SU1710577A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к инсулину человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и касаетс  получени  моноклональных антител к инсулину человека с помощью нового штамма гибридом. Цель изобретени  -получение штамма гибридомы - продуцента моноклональных антител к новой детерминанте на молекуле инсулина человека. Штамм D4B3 получают гибридизацией иммунных клеток лимфоузлов мыши BALB/c с клетками миеломы Р3-Х63-Ад8.653. Штамм D4B8 хранитс  в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 440 Д. Клетки штамма D4B8 растут на среде RPMJ 1640 или DMEM с 10% эмбриональной тел чьей сыворотки. Концентраци  антител, продуцируемых штаммом D4B8, составл ет в культуральной жидкости 50 мкг/мл, в асцит- ной жидкости 20 мг/мл. Антигенна  детерминанта дл  антител D4B8 включает остаток А4 А-цепи и  вл етс  конформаци- онной.^fcrf^

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и касаетс  получени  моноклональных антител к инсулину человека с помощью нового штамма гибридом.

Цель изобретени  - получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши MUS musculus, используемого дл  получени  моноклональныхантител к новой детерминанте на молекул инсулина человека, 4jo дает возможность разработать двусайтовый иммунометрический способ определени  концентрации инсулина.

Отличие моноклонального антитела, получаемого с помощью предлагаемого штамма, от известных состоит в том, что антигенна  детерминанта, против которой он получен, включает остаток А4 на А-цепи

молекулы инсулина и  вл етс -конформационной . т.е. антитело не св зываетс  с отдельными цеп ми. В литературе не найдено данных о получении антител к антигенной детерминанте, включающей остаток А4 на А-цепи и  вл ющейс  конформациониой.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии ВALB/с иммунизируют инсулином человека (получен от НПО Фермент ) в полном адьюванте Фройнда в подушечки заданных лапок (по 50 мкг на мышь). Чистота инсулина провер лась электрофоретически и составл ет 98%. На 13-й день мышей иммунизируют в подушечки задних лапок тем же количеством инсулина в неполном адъюванте Фройнда. На 16-й день мышей забивают, достают подколенные

лимфоузлы и клетки лимфоузлов сливают с клетками миеломы Р 3. Х63, Ад8.653 с помощью полиэтиленгликол  ПЭГ 2000 (Merck). Соотношение клеток лимфрузлов и клеток миеломы составл ет 5:1. После сли ни  клетки рассеивают в лунки 96- чеечного планшета (Nunc) в количестве 100 тыс. клеток на лунку, в которые предварительно высева1рт перитонеальные макрофаги мыши по 500 клеток на лунку. Селекцию гибридом ведут в среде rAT{RPMJ 1640, содержащий гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Отбор растущих культур клеток, секретирующих антитела нужной специфичности, провод т с помощью радиоиммунологического анализа: в лунки полихлорвинилового планшета, покрытые антителами против иммуноглобулинов мыши, внос т культуральные жидкости растущих культур клеток, инкубируют 2 ч при комнатной темпеоатуре, лунки промывают и инкубируют с 1 меченым инсулином. Лунки нарезают и просчитывают в гамма-счетчике. Гибридому, секретирующую антитела к инсулину, дважды клонировали методом лимитирующих разведений. То есть клетки рассеивают в лунках 96- чеечных планшеток из расчета 1 клетка на лунку в ростовой среде (RP.MJ 1640 с 10% эмбриональной тел чьей сыворотки , 4 мм L-глютамина, 1% пирувата натри , 50 ЕД/мл пенициллина и 2 мкг/мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина). Выросшие клоны тестируют на секрецию антител. Дол  клонов, сохран ющих продукцию антител заданной специфичности, составл ет 100%. Штамм обозначает D4B8. Штамм D4B8 хранитс  в специализирован ной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 440 Д и характеризуетс  следующими признаками.

Культуральные свойства.

Среда дл  культивировани  - RPMJ 1640 или DMEM с 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, 4 мм L-глютамина, 1% пирувата натри ,ВО ЕД/мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОа. Дл  выращивани  штаммов можно использовать стекл нную и пластиковую культуральную посуду. Характер роста стационарна  суспензи .

Частота пассировани  2-3 сут. Кратность рассева 1:3-1:4. При введении мышам BALB/C, предварительно обработанным пристаном, по 1 млн. клеток, асцит образуетс  через 10-15 дней. Стабильна  продукци  наблюдаетс  в течение 7 пассажей на мышах, Титр антител в культуральной жидкости составл ет 1:128 а в асцитической 1:100000. Продуктивность.

Концентраци  антител, продуцируемых

штаммом D4B8, составл ет в культуральной жидкости 50 мкг/мл, в асцитной жидкости 20 мг/мл. Стабильность продуцировани  антител сохран етс  на прот жении 20 пассажей в культуре и 7 мпассажей на живо0 тных, если гибридома перевиваетс . Контаминаци .

