SU1446157A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к мембранному белку ЕSснеRIснIа coLI в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  очистки рекомбинантного интер- лейкина-2 человека. Целью изобретени   вл етс  получение гибридных культивируемых клеток животных MUS musculus, продуцирующих мо- ноклональные антитела (МК) к мембранному белку Е. со11 4 кВ, содержащемус  в препарате части.чно очищенного рекомбинантного интерлейкина-2 (Р1-Ш-2) человека. Штамм получают гибрвдизацией спленоцитов мышей линии Balb/c, иммунизированных РИЛ-2 человека с клетками миеломы ХбЗ- -Ag8-653. Секреци  МКА на 2-3 день культивировани  составл ет 35- 40 мкг/мл культуральной среды и 10- 15 мг/мл асцитической жидкости. МКА относ тс  к классу IgGi. Они специфически взаимодействуют с мембранным белком Е. coli м.м. 4кВ. Содержание примесного белка Е. coli после очистки РИЛ-2 на сорбенте, содержащем полученные МКА, составл ет 15%. 1 табл. Ф

Description

1

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  очистки рекомбинантного интерлей кина-2 (РИЛ-2) человека.

Целью изобретени   вл етс  чени  штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего монокло-нальные антитела (МКА) к мембранному белку Е. coli м,м. 4 кВ, загр зн ющему препараты РИЛ-2.

Штамм получают следующим образом

Мышей линии Bal b/c иммунизируют внутрибрюшинным введением 1500 ЕД РИЛ-2 человека в О,15 мл 0,15 М NaCl в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Иммунизации повтор ют 3 раза через 14 дней тем же количеством антигена в смеси с не- полным адъювантом Фрейнда. За 3 дн  до сли ни  Р1Ш-2 ввод т внутрибрюшин но в 0,5 мл 0,15 М NaCl. Гибридизацию 1-10 клеток селезенки иммунных мышей и З Ю клеток миеломы мыши X63-Ag8-653 .провод т 50%-ным раствором полиэтиленгликол  мол.массы 4000, содержащего 5% диметилсульфок- сида, в течение 1,5 мин. После гибридизации и отмывки от полиэтилен- гликол  клетки высевают в 96-луноч- ные панели по 1-10 спленоцитов в лупку. Дл  культивировани  и селекции гибридом используют среду 1МДМ (модифицированна  Iskove s среда Дульбекко) с добавлением 10% эмбри- овальной тел чьей сыворотки (ЭТО), гипоксантииа, 4-10 М аминоп- терипа и 1,6-10 М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высева  по 1 клетке в лунку, содержащую 4-10 клеток селезенки. После 2 клонирований практически 100% субклонов проду цируют МКЛ к антигену Е. coli.

Полученньй штамм обозначают 29БК25 он хранитс  в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных под номер ВСКК (П) 110 D и характеризуетс  слдующими признаками.

Культуральные признаки. Среда культивировани  - среда 1МДМ с 10% донорской тел чьей сыворотки, 2 мМ L-гЛютамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтапола, при 37 С и в атмосфере 5% COj..

«

t Q 5 Q

0

5

0

572

Дл  выращивани  штамма используют стекл нную посуду; посевна  доза 200 тыс. клеток на мл, клетки пассируют один раз в 2-3 дн , кратность рассева 1:6-1:8.

Культура суспензионна .

Культивирование в организме животных . -Дл  выращивани  асцита пригодны мыши Balb/c, -Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма ввод т внутри- брюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5-10 клеток в 1 мл среды 1МДМ. Асцит форми- мируетс  через 12-14 дней.

Продуктивность штамма. Секреци  моноклональных антител на 2-3 день культивировани  cocfaвл eт 35-40 мкг в 1 мл культуральной среды и 10-15 мг в 1 МП асцитной. жидкости при определении иммуноферментным методом.

Характеристика полезного продукта. Штамм -продуцирует моноклональные антитела изотипа IgGl. Специфичность - мембранный пептид Е. coli с мол.массой 4000, содержащийс  в препарате РИЛ-2 человека. Методы оценки сохранени  специфичности: тест на св зыва- ние МКА с иммобилизованным частично очищенным РИЛ-2 (иммуноферментньй анализ). Продукци  МКА сохран етс  как минимум до 10 пассажей in vitro . В асцитной форме штамм не пассируетс  более одного раза.

Контаминаци . Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не вы влено по характеру включени  ти- мидиновой метки.

Криоконсервирование. Дл  длительного хранени  клетки штамма замораживают в эмбриональной тел чьей сыворотке с добавлением 10% диметил- сульфоксида. Режим замораживани : Ис в 1 мин до -70°С. После замораживани  клетки перенос т в жидкий . азот. Размораксивание - на вод ной бане при +37°С. Жизнеспособность клеток после размораживани  40-50% по окрашив анию трипановым синим.

