SU1567624A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к @ -интерферону человека - Google Patents
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к @ -интерферону человека Download PDFInfo
- Publication number
- SU1567624A1 SU1567624A1 SU884478667A SU4478667A SU1567624A1 SU 1567624 A1 SU1567624 A1 SU 1567624A1 SU 884478667 A SU884478667 A SU 884478667A SU 4478667 A SU4478667 A SU 4478667A SU 1567624 A1 SU1567624 A1 SU 1567624A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- interferon
- strain
- mon
- cells
- medium
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано дл определени содержани γ-интерферона в биологических жидкост х и в культуральной среде. Цель изобретени - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего моноклональные антитела (Мон АТ), специфичные к γ-интерферону человека. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей линии BALB/C, иммунизированных рекомбинантным γ-интерфероном человека с клетками миеломы SP 2/O . AG 14. Клетки штамма ВСКК(П) N 158Д культивируют в среде RPMI 1640 с добавлением некоторых аминокислот, а также 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 10% сыворотки плода коровы при 37°С в атмосфере 5% CO2. Клетки пассируют 2 - 3 раза в неделю, кратность рассева 1:2. Штамм продуцирует Мон АТ, относ щиес к классу JGG. Секреци Мон АТ на 3 - 4 день культивировани составл ет 3 - 10 мкг/мл среды и 3 - 5 мг/мл асцитической жидкости. Мон АТ специфически взаимодействуют с γ-интерфероном человека, а также с рекомбинантным γ-интерфероном. Мон АТ узнают эпитоп, локализованный в C-концевом участке молекулы рекомбинантного γ-интерферона.
Description
Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано дл определени содержани J-интерферона человека в биологических жидкост х и в культуральной среде.
Цель изобретени - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего моноклональные антитела, специфичные к X-интерферону человека.
Штамм получают следующим образом.
Клетки мышинной миеломы Sp 2/0-Ag Ц гибридизуют с клетками селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной рекомбинатным У-интерфероном человека по схеме, обеспечивающей максимальный иммунный ответ дн слабых антигенов. Предварительно подбирают оптимальные услови дл сли ни спле- ноцитов с клетками миеломы, что обеспечивает высокую степень гибридизации клеток. В результпге сепекции полу10
ченных гибридных клеток на среде ГАТ, скрининга гибридом по признаку продукции антител к Ј-интерферону и последующего клонировани отбирают штамм (авторское наименование У -89), стабильно продуцирующий мон AT к интерферону.
Штамм ВСКК(П)-158Д хранитс в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР. К моменту депонировани штамм прошел 12 пассажей.
Культуральные признаки.
Стандартные услови культивирова- 15 ни - среда RPMI с добавлением следующих аминокислот, мг на 1 л среды: L-аланин 8,9; L-аспарагин 15,0; L-аспарагинова кислота 13,0; глицин 7,5; L-глютаминова кислота 20 И,7; L-пролин 11,5; L-серин 10,5, а также 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 10% сыворотки плода коровы.
Клетки культивируют в пластиковой или стекл нной посуде в закрытой сие- 25 теме или в атмосфере 50%-ной С0а при 37°С. При росте на указанной среде штамм образует округлые клетки. Врем удвоени попул ции ч. Клетки пассируют 2-3 раза в неделю. Крат- зо ность рассева 1:2.
Культивирование в организме животных .
Прививка гибридных культивируемых клеток штамма 158Д сингенным мышам линии BALB/c вызывает у них образование асцитной опухоли. В асцитной жидкости содержатс мон AT к Я-интерферону . Способность к продукции мон AT стабильно сохран етс на про- 40 т жении по крайней мере 12 пассажей в культуре и 2 пассажей при перевивках на животных (срок наблюдени ), а также при переводе асцитных клеток
интерферону 3-5 мг/мл (в среднем I мг/мл) .
получени больших количеств мон AT целесообразно использовать культивирование штамма in vivo с последующим извлечением мон АН из асци- тической жидкости.
Криоконсервирование.
Криоконсервацию провод т в смеси равных объемов в кондиционированной ростовой среды и 20%-ного диметил- сульфоксида на ростовой среде при концентрации 0,5106 кл. в 1 мл. Ре35
жим замораживани : 1 град в 1 мин от (-20 до минус 60°С, 10 град в 1 мин от минус 60 до синус 100°С, 50 град в 1 мин от минус 100 до минус 150°С. Клетки хран т в жидком азоте. Отогревают при 0°С в течение 1-2 мин, далее разбавл ют 10-кратным объемом среды, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и высевают в ростовую среду. Жизнеспособность клеток штамма 158Ц после размораживани , определенна по включению трипанового синего, составл ет 60-70%. I
Контаминаци .
Бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Микроплазма не вы влена по включению тимидиновой метки.