Бактерии и грибы в культурах не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение

5 микроплазмой не вы влено при окрашивании красител ми на ДНК и тимидиновом промечивании культуральной среды. Консерваци  клеток. Клетки штаммов замораживают после 2

0 и 3-го клонировани  на 10 и 15 пассгажах в культуре и после роста в виде асцитной опухоли в мышах. Криозащитна среда 50% ростовой среды, 40% эмбриональной тел чьей сыворотки и 10% диметилсульфокси5 да.

Режим замораживани : клетки в криозащитной среде помещают на сутки в холодильник при -70° С, после чего перенос т в жидкий азот. Выживаемость клеток после

0 размораживани  составл ет 50%. Полезный продукт.

Моноклональные антитела IgG 1 класса. Специфичность - инсулин человека, проинсулин человека. Метод оценки сохранени 

5 специфичности: кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши сорбируют на поверхности лунок гибкого планшета, в лунки внос т супернатанты клеток D4B8, затем планшет отмывают и в лунки внос т 125

0 1-инсулин, планшет вновь отмывают, лунки вырезают и просчитывают в гамма-счетчике .

П р и м е р 1. Получение антител D4B8 с помощью штамма гибридом D4B8.

5 Дл  получени  моноклональных антител D4B8 клетки штамма гибридом D4B8 выращивают в пластиковых флаконах на среде дл  культивировани : RPMJ 1640 (или DMEM) с 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 1% пирувата натри , 50 ЕД/мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина. Концентраци  клеток в среде не должна превышать 0,5 мпн./мл. Когда число клеток достигнет 20 млн, клетки ввод т внутрибрюшинно в мышей, которым за 10-14 дней ввели по 0.5 мл пристана. Дл  этого перед введением клеток в мышей культуральную жидкость, содержащую клетки шта1«/ма, центрифугируют 10 мин при 2000д, надосадочную культуральную жидкость удал ют, клетки штамма перевод т в среду без 10% эмбриональной тел чьей сыворотки и вкалывают внутрибрюшиино по 1 млн. клеток на мышь. Через 10-14 дней, когда у мышей вырастет асцит, мышей забивают и с помощью шприца забирают асцитную жидкость. Асцитную жидкость центрифугируют при 20QOg в течение 10 мин, чтобы освободитьс  от клеток, и надосадочную жидкость используют дл  выделени  моноклональных антител.

К асцитно.й жидкости мыши, содержащей моноклональные антитела D4B8, добавл ют равный объем насыщенного сульфата аммони  и центрифугируют при 5000д 10 мин. Осадок раствор ют, тщательно диализуют против 0,5 М фосфатногобуфера рН 7,2 и нанос т на колонку с DEAE-52, целлюлозой, уравновешенную этим же бУ фером. Моноклональные антитела выход т не задержива сь на колонке. Из 1 мл асцитной жидкости получаетс  18,5 мг моноклональных антител D4B8.:

Концентрацию антител в асцитной и культуральной жидкост х штамма D4B8 опг редел ют с помощью иммуноферментного анализа. 100 мкл раствора инсулина в концентрации 10 мкг/мл в 0,2 М боратном буфере внос т в лунки 9б-луночного планшета дл  иммуноферментного анализа и инкyбИjруют 2 ч при комнатной температуре. По окончании инкубации лунки пррмы.вают 3 раза, водопроводной водой. Готов т серию п тикратных разведений исследуемых проб в 0,2 М буферном растворе рН 8,0, содержащем исследуемых проб в 0,2 М буферном растворе рН 8,0, содержащем 0,1% желатины . Анализируемые пробы в объеме 50 мкл внос т с 2-кратным повтором в лунки планшета , покрытого инсулином и контрольным

белком (БСА) и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После инкубации содержимое лунок удал ют, лунки промывают и в каждую внос т по 50 мкл раствора конъюгата кроличьих антител с пероксидазой хрена к иммуноглобулинам мыши, предварительно разведенного буферным раствором в 1000 раз. Планшеты инкубируют еще 2 ч, отмывают и в лунки внос т по 100 мкл субстратного буферного раствора, содержащего о-фенилендиамин (4 мг/мл) и 0,0003% перекись водорода. Планшеты инкубируют 15-20 мин и в лунки внос т по 50 мкл 2.5 М с ерной кислоты дл  остановки реакции. Планшеты сканируют на ридере дл  микропланшетов при длинб волны 492 нм. Концентрацию антител в анализируемых образцах определ ют по калибровочной кривой, которую получают одновременно с проведением теста. Дл  построени  калибровочной кривой процедуру провод т так же, но вместо анализируемых образцов в лунки внос т разведени  стандартных препаратов очищенных антител D4B8 в известной концентрации. Концентраци  антител D4B8 в культуральной жидкости штамма Р4В8 равна 50 мкг/мл, в асцитной жидкости 20 мг/мл.

Таким образом, предлагаемый штамм позвол ет получить моноклональные антитела к инсулину человека, распознающие новую детермийанту на молекуле инсулина, что расшир ет возможности разработки двусайтового способа определени  концентрации инсулина.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L ВСКК (П) 440 D-продуцент моноклональных антител к инсулину человека.