SU1445183A1

SU1445183A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к МYсовастеRIUм воVIS (BCG)

Info

Publication number: SU1445183A1
Application number: SU874236683A
Authority: SU
Inventors: М.В. Андросова; И.Н. Трахт; М.А. Владимирский; Л.М. Ходун; Л.А. Ильиных; Л.В. Погуляева
Original assignee: Московский научно-исследовательский институт туберкулеза; Институт Экспериментальной Кардиологии Всесоюзного Кардиологического Научного Центра Амн Ссср; Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Бруцеллеза И Туберкулеза Животных
Priority date: 1987-04-28
Filing date: 1987-04-28
Publication date: 1990-09-30

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии н может быть использовано , дл диагностики туберкулеза. Целью, изобретени вл етс получение штамме гибридных культивируемых клеток животных MUS mosculus, продуцирукщёго моноклональные антитела (МКА), специфически взаимодействующие с микробактери ми вакционного штамма БЦЖ. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей лииии BALB/c, иммунизированных авирулентным штаммом с клетками миеломы Pj 01, Через 3-4 дн культивировани концентраци МКА в культуральной жидкости составл ет 40-50 мкг/мл, в асцнти- ческой - J-8 мг/мл. МКА относ тс к классу IgG, они специфически взаимодействуют с микробактери ми бычьего вида БЦЖ (и слабее с Bovinue 8), 1 табл.

Description

Изобретение относитс к биотехнй- огин и может быть использовано дл иагностики туберкулеза.

Целью изобретени вл етс получе. - ие штамма гибридных культивируемьгх леток животньк Mus musculus, продуцирующего ,моноклональньге антитела МКА)5 специфически взаимодействуюие с микробактери ми вакцинного штам- д ма БЦЖ. . Штамм получают. следу5ощим образом.

Мьппей линии BALB/c иммунизируют аЙ1фулентным ютаь1мом микобактерий туберкулеза Н„Наг А инъекции по 15 0,2 мг. полувлажной массы .подкожно в течение 5 мес. Через А8 ч после трех еж едневнызс внутрибрюшйнных буст инъекций по 0,2 мг белка сониката (надосадок разрушенных ультразвуко- 20 вой обработкой микробактерий) и БЦЖ в равном соотношении берут селезеночные клетки дл проведени гибридизации . Сли ние селезеночных клё- ток и клеток, мышиной миеЛомы Р.01 25. провод т в соотногаейии 5:1 с помощью 50%- полиэтиленгликол (мол,м.3500). Клеточную смесь разливают в 96-лу ночные пластины по 2-10 спленоци- тов на лунку. Дл культивировани и ;зО селекции гибридов используют йреду с добавлением 10% лошадиной сыворотки 10% тел чьей эмбрио- .нальной сыворотки, 10 М гипоксанти- иа,- 4 ) гипоксантина, , аминоптерина и 1, тимидина, К.ультуральную жидкость гибридных клеток провер ют на содержание антител, специфически св зьшающихс с антигеном микобактерий человеческого ви- до да Н„Ку и бычьего вида - БЦЖ (надосадок разрушенных ультразвуком мшсоб актерий) в твердофазной радиоиммунной реакции.

Отобранный из 500 гибридных клонов 45 клон 2А5 продуцирует в культуральную среду антитела, св зывающиес в ра- диоимунной и иммуноферментной реакци х с антигенами микобактерий бычье- го вида (штамма БЦЖ и в меньшей сте- CQ пени музейного штамма Bovinus-S), Антигены микобактерий различных видов и шт.аммов получают путем ультра - звэтсового разрушени .бактериальных клеток с последующим их 11ентрифуги . е рованием npVi 5000 g и используют пернатант в качестве антигена (сони- кат), Кпетки клона 2Л5 дважды клонируют методом предельных разведений

по 2 клетки в лунку, содержащую в качестве подложки клеток селезенки , После второго клонировани число позитивных клонов 99%. Продукци антител сохран етс в течение 8 пассажей в культуре клеток. Часть гибридомных клеток 2АЗ замораживают в змбриональной тел чьей сыворотке с добавлением I0% ДМСО в жидком азоте дл хранени . Другую часть используют дл получени гибридной опухоли в асцитной форме у мышей BALB/c введением внутрибрюшинно 10 клеток мышам , подготовленным внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл вазелинового масла за 3-30 дней до. инъекции клеток. Асцит образуетс через JO-16 дней. Из асцитической жидкости выдел ют иммуноглобулины с помощью сульфата аммони . Штамм 2А5 хранитс в Специа- лизироваиной коллекции перевиваемьгх соматических клеток позвоночнйх Института цитологии АН СССР по номером 60D и характеризуетс следующими признаками,

Хультуральные признаки.

