высокую по сравнению с известным штаммом ЛНП-св зывающую активность моноклонального антитела, вырабатываемого клетками штамма 5F8.

Приме р 2. Препарат монАТ, иммобилизованный на 3 мл сефарозы, как описано в примере 1, помещают в колонку и пропускают 20 мл человеческой донорской плазмы в течение 1 ч. Определ ют общий холестерин плазмы до и после колонки, использу  набор реактивов дл  определени  холестерина.

В табл. 2 представлены сравнительные данные по эффективности уда- Ленин ЛНП из плазмы крови человека. |

Данные опыта свидетельствуют о вы- cokoй эффективности удалени  холестерина ЛНП из плазмы крови человека мо515130306

ноклональными антителами, вырабаты- ладающиев иммобилизованном состо нии

Баемыми клетками штамма 5F8.в 60 разболее высокой св зывающей

Таким образом, штамм 5F8 имеет

активностью по отношению к антигену.

большое практическое значение и моно- клональные антитела, вырабатываемые этим штаммом, могут быть успешно использованы в практической медицине дл  эффективного удалени  ЛНП из плазмы крови пациента.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Итамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (II) 0 № 179D, используемый дл  получени 

   моноклональных антител к липопротеиПо сравнению с известным предлага- дам низкой плотности плазмы крови че- емый штамм вырабатьшает антитела, об- .ловека.

   (сТаблица

   монАТ

   Штамм 5F8 Известный штамм

   8,43 (матрица - Affi-Gel 10) 0,14 (матрица Sepharose CL-4B)

   активностью по отношению к антигену.

   Формула изобретени 

   Количество белка ЛНП, св зываемое 10 мг монАТ, иммобилизованных на агарЬзном носителе, м

   25

   Таблица 2