RU2002803C1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к JGG 1, 3, 4 человека - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи  иммуноглобулинов , разработка иммунодиагностикумов в биологии и медицине, аффинное выделение lgG2. Сущность изобретени : получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus muscslus L продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к IgG 1,3,4 человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками мие- ломы Sp/20 Ag14. МКА относ тс  к подклассу IgGI, они специфически взаимодейавуют с lgG1, G3, G4 человека, а также с их Рав- и Г-с-фрагментзми Концентраци  МКА в культуральной жидкости составл ет 5-10 мкг/мл, в асцитной - 5 мг/ма Продукци  антител сохран етс  в течение 29 пассажей в культуре и 14 пассажей на животных 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  структурных и функциональных исследований иммуноглобулинов G (IgG) человека, аффинного выделени  lgG2, разработки иммуно- диагностикумов в биологии и медицине.

Известны штаммы, продуцирующие мо- ноклональные антитела (МКА) к lgG2, lgG1, 2, 3, 4 человека.

Отличительное свойство предложенно- го штамма - это продукци  антител, с высокой аффинностью взаимодействующих с целыми молекулами IgGI, lgG3, lgG4 человека , их Fab- и Рс;фрагментами и не вступающих в реакцию с lgG2.

Преимущество полученных МКА заключаетс  в возможности их использовани  дол  аффинного выделени  lgG2 из сыворотки крови миеломных больных не только в м гких услови х, но и при физиологических зна- чени х рН.

Кроме того, кажда  вновь полученна  гибридома уникальна. МКА, продуцируемые разными гибридомами, различаютс  по своей первичной структуре, специфичности к различным антигенным детерминантам, аффинности и многим другим.физико-химическим свойствам. Поэтому получение как можно большего количества моноклональ- ных антител к иммуноглобулинам человека,  вл ющимс  центральным звеном гуморального иммунитета, чрезвычайно важно с научной и практической точки зрени .

Технический результат изобретени  заключаетс  в получении штамма гибридных bTHBVipyeMbix клеток, продуцирующего МКА к IgGI, 3, 4 человека, которые на взаимодействуют с lgG2 человека.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии ВАШ/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг IgG (выделенного из сыворотки крови больного аденокарциномой желудка методом переосаждени  сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе) в 0,005 М фосфатном буферном растворе с 0,15 М NaCl, рН 7,4 (PBS) в полным адъювантом Фрейнда. Иммунизацию повтор ют через один мес ц, но без адъюванта. Еще через один мес ц мышей бустируют путем внутривенного введени  100 мкг IgG в PBS. Через три дн  у животных определ ют титр антител к IgG человека (используемому дл  иммунизации ) методом иммуноферментного знали- за. Мышь с лучшим иммунным ответом используют дл  получени  гибридомы. Дл  этого 10 клеток селезенки иммунной мыши гибридизуют с 4 107 клеток миеломы Sp 2/0 Ag I4 в присутствии 50% полиэтиленглико.л 

с мол.м. 4000 (Merck, ФРГ). После гибридизации клетки высевают в 96-ти луночные планшеты на 105 клеток на лунку. В качестве питающего сло  используют перитонеаль- ные макрофаги мыши, которые высевают по 104 клеток на лунку за сутки до гибридизации . Гибридому клонируют два раза методом лимитирующего разведени  (из расчета 32 клетки на 96-ти луночный планшет), высева  клетки на слой перитонеальных макрофагов . После второго клонировани  более 70% полученных субклонов продуцируют антитела к gG1, 3, 4 человека. Наиболее продуктивный клон вывод т в массовую культуру и обозначают А5В8.

Штамм А5В8 характеризуетс  следующими признаками.

Морфологические признаки. Тип роста штамма - суспензионный, клетки округлой формы, расположены кластерами. Гибридома вызывает образование смешанных ас- цитных и солидных опухолей при прививке в перитонеальную полость мышей линии BALB/c в дозе 1 млн. клеток на мышь.

Культуральыые признаки. Гибридому культивируют в пластиковых флаконах на 50-250 мл. Посевна  доза 5-105 клеток на мл. Кратность рассева 1:5, врем  субкультивировани  3-4 дн . Среда дл  культивировани  RPMI-1640-c добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, по 2 мМ глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, В первые три недели после гибридизации в среду добавл ют 10 М гипоксантинз, 4-10 М аминоп- терина, и 1,610 М тимидина, так как клетки миеломы Sp 2/0 Ag14 дефекты по ферменту гипоксантин-гуанин-фосфорибо- зилтрансферазе. Клетки выращивают в атмосфере 5% С02 при 37°С,

Культивирование в организме животного . Дл  выращивани  гибридомы в асцитной форме клетки (107) ввод т в брюшную полость мышей BALB/c, которым предварительно (за 7-10 сут) внутрибрюшинной инъецируют пристан. Врем  образовани  асцита 10-14 дней.

Характеристика полезного продукта. МКА, продуцируемые штаммом А5В8, относ тс  к IgGI подклассу, специфически взаимодействуют с IgGI, lgG3, lgG4 человека и их Fab-и Fc-фрагментами. Принадлежность к подклассу IgG определ ют при помощи преципитирующих сывороток против IgG мыши разных подклассов (Sigma, США) методом радиальной иммунодиффузии по Оух- терлони. Взаимодействие антител с IgGI, 3. 4 человека определ ют методом иммуно- ферментного анализа.

