SU1437393A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к рекомбинантному интерлейкину-2 человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  очистки и определени  интерлейкина . Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридных культивируемых клеток животньк Mus. musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к рекомбинантному интерлей- кину-2 (РИЛ-2) человека повышенной специфичности. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/C, иммунизированных РИЛ-2 человека , с клетками миеломы X63-Ag 8-653. Продукци  MICA на 2-3 день культивировани  составл ет 20-22 мкг/мл куль- туральной среды и 10-12 мг/мл асцити- ческой жидкости. МКА относ тс  к классу IgGj они специфически взаимодействуют как с мономером РИЛ-2, так и 3 с его мультимерами. Продукци  МКА сохран етс  как минимум до 10 пассажей in vitro. (Л с

Description

со

с со

00

114

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл очистки и определени  интерлейкина.

Цель изобретени  - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus, продуцирующе то моноклонапьные антитела (МКА) и рекомбинантному интерлейкнну-.2 (РИЛ-2 человека повышенной специфичности,.

Штамм получают следующим образом.

Мьаией линии BALB/c, иммунизируют внутрибрюшинным введением 1500 ЕД РИЛ-2 человека в .0,15 мл 0,15 М NaCl в смеси с равньм объемом полного адью ванта Фрейнда., Иммунизации повтор ют 3 раза через 14 дней тем же количеством антигена в смеси с неполным адью вантом Фрейнда. За 3 дн  до сли ни  РШ1-2 ввод т внутрибрюшинно в,О,5 мл 0,15 М NaCl. Гибридизацию 1 10® кпе- ток селезенки иммунных и 3-10 клеток м1-5еломы мыши X63-Ag8 653 провод т 50%-ным раствором полиэтилен-гликол  мол, массы 4000, содержащего 5% диметилсух ьфокс1ща, в течение . гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликол  клетки высевают в 96-луночные панели по 1-10 спленоцитов в лунку. Дл  культивировани  и селекции гибридом используют среду 1МДМ (мoдифищipoвaн- на  Iskove s среда Дульбекко) с добавлением 10% эмбриональной тел чьей

V-4

М гипоксантина,.

аминоптерина и 1j6-10 M

сыворотки (ЗТС), 10 4

тимидина. Гибриды-продуценты клони- pyioT 2. раза методом конечных разведений , высева  по 1 клетке в лунку;, содержащую 4-Ю клеток селезенки. После двух клонирований практически 100% субклонов продуцируют МКА к РИЛ-2 человека. Полученньй штамм обоз начают 13Б1.2. Он хранитс  в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института Цитологии АН СССР под номером .ВСКК (II) 108D и характеризуетс  следующими признаками.

Культуральные признаки.

Стандартные услови  культивировани  - среда 1МДМ с 10% донорской тел чьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина 100 мсг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэта- нола, при и в атмосфере 5% СО . Дл  выращивани  штамма используит стекл нную посуду, посевна  доза 200 тыс. спеток на миллилитр, клетки

0

5

0

5

пассируют один раз в 2-3 дн , кратность рассева 1:6-1:8. Культура суспензионна .

Культивирование в организме животных . Дп  вырапщвани  асцита пригодны : мьшш, BALB/C. Мьшам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма ввод т внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки иньекцируют внутрибрюшинно по 2 - 5х X 10 клеток в 1 мл среды ШДМ. Асцит формируетс  через 12-14 дней.

Продуктивность штамма. Секреци  моноклон,альных антител на 2-3 день культивировани  составл ет 20 - 22 мкг/мл культуральной среды и 10- 12 мг в 1 мл аст дтной жидкости при определении и: шуноферментным методом.

Характеристика полезного продукта МКА относитс  к классу IgG. Они специфически взаимодействуют как с мономером РШ1-2, так и с его мультимера- ми. Продукци  шел сохран етс  как минимум до 10 пассажей in vitro, в асцитной форме штамм не пассируетс  более одного раза.

Контаминаци . Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не вы влено при окрашивании красител ми на ДК Н и по характеру включени  ти- мидиновой метки.

Криоконсервирование. Дл  длительного хранени  клетки штамма замораживают в эмбриональной тел чьей сыворотке с добавлением 10% диметил- сульфоксида. Режим замораж;ний: 1 С/мин; до -70 С. После замораживани  клетки перенос т в жидкий азот. Размораживание - на вод ной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживани  70-80% по окрапшванию три- пановым синим.

Использование штамма иллюстрируетс  следующими примерами.

Пример 1, Гибридомные клетки помещают в стекл нный фла кон объемом 50 мл во 1 «10 клеток в 5 мл среды 1МДМ с 10% ЭТС, 2 ММ 1-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина , 0,05 мМ меркаптоэтанола. Клетки культивируют 2-3 дн  при в атмосфере 5% COj. Полученный суперна- тант используют в качестве реагента в иммунохимических реакци х (как препарат МКА) .