Пример I. Гибридомные клетки помещают в стекл нный флакон объемом 50 МП п о 1-10 клеток S 5 мл среды с 10% ЭТС, 2 мМ L-глютами- на, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина , 0,05 мМ меркаптоэтанола (МЭ). Клетки культивируют 2-3 дн  при З7 с в атмосфере 5% СО. Полученныи супернатант используют в ка- честре реагента в-иммунохимических реакци х (как препарат МКА),

Антигеиы высушивают в лунках 96- чеечных микроплат при 37°С или 20 с в следующих количествах: частично очищенный РИ.П-2 - 150 нг в 20 мкл бидистиллированной воды; мембранна  фракци , растворимые белки Е. со11 и бычий сывороточньй альбумин (БСА) по 1 мкг в 20 мкл бидистиллированной воды. После отмывок в  чейки внос т по 50 мкл культуральной среды штамма 29Б1.2, Панель инкубируют 2 ч при 20°С, затем отмывают 5 раз биистиллированной водой и внос т по 50 мкл/лунку кроличьи противомьшиные антитела, меченые пероксидазой, раз- веденной 1/2500 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4,.О,15 М NaCL, 1% БСА (ЗФР-БСА). После инкубации в течение 1 ч при 20 С плату отмывают и в лунки добавл ют субстрат - ортофенилен- иамин гидрохлорид (0,6 мг/мл) в итратно-фосфатном буфере рН 4,7, содержащем 0,03% . Реакцию останавливают через 10 мин I М серной кислотой и учитывают на спектрофотоетре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты исследований представены в таблице.

2083 420

1141 218

Результаты, представленные в таблице , свидетельствуют о высокой специфичности полученнь х МКА к мембранному белку Е. coli.

П р и М е р 2. Электрофорез в 15% -ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натри  (ДСН-ПЛАГЭ) провод т с использованием аппарату дл  вертикального элект- рофореза. РИЛ-2 в количестве 10 мкг в буфере дл  образца, содержащем или не содержащем МЭ (редуцирующие

0

5

0

5

и нередуцируюгцие услови ), и эквивалентное количество лизата Е. cell в буфере дл  образца с МЭ прогревают 2 мин при 100 С и нанос т в  чейки гел . Электрофорез осуществл ют при посто нной силе тока 30 мА,

Электроперенос разделенных компонентов из гел  на нитроцеллюлозу (НЦ) с диаметром пор 0,45 мкм провод т в течение 1 ч. После переноса ПЦ промывают дистиллированной водой и далее обрабатывают с помощью набора дл  иммуноблотинга. Неспецифическую сорбцию белка на НЦ блокируют в 0,02 М трис-НС буфере рН 7,4 с 0,5 М NaCl (ТБР), содержащем 3% желатины . После этого НЦ промывают 2 раза ТБР с 0,05% твин-20 (ТТБР) и разрезают на полоски. Полоски, соответствующие ДСН-ПААГЭ РИЛ-2 в редуцирующих и нередуцирующих услови х и лизата Е. coli, помещают в стекл нные пробирки емкостью 15 мл и добавл ют 10 мл супернатанта MICA. 29Б1.2.

Инкубацию с МКА продолжают 2 ч при 20 С на аппарате с горизонтальным перемещиванием. После этого НЦ отмывают 3 раза по 5 мин ТТБР, добав л ют козьи антимышиные антитела, разведенные 1/2000 в ТТБР, 1% БСА и инкубируют 1 ч при 20 с с перемешиванием . После 2 отмывок ТТБР и одной-г отмывки ТБР реакцию про вл ют в растворе субстрата, содержащем 4-хлор- -I-нафтол и 0,015% 112.0: в течение 20 мин. Дл  хранени  и фотогрйфирова- НЦ промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе.

Результаты исследований свидетельствуют о взаимодействии полученных антител с мембранным белком Е. coli м.м 4кВ, содержащимс  в препарате с частично очищенного РИЛ-2 человека. Электрофоторетическа  подвижность белка Е. coli при ДСН-ПААГЭ одинакова в редуцирующих и нередуцирумцих услови х. Полученные МКА используют дл  очистки РИЛ-2 человека. Содержание примесного белка Е. coli после очистки РИЛ-2 на сорбенте, содержащем полученные МКА, составл ет 15%.

0

0

5

0

55

Claims (1)

1. Формула изобретени

   Штамм гибридных культивируемых клеток животных Ми§ musculus ВСКК (П)М110 D, используемый дл  получе514461576

   ПИЯ моноклональных антител к мембран- парате рекомбинаитного интерлейки- ному белку Escherichia coli в пре-на-2 человека.