-Ј

Продуктивность штамма, стабильность антител.

Концентраци  МКА через 3-4 дн  культивировани  ин витро составл ет 5-10 мкг/мл, в асцитной жидкости 5 мг/мл. Кон- троль продуктивности осуществл етс  с помощью иммуноферментного анализа, титр 1/5000. Продукци  антител сохран етс  в течение 29 пассажей в культуре и 14 пассажей на животных. Контроль контаминации. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при окрашивании красител ми на ДНК.

Способ криоконсервировани . Дл  длительного хранени  клети штамма замораживают в фетальной бычьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режима замораживани : сутки при -70°С, затем ампулы с клетками перенос т в жидкий азот. Размораживают клетки, перенос  ампулу из жидкого азота в вод ную баню на 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживани  составл ет 80-90% по окрашиванию трипановым синим.

П р и м е р 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см2 по 5-Ю5 клеток в 5 мл среды RPMI- 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, по 2 мМ глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина . Клетки культивируют 3-4 дн  при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОа. Культу- ральную среду собирают, центрифугируют 10 мин при 800 об/мин. Супернатант, содержащий МКА к IgG человека примен ют в иммуноферментном анализе. В качестве ан- тигенов используют различные иммуноглобулина , выделенные из сыворотки крови больных миеломной болезнью методом переосаждени  сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе: lgG1 Бог, lgG1 Мис, lgG2 Рыб, gG2 Боб, lgG2 Гол, lgG2 б/н, lgG3 Дал, lgG4 Жел, lgG4 Бер, gG4 б/н, IgA, a также IgM, выделенный из сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема пере- осаждением бидистиллированной водой с последующей гель-фильтрацией, и папаи- иовые Fab-, Fc-фрагменты IgG человека. Антигены развод т до концентрации 10 мкг/мл в 0,05 Na-карбонатном буфере, рН 9,2, и внос т по 50 мкл в лунку 96-ти луночного пластикового планшета. Инкубируют в течение 1 ч при 37°С, затем сливают и внос т по 100 мкл к лунку 1 %-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 1 ч при 37°С. После окончани  инкубации раствор BSA сливают, планшет промывают холодной водой и PBS с 0,05% твином (PBST), внос т супернатант культуральной среды по 50 мкл в лунку и инкубируют при 37°С. Через 1 ч содержимое лунок сливают, промывают холодной водой и PBST, добавл ют по 50 мкл конъюгата кроличьих антител против IgG мыши с пероксидазой в разведении 1:500 в растворе PBST и инкубируют при 37°С 1 ч. После тщательной промывки в лунки внос т по 100 мкл 0,4 мМ раствора субстрата -2.2 -азино ди- 3-этилбензтиазо- линсульфонат(б) (ABTS) в 0,05 М Na-цитрат- ном буфере, рН 4,0 с добавлением перекиси водорода до конечной концентрации 0,01 % и инкубируют на шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем оценивают результат на спектрофотометре Muitiskan (Flow, Великобритани ) при длине волны 405 нм.

Полученные данные, выраженные з процентах от максимальной зкстинкции (0,8-100%). представлены в таблице.

Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что гибридома А5В8 продуцирует МКА, специфически взаимодействующие с целыми молекулами gG1, 3, 4 человека и их Fab- и Fc-фра ментами.

П р и м е р 2, 30 мг МКА штамма А5В8 (полученных методом переосаждени  сернокислым аммонием асцитной жидкости) смешивают с 1 г CNBr-сефарозы 4В (предпочтительно замоченной и промытой в 1 мМ НС)на шейкере в течение 2 ч при комнатной температуре. Полученным аффинным сорбентом забивают стекл нную колонку объемом 5 мл и промывают в течение 3 ч со скоростью 3 кап/мин 0,1 М бикарбонатным буфером с 0,5 М Nad, рН 8,3. Отмывают избыток белка рабочим буфером (бикарбонатным ), блокируют избыток активных групп в геле раствором 0,2 М глицина (рН 8,0)2 ч при комнатной температуре, отмывают сначала рабочим буфером, потом попеременно буферными растворами с высоким и низким значением рН на стекл нном фильтре 4-5 раз, затем промывают раствором PBS (рН 7,4) и пропускают 1 мл раствора 1дЗ дон BPBS (с 2 мг/мл) со скоростью 3 кап/мин. Элюат собирают порци ми по 1 мл в 10 пробирок, определ ют экстинкцию на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Дл  оценки результатов аффинной хроматографии провод т ИФА, который показывает , что выделен lgG2.

Таким образом, предложенный гибридный штамм продуцирует МКА, которые специфически взаимодействуют с целыми молекулами lgG1, 3, 4 человека и их Fab- и Fc-фрагментами. Полученные антитела могут эффективно использоватьс  дл  аффинного выделени  lgG2, клинических и биохимических исследований.

(56) Jefferis R., Relmer C.B., Skwaril F. et al./ /Immunology Letters. - 1985. - v. 10. -p. 223- 252.

Европейский патент № 0163141, кл. С 12 Р21/00, 1985.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus muscutus L, ВСКК (П)

   N492 Д, используемый дл  получени  мо- ноклональных антител к JgG 1.3,4 человека .