Пример. Кажда мышь линии BALB/c предварительно получают внут- рибрюшинно по 0,5 мл пристана. Через 8-10 дней подготовленным таким образом животным внутрибрюшинно ввод т гибридные клетки, полученные из асци- тической жидкости мышей - носителей опухоли. Дл этого из брюшной полости мыши извлекают 5,5 мл асцитичес- кой жидкости, которую стерильно центрифугируют 7 мин при 1000 об/мин на центрифуге К-23 (ГДР). Осадок клеток
на обычную ростовую среду. Штамм про- д5 отмыва10т стерильным фосфатным буферным раствором (0,02 М фосфатный буфер с 0,Й М NaCl, pH 7,2) и повторно центрифугируют в том же режиме. Осадок ресуспендируют в 1,5 мл фосфатного буфера и провод т подсчет клеток в камере Гор ева. Каждой из трех вз дуцирует мон AT относ щиес к классу . Ig G.
Продуктивность штамма.
При стандартных услови х культивировани штамм продуцирует мон АН в количестве 3-Ю мкг/мл среды в зависимости от условий культивировани . Решающее значение имеет качество эмбриональной тел чьей сыворотки.
При культивировании штамма 1 58Д in vivo от одной мыши можно получить 3-7 мл асцитической жидкости (в среднем 5 мл) с содержанием мон AT к У 50
55
тых в опыт мышей ввод т 2,510 клеток в объеме 0,5 мл. Спуст 12 дней мышей забивают и из брюшной полости извлекают асцитическую жидкость. Всего от трех мышей получают 16,6 мл асцитической жидкости (3,5+6,3+6,8). Клетки из асцитической жидкости отдел ют центрифугированием и исполь10
интерферону 3-5 мг/мл (в среднем I мг/мл) .
получени больших количеств мон AT целесообразно использовать культивирование штамма in vivo с последующим извлечением мон АН из асци- тической жидкости.
Криоконсервирование.
Криоконсервацию провод т в смеси равных объемов в кондиционированной ростовой среды и 20%-ного диметил- сульфоксида на ростовой среде при концентрации 0,5106 кл. в 1 мл. Ре5 0
5 о
0
5
жим замораживани : 1 град в 1 мин от (-20 до минус 60°С, 10 град в 1 мин от минус 60 до синус 100°С, 50 град в 1 мин от минус 100 до минус 150°С. Клетки хран т в жидком азоте. Отогревают при 0°С в течение 1-2 мин, далее разбавл ют 10-кратным объемом среды, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и высевают в ростовую среду. Жизнеспособность клеток штамма 158Ц после размораживани , определенна по включению трипанового синего, составл ет 60-70%. I
Контаминаци .
Бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Микроплазма не вы влена по включению тимидиновой метки.
Пример. Кажда мышь линии BALB/c предварительно получают внут- рибрюшинно по 0,5 мл пристана. Через 8-10 дней подготовленным таким образом животным внутрибрюшинно ввод т гибридные клетки, полученные из асци- тической жидкости мышей - носителей опухоли. Дл этого из брюшной полости мыши извлекают 5,5 мл асцитичес- кой жидкости, которую стерильно центрифугируют 7 мин при 1000 об/мин на центрифуге К-23 (ГДР). Осадок клеток
тых в опыт мышей ввод т 2,510 клеток в объеме 0,5 мл. Спуст 12 дней мышей забивают и из брюшной полости извлекают асцитическую жидкость. Всего от трех мышей получают 16,6 мл асцитической жидкости (3,5+6,3+6,8). Клетки из асцитической жидкости отдел ют центрифугированием и исполь1
зуют дл дальнейших перевивок гибри- домы, а из надосадочной жидкости извлекают мон AT.
С помощью стандартного твердофазного иммуноферментного метода устанавливают , что полученна асцитичес- ка жидкость содержит мон ДТ к J- интерферону. К препарату У -интерферона , сорбированному и лунках платы дл иммунологических исследований, добавл ют разведенную асцитическую жидкость. После инкубации и соответствующих ОТМЫВОК В ЛуНКИ ДобиВЛЯЮТ кснъюгированные с пероисицазой хрена кроличьи антитела против мышиных иммуноглобулинов . По окончании ферментативной реакции расщеплени в присутствии диаминобензидина развивающуюс окраску регистрируют на спектрофотометре Мультискан при длине волны 50 нм. Св зывание мон AT с интерфероном обнаруживают при разведении асцитической жидкости до .
Цл получени мон AT из асцитической жидкости иммуноглобулины осаждают сульфатом аммони до 50%-ного сыщени . Осадок отдел ют центрифугированием , раствос ют в 20 мМ фосфатном буфере с 0,1 М NaCl и обессоливают на колонке PR10. Белковый раствор нанос т на колонку моно QHR 5/5, вл ющуюс частью системы быстрой жидкостной хроматографии. За один проход из раствора иммуноглобулинов, соответствующего 0,5 мл асцитической жидкости, элюируют 2 мг мон AT. Таким образом, при культивировании гиб- ридомы штамма 158/1 а виде асцит ной формы опухоли выход мон AT составл ет около 22 мг/мышь.
Характеристика мон AT продуцируемых штаммом гибридомы 158Д.