Среда RPMI-J640 с 10% тел чьей эмриональной сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глутамина, ЮО мкг/ пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина , 10 пирувата натри , аминокислотами дл базальной среды , витаминами дл среды Игла, 0,05 мМ меркаптоэтанола, при 37 С в атмосфере 5%-ной углекислоты.

Дл выращивани штамма используют пластиковую посуду. Посевна доза 100 тыс,клеток/мл. Клетки пассируют 1 раз в 3-4 дн , кратность рассева 1:10, Культура суспензионна .

Культивирование в организме живот . ных,

Дл выращивани опухоли пригодны мыши BALB/C. Свежим мьш)ам. за 3- 30 дней до инъекции штамма ввод т внутрибрюшинно по 0,5 вазе;гинового масла. Штамм инъецируют внутрибрюшинно по ГО клеток в I мл среды Игла , Асцит образуетс через Ю-16 дней Штамм не перевивали.

Продуктивность штамма.

Через 3-4 дн концентраци антите в культуральной жидкости составл ет 40-50 мкг/мл, в асцитической 7- .8 мг/мл. Стабильна секрели продукта сохран етс до 8 пасс.чжен in vitro.

Характеристика полезного продукта

МКА относ тс к классу IgG, они специфически реагирует с антигенами микробактерий быМьего вида штаммов bovinus-8 и БЦЖ, Контаминаци бактери ми , грибами, микоЬлазмой не об- йаружена.

Криоконсервироваиие: 0,7- 1-10 клеток штамма консервировали в 1 мл тел чьей эмбиональной сьшоротке с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание проводили в программном эамораживате- ле по следующей программе: температу- ру снижали по А С в минуту до 4 с и -по 1°С в минуту до -АО° С. .Клетки хран т в жидком азоте. Размораживание: быстро при 37 С. Жизнеспособность после размораживани по включению трипа- нового синего 80-90%.

II р и м е р. На полистироловую 96-лунрчную панель-дл микротитровани сорбируют убитые гамма-облучением микобактерии - 100 мкг культуры на чейку в 200 мкл карбонатно-бикар- бонатного буфера (0,02 М, рН 9,6), при 37 С в течение ночи. После насыщени панели IO/J-ным раствором ичного белка в фосфатно-солевом буфере (0,02 М, рН 7,4) дл уменьшени неспецифического св зьшани антител пластиком н чейки панели внос т 200 мкл культуральной среды штамма 2А5 на 1 ч, -после чего панель трижды отмьшают водопроводной водой, а потом водой с 0,05% твина-2б (процедуру отмьшки повтор ют трижды), внос т конъюгат антител кролика против им

муноглобулинов мыши, крвалентно св - занных с пероксидазой (1:J600, 37 С, 1 ч). После окончан1т инкубации нё- св завшиес продукты реакции отмьгаа- ют указанным вышесгюсобом, а св завшуюс пероксидазу, а значит и анти- тела против микобактерии БЦЖ, определ ют количественно по расщепле

нию субстрата (Hjbj)B присутствии хромогена - ортофенипендиамина; Положительна реакци про вл етс коричневым окрашиванием н количествеи- но учитьшаетс с помощью сканирующего спектрофотометра при длине волга 1 490 нм.

Результаты исследований представлены в таблице.

Штамм микробак- тернй

Показатель оптической плотности

Н„ПУ (человеческий

35

40 45

Результаты, представленные в таблице , свидетельствуют о том, что полученные МКА спецнфнчески реагируют с микобактери ми туберкулеза бычьего вида - БЦЖ (и слабее с Bovl- nus-8).

Claims

Формула изо б р, е т е Н

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculue ВСКК (П) N 60D, используемый дл получени моноклональных антител к fyc6- bacterium bovie (BCG).