0

5

0

5

0

Антигены высушивают в лунках 96-  чеечных змикроплат при З7 с или

в следукнцих количествах: РИЛ-2 50 нг в 20 мкл бидистиллированнрй воды; мембранна  фракци  E.coli, растворимые белки E.coli и бычий сьшороточный альбумин (БСА) - по 1 мкг в 20 мкл бидистиллированной воды. После отмывок в  чейки внос т по 50 мкл культу- ральной среды полученного штамма. Панель инкубируют 2 ч при , затем отмьтают 5 раз бидистиллированной водой и внос т по 50 мкг/лунку кроличьи противомышиные антитела, меченные пе- роксидазой, разведенные 1/2500 в ЗФР-БСА (0,01 М фосфатный буфер, ph 7,4, 0,15 М NaCl, 1% БСА). После инкубации в течение 1 ч при 20 С плату отмьтают и в лунки добавл ют субстрат - ортофешшеидиамин гкдрохлорид 0,6 мг/мл в цитратио-фосфатном буфере , рН 4,7, содержащем 0,03% . Реакцию останавливают через 10 мин 1 М серной кислотой и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты исследований приведены ниже:

Антигены

Культуральна  среда штамма 1.ЗБ1.2 (А492ЧОЗ) 2363

РИЛ-2

Растворимые белки E.coli376

Мембранна  фракци  E.coli429

БСА , 206

Результаты свидетельствуют о высокой специфичности полученных MICA к РИЛ-2 человека (коммерческие препараты МКА имеют значение. А492 10 дл  РИЛ-2, равное 1517).

Пример 2. Электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натри  (ДСН-ПААГЭ) провод т с использованием аппарата дл  вертикального электрофореза . РИЛ-2, 10 мкг, в буфере дл  образца в редуцирую1цих или нере- дуцируюш 1х услови х и эквивалентное количество лизата E.coli в буфере дл  образца в редуцирующих услови х прогревают 2 мин при 100°С и нанос т в  чейки гел . Электрофорез осуществл ют при посто нной силе тока 50 мА.

Электроперенос разделенных компонентов из гел  на нитроцеллюлозу

(НЦ) с диаметром пор 0,45 мкм провод т в течение 1 ч. После переноса НЦ промьшают дистиллированной водой и

далее обрабатывают с помощью набора дл  иммуноблотинга. Неспецифическую сорбцию белка на НЦ блокируют в 0,02 М трис-НС буфере рН 7,4 с 0,5 М NaCl (ТБР), содержащем 3% желатины.

После этого НЦ промывают 2 раза ТБР с 0,05% твин-20 (ТТБР) и разрезают на полоски. Полоски, соответствующие ДСН-ПААГЭ РШ1-2 в редуцирующих и не- « редуцирующих услови х и лизаты E.coli

помещают в стекл нные пробирки емкостью 15 мл и добавл ют 10 мл су- пернатанта МКА 13Б1.2. Инкубацию с МКА продолжают 2 ч при на аппарате с горизонтальным переме Ш ва-,

нием. После этого МЦ отмьшают 3 раза по 5 Mini ТТБР, добавл ют козьи антимышиные антитела, разведенные 1/2000 в ТТБР, 1% БСА и инкубируют 1 ч при 20°С с перемешиванием. После двух

отмьшок ТТБР и одной отмывки ТБР реакцию про вл ют в растворе субстрата, содерлсащем 4-хлор-1-нафтол и 0,005% ,, в течение 20 мин.. Дл  хранени  и фотографировани  НЦ промывают в

дистиллированной воде и высушивают на воздухе.

Результаты исследований свидетельствуют о взаимодействии МКА 13Б1.2 как с мономером РИЛ-2, так и с его мультимерами. Возможность образовани  многомерных форм РИЛ-2 определ етс  присутствием 3 свободных сульфгид- рильных групп в молекуле ИЛ-2, образующих межмолекул рные дисульфидные св зи в процессе очистки РИЛ-2. Ди- мер РИЛ-2 достаточно устойчив и сохран етс  даже в редуцирующих услови х . Таким образом, МКА, продуцируемые клетками штамма 13Б1.2, могут быть, использованы дл  определени  РШ1-2 . после ДСН-ПААГЭ и электропереноса на нитроцеллюлозу.

50

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus ВСКК (II) № 108D, используемый дл  получе- 55 ни  моноклональных антител к реком- бинантному интерлейкину-2 человека.

   ВНШ1Г111 Заказ 5855/25 Тираж 520

   ПроизБ .-iiojuirp. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4

   Подписное