SU1514769A1

SU1514769A1 - ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ: КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ΜΙΙ5 МиЗОТ ПК-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОМУ АКТИВАТОРУ ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНО

Info

Publication number: SU1514769A1
Application number: SU874361768A
Authority: SU
Inventors: Andrej V Rudin; Leonid Z Yakubov; Georgij A Kratasyuk; Vladimir V Sinitsyn; Sergej P Domogatskij; Oskar V Rokhlin
Original assignee: Vsesojuznyj Kardiologitsches
Priority date: 1987-12-02
Filing date: 1987-12-02
Publication date: 1989-10-15

Description

ГО ТИПА

(57) Изобретение относится к гибридом-, ной технологии. Цель изобретения получение нового штамма культивируемых

2

клеток, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ) к человеческой проурокиназе, способных ингибировать ее ферментативную активность. Штамм получен путем иммунизации мышей человеческой урокиназой, гибридизацией клеток селезенки с клетками миеломы мыши X 63.Ρ3/Αβ.8.653. Штамм дейонирован под номером ВСКК (II) № 150ϋ.

Штамм продуцирует монАТ-иммуноглобулины мыши класса С. Продукция монАТ сохраняется в течение 40 пассажей. Секреция монАТ на 3-4 день культивирования варьируется в пределах 130 мкг/мл культуральной среды и 1030 мг/мл асцитной жидкости. МонАТ, е иммобилизованные на сефарозе, могут быть использованы для одностадийного выделения проурокиназы из культуральной среды. 2 табл.

Изобретение относится к гибридомной технологии.

Цель изобретение - получение нового штамма культивируемых клеток, продуцирующего моноклональные антитела к человеческой проурокинаэе, способных ингибировать ее ферментативную активность.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии ΒΑΙΒ/С иммунизируют подкожно введением 30 мкг человеческой урокиназы в 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда.Через 10-20 дн после первого введения проводят дополнительные иммунизации аналогичным образом. Четвертую иммунизацию проводят, вводя внутрибрюшинно (в/бр) 50 мкг урокина1514769 А1

зы в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) , содержащем 5 мМ ЫаН.РО. , ’ ,140 мМ ЦаС1, рН 7,4. Через 3 дн после последней иммунизации иммунных мышей забивают, 15х10^Т клеток селезенки гибридизируют с 5x10 клеток миеломы мыши Χ63.Ρ3/Αβ.8.653 в течение 1 мин в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 45 об.% полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.массы 1000 и 15Ζ диметилсульфоксида в ЗФР. После Гибридизации и отмывки клеток средой ДМЕМ от ПЭГ клетки высевают в 96-луночные панели по 1x10^У клеток в лунку.

Для культивирования и селекции

гибридов используют среду ДМЕМ с добавлением 20% эмбриональной телячьей

1514769

сыворотки, 2 мМ ί-глуч амина, 10 мМ

пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фунгизона0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,15% гидрокарбоната

натрия, 100 мкМ гипоксантина,

0,4 мкМ аминоптерина и 1 6 мМ тимидина, в атмосфере 5%-ного углекислого газа при 37°С.

С помощью иммуноферментного метода ю отбирают гибриды по способности продуцировать антитела к проурокиназе. Отобранные гибриды дважды клонируют методом конечных разведений. После повторного клонирования практически 15 100% субклонов продуцируют антитела к проурокинаэе. Продукция этих антител сохраняется, по крайней, мере, до 40 пассажа. Гибридома получила условное название иыС-4. 20

Культуральные признаки. Стандартные условия культивирования. Среда ДМЕМ с бикарбонатом и 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ Ь-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 25

100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фунгиэона,0,05 мМ 2-меркаптоэтанола при 37°С в атмосфере 5%-ного углекислого газа. Для выращивания штамма используют пластиковую посуду. Посевная 30 доза 100 тыс.клеток в 1 мл. Плотность в монослое 10⁶ клеток на 1 мл. Клетки пассируют в дозе 100 тыс. в 1 мл 1 раз в 5 дн или в дозе 200 тыс. в 1 мл и более - 1 раз в 3 дн. Культу- 35 ра суспензионная, в микрообъемах может выращиваться как монослойная, Культивирование в организме животных. Интактным мышам линии ВА1В/С за 10 дн до инъекции штамма вводят по 0,5 мл .40 прйстана в/бр. Штамм инъецируют в/бр. по 1-5x10⁶ клеток в 1 мл среды Игла. Асцит образуется через 8-10 дн. Возможна по крайней мере двухкратная перевивка штамма с сохранением про- 45 дукции антител.

Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на 3-4 дн культивирования зависит от посевной дозы и варьирует в диапазоне 1-30 мкг/мл культуральной среды и 10-30 мг/мл асцитной жидкости.

I

Характеристика полезного продукта штамма. Штамм продуцирует моноклональные антитела - иммуноглобулины мыши класса С. Эти антитела специфически связываются с человеческой проурокиназой. Взаимодействие не сопровождается ингибированием ферментативной активности проурокиназы. В пределах чувствительности использованных методов не обнаружено связывание с человеческими альбумином, фибриногеном и коллагенами I, III, IV, V типов. Показано наличие перекрестной реакции с урокиназой. Присутствие плазмы крови не влияет на взаимодействие моноклональных антител с проурокиназой .

Методы оценки сохранения специфичности .

Иммуноферментный метод (ЕЫ5А) .

В качестве антигена используют иммобилизованные на подложку из полистирола человеческие коллагены I, III, IV, V типов, альбумин, фибриноген, фибронектин, проурокиназу и урокиназу. Степень чистоты исследуемых антигенов, проверяющаяся электрофоретически, составляет более 95%, связывание моноклональных антител с исследуемыми антигенами определяют с помощью антител против иммуноглобулинов мыши.

I

Криоконсервирование. Клетки штамма консервируют по 1х10⁶ клеток/мл коровьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул проводят в коробке из вспененного полистирола с толщиной стенок 1 см. Коробку с ампулами оставляют при -70°С и через 1 сут переносят ампулы в жидкий азот для хранения. Размораживание проводят быстро в водяной бане при 37^вС. Жизнеспособность после размораживания по включению трипанового синего 60%.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды.

Пример 1. Определение связывания антител ϋΝΟ-4 с коллагенами I, ИД, IV и V типов, фибриногеном, альбумином, фибронектином, урокиназой и проурокиназой человека.

На дно ячеек 96-ячеечной полистироловой панели сорбируют белки, с которыми определяют связывание антител. Для этого в ячейки вносят по 50 мкл раствора белка в 200 мМ бикарбонатном буферном растворе, рН 9,0 с концентра цией 10 мкг/мл и оставляют на 16 ч. при 4 С. После пятикратной промывки

1 514 769

6

забуферовным физпологическим раствором (ЗФРТ), содержащим 5 мМ ИаН^РО^,

140 мМ МаС1, 0,057 твина 20, рН 7,4, в ячейки вносят по 50 мк.ч культураль- $ ной среды от штамма υΝΟ-4 или раствора ЗФРТ, содержащих моноклональное антитело в различной концентрации, и инкубируют 30 мин при 37°С. Несвязавшиеся антитела отмывают ЗФРТ 5 раз. 10 В ячейки вносят ковалентно связанные с пероксндазон хрена антитела кролика против иммуноглобулинов мыши в концентрации 2 мкг в 1 мл в 50 мкл раст-. вора ЗФРТ, Через 30 мин инкубации 15

при 37°С несвязавшиеся антитета отмывают указанным способом, а количество оставшейся в ячейках пероксидазы, пропорционально количеству молекул антител υΝΟ-4, определяют по расщепле-20 нию субстрата для пероксидазы (Н^0_г) в присутствии хромогена - ортофенилендиамина. Реакцию останавливаю!’ добавлением 507 серной кислоты до конечной концентрации 57. 25

Положительная реакция проявляется изменением окрашивания от желтого до коричневого и просчитывается на спектрофотометре при длине волны 490 нм. Результаты исследований пред- 30 ставлены в табл. 1. Приведенные в табл. 1 цифры - средние величины из не менее, чем трех зависимых определений, выраженные в единицах оптической плотности при длине волны 35

490 нм. Результаты первого примера свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия антител с проурокиназой в диапазоне исследованных концентраций. 40

Пример 2. Ингибирование фибринолитической активности проурокиназы моноклональными антителами υΝ0-4.