Мон AT, секретируемые в асцитическую жидкость клетками штамма 158Д, св зываютс как с нативным jt -интер676 6
фероном человека, полученным из донорское крови, так и с рекомбинэнт- ным у-интерфероном, полученным от бактериальных продуцентов. Св зывание мон AT с указанными препаратами Х-интерферона установлено в тесте твердофазного иммуноферментного анализа , а также методом иммуноблотинга.
По данным электрофореза в полиак- риламидном геле мон AT, продуцируемые клетками штамма 158/1, относ тс к классу IgH.
Характерной особенностью мон AT, j - продуцируемых гибридомой 158/1, вл етс то, что эти мон AT узнают эпи10
топ, локализованный в С-концевом участке молекулы рекомбинантного - интерферона.
Друга особенность мон AT, проду- ДУЦИруемых клетками гибридомы штамма 158Ц, состоит в том, что эти антитела , будучи в иммобилизованном состо нии , сохран ют способность св зывать
Y-интерферон. Поскольку они отличаютс от мон AT штамма 1591 по участку св зывани на молекуле у-интерферона , то это означает, что мон AT от штамма 158Д можно использовать вместе с мон AT от штамма 159П в тест- наборе дл количественного определени У-интерферона в биологических жидкост х и культуральной среде. При этом мон AT, продуцируемые штаммом 158ц, при использовании в иммуно- ферментном или радиоиммунном методах должны сорбироватьс на твердой фазе в качестве первых антител.
40
ф о о м у л а изобретени
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П)- 158Д, используемый дл получени моноклональных антител к у-интерферону человека.
Claims (1)
- 4θ Формула изобретенияШтамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П)15бД, используемый для получения мо45 ноклональных антител к у-интерферону человека.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU884478667A SU1567624A1 (ru) | 1988-07-06 | 1988-07-06 | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к @ -интерферону человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU884478667A SU1567624A1 (ru) | 1988-07-06 | 1988-07-06 | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к @ -интерферону человека |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1567624A1 true SU1567624A1 (ru) | 1990-05-30 |
Family
ID=21397546
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU884478667A SU1567624A1 (ru) | 1988-07-06 | 1988-07-06 | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к @ -интерферону человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1567624A1 (ru) |
-
1988
- 1988-07-06 SU SU884478667A patent/SU1567624A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Van der Meide, Р.Н. et al. J. Immun. Meth., 1985, 79, p.293-305. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPS60500864A (ja) | 近縁関係にあるが別個のタンパク質間に存在する共通決定基に対して特異的なハイブリド−マ抗体の製造および特性づけ | |
Orlik et al. | Modifications of hybridoma technology which improve the yield of monoclonal antibody producing cells | |
SU1567624A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к @ -интерферону человека | |
SU1571063A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к @ -интерферону человека | |
Hokama et al. | Cross‐reactivity of ciguatoxin, okadaic acid, and polyethers with monoclonal antibodies | |
SU1445183A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к МYсовастеRIUм воVIS (BCG) | |
SU1446154A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к мембранному белку ЕSснеRIснIа coLI в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека | |
SU1742326A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к МYсовастеRIUм воVIS | |
SU1666532A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к нуклеокапсидному белку коронавируса крупного рогатого скота | |
RU2319743C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к гипогликозилированным и дегликозилированным изоформам опухоль-ассоциированного антигена muc i человека | |
SU1527260A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к @ - тимозину | |
SU1446157A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к мембранному белку ЕSснеRIснIа coLI в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека | |
RU2265658C2 (ru) | Штамм гибридных клеток животного mus musculus l. 9e2, используемый для получения моноклональных антител к белку e вируса западного нила штамм wnv/leiv-vig99-27889 | |
SU1381158A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к урокиназе человека | |
RU2125093C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного человеческого эритропоэтина, штамм культивируемых клеток яичника китайского хомяка - продуцент эритропоэтина | |
SU1472497A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к липополисахариду ЕSснеRIснIа coLI | |
SU1564184A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных мUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к гормону роста крупного рогатого скота | |
SU1514768A1 (ru) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ клеток животных ми5 миБсиьи5-продуцент моноклонального антитела к ре2 КОМБИНАНТНОМУ ФАКТОРУ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-БЕТА ЧЕ | |
SU1413132A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных мUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к митохондриальной креатинфосфокиназе человека | |
SU1384614A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши мUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к урокиназе человека | |
SU1445184A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS ВСКК (П) N 62 D, используемый дл получени моноклональных антител к МYсовастеRIUм тUвеRсULоSIS | |
SU1437393A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к рекомбинантному интерлейкину-2 человека | |
SU1416509A1 (ru) | Способ получени моноклональных антител к легким @ -Цеп м иммуноглобулинов человека | |
SU1645296A1 (ru) | Штамм культивируемых гибридных клеток животных МUSмUSсULUS L - продуцент моноклональных антител против фактора Н @ эритроцитов крупного рогатого скота | |
SU1604849A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к бактери м рода BRUceLLa |