Проурокиназу или урокиназу в концентрации 1 мкг в 1 мл (87 междуна- 45 родных единиц активности (МЕА) в 1 мл для урокиназы и 50 МЕА в 1 мл для проурокиназы) инкубируют в ЗФР, содержащем 50 мг БСА в 1 мл ЗФР,

30 мин при 37°С в присутствии υΝΟ-4 50 или иммуноглобулинов С (1§С) мыши в различной концентрации. После инкубации по 10 мкл исследуемых растворов наносят на фибриновую пластину и выдерживают 16 ч при 37°С. Диаметр 55 зон лизиса на фибриновой пластине пропорционален активности активатора плазминогена. Результаты экспериментов представлены в табл. 2. Приведенные в табл. 2 цифры - средние величины зон лизиса из трех независимых определений, выраженные в миллиметрах

Результаты примера свидетельствуют, что антитела υΝΟ-4 в диапазоне исследованных концентраций ингибируют ферментативную активность проурокиназы, но не влияют на активность урокиназы. Для проурокиназы связывание, а следовательно, ингибирование обратимо, так как при элюции проурокиназы с иммобилизованных МА υΝΟ-4 активность проурокиназы сохраняется.

Пример 3. Использование моноклональных антител υΝΟ-4 для вьщеления проурокиназы из культуральных сред.

Моноклональные антитела 13Ν0-4 иммобилизуют на ΒΓθΝ-активированную сефарозу. Через 200 мкл полученного сорбента пропускают 10 мл культуральной среды от эмбринальных клеток почки человека, культивируемых ϊη νϊϋτο, содержащей проурокиназу в количестве 200 МЕА в 1 мл. Элюцию проводят раствором 0,1 М ацетата натрия с 0,4М хлоридом натрия, рН 2,5, с последующей нейтрализацией элюата трисом до рН 7,0. Амилолитическую активность проскоков и элюатов анализируют с помощью низкомолекулярного субстрата для урокиназы до и после активации проскоков плазмином.^Появление активности только после активации плазмином (т.е. после превращения проурокиназы в урокиназу) свидетельствует об отсутствии в среде урокиназы. В качестве стандарта используют урокиназу из мочи человека (87 000 МЕА/мг).

Из этого примера следует, что моноклональное антитело, иммобилизованное на сефарозу, может быть использовано для одностадийного выделения проурокинаэы из культуральной среды.

Результаты приведенных примеров однозначно свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального антитела υΝΟ-4, вырабатываемого штаммом υΝΟ-4, показывают, что это антитело способно при взаимодействии с проурокиназой ингибировать ее ферментативную активность, но не влиять на ферментативную активность урокиназы, что может быть применено при исследовании механизма действия проурокиназы. мд υΝΟ-4 в иммобилизованном .состоянии пригодны для одностадийного

1514769

№ 150Ώ - продуцент моноклональных

выделения проурокиназы из кондиционированных сред.

Claims

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых

клеток животных Мид тидси!ид ВСКК(П)

антител к человеческому одноцепочеч,ному активатору плазминогена урокина зного типа.

Концентрация антител, мкг/мл

Таблица 1

Определение специфичности связывания монАТ

Антиген

,0 "^Γ“ϊ | 1,25 |0.62 Коллаген I типа 0,020 0,010 о о о 0,010 0,010 Коллаген III ти- па 0,020 0,010 0,010 0,010 0,010 Коллаген IV ти- па 0,020 0,010 0,010 0,010 0,010 Коллаген V типа 0,030 0,020 0,010 0,010 0,010 Фибриноген 0,020 0,010 0,010 0,010 0,010 Фибронектин 0,020 0,010 0,010 0,010 0,010 Альбумин 0,020 0,010 0,010 0,010 0,010 Урокиназа 0,750 0,740 0,710 0,650 0,310 Проурокиназа 0,800 0,780 0,760 0,690 0,380

Таблица 2

Определение ингибиции фибринолитической активности проурокиназы

Концентрация мкг/мл антител, 100 Г⁵» г 25 12,5 6,25 Урокиназа + МА 15 16 16 15 16 Урокиназа + 16 15 16 16 15 Проурокиназа + МА 0 2 2 3 5 Проурокиназа + 12 13 12 12 13

ν